Каждый из нас слышал о таком неприятном заболевании, как сахарный диабет, а также об инсулине, который больным вводят в качестве заместительной терапии. Все дело в том, что у больных сахарным диабетом инсулин либо не вырабатывается вообще, либо не выполняет свои функции. В нашей статье мы рассмотрим вопрос о том, инсулин - что это такое и какое действие он оказывает на наш организм. Вас ждет увлекательное путешествие в мир медицины.
Инсулин - это…
Инсулин - это гормон, Продуцируют его специальные эндокринные клетки, именуемые островками Лангерганса (бета-клетки). На поджелудочной взрослого человека насчитывается около миллиона островков, в функции которых входит выработка инсулина.
Инсулин - что это такое с точки зрения медицины? Это гормон белковой природы выполняющий в организме чрезвычайно важные необходимые функции. В ЖКТ извне он поступать не может, так как будет переварен, подобно любому другому веществу белковой природы. Ежедневно вырабатывается небольшое количество фонового (базального) инсулина. После еды организм поставляет его в том количестве, которое требуется нашему организму для переваривания поступивших белков, жиров и углеводов. Остановимся на вопросе о том, каково действие инсулина на организм.
Функции инсулина
Инсулин отвечает за поддержание и регулирование углеводного обмена. То есть этот гормон оказывает сложнейшее многогранное действие на все ткани организма, во многом за счет его активизирующего действия на многие ферменты.
Одна из основных и самых известных функций этого гормона - регулировка уровня глюкозы в крови. Она требуется организму постоянно, ведь относится к питательным веществам, которые нужны для роста и развития клеток. Инсулин расщепляет ее до более простого вещества, способствуя его всасыванию в кровь. Если поджелудочная вырабатывает его в недостаточном количестве, глюкоза не питает клетки, а накапливается в крови. Это чревато повышением (гипергликемией), что влечет за собой серьезные последствия.
Также с помощью инсулина осуществляется транспорт аминокислот и калия.
Мало кому известны анаболические свойства инсулина, превосходящие даже эффект стероидов (последние, правда, действуют более избирательно).
Виды инсулина
Различают типы инсулина по происхождению и по действию.
Быстродействующий оказывает ультракороткое действие на организм. Этот тип инсулина начинает свою работу сразу же после приема, а пик его достигается через 1-1,5. Длительность действия - 3-4 часа. Вводят его непосредственно перед или до приема пищи. К препаратам, обладающим подобным действием, относят "Ново-Рапид", "Инсулин Апидра" и "Инсулин Хумалог".
Короткий инсулин оказывает эффект уже через 20-30 минут после применения. Через 2-3 часа концентрация препарата в крови доходит до максимальной точки. В общей сложности действует около 5-6 часов. Вводится инъекция за 15-20 минут до еды. При этом приблизительно через 2-3 часа после введения инсулина рекомендуется делать «перекусы». Время приема пищи должно совпадать со временем максимального эффекта препарата. Лекарства короткого действия - препараты "Хумулин Регуля", "Инсулин Актрапид", "Монодар Хумодар".
Инсулины средней продолжительности действия воздействуют на организм гораздо дольше - от 12 до 16 часов. Необходимо делать 2-3 инъекции в сутки, зачастую с интервалом в 8-12 часов, так как действие свое они начинают не сразу, а через 2-3 часа после введения. Их максимальный эффект достигается через 6-8 часов. Инсулины средней продолжительности действия - препараты "Протафан" (инсулин человека), "Хумудар БР", "Инсулин Новомикс".
И, наконец, инсулин длительного действия, максимальная концентрация которого достигается через 2-3 дня после введения, несмотря на то, что действовать он начинает уже через 4-6 часов. Применяют его 1-2 раза в сутки. Это такие препараты, как "Инсулин Лантус", "Монодар Лонг", "Ультраленте". К этой группе можно также отнести так называемый "безпиковый" инсулин. Что это такое? Это инсулин, который не имеет ярко выраженного эффекта, действует мягко и ненавязчиво, поэтому практически заменяет человеку «родной», вырабатываемый поджелудочной.
Разновидности инсулинов
Человеческий инсулин - это аналог гормона, вырабатываемого нашей поджелудочной железой. Такой инсулин и его генно-инженерные «братья» считается более усовершенствованным, чем другие типы инсулина животного происхождения.
Свиной гормон схож с вышеупомянутым, за исключением одной аминокислоты в составе. Способен вызывать аллергические реакции.
Инсулин крупного рогатого скота наименее схож с человеческим. Часто вызывает аллергию, так как содержит чужеродный нашему организму белок. Уровень инсулина в крови у здорового человека имеет строгие ограничения. Рассмотрим их подробнее.
Каким должен быть уровень инсулина в крови?
В среднем, у здорового человека нормальный показатель инсулина в крови натощак, колеблется от 2 до 28 мкЕД/моль. У детей он несколько ниже - от 3 до 20 ед, а у беременных женщин,напротив, выше - норма составляет от 6 до 27 мкЕД/моль. В случае беспричинного отклонения инсулина от нормы (уровень или понижен), рекомендуется обратить внимание на ваш рацион и образ жизни.
Повышение уровня гормона в крови
Повышенный инсулин влечет за собой потерю практически всех его что негативно сказывается на состоянии здоровья. Он повышает артериальное давление, способствует ожирению (за счет неправильно транспортированной глюкозы), оказывает канцерогенный эффект и повышает риск сахарного диабета. Если у вас повышенный инсулин, вам следует обратить внимание на свой рацион, стараясь употреблять как можно больше продуктов с низким гипокликемическим индексом (нежирные кисломолочные продукты, овощи, кисло-сладкие фрукты, хлеб с отрубями).
Пониженный инсулин в крови
Встречаются случаи и когда в крови понижен инсулин. Что это такое и как лечить? Чрезмерно низкое количество сахара в крови ведет к нарушениям работы мозга. В этом случае рекомендуется обратить внимание на продукты, которые стимулируют работу поджелудочной железы - это кефир, свежая черника, мясо нежирное отварное, яблоки, капуста и (отвар особенно эффективен при его приема натощак).
Благодаря правильному питанию, вы сможете нормализовать уровень инсулина и избежать осложнений, в частности, сахарного диабета.
Инсулин и сахарный диабет
Различают два вида диабета - 1 и 2. Первый относится к врожденным заболеваниям и характеризуется постепенным разрушением бета-клеток поджелудочной железы. Если их остается меньше 20%, организм перестает справляться, и ему становится необходима заместительная терапия. А вот когда островков более 20%, вы можете даже не заметить никаких изменений в своем здоровье. Зачастую в лечении применяют короткий и ультракороткий инсулин, а также фоновый (продленный).
Второй тип сахарного диабета - приобретенный. Бета-клетки при этом диагнозе работают "на совесть", однако действие инсулина нарушено - он уже не может выполнять свои функции, вследствие чего сахар опять-таки накапливается в крови и может вызывать серьезные осложнения, вплоть до гипокликемической комы. Для его лечения применяют препараты, которые помогают восстановить утраченную функцию гормона.
Больным крайне необходимы инъекции инсулина, а вот диабетики второго типа нередко долгое время (годами и даже десятилетиями) обходятся препаратами. Правда, со временем все равно приходится «садиться» на инсулин.
Лечение инсулином помогает избавиться от осложнений, которые развиваются при игнорировании потребности организма в его получении извне, а также помогает снизить нагрузку на поджелудочную железу и даже поспособствовать частичному восстановлению ее бета-клеток.
Считается, что, начав терапию инсулином, вернуться к препаратам (таблеткам) уже нельзя. Однако, согласитесь, лучше начать раньше вводить инсулин, если это будет необходимо, чем отказаться от него - в этом случае не избежать серьезных осложнений. Врачи утверждают, что есть шанс в будущем отказаться от уколов при диабете 2 типа в случае, если лечение инсулином было начато вовремя. Поэтому внимательно следите за своим самочувствием, не забывайте придерживаться диет - они являются неотъемлемым фактором хорошего самочувствия. Помните, что диабет - это не приговор, а образ жизни.
Новые исследования
Ученые продолжают настойчиво искать способ облегчить жизнь больным сахарным диабетом. В 2015 году США представили новую разработку - прибор для ингаляций инсулина, который заменит шприцы, сделав жизнь диабетиков более легкой. Этот прибор уже можно приобрести в аптеках Америки по рецепту врача.
В этом же году (и опять-таки в США) был выведен так называемый «умный инсулин», который вводится в организм раз в сутки, активируясь самостоятельно при необходимости. Несмотря на то, что он пока был опробован только на животных и еще не тестировался на людях, очевидно - ученые сделали очень важные открытия в начале 2015 года. Будем надеяться, что в будущем они будут радовать диабетиков своими открытиями.
Инсулин является жизненно важным лекарственным препаратом, он произвел настоящую революцию в жизни многих людей, страдающих сахарным диабетом.
Во всей истории медицины и фармации 20 века можно выделить, пожалуй, только одну группу медикаментов, имеющих такую же важность – это антибиотики. Они, равно как и инсулин, очень быстро вошли в медицину и помогли спасти множество человеческих жизней.
День борьбы против сахарного диабета отмечается по инициативе Всемирной Организации Здравоохранения каждый год, начиная с 1991 г в день рождения канадского физиолога Ф.Бантинга, который открыл гормон инсулин вместе с Дж.Дж.Маклеодом. Давайте рассмотрим, как получают делают этот гормон.
Чем отличаются препараты инсулина друг от друга
- Степень очистки.
- Источник получения – бывает свиной, бычий, человеческий инсулин.
- Дополнительные компоненты, входящие в раствор препарата – консерванты, пролонгаторы действия и другие.
- Концентрация.
- рН раствора.
- Возможность смешивания препаратов короткого и продленного действия.
Инсулин представляет собой гормон, который вырабатывается специальными клетками поджелудочной железы. Он является двухцепочечным белком, в состав которого включена 51 аминокислота.
В мире ежегодно употребляется около 6 миллиардов единиц инсулина (1 единица – это 42 мкг вещества). Производство инсулина является высокотехнологичным и осуществляется только промышленными способами.
Источники получения инсулина
В настоящее время в зависимости от источника получения выделяют свиной инсулин и препараты человеческого инсулина.
Свиной инсулин сейчас имеет очень высокую степень очистки, обладает хорошим сахароснижающим эффектом, на него практически не бывает аллергических реакций.
Препараты инсулина человека полностью соответствуют по химическому строению человеческому гормону. Они производятся обычно путем биосинтеза с применением генно-инженерных технологий.
Крупные фирмы производители используют такие методики производства, которые гарантируют соответствие их продукции всем стандартам качества. Больших различий в действии человеческого и свиного монокомпонентного инсулина (то есть высокоочищенного) не выявлено, в отношении иммунной системы, по данным многих исследований, разница минимальна.
Вспомогательные компоненты, используемые при производстве инсулина
Во флаконе с препаратом содержится раствор, содержащий не только сам гормон инсулин, но также и другие соединения. Каждое из них играет свою определенную роль:
- продление действия препарата;
- дезинфекция раствора;
- наличие буферных свойств раствора и поддержание нейтрального рН (кислотно-щелочной баланс).
Продление действия инсулина
Для создания инсулина продленного действия к раствору обычного инсулина добавляют одно из двух соединений – цинк или протамин. В зависимости от этого все инсулины можно разделить на две группы:
- протамин-инсулины – протафан, инсуман базал, НПХ, хумулин Н;
- цинк-инсулины – инсулин-цинк-суспензии моно-тард, ленте, хумулин-цинк.
Протамин представляет собой белок, но побочные реакции в виде аллергии на него бывают очень редко.
Для создания нейтральной среды раствора к нему добавляют фосфатный буфер. При этом нужно помнить, что инсулин, содержащий фосфаты, категорически запрещено соединять с инсулин-цинк-суспензией (ИЦС), так как фосфат цинка при этом выпадает в осадок, и действие цинк-инсулина укорачивается самым непредсказуемым образом.
Дезинфицирующие компоненты
Обеззараживающим действием обладают некоторые из соединений, которые по фармако-технологическим критериям и так должны быть введены в препарат. К ним относятся крезол и фенол (оба они имеют специфический запах), а еще метилпарабензоат (метилпарабен), у которого запах отсутствует.
Введение какого-либо из данных консервантов и обуславливает специфический запах некоторых препаратов инсулина. Все консерванты в количестве, в котором они находятся в препаратах инсулина, не имеют какого-либо негативного влияния.
В протамин-инсулины обычно включают крезол или фенол. В растворы ИЦС фенол добавлять нельзя, потому что он изменяет физические свойства частиц гормона. В данные препараты включают метилпарабен. Также антимикробным действие обладают ионы цинка, находящиеся в растворе.
Благодаря такой многоступенчатой антибактериальной защите с помощью консервантов предотвращается развитие возможных осложнений, причиной которых могло бы стать бактериальное обсеменение при многократном введении иглы во флакон с раствором.
За счет наличия такого механизма защиты пациент может использовать для подкожных инъекций препарата один и тот же шприц в течение 5 – 7 дней (при условии, что шприц использует только он один). Более того, консерванты дают возможность не использовать спирт для обработки кожи перед инъекцией, но опять же только в том случае, если больной делает инъекцию сам себе шприцем с тонкой иглой (инсулиновым).
Калибровка инсулиновых шприцев
В первых препаратах инсулина в одном мл раствора содержалась только дона единица гормона. Позднее концентрацию увеличили. Большая часть препаратов инсулина во флаконах, применяемых в России, содержит в 1 мл раствора 40 ед. Флаконы при этом обычно маркируются символом U-40 или 40 ед/мл.
Для широкого использования предназначаются, как раз, для такого инсулина и их калибровка произведена по следующему принципу: при наборе шприцем 0,5 мл раствора человек набирает 20 единиц, 0,35 мл соответствует 10 единицам и так далее.
Каждая отметка на шприце равна определенному объему, и больной уже знает, сколько единиц в этом объеме содержится. Таким образом, калибровка шприцев представляет собой градуировку по объему препарата, рассчитанную на применение инсулина U-40. 4 единицы инсулина содержатся в 0,1 мл, 6 единиц – в 0,15 мл препарата и так далее до 40 единиц, которые соответствуют 1 мл раствора.
В некоторых станах применяется инсулин, 1 мл которого содержит 100 единиц (U-100). Для таких препаратов выпускаются специальные инсулиновые шприцы, которые похожи на те, что были рассмотрены выше, но на них нанесена другая калибровка.
Она учитывает именно данную концентрацию (она в 2,5 раза превышает стандартную). При этом доза инсулина для пациента, естественно, остается прежней, так как она удовлетворяет потребность организма в конкретном количестве инсулина.
То есть если ранее больной использовал препарат U-40 и в сутки вводил 40 единиц гормона, то эти же 40 единиц он должен получать и при инъекциях инсулина U-100, но вводить его в количестве в 2,5 раза меньше. То есть те же самые 40 единиц будут содержаться в 0,4 мл раствора.
К сожалению, не все врачи и тем более больные сахарным диабетом об этом знают. Первые сложности начались, когда некоторые из пациентов перешли на использование инъекторов инсулина (шприц-ручки), в которых применяются пенфиллы (специальные картриджи), содержащие инсулин U-40.
Если в такой шприц набрать раствор с маркировкой U-100, к примеру, до отметки 20 единиц (то есть 0,5 мл), то в данном объеме будет содержаться целых 50 единиц препарата.
Каждый раз, наполняя инсулином U-100 обычные шприцы и смотря при этом на отсечки единиц, человек будет набирать дозу в 2,5 раза большую, чем та, которая показана на уровне данной отметки. Если ни врач, ни пациент своевременно не заметят эту ошибку, то высока вероятность развития тяжелой гипогликемии из-за постоянной передозировки препарата, что на практике нередко и происходит.
С другой стороны, иногда встречаются инсулиновые шприцы, откалиброванные именно для препарата U-100. Если такой шприц ошибочно наполнить привычным многим раствором U-40, то доза инсулина в шприце будет в 2,5 раза меньше, чем та, которая написана около соответствующей отметки на шприце.
В результате этого возможно на первый взгляд необъяснимое повышение глюкозы в крови. На самом деле, конечно, все вполне логично – для каждой концентрации препарата необходимо использовать подходящий шприц.
В некоторых странах, например в Швейцарии, был тщательно продуман план, согласно которому был осуществлен грамотный переход на препараты инсулина с маркировкой U-100. Но это требует тесного контакта всех заинтересованных сторон: врачей многих специальностей, пациентов, медсестер из любых отделений, фармацевтов, производителей, органов власти.
В нашей стране очень сложно осуществить переход всех пациентов только на использование инсулина U-100, потому что, скорее всего, это приведет к увеличению количества ошибок при определении дозы.
Совместное применение инсулинов короткого и продленного действия
В современной медицине лечение сахарного диабета, особенно первого типа, обычно происходит с использованием комбинации двух типов инсулина – короткого и пролонгированного действия.
Для пациентов было бы намного удобнее, если бы препараты с разной продолжительностью действия можно было соединять в одном шприце и вводить одновременно, чтобы избежать двойного прокола кожи.
Многие врачи не знают, чем определяется возможность смешивания различных инсулинов. В основе этого лежит химическая и галеновая (определяемая составом) совместимость инсулинов продленного и короткого действия.
Очень важно, чтобы при смешивании двух типов препаратов быстрое начало действия короткого инсулина не растягивалось и не исчезало.
Доказано, что препарат короткого действия можно комбинировать в одной инъекции с протамин-инсулином, при этом начало работы короткого инсулина не откладывается, потому что не происходит связывания растворимого инсулина с протамином.
При этом производитель препарата не имеет никакого значения. Например, можно соединять с хумулином Н или протафаном. Более того, смеси этих препаратов можно хранить.
Относительно препаратов цинк-инсулина давно установлено, что инсулин-цинк-суспензию (кристаллическую) нельзя соединять с коротким инсулином, так он связывается с излишком ионов цинка и трансформируется в продленный инсулин, иногда частично.
Некоторые больные сначала вводят препарат короткого действия, потом, не вынимая иглы из-под кожи, немного изменяют ее направление, и вводят через нее же цинк-инсулин.
По такому способу введения проводилось довольно мало научных исследований, поэтому нельзя исключать тот факт, что в некоторых случаях при таком способе инъекции под кожей может образовываться комплекс цинк-инсулина и препарата короткого действия, что приводит к нарушению всасывания последнего.
Поэтому лучше вводить короткий инсулин совершенно отдельно от цинк-инсулина, делать две раздельные инъекции в участки кожи, находящиеся друг от друга на расстоянии не менее 1 см. это не удобно, чего не сказать о стандартном приеме.
Комбинированные инсулины
Сейчас фармацевтической промышленностью выпускаются комбинированные препараты, содержащие инсулин короткого действия вместе с протамин-инсулином в строго определенном процентном соотношении. К таким препаратам относятся:
- микстард,
- актрафан,
- инсуман комб.
Наиболее эффективными являются комбинации, в которых соотношение короткого и продленного инсулина составляет 30:70 или 25:75. Это соотношение всегда указывается в инструкции по применению каждого конкретного препарата.
Такие препараты лучше всего подойдут для людей, соблюдающих постоянный режим питания, имеющих регулярную двигательную активность. Например, их часто используют пожилые больные диабетом второго типа.
Комбинированные инсулины не подходят для осуществления так называемой «гибкой» инсулинотерапии, когда возникает необходимость постоянно менять дозировку инсулина короткого действия.
Например, это нужно делать при изменении количества углеводов в продуктах питания, уменьшении или усилении физической активности и т.д. При этом доза базального инсулина (пролонгированного) практически не изменяется.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
КАЗАХСКИЙ АГРОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ С.СЕЙФУЛЛИНА
Кафедра микробиологии и биотехнологии
КУРСОВАЯ РАБОТА
По дисциплине «Биотехнологии мокроорганизмов»
На тему: Технология получения инсулина
Выполнила: Мырзабек М?лдір Курбанбек?ызы
Проверила: Акимбаева А.К (к. б. н.)
Астана - 2013
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
1. История открытия
2. Получение инсулина в биотехнологии
3. Способы получения инсулина человека
4. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli
5. Очистка инсулина
6. Способ применения и дозы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В данной курсовой работе применялись следующие определения:
Белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;
Аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.
Инсулин (от лат. insula - остров) - гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.
Интерлейкины - группа цитокинов, синтезируемая в основном лейкоцитами (по этой причине было выбрано окончание «-лейкин»).
Проинсулин - это предшественник инсулина, синтезирующийся В-клетками островкового аппарата поджелудочной железы.
Хроматогр афия (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.
Инкапсуляция
Гибридный белок (англ. fusionprotein , также химерный, составной белок) - белок, полученный объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки.
Горм оны (от греч. hormao - привожу в движение, побуждаю), инкреты, биологически активные вещества, вырабатываемые эндокринными железами, или железами внутренней секреции, и выделяемые ими непосредственно в кровь.
Сахарный диабет -группа эндокринных заболеваний, развивающихся вследствие абсолютной или относительной недостаточности гормона инсулина.
Инкапсуляция - механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта.
Соматостатин - гормон дельта-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, а также один из гормонов гипоталамуса.
Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами.
СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
% - процентное содержание
ОФ - обращеннофазовой
ВЭЖХ - высокоэффективной жидкостной хроматографией
ИО - ионообменной
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
MP -монопиковые
MC - монокомпонентные
ФИТЦ - фенилизотиоцианатом
ВВЕДЕНИЕ
Основная функция инсулина - обеспечивать проницаемость клеточных мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные вещества, в конечном счете, расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций - митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.
Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток - абсолютная недостаточность инсулина - является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани - относительная инсулиновая недостаточность - имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.
Использование аффиннойхромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.
Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.
Целью данной курсовой работы является изучить технологию получения инсулина. Для достижения были поставлены следующие задачи:
1.получение инсулина в биотехнологии
2. способы получения инсулина
З. очистка инсулина
1. История открытия
История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.
В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.
После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных сахарным диабетом 1 типа.
В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.
Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.
В начале 70-х гг. советскими учеными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.
В дальнейшем шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.
В 80-годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были, затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.
2 . Получение инсулина в биотехнологии
Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1-3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.
Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генно-инженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. colie А - и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании гена проинсулина - предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.
К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.
Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной системы -энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина.
3 . Способы получения инсулина человека
Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.
С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического.
При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).
В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.
В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr . Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. (рисунок 1)
Рисунок 1 - Схема способы получения инсулина человека
Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением мизоформ. Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой. В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения мизоформ и ренатурации.
При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:
1) белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;
2) аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.
При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.
4 . Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli
В работе использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcusaureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого intube приводят к инсулину. Другая группа исследователей получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфурированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Также сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида - носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr . При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе.
5 . Очистка инсулина
Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты . Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина . В работе авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина. Сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд.
В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина, структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 - 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. Сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения, представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.
Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, трансфицировали кДНК белка переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins . В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа "искусственной b-клетки", полученной методами генной инженерии .
Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида показано наличие биологической активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях наряду с инсулином. В следующих статьях этой серии будут рассмотрены физико-химические и биологические свойства С-пептида, а также методы его получения.
Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacterglobiformis , для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей.
По степени очистки
· традиционные - экстрагируются кислым этанолом, а в процессе очистки фильтруются, высаливаются и многократно кристаллизуются (метод не позволяет очистить препарат от примесей других гормонов, содержащихся в поджелудочной железе)
· монопиковые (MP) - после традиционной очистки фильтруются на геле (при проведении гельхроматографии образуют всего один «пик»: содержание вышеперечисленных примесей не более 1·10 ?3
· Монокомпонентные (MC) - подвергаются ещё более глубокой очистке с помощью молекулярного сита и метода ионообменной хроматографии на DEAE -целлюлозе, что позволяет добиться 99 % степени их чистоты (1·10 ?6) (рисунок 2)
Рисунок 2- Схема очистки инсулина
инсулин сахарный диабет биотехнология
6 . Способ применения и дозы
Определяются и регулируются строго под медицинским наблюдением в соответствии с состоянием пациента. Все препараты хумулина могут вводиться подкожно или внутривенно; хумулин Р в ампулах вводится внутривенно. Подкожное введение, предпочтительное пациентам, следует делать в верхнюю часть руки, бедра, ягодицы или в брюшную область. Места укола нужно менять, чтобы одна и та же часть тела использовалась не чаще одного раза в месяц. При этом не должны затрагиваться капилляры. Место укола не требует массажа. Патрончики с хумулином используются только для инъекции в Пенах Бектон Дикинсона. При этом необходимо тщательно придерживаться указаний производителя, отмеченных на Пенах при их заправке и применении. Пациенты должны всегда иметь под рукой запасной шприц и ампулу с хумулином на случай, если Пен - устройство для инъекции или патрончик будут утеряны. Профили действия хумулина. Хумулин Р: начало действия через 10 минут, максимум действия - между 1 и 3 часами, длительность действия - от 5 до 7 часов. Хумулин Н: начало действия - через 30 минут, максимум действия - между 2 и 8 часами, длительность действия - от 18 до 20 часов. Хумулин М1: начало действия - через 30 минут, максимум действия - между 2 и 9 часами, длительность действия - от 16 до 18 часов. Хумулин М2: начало действия - через 30 минут, максимум действия между 1,5 и 9 часами, длительность действия - от 14 до 16 часов. Хумулин М3: начало действия - через 30 минут, максимум действия - между 1 и 8,5 часами, длительность действия - от 14 до 15 часов. Хумулин М4: начало действия - через 30 минут, максимум действия - между 1 и 8 часами, длительность действия - от 14 до 15 часов. Хумулин Л: начало действия - через 2 часа, максимум действия - между 4 и 16 часами, длительность действия - около 24 часов. Хумулин У: начало действия - через 3 часа, максимум действия - между 3 и 18 часами, длительность действия - от 24 до 28 часов. Терапия одним препаратом. Хумулин Р можно вводить без других видов инсулина, используя многоразовые ежедневные инъекции. Хумулин Н, Л и У также можно вводить самостоятельно 1-2 раза в день. Комбинированная терапия. Для усиления первоначального эффекта некоторым пациентам дополнительно к хумулину Р назначают хумулины Н, Л и У. Одновременное применение инсулинов животной группы, выпущенных различными фирмами не рекомендуется. Хумулин М не требует комбинационной терапии, его вводят два раза в день (2/3 ежедневной потребности утром, остальное - вечером). Для любого введения доза не должна превышать 50 единиц. Пациент обязан информировать врача о беременности. В этот период необходим строгий контроль за состоянием здоровья инсулинозависимой пациентки. Потребность в препарате обычно уменьшается в первом триместре и увеличивается во втором и третьем. Пациенткам с диабетом в период лактации требуется коррекция дозы инсулина (и диеты) .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сахарный диабет - хроническое заболевание, обусловленное абсолютной или относительной недостаточностью инсулина. Оно характеризующееся глубоким нарушением обмена углеводов с гипергликемией и гликозурией, а также другими нарушениями обмена веществ в результате воздействия ряда генетических и внешних факторов.
Инсулин до настоящего времени служит радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом. До получения и внедрения инсулина в клинику в 1922-1923 гг. больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход в течение одного-двух лет с начала заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение в силу тех или иных причин регулярного введения инсулина ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
В настоящее время сахарный диабет по распространенности находится на 3-м месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность сахарного диабета среди взрослого населения в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеется тенденция увеличения количества больных почти в два раза каждые 15 лет. Несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, численность инсулинозависимых больных увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.
Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.
Сахарный диабет занимает третье место в мире после сердечнососудистых и онкологических недугов. По различным источникам, в мире насчитывается от 120 до 180 млн. больных диабетом, что составляет 2-3 процентов от всего населения планеты. По прогнозам ученых, каждые 15 лет ожидается двукратное увеличение числа больных.
По моему мнению, инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. С момента открытия того факта, что инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, отвечает за снижение уровня сахара в крови, до настоящего времени прошло уже более 80 лет. Тем не менее, и по сей день этот гормон вызывает огромный интерес.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рэ, Л. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека; пер. с франц.- М.:Мир,2002.-С. 140-143.
2. Шевелуха, В. С. Сельскохозяйственная биотехнология/В. С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, 4-е изд.- М.:Изд-во Высшая школа,2003.-437 с.
3. Смит,О. Государственный реестр лекарственных средств; пер. с англ.- М.:Мир, 2003.-С. 37-39.
4. Грищенко, В. И. . Молекулярная биотехнология интерферонов - 2008.-Т. 11,вып. 7.-Харьков. 238.
5. Садченко, Л. С. Современные достижения биотехнологии в медицинской промышленности. -2008.-М. 31,вып. 5.-Л. 213.
6.Современная биотехнология [Электронный ресурс]: сайт по биотехнологии. - Режим доступа: http://www.bionews.ru/news/Bio.htm
7. Маринива А.К. Производство белковых веществ. Биотехнология - 2007.-Т. 51,вып. 5.-СПб. 17.
8.http://ru.wikipedia.org/wiki/
9.http://www.medichelp.ru/
10.http://mikrobio.ho.ua/
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Обеспечение проницаемости клеточных мембран для молекул глюкозы инсулином - гормоном пептидной природы. Реакции на препараты инсулина: иммунологическая инсулинорезистентность, аллергия, липодистрофия. Получение инсулина, разновидность его препаратов.
реферат , добавлен 05.02.2010
История создания и механизм действия инсулина, который является белково-пептидным гормоном, вырабатываемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Методы получения. Недостатки животного инсулина. Преимущества биотехнологического инсулина.
презентация , добавлен 15.03.2016
Этиология и патогенез, классификация сахарного диабета, инсулинотерапия. Фармакокинетика препаратов инсулина, его взаимодействие с другими лекарственными средствами. Трансбуккальный и сублингвальный, ингаляционный пути доставки в организм человека.
дипломная работа , добавлен 16.10.2014
Повышение качества жизни больных сахарным диабетом. Расчет состава пищевого рациона. Назначение инсулина, расчет его дозы, распределение инсулина в течении суток. Процессы биосинтеза и секреции инсулина. Применение синусоидального модулированного тока.
презентация , добавлен 20.10.2014
Изучение строения и действия инсулина. Секреция и синтез глюкогона. Исследование симптомов и диагностика сахарного диабета. Характеристика заболевания эндокринной системы. Применение лекарственных препаратов и химических веществ при лечении болезни.
презентация , добавлен 12.10.2015
Понятие и функции гормонов. Микробиологические трансформации стероидов, имеющих промышленное применение. Сырье для синтеза стероидных гормонов. Генно-инженерный метод получения соматостатина. Создание инсулина на основе технологии рекомбинантных ДНК.
презентация , добавлен 22.12.2016
Особенности лечения сахарного диабета I типа. Использование диетотерапии, физической нагрузки, инсулинотерапии. Критерии компенсации сахарного диабета. Рекомендации по режиму физических нагрузок. Хроническая передозировка инсулина (синдром Сомоджи).
презентация , добавлен 23.09.2016
Этиология и клинические проявления сахарного диабета. Виды инсулина, правила хранения. Понятие и схемы инсулинотерапии. Изучение осложнений, возникающих после инъекции инсулина. Роль медицинской сестры в вопросах обучения пациентов с сахарным диабетом.
курсовая работа , добавлен 01.06.2016
Нарушение внутренней секреции поджелудочной железы. Особенности симптомов сахарного диабета, случаи повышенного содержания инсулина в крови. Методы распознавания различных видов гипогликемии. Гипотезы причин повреждения работы поджелудочной железы.
реферат , добавлен 28.04.2010
Оценка эффективности лечения диабета. Клинико-диагностическое значение глюкозы в спинномозговой жидкости. Главные особенности глюкозотолерантного теста. Кривая после однократной нагрузки глюкозой. Кривая секреции инсулина для диабета второй степени.
Инсулинозависимый диабет – это заболевание, которое требует пожизненной терапии. От наличия или отсутствия инсулина в прямом смысле слова зависит жизнь пациента.
Диабет официально признан неинфекционной эпидемией и по данным ВОЗ занимает по темпам распространения третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. В мире насчитывается 200 млн больных диабетом, что составляет уже 6% взрослого населения мира. Более 2,7 млн из них проживают в нашей стране. Во много их жизнь зависит от того, что производится в этих стенах.
Завод «Медсинтез» работает в свердловском Новоуральске с 2003 года. Сегодня он удовлетворяет 70% потребности всего российского рынка инсулина. Так что я с удовольствием и интересом воспользовался возможностью совершит небольшую экскурсию по этому предприятию.
И первое, что меня удивило, так это здания-«матрешки». Внутри производственного «нестерильного» цеха находиться еще один — «чистый». Конечно и в общих коридорах везде зеркальные полы и чистота. Но основное действо разворачивается там, за стеклянными окошками.
ООО «Завод Медсинтез», созданное в 2003 г., входит в НП «Уральский фармацевтический кластер». Сегодня кластер объединяет 29 фирм различного профиля с общей численностью персонала более 1 000 человек. На заводе в настоящее время работает более 300 человек.
Гостям внутрь вход заказан, хоть мы и были упакованы в спецодежду. Приходилось глазеть через окна.
Внутри главенствует женский ручной труд. Что-то раскладывают и упаковывают.
И хоть осознаешь, что там внутри все безопасно и производятся лекарства, все равно как-то не по себе.
Так чем же заняты на работе эти прекрасные глаза напротив?
Если в двух словах, вернее в одной картинке, то вот:
СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ИНСУЛИНА
А теперь по существу. В 2008 г. на заводе «Медсинтез» при участии губернатора Свердловской области Э.Э. Росселя состоялось открытие первого в России промышленного производства готовых лекарственных форм генно-инженерного инсулина человека в соответствии с требованиям GMP EC (сертификат TUV NORD № 04100 050254/01).
Мощность производственного участка составляет до 10 млрд. МЕ в год, что позволяет удовлетворить до 70% потребности российского рынка инсулинов.
Производство располагается в новом здании площадью более 4000 м². Имеет в своем составе комплекс чистых помещений площадью 386 м², включающий помещения классов чистоты А, В, С и Д.
На производстве смонтировано технологическое оборудование ведущих мировых производителей: BOSCH (Германия), SUDMO (Германия), GF (Италия), EISAI (Япония).
Однако субстанцию, которая необходима для производства препарата, ранее приходилось приобретать во Франции. Чтобы самим выпускать субстанцию, нужно было разработать собственную бактерию. На это у уральских ученых ушло четыре года - свой штамм они запатентовали в мае 2012-го. Теперь дело за тем, чтобы развернуть производство.А пока нам показали святая-святых — вот с этой субстанции и начинается производственная цепочка.
Уральский полпред Игорь Холманских и сопровождающие лица слушают краткое описание рабочего процесса.
По ту сторону стекла находятся биореакторы. Все автоматизировано и люди находятся только по эту сторону.
«Живых» сотрудников можно увидеть только дальше по технологической цепочке. Цех подготовки воды.
Сами препараты перемещаются из цеха в цех исключительно на конвейерах.
Вот девушки собирают упаковки и складывают их на транспортную ленту.
Транспортер подходит к границе «стерильной» зоны с сбрасывает упаковки в специальный лоток.
Вместе с упаковками из лотка выбивается мощный поток воздуха. Бактериям и прочей гадости «против шерсти» не пробраться.
Там их раскладывают на паллеты и отправляют в этот здоровенный очиститель.
Тоже безлюдно, вернее трудится всего один оператор. Тележки катаются автоматически по рельсам.
Теперь последний участок — фасовка в транспортную тару. Инсулин готов отправиться к потребителю. Народу тоже не много, даже коробки раскладывает жуткая машина на сервоприводах.
В Новоуральске строится новый корпус, который должен полностью покрыть потребность в субстанции инсулина для всей страны. Более того, часть продукции будет поставляться за рубеж - соглашения об этом уже подписаны.
Новый корпус вступит в строй через несколько месяцев. Первую партию полностью российского инсулина на «Медсинтезе» рассчитывают получить уже в первом полугодии 2013 года.
Стоимость проекта строительства нового корпуса - 2,6 млрд рублей. Площадь цеха 15 тыс. кв. м, из них 2 тыс. - лаборатории. Большая часть оборудования будет закуплена в Германии. Мощность завода должна составить 400 кг субстанции в год. Это, по оценкам экспертов, на 75 кг превышает потребность Российской Федерации.
На сегодняшний день около 2 млн россиян нуждаются в ежедневном приеме инсулина. Упаковка зарубежного препарата стоит около 600 рублей, отечественного - около 450–500 рублей. После реализации проекта стоимость должна снизиться до 300 рублей. Экономия российского бюджета при этом может составить примерно 4 млрд рублей.
Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.
Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков
Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.
При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин.
Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.
С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.
До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота
Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.
Молекула инсулина состоит из двух цепей А-цепь – 21 аминокислота и В- цепь – 30 аминокислот. Молекула стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые необходимы для ее нормального функционирования. В организме человека и животных синтезируется проинсулин, в котором А и В-цепи соединены С-пептидом. После синтеза С-пептид выщепляется под действием протеолитических ферментов с образованием инсулина.
До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:
1)недостаток поголовья скота;
2)сложности хранения и транспортировки сырья;
3)трудности выделения и очистки гормона;
4)возможность развития аллергических реакций.
Все это сделало необходимым поиск альтернативных источников получения препарата. До настоящего времени единственным вариантом такого получения является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных микроорганизмов.
В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:
1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;
Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.
2) генно-инженерным способом;
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).
Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.
1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).
2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.
4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.
6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.
Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.
Синтез методом
В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:
Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.
С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.
Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.
Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.
В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.
Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.
Из проинсулина выделяется инсулин.
Loading...