पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)

पीसीआर विधि का सार। डीएनए पोलीमरेज़

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन आणविक जीव विज्ञान की एक प्रायोगिक विधि है जो जैविक सामग्री में कुछ न्यूक्लिक एसिड के टुकड़ों की छोटी सांद्रता में उल्लेखनीय वृद्धि की अनुमति देता है। डीएनए की प्रतियों की संख्या बढ़ाने की इस प्रक्रिया को कहा जाता है विस्तारण... पीसीआर के दौरान डीएनए की नकल एक विशेष एंजाइम द्वारा की जाती है - पोलीमरेज़डीएनए पोलीमरेज़ (चित्र 3) डीएनए प्रतिकृति (जीवित जीवों में डीएनए का प्रवर्धन) में शामिल एक एंजाइम है। इस वर्ग के एंजाइम डीएनए न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के साथ डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स के पोलीमराइजेशन को उत्प्रेरित करते हैं, जिसे एंजाइम "पढ़ता है" और एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करता है। एक नए न्यूक्लियोटाइड का प्रकार उस टेम्पलेट के साथ पूरकता के सिद्धांत के अनुसार निर्धारित किया जाता है जिससे इसे पढ़ा जाता है।

डीएनए पोलीमरेज़ मुक्त न्यूक्लियोटाइड को 3 "इकट्ठे हुए स्ट्रैंड के अंत में जोड़ता है। इससे 5" -3 "दिशा में स्ट्रैंड का विस्तार होता है। कोई भी ज्ञात डीएनए पोलीमरेज़ खरोंच से एक स्ट्रैंड नहीं बना सकता है: वे केवल न्यूक्लियोटाइड जोड़ सकते हैं। पहले से मौजूद 3 "-हाइड्रॉक्सिल समूह। इस कारण से, डीएनए पोलीमरेज़ की जरूरत है भजन की पुस्तक- न्यूक्लियोटाइड्स का एक छोटा अनुक्रम (आमतौर पर 20-25), अध्ययन के तहत जीन के सिरों के पूरक - जिसमें वह पहला न्यूक्लियोटाइड जोड़ सकती है। प्राइमर में हमेशा डीएनए और आरएनए बेस होते हैं, जबकि पहले दो बेस हमेशा आरएनए बेस होते हैं। प्राइमर एक अन्य एंजाइम द्वारा संश्लेषित होते हैं - प्राइमाज़ॉय... एक अन्य एंजाइम - हेलीकाप्टर- एकल-फंसे संरचना के निर्माण के साथ डीएनए डबल हेलिक्स को खोलने के लिए आवश्यक है, जो अर्ध-संरक्षित डीएनए प्रतिकृति मॉडल के अनुसार दोनों किस्में की प्रतिकृति सुनिश्चित करता है।

कुछ डीएनए पोलीमरेज़ में नए इकट्ठे डीएनए स्ट्रैंड में त्रुटियों को ठीक करने की क्षमता भी होती है। यदि न्यूक्लियोटाइड्स की एक गलत जोड़ी का पता लगाया जाता है, तो डीएनए पोलीमरेज़ को एक कदम पीछे ले जाया जाता है, श्रृंखला से गलत न्यूक्लियोटाइड को बाहर कर दिया जाता है, फिर उसके स्थान पर सही न्यूक्लियोटाइड डाला जाता है, जिसके बाद प्रतिकृति हमेशा की तरह जारी रहती है।

पीसीआर का संचालन

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक डीएनए एम्प्लीफिकेशन विधि है जो आपको कुछ घंटों के भीतर एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम को अरबों बार अलग और गुणा करने की अनुमति देती है। जीनोम के एक कड़ाई से परिभाषित क्षेत्र की बड़ी संख्या में प्रतियां प्राप्त करने की संभावना उपलब्ध डीएनए नमूने के अध्ययन को बहुत सरल बनाती है।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को अंजाम देने के लिए, कई शर्तों को पूरा करना होगा। सरलतम मामले में पीसीआर करने के लिए, निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:

डीएनए टेम्प्लेट जिसमें डीएनए का वह हिस्सा होता है जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं।

वांछित टुकड़े के सिरों के पूरक दो प्राइमर। (कृत्रिम रूप से संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एक जोड़ी, आमतौर पर आकार में 15 से 30 बीपी, लक्ष्य डीएनए के संबंधित क्षेत्रों के समान होते हैं। वे प्रवर्धन प्रतिक्रिया उत्पादों के निर्माण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सही ढंग से चयनित प्राइमरों की विशिष्टता और संवेदनशीलता प्रदान करते हैं। परीक्षण प्रणाली।)

थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़। पीसीआर में उपयोग किया जाने वाला पोलीमरेज़ लंबे समय तक उच्च तापमान पर सक्रिय रहना चाहिए, इसलिए थर्मोफाइल से पृथक एंजाइमों का उपयोग किया जाता है - थर्मस एक्वाटिकस (टाक पोलीमरेज़) और अन्य।

डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी, डीटीटीपी)।

पोलीमरेज़ के काम करने के लिए आवश्यक Mg 2+ आयन।

आवश्यक प्रतिक्रिया की स्थिति प्रदान करने वाला बफर समाधान - पीएच, समाधान की आयनिक शक्ति। इसमें लवण, सीरम एल्ब्यूमिन होता है।

प्रतिक्रिया मिश्रण के वाष्पीकरण से बचने के लिए, एक उच्च उबलते तेल, उदाहरण के लिए, वैसलीन, टेस्ट ट्यूब में जोड़ा जाता है। यदि आप गर्म ढक्कन वाले उपकरण का उपयोग कर रहे हैं, तो यह आवश्यक नहीं है।

पाइरोफॉस्फेट को जोड़ने से पीसीआर प्रतिक्रिया की उपज बढ़ सकती है। यह एंजाइम पायरोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है, जो बढ़ती डीएनए श्रृंखला में न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट को जोड़ने का एक उप-उत्पाद है, ऑर्थोफॉस्फेट को। पाइरोफॉस्फेट पीसीआर प्रतिक्रिया को रोक सकता है।

मूल डीएनए की प्रतियों की संख्या को गुणा करने के लिए, एक चक्रीय प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, क्रमिक रूप से दोहराए गए प्रत्येक पीसीआर चक्र में तीन चरण होते हैं:

1... डीएनए का विकृतीकरण, या "पिघलना"।डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्प्लेट को 0.5 - 2 मिनट के लिए 94 - 96 ° C (या 98 ° C तक, यदि विशेष रूप से थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है) तक गर्म किया जाता है ताकि डीएनए स्ट्रैंड को अलग किया जा सके। इस चरण को विकृतीकरण कहा जाता है, क्योंकि दो डीएनए स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बांड नष्ट हो जाते हैं। कभी-कभी, पहले चक्र से पहले (पोलीमरेज़ जोड़ने से पहले), प्रतिक्रिया मिश्रण को टेम्पलेट और प्राइमरों को पूरी तरह से नकारने के लिए 2 - 5 मिनट के लिए पहले से गरम किया जाता है। इस तकनीक को कहा जाता है ठोस शुरुआत, यह आपको गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा को कम करने की अनुमति देता है।

2. एनीलिंग - प्राइमरों को टेम्प्लेट डीएनए से बांधना... जब जंजीरें अलग हो जाती हैं, तो तापमान धीरे-धीरे कम हो जाता है ताकि परिमर्स एकल-फंसे मैट्रिक्स से बंध सकें। एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर इसे 50-65 डिग्री सेल्सियस चुना जाता है। स्टेज का समय - 20 - 60 सेकंड। एनीलिंग तापमान का गलत चुनाव या तो मैट्रिक्स के लिए प्राइमरों के खराब बंधन (एक ऊंचे तापमान पर), या गलत जगह पर बाध्यकारी और गैर-विशिष्ट उत्पादों की उपस्थिति (एक कम तापमान पर) की ओर जाता है।

3. संश्लेषण (श्रृंखला बढ़ाव)।डीएनए पोलीमरेज़ एक प्राइमर का उपयोग "बीज" के रूप में टेम्पलेट स्ट्रैंड को दोहराता है। पोलीमरेज़ प्राइमर के 3 'छोर से दूसरे स्ट्रैंड का संश्लेषण शुरू करता है, जो टेम्प्लेट से जुड़ता है और टेम्प्लेट के साथ चलता है। बढ़ाव तापमान पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है। अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले टाक और पीएफयू पोलीमरेज़ 72 डिग्री पर सबसे अधिक सक्रिय होते हैं। C. संश्लेषण का समय डीएनए पोलीमरेज़ के प्रकार और प्रवर्धित किए जाने वाले टुकड़े की लंबाई पर निर्भर करता है। किया गया अंतिम बढ़ावसभी एकल-फंसे टुकड़ों को पूरा करने के लिए। यह चरण 7 से 10 मिनट तक रहता है।

इसके बाद, विकृतीकरण, एनीलिंग और बढ़ाव के चरणों को कई बार (30 या अधिक बार) दोहराया जाता है। प्रत्येक चक्र में, डीएनए टुकड़े की संश्लेषित प्रतियों की संख्या दोगुनी हो जाती है।

सभी प्रतिक्रियाएं थर्मोस्टैट में डूबी हुई टेस्ट ट्यूब में की जाती हैं। तापमान शासन बदल जाता है और स्वचालित रूप से बनाए रखा जाता है।

यह समझने के लिए कि पीसीआर के दौरान एक विशिष्ट डीएनए खंड को कैसे बढ़ाया जाता है, प्रत्येक दौर में प्रवर्धित किस्में में सभी प्राइमरों की स्थिति और उनके पूरक अनुक्रमों की स्पष्ट रूप से कल्पना करना आवश्यक है। पहले दौर में, प्रत्येक नए संश्लेषित स्ट्रेंड्स अपने प्राइमर के 3'-हाइड्रॉक्सिल समूह से दूसरे प्राइमर के पूरक अनुक्रम के टर्मिनल न्यूक्लियोटाइड की दूरी से अधिक लंबा होता है। ऐसे स्ट्रैंड्स को "लॉन्ग टेम्प्लेट" कहा जाता है, वे आगे संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाएगा।

दूसरे दौर में, समान और नए संश्लेषित (लंबे टेम्पलेट) स्ट्रैंड से युक्त डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को फिर से विकृत किया जाता है और फिर प्राइमरों के साथ एनील किया जाता है। इस दौर में संश्लेषण के दौरान, "लंबे टेम्पलेट्स" को फिर से संश्लेषित किया जाता है, साथ ही एक छोर पर एक प्राइमर के साथ कई किस्में और दूसरे पर दूसरे प्राइमर ("लघु टेम्पलेट्स") के पूरक अनुक्रम के साथ। तीसरे दौर के दौरान, पहले से बने सभी हेटेरोडुप्लेक्सों को एक साथ विकृतीकृत किया जाता है और प्राइमरों के साथ annealed किया जाता है, और फिर दोहराया जाता है। बाद के दौरों में, "लघु मैट्रिक्स" की संख्या अधिक से अधिक हो जाती है, और 30 वें दौर तक उनकी संख्या पहले से ही मूल श्रृंखलाओं या "लंबी मैट्रिक्स" की संख्या से 10 6 गुना अधिक हो जाती है।

एक विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा (प्राइमर्स द्वारा सीमित) सैद्धांतिक रूप से 2 n के अनुपात में बढ़ जाती है, जहां n प्रतिक्रिया चक्रों की संख्या है। वास्तव में, प्रत्येक चक्र की दक्षता 100% से कम हो सकती है, इसलिए वास्तव में:

जहां पी उत्पाद की मात्रा है, ई चक्र की औसत दक्षता है।

"लंबी" डीएनए प्रतियों की संख्या भी बढ़ती है, लेकिन रैखिक रूप से, इसलिए प्रतिक्रिया उत्पादों में एक विशिष्ट टुकड़ा हावी होता है। आवश्यक उत्पाद की वृद्धि तेजी से अभिकर्मकों की मात्रा, अवरोधकों की उपस्थिति और उप-उत्पादों के गठन से सीमित है।

पीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील विधि है, इसलिए, यदि परीक्षण नमूने में डीएनए की एक नगण्य मात्रा भी है, जो गलती से एक प्रतिक्रिया मिश्रण से दूसरे में मिल गई है, तो गलत सकारात्मक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। इससे पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों और बर्तनों की सावधानीपूर्वक निगरानी करना आवश्यक हो जाता है।

प्राइमर चयन के मूल सिद्धांत।

पीसीआर परीक्षण प्रणाली बनाते समय, मुख्य कार्यों में से एक प्राइमर का सही चयन होता है, जिसे कई मानदंडों को पूरा करना चाहिए:

1. प्राइमर विशिष्ट होना चाहिए। प्राइमरों के 3 'सिरों पर विशेष ध्यान दिया जाता है, क्योंकि यह उनसे है कि पूरक डीएनए स्ट्रैंड टैक पोलीमरेज़ का निर्माण शुरू होता है। यदि उनकी विशिष्टता अपर्याप्त है, तो संभावना है कि टेस्ट ट्यूब में अवांछनीय प्रक्रियाएं होंगी प्रतिक्रिया मिश्रण, अर्थात्, गैर-विशिष्ट डीएनए (छोटे या लंबे टुकड़े) का संश्लेषण। यह भारी या हल्के अतिरिक्त बैंड के रूप में वैद्युतकणसंचलन पर दिखाई देता है। यह प्रतिक्रिया परिणामों के मूल्यांकन में हस्तक्षेप करता है, क्योंकि एक को भ्रमित करना आसान है संश्लेषित बाहरी डीएनए के साथ विशिष्ट प्रवर्धन उत्पाद। कुछ प्राइमर और डीएनटीपी गैर-विशिष्ट डीएनए के संश्लेषण पर खर्च किए जाते हैं, जिससे संवेदनशीलता का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है।

2. प्राइमरों को डिमर और लूप नहीं बनाना चाहिए; प्राइमरों को खुद से या एक-दूसरे से एनीलिंग करने के परिणामस्वरूप कोई भी स्थिर डबल चेन नहीं बननी चाहिए।

जो आपको जैविक सामग्री में कम मात्रा में अधिक सटीक रूप से इसके कुछ अंशों का पता लगाने और उन्हें कई बार गुणा करने की अनुमति देता है। फिर उन्हें जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नेत्रहीन रूप से पहचाना जाता है। प्रतिक्रिया 1983 में के। मुलिस द्वारा विकसित की गई थी और हाल के वर्षों की उत्कृष्ट खोजों की सूची में शामिल है।

पीसीआर के तंत्र क्या हैं

पूरी तकनीक न्यूक्लिक एसिड की स्वतंत्र रूप से दोहराने की क्षमता पर आधारित है, जिसे इस मामले में कृत्रिम रूप से प्रयोगशाला में किया जाता है। डीएनए का प्रजनन अणु के किसी भी क्षेत्र में शुरू नहीं हो सकता है, लेकिन केवल न्यूक्लियोटाइड के एक निश्चित अनुक्रम वाले क्षेत्रों में - शुरुआती टुकड़े। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन शुरू करने के लिए, प्राइमर (या डीएनए जांच) की आवश्यकता होती है। ये किसी दिए गए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के साथ डीएनए श्रृंखला के छोटे टुकड़े हैं। वे प्रारंभिक स्थलों के पूरक (अर्थात संगत) हैं

बेशक, प्राइमर बनाने के लिए, वैज्ञानिकों को तकनीक में शामिल एक के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का अध्ययन करना चाहिए। यह डीएनए जांच है जो प्रतिक्रिया और इसकी दीक्षा की विशिष्टता प्रदान करती है। यदि नमूने में वांछित डीएनए का कम से कम एक अणु नहीं है तो काम नहीं करेगा। सामान्य तौर पर, प्रतिक्रिया के लिए उपरोक्त प्राइमर, न्यूक्लियोटाइड का एक सेट और एक गर्मी प्रतिरोधी डीएनए पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है। उत्तरार्द्ध एक एंजाइम है - एक नमूने के आधार पर नए न्यूक्लिक एसिड अणुओं के संश्लेषण के लिए उत्प्रेरक। ये सभी पदार्थ, जैविक सामग्री सहित, जिसमें डीएनए की पहचान करना आवश्यक है, एक प्रतिक्रिया मिश्रण (समाधान) में संयुक्त होते हैं। इसे एक विशेष थर्मोस्टेट में रखा जाता है जो एक निश्चित समय में बहुत जल्दी गर्म और ठंडा होता है - एक चक्र। आमतौर पर उनमें से 30-50 होते हैं।

यह प्रतिक्रिया कैसे जाती है?

इसका सार यह है कि एक चक्र के दौरान, प्राइमर डीएनए के वांछित वर्गों से जुड़े होते हैं, जिसके बाद यह एक एंजाइम की क्रिया के तहत दोगुना हो जाता है। परिणामी डीएनए स्ट्रैंड के आधार पर, अणु के नए और नए समान टुकड़े बाद के चक्रों में संश्लेषित होते हैं।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन क्रमिक रूप से आगे बढ़ता है, इसके निम्नलिखित चरण प्रतिष्ठित हैं। पहले प्रत्येक हीटिंग और कूलिंग चक्र के दौरान उत्पाद की मात्रा को दोगुना करने की विशेषता है। दूसरे चरण में, प्रतिक्रिया धीमी हो जाती है, क्योंकि एंजाइम क्षतिग्रस्त हो जाता है और गतिविधि भी खो देता है। इसके अलावा, न्यूक्लियोटाइड और प्राइमर के भंडार समाप्त हो रहे हैं। अंतिम चरण में - एक पठार - उत्पाद अब जमा नहीं होते हैं, क्योंकि अभिकर्मक समाप्त हो गए हैं।

इसका उपयोग कहाँ किया जाता है

निस्संदेह, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का व्यापक अनुप्रयोग चिकित्सा और विज्ञान में है। इसका उपयोग सामान्य और निजी जीव विज्ञान, पशु चिकित्सा, फार्मेसी और यहां तक ​​कि पारिस्थितिकी में भी किया जाता है। इसके अलावा, बाद में, यह बाहरी वातावरण में भोजन और वस्तुओं की गुणवत्ता को ट्रैक करने के लिए किया जाता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन सक्रिय रूप से पितृत्व की पुष्टि करने और किसी व्यक्ति के व्यक्तित्व की पहचान करने के लिए फोरेंसिक अभ्यास में उपयोग किया जाता है। फोरेंसिक चिकित्सा परीक्षा में, साथ ही जीवाश्म विज्ञान में, यह तकनीक अक्सर एकमात्र रास्ता है, क्योंकि आमतौर पर अनुसंधान के लिए डीएनए की बहुत कम मात्रा उपलब्ध होती है। बेशक, इस पद्धति ने व्यावहारिक चिकित्सा में बहुत व्यापक आवेदन पाया है। आनुवंशिकी, संक्रामक और ऑन्कोलॉजिकल रोगों जैसे क्षेत्रों में इसकी आवश्यकता होती है।

हालाँकि, उस समय यह विचार लावारिस रहा। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन की खोज 1983 में कैरी मैलिस ने की थी। उनका लक्ष्य एक ऐसी विधि बनाना था जो डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम का उपयोग करके मूल डीएनए अणु के कई अनुक्रमिक दोहराव के दौरान डीएनए प्रवर्धन की अनुमति दे। इस विचार के प्रकाशन के 7 साल बाद 1993 में मुलिस को इसके लिए नोबेल पुरस्कार मिला।

विधि का उपयोग करने की शुरुआत में, प्रत्येक हीटिंग-कूलिंग चक्र के बाद, डीएनए पोलीमरेज़ को प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ना आवश्यक था, क्योंकि यह डीएनए हेलिक्स के स्ट्रैंड्स को अलग करने के लिए आवश्यक उच्च तापमान पर जल्दी से निष्क्रिय हो गया था। प्रक्रिया बहुत अप्रभावी थी और इसमें बहुत समय और एंजाइम की आवश्यकता होती थी। 1986 में, इसमें काफी सुधार हुआ था। थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करने का प्रस्ताव था। ये एंजाइम ऊष्मीय रूप से स्थिर पाए गए और कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम थे। उनके उपयोग ने पीसीआर को सरल और स्वचालित करना संभव बना दिया। पहले थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ में से एक को बैक्टीरिया से अलग किया गया था थर्मस एक्वाटिकसऔर नाम दिया तकी-पोलीमरेज़। इस पोलीमरेज़ का नुकसान यह है कि एक गलत न्यूक्लियोटाइड पेश करने की संभावना काफी अधिक है, क्योंकि इस एंजाइम में त्रुटि सुधार तंत्र (3 "→ 5" एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि) का अभाव है। पोलीमर्स पीएफयूतथा पवोआर्किया से पृथक एक ऐसा तंत्र है, उनके उपयोग से डीएनए में उत्परिवर्तन की संख्या में काफी कमी आती है, लेकिन उनके काम की गति (प्रक्रियात्मकता) की तुलना में कम है तकी... अब मिश्रण का उपयोग किया जाता है तकीतथा पीएफयूउच्च पोलीमराइजेशन गति और उच्च प्रतिलिपि सटीकता दोनों प्राप्त करने के लिए।

विधि के आविष्कार के समय, मल्लिस ने सेटस कॉर्पोरेशन के लिए काम किया, जिसने पीसीआर पद्धति का पेटेंट कराया। 1992 में, Cetus ने विधि और उपयोग के लिए पेटेंट के अधिकार बेच दिए तकीहॉफमैन-ला रोश कंपनी से -पोलीमरेज़ $ 300 मिलियन में। हालांकि, यह पता चला कि तकी-पोलीमरेज़ को 1980 में रूसी बायोकेमिस्ट एलेक्सी कलेडिन द्वारा चित्रित किया गया था, जिसके संबंध में प्रोमेगा कंपनी (पॉमेर्गा) ने रोश को इस एंजाइम के अनन्य अधिकारों को त्यागने के लिए अदालत में मजबूर करने की कोशिश की थी। पीसीआर पद्धति के लिए अमेरिकी पेटेंट मार्च 2005 में समाप्त हो गया।

पीसीआर का संचालन

विधि कृत्रिम परिस्थितियों में एंजाइमों का उपयोग करके एक विशिष्ट डीएनए क्षेत्र की कई चयनात्मक प्रतिलिपि पर आधारित है ( कृत्रिम परिवेशीय) इस मामले में, केवल निर्दिष्ट शर्तों को पूरा करने वाले अनुभाग की प्रतिलिपि बनाई जाती है, और केवल तभी जब वह अध्ययन के तहत नमूने में मौजूद हो। जीवित जीवों में डीएनए प्रवर्धन के विपरीत, (प्रतिकृति), डीएनए के अपेक्षाकृत छोटे वर्गों को पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धित किया जाता है। एक सामान्य पीसीआर प्रक्रिया में, कॉपी किए गए डीएनए क्षेत्रों की लंबाई ३००० बेस पेयर (३ केबीपी) से अधिक नहीं होती है। विभिन्न पोलीमरेज़ के मिश्रण का उपयोग करके, एडिटिव्स का उपयोग करके और कुछ शर्तों के तहत, पीसीआर टुकड़े की लंबाई 20-40 हजार बेस जोड़े तक पहुंच सकती है। यह अभी भी यूकेरियोटिक कोशिका के गुणसूत्र डीएनए की लंबाई से काफी कम है। उदाहरण के लिए, मानव जीनोम में लगभग 3 बिलियन बेस पेयर होते हैं।

प्रतिक्रिया घटक

सरलतम मामले में पीसीआर करने के लिए, निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:

• डीएनए मैट्रिक्सजिसमें डीएनए का वह हिस्सा होता है जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं।
• दो प्राइमरवांछित डीएनए टुकड़े के विभिन्न किस्में के विपरीत सिरों के पूरक।
• थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़- एक एंजाइम जो डीएनए पोलीमराइजेशन रिएक्शन को उत्प्रेरित करता है। पीसीआर में उपयोग के लिए पोलीमरेज़ को लंबे समय तक उच्च तापमान पर गतिविधि बनाए रखना चाहिए, इसलिए थर्मोफाइल से पृथक एंजाइमों का उपयोग किया जाता है - थर्मस एक्वाटिकस(ताक पोलीमरेज़), पाइरोकोकस फ्यूरियोसस(पीएफयू पोलीमरेज़), पाइरोकोकस वोसेई(Pwo-पोलीमरेज़) और अन्य।
• डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट(डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी, डीटीटीपी)।
• पोलीमरेज़ के काम करने के लिए आवश्यक Mg 2+ आयन।
• उभयरोधी घोलआवश्यक प्रतिक्रिया की स्थिति प्रदान करना - पीएच, समाधान की आयनिक शक्ति। इसमें लवण, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन होता है।

प्रतिक्रिया मिश्रण के वाष्पीकरण से बचने के लिए, एक उच्च उबलते तेल, उदाहरण के लिए, वैसलीन, टेस्ट ट्यूब में जोड़ा जाता है। यह आवश्यक नहीं है यदि गर्म ढक्कन वाले थर्मल साइक्लर का उपयोग किया जाता है।

पाइरोफॉस्फेट को जोड़ने से पीसीआर प्रतिक्रिया की उपज बढ़ सकती है। यह एंजाइम पायरोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है, जो बढ़ती डीएनए श्रृंखला में न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट को जोड़ने का एक उप-उत्पाद है, ऑर्थोफॉस्फेट को। पाइरोफॉस्फेट पीसीआर प्रतिक्रिया को रोक सकता है।

प्राइमरों

पीसीआर की विशिष्टता टेम्पलेट और प्राइमरों के बीच पूरक परिसरों के गठन पर आधारित है, लंबाई में 18-30 आधार छोटे सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स। प्रत्येक प्राइमर डबल-स्ट्रैंडेड टेम्प्लेट के किसी एक स्ट्रैंड का पूरक है और प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत का परिसीमन करता है।

प्राइमर (एनीलिंग) के साथ टेम्पलेट के संकरण के बाद, बाद वाला टेम्पलेट के पूरक स्ट्रैंड के संश्लेषण में डीएनए पोलीमरेज़ के लिए प्राइमर के रूप में कार्य करता है (देखें)।

प्राइमरों की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता प्राइमर-टेम्पलेट परिसर का गलनांक (T m) है। टी एम वह तापमान है जिस पर आधे डीएनए टेम्प्लेट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर के साथ एक कॉम्प्लेक्स बनाते हैं। गलनांक लगभग सूत्र द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जहां एन एक्स प्राइमर में एक्स न्यूक्लियोटाइड की संख्या है। प्राइमर या एनीलिंग तापमान की लंबाई और न्यूक्लियोटाइड संरचना के गलत विकल्प के मामले में, टेम्पलेट डीएनए के अन्य क्षेत्रों के साथ आंशिक रूप से पूरक परिसरों का गठन संभव है, जिससे गैर-विशिष्ट उत्पादों की उपस्थिति हो सकती है। गलनांक की ऊपरी सीमा पोलीमरेज़ की क्रिया के इष्टतम तापमान द्वारा सीमित होती है, जिसकी गतिविधि 80 ° C से ऊपर के तापमान पर घट जाती है।

प्राइमर चुनते समय, निम्नलिखित मानदंडों का पालन करना उचित है:

एम्पलीफायर

चावल। 1: पीसीआर के लिए एम्पलीफायर

पीसीआर एक एम्पलीफायर में किया जाता है - एक उपकरण जो आवधिक शीतलन और ट्यूबों को गर्म करता है, आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ। आधुनिक एम्पलीफायर आपको "हॉट स्टार्ट", टचडाउन पीसीआर (नीचे देखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धित अणुओं के बाद के भंडारण की संभावना सहित जटिल कार्यक्रम सेट करने की अनुमति देते हैं। रीयल-टाइम पीसीआर के लिए, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से लैस उपकरणों का उत्पादन किया जाता है। स्वचालित सिस्टम में एकीकरण के लिए एक स्वचालित ढक्कन और माइक्रोप्लेट डिब्बे के साथ उपकरण भी हैं।

प्रतिक्रिया प्रगति

मार्कर डीएनए (1) और पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पादों (2,3) युक्त जेल का फोटो। संख्याएं न्यूक्लियोटाइड जोड़े में डीएनए अंशों की लंबाई दर्शाती हैं

आमतौर पर, पीसीआर करते समय, 20-35 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं (चित्र 2)।

विकृतीकरण

डीएनए स्ट्रैंड को अलग करने की अनुमति देने के लिए डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्प्लेट को 0.5-2 मिनट के लिए 94-96 ° C (या 98 ° C यदि विशेष रूप से थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है) तक गर्म किया जाता है। इस चरण को कहा जाता है विकृतीकरणचूंकि दो डीएनए स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बांड नष्ट हो जाते हैं। कभी-कभी, पहले चक्र से पहले (पोलीमरेज़ जोड़ने से पहले), प्रतिक्रिया मिश्रण को 2-5 मिनट के लिए पहले से गरम किया जाता है। टेम्पलेट और प्राइमरों के पूर्ण विकृतीकरण के लिए। इस तकनीक को कहा जाता है ठोस शुरुआत, यह आपको गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा को कम करने की अनुमति देता है।

एनीलिंग

जब किस्में फैल जाती हैं, तो तापमान कम हो जाता है ताकि प्राइमर एकल फंसे हुए टेम्पलेट से बंध सकें। इस चरण को कहा जाता है annealing... एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर उनके गलनांक से 4-5 डिग्री सेल्सियस नीचे चुना जाता है। स्टेज का समय - 0.5-2 मिनट। एनीलिंग तापमान का गलत चुनाव या तो टेम्पलेट के लिए प्राइमरों के खराब बंधन (उच्च तापमान पर), या गलत जगह पर बाध्यकारी और गैर-विशिष्ट उत्पादों (कम तापमान पर) की उपस्थिति की ओर जाता है।

बढ़ाव

पीसीआर की किस्में

• "नेस्टेड" पीसीआर (नेस्टेड पीसीआर (इंग्लैंड।)) - प्रतिक्रिया के उप-उत्पादों की संख्या को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। दो जोड़ी प्राइमरों का उपयोग किया जाता है और दो लगातार प्रतिक्रियाएं की जाती हैं। प्राइमर की एक दूसरी जोड़ी पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद के भीतर डीएनए के खिंचाव को बढ़ाती है।
• "उलटा" पीसीआर (उलटा पीसीआर (इंग्लैंड।)) - का उपयोग उस स्थिति में किया जाता है जब वांछित अनुक्रम के भीतर केवल एक छोटा सा हिस्सा जाना जाता है। यह विधि विशेष रूप से तब उपयोगी होती है जब जीनोम में डीएनए डालने के बाद आसन्न अनुक्रमों को निर्धारित करना आवश्यक होता है। उल्टे पीसीआर को अंजाम देने के लिए, प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस के साथ डीएनए कट की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया जाता है, इसके बाद टुकड़ों (लिगेशन) को जोड़ा जाता है। नतीजतन, ज्ञात टुकड़े अज्ञात क्षेत्र के दोनों सिरों पर दिखाई देते हैं, जिसके बाद पीसीआर हमेशा की तरह किया जा सकता है।
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) का उपयोग आरएनए लाइब्रेरी से ज्ञात अनुक्रम को बढ़ाने, अलग करने या पहचानने के लिए किया जाता है। पारंपरिक पीसीआर से पहले, एक एकल-फंसे डीएनए अणु को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके एमआरएनए टेम्पलेट पर संश्लेषित किया जाता है और एक एकल-फंसे सीडीएनए प्राप्त किया जाता है, जिसका उपयोग पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है। इस पद्धति का उपयोग अक्सर यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि ये जीन कहाँ और कब व्यक्त किए जाते हैं।
• असममित पीसीआर (रस। असममित पीसीआर) - तब किया जाता है जब मूल डीएनए के मुख्य रूप से एक स्ट्रैंड को बढ़ाना आवश्यक होता है। कुछ अनुक्रमण और संकरण विश्लेषण तकनीकों में उपयोग किया जाता है। पीसीआर हमेशा की तरह किया जाता है, सिवाय इसके कि प्राइमरों में से एक को बड़ी मात्रा में लिया जाता है।
• मात्रात्मक पीसीआर (क्यू-पीसीआर) का उपयोग एक नमूने में एक विशिष्ट डीएनए, सीडीएनए या आरएनए की मात्रा को जल्दी से मापने के लिए किया जाता है।
• मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर - यह विधि जमा होने पर प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा को सटीक रूप से मापने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अभिकर्मकों का उपयोग करती है।
• टचडाउन (स्टेपडाउन) पीसीआर (टचडाउन पीसीआर) - इस विधि से उत्पाद निर्माण पर गैर-विशिष्ट प्राइमर बाइंडिंग का प्रभाव कम हो जाता है। पहले चक्र को एनीलिंग तापमान से ऊपर के तापमान पर किया जाता है, फिर तापमान हर कुछ चक्रों में कम हो जाता है। एक निश्चित तापमान पर, सिस्टम डीएनए के लिए प्राइमरों की इष्टतम विशिष्टता के बैंड से गुजरेगा।
• आण्विक कॉलोनी विधि (जेल पीसीआर) पोलोनी - पीसीआर कॉलोनी) - एक्रिलामाइड जेल को सतह पर सभी पीसीआर घटकों के साथ पोलीमराइज़ किया जाता है और पीसीआर किया जाता है। विश्लेषण किए गए डीएनए वाले बिंदुओं पर, आणविक कालोनियों के गठन के साथ प्रवर्धन होता है।
• सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन के साथ पीसीआर समाप्त होता है (रस। सीडीएनए का तेजी से प्रवर्धन समाप्त होता है, रेस-पीसीआर )
• लॉन्ग फ्रैगमेंट पीसीआर (रस। लंबी दूरी की पीसीआर) - विस्तारित डीएनए क्षेत्रों (10 हजार आधार और अधिक) के प्रवर्धन के लिए पीसीआर का संशोधन। दो पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है, जिनमें से एक उच्च प्रक्रियात्मकता के साथ टाक पोलीमरेज़ है (अर्थात, एक पास में एक लंबी डीएनए श्रृंखला को संश्लेषित करने में सक्षम), और दूसरा एक डीएनए पोलीमरेज़ है जिसमें 3 "-5" एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि है। पहले द्वारा शुरू की गई त्रुटियों को ठीक करने के लिए दूसरे पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है।
• आरएपीडी पीसीआर (इंग्लैंड। बहुरूपी डीएनए पीसीआर का यादृच्छिक प्रवर्धन , पॉलीमॉर्फिक डीएनए के यादृच्छिक प्रवर्धन के साथ पीसीआर - का उपयोग तब किया जाता है जब जीवों को आनुवंशिक अनुक्रम में करीब से अलग करना आवश्यक होता है, उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार के खेती वाले पौधे, कुत्ते की नस्लें या निकट से संबंधित सूक्ष्मजीव। यह विधि आमतौर पर एक छोटे प्राइमर (20 - 25 बीपी) का उपयोग करती है। यह प्राइमर अध्ययन किए गए जीवों के यादृच्छिक डीएनए क्षेत्रों का आंशिक रूप से पूरक होगा। शर्तों (प्राइमर लंबाई, संरचना, तापमान, आदि) का चयन करके, दो जीवों के लिए पीसीआर पैटर्न में संतोषजनक अंतर प्राप्त करना संभव है।

यदि टेम्पलेट का न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम आंशिक रूप से या बिल्कुल भी ज्ञात नहीं है, तो आप इसका उपयोग कर सकते हैं पतित प्राइमर, जिसके अनुक्रम में पतित स्थितियाँ होती हैं जिसमें कोई भी आधार स्थित हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्राइमर अनुक्रम हो सकता है: ... एटीएच ..., जहां एच ए, टी, या सी है।

पीसीआर आवेदन

पीसीआर का उपयोग कई क्षेत्रों में विश्लेषण और वैज्ञानिक प्रयोगों के लिए किया जाता है।

फोरेंसिक

पीसीआर का उपयोग तथाकथित "आनुवंशिक उंगलियों के निशान" की तुलना करने के लिए किया जाता है। अपराध स्थल से आनुवंशिक सामग्री के नमूने की आवश्यकता होती है - रक्त, लार, वीर्य, ​​बाल आदि। इसकी तुलना संदिग्ध व्यक्ति की आनुवंशिक सामग्री से की जाती है। डीएनए की एक बहुत छोटी मात्रा सैद्धांतिक रूप से पर्याप्त है - एक प्रति। डीएनए को टुकड़ों में विभाजित किया जाता है, फिर पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। डीएनए वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके टुकड़ों को अलग किया जाता है। डीएनए बैंड के स्थान के परिणामी चित्र को कहा जाता है आनुवंशिक फिंगरप्रिंट(इंजी। आनुवंशिक फिंगरप्रिंट).

पितृत्व की स्थापना

चावल। 3: पीसीआर द्वारा प्रवर्धित डीएनए अंशों के वैद्युतकणसंचलन के परिणाम। (१) पिता। (२) बच्चा। (३) माँ। बच्चे को माता-पिता दोनों की आनुवंशिक छाप की कुछ विशेषताएं विरासत में मिलीं, जिसने एक नई, अनूठी छाप दी।

यद्यपि "आनुवंशिक उंगलियों के निशान" अद्वितीय हैं (समान जुड़वाँ के मामले को छोड़कर), फिर भी ऐसे कई उंगलियों के निशान बनाकर पारिवारिक संबंध स्थापित किए जा सकते हैं (चित्र 3)। जीवों के बीच विकासवादी रिश्तेदारी स्थापित करने के लिए उसी विधि को लागू किया जा सकता है, थोड़ा संशोधित किया जा सकता है।

चिकित्सा निदान

पीसीआर वंशानुगत और वायरल रोगों के निदान में काफी तेजी लाने और सुविधा प्रदान करना संभव बनाता है। वांछित जीन को उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है और फिर उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुक्रमित किया जाता है। संक्रमण के तुरंत बाद, लक्षणों के प्रकट होने के हफ्तों या महीनों पहले वायरल संक्रमण का पता लगाया जा सकता है।

निजीकृत दवा

यह ज्ञात है कि अधिकांश दवाएं उन सभी रोगियों पर काम नहीं करती हैं जिनके लिए उनका इरादा है, लेकिन उनकी संख्या के केवल 30-70% पर। इसके अलावा, कई दवाएं कुछ रोगियों के लिए विषाक्त या एलर्जी पैदा करने वाली होती हैं। इसके कारण आंशिक रूप से दवाओं और उनके डेरिवेटिव की संवेदनशीलता और चयापचय में व्यक्तिगत अंतर हैं। ये अंतर आनुवंशिक स्तर पर निर्धारित होते हैं। उदाहरण के लिए, एक रोगी में, एक निश्चित साइटोक्रोम (विदेशी पदार्थों के चयापचय के लिए जिम्मेदार एक यकृत प्रोटीन) अधिक सक्रिय हो सकता है, दूसरे में यह कम हो सकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि किसी रोगी के पास किस प्रकार का साइटोक्रोम है, दवा का उपयोग करने से पहले एक पीसीआर विश्लेषण करने का प्रस्ताव किया गया था। इस विश्लेषण को प्रारंभिक जीनोटाइपिंग कहा जाता है (इंग्लैंड। संभावित जीनोटाइपिंग).

जीन क्लोनिंग

जीन क्लोनिंग (क्लोनिंग जीवों के साथ भ्रमित नहीं होना) जीन को अलग करने की प्रक्रिया है और, आनुवंशिक इंजीनियरिंग जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप, किसी दिए गए जीन के उत्पाद की एक बड़ी मात्रा प्राप्त करना। पीसीआर का उपयोग जीन को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिसे बाद में में डाला जाता है वेक्टर- एक डीएनए टुकड़ा जो एक विदेशी जीन को उसी या दूसरे में स्थानांतरित करता है, जो बढ़ने के लिए सुविधाजनक है, जीव। जैसे वैक्टर का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, प्लास्मिड या वायरल डीएनए। एक विदेशी जीव में जीन का सम्मिलन आमतौर पर इस जीन के उत्पाद को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है - आरएनए या, अधिक बार, एक प्रोटीन। इस प्रकार, कृषि, चिकित्सा आदि में उपयोग के लिए औद्योगिक मात्रा में कई प्रोटीन प्राप्त होते हैं।

चावल। 4: प्लाज्मिड का उपयोग करके जीन का क्लोन बनाना। ...
(१) जीव ए का गुणसूत्र डीएनए (२) पीसीआर। (३) जीव ए के जीन की कई प्रतियां। (४) प्लास्मिड में जीन का सम्मिलन। (५) जीव के जीन के साथ प्लाज्मिड ए। (६) जीव बी में प्लास्मिड का परिचय। (७) जीव बी में जीव ए के जीन की प्रतियों की संख्या का गुणन।

डीएनए श्रृंखला बनाना

फ्लोरोसेंटली लेबल या रेडियोधर्मी आइसोटोप डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके अनुक्रमण विधि में, पीसीआर एक अभिन्न अंग है, क्योंकि यह पोलीमराइजेशन के दौरान होता है कि फ्लोरोसेंट या रेडियोधर्मी लेबल के साथ लेबल किए गए न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव को डीएनए स्ट्रैंड में शामिल किया जाता है। यह प्रतिक्रिया को रोकता है, जेल में संश्लेषित किस्में को अलग करने के बाद विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड की स्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है।

म्युटाजेनेसिस

वर्तमान में, पीसीआर उत्परिवर्तन को अंजाम देने का मुख्य तरीका बन गया है। पीसीआर के उपयोग ने उत्परिवर्तन को अंजाम देने की प्रक्रिया को सरल और तेज करने के साथ-साथ इसे और अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाना संभव बना दिया।

1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)

2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि का सिद्धांत

२.१ प्रतिक्रिया मिश्रण में कई घटकों की उपस्थिति

२.२ चक्रीय तापमान की स्थिति

२.३ प्राइमर चयन के बुनियादी सिद्धांत

२.४ "पठार" प्रभाव

3. पीसीआर उत्पादन के चरण

३.२ प्रवर्धन

3.4.1 सकारात्मक नियंत्रण

3.4.2 आंतरिक नियंत्रण

४.१ गुणात्मक विश्लेषण

4.1.2 आरएनए अणुओं का पता लगाना

३.१ जैविक सामग्री का नमूना तैयार करना

डीएनए निष्कर्षण के लिए, कार्यों के आधार पर विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है। उनका सार एक जैविक उत्पाद से डीएनए के निष्कर्षण (निष्कर्षण) और पीसीआर के लिए उपयुक्त शुद्धता के साथ डीएनए तैयारी प्राप्त करने के लिए अशुद्धियों को हटाने या बेअसर करने में निहित है।

मार्मुर द्वारा वर्णित शुद्ध डीएनए तैयार करने की विधि को मानक माना जाता है और यह पहले से ही क्लासिक बन चुकी है। इसमें एंजाइमैटिक प्रोटियोलिसिस शामिल है जिसके बाद डीप्रोटीनाइजेशन और अल्कोहल के साथ डीएनए रिप्रेजर्वेशन होता है। यह विधि आपको शुद्ध डीएनए तैयारी प्राप्त करने की अनुमति देती है। हालांकि, यह काफी श्रमसाध्य है और इसमें फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे आक्रामक और तीखे पदार्थों के साथ काम करना शामिल है।

बूम एट अल द्वारा प्रस्तावित डीएनए निष्कर्षण विधि वर्तमान में लोकप्रिय तरीकों में से एक है। यह विधि सेल लिसिस के लिए एक मजबूत कैओट्रोपिक एजेंट, गुआनिडाइन थियोसाइनेट (GuSCN) के उपयोग पर आधारित है, और एक वाहक (कांच के मोती, डायटोमेसियस पृथ्वी, कांच "दूध", आदि) पर डीएनए के बाद के सोखना पर आधारित है। धोने के बाद, डीएनए नमूने में रहता है, एक वाहक पर सोख लिया जाता है, जिससे इसे रेफरेंस बफर का उपयोग करके आसानी से हटाया जा सकता है। प्रवर्धन के लिए नमूना तैयार करने के लिए विधि सुविधाजनक, तकनीकी और उपयुक्त है। हालांकि, वाहक पर अपरिवर्तनीय सोखने के साथ-साथ कई धोने की प्रक्रिया में डीएनए की हानि संभव है। नमूने में डीएनए की थोड़ी मात्रा के साथ काम करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, GuSCN की ट्रेस मात्रा भी पीसीआर को बाधित कर सकती है। इसलिए, इस पद्धति का उपयोग करते समय, शर्बत का सही विकल्प और तकनीकी बारीकियों का सावधानीपूर्वक पालन बहुत महत्वपूर्ण है।

नमूना तैयार करने के तरीकों का एक अन्य समूह चिलेक्स-प्रकार के आयन एक्सचेंजर्स के उपयोग पर आधारित है, जो कांच के विपरीत, डीएनए का विज्ञापन नहीं करते हैं, लेकिन इसके विपरीत, अशुद्धियाँ जो प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करती हैं। एक नियम के रूप में, इस तकनीक में दो चरण शामिल हैं: नमूना उबालना और आयन एक्सचेंजर पर अशुद्धियों का शर्बत। निष्पादन की सादगी के लिए विधि अत्यंत आकर्षक है। ज्यादातर मामलों में, यह नैदानिक ​​सामग्री के साथ काम करने के लिए उपयुक्त है। दुर्भाग्य से, कभी-कभी ऐसी अशुद्धियों के नमूने होते हैं जिन्हें आयन एक्सचेंजर्स का उपयोग करके हटाया नहीं जा सकता है। इसके अलावा, कुछ सूक्ष्मजीवों को साधारण उबालने से नष्ट नहीं किया जा सकता है। इन मामलों में, नमूना प्रसंस्करण के अतिरिक्त चरणों को शुरू करना आवश्यक है।

इस प्रकार, नमूना तैयार करने की विधि के चुनाव पर विचार विश्लेषण के उद्देश्यों की समझ के साथ किया जाना चाहिए।

३.२ प्रवर्धन

प्रवर्धन प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए, एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना और उसमें विश्लेषण किए गए डीएनए नमूने को जोड़ना आवश्यक है। इस मामले में, प्राइमर एनीलिंग की कुछ विशेषताओं को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। तथ्य यह है कि, एक नियम के रूप में, विश्लेषण किए गए जैविक नमूने में विभिन्न प्रकार के डीएनए अणु होते हैं, जिनके लिए प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर आंशिक होते हैं, और कुछ मामलों में महत्वपूर्ण, होमोलॉजी। इसके अलावा, प्राइमर प्राइमर डिमर बनाने के लिए एक दूसरे से जुड़ सकते हैं। दोनों उप-उत्पाद (गैर-विशिष्ट) प्रतिक्रिया उत्पादों के संश्लेषण के लिए प्राइमरों की एक महत्वपूर्ण खपत की ओर ले जाते हैं और परिणामस्वरूप, सिस्टम की संवेदनशीलता को काफी कम कर देते हैं। इससे वैद्युतकणसंचलन के दौरान प्रतिक्रिया के परिणामों को पढ़ना मुश्किल या असंभव हो जाता है।

3.3 प्रतिक्रिया परिणामों का आकलन

पीसीआर परिणामों के सही आकलन के लिए यह समझना महत्वपूर्ण है कि यह विधि मात्रात्मक नहीं है। सैद्धांतिक रूप से, 30-35 चक्रों के बाद वैद्युतकणसंचलन द्वारा एकल लक्ष्य डीएनए अणुओं के प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में, यह केवल उन मामलों में किया जाता है जहां प्रतिक्रिया आदर्श के करीब स्थितियों में होती है, जो अक्सर जीवन में नहीं होती है। डीएनए की तैयारी की शुद्धता की डिग्री का प्रवर्धन दक्षता पर विशेष रूप से बहुत प्रभाव पड़ता है, अर्थात। प्रतिक्रिया मिश्रण में कुछ अवरोधकों की उपस्थिति, जिससे कुछ मामलों में छुटकारा पाना बेहद मुश्किल हो सकता है। कभी-कभी, उनकी उपस्थिति के कारण, हजारों लक्षित डीएनए अणुओं को भी बढ़ाना संभव नहीं होता है। इस प्रकार, लक्ष्य डीएनए की प्रारंभिक मात्रा और प्रवर्धन उत्पादों की अंतिम मात्रा के बीच अक्सर कोई सीधा संबंध नहीं होता है।

3.3.1 क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन विधि

प्रवर्धन के परिणामों की कल्पना करने के लिए विभिन्न विधियों का उपयोग किया जाता है। आज सबसे आम तरीका वैद्युतकणसंचलन है, जो आकार के आधार पर डीएनए अणुओं के पृथक्करण पर आधारित है। ऐसा करने के लिए, agarose जेल की एक प्लेट तैयार करें, जो एक वैद्युतकणसंचलन बफर agarose में 1.5-2.5% की एकाग्रता में पिघलने के बाद एक विशेष डीएनए डाई के अलावा, उदाहरण के लिए, एथिडियम ब्रोमाइड के साथ जमी है। जमे हुए agarose एक स्थानिक जाली बनाता है। कंघी से भरते समय, जेल में विशेष कुएं बनते हैं, जिसमें प्रवर्धन उत्पादों को बाद में पेश किया जाता है। जेल प्लेट को एक क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन उपकरण में रखा जाता है और एक निरंतर वोल्टेज स्रोत जुड़ा होता है। जेल में ऋणात्मक रूप से आवेशित डीएनए माइनस से प्लस की ओर बढ़ना शुरू कर देता है। इस मामले में, छोटे डीएनए अणु लंबे लोगों की तुलना में तेजी से आगे बढ़ते हैं। जेल में डीएनए आंदोलन की गति agarose की एकाग्रता, विद्युत क्षेत्र की ताकत, तापमान, वैद्युतकणसंचलन बफर की संरचना और कुछ हद तक, डीएनए की जीसी संरचना से प्रभावित होती है। एक ही आकार के सभी अणु एक ही गति से चलते हैं। डाई को प्लानर समूहों में डीएनए अणुओं में अंतःस्थापित (अंतःस्थापित) किया जाता है। 10 मिनट से 1 घंटे तक चलने वाले वैद्युतकणसंचलन की समाप्ति के बाद, जेल को पराबैंगनी रेंज (254 - 310 एनएम) में प्रकाश उत्सर्जित करने वाले एक ट्रांसिल्यूमिनेटर के फिल्टर पर रखा जाता है। 260 एनएम क्षेत्र में डीएनए द्वारा अवशोषित यूवी ऊर्जा को डाई में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे यह दृश्यमान स्पेक्ट्रम (590 एनएम) के नारंगी-लाल क्षेत्र में प्रतिदीप्त हो जाता है।

प्रवर्धन उत्पादों के बैंड की चमक भिन्न हो सकती है। हालाँकि, यह नमूने में लक्ष्य डीएनए की प्रारंभिक मात्रा से संबंधित नहीं हो सकता है।

3.3.2 लंबवत वैद्युतकणसंचलन विधि

ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन की विधि मूल रूप से क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन के समान है। उनका अंतर इस तथ्य में निहित है कि इस मामले में agarose के बजाय पॉलीएक्रिलामाइड जैल का उपयोग किया जाता है। यह ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन के लिए एक विशेष कक्ष में किया जाता है। पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन में agarose वैद्युतकणसंचलन की तुलना में एक उच्च संकल्प है और एक न्यूक्लियोटाइड की सटीकता के साथ विभिन्न आकारों के डीएनए अणुओं को भेद करना संभव बनाता है। पॉलीएक्रिलामाइड जेल की तैयारी agarose जेल की तुलना में कुछ अधिक जटिल है। इसके अलावा, एक्रिलामाइड एक जहरीला पदार्थ है। चूंकि 1 न्यूक्लियोटाइड की सटीकता के साथ प्रवर्धन उत्पाद के आकार को निर्धारित करने की आवश्यकता शायद ही कभी उत्पन्न होती है, इसलिए नियमित कार्य में क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन विधि का उपयोग किया जाता है।

३.४ प्रवर्धन प्रतिक्रिया के पारित होने पर नियंत्रण

3.4.1 सकारात्मक नियंत्रण

वांछित सूक्ष्मजीव की डीएनए तैयारी का उपयोग "सकारात्मक नियंत्रण" के रूप में किया जाता है। गैर-विशिष्ट आयाम एक नियंत्रण डीएनए तैयारी के साथ प्रवर्धन द्वारा उत्पन्न एम्पलीकॉन्स से आकार में भिन्न होते हैं। गैर-विशिष्ट उत्पादों का आकार सकारात्मक नियंत्रण से बड़ा या छोटा हो सकता है। सबसे खराब स्थिति में, ये आयाम मेल खा सकते हैं और वैद्युतकणसंचलन में सकारात्मक के रूप में पढ़े जाते हैं।

परिणामी प्रवर्धन उत्पाद की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए, एंजाइम लेबल या रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ लेबल किए गए संकरण जांच (प्रवर्धित अनुक्रम के अंदर स्थित डीएनए क्षेत्र) और डीएनए के साथ बातचीत का उपयोग प्राइमरों के समान सिद्धांतों के अनुसार किया जा सकता है। यह विश्लेषण को काफी जटिल और लंबा करता है, और इसकी लागत काफी बढ़ जाती है।

3.4.2 आंतरिक नियंत्रण

प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ प्रत्येक ट्यूब में प्रवर्धन के पाठ्यक्रम को नियंत्रित करना आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, एक अतिरिक्त, तथाकथित "आंतरिक नियंत्रण" का उपयोग किया जाता है। यह कोई भी डीएनए तैयारी है जो लक्ष्य सूक्ष्मजीव के डीएनए के समान नहीं है। यदि प्रतिक्रिया मिश्रण में आंतरिक नियंत्रण जोड़ा जाता है, तो यह प्राइमर एनीलिंग के लिए वांछित संक्रामक एजेंट के क्रोमोसोमल डीएनए के समान लक्ष्य बन जाएगा। आंतरिक नियंत्रण के प्रवर्धन उत्पाद का आकार चुना जाता है ताकि यह सूक्ष्मजीव के वांछित डीएनए के प्रवर्धन से बनने वाले एम्पलीकॉन्स से 2 या अधिक गुना बड़ा हो। नतीजतन, यदि आंतरिक नियंत्रण डीएनए को परीक्षण नमूने के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है, तो जैविक नमूने में सूक्ष्मजीव की उपस्थिति की परवाह किए बिना, आंतरिक नियंत्रण विशिष्ट एम्पलीकॉन्स के गठन का कारण होगा, लेकिन बहुत लंबा (भारी) ) सूक्ष्मजीव एम्प्लिकॉन की तुलना में। प्रतिक्रिया मिश्रण में भारी एम्पलीकॉन्स की उपस्थिति प्रवर्धन प्रतिक्रिया की सामान्य प्रगति और अवरोधकों की अनुपस्थिति का संकेत देगी। यदि आवश्यक आकार के आयाम नहीं बने थे, लेकिन आंतरिक नियंत्रण के आयाम भी नहीं बने थे, तो यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि विश्लेषण किए गए नमूने में अवांछनीय अशुद्धियाँ हैं, जिन्हें समाप्त किया जाना चाहिए, लेकिन वांछित डीएनए की अनुपस्थिति के बारे में नहीं। .

दुर्भाग्य से, इस दृष्टिकोण के सभी आकर्षण के बावजूद, इसमें एक महत्वपूर्ण दोष है। यदि आवश्यक डीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण में है, तो प्राइमरों के आंतरिक नियंत्रण के साथ प्रतिस्पर्धा के कारण इसके प्रवर्धन की दक्षता तेजी से कम हो जाती है। परीक्षण नमूने में डीएनए की कम सांद्रता में यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिससे गलत नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।

फिर भी, यदि प्राइमरों के लिए प्रतिस्पर्धा की समस्या हल हो जाती है, तो प्रवर्धन दक्षता को नियंत्रित करने की यह विधि निश्चित रूप से बहुत उपयोगी होगी।

4. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन पर आधारित तरीके

४.१ गुणात्मक विश्लेषण

पीसीआर प्रदर्शन की शास्त्रीय पद्धति, जिसके सिद्धांतों को ऊपर उल्लिखित किया गया था, ने पीसीआर की सीमाओं पर काबू पाने और प्रतिक्रिया की दक्षता बढ़ाने के उद्देश्य से कुछ संशोधनों में इसका विकास पाया।

4.1.1 "हॉट स्टार्ट" का उपयोग करके पीसीआर स्थापित करने की विधि

प्रवर्धन प्रतिक्रिया के गैर-विशिष्ट उत्पादों के गठन के जोखिम को कम करने के लिए, "हॉट स्टार्ट" ("हॉट-स्टार्ट") नामक एक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।

तथ्य यह है कि, जीसी संरचना और आकार के आधार पर, प्राइमरों का एक निश्चित गलनांक (टीएम) होता है। यदि सिस्टम का तापमान Tm से अधिक हो जाता है, तो प्राइमर डीएनए स्ट्रैंड और डेन्चर का पालन करने में असमर्थ होता है। इष्टतम परिस्थितियों में, अर्थात्। पिघलने के तापमान के करीब तापमान को कम करने के लिए, प्राइमर केवल अपनी पूर्ण पूरकता की स्थिति के तहत एक डबल-स्ट्रैंडेड अणु बनाता है और इस प्रकार, प्रतिक्रिया की विशिष्टता सुनिश्चित करता है।

हॉट स्टार्ट को लागू करने के लिए कई विकल्प हैं:

ट्यूब को विकृतीकरण तापमान तक गर्म करने के बाद पहले चक्र के दौरान प्रतिक्रिया मिश्रण में टाक-पोलीमरेज़ का परिचय।

पैराफिन परत के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण के अवयवों को परतों में अलग करना (निचले भाग में - प्राइमर, ऊपरी भाग में - टैक-पोलीमरेज़ और डीएनए लक्ष्य), जो पैराफिन के पिघलने पर मिश्रित होते हैं (~ 65-75 0 )

टैक पोलीमरेज़ के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से बंधे एंजाइम पहले विकृतीकरण चरण के बाद ही सक्रिय हो जाते हैं, जब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अपरिवर्तनीय रूप से टाक पोलीमरेज़ की सक्रिय साइटों को अस्वीकार कर देते हैं।

इन सभी मामलों में, भले ही तापमान चक्र की शुरुआत से पहले गैर-विशिष्ट एनीलिंग हुई हो, बढ़ाव नहीं होता है, और गर्म होने पर, प्राइमर-डीएनए परिसरों को विकृत कर दिया जाता है, इसलिए गैर-विशिष्ट उत्पाद नहीं बनते हैं। इसके बाद, टेस्ट ट्यूब में तापमान पिघलने के तापमान से नीचे नहीं गिरता है, जो एक विशिष्ट प्रवर्धन उत्पाद के गठन को सुनिश्चित करता है।

4.1.2 आरएनए अणुओं का पता लगाना

पीसीआर के लिए एक लक्ष्य के रूप में आरएनए का उपयोग करने की संभावना इस पद्धति के अनुप्रयोगों की सीमा का काफी विस्तार करती है। उदाहरण के लिए, कई वायरस (हेपेटाइटिस सी, इन्फ्लूएंजा वायरस, पिकोर्नवायरस, आदि) के जीनोम आरएनए द्वारा दर्शाए जाते हैं। साथ ही, उनके जीवन चक्र में डीएनए में परिवर्तन का कोई मध्यवर्ती चरण नहीं होता है। आरएनए का पता लगाने के लिए सबसे पहले इसे डीएनए के रूप में बदलना जरूरी है। इसके लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाता है, जिसे दो अलग-अलग वायरस से अलग किया जाता है: एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस और मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस। इन एंजाइमों का उपयोग कुछ कठिनाइयों से जुड़ा है। सबसे पहले, वे थर्मोलैबाइल हैं और इसलिए इसका उपयोग 42 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर नहीं किया जा सकता है। चूंकि इस तापमान पर आरएनए अणु आसानी से माध्यमिक संरचनाएं बनाते हैं, प्रतिक्रिया दक्षता काफ़ी कम हो जाती है और विभिन्न अनुमानों के अनुसार, लगभग 5% है। थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव थर्मस थर्मोफिलस से प्राप्त थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ का उपयोग करके इस कमी को दूर करने का प्रयास किया जा रहा है, जो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के रूप में एमएन 2+ की उपस्थिति में ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि प्रदर्शित करता है। यह एकमात्र ज्ञात एंजाइम है जो पोलीमरेज़ और ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि दोनों को प्रदर्शित करने में सक्षम है।

प्रतिक्रिया मिश्रण में और साथ ही पीसीआर में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए, प्राइमर को प्राइमर के रूप में और एक निर्माण सामग्री के रूप में 4 डीएनटीपी के मिश्रण के रूप में मौजूद होना चाहिए।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के बाद, परिणामी सीडीएनए अणु पीसीआर के लिए एक लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं।

5. पीसीआर की स्थापना की तकनीकी प्रक्रिया का संगठन

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन की संभावित उच्च संवेदनशीलता विशेष रूप से संपूर्ण पीसीआर प्रयोगशाला डिजाइन को आवश्यक बनाती है। यह विधि की सबसे तीव्र समस्या के कारण है - संदूषण।

संदूषण बाहरी वातावरण से विशिष्ट डीएनए अणुओं की प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रवेश है जो प्रवर्धन प्रतिक्रिया में लक्ष्य के रूप में काम कर सकता है और झूठे सकारात्मक परिणाम दे सकता है।

इस अप्रिय घटना से निपटने के कई तरीके हैं। उनमें से एक एंजाइम एन-यूरैसिल-ग्लाइकोसिलेज (यूजी) का उपयोग है। यह विधि एम्बेडेड यूरैसिल के साथ डीएनए अणुओं को साफ करने के लिए यूजी की क्षमता पर आधारित है। डीएनटीपी मिश्रण का उपयोग करके प्रवर्धन प्रतिक्रिया की जाती है, जिसमें डीटीटीपी को यूरैसिल द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, और थर्मल साइकलिंग के बाद, टेस्ट ट्यूब में बनने वाले सभी एम्पलीकॉन्स में यूरैसिल होगा। यदि प्रवर्धन से पहले प्रतिक्रिया मिश्रण में यूजी जोड़ा जाता है, तो प्रतिक्रिया मिश्रण में एम्पलीकॉन नष्ट हो जाएंगे, जबकि देशी डीएनए बरकरार रहेगा और आगे प्रवर्धन के लिए एक लक्ष्य के रूप में काम करेगा।

इस प्रकार, यह विधि केवल कुछ हद तक संदूषण के स्रोत को समाप्त करती है और झूठे सकारात्मक परिणामों की गारंटी नहीं देती है।

संदूषण के परिणामों से निपटने का एक अन्य तरीका प्रतिक्रिया चक्रों की संख्या (25-30 चक्र तक) को काफी कम करना है। लेकिन इस दृष्टिकोण के साथ भी, झूठे सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने का जोखिम अधिक है, क्योंकि इस मामले में, अवरोधकों की अनुपस्थिति में, संदूषण के कारण प्रवर्धन उत्पाद प्राप्त करना आसान है।

इस प्रकार, झूठे सकारात्मक परिणामों का कारण बनने वाले डीएनए अणुओं को निष्क्रिय करने के उद्देश्य से प्रस्तावना उपायों के लाभों के बावजूद, सबसे कट्टरपंथी साधन प्रयोगशाला का एक पूर्व-नियोजित संगठन है।

निष्कर्ष

पीसीआर की सबसे व्यापक विधि वर्तमान में विभिन्न संक्रामक रोगों के निदान के लिए एक विधि के रूप में प्राप्त की जाती है। पीसीआर आपको संक्रमण के एटियलजि की पहचान करने की अनुमति देता है, भले ही विश्लेषण के लिए लिए गए नमूने में रोगज़नक़ के केवल कुछ डीएनए अणु हों। एचआईवी संक्रमण, वायरल हेपेटाइटिस आदि के शुरुआती निदान में पीसीआर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। आज, लगभग कोई संक्रामक एजेंट नहीं है जिसे पीसीआर का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है।

बहुत पहले नहीं, मनुष्यों में विभिन्न संक्रामक रोगों के निदान के लिए एक विश्वसनीय, अत्यधिक संवेदनशील और तेज़ विधि विकसित की गई थी। इस विधि को "पीसीआर विश्लेषण" कहा जाता है। यह क्या है, इसका सार क्या है, यह किन सूक्ष्मजीवों का पता लगा सकता है और इसे सही तरीके से कैसे लेना है, हम आपको अपने लेख में बताएंगे।

डिस्कवरी इतिहास

साथ ही, कैंसर के निदान में पीसीआर विधियों का उपयोग किया जाता है।

विधि लाभ

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के कई फायदे हैं:

1. उच्च संवेदनशील। एक सूक्ष्मजीव के केवल कुछ डीएनए अणुओं के साथ भी, पीसीआर विश्लेषण संक्रमण की उपस्थिति को निर्धारित करता है। विधि पुरानी और गुप्त बीमारियों में मदद करेगी। अक्सर ऐसे मामलों में, सूक्ष्मजीव अन्य तरीकों से खेती नहीं की जाती है।
2. कोई भी सामग्री अनुसंधान के लिए उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, लार, रक्त, जननांग स्राव, बाल, उपकला कोशिकाएं। पीसीआर के लिए रक्त परीक्षण और मूत्रजननांगी स्मीयर सबसे आम है।

   

3. फसलों की लंबी अवधि की खेती की आवश्यकता नहीं है। स्वचालित निदान प्रक्रिया आपको 4-5 घंटों के बाद अध्ययन के परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देती है।
4. विधि लगभग 100% विश्वसनीय है। झूठे नकारात्मक परिणाम के केवल कुछ मामले दर्ज किए गए हैं।
5. सामग्री के एक नमूने से कई प्रकार के रोगजनकों की पहचान करने की क्षमता। यह न केवल रोग के निदान की प्रक्रिया को गति देता है, बल्कि भौतिक लागत को भी काफी कम करता है। अक्सर डॉक्टर एक व्यापक पीसीआर विश्लेषण निर्धारित करते हैं। परीक्षा की लागत, जिसमें छह रोगजनकों की पहचान शामिल है, लगभग 1,500 रूबल है।

पीसीआर अध्ययन करते समय परिणाम विश्वसनीय होने के लिए, निदान के लिए प्रारंभिक तैयारी के लिए सिफारिशों का पालन करते हुए, विश्लेषण पास करना आवश्यक है:

1. लार दान करने से पहले, आपको सामग्री लेने से पहले 4 घंटे तक खाने और दवा लेने से बचना चाहिए। प्रक्रिया से तुरंत पहले, अपने मुंह को उबले हुए पानी से धो लें।
2. गाल की भीतरी सतह से नमूना लेते समय उपरोक्त नियमों का पालन करना चाहिए। कुल्ला करने के बाद, ग्रंथि के स्राव को मुक्त करने के लिए त्वचा की हल्की मालिश करने की सलाह दी जाती है।
3. मूत्र आमतौर पर घर पर एकत्र किया जाता है। ऐसा करने के लिए, आपको पूरी तरह से जननांगों के शौचालय का संचालन करने की आवश्यकता है। एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में 50-60 मिलीलीटर मूत्र एकत्र करें। सामग्री की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए, महिलाओं को योनि में एक टैम्पोन डालने की सिफारिश की जाती है, और पुरुषों के लिए जितना संभव हो सके त्वचा की तह को बाहर निकालने के लिए। मासिक धर्म की अवधि के दौरान आप सामग्री का दान नहीं कर सकते।
4. शुक्राणु दान करने के लिए, आपको सामग्री लेने से पहले 3 दिनों तक संभोग से बचना चाहिए। इसके अलावा, डॉक्टर सलाह देते हैं कि सौना जाना और गर्म स्नान करना, शराब और मसालेदार भोजन पीना छोड़ दें। विश्लेषण से 3 घंटे पहले, आपको पेशाब करने से बचना चाहिए।
5. प्रसव के लिए, उदाहरण के लिए, यदि क्लैमाइडिया पीसीआर का विश्लेषण किया जाता है, तो महिलाओं और पुरुषों दोनों को 3 दिनों के लिए यौन आराम करने की सलाह दी जाती है। विश्लेषण से 2 सप्ताह पहले जीवाणुरोधी दवाएं नहीं ली जानी चाहिए। एक सप्ताह के लिए, आपको अंतरंग जैल, मलहम, योनि सपोसिटरी, डचिंग का उपयोग बंद करने की आवश्यकता है। अध्ययन से 3 घंटे पहले आपको पेशाब करने से बचना चाहिए। मासिक धर्म के दौरान, सामग्री नहीं ली जाती है, रक्त स्राव की समाप्ति के केवल 3 दिन बाद, आप मूत्रजननांगी स्मीयर ले सकते हैं।

गर्भावस्था के दौरान पीसीआर

बच्चे की प्रतीक्षा करते समय, कई यौन संचारित संक्रमण भ्रूण के सामान्य विकास के लिए बेहद खतरनाक होते हैं। एसटीडी अंतर्गर्भाशयी विकास मंदता, गर्भपात या समय से पहले जन्म, बच्चे की जन्मजात विकृतियों को भड़का सकते हैं। इसलिए, गर्भावस्था के शुरुआती चरणों में पीसीआर जांच करवाना बेहद जरूरी है। पंजीकरण पर विश्लेषण पास करना आवश्यक है - 12 सप्ताह तक।



सामग्री को एक विशेष ब्रश का उपयोग करके ग्रीवा नहर से लिया जाता है। प्रक्रिया दर्द रहित है और इससे बच्चे को कोई खतरा नहीं है। आमतौर पर, गर्भावस्था के दौरान, पीसीआर विधि द्वारा क्लैमाइडिया के लिए एक विश्लेषण किया जाता है, साथ ही यूरियाप्लाज्मोसिस, मायकोप्लास्मोसिस, साइटोमेगालोवायरस, हर्पीज, पेपिलोमावायरस के लिए भी। परीक्षा के ऐसे परिसर को पीसीआर-6 कहा जाता है।

एचआईवी निदान के लिए पीसीआर

इस तथ्य के कारण कि विधि शरीर में परिवर्तन और निदान की स्थितियों के प्रति बहुत संवेदनशील है, कई कारक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, एचआईवी संक्रमण के लिए पीसीआर का विश्लेषण एक विश्वसनीय तरीका नहीं है, इसकी दक्षता 96-98% है। शेष 2-4% मामलों में, परीक्षण गलत सकारात्मक परिणाम देता है।

लेकिन कुछ स्थितियों में, एचआईवी का पीसीआर निदान अपरिहार्य है। यह आमतौर पर झूठे-नकारात्मक एलिसा परीक्षण वाले लोगों को दिया जाता है। ऐसे संकेतक इंगित करते हैं कि किसी व्यक्ति ने अभी तक वायरस के प्रति एंटीबॉडी विकसित नहीं की है और संख्या में कई वृद्धि के बिना उनका पता नहीं लगाया जा सकता है। यह वही है जो पीसीआर रक्त परीक्षण से प्राप्त किया जा सकता है।

एचआईवी पॉजिटिव मां से जन्म लेने वाले जीवन के पहले वर्ष के बच्चों के लिए भी इस तरह के निदान आवश्यक हैं। विधि बच्चे की स्थिति को मज़बूती से निर्धारित करने का एकमात्र तरीका है।

हेपेटाइटिस के निदान के लिए पीसीआर

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि संक्रमण के लिए एंटीबॉडी के गठन या रोग के लक्षणों की उपस्थिति से बहुत पहले हेपेटाइटिस ए, बी, सी वायरस के डीएनए का पता लगाने की अनुमति देती है। हेपेटाइटिस सी के लिए पीसीआर विश्लेषण विशेष रूप से प्रभावी है, क्योंकि 85% मामलों में ऐसी बीमारी स्पर्शोन्मुख होती है और समय पर उपचार के बिना एक पुरानी अवस्था में चली जाती है।



रोगज़नक़ का समय पर पता लगाने से जटिलताओं और दीर्घकालिक उपचार से बचने में मदद मिलेगी।

व्यापक पीसीआर परीक्षा

व्यापक पीसीआर विश्लेषण: पॉलीमेसर चेन रिएक्शन द्वारा परीक्षा, जिसमें एक ही समय में कई प्रकार के संक्रमणों का निर्धारण शामिल है: माइकोप्लाज्मा जननांग, माइकोप्लाज्मा होमिनिस, गार्डनेरेला वेजिनेलिस, कैंडिडा, ट्राइकोमोनास, साइटोमेगालोवायरस, हर्पीज 1 और 2 प्रकार, गोनोरिया, पेपिलोमावायरस। इस तरह के निदान की कीमत 2,000 से 3,500 रूबल तक होती है। क्लिनिक के आधार पर, उपयोग की जाने वाली सामग्री और उपकरण, साथ ही विश्लेषण के प्रकार पर: गुणात्मक या मात्रात्मक। आपके मामले में क्या आवश्यक है - डॉक्टर तय करेगा। कुछ मामलों में, यह केवल रोगज़नक़ की उपस्थिति को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है, दूसरों में, उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण में, मात्रात्मक अनुमापांक एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उपरोक्त सभी रोगजनकों का निदान करते समय, परीक्षा को "पीसीआर -12 विश्लेषण" कहा जाता है।

विश्लेषण परिणामों की व्याख्या

पीसीआर विश्लेषण को डिकोड करना मुश्किल नहीं है। संकेतक के केवल 2 पैमाने हैं - "सकारात्मक परिणाम" और "नकारात्मक परिणाम"। जब एक रोगज़नक़ का पता लगाया जाता है, तो डॉक्टर 99% निश्चितता के साथ रोग की उपस्थिति की पुष्टि कर सकते हैं और रोगी का इलाज शुरू कर सकते हैं। संक्रमण का निर्धारण करने के लिए मात्रात्मक विधि के साथ, पाए गए बैक्टीरिया के संख्यात्मक संकेतक को संबंधित कॉलम में दर्शाया जाएगा। केवल एक डॉक्टर रोग की डिग्री निर्धारित कर सकता है और आवश्यक उपचार लिख सकता है।



कुछ मामलों में, उदाहरण के लिए, पीसीआर द्वारा एचआईवी संक्रमण का निर्धारण करते समय, नकारात्मक परिणाम के मामले में, प्राप्त संकेतकों की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त परीक्षा आयोजित करना आवश्यक हो जाता है।

कहां जांच कराएं?

पीसीआर विश्लेषण कहां से लें: राज्य के क्लिनिक में या निजी प्रयोगशाला में? दुर्भाग्य से, नगरपालिका चिकित्सा संस्थानों में, उपकरण और तरीके अक्सर पुराने होते हैं। इसलिए, आधुनिक उपकरणों और उच्च योग्य कर्मियों के साथ निजी प्रयोगशालाओं को वरीयता देना बेहतर है। इसके अलावा, एक निजी क्लिनिक में, आपको बहुत तेजी से परिणाम मिलेंगे।

मॉस्को में, कई निजी प्रयोगशालाएं विभिन्न संक्रमणों के लिए पीसीआर विश्लेषण की पेशकश करती हैं। उदाहरण के लिए, "वीटा", "कॉम्प्लेक्स क्लिनिक", "हैप्पी फैमिली", "यूरो-प्रो" जैसे क्लीनिकों में पीसीआर विश्लेषण किया जाता है। परीक्षा की लागत 200 रूबल से है। एक रोगज़नक़ की पहचान के लिए।

यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि ज्यादातर मामलों में पीसीआर द्वारा संक्रामक रोगों का निदान संक्रमण के प्रारंभिक चरण में शरीर में रोगज़नक़ का पता लगाने का एक त्वरित और विश्वसनीय तरीका है। लेकिन फिर भी, कुछ मामलों में, यह अन्य नैदानिक ​​​​विधियों को चुनने के लायक है। केवल एक विशेषज्ञ ही इस तरह के अध्ययन की आवश्यकता निर्धारित कर सकता है। पीसीआर विश्लेषण को डिकोड करने के लिए भी एक पेशेवर दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। डॉक्टर की सिफारिशों का पालन करें और स्वयं ऐसे परीक्षण न करें जो आवश्यक न हों।