تفاعل سلسلة بوليميريز، جوهرها ومنطقة التطبيق. رد فعل سلسلة Polymerase (PCR) واستخدامه لطريقة رد الفعل سلسلة PCR PCR

منذ وقت ليس ببعيد، تم تطوير طريقة موثوقة وحساسة للغاية وسريعة لتشخيص العديد من الأمراض المعدية للشخص. تسمى هذه الطريقة تحليل "PCR". ما هو عليه، ما هو جوهره، الذي يمكنه الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة وكيفية نقله بشكل صحيح، سنقول لنا في مقالتنا.

فتح التاريخ

تستخدم أساليب PCR أيضا في تشخيص السرطان.

فوائد الطريقة

تشخيص PCR لديه عدد من الفوائد:

حساسية عالية. حتى لو لم يكن هناك سوى عدد قليل من جزيئات الحمض النووي الدقيقة، فإن تحليل PCR يحدد وجود العدوى. سوف تساعد الطريقة في الأمراض المزمنة والكامنة. في كثير من الأحيان، في مثل هذه الحالات، لا تزرع الكائنات الحية الدقيقة بطرق أخرى.
للدراسة، أي مادة مناسبة، على سبيل المثال، اللعاب، الدم، الجنس، الشعر، خلايا الظهارة للشعر. الأكثر شيوعا هو اختبار الدم ومسحة البيوتية على PCR.
لا يلزم زراعة الطويلة للمحاصيل. تسمح لك عملية التشخيص الآلي بالحصول على نتائج الدراسة بعد 4-5 ساعات.
الطريقة هي تقريبا 100٪ موثوقة. يتم تسجيل حالات واحدة فقط من نتيجة سلبية كاذبة.
القدرة على تحديد عدة أنواع من مسببات الأمراض من عينة مواد واحدة. لا يسرع هذا فقط عملية تشخيص المرض، ولكن أيضا يقلل بشكل كبير من تكاليف المواد. غالبا ما يعين الطبيب تحليلا شاملا PCR. يبلغ سعر المسح الذي يتكون من تحديد ستة مسببات الأمراض حوالي 1500 روبل.

بحيث كانت النتائج موثوقة عند إجراء دراسة PCR، من الضروري اجتياز التحليل، والامتثال لتوصيات التحضير الأولية للتشخيص:

قبل تمرير اللعاب، يجب عليك الامتناع عن الوجبات والمخدرات في 4 ساعات قبل السياج المادي. مباشرة قبل الإجراء، شطف بالماء المغلي.
يجب أن تسترشد القواعد المذكورة أعلاه وعندما تأخذ عينة من السطح الداخلي للخد. بعد شطف، يوصى بإجراء تدليك بشري خفيف لتسليط الضوء على حافة الغدة.
البول عادة ما يتم جمعها في المنزل. للقيام بذلك، تحتاج إلى قضاء مرحاض شامل للأجهزة التناسلية. في حاوية بلاستيكية معقمة، من الضروري جمع 50-60 مل من البول. لضمان نظافة المواد، يوصى بإدخال حشوة في المهبل، وسحب الذكور طي الجلد قدر الإمكان. من المستحيل التبرع بالمواد خلال فترة إفرازات الحيض.
لوضع الحيوانات المنوية، تحتاج إلى الامتناع عن الجماع الجنسي في غضون 3 أيام قبل سياج المواد. أيضا، ينصح الأطباء رفض زيارة الساونا واعتماد الحوض الساخن، وشرب الكحول والغذاء الحاد. قبل 3 ساعات من التحليل، تحتاج إلى الامتناع عن التبول.
للتسليم، على سبيل المثال، إذا كان التحليل في الكلاميديا \u200b\u200bPCR، ينصح كل من النساء والرجال بالراحة الجنسية في غضون 3 أيام. قبل أسبوعين من التحليل من المستحيل أن تأخذ الأدوية المضادة للجراثيم. لمدة أسبوع، من الضروري التوقف عن استخدام المواد الهلامية الحميمة والمراهم والشموع المهبلية والموت. قبل 3 ساعات من الدراسة، تحتاج إلى الامتناع عن التبول. أثناء الحيض، لا يتم تنفيذ سياج المواد، فقط بعد 3 أيام بعد وقف إفرازات الدم، يمكنك أن تأخذ مسحة عن الهواء المديرية.

PCR أثناء الحمل

خلال فترة الانتظار، لدى الأطفال العديد من الأمراض المعدية التي تنقلها الجنسية، تكون خطيرة للغاية بالنسبة للتنمية الطبيعية للجنين. يمكن أن تثير الأمراض المنقولة جنسيا تأخيرا داخل الرحم في التنمية أو الإجهاض أو الولادات المبكرة، عيوب الطفولة الخلقية. لذلك، من الضروري تمرير الحمل المبكر لطريقة PCR. المساعدة ضرورية عند تسجيلها - ما يصل إلى 12 أسبوعا.

يأتي سياج المواد من عنق الرحم العنقي باستخدام فرشاة خاصة. الإجراء غير مؤلم ولا يشكل خطرا على الطفل. عادة، أثناء الحمل، تحلل في طريقة الكلاميديا \u200b\u200bPCR، وكذلك على Ureablasmosis، MyCoplasmisis، Cytomegalovirus، الهربس، Papillomavirus. هذا المجمع من المسوحات يسمى PCR-6.

PCR لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية

نظرا لحقيقة أن الطريقة حساسة للغاية للتغيرات في الجسم وشروط إجراء التشخيص، قد تؤثر العديد من العوامل على النتيجة. لذلك، فإن تحليل PCR على عدوى فيروس نقص المناعة البشرية ليست طريقة موثوقة، فعاليتها هي 96-98٪. في المتبقية 2-4٪ من الحالات، فإن الاختبار يعطي نتائج إيجابية كاذبة.

ولكن في بعض الحالات دون تشخيص PCR، لا يمكن لفيروس نقص المناعة البشرية القيام به. وعادة ما يجري ذلك للأشخاص الذين لديهم نتيجة سلبية خاطئة من Elisa. تشير هذه المؤشرات إلى أن الشخص لم يطور بعد للأجسام المضادة للفيروس، ومن المستحيل أن تكشف عن زيادة كبيرة في الكمية. هذا هو بالضبط ما يمكن تحقيقه عن طريق إجراء اختبار الدم بواسطة طريقة PCR.

ضروري أيضا لتشخيص السنة الأولى من الحياة المولودة من الأم الإيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية. الطريقة هي الطريقة الوحيدة لتحديد حالة الطفل بشكل موثوق.

PCR لتشخيص التهاب الكبد

تسمح طريقة تفاعل سلسلة Polymerase للكشف عن الحمض النووي للتهاب الكبد الفيروس، ب، مع فترة طويلة قبل تكوين الأجسام المضادة للعدوى أو ظهور أعراض المرض. فعالة بشكل خاص هو تحليل PCR لالتهاب الكبد C، نظرا لعام 85٪ من الحالات، فإن مثل هذا المرض يظل بدون أعراض ودون العلاج في الوقت المناسب يذهب إلى مرحلة مزمنة.

ستساعد الكشف في الوقت المناسب من الوكيل المسبب إلى تجنب المضاعفات والمعاملة الطويلة الأجل.

فحص شامل PCR

تحليل شامل PCR: فحص رد فعل سلسلة بوليمزار، والذي يتضمن تعريف عدة أنواع في وقت واحد من الالتهابات: Mycoplasmis Genitalium، Hominis MyOplasma، GardNerners Vagynis، Candida، Trichomonas، Cytomegalovirus، الهربس من النوع الأول والثاني، السيلان، Papillomavirus. يتراوح سعر مثل التشخيص من 2000 إلى 3500 روبل. اعتمادا على العيادة المستخدمة من قبل المواد والمعدات، وكذلك على نوع التحليل: جودة عالية أو كمية كمية. ما هو ضروري في حالتك - سيقرر الطبيب. في بعض الحالات، يكفي تحديد وجود الممرض، في غيرها، على سبيل المثال، في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، يلعب العيار الكمي دورا مهما. في تشخيص جميع الوكلاء السببين أعلاه، يسمى الفحص "تحليل PCR-12".

فك تكشف نتائج التحليل

تحليل فك الرفوف PCR لا يمثل التعقيد. هناك 2 موازين فقط من المؤشر - "النتيجة الإيجابية" و "النتيجة السلبية". عند اكتشاف الوكيل المسبب، يمكن للأطباء بثقة 99٪ تؤكد وجود المرض والمضي قدما في علاج المريض. مع طريقة كمية لتحديد العدوى في الرسم البياني المقابل، سيتم تحديد مؤشر رقمي للبكتيريا المكتشفة. فقط الطبيب يمكن أن يحدد درجة المرض وتعيين العلاج اللازم.

في بعض الحالات، على سبيل المثال، في تحديد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من قبل طريقة PCR، مع نتيجة سلبية، هناك حاجة إلى استطلاعات إضافية لتأكيد المؤشرات التي تم الحصول عليها.

أين لتمرير التحليل؟

حيث تمرير تحليل PCR: في عيادة الدولة أو في مختبر خاص؟ لسوء الحظ، في المؤسسات الطبية البلدية والمعدات والأساليب غالبا ما تكون قديمة. لذلك، من الأفضل إعطاء الأفضلية للمختبرات الخاصة مع المعدات الحديثة والموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا. بالإضافة إلى ذلك، في عيادة خاصة، ستحصل على نتائج أسرع بكثير.

في موسكو، تقترح العديد من المختبرات الخاصة تحليل PCR للعدوى المختلفة. على سبيل المثال، في مثل هذه العيادات، مثل "Vita"، "عيادة معقدة"، "عائلة سعيدة"، "Uro-Pro"، وإجراء تحليل PCR. سعر المسح هو من 200 روبل. لتحديد ممرض واحد.

يمكن أن نستنتج أن تشخيص الأمراض المعدية من طريقة PCR في معظم الحالات هي طريقة سريعة وموثوقة للكشف عن الممرض في الجسم في العدوى المبكرة. ولكن لا يزال في بعض الحالات يستحق اختيار طرق أخرى لتشخيص. فقط أخصائي يمكن أن يحدد الحاجة لمثل هذه الدراسة. يتطلب تحليل فك تشفير PCR أيضا نهجا مهنيا. اتبع توصيات الطبيب ولا تعطي التحليلات بشكل مستقل ليس هناك حاجة.

غالبا ما يستخدم كطريقة صريحة للإشارة إلى الفيروسات وتحديدها.

لأول مرة، تم تطوير هذه الطريقة بواسطة K. Mulis (الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983 طن. نظرا لحساسية عالية، خصوصيته وسهولة الإعدام، يستخدم على نطاق واسع في علم الوراثة والطب الشرعي والتشخيص وغيرها من المجالات.

جوهر الطريقة هو التضخيم، أي زيادة في عدد نسخ من شظايا محددة بدقة من جزيء الحمض النووي في المختبر. في هذه الطريقة هناك آلية مصفوفة ومبدأ التكامل. سلاسلان واحدة من بولينوكلوتيد (الحمض النووي) قادرة على ملزمة لسندات الهيدروجين في واحد مزدوج، إذا كانت تسلسلات النيوكليوتيدات التي تتوافق تماما مع تسلسل النيوكليوتيدات من الآخر بحيث يمكن أن تشكل قواعدها النيتروجين أزواج الأدرين والثيمان وغوانيين وبعد

يعتمد PCR على تضخيم الحمض النووي باستخدام بوليميريز دارية مستقرة حرارية، وأداء توليف دوائر الحمض النووي التكميلي المتبادل، بدءا من اثنين من الاشعال. التمهيدي هو جزء الحمض النووي يتكون من 20-30 نوكليوتيدات. هؤلاء الاشعال (البذور) تكميلية سلاسل الحمض النووي المعاكس. أثناء توليح الحمض النووي، يتم بناء الاشعال في سلسلة جزيئات الحمض النووي الاستشعار حديثا.

عادة ما وضعت PCR في 25-40 دورة. تتضمن كل دورة ثلاث مراحل: الطابق الأول عند 92-95 درجة مئوية في الوقت نفسه، تحتل سلاسل الحمض النووي؛ الثانية - الصلب، أو إضافة الاشعال في 50-65 درجة مئوية؛ ثالثا، استطالة، أو بلمرة عند 68-72 درجة مئوية، في حين أن بوليميريز DNA ينفذ استكمالا مكملا من سلاسل مصفوفة الحمض النووي باستخدام أربعة أنواع من النيوكليوتيدات. نتيجة لدورة واحدة، يحدث مضاعفة المواد الوراثية المرغوبة. تعمل سلسلة الحمض النووي المتولدة في الدورة الأولى بمثابة مصفوفة للدورة الثانية، وما إلى ذلك بعد الدورة الأولى، فقط جزء بين اثنين من الاشعال تضخيم. وبالتالي، فإنه يشك في عدد نسخ الأقسام المضخمة، والتي تسمح 25-40 دورة إلى ملايين Nasyzinate (2 ن) شظايا الحمض النووي - المبلغ الكافي للإشارة عنها بطرق مختلفة (من خلال طريقة تحقيقات التهجين التي تحتوي على تسمية معينة ، الكهربائي، إلخ). في كثير من الأحيان لهذا الغرض، يتم استخدام طريقة الكهروميسري في جل Agarose مع تلطيخ مع إيثيديوم بروميد.

في PCR، يتم استخدام الاشعال التي لديها تسلسل فريد من مميزة النيوكليوتيدات فقط لأمراض معينة على PCR من الحمض النووي من الوكيل المسبب.

تأتي طريقة أداء PCR إلى ما يلي: يتم فصل مصفوفة الحمض النووي عن المواد قيد الدراسة؛ يجمع الأنبوب بين الحمض النووي المخصص مع خليط التضخيم، والذي يتضمن Polymerase الحمض النووي، جميع أنواع النيوكليوتيدات الأربعة، نوعين من الاشعال، MGCL، العازلة، المياه المنزلية والزيت المعدني. ثم يتم وضع أنابيب الاختبار في مكبر للصوت، وتضغط في الوضع التلقائي وفقا لبرنامج معين يتوافق مع مظهر المسارين. يتم تسجيل النتائج في كثير من الأحيان عن طريق الكهربائي في هلام أغاروز 1-2٪ في وجود بروميد الإيثيديوم، وهو متصل بشظايا الحمض النووي ويتم اكتشافه كشرائط مضيئة أثناء تشعيع جل الأشعة فوق البنفسجية على مرؤس الترانسيل. جميع إجراءات PCR تأخذ 1-2 أيام عمل.

من أجل زيادة خصوصية وحساسية PCR، يتم استخدام الخيارات المختلفة: التعشيش PCR؛ PCR مع بداية ساخنة باستخدام طبقات البارافين أو حصار مراكز البوليميريز النشط بواسطة الأجسام المضادة أحادية النسخ. بالإضافة إلى ذلك، تنتج بعض الشركات مجموعات الكاشف المحمولة لتنفيذ تضخيم الحمض النووي تتيح لك تسريع عملية PCR وتقليل إمكانية ظهور نتائج إيجابية خاطئة.

حاليا، يتم تنفيذ تقنية PCR PCR جديدة (PCR في الوقت الحقيقي). تتمثل ميزةها الأساسية في المراقبة والتحليل الكمي لتراكم منتجات تفاعل سلسلة البوليميرات والتسجيل التلقائي وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها. لا تتطلب هذه الطريقة مرحلة الكهربائي، مما يجعل من الممكن تقليل المتطلبات المختبرية ل PCR. يستخدم PCR في الوقت الحقيقي تحقيقات oligonucleucleotide المسمى الفلورسنت للكشف عن الحمض النووي في عملية تضخيمها. يسمح لك PCR في الوقت الفعلي بإجراء تحليل كامل للعينة لمدة 20-60 دقيقة والطريقة النظرية للكشف عن جزيء الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في العينة.

يتيح نظام الكشف عن المنتج في تفاعل سلسلة Polymerase "في الوقت الحقيقي" (مراقبة PCR) دورة دورة لرصد تراكم الحمض النووي المضخم. يتضمن النظام نفسه مسبار oligonucleotide، وهو قادر على الانضمام (الهجين) إلى القطاع الداخلي من الحمض النووي المستهدف. في النهاية 5، يتم وضع علامة التحقيق مع مراسل صبغ الفلورسنت (صبغة مراسل)، وعلى 3 'نهاية - مانع (صبغة quencher). نظرا لأن منتج PCR يتراكم التحقيق الهجين به، ولكن الوهج لا يحدث بسبب القرب بين المراسل والميكر. نتيجة لنسخ تسلسل البوليميريز يصل إلى 5 'نهاية المسبار. يفصل نشاط 5'-3 of Othonucleic البوليميريز تسمية الفلورسنت من الساعة الثالثة من العينة، وبالتالي تحرير مراسل الفلورسنت من اتصالها إلى مانع الإشارة، مما يؤدي إلى زيادة في مضان. يتناسب مستوى الإثارة إلى عدد منتج رد فعل معين. من المهم أن يتم تسجيل نتائج PCR بحضور مضان في أنابيب مغلقة، وبالتالي، تتم حل إحدى المشكلات الرئيسية لهذه الطريقة - مشكلة التلوث مع المكالمات.

مزايا PCR: سرعة التحليل؛ حساسية عالية وخصوصية؛ الحد الأدنى من المواد قيد الدراسة؛ من السهل الأداء والأتمتة الكاملة.

نظرا لحقيقة أن حساسية PCR يمكن أن تصل إلى اكتشاف نسخة واحدة من مصفوفة الحمض النووي، هناك درجة عالية من الخطر الحصول على نتائج إيجابية كاذبة. لذلك، يحتاج مختبر تشخيص وراثيا تحت صياغة PCR إلى أداء متطلبات خاصة بشكل مطرد لنظام التخطيط ونظام العمل.

PCR هي واحدة من الأساليب التكميلية الموجودة في التشخيصات الفيروسية. هذا التفاعل مهم جدا لتشخيص الالتهابات الفيروسية، عندما لا يمكن اكتشاف المستضدات الفيروسية أو الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس وعندما يكون وجود حمض النووي الفيروسي هو الدليل الوحيد على العدوى، خاصة عندما الإصابات الكامنة والمختلطة.

إذا وجدت خطأ، فيرجى تحديد جزء النص وانقر فوق CTRL + ENTER..

حصلت على جائزة نوبل.

في بداية طريقة استخدام الأسلوب بعد كل دورة من دورة التبريد بالتسخين، كان من الضروري إضافة إلى خليط تفاعل بوليميريز الحمض النووي، لأنه تم تعطيله في درجة حرارة عالية مطلوبة لفصل الدوائر الحلزونية DNA. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيا، وطالب الكثير من الوقت والإنزيم. في عام 1986، تم تحسين طريقة تفاعل سلسلة بوليميريز بشكل كبير. اقترح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا الحرارية. كانت هذه الإنزيمات قابلة للحرارة وتمكنت من تحمل العديد من دورات التفاعل. جعل استخدامهم من الممكن تبسيط وأتمتة PCR. تم تسليط الضوء على إحدى بوليميراز الحمض النووي الأول من البكتيريا الحرارية aquaticus. واسمى طاك.- بوليميا. عدم وجود هذا البوليميريز هو أن احتمال صنع نواة خاطئة مرتفعة بما يكفي، لأن هذا الإنزيم ليس لديه آليات تصحيح خطأ (3 "→ 5" نشاط exonuclease). Polymerase. Pfu. و Pwo.تم اختيارها من Archey تمتلك مثل هذه الآلية، واستخدامها يقلل بشكل كبير من عدد الطفرات في الحمض النووي، ولكن سرعتها (البراهين) أقل من ذلك طاك.وبعد الآن تطبيق المزيج طاك. و Pfu.لتحقيق في نفس الوقت ارتفاع معدل البلمرة ودقة النسخ العالية.

في لحظة الاختراع، عملت طريقة Cary Mullis ككيميائي صناعي (وهي توليف oligonuclecleotides، والتي استخدمت بعد ذلك اكتشاف طفرات نقطة عن طريق التهجين مع الحمض النووي الجيني) في شركة CETUS Corporation، والتي براءة اختراع طريقة PCR. في عام 1992، باع Zetus الحق في الطريقة وبراءات الاختراع للاستخدام طاك.- البلمرة من شركة هوفمان لا روش مقابل 300 مليون دولار. ومع ذلك، اتضح ذلك طاك.- تميز البوليمرازا بالكيمياء الحيوية السوفيتية A. Kaltedin و A. Slyusarenko و S. Rodetsky في عام 1980، بالإضافة إلى 4 سنوات قبل هذا المنشور السوفيتي، أي في عام 1976، أليس الكيمياء الحيويين الأمريكيون أليس شين وديفيد بارد وجون م. تريلا. في هذا الصدد، حاولت شركة بروميجا (بروميجا) إجبار روش لرفض الحقوق الحصرية لهذا الإنزيم. انتهت صلاحية براءات الاختراع الأمريكية لطريقة PCR في مارس 2005

PCR.

تستند الطريقة إلى نسخ انتخابي متعدد من قسم معين من الحمض النووي بمساعدة الإنزيمات في الظروف الاصطناعية ( في المختبر.). في الوقت نفسه، يتم نسخ الموقع فقط، والذي يرضي الشروط المحددة، وفقط إذا كان موجودا في العينة قيد الدراسة. على عكس تضخيم الحمض النووي في الكائنات الحية، (النسخ المتماثل)، بمساعدة PCR، يتم تضخيم أقسام الحمض النووي القصيرة نسبيا. في عملية PCR المعتادة، لا يزيد طول أقسام الحمض النووي المنسوخة عن 3000 زوجا أساسيا (3 كيلو بايت). بمساعدة مزيج من البلسمات المختلفة، باستخدام إضافات وتحت ظروف معينة، يمكن أن يصل طول جزء PCR إلى 20-40 ألف زوج من النيوكليوتيدات. لا يزال أقل بكثير من طول الحمض النووي للكروموسوم من الخلية النوى. على سبيل المثال، يتكون الجينوم البشري من حوالي 3 مليارات من أزواج قاعدة.

مكونات رد الفعل

بالنسبة ل PCR في أبسط الحالة، تكون المكونات التالية مطلوبة:

مصفوفة الحمض النوويتحتوي على جزء الحمض النووي المطلوب لتضخمه.
اثنين من التمهيديتكميلية من النهايات المعاكسة من دوائر مختلفة من شظية الحمض النووي المطلوب.
ثابت حراريا الحمض النووي بوليميراسي - إنزيم يحفز رد فعل بلمرة الحمض النووي. يجب أن يحتفظ polymerase للاستخدام في PCR بالنشاط في درجة حرارة عالية لفترة طويلة، لذلك يستخدمون الإنزيمات معزولة من Therghophiles - الحرارية aquaticus. (طاك بوليميريز)، البيروكوكوس فليافوس (PFU Polymerase) البيروكوكوس ويزي. (pwo polymerase) وغيرها.
deoxyribonucleadtrifhosphost. (DATP، DGTP، DCTP، DTTP).
MG 2+ الأيونات اللازمة لتشغيل البوليميريز.
محلول منظمتوفير ظروف التفاعل اللازمة - درجة الحموضة، قوة القوة الأيونية. يحتوي على الأملاح، الألبومين مصل الألبوم البقري.

لتجنب تبخر خليط التفاعل، يضاف النفط العالي المغلي إلى الأنبوب، على سبيل المثال، Vaseline. إذا تم استخدام مكبر للصوت مع غطاء ساخن، فلا يطلب من ذلك القيام به.

إضافة Pyrophosphatase يمكن أن تزيد من عائد رد فعل PCR. تحفز هذا الإنزيم تحفيز البيرفوسفات، والمنتجات الجانبية لمرفق النوكليوتترفوسفات في سلسلة الحمض النووي المتزايد، إلى فوسفاته. البيروفوسفات يمكن أن تمنع رد فعل PCR.

المديمون

يعتمد خصوصية PCR على تكوين المجمعات التكميلية بين المصفوفة والمواصفات، والأوليغونوكسلوط الاصطناعية القصيرة من 18 إلى 30 قاعدة. كل من الاشعالين متكاملين لأحد سلاسل مصفوفة سلسلة من سلسلة ويحد من بداية ونهاية المنطقة المضغوطة.

بعد تهجين المصفوفة مع التمهيدي (الصلب)، فإن الأخير بمثابة بذرة لبوليميراز الحمض النووي في توليف السلسلة التكميلية للمصفوفة (انظر).

أهم سمة من الخصائص هي نقطة الانصهار (T م) من مجمع المصفوفة التمهيدي.

T M هو درجة الحرارة التي يشكل فيها نصف مصفوفات الحمض النووي مجمعا مع التمهيدي Oligonucleotide. مظللة الحساب في المتوسط \u200b\u200bT M مقابل oligonucleotide قصيرة (وعلى شظايا الحمض النووي الطويل)، مع مراعاة تركيز K + و DMSO أيونات:

حيث L هو عدد النيوكليوتيدات في التمهيدي، K + هو التركيز المولي أيونات البوتاسيوم، G + C - مجموع جميع جوانينز والسكوتينات.

في حالة الاختيار غير الصحيح من طول التركيب الطول والنيوكليوتيد في درجة حرارة التمهيدي أو الصلب، من الممكن تشكيل مجمعات متكاملة جزئيا مع أجزاء أخرى من الحمض النووي المصفوفة، والتي يمكن أن تؤدي إلى منتجات غير محددة. يقتصر الحد العلوي لنقطة الانصهار على درجة الحرارة المثلى من البوليميريز، وهو نشاط يسقط في درجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية.

عند اختيار الاشعال، من المرغوب فيه الالتزام بالمعايير التالية:

المضخم

تين. واحد: مكبر للصوت ل PCR

يتم تنفيذ PCR في مكبر للصوت - أداة توفر أنابيب تبريد دورية وتسخين، عادة بدقة لا تقل عن 0.1 درجة مئوية تسمح لك مكبرات الصوت الحديثة بتحديد البرامج المعقدة، بما في ذلك إمكانية "بداية ساخنة"، مسند PCR (انظر أدناه) والتخزين اللاحق للجزيئات المضخمة عند 4 درجات مئوية بالنسبة ل PCR في الوقت الفعلي، يتم إصدار الأجهزة المجهزة مع كاشف الفلورسنت. هناك أيضا أدوات مع غطاء تلقائي ومقصورة من أجل microplate، والتي تتيح لك تضمينها في أنظمة آلية.

دورة رد الفعل

هلام التصوير الفوتوغرافي يحتوي على علامات الحمض النووي (أول فتحات أولية) ومنتجات PCR

عادة، أثناء PCR، يتم تنفيذ 20-35 دورة، كل منها يتكون من ثلاث مراحل (الشكل 2).

تمسخ

يتم تسخين مصفوفة الحمض النووي ذات التقت سبلها إلى 94-96 درجة مئوية (أو ما يصل إلى 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليميريز قابل للحرارة معين) بمقدار 0.5-2 دقيقة بحيث يتم فصل سلاسل الحمض النووي. وتسمى هذه المرحلة تمسخمنذ سندات الهيدروجين يتم تدميرها بين سلاسل الحمض النووي. في بعض الأحيان قبل الدورة الأولى (قبل إضافة polymerase)، يتم إجراء تسخين أولي لخليط التفاعل لمدة 2-3 دقائق للتخلص الكامل من المصفوفة والمواصفات. يسمى هذا الاستقبال بداية ساخنةيتيح لك تقليل عدد منتجات التفاعل غير المعبعة.

التلدين

عندما تم فصل الدوائر، يتم تخفيض درجة الحرارة بحيث يمكن للموزعين الاتصال بمصفوفة واحدة تقطعت بهم السبل. وتسمى هذه المرحلة التلدينوبعد تعتمد درجة حرارة الصلب على تكوين الاشعال وعادة ما يتم اختيارها تساوي نقطة انصهار للموزعين. يؤدي الاختيار الخاطئ لدرجة الحرارة الصلب إما إلى ضعف الربط للمواصفات مع مصفوفة (بدرجة حرارة مبالغ فيها)، أو ملزمة بالمكان الخطأ ومظهر المنتجات غير المعقدة (في درجات حرارة منخفضة). إن وقت المرحلة الصلب هو 30 قطعة، في نفس الوقت، خلال هذا الوقت، تمكنت البوليمر بالفعل من توليف عدة مئات من النيوكليوتيدات. لذلك، يوصى بتحديد الاشعال مع نقطة انصهار فوق 60 درجة مئوية وتنفيذ الصلب والمستطيل في نفس الوقت، عند 60-72 درجة مئوية

استطالة

DNA Polymerase تكرر الدائرة المصفوفة باستخدام التمهيدي كسلحة. هذه مرحلة استطالةوبعد يبدأ Polymerase في توليفة السلسلة الثانية من 3 "-Contizer من التمهيدي، والتي اتصلت بالمصفوفة، ويتحرك على طول المصفوفة، وتوليف السلسلة الجديدة في اتجاه 5" إلى 3 "نهاية. درجة حرارة الاستيلاء يعتمد على البوليميراز. في كثير من الأحيان تعد بوليمرزات Taq في كثير من الأحيان هي الأكثر نشاطا عند 72 درجة مئوية. يعتمد وقت الاستطلاع على حد سواء من نوع بوليميراتيز الحمض النووي وعلى طول الجزء المضغوط. عادة ما يستغرق وقت الاستطلاع على قدم المساواة دقيقة لكل ألف أزواج قاعدة. بعد نهاية جميع الدورات، غالبا ما تكون هناك خطوة إضافية الاستيلاء النهائيلإكمال جميع شظايا السلسلة الفردية. هذه المرحلة تستمر 7-10 دقائق.

تين. 2.: التمثيل التخطيطي لدورة PCR الأولى. (1) مستبد في 94-96 درجة مئوية (2) الصلب عند 68 درجة مئوية (على سبيل المثال). (3) استطالة عند 72 درجة مئوية (P \u003d Polymerase). (4) اكتمال الدورة الأولى. تخدم سلاسل الحمض النووي اثنين من اثنين من مصفوفة للدورة التالية، وبالتالي فإن كمية الحمض النووي المصفوفة خلال كل دورة تتضاعف

يزيد حجم منتج رد فعل معين (يحدها الاشعال) من الناحية النظرية بما يتناسب مع 2 N - 2N، حيث n هو عدد دورات التفاعل. في الواقع، قد تكون فعالية كل دورة أقل من 100٪، وبالتالي، في الواقع P ~ (1 + E) N، حيث P هو مقدار المنتج، E هو متوسط \u200b\u200bكفاءة الدورة.

ينمو عدد النسخ "الطويلة" من الحمض النووي أيضا، ولكن خطيا، لذلك، يهيمن على جزء محدد في منتجات رد الفعل.

إن نمو المنتج المطلوب في تقدم هندسي محدود من عدد الكواشف، ووجود مثبطات، وتشكيل المنتجات الثانوية. على الدورات الأخيرة من رد الفعل، يبطئ النمو، ويسمى "تأثير الهضبة".

أصناف PCR.

متداخل PCR. (متداخل PCR (ENG)) - يتم استخدامه لتقليل عدد المنتجات الثانوية لرد الفعل. استخدم اثنين من أزواج من الاشعال وإجراء ردود فعل متتالية. يزعم الزوج الثاني من الاشعال قسم الحمض النووي داخل منتج رد الفعل الأول.
مقلوب pcr. (معكوس PCR (الإنجليزية)) - يستخدم إذا كان جزء صغير فقط معروف داخل التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يكون من الضروري تحديد التسلسلات المجاورة بعد إدراج الحمض النووي في الجينوم. لتنفيذ برنامج PCR المقلوب، يتم إجراء عدد من القيود القلاعية من الحمض النووي مع مركب لاحق من الشظايا (الرببة). نتيجة لذلك، تكون شظايا معروفة على طرفي قسم غير معروف، وبعد ذلك يمكن تنفيذ PCR كالمعتاد.
PCR مع النسخ العكسي (عكس النسخ PCR، RT-PCR (ENG.)) - يستخدم لتضخيم تسلسل معروف أو تحديده أو تحديده من مكتبة الحمض النووي الريبي. قبل إجراء PCR العادي، تم تنفيذ توليفة جزيء الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت بهم السبل على مصفوفة مرنا مع Revertase ويتم الحصول على CDNA سلسلة واحدة، والتي يتم استخدامها كصفريات ل PCR. غالبا ما تحدد هذه الطريقة أين وعندما يتم التعبير عن بيانات الجينات.
pcr غير المتماثلة (المهندس pcr غير المتماثلة.) - يتم تنفيذها عندما يكون من الضروري أن تضخيم أساسا واحدة من سلاسل الحمض النووي الأصلي. المستخدمة في بعض طرق تحليل التسلسل والتهجين. يتم تنفيذ PCR كالمعتاد، إلا أن أحد الاشعاليات تؤخذ في فائض كبير. تعديلات هذه الطريقة هي اللغة الإنجليزية. ل. في الاذن-أ. فخT. هو-هيا xponential-pcr. (أواخر PCR)، حيث يتم استخدام الاشعال مع تركيزات مختلفة، يتم تحديد التمهيدي منخفض التركيز مع ارتفاع (درجة حرارة الانصهار) من التمهيدي التركيز العالي. يتم تنفيذ PCR بدرجة حرارة عالية الصلب، وبالتالي من الممكن الحفاظ على كفاءة التفاعل في جميع الدورات.
PCR الكمي (PCR الكمي، Q-PCR (الإنجليزية)) أو PCR في الوقت الحقيقي - تستخدم لمراقبة مباشرة قياس كمية منتج PCR معين في كل دورة رد الفعل. في هذه الطريقة، تستخدم الاشعال المسمى الفلورسنت أو مجسات الحمض النووي لقياس كمية منتج التفاعل بدقة كما هو متراكم؛ أو يتم استخدام صبغة الفلورسنت الواجهة SYBR أخضر I. التي تربط إلى الحمض النووي المزدوج. SYBR أخضر I. يوفر خيارا بسيطا واقتصاديا للكشف عن التصميم الكمي لمنتجات PCR خلال PCR في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى استخدام تحقيقات أو أولئذ من الفلورسنت. أثناء صبغ التضخيم SYBR أخضر I. تضمين في أخدود صغير من منتجات الحمض النووي PCR وتأكل أقوى مقارنة بصدقة غير ذات صلة مع إشارة الفلورسنت عند التشعيع مع ليزر أزرق. SYBR أخضر I. متوافق مع جميع الأجهزة المعروفة حتى الآن ل PCR في الوقت الحقيقي. أقصى امتصاص ل SYBR أخضر I. تقع عند الطول الموجي 494 نانومتر. بالإضافة إلى الرئيسية، في طيف صبغ هناك اثنين من امتصاص إضافي صغير Maxima - عند 290 نانومتر و 380 نانومتر. أقصى انبعاثات ل SYBR أخضر I. تقع عند الطول الموجي من 521 نانومتر (الأخضر).
الخطوة PCR. (TouchDown PCR (English)) - بمساعدة هذا النهج تقلل من تأثير الربط التمهيدي غير محدد. يتم تنفيذ الدورات الأولى في درجات حرارة أعلى درجة حرارة الصلب الأمثل، ثم كل دورة قليلة يتم تقليل درجة حرارة المراهقة تدريجيا إلى الأمثل. يتم ذلك من أجل تهجين التمهيدي بالسلسلة التكميلية من كل طولها؛ بينما مع درجة حرارة الصلب الأمثل، يتم تهجين التمهيدي جزئيا مع السلسلة التكميلية. تهجين جزئي من التمهيدي على الحمض النووي الجيني يؤدي إلى تضخيم غير محددة، إذا كان هناك العديد من المواقع الربطية للتمهيدي. في معظم الحالات، يمكن تنفيذ دورات PCR العشرة الأولى في درجة حرارة الصلب من 72-75 درجة مئوية، ثم تقلل على الفور إلى الأمثل، على سبيل المثال حتى 60-65 درجة مئوية.
طريقة المستعمرات الجزيئية (PCR في هلام، م. مستعمرة - مستعمرة PCR) - يتبولم جل AcryLamide مع جميع مكونات PCR على السطح وإجراء PCR. عند النقاط التي تحتوي على الحمض النووي الذي تم تحليله، يحدث التضخيم بتشكيل المستعمرات الجزيئية.
PCR مع تضخيم سريع من نهايات CDNA (المهندس Aplification سريع من CDNA ينتهي، سباق PCR ).
PCR شظايا طويلة (المهندس PCR طويل المدى) - تعديل PCR لتضخيم أقسام الحمض النووي الموسعة (10 آلاف وأسباب أخرى). يتم استخدام مزيج من بوليميراتين، واحدة منها بوليميريز Taq مع دليل عالي (أي، قادر على توليف سلسلة الحمض النووي الطويل في تمريرة واحدة)، والثاني - Polymerase من الحمض النووي مع نشاط exonuclease 3 "-5" عادة pfu polymerase. البوليميريز الثاني ضروري من أجل ضبط الأخطاء التي اتخذتها الأول، نظرا لأن Taq Polymerase يمنع تخليق الحمض النووي إذا لم تتم إضافة Nucleotide مكملية. هذا النوكليوتيد غير التكميلي يزيل PFU Polymerase. يتم اتخاذ مزيج من بوليميراز فيما يتعلق ب 50: 1 أو حتى أقل من 100: 1، حيث يستغرق Taq Polymerase 25-100 مرة نسبة إلى PFU Polymerase.
رابد. (المهندس تضخيم عشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال )، PCR مع تضخيم عشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال - يستخدم عندما يكون من الضروري التمييز بين الكائنات الحية بالقرب من التسلسل الوراثي، على سبيل المثال، أنواع مختلفة من النباتات المزروعة أو سلالات الكلاب أو الكائنات الحية الدقيقة القريبة. في هذه الطريقة، عادة ما يتم استخدام أحد التمهيدي صغير الحجم (حوالي 10 ص). سيكون هذا التمهيدي مكمل جزئيا عن طريق مواقع الحمض النووي العشوائية للكائنات الحية المدروسة. اختيار الشروط (طول التمهيدي، وتكوينه، درجة الحرارة، إلخ)، فمن الممكن تحقيق اختلافات مرضية في لوحات PCR للكائنات الحية.
PCR محددة (المهندس pCR المجموعة الخاصة) - PCR للحصول على تسلسلات ذات صلة داخل واحد أو بين الأنواع المختلفة، باستخدام الاشعال المحافظين لهذه التسلسلات. على سبيل المثال، اختيار الاشعال العالمي للريبوسوم 18s. و 26s. جينات لتضخيم الفاصل الورثي بين الأنواع: تسلسل الجينات 18s. و 26s. المحافظة بين الأنواع، لذلك سيتم الاحتفاظ PCR بين هذه الجينات لجميع الأنواع المدروسة. الطريقة المعاكسة هي - pCR فريدة من نوعها (المهندس pCR فريدة من نوعها.)، حيث تتكون المهمة في اختيار الاشعاليات لتضخيم تسلسل محدد فقط بين التسلسلات ذات الصلة.
PCR باستخدام بداية ساخنة (المهندس حار بدء PCR) - تعديل PCR باستخدام بوليميريز الحمض النووي، والذي يتم حظر نشاط البوليميريز في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة أو الجسم المضاد تقليد الجزيئات الصغيرة مثل القفل، وهذا هو، في وقت التفاعل في الطابق الأول في PCR. عادة ما يتم الطنب الأول عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
pcr الظاهري (الإنجليزية في السيليكون PCR، PCR الرقمية، PCR الإلكترونية، E-PCR) - الطريقة الرياضية لتحليل الكمبيوتر لتفاعل سلسلة البوليميرات النظري باستخدام قائمة الاشعال (أو مجسات الحمض النووي) تسلسلات للتنبؤ بتضخيم الحمض النووي المحتمل من الجينوم دراسة أو كروموسوم أو حلقة الحمض النووي أو أي مؤامرة الحمض النووي الأخرى.

إذا كان تسلسل النيوكليوتيد من المصفوفة معروف جزئيا أو غير معروف على الإطلاق، يمكنك استخدامه التدهور الاشعاليحتوي التسلسل الذي يحتوي على مواقع تنكسية يمكن أن تكون فيها أي قاعدة. على سبيل المثال، قد يكون تسلسل التمهيدي مثل هذا: ... ATH ...حيث n - أ، ر أو ق.

تطبيق PCR.

يستخدم PCR في العديد من المناطق للتحليلات وفي التجارب العلمية.

جرمائية

يستخدم PCR لمقارنة ما يسمى ب "البصمات الوراثية". نحتاج إلى عينة من المواد الوراثية من مسرح الجريمة - الدم، اللعاب، الحيوانات المنوية، الشعر، إلخ. مقارنة بالمواد الوراثية للمشتبه به. عدد صغير جدا من الحمض النووي، من الناحية النظرية - نسخة واحدة. الانقسام الحمض النووي في شظايا، ثم تضخيم باستخدام PCR. يتم فصل الشظايا بواسطة DNA الكهربائي. النمط الناتج من عصابات الحمض النووي ويسمى بصمة وراثية (المهندس بصمة وراثية.).

مؤسسة الأبوة

تين. 3.: نتائج الكهربائي لشظايا الحمض النووي تضخيم بواسطة PCR. (1) الأب. (2) طفل. (3) الأم. ورث الطفل بعض ميزات البصمة الوراثية لكلا الوالدين، مما أعطى بصمة جديدة فريدة من نوعها.

على الرغم من أن "بصمات الأصابع الوراثية" فريدة من نوعها (باستثناء حالة التوائم المرتين)، لا يزال من الممكن تثبيت العلاقات من خلال صنع العديد من هذه البصمات (الشكل 3). يمكن تطبيق نفس الطريقة، وتعديلها قليلا، لإنشاء القرابة التطورية بين الكائنات الحية.

تشخيص طبي

PCR يجعل من الممكن تسريعها بشكل كبير وتسهيل تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية. يتم تضخيم الجين المرغوب ب PCR باستخدام الاشعال المناسبين، ثم إرسال الطفرات. يمكن اكتشاف الالتهابات الفيروسية فور العدوى، لأسابيع أو أشهر قبل أعراض المرض.

طب شخصي

في بعض الأحيان تكون الأدوية السامة أو الحساسية لبعض المرضى. أسباب ذلك جزئيا في الفروق الفردية في الحساسية والتمثيل الغذائي للمخدرات ومشتقاتها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الوراثي. على سبيل المثال، يحتوي مريض واحد على نسبة سيتوكروم محددة (بروتين الكبد، وهو المسؤول عن عملية التمثيل الغذائي للمواد الغريبة) أكثر نشاطا، والآخر أقل. من أجل تحديد نوع Cytochrome الذي يحتوي على هذا المريض، يقترح إجراء تحليل PCR قبل تطبيق الدواء. يسمى هذا التحليل هو الجينات الوراثية الأولية (المهندس النعومة المحتملة.).

استنساخ الجينات

استنساخ الجينات (عدم الخلط بينه مع استنساخ الكائنات الحية) هو عملية فصل الجينات، ونتيجة للتلاعب المهندسي وراثيا، مما يؤدي إلى إنتاج عدد كبير من المنتجات من هذا الجين. يستخدم PCR لتضخيم الجينات، والتي يتم إدراجها بعد ذلك المتجه - جزء من الحمض النووي، يحمل الجين الأجنبي في نفسه أو مختلف، مريح للزراعة والكائن الحي. كمتجهات، على سبيل المثال، يتم استخدام البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي. عادة ما يتم استخدام جينات إلى كائن حي أجنبي للحصول على نتاج هذا الجين - الحمض النووي الريبي أو في أغلب الأحيان البروتين. وبالتالي، في كميات صناعية، يتم الحصول على العديد من البروتينات للاستخدام في الزراعة والطب، إلخ.

تين. أربعة: استنساخ الجينات باستخدام البلازميد.
(1) الحمض النووي للكروموسوم من الكائن الحي A. (2) PCR. (3) العديد من نسخ الجين الجيني أ. (4) إدراج جين في البلازميد. (5) البلازميد مع جينوم الكائن الحي أ. (6) إدخال البلازميد في الجسم V. (7) مضاعفة عدد نسخ من جين الجسم أ في الجسم ب.

تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام تسمية الفلورسنت أو النظائر المشعة ل Dideoxinucleotide PCR جزء لا يتجزأ، نظرا لأنها على وجه التحديد أثناء البلمرة لدائرة الحمض النووي، مشتقات من النيوكليوتيدات المسماة مع تسمية الفلورسنت أو المشعة. يؤدي مرفق dideoxinucleotide إلى الدائرة المركبة إلى جرف من التوليف، مما يتيح لك تحديد موقف النيوكليوتيدات المحددة بعد الانفصال في الجل.

mutagenez.

حاليا، أصبح PCR الطريقة الرئيسية لمعالجة الطبل (تعديل تسلسل النيوكليوتيد من الحمض النووي). جعل استخدام PCR لتبسيط وإسراع الإجراء الخاص بإجراء تلبيس، وكذلك جعلها أكثر موثوقية وغير قابلة للتكرار.

رد فعل سلسلة Polymerase (PCR) - طريقة دقة عالية في مجال تشخيص الأمراض الوراثية والالتهابات والأمراض الفيروسية في أي مرحلة (حادة أو مزمنة)، وكذلك - في مرحلة مبكرة - إلى مظاهر واضحة للمرض من خلال تحديد مسببات الأمراض بناء على الحمض النووي الخاص بهم، الحمض النووي الريبي والمواد الوراثية، في العينات التي يتم الحصول عليها من المريض. واليوم سنتحدث عن الجوهر، المراحل التشخيصية ومبادئ طرق تفاعل سلسلة البوليميريز (PCR)، وكذلك قيمتها.

ما هو رد فعل سلسلة بوليميريز

أساس التحليل هو تضخيم (مضاعفة) - إنشاء تعددية من نسخ من قسم الحمض النووي القصير (حمض DEOXyRibonukleic) يمثل المجمع الوراثي البشري. للدراسة، كمية صغيرة جدا من المادة الفسيولوجية (البلغم، كتلة القفلة، خردة الظهارة، عصير البروستاتا، الدم، الحيوانات المنوية، الماء الدهني، المخاط، النسيج المشيمة، البول، اللعاب، السائل الجنبي، نخبك). في الوقت نفسه، على سبيل المثال، في المسار المفرط للمريض، يمكن اكتشاف ميكروب ضار واحد.

طورت منهجية PCR (تفاعل سلسلة Polymerase) عالم أمريكي ك. موليس، في عام 1993 تلقى جائزة نوبل.

تستخدم بنشاط:

في التشخيص المبكر للالتهابات، وراثي،؛
في الفحص الشرعي، إذا كان هناك عدد صغير للغاية من الحمض النووي للدراسة؛
في الطب البيطري، الصيدلانية، علم الأحياء، الوراثة الجزيئية؛
لتحديد هوية الحمض النووي، تأكيد الأبوة؛
في علم الحفريات، الأنثروبولوجيا، البيئة (عند تتبع جودة المنتجات والعوامل البيئية).

حول حقيقة أن رد فعل سلسلة Polymerase سيقول بالتفصيل هذا الفيديو:

إلى من هو محدد

تفاعل سلسلة بوليميريز في تشخيص الأمراض المعدية هي واحدة من أكثر التقنيات موثوقية من الدقة والموثوقية الخاصة. على سبيل المثال، فإن دقة تحليل PCR على الكلاميديا \u200b\u200bوعن العديد من مسببات الأمراض الأخرى تقترب من 100٪ (المطلق). في أغلب الأحيان، يوصف عملية تفاعل سلسلة البوليميريز للمرضى الذين يعانون من صعوبات في تحديد ممرض معين في التشخيص.

اختبار المختبر PCR الاستخدام:

للكشف عن الكائنات الحية المسضية التي تسبب إصابة الأعضاء البولية والتناسلية، يصعب التعرف عليها عند استخدام المحاصيل أو طرق علم المناعة؛
لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية المتكرر في المرحلة الأولية في حالة إيجابية، ولكن تسبب في شك في أن نتيجة التحليل الأساسي (على سبيل المثال، في حديثي الولادة من الوالدين المصابة بالإيدز)؛
لإنشاء مرض ساذج في مرحلة مبكرة (دراسة طفرات oncogenes) والتصحيح الفردي لنظام العلاج في مريض معين؛
من أجل الكشف المبكر والمعاملة المحتملة للمرضات الوراثية.

وبالتالي، يدقق الآباء في المستقبل التحليل لمعرفة ما إذا كانت شركات نقل الأمراض الوراثية، في الأطفال PCR يحدد احتمال المرض الذي يحيله الميراث.

للكشف عن أمراض الجنين في الفترة المبكرة من البلى (يتم التحقيق في الخلايا الفردية من الجنين المتزايد للحصول على الطفرات الممكنة)؛
في المرضى قبل زرع الأعضاء - عن "كتابة النسيج" (تقدير توافق الأنسجة)؛
لتحديد الكائنات المسببة للأمراض الخطيرة في الدم المانح؛
في حديثي الولادة، الأطفال - لتحديد الالتهابات الخفية؛
لتقييم نتائج مكافحة الفيروسات والعلاج المضاد للميكروبات.

لماذا تمرير هذا الإجراء

نظرا لأن PCR طريقة فعالة للغاية للتشخيص، فإن إعطاء نتيجة بنسبة 100٪ تقريبا، يتم استخدام الإجراء:

لتأكيد أو القضاء على التشخيص النهائي؛
التقييم السريع لفعالية العلاج.

في كثير من الحالات، فإن PCR هو الاختبار الوحيد المحتمل للكشف عن مرض نامي، إذا كانت تقنيات التشخيص البكتيريولوجية والمناعة والفيروسية الأخرى عديمة الفائدة.

يتم اكتشاف الفيروسات باستخدام إجراء PCR مباشرة بعد العدوى وقبل ظهور علامات المرض. الكشف المبكر عن الفيروس يسمح لك بتعيين العلاج بسرعة.
يتم أيضا تحديد ما يسمى "الحمل الفيروسي" (أو - عدد الفيروسات في الجسم) عند تحليل الحمض النووي من خلال الطريقة الكمية.
الكائنات المسببة للأمراض المحددة (على سبيل المثال، عصا دروية الكوخ) صعبة ومزودة طويلا. يتيح لك تحليل PCR تحديد الحد الأدنى لعدد مسببات الأمراض (Living and Dead) في عينات مريحة للبحث.

يتم استخدام تحليل مفصل للحمض النووي المسمر:

لتحديد حساسيتها لأنواع محددة من المضادات الحيوية، والتي تسمح لك بالمضي قدما على الفور في العلاج؛
لمراقبة انتشار الأوبئة بين الحيوانات المحلية والحيوانات؛
لكشف وتتبع أنواعا معدية جديدة من الميكروبات والبحث عن مسببات الأمراض التي أثارت الأوبئة السابقة.

أنواع التشخيص

الطريقة القياسية

يتم إجراء تحليل لرد فعل سلسلة البوليميريز على أساس تضخيم متعددة (مضاعفة) من شظية معينة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام إنزيمات التمهيدية الخاصة. نتيجة لذلك، اتضح سلسلة النسخ كمية المواد الكافية للدراسة.

أثناء الإجراء، يتم نسخ الشظية المطلوبة فقط (المقابلة بالظروف المحددة المحددة) وفي حالة حدوثها بالفعل في العينة.

حول كيفية مرور PCR، يروي هذا الفيديو التفصيلي مع مخططات مفيدة:

أساليب أخرى

PCR أجريت في الوقت الحقيقيوبعد في هذا النوع من الأبحاث، يتم إطلاق عملية الكشف عن جزء من الحمض النووي المعطى بعد اجتياز كل دورة، وليس بعد السلسلة بأكملها من 30 - 40 دورة. يتيح لك هذا النوع من الدراسة الحصول على معلومات عن عدد المسارين (الفيروس أو الميكروب) في الجسم، أي تحليل كمي.
من PCR (وضع النسخ العكسي)وبعد يستخدم هذا التحليل للعثور على الحمض النووي الريبي مع سلسلة واحدة للكشف عن الفيروسات التي تعد قاعدتها الوراثية على وجه التحديد (على سبيل المثال، فيروس التهاب الكبد التهاب الكبد، المناعة الأكيار). مع هذه الدراسة، يتم استخدام إنزيم خاص - ترانسيستاسي عكس وتمثيلي معين وسلسلة واحدة تم تصميم الحمض النووي الواحد على أساس الحمض النووي الريبي. ثم من هذه السلسلة استعادة دائرة الحمض النووي الثاني ويتم تنفيذ الإجراء القياسي.

مؤشرات لعقد

يستخدم الإجراء PCR في عيادة الأمراض المعدية، علم الوليد الوليد، التوليد، طب الأطفال، علم أمراض السلول، أمراض النساء، علم الأورام، علم الأعصاب، الكلى، طب العيون.

مؤشرات لتعيين التحليل:

توضيح مخاطر تطوير التشوهات الوراثية في طفل في احتمالية الأمراض الوراثية؛
تشخيص كلا الوالدين عند التخطيط لحمل أو حالة خطيرة للأم مع الحمل؛
صعوبات في الحمل، وتحديد أسباب العقم؛
شكوك العدوى الجنسية في المرحلة الحادة ومع أعراض الانتقال إلى مزمن؛
الكشف عن أسباب العمليات الالتهابية من أصل غامض؛
اتصالات جنسية عشوائية وغير محمية؛
تحديد حساسية الكائنات الحية الدقيقة المسببة للمضادات الحيوية المحددة؛
المرضى الذين يعانون من الشك في الإصابة الخفية للكشف عن مسببات الأمراض لتطوير الأعراض الصريحة (التشخيصات السابقة)؛
المرضى لتأكيد الانتعاش بعد المرض (التشخيصات بأثر رجعي)؛

تستخدم أيضا للتشخيص إذا لزم الأمر للكشف بدقة عن مسببات الأمراض التالية ::

فيروسات التهاب الكبد (A B C G)، المناعة البشرية، cytomegalovirus؛
هزلا الكوليرا.
فيروس الهربس، الأنواع الهربفية؛
الرجعية - Adeno - و Rinoviruses؛
فيروسات الحصبة الألمانية، Epstein-Barr، فاريزيلا (Zoster - Virus)؛
بارسون - و Picovirovirus؛
البكتيريا هيليكوباكتر بيلوري؛
legionells، أنواع المسببة للأمراض المعوية؛
المكورات العنقودية الذهبية
العامل المسبب؛
كلوزتريديا، الدفتيريا وعصا الهيموفيلية؛

تستخدم وتحديد الالتهابات:

أحادية الدمية المعدية؛
borreliosis، Lemaryiosis، التهاب الدجاجة الدماغ؛
اشتعلت الفطر المبيضات.
الالتهابات الجنسية - Trichomoniasis، Ureaclasmosis، شاحب Treponema، Gardnerellosis، السيلان، Mycoplasmosis، Chlamydia؛
مرض السل.

موانع لعقد القابضة

نظرا لأن الإجراء لا يتم تنفيذه مع مريض، دون أي تأثير على الجسم، ولكن مع المواد البيولوجية التي اتخذت للبحث، فإن أي موانع ل PCR ليست بسبب عدم وجود خطر محتمل.

ومع ذلك، فإن سياج المواد الحيوية من قناة الرحم عنق الرحم لا يتم تنفيذه بعد إجراء Coloscopy. تسليم المسحات، لا يسمح بتسليم التحليل بعد 4 أيام فقط بعد نهاية الحيض وإيقاف التحديد.

هل الطريقة آمنة؟

لا يوجد تأثير سلبي على المريض مع دراسة معزولة لمادته الحيوية في ظروف المختبر أمر مستحيل.

التحضير للإجراء (التبرع بالمواد البيولوجية للتحليل)

كعينة من أجل تحليل PCR، حيث تم اكتشاف الحمض النووي لأمراض أجنبية، هناك أي سائل بيولوجي، أنسجة، مخصصات كائن حي. يتم تنفيذ سياج المادة المدروسة في شكل دماء يأخذون من الأوردة، والخردة من الحنجرة، وتجويف الأنف، قناة مجرى البول، التجويف الجنبي، عنق الرحم.

قبل إجراء التشخيص، يشرح الطبيب المريض، وسيتم اتخاذ سياج المواد:

عند فحص الالتهابات الجنسية، يتم اختيار التناسع التناسعيين، البول، السكتة الدماغية من مجرى البول.
عند تحليل الالتهابات الهربية، ViTomegalovirus، Mononukleosleos، خذ تحليل البول، تشويه من الزيا، والتهاب الكبد، والتكسيمات القمامة - الدم من فيينا.
من أجل تشخيص الأنواع المختلفة، يتم اتخاذ السوائل المخاطية.
في أمراض الرئة، عينات لتحليل - البلغم والسائل الجنبي.
عندما تكون هناك دراسة من الالتهابات داخل الرحمات المحتملة عند دخول الجنين للتحليل، يتم استخدام خلايا المياه الحديدية والمشيمة.

يعتمد دقة ودقة التحليل على عقم الشروط عند أخذ المواد. نظرا لأن دراسة PCR لديها حساسية عالية، فإن أي تلوث للمادة المدروسة يمكنه تشويه النتيجة.

التحضير المختص لتسليم المواد الحيوية لا يمثل أي صعوبات للمرضى. هناك بعض التوصيات:

عند تحليل الالتهابات الجنسية:
- القضاء على الاتصالات الحميمة 72 ساعة قبل المواد؛
- التوقف عن استخدام أي أدوات مهاجمة في 3 أيام؛
- منذ أمسية اليوم السابق، لا تدير النظافة تحت المنطقة المحتجزة؛
- استبعاد التبول لمدة 3 إلى 4 ساعات عند أخذ عينة من مجرى البول؛
التوقف عن تناول المضادات الحيوية قبل شهر من اختبارات العدوى؛
يتم تسليم الدم في الصباح حتى تناول الطعام والشرب؛
يتم جمع جزء الصباح الأول من البول في حاوية معقمة بعد مرحاض حميم دقيق.

حول كيفية تنفيذ التشخيص تحت طريقة تفاعل سلسلة Polymerase، اقرأ أدناه.

كيف هو الإجراء

عند إجراء دراسة PCR، تتكرر دورات معينة في مفاعل (مكبر للصوت أو Cycler الحراري):

الخطوة الأولى - تدوينوبعد يعلق اللعاب والدم والفترات الحيوية والعينات النسائية، البلغم، التي يتم فيها تعليق وجود مرض الحمض النووي (أو الحمض النووي)، في مكبر للصوت، حيث يتم تسخين المواد وانقسام الحمض النووي في سلاسل منفصلة يحدث.
الخطوة الثانية - إلغاء أو تبريد صغير للمواد وإضافة الاشعال إليها قادرة على الاعتراف بالمناطق المرجوة في جزيء الحمض النووي والاتصال بهم.
الخطوة الثالثة - المخففة - يحدث بعد توصيل 2 الاشعال في كل سلاسل الحمض النووي. أثناء العملية، اكتمال جزء DNA Pathogen، ويتم تشكيل نسخة.

تتكرر هذه الدورات بنوع "تفاعل السلسلة"، في كل مرة تؤدي إلى مضاعفة نسخ من شظية الحمض النووي المحددة (على سبيل المثال، شريحة حيث يتم برمجة فيروس معين). لعدة ساعات، يتم تشكيل العديد من نسخ شظية الحمض النووي، وتم اكتشاف وجودها في العينة. بعد ذلك، تحلل وتقارن النتائج مع قاعدة بيانات أنواع مختلفة من مسببات الأمراض لتحديد نوع العدوى.

حول فك النتائج واستنتاج بناء على رد فعل PCR القراءة أدناه.

نتائج فك التشفير

يتم إصدار النتيجة النهائية للدراسة في 1 - 2 أيام بعد اجتياز المواد البيولوجية. في كثير من الأحيان - بالفعل في اليوم الأول بعد التحليل.

التحليل النوعي

نفيهذه النتيجة تعني أنه في المادة المسماة عن الدراسة، لم يتم الكشف عن آثار الوكلاء السببية للعدوى.
إيجابيوالنتيجة تعني اكتشاف الفيروسات أو البكتيريا المسببة للأمراض في عينة بيولوجية بدرجة عالية جدا من الدقة في وقت تسليم المواد.

إذا كانت النتيجة إيجابية، لكن علامات زيادة العدوى لم يتم تحديدها - يطلق على هذه الحالة من الجسم "ناقلات صحية" بدون أعراض. في أغلب الأحيان، لوحظ عند تناول مادة حيوية من مكان معين (قناة عنق الرحم، مجرى البول، تجويف الفم) في الأمراض الفيروسية. العلاج في هذه الحالة غير مطلوب، ولكن بالضرورة ملاحظة طبية ثابتة، لأن هناك فرصة:

انتشار الفيروس من وسائل الإعلام والعدوى للأشخاص الأصحاء؛
تنشيط عملية وانتقال المرض في شكل مزمن.

ومع ذلك، إذا كان اختبار الدم إيجابيا، فإن هذا يشير إلى أن العدوى ضرب الجسم، وهذا لم يعد حالة من العربة، لكن الأمراض التي تتطلب علاجا محددا فوريا.

تحليل كمي

تحدد النتيجة الكمية أخصائيا خصيصا لنوع معين من العدوى. على أساسها، من الممكن تقدير درجة التطوير، مرحلة المرض، مما يجعل من الممكن تعيين العلاج المناسب بسرعة.

متوسط \u200b\u200bالسعر

يتم تحديد أسعار تفاعل سلسلة البوليميريز من قبل: نوع البحوث، وتعقيد الوكيل المسبب، صعوبة تناول المواد البيولوجية، ونوع التحليل (عالية الجودة أو كمية)، مستوى السعر في المختبر.

من ناحية أخرى، في دراسة PCR، من الممكن تحديد العديد من مسببات الأمراض في وقت واحد أثناء سياج نوع واحد من المواد للتحليل. هذا يحفظ على التحليلات المختبرية الأخرى.

تقريبا، تكلفة تحليل PCR في الروبل:

gonokokk، Gardnerwell، Trichomonada Vagynis - من 180
الكلاميديا \u200b\u200bلهاراتيس - من 190
papillomavirus - من 380 إلى 500
biocenosis من القناة البيولوجية من المسالك البولية في النساء (تقييم الكمي والعالية الجودة من Microflora) - من 800.

حتى معلومات أكثر فائدة بشأن دراسة PCR موجودة في الفيديو أدناه:

علم الوراثة للبكتيريا. معلومات للفصول الثانية.

تفاعل سلسلة بوليميريز

تفاعل سلسلة Polymerase هو طريقة تسمح بزيادة متعددة في (تضخيم) بمبلغ جزيئات الحمض النووي معينة في العينة التي تم تحليلها (بما في ذلك المواد البيولوجية أو الثقافة النقية).

المزايا الرئيسية ل PCR كطريقة تشخيصية في علم الأحياء الدقيقة هي حساسية عالية جدا تتيح للكشف عن تركيزات صغيرة للغاية من مسببات الأمراض في العينات في العينات، وخصوصية قابل للتعديل من الضرائب، والتي تتيح لك اكتشاف أو تحديد مسببات الأمراض على عام أو نوع أو فرعي مستوى المستوى. يتبع العيب الرئيسي ل PCR من حساسية عالية للغاية - الصور سهلة للغاية تلوث الحمض النووي من التحكم الإيجابي أو عينة أخرى أو منتج PCR، مما يؤدي إلى رد فعل إيجابي كاذب. هذا يفرض قيودا قاسية على الظروف التي يتم فيها خلط PCR وتعمل مع منتجات PCR جاهزة.

إجراء PCR.يتم إعداد خليط التفاعل الذي يحتوي على المكونات التالية:

الحمض النووي المحدد من العينة قيد الدراسة،

متعادل

أيونات MG2 + (ضرورية لعمل الإنزيم)،

اثنين من الاشعال جزيئات الحمض النووي المقلدة (طول أكثر من 18 إلى 24 نوكليوتيدات)، ونهايات تكميلية لدائرات مختلفة من تسلسل الحمض النووي القابل للكشف.

مزيج من deoxinucleucleotidtriphives.

البوليميريز الحمض النووي المقاوم للحرارة (Taq Polymerase يستخدم في معظم الأحيان، معزولة من الحرارية. aquaticus.).

ثم يتم وضع خليط رد الفعل هذا في مكبر للصوت، وهو في الواقع ترموستات قابل للبرمجة. في مكبر للصوت، يتم تنفيذ دورات التحول في درجة الحرارة 30-40. تتكون كل دورة من هذه الدورات من ثلاث مراحل (انظر الشكل 1):

Dubnaturation (درجة الحرارة 94 درجة مئوية) - سلاسل الهيدروجين التي تنفجر، وسلاسل الحمض النووي تباعدت.

تعدد الصلب (درجة الحرارة عادة حوالي 50-60 س ج) - ينضم الاشعال إلى نهايات دوائر الحمض النووي. بشكل عام، عندما تنخفض درجة الحرارة، فإن إعادة توحيد دوائر الحمض النووي الأصلية بدءا من العينة المدروسة (الميني) أكثر ربحية أكثر ربحية، ولكن تركيز الاشعال في خليط التفاعل للعديد من أوامر الحجم أكثر من تركيز الحمض النووي عينة (على الأقل على دورات PCR الأولي)، وبالتالي رد فعل التدفقات الصلب التمهيدي بشكل أسرع الحمض النووي. يتم تحديد درجة حرارة الصلب اعتمادا على درجات حرارة الذوبان (قضايا) من الاشعال.

المستطيل (درجة الحرارة عادة ما تكون 72 درجة مئوية) - بوليميريز DNA يكمل الاشعاليات وفقا لمصفوفة سلاسل الحمض النووي الطويلة. تتوافق درجة الحرارة مع درجة الحرارة المثلى من بوليميريز الحمض النووي المستخدمة.

يختلف الكشف عن النتائج في إصدارات مختلفة من مجموعات PCR ويوصف في قسم "أصناف PCR".

PCR المتكلم

في دورات PCR المبكرة، عدد جزيئات الحمض النووي التي تقطعت بهم السبل، يتم تحديد حجمها عن طريق المسافة بين أماكن الاشعال، الزوجي مع كل دورة. يتم تشكيل عدد صغير من جزيئات الحمض النووي الأطول، والتي يمكن إهمالها (انظر الشكل 2).

وبالتالي، في الدورات المبكرة، يتم وصف كمية منتجات PCR من قبل الصيغة M * 2 N، حيث M هو العدد الأولي للحمض النووي في العينة، n هو عدد الدورات. ثم يذهب التفاعل إلى الهضبة. ويرجع ذلك إلى تراكم منتج التفاعل، مما يقلل من تركيز الاشعال و deoxynucleothiffosposphites، وكذلك عن طريق زيادة تركيز البيروفوسفات (انظر الشكل 3).

أصناف PCR.

اتفاقية PCR.

في هذا النموذج، يقوم PCR بإجراء رد الفعل هو عدد محدد مسبقا من الدورات (30-40)، وبعد ذلك يتم تحليله ما إذا كان تراكم جزيئات الحمض النووي المزدوجة حدثت في خليط التفاعل.

هذا البديل من تركيبات PCR عند استخدامه كوسيلة للتشخيص هو طريقة نوعية. يشير رد فعل إيجابي إلى وجود كميات تتبع على الأقل من جزيئات الحمض النووي المرغوبة في العينة. رد الفعل السلبي يشير إلى غيابهم. يعد التقييم الكمي لمحتوى جزيئات الحمض النووي الأصلية في العينة بسبب رد الفعل على الهضبة.

الطريقة الرئيسية للكشف عن وجود المنتج كهربي في هلام agarose أو polyacrylamide. تنقسم منتجات PCR إلى جل تحت عمل المجال الكهربائي وفقا للوزن الجزيئي. تتم إضافة صبغة Intercalating إلى الجل (الفلورسنت في الحالة المرتبطة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل - في معظم الأحيان برومين إيثيديوم). وبالتالي، عند الإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية، سيكون من الممكن رؤية وجود أو عدم وجود شريط يقابل الحمض النووي للوزن الجزيئي المطلوب. عند إجراء PCR للأغراض التشخيصية، يتم دائما وضع سيطرة إيجابية وسالبة على التفاعل دائما، والتي تتم مقارنة العينات (انظر الشكل 4).

PCR في الوقت الحقيقي

في هذا النماذج، يقوم PCR بإجراء مبلغ منتج PCR في خليط التفاعل مسجلا باستمرار أثناء تدفق التفاعل. هذا يسمح لنا بإنشاء منحنى رد الفعل (انظر الشكل 3)، وبناء عليه، احسب عدد جزيئات الحمض النووي المطلوب في العينات.

واحدة من أنواع PCR في الوقت الفعلي - استخدام Interclaterantant، والتي تتم إضافتها مباشرة إلى خليط التفاعل (غالبا ما يستخدم Sybrgreen). نوع آخر - استخدام أحد أنواع تحقيقات الفلورسنت، ملزمة إلى قسم داخل منتج PCR، مما يجعل من الممكن زيادة خصوصية الكشف (انظر الشكل 5). يحدث مضان التدفق مباشرة في الأداة أثناء تدفق التفاعل وبعد

بالإضافة إلى إمكانية الكشف الكمي، هناك مزايا أخرى ل PCR في الوقت الفعلي مقارنة مع التقليدية. هذا الإصدار من PCR هو أبسط، سريع، ولا يتطلب أيضا اكتشاف أنابيب مع منتجات PCR، مما يقلل من احتمال تلوث العينات الأخرى. العيب الرئيسي هو أعلى قيمة مكبر للصوت مع إمكانية تكامل الكشف عن الإسفار مقارنة مع المعتاد.

PCR الكمي الرقمية

نسخة جديدة ومكلفة وحتى الآن نسخة صغيرة جدا من PCR، والتي تتيح لك تحديد مقدار الحمض النووي الأكثر دقة في العينة. في هذا النماذج، يتم تقسيم خليط التفاعل الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت إلى عدد كبير من أحجام مجهرية (على سبيل المثال، قطرات في المستحلب). بعد تحليل تدفق PCR، في أي جزء جزء من القطرات، كان رد الفعل إيجابيا، وعليه، يلاحظ الإفلز. ستكون هذه المشاركة متناسبة مع عدد جزيئات الحمض النووي المرغوبة في العينة.

PCR مع النسخ العكسي

في هذه الحالة، قبل إجراء PCR متغير معين، يتم تنفيذ النسخ العكسي (الحمض النووي الريبي في الحمض النووي) باستخدام إنزيم Revertase. وبالتالي، تتيح لك هذه الطريقة إجراء اكتشاف عالي الجودة أو الكمي لجزيئات الحمض النووي الريبي. يمكن استخدام هذا للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي أو تحديد مستوى النسخ (عدد مرنا) من الجين أو الآخر.

الصورة 1. مراحل PCR. اللون الأحمر يلفظ الاشعال.

الشكل 2.تراكم جزيئات الحمض النووي المزدوجة المحدودة من قبل الاشعال أثناء PCR.

الشكل 3.ديناميات رد الفعل PCR في تركيزات أولية مختلفة من جزيئات الحمض النووي المرغوبة في العينة. (أ) - أعلى تركيز (ب) - التركيز المتوسط \u200b\u200b(ب) - أصغر تركيز

الشكل 4.agaromic الكهربائي من منتجات PCR. K + - التحكم الإيجابي (الحمض النووي SHENS موجود). 1-7 - العينات التي تمت دراستها (منها 1-2 إيجابية، 3-7 هي سلبية). K - التحكم السلبي (الحمض النووي المطلوب مفقود بشكل واضح). في كثير من الحالات، بالإضافة إلى المنتج المستهدف، تكون منتجات التفاعل غير المحددة أخف وزنا مرئية (Dimers Primer).

الشكل 5.طرق للكشف عند استخدام PCR في الوقت الحقيقي. (أ) - صبغ الواجهة - الفلفل - الفلور عند الربط إلى الحمض النووي السابق تقطعت بهم السبل (B) - Taqman - مسبار مضان يحدث عندما يكون مسبار الحمض النووي البوليميراسي مع نشاط endonuclease 5'-3 بسبب فصل الفلوروفور والإبادة. (ج) - الجزيئية - مسبار مضان تنشأ عندما تنشأ تهجين التحقيق مع شظية مستهدفة بسبب المسافة المكانية للفلوروفور والإرهاق (G) - التحقيقات lightcycler - يحدث مضان متقبل في تهجين التحقيقات (تحتوي على المقبول والجهات المانحة) مع الجزء المستهدف بسبب نقل طاقة مضان الرنين (FRET).