Aminosav összetétel meghatározása. A tej aminosav-összetételének meghatározása. Aminosavak meghatározása vékonyréteg-kromatográfiával

OKTATÁSI KÉZIKÖNYV

FÜGGETLEN FELKÉSZÜLÉSÉHEZ

OSZTÁLYOKHOZ

A BIOLÓGIAI KÉMIÁBAN

szakon tanuló hallgatók számára

Gyermekgyógyászat

I. rész

Központi Módszertani Tanács

Szmolenszki Állami Orvosi Akadémia

Szmolenszk

UDC: 612.015.

Bírálók: az orvostudományok doktora, professzor A.S. Szolovjov

Az orvostudományok doktora, professzor O.V. Molotkov

Oktatási és módszertani kézikönyv a biológiai kémia órákra való önálló felkészítéshez gyermekgyógyász szakon tanuló hallgatók számára.

I. rész / T.G. Makarenko, K.A. Mageenkova

Szmolenszk SGMA. 2012. - 92 p.

A kézikönyv röviden összefoglalja a biokémia program elméleti anyagát, amely nem szerepel az előadási kurzusban, teszteket az ismeretek ellenőrzésére, szituációs problémákat és vizsgákra vonatkozó kérdéseket. A kézikönyv speciális kérdéseket is tartalmaz a gyermekek anyagcseréjének jellemzőiről. A kézikönyv a III. és IV. félév tantervének megfelelően két részből áll. A kézikönyv a gyermekgyógyászat szakon tanuló hallgatók számára készült.

Az Orosz Föderáció SGMA Roszdrav Állami Költségvetési Szakmai Felsőoktatási Intézményének Tanácsa

Biokémia előadások témái (43 óra)

1. Bevezetés a biokémiába.

2. A fehérjék szerkezeti szerveződése.

3. A fehérjék fizikai-kémiai tulajdonságai.

4. Az enzimek felépítése, hatásmechanizmusa.

5. Az enzimek tulajdonságai.

6. Intramitokondriális oxidáció. Energiacsere.

7. Extramitokondriális oxidáció.

8. A katabolizmus általános útjai.

9. Szénhidrátok anaerob oxidációja.

10. A szénhidrátok aerob oxidációja. Glükoneogenezis.

11. Pentoso - foszfát útvonal.

12. A triacilglicerinek és glicerofoszfolipidek metabolizmusa

13. Koleszterin, szfingolipidek metabolizmusa.

14. A zsír és a szénhidrát anyagcsere kapcsolata. Keton testek.

15. Az aminosav-anyagcsere általános útjai a szövetekben.

16. A szövetekben lévő ammónia semlegesítésének módjai.

17. Fenilalanin és tirozin cseréje.

18. Purin és pirimidin nukleotidok cseréje.

19. A hormonok biokémiája.

20. Az eritrociták biokémiája. Hemoproteinek cseréje.

21. A vér fizikai-kémiai tulajdonságai. A vér légzési funkciója.

22. Véralvadási és véralvadásgátló rendszerek.

23. Víz-só csere.

Anyag a tanulók önálló munkájához

(72 óra tanórán kívüli munka)

A kézikönyv a gyermekorvosi kar hallgatói számára készült, a biológiai kémia tanórán kívüli önálló munkájára.

A kézikönyv tartalmazza az orvostanhallgatók biológiai kémia tantervének anyagának összefoglalását, amely nem szerepel a tantermi előadási kurzusban. A gyermekgyógyászat szakon tanuló hallgatók számára további információk találhatók a gyermekek anyagcseréjének jellemzőiről. Az órai témákhoz tartozó tesztfeladatokat a tudás köztes és záró ellenőrzésére használjuk. A szituációs problémák megbeszélése várhatóan tanórán történik a pedagógus részvételével. Ezzel kapcsolatban a kézikönyv nem tartalmaz megjegyzéseket a szituációs feladatokhoz. A kézikönyv tartalmazza a biokémia vizsgakérdéseinek listáját.

1. óra témája

A FEHÉRJÉK AMINOSAV ÖSSZETÉTELE. AZ EGYSZERŰ FEHÉRJÉNEK HIDROLÍZISE. AMINOSAVAK KROMATOGRÁFIAI ELVÁLASZTÁSA

2. Az önálló munkavégzés céljai: bővítse a fehérjék szerkezeti szerveződésével kapcsolatos elképzeléseket

Ismerje meg a fehérjék biológiai funkcióit,

Teljes információ a fehérjék elsődleges, másodlagos, harmadlagos, kvaterner szerkezetéről,

Megismerni a gyermekek testében lévő szövetek fehérjeösszetételének sajátosságait,

Fejleszti a megszerzett ismeretek felhasználásának képességét.

4. Az önálló munkához szükséges kérdések és feladatok listája

A fehérjék nagy molekulájú polimer N-tartalmú szerves anyagok, amelyek peptidkötésekkel összekapcsolt aminosavakból állnak, és összetett szerkezeti felépítésűek.

A „fehérjék” kifejezés ezen vegyületek azon képességének köszönhető, hogy fehér csapadékot termelnek. A „fehérjék” elnevezés a protos (görög) szóból származik – az első, fontos, és ennek az anyagcsoportnak a szervezetben betöltött központi szerepét tükrözi.

Fehérjetartalom az emberi szervezetben magasabb, mint a lipid- és szénhidráttartalom. A teljes szövettömeg (nedves tömeg) 18-20%-át teszi ki. A fehérjék túlsúlya a szövetekben más anyagokhoz képest a szövetek száraz tömegére vonatkoztatott fehérjetartalom kiszámításakor derül ki - 40-45%. A fehérjetartalom a különböző szövetekben egy bizonyos tartományon belül ingadozik. A legmagasabb fehérjetartalom a vázizmokban van (a nedves tömeg 18-23%-a vagy a száraz szövettömeg 80%-a). A zsírszövet alacsony fehérjetartalmú (6% nedves tömeg vagy 4% száraz szövettömeg).

Gyermekkorban a szervezetben lévő fehérjék összmennyisége és összetétele eltér a felnőttekétől. A magzati testben a teljes fehérjetartalom nem haladja meg a 10%-ot. Újszülötteknél a testtömeg 10-12%-át teszi ki. Az újszülöttkori időszakban az energiacélú fehérjebontási folyamatok fokozódnak. Emiatt a fehérjetartalom átmenetileg csökken. Kora gyermekkorban az éretlen oldható szerkezeti fehérjék dominálnak. Az életkor előrehaladtával fokozódik differenciálódásuk érett funkcionális fehérjékké.

A fehérjék biológiai funkciói változatos. Nagy fehérjespecifitással és különféle ligandumokkal, receptorokkal és sejtszerkezetekkel való kölcsönhatásra való képességgel járnak.

· Plasztikus (strukturális) funkció – a fehérjék a nukleinsavakkal, lipidekkel, szénhidrátokkal együtt minden sejtszerkezet részét képezik.

Energia - 1 g fehérje körülbelül 4 kcal-t biztosít

Szabályozási funkciók:

a) enzimatikus - több mint 2000 fehérje biológiai katalizátor, szabályozza a kémiai reakciók sebességét a szervezetben

b) hormonális - egyes hormonok, amelyek a szervezet biokémiai és élettani folyamatait szabályozzák, fehérjék

c) a kromatinban lévő hisztonfehérjék szabályozzák a DNS-gének aktivitását

d) az intracelluláris fehérje, a kalmodulin szabályozza a különböző enzimek aktivitását

· Védő (immun) funkció. Egyes fehérjék (immunglobulinok, interferon, lizozim) képesek megkötni a szervezet számára idegen anyagokat.

· Speciális funkciók:

a) kontraktilis (izomfehérjék, aktin és miozin)

b) fotoreceptor (retina protein rodopszin)

c) véralvadás (véralvadási faktor fibrinogén)

d) receptor – a fehérjék a sejtreceptorok részét képezik

A fehérjék kémiai összetétele

A fehérjék elemi összetétele elég változatos. Sok vegyszert tartalmaznak. A kötelező kémiai elemek azonban a szén (51-55%), oxigén (21-23%), nitrogén (16% - a legállandóbb érték), hidrogén (6-7%) és kén (0,5-2%)

A fehérjék aminosav összetétele. A természetes fehérjék α aminosavakat tartalmaznak, amelyek az α-szénatom gyökének szerkezetében különböznek.

Tesztek

1. A természetes fehérjék összetétele kémiai elemeket tartalmaz: Kalcium. Szén. Klór. Hidrogén. Nátrium. Nitrogén. Kálium . Oxigén. Kén .

Szén. Hidrogén. Nitrogén. Oxigén. Kén.

3. Az aminosavak helyettesítése a fehérjék biológiai tulajdonságaiban jelentős változásokhoz vezet:

Glutamát aszpartáttá. Glutamát valinná, triptofán glutamáttá. Valin a leucin. A glicin aszpartáttá. Fenilalanin triptofán. Szerinből treoninba. A glicin alaninná.

4. A fehérjehidrolízis befejeződése a következőképpen ítélhető meg:

A denaturált fehérje üledékének feloldásával. A hidrolizátum zavarosságának eltűnésével. Pozitív biuret reakció alapján. Pozitív ninhidrin reakció alapján. Negatív ninhidrin reakció alapján. Adamkiewicz pozitív reakciója szerint. Negatív biuret reakció alapján Formol titrálás eredménye alapján.

5. A fehérje harmadlagos szerkezetét kötések stabilizálják:

Hidrofób. Peptid. Diszulfid. Ión .Hidrogén.

6. A fehérjék másodlagos szerkezetét kötések stabilizálják:

Diszulfid. Peptid. Ión. Hidrofób. Hidrogén.

7. A fehérjék poláris funkciós csoportjai a következők:

karboxil. Metil. fenolos . Amin. karbonil. Indolic.

8. Az aminosavak funkcionális csoportjai részt vesznek a peptidkötés kialakításában:

Epszilon-amin. Alfa - amin. Béta - karboxil. Gamma-karboxil. Alfa - karboxil. tiolok.

9. A mögöttes szerkezet, i.e. A fehérje szerkezeti szerveződésének magasabb szintjei a következők:

Elsődleges. Másodlagos. Harmadlagos. negyedidőszak.

10. Az azonos természetes biológiai tulajdonságokkal rendelkező fehérjék kifejezett fajspecifitása az alábbiaknak köszönhető:

Alapvető különbségek az aminosav-összetételben. Jelentős különbségek a molekulatömegben. A molekulák térszerkezetének jellemzői. Ha az elsődleges szerkezetek hasonlóak, egyedi ekvivalens aminosav-szubsztitúciók vannak. Ha az elsődleges szerkezetek hasonlóak, akkor egyedi aminosav-szubsztitúciók vannak. Különbségek a nem fehérje összetevők összetételében.

11. Az aminosavak túlnyomórészt a fehérjemolekula felületén találhatók:

Nem poláris aminosavak. Poláris aminosavak. Mindkét aminosavcsoport. Ezen csoportok egyike sem

12. Az aminosavak főleg a fehérjemolekula mélyén találhatók:

Nem poláris aminosavak. Poláris aminosavak. Ezen csoportok egyike sem. Mindkét aminosavcsoport

13. A 3. fehérjeszerkezet kialakítása magában foglalja:

Nem poláris aminosavak. Poláris aminosavak. Mindkét aminosavcsoport . Ezen csoportok egyike sem

14. A hemoglobin oxigén iránti affinitásának változásának oka:

Változások a protomerek harmadlagos szerkezetében. A protomerek relatív helyzetének változása. Kooperatív változások a protomer konformációban

15. Helyes ez az állítás?

Epsilon - a lizin aminocsoportja részt vesz a peptidkötés kialakításában

Igen. Nem. Nincs helyes válasz

16. Helyes ez az állítás?

A szerin és valin gyökök hidrofil tulajdonságokkal rendelkeznek

Igen. Nem. Nincs helyes válasz

17. A kísérők főként a következők kialakításában és karbantartásában vesznek részt:

A fehérjék elsődleges szerkezete . A fehérjék harmadlagos szerkezete . A nukleinsavak másodlagos szerkezete

20%. 10-12%. 5%

Szituációs feladatok

1. Egy peptidfragmensen: Tyr - Cis - Leu - Val - Asp - Ala

Nevezze meg, mely aminosavgyökök vehetnek részt a kötések kialakításában:

Hidrofób. Ión. Diszulfid

2. Peptid fragmensen: Tyr – Cis – Leu – Val – Asp – Ala

jelzik, hogy a fehérje szerkezeti szerveződésének mely szintjein vesznek részt az ezen aminosavak gyököi által létrehozott kötések

3. Sarló alakú vörösvértesteket találtak egy afrikai diák vérében, aki légszomj, szédülés, szapora szívverés és végtagfájdalom panaszaival került be a klinikára.

Magyarázza el a betegség kialakulásának okát.

4. A hemoglobin egy komplex oligomer hemoprotein fehérje. Milyen poszttranszlációs változások vezetnek funkcionálisan aktív fehérje kialakulásához?

Fő

Biokémia. Szerk. E.S. Severina. 2003. 9-28., 31-56.

Biokémia. Rövid tanfolyam gyakorlatokkal és feladatokkal. 2001. P. 7-25.

ÉS ÉN. Nikolaev Biológiai kémia. 2004. 16-35.,38-43.o.

O.D. Kushmanova. Útmutató a biológiai kémia laboratóriumi gyakorlataihoz. 1983. 15-19., 19-24.

Előadás anyaga

További

T.T. Berezov, B.F. Korovkin. Biológiai kémia. 1990. 10-41., 49-59.

R. Murray és társai „Human Biochemistry”. M. "Béke". 1993. p. 21-51 (1)

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Oktatási és módszertani kézikönyvek „A gyermek szervezetének biokémiai jellemzői”. Szmolenszk 2001. 2007.

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Az oktatási intézmény által ajánlott tankönyv „Az anyagcsere jellemzői újszülötteknél és csecsemőknél”. Szmolenszk 2012.

A.E. Medvegyev „Felfedezték a 22. genetikailag kódolt aminosavat” // Vopr. édesem. kémia. 2002. 5. szám -. Val vel. 432

2. óra témája

ÜLEDEKES REAKCIÓK FEHÉRJÉKRE.

A FEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSÁNAK MÓDSZEREI

2 . Az önálló munkavégzés céljai: ismeretek bővítése a fehérjék alapvető fizikai-kémiai tulajdonságairól és alkalmazott orvosi jelentőségéről, a laboratóriumi gyakorlatban alkalmazott módszerekről a fehérjék mennyiségi meghatározására biológiai folyadékokban

3. Az önálló munkavégzés feladatai:

Legyen képes felmérni a fehérjeoldatok alapvető fizikai-kémiai tulajdonságainak orvosbiológiai jelentőségét,

Ismerkedjen meg a vérszérum normál fehérjetartalmával, az esetleges eltérésekkel és azok biokémiai értelmezésével,

Fejleszteni kell az új információkkal való munkavégzés, annak elemzése, logikus bemutatása,

A laboratóriumi gyakorlatban

A fehérjék mennyiségi meghatározására optikai, kolorimetriás és azotometrikus módszereket alkalmaznak.

Optikai módszerek a fehérjék optikai tulajdonságai alapján.

Ezek tartalmazzák:

- spektrofotometriás módszerek, megbecsülve az UV-sugarak fehérjék általi abszorpciójának intenzitását a körülbelül 200 és 260 nm tartományban. Az UVL-elnyelés mértéke arányos a fehérjekoncentrációval;

- refraktometriás módszerek a fehérjeoldatok azon képessége alapján, hogy a koncentrációjukkal arányosan megtörik a fényt;

- nefelometrikus módszerek a fehérjeoldatok azon képessége alapján, hogy a koncentrációjukkal arányosan szórják a fényt;

- polarimetriás módszerek A fehérjeoldatok azon képességén alapulnak, hogy koncentrációjukkal arányosan el tudják forgatni a polarizált fény síkját.

Kolorimetriás módszerek fehérjék színreakcióin alapul - biuret reakció, Lowry-módszer, bizonyos színezékek fehérjék általi szorpciós módszere. A szín intenzitását a fehérjeoldat koncentrációja határozza meg.

Nitrometriás módszerek a nitrogéntartalom meghatározásán és fehérjekoncentrációvá alakításán alapulnak (a fehérjék 16% nitrogént tartalmaznak).

Tesztek

1. A kolorimetriás módszerek a következők:

Nitrometriás. Spektrofotometriás . Színezékek szorpciója. Lowry módszer. Biuret módszer. Refraktometriás.

2. Elemzésük módszerei a fehérjék töltésszerzési képességén alapulnak:

Röntgen-diffrakciós elemzés. Elektroforézis, ioncserélő kromatográfia, potenciometrikus titrálás. Refraktometria. Ultracentrifugálás. Oszlopos gélszűrés.

3. A fehérjék oldatokból való kisózásának hatása a következőkhöz kapcsolódik:

A másodlagos és harmadlagos struktúrák megzavarásával. A peptidkötések megszakadásával. A fehérjék által okozott töltésvesztéssel. Molekuláik kiszáradásával. Kvaterner szerkezet kialakulásával.

4. A fehérjék állati eredetű szövetekből történő legteljesebb kinyeréséhez a következő folyadékokat használhatja:

Alkohol-víz keverék. Aceton. 10%-os ammónium-szulfát oldat. Desztillált víz. 10%-os NaCl oldat 10%-os KCl oldat.

5. Az alábbi módszerekkel megszabadulhat a fehérje extrakció során jelenlévő kis molekulatömegű anyagoktól anélkül, hogy elveszítené a fehérjék natív tulajdonságait:

Elektroforézis. Dialízis oszlopos gél - szűrés. Fehérjék kicsapása triklór-ecetsavval.

6. A különböző molekulatömegű fehérjék fizikai és kémiai elemzési technikákkal választhatók szét:

Dialízis. Elektroforézis. Kisózni. Potenciometrikus titrálás. Oszlopos gélszűrés.

7. Fiziológiás pH-értékek mellett egy aminosav töltődhet vagy veszíthet:

cisztein. Arginin. Tirozin. Serin. hisztidin. Treonin.

8. A globulinok jelenléte az oldatban igazolható:

Elektroforézis. Oszlopos gélszűrés. Kisózzuk 50%-os telítettségnél ammónium-szulfáttal. Kisózzuk 100%-os telítettségnél ammónium-szulfáttal. Denaturálás karbamiddal.

9. A denaturációs hatást a következő jelek jellemzik:

Gyors üledékképződés. A biológiai aktivitás elvesztése. Biológiai tulajdonságok megőrzése. A fehérje elsődleges szerkezetének megsértése. Lassú üledékképződés. A másodlagos és harmadlagos szerkezet (konformáció) megsértése. Konformáció megőrzése.

10. A kisózási hatást a következő tünetek jellemzik:

A hatás visszafordíthatósága. A biológiai tulajdonságok elvesztése. Biológiai tulajdonságok megőrzése. A fehérje konformációjának zavara. A fehérje konformáció fenntartása. Gyors üledékképződés.

11. A fehérjedenaturációt a következők okozzák:

Nátrium-klorid. Kénsav. Ólom-acetát. Ammónium-szulfát. Ezüst nitrát. Szulfoszalicilsav. Karbamid. Szőlőcukor.

A potenciál gradiensből. A fehérjék molekulatömegéből. A környezet pH-jától. A fehérjemolekulák alakjából. A fehérjék aminosav-összetételének jellemzőiből. Protetikus csoportok jelenlététől a fehérjékben.

13. Fehérjekeverékből történő kisózással izolálhatja:

Ovaalbumin. Gamma globulin. Szérum albumin.

14. A fehérjék vízben való oldhatóságát a polipeptidláncok funkcionális csoportjai biztosítják:

karboxil. Metil. fenolos. Amin. karbonil. Indolic. Hidroxil. tiolok. Immunous.

15. A fehérjék molekulatömegére vonatkozó legobjektívebb adatokat fizikai-kémiai módszerekkel biztosítjuk:

Krioszkópia. Ebullioszkópia. Röntgen szerkezeti elemzés Ultracentrifugálás. Elektronmikroszkópia.

16. Az oldat fehérjetartalmának pontos meghatározásához használhatja az optikai effektust:

Fénysugarak törése. Fényszórás hatás. Optikai tevékenység. A sugarak elnyelése a spektrum UV-részében.

17. A fehérjék gélszűrése során a következőket kell alkalmazni:

Különbségek a töltés nagyságában. Különbségek a molekulatömegben . Különbségek az optikai tulajdonságokban

18. A fehérje elektroforézisben a következőket használják:

Különbségek a töltés méretében . Különbségek a molekulatömegben . Különbségek az optikai tulajdonságokban

19. A ceruloplazmin (molekulatömeg 151 000, izoelektromos pont 4.4) és a γ - globulin (móltömeg: 150 000, izoelektromos pont 6.3) fehérjék keveréke a következő módszerekkel választható el:

Elektroforézis. Gél - szűrés. Ioncserélő kromatográfia

20. A fehérjék mennyiségi meghatározására szolgáló refraktometriás módszerek a következők hatásán alapulnak:

Fényszórás. Fényelnyelés. Fénytörés . A polarizált fény síkjának forgásai

21. A fehérjék mennyiségi meghatározására szolgáló spektrofotometriás módszerek a következők hatásán alapulnak:

Fényszórás. Fényelnyelés egy bizonyos hullámhosszon. Fénytörés. A polarizált fény síkjának elfordulásai

22. Az izoelektromos pontban egy fehérje molekula:

Nem disszociálnak. E elektromosan semleges . Az anód felé haladva. Polipeptidekre bomlik

23. A fehérjék stabil vizes oldatokat képezhetnek a következők jelenlétének köszönhetően:

Brown-mozgás Hidrofób gyökök jelenléte. A töltés és a hidratáló héj jelenléte a fehérjemolekulákban. A fenti tényezők mindegyike

Szituációs feladatok

1. Adja meg a következő peptid mozgási irányát (az anódhoz, a katódhoz vagy maradjon a kezdetben)

Liz - Gli - Ala - Gli

2. Adja meg a következő peptid mozgási irányát (az anódhoz, a katódhoz vagy maradjon az elején)

Liz – Glu – Ala – Gli

3. Adja meg a következő peptid mozgási irányát (az anódhoz, a katódhoz vagy maradjon az elején)

Glu - Gli - Ala - Gli

4. vonjon le következtetéseket egy olyan fehérje aminosav összetételének jellemzőire, amelynek izoelektromos pontja = 4,7

5. Milyen töltést szerez semleges környezetben egy fehérje, amelynek izoelektromos pontja = 4,7?

Magyarázza meg válaszát.

6. A fehérjét ammónium-szulfáttal kisózva csapadékot kapunk, amely a vizsgált fehérjét sókeverékkel tartalmazza. Hogyan lehet elkülöníteni a fehérjét a sótól?

7. Alap- és kiegészítő irodalom a témában

Fő

Biokémia. Szerk. E.S. Severina. 2003. 67-74

Biokémia. Rövid tanfolyam gyakorlatokkal és feladatokkal. 2001. 29-31.o

ÉS ÉN. Nikolaev Biológiai kémia. 2004. 43-60.o

O.D. Kushmanova. Útmutató a biológiai kémia laboratóriumi gyakorlataihoz. 1983. 7-15., 28-29.

Előadás anyaga

További

T.T. Berezov, B.F. Korovkin. Biológiai kémia. 1990. 37-41.

R. Murray és társai „Human Biochemistry”. M. "Béke". 1993. 43-51. o. (1)

Yu.E. Veltiscsev, M.V. Ermolaev, A.A. Ananenko, Yu.A. Knyazev. "Metabolizmus gyermekeknél." M.: Orvostudomány. 1983. 462 p.

R.M. Kohn, K.S. Száj. Az anyagcsere-betegségek korai diagnosztizálása. M. "Gyógyászat" - 1986.

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Oktatási és módszertani kézikönyvek „A gyermek szervezetének biokémiai jellemzői”. Szmolenszk 2001. 2007

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Oktatási és módszertani kézikönyv „Az anyagcsere jellemzői újszülötteknél és csecsemőknél” (Az UMO ajánlása). Szmolenszk 2012.

Titov V.N. A vérszérum összfehérje-tartalmának meghatározásának módszertani vonatkozásai // Klin. labor. diagnosztika, 1995, - .№ 2.S. 15-18

3. óra témája

A FEHÉRJÉK OSZTÁLYOZÁSA.

EGYSZERŰ ÉS KOMPLEX FEHÉRJÉK

2. Az önálló munkavégzés céljai: megszilárdítani az ismereteket a fehérjék osztályozásának elveiről, az egyszerű és összetett fehérjék fő csoportjainak tulajdonságairól és összetételi jellemzőiről

3. Az önálló munkavégzés feladatai:

Fontolja meg a fehérje osztályozás alapelveit,

Tanulmányozni az egyszerű és összetett fehérjék fő csoportjainak tulajdonságait, kémiai összetételét és biológiai funkcióit,

Fejleszteni kell az új információkkal való munkavégzés, annak elemzése, logikus bemutatása,

A megszerzett ismeretek oktatási és szakmai tevékenységben való felhasználásának készségének fejlesztése.

4. Kérdések listája önálló munkához

A fehérjék osztályozása

A szervezetben található fehérjék hatalmas száma, tulajdonságaik és biológiai funkcióik sokfélesége meghatározza taxonómiájuk összetettségét.

Javasoljuk a fehérjék szerkezeti és funkcionális elvek szerinti osztályozását.

„Ma túl sokat tudunk a fehérjékről ahhoz, hogy elégedettek legyünk a régi osztályozással, és túl keveset ahhoz, hogy jobbat alkossunk” – a fehérjeosztályozás helyzetének ez a meghatározása a mai napig aktuális.

Gyakorlati szempontból a fehérjék osztályozása meglehetősen kényelmes, figyelembe véve kémiai összetételük és fizikai-kémiai tulajdonságaik sajátosságait.

Ezen osztályozás szerint az összes fehérjét 2 csoportra osztják: egyszerű (fehérjék) és összetett (fehérjék.

NAK NEK fehérjék (egyszerű fehérjék) csak aminosavakból álló fehérjéket tartalmaznak.

Ezeket viszont csoportokra osztják az aminosav-összetétel fizikai-kémiai tulajdonságaitól és jellemzőitől függően. Az egyszerű fehérjék következő csoportjait különböztetjük meg:

· albuminok,

· globulinok,

· protaminok,

· hisztonok,

· prolaminok,

· glutelin,

· proteinoidok.

Albumin – fehérjék széles körben elterjedt csoportja az emberi test szöveteiben. Viszonylag alacsony molekulatömegük van, 50 – 70 ezer dalton. A fiziológiás pH tartományban lévő albuminok negatív töltésűek, mivel összetételükben található magas glutaminsav tartalom miatt 4,7 pH-értéken izoelektromos állapotban vannak. Alacsony molekulatömeggel és kifejezett töltéssel rendelkező albuminok az elektroforézis során meglehetősen nagy sebességgel mozognak. Az albuminok aminosav-összetétele változatos, az esszenciális aminosavak teljes skáláját tartalmazzák. Az albuminok erősen hidrofil fehérjék. Desztillált vízben oldódnak. Az albuminmolekula körül erős hidratáló héj képződik, ezért magas, 100%-os koncentrációjú ammónium-szulfát szükséges az oldatokból való kisózáshoz. Az albuminok szerkezeti és szállítási funkciót látnak el a szervezetben, és részt vesznek a vér fizikai és kémiai állandóinak fenntartásában.

Globulinok– fehérjék széles körben elterjedt csoportja, általában az albuminokat kísérő. Nagyobb molekulatömegük van, mint az albuminoknak - körülbelül 200 ezer dalton, ezért lassabban mozognak az elektroforézis során. A globulinok izoelektromos pontja pH 6,3-7 között van. Különböző aminosavak jellemzik őket. A globulinok desztillált vízben oldhatatlanok, KCl és NaCl sóoldataiban 5-10%-os koncentrációban oldódnak. A globulinok kevésbé hidratáltak, mint az albuminok, ezért már 50%-os ammónium-szulfáttal telített oldatokból kisózzák őket. A szervezetben lévő globulinok szerkezeti, védő és szállító funkciókat látnak el.

Hisztonok– kis molekulatömege 11-24 ezer dalton. Gazdag lúgos aminosavakban, lizinben és argininben, ezért izoelektromos állapotban vannak erősen lúgos környezetben, pH 9,5-12 között. Fiziológiás körülmények között a hisztonok pozitív töltéssel rendelkeznek. A különböző típusú hisztonokban az arginin és a lizin tartalma változó, ezért 5 osztályba sorolják őket. A H1 és H2 hisztonok lizinben, a H3 hisztonok argininben gazdagok. A hisztonmolekulák polárisak, nagyon hidrofilek, ezért nehezen sózhatók ki az oldatokból. A sejtekben a pozitív töltésű hisztonok jellemzően a kromatinban lévő negatív töltésű DNS-hez kapcsolódnak. A kromatinban lévő hisztonok vázat alkotnak, amelyre a DNS-molekula feltekercselődik. A hisztonok fő funkciói strukturális és szabályozó.

Protaminok– kis molekulatömegű lúgos fehérjék. Molekulatömegük 4-12 ezer dalton. A protaminok akár 80%-ban arginint és lizint tartalmaznak. A tejhalak nukleoproteinekjében találhatók - klupein (hering), makréla (makréla).

Prolaminok, glutelinok – glutaminsavban (akár 43%) és hidrofób aminosavakban gazdag növényi fehérjék, különösen prolin (10-15%). A prolaminok és glutelinek aminosav-összetételük sajátosságai miatt vízben és sóoldatban oldhatatlanok, de 70%-os etil-alkoholban oldódnak. A prolaminok és a glutelinok a gabonafélék táplálékfehérjéi, az úgynevezett gluténfehérjéket alkotják. A gluténfehérjék közé tartozik a szekalin (rozs), a gliadin (búza), a hordein (árpa), az avenin (zab). Gyermekkorban gluténfehérjékkel szembeni intolerancia léphet fel, amelyek ellen a bél limfoid sejtjeiben antitestek termelődnek. Cöliákia enteropathia alakul ki, és a bélenzimek aktivitása csökken. Ebben a tekintetben 4 hónapos kor után ajánlott gabonafőzeteket adni a gyermekeknek. A rizs és a kukorica nem tartalmaz gluténfehérjét.

Proteinoidok(fehérjeszerű) - fibrilláris vízben oldhatatlan fehérjék. A támasztószövetek (csontok, porcok, inak, szalagok) részét képezik. Kollagén, elasztin, keratin, fibroin képviseli őket.

kollagén ( születési ragasztó ) – A szervezetben széles körben elterjedt fehérje, a szervezetben lévő összes fehérje körülbelül egyharmadát teszi ki. A csontok, porcok, fogak, inak és más szövetek része.

A kollagén aminosav-összetételének sajátosságai elsősorban a glicin (az összes aminosav 1/3-a), a prolin (az összes aminosav 1/4-e) és a leucin tartalma. A kollagén ritka aminosavakat, hidroxiprolint és hidroxilizint tartalmaz, de hiányoznak belőle ciklikus aminosavak.

A kollagén polipeptid láncai körülbelül 1000 aminosavat tartalmaznak. A kollagénnek többféle típusa létezik, attól függően, hogy a benne lévő különböző típusú polipeptidláncok milyen kombinációban vannak jelen. A rostképző kollagén típusok közé tartozik az I-es típusú kollagén (túlnyomórészt a bőrben), a II-es típusú kollagén (a porcokban dominál) és a III-as típusú kollagén (az erekben túlnyomóan). Újszülötteknél a kollagén zöme III-as, felnőtteknél II-es és I-es típusú.

A kollagén másodlagos szerkezete egy „megtört” alfa hélix, amelynek fordulata 3,3 aminosavat tartalmaz. A hélix osztásköze 0,29 nm.

A kollagén három polipeptidlánca háromszorosan csavart kötél formájában van elrendezve, hidrogénkötésekkel rögzítve, és a kollagénrost - tropokollagén - szerkezeti egységét alkotják. A tropokollagén struktúrák párhuzamos, hosszirányban eltolt sorokban helyezkednek el, kovalens kötésekkel rögzítik, és kollagénrostokat alkotnak. A tropokollagén közötti terekben a kalcium lerakódik a csontszövetben. A kollagén rostok szénhidrátokat tartalmaznak, amelyek stabilizálják a kollagén kötegeket.

Keratin - haj, köröm fehérjéi. Sók, savak és lúgok oldataiban oldhatatlanok. A keratinok olyan frakciót tartalmaznak, amely nagy mennyiségben (akár 7-12%) kéntartalmú aminosavat tartalmaz, ami diszulfidhidakat képez, amelyek nagy szilárdságot adnak ezeknek a fehérjéknek. A keratinok molekulatömege nagyon magas, eléri a 2 000 000 daltont. A keratinok alfa és béta szerkezetűek lehetnek. Az alfa-keratinokban három alfa-hélix szuperspirálba egyesül protofibrillumokká. A protofibrillumok profibrillumokká egyesülnek, majd makrofibrillákká. A béta-keratinok példája a selyemfibroin.

Elasztin – rugalmas rostok, szalagok, inak fehérje. Az elasztin vízben nem oldódik és nem tud megduzzadni. Az elasztin nagy arányban tartalmaz glicint, valint és leucint (akár 25-30%). Az elasztin terhelés alatt képes megnyúlni és a terhelés eltávolítása után visszaállítani méretét. A rugalmasság azzal jár, hogy az elasztinban nagyszámú láncközi keresztkötés található a lizin aminosav részvételével. A két fehérjelánc lizil-norleucin kötést alkot. Négy fehérjelánc alkot egy dezmozin nevű kötést.

NAK NEK összetett fehérjék (fehérjék) olyan fehérjéket foglalnak magukban, amelyek a fehérje részen kívül nem fehérjetartalmú anyagokat (protéziscsoportokat) is tartalmaznak.

A komplex fehérjéket protéziscsoportjuk kémiai összetétele szerint osztályozzák. A komplex fehérjék következő csoportjait különböztetjük meg:

· kromoproteinek,

· lipoproteinek,

· glikoproteinek,

· foszfoproteinek,

· metalloproteinek.

Kromoproteinek protéziscsoportként színes, nem fehérjevegyületeket tartalmaznak. A kromoproteinek csoportjába tartoznak a hemoproteinek és a flavoproteinek.

Hemoporotheidákban A protéziscsoport a hem - egy szerves, vastartalmú anyag, amely a fehérje vörös színét adja. A hem koordinációs és hidrofób kötéseken keresztül kötődik a fehérje globinhoz. Hemoproteinek például az eritrocita fehérje hemoglobin, izomfehérje mioglobin, szöveti fehérjék, citokrómok, kataláz enzimek, peroxidáz. A hemoproteinek részt vesznek az oxigénszállításban és a szövetek oxidatív folyamataiban.

A flavoproteinekben sárga protéziscsoportot tartalmaz. A FAD és az FMN nukleotidok protéziscsoportként ábrázolhatók. A flavoproteinek közé tartozik a szukcinát-dehidrogenáz enzim. Egyes flavoproteinek tartalmaznak fémeket – metalloflavoproteineket. A flavoproteinek részt vesznek a szervezet oxidatív folyamataiban.

Nukleoproteinek fehérje részből és nukleinsavakból áll: DNS vagy RNS. A dezoxiribonukleoproteinek a sejtmagban, a ribonukleoproteinek pedig a citoszolban lokalizálódnak. A sejtmag nukleoproteinjeiben található fehérjéket főleg hisztonok képviselik. A nukleoproteinek fehérje és nem fehérje részeit ionos és hidrofób kötések kötik össze. A nukleoproteinek teljes hidrolízisével aminosavak, foszforsav, szénhidrátok és purin vagy pirimidin nitrogéntartalmú bázis képződik. A nukleoproteinek részt vesznek a genetikai információ tárolásában és reprodukciójában.

Lipoproteinek Különféle zsírokat tartalmaznak protéziscsoportként (triacilglicerolok, foszfolipidek, koleszterin stb.). A fehérje és a lipid között hidrofób és ionos kötések jönnek létre. A lipoproteineket általában strukturálisra osztják, amelyek a sejtmembránok részét képezik, és transzportra, amelyek a zsírokat szállítják a vérben. A transzport lipoproteinek olyan gömb alakú részecskék, amelyek belsejében hidrofób zsírokat, a felszínen pedig hidrofil fehérjéket tartalmaznak. A lipoproteinre példa a véralvadási faktor, a tromboplasztin.

Foszfoproteinekösszetételükben olyan foszforsav-maradékokat tartalmaznak, amelyek észterkötésekkel kapcsolódnak a fehérjerész szerinjéhez. A foszforsav fehérjéhez való hozzáadása reverzibilis, és ionos kötések kialakulása vagy felszakadása kíséri a foszforsav és a fehérje töltött csoportjai között, ami megváltoztatja a foszfoprotein biológiai aktivitását. A foszfoproteinek közé tartoznak a csontszövet szerkezeti fehérjéi, tejkazeinogén, tojásfehérje-ovotellin, egyes enzimek (foszforiláz, glikogén-szintetáz, TAG-lipáz)

Glikoproteinekáltalában tartalmaznak , szénhidrátmaradékok (monoszacharidok, oligoszacharidok), amelyek glikozidos kötésekkel szilárdan kötődnek. A glikoproteinek általában mozaik szerkezetűek, amelyben szénhidrát és fehérje fragmentumok váltják egymást. A szénhidrát rész specifitást ad a glikoproteineknek és meghatározza azok rezisztenciáját a szöveti enzimekkel szemben. A glikoproteinek széles körben képviseltetik magukat az emberi szervezetben. Mind a szövetekben, mind a biológiai folyadékokban megtalálhatók. A nyálmucin legfeljebb 15% mannózt és galaktózt tartalmaz. A glikoproteinek néhány

A fehérjék elsődleges szerkezetének meghatározásának első lépése egy adott fehérje aminosav-összetételének minőségi és mennyiségi értékelése.

A fehérjék savas hidrolízise

Az aminosav-összetétel meghatározásához a fehérjében lévő összes peptidkötést meg kell semmisíteni. A vizsgált fehérjét 6 mol/l-es sósavban 110 °C körüli hőmérsékleten 24 órán keresztül hidrolizálják, ennek eredményeként a fehérje peptidkötései tönkremennek, és csak szabad aminosavak vannak jelen a hidrolizátumban.

Aminosavak szétválasztása ioncserélő kromatográfiával A fehérjék savas hidrolízisével nyert aminosav-keveréket egy oszlopon kationcserélő gyantával választják el.

A kapott frakciók kvantitatív elemzése. az aminosavak külön frakcióit ninhidrinnel hevítik, amely vörös-ibolya színű vegyületet képez. A minta színének intenzitása arányos a benne lévő aminosav mennyiségével.

2. Az aminosav szekvencia meghatározása fehérjében

Az N-terminális aminosav meghatározása fehérjében és aminosavszekvencia meghatározása oligopeptidekben

A fehérjék elsődleges szerkezetének vizsgálata fontos általános biológiai és orvosi jelentőséggel bír. Az egyes aminosavmaradékok váltakozási sorrendjének vizsgálatával a fehérjék térszerkezetének kialakulásában általános alapvető mintázatok azonosíthatók, számos genetikai betegség hátterében a fehérjék aminosavsorrendjének megzavarása áll. A normál és mutáns fehérjék elsődleges szerkezetére vonatkozó információk hasznosak lehetnek a betegség diagnosztizálásában és előrejelzésében.

A fehérjék elsődleges szerkezetének kialakítása 2 fő szakaszból áll:

a vizsgált fehérje aminosav-összetételének meghatározása;

aminosav szekvencia egy fehérjében.

Például sarlósejtes vérszegénységben a hemoglobin β láncának hatodik pozíciója kicserélődik glutaminsav tovább valin. Ez a hemoglobin S szintéziséhez vezet. HbS) - hemoglobin, amely dezoxi formában polimerizálódik és kristályokat képez. Ennek eredményeként a vörösvértestek deformálódnak, sarló alakot vesznek fel, elveszítik rugalmasságukat, és a kapillárisokon áthaladva elpusztulnak. Ez végül a szövetek oxigénellátásának csökkenéséhez és nekrózishoz vezet.

Az elsődleges szerkezetben az aminosavak sorrendje és aránya határozza meg a kialakulását másodlagos, harmadlagosÉs negyedidőszak szerkezetek.

8 . A fehérje másodlagos szerkezete– a peptidvázat alkotó funkciós csoportok közötti kölcsönhatások eredményeként kialakuló térszerkezet.kétféle szabályos szerkezet: a-hélix és b-struktúra.

Kialakul a másodlagos szerkezet csak hidrogénkötések részvételével peptidcsoportok között: az egyik csoport oxigénatomja reakcióba lép a második hidrogénatomjával, ugyanakkor a második peptidcsoport oxigénje a harmadik hidrogénatomjával kötődik stb.

α-Hélix

a peptid gerince a karbonilcsoportok oxigénatomjai és az aminocsoportok nitrogénatomjai között hidrogénkötések kialakulása miatt spirálba csavarodik. A hidrogénkötések a hélix tengelye mentén helyezkednek el. Az α-hélix fordulatánként 3,6 aminosav található.

A peptidcsoportok szinte minden oxigén- és hidrogénatomja részt vesz a hidrogénkötések kialakításában. Ennek eredményeként az α-hélixet sok hidrogénkötés „összehúzza”. A kötések gyengének minősülnek, számuk biztosítja az α-hélix lehető legnagyobb stabilitását. az α-hélixek hidrofilitása csökken, és hidrofóbitásuk nő.

A spirális szerkezet a peptidváz legstabilabb konformációja, amely megfelel a minimális szabad energiának. Az α-hélixek képződése következtében a polipeptidlánc lerövidül.

Az aminosav gyökök az α-hélix külső oldalán helyezkednek el, és a peptid gerincétől elfelé irányulnak; néhányuk megzavarhatja az α-hélix kialakulását. Ezek tartalmazzák:

prolin Nitrogénatomja egy merev gyűrű része, ami kizárja az -N-CH- kötés körüli forgás lehetőségét. Ezenkívül a prolit nitrogénatom, amely egy másik aminosavval peptidkötést képez, nem rendelkezik hidrogénatommal. Ennek eredményeként a prolin nem tud hidrogénkötést kialakítani a peptidváz ezen a pontján, és az α-helikális szerkezet megbomlik. Jellemzően a peptidlánc ezen a pontján hurok vagy hajlítás lép fel;

olyan területek, ahol egymás után több azonos töltésű gyök található, amelyek között elektrosztatikus taszító erők lépnek fel;

olyan területeken, ahol szorosan elhelyezkedő, terjedelmes gyökök találhatók, amelyek mechanikusan megzavarják az α-hélix képződését, például metionin, triptofán

β-redős réteg A szerkezet az egyik polipeptidlánc lineáris régióinak peptidcsoportjainak atomjai között kanyargó, vagy különböző polipeptidláncok között kialakuló sok hidrogénkötés következtében alakul ki, a β-struktúra egy laphoz hasonló alakzatot alkot. Ha hidrogénkötések jönnek létre a különböző polipeptidláncok peptidvázának atomjai között, ezeket láncközi kapcsolatoknak nevezzük. Az egy polipeptidláncon belüli lineáris régiók között létrejövő hidrogénkötéseket intraláncnak nevezzük. A β-struktúrákban a hidrogénkötések a polipeptidláncra merőlegesen helyezkednek el.

Ha az összekapcsolt polipeptidláncok ellentétes irányúak, akkor antiparallel a-redős szerkezet jön létre, de ha a polipeptidláncok N- és C-terminálisai egybeesnek, akkor párhuzamos a-szeres szerkezet alakul ki.

9. Harmadlagos szerkezet– ez egy polipeptidlánc gömbölyűvé („golyóvá”) való elrendeződése. A másodlagos és harmadlagos struktúrák között nem lehet egyértelmű határt húzni, a tercier szerkezet a láncban egymástól távol elhelyezkedő aminosavak közötti sztérikus kapcsolatokon alapul. A harmadlagos szerkezetnek köszönhetően a láncképzés még tömörebb. A fehérje harmadlagos szerkezetének stabilizálásában a következők vesznek részt:

kovalens kötések (két cisztein-maradék között - diszulfid hidak);

ionos kötések az aminosavak ellentétes töltésű oldalcsoportjai között;

hidrogénkötések;

hidrofil-hidrofób kölcsönhatások. Amikor kölcsönhatásba lép a környező vízmolekulákkal, a fehérjemolekula „hajlamos” a hajtogatásra, így az aminosavak nempoláris oldalcsoportjai izolálódnak a vizes oldatból; poláris hidrofil oldalcsoportok jelennek meg a molekula felületén.

Kapcsolat az elsődleges szerkezettel. A harmadlagos szerkezetet nagymértékben előre meghatározza az elsődleges szerkezet. A fehérje harmadlagos szerkezetének az elsődleges szerkezeten alapuló előrejelzésére irányuló erőfeszítést fehérjeszerkezet-előrejelzési problémának nevezik. Azonban a környezet, amelyben a fehérje redősödik, jelentősen meghatározza a végső formát, de a jelenlegi előrejelzési módszerek általában nem veszik közvetlenül figyelembe. A legtöbb ilyen módszer a már ismert szerkezetekkel való összehasonlításra támaszkodik, és így közvetetten beépíti a környezetet is.. A fehérjék szuperszekunder szerkezete. A különböző szerkezetű és funkciójú fehérjék konformációinak összehasonlítása másodlagos szerkezeti elemek hasonló kombinációinak jelenlétét mutatta ki. A másodlagos struktúrák kialakulásának ezt a sajátos sorrendjét a fehérjék szuperszekunder szerkezetének nevezzük, amely interradikális kölcsönhatások következtében jön létre. Az a-hélixek és b-struktúrák bizonyos jellegzetes kombinációit gyakran "szerkezeti motívumoknak" nevezik.

A fehérjék aminosav-összetételének meghatározása többféle módszerrel történhet: kémiai, kromatográfiás, mikrobiológiai és izotópos módszerekkel. A kromatográfiás módszereket gyakrabban alkalmazzák.

Papírkromatográfia. A papírkromatográfiát fehérjék és polipeptidek részleges hidrolízisével nyert di- és tripeptidekkel alkotott aminosav-keverék komponenseinek azonosítására használják.

A hidrolízist savas, lúgos vagy enzimes módszerekkel végezhetjük. A savas módszert gyakrabban alkalmazzák (6 N HCl, 8 N H 2 SO 4). A hidrolízist hevítéssel hajtják végre, néha emelt nyomáson. A hidrolízis végére utaló jelek lehetnek: a hidrolizátumban a karboxil- vagy amincsoportok növekedésének leállása, vagy negatív biuretreakció. A hidrolizáló reagens feleslegét eltávolítjuk: a kénsavat Ca(OH) 2-vel, a sósavat vákuumban ledesztilláljuk, a maradék savat ezüst-nitráttal kicsapjuk.

A hidrolizátum komponensei a cellulózon adszorbeált víz, amely az állófázis, és egy szerves oldószer, a mozgófázis között oszlanak meg, amely a lap mentén felfelé vagy lefelé mozog. Mozgófázisként butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányú keverékét használjuk. A lipofil aminosavak erősebben vonzódnak a szerves oldószerhez, míg a hidrofilebbek nagyobb hajlamot mutatnak az állófázishoz való kötődésre. A homológ vegyületek, amelyek akár egy metilénegységben is különböznek egymástól, különböző sebességgel mozognak és könnyen szétválaszthatók. A kromatográfia végén a papírt szárítjuk, előhívóval kezeljük (0,5%-os ninhidrin oldat aceton-jégecet-víz elegyben), majd néhány percig melegítjük. Az aminosavak színes foltok formájában jelennek meg. A mobilitás az egyes vegyületekre jellemző állandó érték, és a molekulatömeg növekedésével növekszik. Az egyenes láncú aminosavak mobilitási értéke valamivel magasabb, mint a megfelelő izomerek esetében. A poláris csoportok bejuttatása a molekulába csökkenti a vegyület mobilitását. A terjedelmes, nem poláris oldalláncú aminosavak (leucin, izoleucin, fenilalanin, triptofán stb.) gyorsabban mozognak, mint a rövidebb nempoláris oldalláncokkal (prolin, alanin, glicin) vagy poláris oldalláncokkal (treonin, arginin, cisztein, hisztidin) rendelkező aminosavak, lizin). Ez annak köszönhető, hogy a poláris molekulák jobban oldódnak a hidrofil állófázisban és a nem poláris molekulák szerves oldószerekben.

A papírkromatográfia használható az aminosavtartalom mennyiségi meghatározására. Mindegyik foltot kivágjuk és megfelelő oldószerrel eluáljuk; majd kvantitatív kolorimetriás (ninhidrin) vizsgálatot végzünk. Egy másik kiviteli alakban a papírt ninhidrinnel permetezzük, és a folt színintenzitását fotométerrel mérjük visszavert vagy áteresztett fényben. A félkvantitatív értékelés során az aminosav-tartalmat a kromatogramon lévő foltok területe alapján értékelik, amelyek arányosak az elválasztandó keverékben lévő aminosav-koncentrációkkal.

Vékonyréteg-kromatográfia. A vékonyréteg-kromatográfia használható aminosavak elkülönítésére és meghatározására is. A TLC, mint ismeretes, két változatban létezik. A megosztásos TLC hasonló a papíron lévő megosztásos TLC-hez, és az adszorpciós TLC teljesen más elveken alapul.

Ha cellulózporon vagy más, viszonylag közömbös hordozón RTLC-t végeznek, ugyanazok az oldószerrendszerek és ugyanazok az előhívó reagensek használhatók, mint a papírkromatográfiában.

Az ATLC-vel történő elválasztást az határozza meg, hogy egy oldószer (ez az oldószer nem feltétlenül bináris vagy összetettebb keverék) képes-e eluálni a minta komponenseit az aktivált szorbens adszorpciójának helyéről. Például fűtött szilikagélen. Az ATLC hasznos a nem poláris vegyületek, például lipidek elválasztására, de nem az aminosavak és a legtöbb peptid elválasztására. Az aminosavak elválasztásához RTLC-t használnak, amely lehetővé teszi a fehérje-hidrolizátumok 22 aminosavának gyors elkülönítését és meghatározását.

A fehérje-hidrolizátumban lévő aminosavak gázkromatográfiával is meghatározhatók, de a kromatográfiás elemzés előtt az aminosavakat általában illékony vegyületekké alakítják.

Kölcsönhatás ninhidrinnel. A megfelelő aldehidek keletkeznek.

Így aldehidek keverékét kapjuk és elemzik. Ez a legegyszerűbb eset, csak néhány aminosavra alkalmas.

Az aminosavak illékony észterekké alakulnak (alkil-észterek, hidroxisavak metil-észterei, klórozott savak metil-észterei stb.).

A származékok kiválasztása a vizsgált aminosavak keverékétől függ.

Ioncserélő kromatográfia. Jelenleg az élelmiszerek aminosav-összetételét kizárólag automatikus ioncserélő kromatográfiával határozzák meg.

A szerves ionok esetében az ioncserélő rögzített töltéseivel való elektrosztatikus kölcsönhatást az ion szerves részének az ioncserélő mátrixszal való hidrofób kölcsönhatása felülírja. A szerves ionok visszatartásában való részvételének csökkentése és elválasztásuk optimális szelektivitása érdekében szerves komponenst (1-25% metanol, izopropanol, acetonitril) adnak a vizes eluenshez.

A Moore és Stein módszer Na + formájú szulfonált polisztirol gyantával töltött rövid és hosszú oszlopokat használ. Ha pH = 2-es savas hidrolizátumot viszünk fel az oszlopra, az aminosavak nátriumionokkal történő kationcserén keresztül kötődnek meg. Az oszlopot ezután nátrium-citrát oldattal eluáljuk előre programozott pH- és hőmérsékletértékeken. Egy rövid oszlopot egy pufferrel, egy hosszú oszlopot kettővel eluálunk. Az eluátumot ninhidrinnel kezeljük, és áramlási koloriméterrel mérjük a színintenzitást. Az adatok automatikusan rögzítésre kerülnek egy térképrögzítőn, és átvihetők egy számítógépre a csúcs alatti terület kiszámításához.

Nagyfeszültségű elektroforézis inert hordozókon. A biokémiában széles körben elterjedt az aminosavak, polipeptidek és egyéb amfolitok (molekulák, amelyek össztöltése a környezet pH-jától függ) elválasztása alkalmazott állandó elektromos tér hatására. Ez a nagyfeszültségű elektroforézis módszere inert hordozókon. Az aminosavak szétválasztásakor leggyakrabban papírcsíkokat vagy vékony cellulózport használnak inert hordozóként. Az elválasztást 0,5-2 órán keresztül 2000-5000 V feszültségen végezzük, az amfolitok teljes töltésétől és molekulatömegüktől függően. Az azonos töltést hordozó molekulák között a könnyebbek gyorsabban vándorolnak. De az elválasztás során fontosabb paraméter a teljes töltés. A módszert aminosavak, kis molekulatömegű peptidek, egyes fehérjék és nukleotidok elválasztására használják. A mintát a hordozóra helyezzük, megfelelő pH-jú pufferrel megnedvesítjük, és egy szűrőpapírcsíkkal a puffertartályhoz csatlakoztatjuk. A papírt üveglappal letakarják vagy szénhidrogén oldószerbe merítik hűtés céljából. Az elektromos térben az adott pH mellett negatív töltést hordozó molekulák az anódra, a pozitív töltést hordozó molekulák pedig a katódra vándorolnak. Ezt követően a szárított elektroferogramot ninhidrinnel „fejlesztik” (amikor aminosavakkal, peptidekkel dolgozunk), vagy mérjük az UV fényben való elnyelést (nukleotidokkal végzett munka során).

A pH megválasztását a keverék molekuláiban lévő disszociáló csoportok pK-értékei határozzák meg. 6,4 pH-értéken a glutamát és az aszpartát –1 töltést hordoz, és az anód felé halad; szétválasztásuk a molekulatömeg-különbség miatt történik. A lizin, az arginin és a hisztidin az ellenkező irányba mozog, a fehérjét alkotó összes többi aminosav pedig az alkalmazás helyének közelében marad. Az enzimatikus emésztésből származó peptidek szétválasztásakor a pH 3,5-re való csökkentése növeli a kationos csoportok töltését és jobb elválasztást biztosít.

R-COOH ↔ R-COO – + H +

R-NH 3 + ↔ R-NH 2 + H + (konjugált savak és bázisok)

Az R-COOH és az R-NH 3 + gyenge savak, de az első több nagyságrenddel erősebb. Ezért leggyakrabban (vérplazma, sejtközi folyadék pH 7,1-7,4) a karboxilcsoportok karboxilát ionok formájában vannak, az aminocsoportok protonálódnak. Az aminosavak egyetlen pH-értéken sem léteznek molekuláris (nem disszociált) formában. Az a-aminosav és az a-aminosavban lévő a-aminocsoport hozzávetőleges pK értéke 2, illetve 10.

Egy aminosav teljes (teljes) töltése (az összes pozitív és negatív töltés algebrai összege) függ a pH-tól, azaz. az oldatban lévő protonok koncentrációjáról. Egy aminosav töltése megváltoztatható a pH változtatásával. Ez megkönnyíti az aminosavak, peptidek és fehérjék fizikai szétválasztását.

Azt a pH-értéket, amelynél egy aminosav teljes töltése nulla, és ezért nem mozog állandó elektromos térben, izoelektromos pontnak (pI) nevezzük. Az izoelektromos pont a disszociáló csoportok legközelebbi pK-értékei között félúton található.

A papír-, vékonyréteg-kromatográfiás, mikrobiológiai, gázkromatográfiás és számos egyéb módszert jelenleg gyakorlatilag nem alkalmazzák a rossz reprodukálhatóság és a hosszú időtartam miatt. A modern kromatográfok lehetővé teszik, hogy 2-4 óra alatt akár 5%-os reprodukálhatósággal meghatározzuk az egyes komponensekből mindössze 10 –7 –10 –9 mol aminosav-összetételt.

Az aminosav-összetétel elemzése magában foglalja a vizsgált fehérje vagy peptid teljes hidrolízisét és a hidrolizátumban lévő összes aminosav mennyiségi meghatározását. Mivel a peptidkötések semleges pH-n stabilak, savas vagy lúgos katalízist alkalmaznak. Az enzimatikus katalízis kevésbé alkalmas a teljes hidrolízisre. Egy fehérje aminosavakká történő teljes hidrolízise elkerülhetetlenül együtt jár néhány aminosav-maradék részleges elvesztésével. A hidrolízishez általában 6N-t használnak. vizes sósavoldat (110 ºС), evakuált ampullában. A hidrolizátumban lévő aminosavak mennyiségi meghatározását aminosav-analizátorral végezzük. A legtöbb ilyen analizátorban az aminosavak keverékét szulfon-kationcserélőn választják el, és a detektálást spektrofotometriásan ninhidrinnel reagáltatva vagy fluorimetriásan O- ftálsav-dialdehid.

Azonban a hasonló termékek aminosav-összetételére vonatkozó adatok, amelyeket különböző laboratóriumokban az egyes aminosavakra vonatkozóan nyernek, néha akár 50%-kal is eltérnek.

Ezek a különbségek nemcsak fajta-, faj- vagy technológiai különbségekből, hanem főként az élelmiszertermék hidrolízisének körülményeiből adódnak. A szokásos savas hidrolízissel (6 N HСl, 110–120ºС, 22–24 óra) egyes aminosavak részlegesen elpusztulnak, beleértve a treonint, a szerint (10–15%-kal és minél többel, annál hosszabb a hidrolízis) és különösen metionin (30-60%) és cisztin 56-60%, valamint a triptofán és a cisztein szinte teljes elpusztítása. Ez a folyamat fokozódik, ha a termékben nagy mennyiségű szénhidrát van jelen. A metionin és a cisztin mennyiségi meghatározásához ezek előzetes oxidációját perhangyasavval javasolt elvégezni. Ebben az esetben a cisztin ciszteinsavvá, a metionin pedig metionin-szulfonná alakul, amelyek nagyon stabilak a későbbi savas hidrolízis során.

Az aminosavelemzésben nehéz feladat a triptofán meghatározása. Mint már említettük, a savas hidrolízis során szinte teljesen megsemmisül (akár 90%). Ezért a triptofán meghatározásához a 2 N alkalikus hidrolízisének egyik változatát hajtjuk végre. NaOH, 100ºС, 16-18 óra 5% ón-klorid vagy 2 N jelenlétében. bárium-hidroxid, amelyben enyhén (legfeljebb 10%) megsemmisül. A minimális lebomlás tioglikolsav és előhidrolizált keményítő jelenlétében megy végbe. (A lúgos hidrolízis során a szerin, a treonin, az arginin és a cisztein elpusztul). A citrom- és sósav keverékével történő semlegesítés után a hidrolizátumot azonnal elemzik (a gélesedés elkerülése érdekében) aminosav-elemző készüléken. Ami a triptofán meghatározására szolgáló számos kémiai módszert illeti, ezek általában rosszul reprodukálhatók élelmiszerekben, ezért alkalmazásuk nem javasolt.

A húskészítményeknél további esszenciális aminosav a hidroxiprolin, amely a húsban található kötőszöveti fehérjék mennyiségét jellemzi. Meghatározható ioncserélő kromatográfiával automatikus analizátorral vagy kémiai kolorimetriás módszerrel. A módszer a savas hidrolizátum pH 6,0-ra történő semlegesítésén, a hidroxiprolin ezt követő oxidációján alapul klóramin T (vagy klóramin B) 1,4%-os propil-alkohol és puffer keverékével készült oldatával, valamint az oxidációs termékek kolorimetriás meghatározása 533 nm-en. hidroxiprolin 10% -os reakció után - para-dimetil-amino-benzaldehid oldata perklórsav és propil-alkohol keverékében (1:2).

Tekintettel arra, hogy a tirozin, a fenilalanin és a prolin oxigén jelenlétében részben oxidálható, a standard savas hidrolízist nitrogén atmoszférában javasolt elvégezni. Számos aminosav, köztük a leucin, az izoleucin és a valin, hosszabb savas hidrolízist igényel a fehérjéktől való teljes izoláláshoz - akár 72 óráig.. A biokémiában a fehérjék elemzésekor párhuzamos mintákat 24, 48, 72 és 96 órán keresztül hidrolizálnak.

Az összes aminosav pontos mennyiségi meghatározásához 5 különböző hidrolízist kell végrehajtani, ami nagymértékben meghosszabbítja a meghatározást. Általában 1-2 hidrolízist hajtanak végre (standard sósavval és előzetes oxidáció perhangyasavval).

Az aminosavak elvesztésének elkerülése érdekében a savas hidrolízis során a felesleges sav eltávolítását azonnal el kell végezni vákuum-exszikkátorban desztillált víz hozzáadásával végzett ismételt bepárlással.

Ha az analizátor megfelelően működik, az ioncserélő oszlopok elég hosszú ideig működnek anélkül, hogy a gyantát kicserélnék. Ha azonban a minták jelentős mennyiségű színezéket és lipidet tartalmaznak, az oszlop gyorsan eltömődik, és többszöri regenerációra van szükség, amely néha az oszlop újracsomagolásával jár, hogy helyreállítsa az elválasztási képességét. Ezért az 5%-nál több zsírt tartalmazó termékeknél ajánlatos először a lipideket extrakcióval eltávolítani. A 2.3. táblázat a fő élelmiszerek minta-előkészítési feltételeit mutatja be az aminosav-összetétel elemzésekor.

2.3. táblázat. – Az élelmiszerminták elemzésre történő előkészítésének feltételei

	Lipid eltávolítási módszer	Fehérje tömegaránya: HCl (6M)
Fehérje koncentrátumok (izolátumok)	Nem szükséges
Hús, hal, hús- és halkonzervek, belsőségek)	Extrahálás 10-szeres dietil-éterrel 3-4-szer vagy 10-szeres etanol-kloroform (1:2) 2-szer
Tej és tejtermékek	Extrahálás 10-szeres mennyiségű mintával etanol-kloroform (1:2) keverékével kétszer
Gabona és gabonatermékek	Nem szükséges
Növényi termékek	Nem szükséges
Hús-zöldség és hal-zöldség termékek	Extrahálás 10-szeres mennyiségű dietil-éterrel 3-4 alkalommal; etanol-kloroform (1:2) elegye a 2-szeres mennyiség 10-szeresével
Tojás, tojástermékek	Extrahálás etanol-kloroform (1:2 arányú) eleggyel, a lemért mennyiség 10-szerese, kétszerese

A fehérjéket alkotó aminosavak meghatározására savas (HC1), lúgos (Ba(OH)2) és enzimatikus hidrolízist alkalmaznak. Amikor tiszta, szennyeződésektől mentes fehérjét hidrolizálnak, 20 különböző aminosav szabadul fel.

Aminosavak, a fehérjék összetevői
a-aminosavak. Mindegyik az L-sorozatba tartozik, és az optikai forgás nagysága és előjele az aminosav gyökök természetétől és az oldat pH-értékétől függ. A D-aminosavak nem találhatók meg az emberi fehérjékben, de megtalálhatók a baktériumok sejtfalában, egyes antibiotikumok (actinomycin) részeként.

Az aminosavak az R gyök kémiai természetében különböznek egymástól, amely nem vesz részt a peptidkötés kialakításában.

Az aminosavak modern ésszerű osztályozása a gyökök polaritásán alapul:

Nem poláris (hidrofób)

Poláris (hidrofil)

Negatív töltésű

Egyes fehérjékben megtalálható aminosav származékok. A kötőszöveti kollagén fehérje hidroxiprolint és oxilizint tartalmaz. A dijódtirozin a pajzsmirigyhormonok szerkezetének alapja.

Az aminosavaknak közös tulajdonságuk van - amfoter(a görög amphoteros szóból - kétoldalas). A 4,0-9,0 pH tartományban szinte minden aminosav bipoláris ionok (ikerionok) formájában létezik. Jelentése aminosav izoelektromos pontja (IEP, pI) képlettel számolva:

Monoamino-dikarbonsavak esetén a pI-t az a- és w-karboxilcsoportok pK-értékeinek feleként (1. táblázat), a diamino-monokarbonsavak esetében az a- és w-csoport pK-értékeinek feleként számítjuk ki. aminocsoportok.

Vannak nem esszenciális aminosavak (az emberi szervezetben szintetizálhatók), és esszenciális aminosavak, amelyek nem képződnek a szervezetben, és táplálékkal kell ellátni őket.

Esszenciális aminosavak: valin, leucin, izoleucin, lizin, metionin, treonin, triptofán, fenilalanin.

Esszenciális aminosavak: glicin, alanin, aszparagin, aszpartát, glutamin, glutamát, prolin, szerin.

Feltételesen cserélhető(más aminosavakból szintetizálható a szervezetben): arginin (citrullinból), tirozin (fenilalaninból), cisztein (szerinből), hisztidin (glutamin részvételével).

A biológiai tárgyakban található aminosavak felfedezésére és mennyiségi meghatározására ninhidrinnel való reakciót alkalmaznak.

1. táblázat Aminosav disszociációs állandók

Aminosav	pK 1	pK 2	pK 3
Alanya	2,34	9,69
Arginin	2,18	9,09	13,2
Aszparagin	2,02	8,80
Aszparaginsav	1,88	3,65	9,60
Valii	2,32	9,62
hisztidin	1,78	5,97	8,97
glicin	2,34	9,60
Glutamin	2,17	9,13
Glutaminsav	2,19	4,25	9,67
Izoleucin	2,26	9,62
Leucin	2,36	9,60
Lizin	2,20	8,90	10,28
metionin	2,28	9,21
Prolin	1,99	10,60
Sorozat	2,21	9,15
Tirozin	2,20	9,11	10,07
Treonin	2,15	9,12
triptofán	2,38	9,39
Fenilalanin	1,83	9,13
cisztein	1,71	8,33	10,78

Ha cellulózporon vagy más, viszonylag közömbös hordozón RTLC-t végeznek, ugyanazok az oldószerrendszerek és ugyanazok az előhívó reagensek használhatók, mint a papírkromatográfiában.

A fehérje-hidrolizátumban lévő aminosavak gázkromatográfiával is meghatározhatók, de a kromatográfiás elemzés előtt az aminosavakat általában illékony vegyületekké alakítják.

Kölcsönhatás ninhidrinnel. A megfelelő aldehidek keletkeznek.

Így aldehidek keverékét kapjuk és elemzik. Ez a legegyszerűbb eset, csak néhány aminosavra alkalmas.

Az aminosavak illékony észterekké alakulnak (alkil-észterek, hidroxisavak metil-észterei, klórozott savak metil-észterei stb.).

A származékok kiválasztása a vizsgált aminosavak keverékétől függ.

Ioncserélő kromatográfia. Jelenleg az élelmiszerek aminosav-összetételét kizárólag automatikus ioncserélő kromatográfiával határozzák meg.

Ioncserélő kromatográfia az oldatban lévő ionok reverzibilis sztöchiometrikus cseréjén alapul az ioncserélőben lévő ionokkal (kationcserélő, anioncserélő), valamint az elválasztott ionok eltérő ioncserélő képességén az ionogén anyagok disszociációja eredményeként kialakuló rögzített szorbens ionokkal. csoportok. A szerves ionok esetében az ioncserélő rögzített töltéseivel való elektrosztatikus kölcsönhatást az ion szerves részének az ioncserélő mátrixszal való hidrofób kölcsönhatása felülírja. A szerves ionok visszatartásában való részvételének csökkentése és elválasztásuk optimális szelektivitása érdekében szerves komponenst (1-25% metanol, izopropanol, acetonitril) adnak a vizes eluenshez.

Az aminosavak legalább két gyengén ionizált csoportot hordoznak: -COOH és -NH 3 +. Oldatban ezek a csoportok két formában vannak, töltéssel és töltés nélkül, amelyek között a protonegyensúly fennmarad: R-COOH «R-COO – + H + R-NH 3 + «R-NH 2 + H + (konjugált savak és bázisok) ) R -COOH és R-NH 3 + gyenge savak, de az első több nagyságrenddel erősebb. Ezért leggyakrabban (vérplazma, sejtközi folyadék pH 7,1-7,4) a karboxilcsoportok karboxilát ionok formájában vannak, az aminocsoportok protonálódnak. Az aminosavak egyetlen pH-értéken sem léteznek molekuláris (nem disszociált) formában. Az a-aminosav és az a-aminosavban lévő a-aminocsoport hozzávetőleges pK-értéke 2, illetve 10. Egy aminosav teljes (teljes) töltése (az összes pozitív és negatív töltés algebrai összege) függ a pH-tól, azaz. az oldatban lévő protonok koncentrációjáról. Egy aminosav töltése megváltoztatható a pH változtatásával. Ez megkönnyíti az aminosavak, peptidek és fehérjék fizikai szétválasztását. Azt a pH-értéket, amelynél egy aminosav teljes töltése nulla, és ezért nem mozog állandó elektromos térben, izoelektromos pontnak (pI) nevezzük. Az izoelektromos pont a disszociáló csoportok legközelebbi pK-értékei között félúton található.

Azonban a hasonló termékek aminosav-összetételére vonatkozó adatok, amelyeket különböző laboratóriumokban az egyes aminosavakra vonatkozóan nyernek, néha akár 50%-kal is eltérnek.

Ezek a különbségek nemcsak fajta-, faj- vagy technológiai különbségekből, hanem főként az élelmiszertermék hidrolízisének körülményeiből adódnak. A szokásos savas hidrolízissel (6 N HСl, 110–120ºС, 22–24 óra) egyes aminosavak részlegesen elpusztulnak, beleértve a treonint, a szerint (10–15%-kal és minél többel, annál hosszabb ideig megy végbe a hidrolízis) és különösen metionin (30-60%) és cisztin 56-60%, valamint a triptofán és a cisztein szinte teljes elpusztítása. Ez a folyamat fokozódik, ha a termékben nagy mennyiségű szénhidrát van jelen. A metionin és a cisztin mennyiségi meghatározásához ezek előzetes oxidációját perhangyasavval javasolt elvégezni. Ebben az esetben a cisztin ciszteinsavvá, a metionin pedig metionin-szulfonná alakul, amelyek nagyon stabilak a későbbi savas hidrolízis során.

Cisztin Ciszteinsav

2.3. táblázat. – Az élelmiszerminták elemzésre történő előkészítésének feltételei

Termék	Lipid eltávolítási módszer	Fehérje tömegaránya: HCl (6M)
Fehérje koncentrátumok (izolátumok)	Nem szükséges	1:200
Hús, hal, hús- és halkonzervek, belsőségek)	Extrahálás 10-szeres dietil-éterrel 3-4-szer vagy 10-szeres etanol-kloroform (1:2) 2-szer	1:250
Tej és tejtermékek	Extrahálás 10-szeres mennyiségű mintával etanol-kloroform (1:2) keverékével kétszer	1:1000
Gabona és gabonatermékek	Nem szükséges	1:1000
Növényi termékek	Nem szükséges	1:500
Hús-zöldség és hal-zöldség termékek	Extrahálás 10-szeres mennyiségű dietil-éterrel 3-4 alkalommal; etanol-kloroform (1:2) elegye a 2-szeres mennyiség 10-szeresével	1:1000
Tojás, tojástermékek	Extrahálás etanol-kloroform (1:2 arányú) eleggyel, a lemért mennyiség 10-szerese, kétszerese	1:200

Ellenőrző kérdések:

1. Határozza meg a „fehérjék” fogalmát!

2. Milyen csoportokra osztják a fehérjéket a szervezetben betöltött funkciójuk szerint?

3. Mi a fehérjék szerepe az emberi táplálkozásban?

6. Milyen esszenciális aminosavakat ismer, és mely aminosavak válhatnak esszenciálissá?

7. Hogyan határozható meg az élelmiszerek összes nitrogéntartalma?

8. Hogyan határozzák meg a fehérjék aminosav-összetételét?

9. Milyen aminosav-meghatározási módszereket ismer?

§ 2.4. Szénhidrát

A szénhidrátok széles körben jelen vannak a növényekben és állatokban, ahol szerkezeti és anyagcsere-funkciókat is ellátnak. A növényekben a fotoszintézis folyamata során szén-dioxidból és vízből glükóz szintetizálódik, amely aztán keményítő formájában raktározódik, vagy cellulózzá, a növények szerkezeti alapjává alakul. Az állatok számos szénhidrátot képesek szintetizálni zsírokból és fehérjékből, de a legtöbb szénhidrát növényi táplálékból származik.