Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

PGR metodo esmė. DNR polimerazė

Polimerazės grandininė reakcija yra eksperimentinis molekulinės biologijos metodas, leidžiantis pasiekti reikšmingą mažų tam tikrų nukleorūgščių fragmentų koncentracijų padidėjimą biologinėje medžiagoje. Šis DNR kopijų skaičiaus didinimo procesas vadinamas stiprinimas. DNR kopijavimas PGR metu atliekamas specialiu fermentu - polimerazė. DNR polimerazė (3 pav.) – tai fermentas, dalyvaujantis DNR replikacijoje (DNR amplifikacijoje gyvuose organizmuose). Šios klasės fermentai katalizuoja dezoksiribonukleotidų polimerizaciją išilgai DNR nukleotidų grandinės, kurią fermentas „skaito“ ir naudoja kaip šabloną. Naujo nukleotido tipas nustatomas pagal papildomumo su šablonu, iš kurio jis skaitomas, principą.

DNR polimerazė prideda laisvųjų nukleotidų prie 3" surinktos grandinės galo. Dėl to grandinė pailgėja 5"-3 kryptimi. Nė viena iš žinomų DNR polimerazių nesugeba sukurti grandinės nuo nulio: jos gali pridėti tik nukleotidus. į jau esamą 3"-hidroksilo grupę. Dėl šios priežasties reikia DNR polimerazės gruntas– trumpa nukleotidų seka (dažniausiai 20–25), papildanti tiriamo geno galines dalis – prie kurios ji galėtų pridėti pirmąjį nukleotidą. Pradmenys visada susideda iš DNR ir RNR bazių, o pirmosios dvi bazės visada yra RNR bazės. Pradmenis sintetina kitas fermentas - primasas. Kitas fermentas helikaze- būtinas DNR dvigubos spiralės išsivyniojimui, kad susidarytų vienagrandė struktūra, užtikrinanti abiejų grandinių replikaciją pagal pusiau konservatyvų DNR replikacijos modelį.

Kai kurios DNR polimerazės taip pat turi galimybę ištaisyti klaidas naujai surinktoje DNR grandinėje. Jei aptinkama neteisinga nukleotidų pora, DNR polimerazė pasisuka vienu žingsniu atgal, pašalina neteisingą nukleotidą iš grandinės, tada į jo vietą įterpia tinkamą, o po to replikacija tęsiasi kaip įprasta.

PGR atlikimas

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra DNR amplifikacijos metodas, kurį naudojant galima išskirti ir padauginti konkrečią DNR seką milijardus kartų per kelias valandas. Galimybė gauti daugybę vieno griežtai apibrėžto genomo regiono kopijų labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.

Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, turi būti įvykdytos kelios sąlygos. Norint atlikti PGR paprasčiausiu atveju, reikalingi šie komponentai:

DNR šablonas, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.

Du pradmenys, papildantys norimo fragmento galus. (Dirbtinai susintetintų oligonukleotidų pora, kurių dydis paprastai yra nuo 15 iki 30 bp, identiškas atitinkamoms tikslinės DNR sekcijoms. Jie atlieka pagrindinį vaidmenį formuojant amplifikacijos reakcijos produktus. Teisingai parinkti pradmenys užtikrina specifiškumą ir jautrumą. bandymo sistema.)

Termostabili DNR polimerazė. PGR naudojama polimerazė turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus (Taq polimerazė) ir kt.

Deoksinukleotido trifosfatai (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ jonai, būtini polimerazės funkcionavimui.

Buferinis tirpalas, užtikrinantis reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilkite aukštai verdančio aliejaus, pvz., vazelino. Jei naudojate įrenginį su šildomu dangteliu, to nereikia.

Pirofosfatazės pridėjimas gali padidinti PGR reakcijos išeigą. Šis fermentas katalizuoja pirofosfato, nukleotidų trifosfatų pridėjimo prie augančios DNR grandinės šalutinio produkto, hidrolizę iki ortofosfato. Pirofosfatas gali slopinti PGR reakciją.

Norint padauginti pradinės DNR kopijų skaičių, reikalinga ciklinė reakcija. Paprastai kiekvienas iš eilės kartojamas PGR ciklas susideda iš trijų etapų:

1. Denatūracija arba DNR „lydymas“. Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94–96 °C (arba iki 98 °C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5–2 minutes, kad DNR grandinės atsiskirtų. Šis etapas vadinamas denatūravimu, nes nutrūksta vandenilio ryšiai tarp dviejų DNR grandinių. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–5 minutes, kad visiškai denatūruotų matricą ir pradmenis. Ši technika vadinama karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

2. Atkaitinimas – pradmenų prisijungimas prie šabloninės DNR. Kai grandinės atsiskiria, temperatūra lėtai mažinama, kad gruntai susisiektų su vienos grandinės šablonu. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų sudėties ir dažniausiai parenkama 50-65°C. Scenos laikas 20 - 60 sekundžių. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (per aukštoje temperatūroje) arba surišami netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (per žemoje temperatūroje).

3. Sintezė (grandinės pailgėjimas). DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip pradmenį. Polimerazė pradeda antrosios grandinės sintezę nuo 3" grunto galo, kuris prisijungė prie šablono ir juda palei šabloną. Pailgėjimo temperatūra priklauso nuo polimerazės. Dažnai naudojamos Taq ir Pfu polimerazės aktyviausios 72 C. Sintezės laikas priklauso nuo DNR polimerazės tipo ir amplifikuoto fragmento ilgio. Paprastai pailgėjimo laikas yra viena minutė tūkstančiui bazinių porų. Pasibaigus visiems ciklams dažnai atliekamas papildomas etapas galutinis pailgėjimas, kad užbaigtumėte visus vienos grandinės fragmentus. Šis etapas trunka 7-10 minučių.

Vėliau denatūravimo, atkaitinimo ir pailginimo etapai kartojami daug kartų (30 ir daugiau kartų). Kiekviename cikle susintetintų DNR fragmento kopijų skaičius padvigubėja.

Visos reakcijos atliekamos mėgintuvėliuose, panardintuose į termostatą. Temperatūros režimo keitimas ir jo palaikymas vyksta automatiškai.

Norėdami tiksliai suprasti, kaip konkretus DNR segmentas amplifikuojamas PGR metu, turite aiškiai įsivaizduoti visų pradmenų ir jų papildomų sekų padėtį amplifikuotose kiekviename raunde. Pirmajame raunde kiekviena naujai susintetinta grandinė yra daug ilgesnė nei atstumas nuo jos pradmens 3" hidroksilo grupės iki antrajam pradmeniui komplementarios sekos galinio nukleotido. Tokios grandinės vadinamos "ilgais šablonais". ; būtent ant jų vyks tolesnė sintezė.

Antrajame raunde dvigrandė DNR, susidedanti iš panašių ir naujai susintetintų (ilgo šablono) grandžių, vėl denatūruojama, o po to atkaitinama pradmenimis. Šio etapo sintezės metu vėl susintetinami „ilgieji šablonai“, taip pat keletas gijų, kurių viename gale yra pradmuo, o kitame – seka, papildanti antrąjį pradmenį („trumpieji šablonai“). Trečiojo raundo metu visi anksčiau susidarę heterodupleksai vienu metu denatūruojami ir atkaitinami pradmenimis, o po to pakartojami. Vėlesniuose turuose „trumpųjų matricų“ atsiranda vis daugiau, o 30-ajame raunde jų skaičius jau yra 10 6 kartus didesnis nei pradinių grandinių arba „ilgų matricų“.

Specifinio reakcijos produkto kiekis (ribojamas pradmenų) teoriškai didėja proporcingai 2n, kur n yra reakcijos ciklų skaičius. Tiesą sakant, kiekvieno ciklo efektyvumas gali būti mažesnis nei 100%, todėl iš tikrųjų:

kur P yra produkto kiekis, E yra vidutinis ciklo efektyvumas.

Didėja ir „ilgųjų“ DNR kopijų skaičius, bet tiesiškai, todėl reakcijos produktuose dominuoja specifinis fragmentas. Reikalingo produkto augimą eksponentiškai riboja reagentų skaičius, inhibitorių buvimas ir šalutinių produktų susidarymas.

PGR yra labai jautrus metodas, todėl, jei tiriamajame mėginyje yra net nežymus DNR kiekis, atsitiktinai perėjęs iš vieno reakcijos mišinio į kitą, galima gauti klaidingai teigiamus rezultatus. Dėl to būtina atidžiai kontroliuoti visus tirpalus ir stiklinius indus, naudojamus PGR.

Pagrindiniai grunto parinkimo principai.

Kuriant PGR testavimo sistemą viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:

1. Gruntai turi būti specifiniai. Ypatingas dėmesys skiriamas pradmenų 3" galams, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti komplementarią DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, tikėtina, kad mėgintuvėlyje su pradmenimis įvyks nepageidaujami procesai. reakcijos mišinys, būtent nespecifinės DNR (trumpųjų ar ilgų fragmentų) sintezė. Elektroforezės metu matoma sunkių arba lengvų papildomų juostų pavidalu. Tai trukdo vertinti reakcijos rezultatus, nes lengva supainioti specifinius amplifikacijos produktas su susintetinta svetima DNR Kai kurie pradmenys ir dNTP išleidžiami nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jautrumas.

2. Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. stabilios dvigubos sruogos neturėtų susidaryti, kai gruntai susilieja su savimi arba vienas su kitu.

Tai leidžia aptikti nedidelius kiekius, tiksliau, tam tikrus jo fragmentus biologinėje medžiagoje ir daug kartų juos padauginti. Tada jie vizualiai atpažįstami gelio elektroforezės būdu. Reakciją 1983 metais sukūrė K. Mullis ir ji įtraukta į išskirtinių pastarųjų metų atradimų sąrašą.

Kokie yra PGR mechanizmai

Visa technika pagrįsta nukleorūgščių gebėjimu replikuotis savarankiškai, kuris šiuo atveju atliekamas dirbtinai laboratorijoje. DNR dauginimasis gali prasidėti ne bet kuriame molekulės regione, o tik tose srityse, kuriose yra tam tikra nukleotidų seka – pradiniai fragmentai. Tam, kad prasidėtų polimerazės grandininė reakcija, reikalingi pradmenys (arba DNR zondai). Tai trumpi DNR grandinės fragmentai su nurodyta nukleotidų seka. Jie papildo (t. y. atitinka) pradines vietas

Žinoma, norėdami sukurti pradmenis, mokslininkai turi ištirti technikoje dalyvaujančio asmens nukleotidų seką. Būtent šie DNR zondai suteikia reakcijos specifiškumą ir jos inicijavimą. neveiks, jei mėginyje nebus bent vienos norimos DNR molekulės. Paprastai reakcijai atlikti reikalingi pirmiau minėti pradmenys, nukleotidų rinkinys ir karščiui stabili DNR polimerazė. Pastarasis yra fermentas, katalizuojantis naujų nukleorūgščių molekulių sintezės reakciją pagal mėginį. Visos šios medžiagos, įskaitant biologinę medžiagą, kurioje reikia aptikti DNR, sujungiamos į reakcijos mišinį (tirpą). Jis dedamas į specialų termostatą, kuris per tam tikrą laiką atlieka labai greitą šildymą ir vėsinimą – ciklą. Paprastai jų būna 30-50.

Kaip vyksta ši reakcija?

Jo esmė ta, kad per vieną ciklą prie norimų DNR sekcijų prijungiami pradmenys, po kurių, veikiant fermentui, ji padvigubėja. Remiantis gautomis DNR grandinėmis, vėlesniais ciklais sintetinami vis daugiau identiškų molekulės fragmentų.

Polimerazės grandininė reakcija vyksta nuosekliai, išskiriami šie etapai. Pirmajam būdingas produkto kiekio padvigubinimas per kiekvieną šildymo ir vėsinimo ciklą. Antrame etape reakcija sulėtėja, nes pažeidžiamas fermentas, taip pat prarandamas aktyvumas. Be to, išeikvojamos nukleotidų ir pradmenų atsargos. Paskutiniame etape – plynaukštėje – produktai nebesikaupia, nes baigėsi reagentai.

Kur jis naudojamas?

Be abejo, polimerazės grandininė reakcija plačiai naudojama medicinoje ir moksle. Jis naudojamas bendrojoje ir specialiojoje biologijoje, veterinarijoje, farmacijoje ir net ekologijoje. Be to, pastaruosiuose jie tai daro norėdami stebėti maisto ir aplinkos objektų kokybę. Polimerazės grandininė reakcija aktyviai naudojama teismo medicinos praktikoje tėvystei patvirtinti ir asmens tapatybei nustatyti. Teismo medicinoje, taip pat paleontologijoje, šis metodas dažnai yra vienintelė išeitis, nes paprastai tyrimams prieinamas itin mažas DNR kiekis. Žinoma, šis metodas buvo labai plačiai pritaikytas praktinėje medicinoje. Tai būtina tokiose srityse kaip genetika, infekcinės ligos ir onkologinės ligos.

Tačiau tuo metu ši idėja liko nepriimta. Polimerazės grandininę reakciją 1983 metais iš naujo atrado Kary Mullis. Jo tikslas buvo sukurti metodą, kuris leistų DNR amplifikuoti kelis kartus iš eilės dubliuojant pradinę DNR molekulę, naudojant fermentą DNR polimerazę. Praėjus 7 metams nuo šios idėjos paskelbimo, 1993 m., Mullis už tai gavo Nobelio premiją.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį reikėjo pridėti DNR polimerazės, nes ji greitai buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Procedūra buvo labai neefektyvi ir pareikalavo daug laiko bei fermentų. 1986 metais jis buvo gerokai patobulintas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir galėjo atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticus ir pavadintas Taq- polimerazė. Šios polimerazės trūkumas yra tai, kad klaidingo nukleotido įvedimo tikimybė yra gana didelė, nes šis fermentas neturi klaidų taisymo mechanizmų (3"→5" egzonukleazės aktyvumas). Polimerazės Pfu Ir Pwo, išskirtos iš archajų, turi tokį mechanizmą, jų naudojimas žymiai sumažina DNR mutacijų skaičių, tačiau jų darbo greitis (procesiškumas) yra mažesnis nei Taq. Šiuo metu naudojami mišiniai Taq Ir Pfu kad būtų pasiektas didelis polimerizacijos greitis ir didelis kopijavimo tikslumas.

Metodo išradimo metu Mullis dirbo korporacijoje Cetus, kuri užpatentavo PGR metodą. 1992 m. Cetus pardavė metodo teises ir naudojimo patentą Taq- polimerazės kompanija Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) už 300 mln. Tačiau paaiškėjo, kad Taq-polimerazę 1980 metais charakterizavo rusų biochemikas Aleksejus Kaledinas, o Promega bandė priversti Roche atsisakyti išskirtinių teisių į šį fermentą. JAV PGR metodo patentas pasibaigė 2005 m. kovo mėn.

PGR atlikimas

Metodas pagrįstas pakartotiniu selektyviu tam tikros DNR dalies kopijavimu naudojant fermentus dirbtinėmis sąlygomis ( in vitro). Tokiu atveju nukopijuojamas tik tas skyrius, kuris atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei jis yra tiriamame pavyzdyje. Skirtingai nuo DNR amplifikacijos gyvuose organizmuose (replikacijos), santykinai trumpos DNR dalys amplifikuojamos naudojant PGR. Įprasto PGR proceso metu nukopijuotų DNR sekcijų ilgis yra ne didesnis kaip 3000 bazinių porų (3 kbp). Naudojant įvairių polimerazių mišinį, naudojant priedus ir tam tikromis sąlygomis, PGR fragmento ilgis gali siekti 20-40 tūkstančių nukleotidų porų. Tai vis dar yra žymiai mažiau nei eukariotinės ląstelės chromosominės DNR ilgis. Pavyzdžiui, žmogaus genomą sudaro maždaug 3 milijardai bazinių porų.

Reakcijos komponentai

Norint atlikti PGR paprasčiausiu atveju, reikalingi šie komponentai:

DNR matrica, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.
Du gruntai, papildantis priešingus norimos DNR fragmento skirtingų grandžių galus.
Termiškai stabilus DNR polimerazė- fermentas, katalizuojantis DNR polimerizacijos reakciją. Polimerazė, skirta naudoti PGR, turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus(Taq polimerazė), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerazė), Pyrococcus woesei(Pwo polimerazė) ir kt.
Deoksinukleozidų trifosfatai(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ jonai, būtini polimerazės veikimui.
Buferinis tirpalas, užtikrinant reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, galvijų serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilkite aukštai verdančio aliejaus, pvz., vazelino. Jei naudojate termociklerį su šildomu dangčiu, to nereikia.

Gruntai

PGR specifiškumas pagrįstas komplementarių kompleksų susidarymu tarp šablono ir pradmenų, trumpų sintetinių 18-30 bazių ilgio oligonukleotidų. Kiekvienas iš pradmenų papildo vieną iš dvigrandinio šablono gijų ir riboja sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.

Po šablono hibridizacijos su pradmeniu (prijungimas), pastarasis naudojamas kaip DNR polimerazės pradmuo sintezės metu papildomos šablono grandinės (žr.).

Svarbiausia pradmenų charakteristika yra pradmenų ir matricų komplekso lydymosi temperatūra (Tm). T m yra temperatūra, kurioje pusė DNR šablonų sudaro kompleksą su oligonukleotido pradmeniu. Lydymosi temperatūrą galima apytiksliai nustatyti pagal formulę , kur n X yra nukleotidų X skaičius pradmenyje. Jei pradmens ilgis ir nukleotidų sudėtis arba atkaitinimo temperatūra parinkta neteisingai, gali susidaryti iš dalies papildantys kompleksai su kitomis DNR šablono sritimis, dėl kurių gali atsirasti nespecifinių produktų. Viršutinę lydymosi temperatūros ribą riboja optimali polimerazės veikimo temperatūra, kurios aktyvumas mažėja esant aukštesnei nei 80 °C temperatūrai.

Renkantis gruntus, patartina laikytis šių kriterijų:

Stiprintuvas

Ryžiai. 1: PGR ciklas

PGR atliekama termocikleryje – įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, dažniausiai ne mažesniu kaip 0,1 °C tikslumu. Šiuolaikiniai dviračiai leidžia nustatyti sudėtingas programas, įskaitant „karštojo paleidimo“, „Touchdown“ PGR (žr. toliau) ir paskesnį amplifikuotų molekulių saugojimą 4 °C temperatūroje. Realaus laiko PGR atveju gaminami prietaisai su fluorescenciniu detektoriumi. Taip pat yra prietaisų su automatiniu dangteliu ir skyreliu mikroplokštelėms, kurios leidžia jas integruoti į automatizuotas sistemas.

Reakcijos eiga

Gelio, kuriame yra žymeklio DNR (1) ir PGR reakcijos produktų (2, 3), nuotrauka. Skaičiai rodo DNR fragmentų ilgį nukleotidų poromis

Paprastai PGR apima 20-35 ciklus, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų (2 pav.).

Denatūravimas

Dviejų grandžių DNR šablonas kaitinamas iki 94-96°C (arba iki 98°C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5-2 minutes, kad būtų atskirtos DNR grandinės. Šis etapas vadinamas denatūravimas, nes vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandinių yra sunaikinami. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazės) reakcijos mišinys pašildomas 2-5 minutes. visiškai denatūruoti šabloną ir pradmenis. Ši technika vadinama karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

Atkaitinimas

Kai sruogos atsiskiria, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų sudėties ir paprastai parenkama 4-5°C žemesnė už jų lydymosi temperatūrą. Scenos laikas – 0,5-2 min. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (per aukštoje temperatūroje) arba surišami netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (per žemoje temperatūroje).

Pailgėjimas

PGR tipai

„Nested“ PGR (liet. įdėtas PGR) naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudojamos dvi poros pradmenų ir atliekamos dvi nuoseklios reakcijos. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.
„Apversta“ PGR (atvirkštinė PGR) – naudojama, jei žinomas tik nedidelis norimos sekos regionas. Šis metodas yra ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint atlikti apverstą PGR, atliekama eilė DNR pjūvių su restrikcijos fermentais, po kurių sujungiami fragmentai (ligavimas). Dėl to žinomi fragmentai atsiduria abiejuose nežinomo regiono galuose, o po to PGR galima atlikti kaip įprasta.
Atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) naudojama žinomai sekai iš RNR bibliotekos amplifikuoti, išskirti arba identifikuoti. Prieš atliekant įprastą PGR, vienos grandinės DNR molekulė sintetinama ant mRNR šablono, naudojant atvirkštinę analizę, ir gaunama vienos grandinės cDNR, kuri naudojama kaip PGR šablonas. Šis metodas dažnai nustato, kur ir kada šie genai yra išreikšti.
Asimetrinė PGR Asimetrinė PGR) – atliekama, kai reikia amplifikuoti daugiausia vieną iš pirminės DNR grandžių. Naudojamas kai kuriuose sekos nustatymo ir hibridizacijos analizės metoduose. PGR atliekama kaip įprasta, išskyrus tai, kad vienas iš pradmenų imamas dideliu pertekliumi.
Kiekybinė PGR (Q-PGR) naudojama norint greitai išmatuoti specifinės DNR, cDNR arba RNR kiekį mėginyje.
Kiekybinė realaus laiko PGR – šis metodas naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus reagentus, kad tiksliai išmatuotų besikaupiančio reakcijos produkto kiekį.
Touchdown (Stepdown) PGR (Touchdown PCR) – naudojant šį metodą, sumažėja nespecifinio pradmenų surišimo įtaka produkto susidarymui. Pirmieji ciklai atliekami esant aukštesnei nei atkaitinimo temperatūrai, tada temperatūra mažinama kas kelis ciklus. Tam tikroje temperatūroje sistema praeis per optimalaus pradmenų specifiškumo juostą DNR.
Molekulinės kolonijos metodas (PGR gelyje, anglų k. Polony – PGR kolonija) - akrilamido gelis polimerizuojamas su visais PGR komponentais ant paviršiaus ir atliekama PGR. Taškuose, kuriuose yra analizuojama DNR, amplifikacija vyksta formuojant molekulines kolonijas.
PGR su greitu cDNR galų amplifikavimu Greitas cDNR galų amplifikavimas, RACE-PGR )
Ilgo fragmento PGR Ilgo nuotolio PGR) – PGR modifikacija, skirta išplėstų DNR sekcijų (10 tūkst. bazių ir daugiau) amplifikacijai. Naudojamos dvi polimerazės, viena iš kurių yra Taq polimerazė, turinti didelį procesyvumą (tai yra, vienu žingsniu galinti susintetinti ilgą DNR grandinę), o antroji – DNR polimerazė, turinti 3"-5" endonukleazės aktyvumą. Antroji polimerazė yra būtina norint ištaisyti pirmosios padarytas klaidas.
RAPD PGR Atsitiktinis polimorfinės DNR PGR amplifikavimas , PGR su atsitiktine polimorfinės DNR amplifikacija – naudojama, kai reikia atskirti organizmus, kurie yra artimi genetine seka, pavyzdžiui, skirtingų veislių auginamų augalų, šunų veislių ar artimai giminingų mikroorganizmų. Šiam metodui dažniausiai naudojamas vienas mažas gruntas (20–25 bp). Šis pradmuo iš dalies papildys atsitiktines tiriamų organizmų DNR dalis. Pasirinkus sąlygas (pradiklio ilgį, sudėtį, temperatūrą ir kt.), galima pasiekti patenkinamą dviejų organizmų PGR modelio skirtumą.

Jei šablono nukleotidų seka iš dalies žinoma arba visai nežinoma, galite naudoti išsigimę pradmenys, kurios sekoje yra išsigimusių pozicijų, kuriose gali būti bet kokios bazės. Pavyzdžiui, pradmenų seka gali būti: ...ATH..., kur H yra A, T arba C.

PGR taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių bandymams ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Tai lyginama su įtariamojo genetine medžiaga. Pakanka labai mažo DNR kiekio, teoriškai vienos kopijos. DNR suskaidoma į fragmentus ir amplifikuojama naudojant PGR. Fragmentai atskiriami naudojant DNR elektroforezę. Gautas DNR juostų išsidėstymo vaizdas vadinamas genetinis pirštų atspaudas(Anglų) genetinis pirštų atspaudas).

Tėvystės nustatymas

Ryžiai. 3: DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. (1) Tėvas. (2) Vaikas. (3) Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, todėl atsirado naujas unikalus įspaudas.

Nors genetiniai pirštų atspaudai yra unikalūs (išskyrus identiškų dvynių atvejus), šeimos santykius vis tiek galima užmegzti padarius kelis pirštų atspaudus (3 pav.). Tas pats metodas gali būti taikomas, šiek tiek pakeistas, siekiant nustatyti evoliucinį organizmų ryšį.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki simptomų atsiradimo.

Individualizuota medicina

Žinoma, kad dauguma vaistų veikia ne visus pacientus, kuriems jie skirti, o tik 30-70 proc. Be to, kai kuriems pacientams daugelis vaistų yra toksiški arba alergizuojantys. To priežastys iš dalies yra dėl individualių vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumų. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam pacientui tam tikras citochromas (kepenų baltymas, atsakingas už pašalinių medžiagų apykaitą) gali būti aktyvesnis, kitam – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromas yra tam tikram pacientui, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu. numatomas genotipų nustatymas).

Genų klonavimas

Genų klonavimas (nepainioti su organizmų klonavimu) yra genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorius- DNR fragmentas, pernešantis svetimą geną į tą patį ar kitą patogų auginimui organizmą. Pavyzdžiui, plazmidės arba virusinė DNR naudojamos kaip vektoriai. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas to geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gaminti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

Ryžiai. 4: Genų klonavimas naudojant plazmidę. .
(1) A organizmo chromosominė DNR. (2) PGR. (3) Daug organizmo A geno kopijų. (4) Geno įterpimas į plazmidę. (5) Plazmidė su organizmo A genu. (6) Plazmidės įvedimas į organizmą B. (7) Organizmo A geno kopijų skaičiaus dauginimas organizme B.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, naudojant dideoksinukleotidus, paženklintus fluorescencine žyme arba radioaktyviu izotopu, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po to, kai gelyje yra atskirtos susintetintos grandinės.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

1. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

2. Polimerazės grandininės reakcijos metodo principas

2.1 Daugelio komponentų buvimas reakcijos mišinyje

2.2 Ciklinis temperatūros režimas

2.3 Pagrindiniai gruntų parinkimo principai

2.4 Plokštumos efektas

3. PGR etapai

3.2 Stiprinimas

3.4.1 Teigiami valdikliai

3.4.2 Vidaus kontrolė

4.1 Kokybinė analizė

4.1.2 RNR molekulių aptikimas

3.1 Biologinio mėginio paruošimas

DNR išskyrimui naudojami įvairūs metodai, priklausomai nuo atliekamų užduočių. Jų esmė yra DNR išskyrimas (ekstrahavimas) iš biologinio preparato ir pašalinių priemaišų pašalinimas arba neutralizavimas, siekiant gauti PGR tinkamo grynumo DNR preparatą.

Marmur aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios seka deproteinizacija ir DNR pakartotinis nusodinimas alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą. Tačiau tai yra gana daug darbo jėgos ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir stipriai kvepiančiomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas.

Vienas iš šiuo metu populiarių metodų yra DNR ekstrahavimo metodas, kurį pasiūlė Boom ir kt. Šis metodas pagrįstas stipraus chaotropinio agento, guanidino tiocianato (GuSCN) naudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklo pieno ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, sorbuota ant nešiklio, iš kurio lengvai pašalinama naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginiui paruošti amplifikacijai. Tačiau DNR praradimas yra įmanomas dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR. Todėl naudojant šį metodą labai svarbu teisingai pasirinkti sorbentą ir atidžiai laikytis technologinių niuansų.

Kita mėginių paruošimo metodų grupė yra paremta Chilex tipo jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, nesorbuoja DNR, o greičiau – priemaišas, trukdančias reakcijai. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų sorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų tai tinka darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus.

Taigi, į mėginio paruošimo metodo pasirinkimą reikia atsižvelgti, suprantant numatomos analizės tikslus.

3.2 Stiprinimas

Norint atlikti amplifikacijos reakciją, reikia paruošti reakcijos mišinį ir į jį įpilti analizuotą DNR mėginį. Svarbu atsižvelgti į kai kurias grunto atkaitinimo ypatybes. Faktas yra tas, kad analizuojamame biologiniame mėginyje paprastai yra įvairių DNR molekulių, su kuriomis reakcijoje naudojami pradmenys turi dalinę, o kai kuriais atvejais reikšmingą homologiją. Be to, gruntai gali susijungti vienas su kitu, sudarydami pradmenų dimerus. Abu jie sukelia didelį pradmenų suvartojimą šalutinių produktų (nespecifinių) reakcijos produktų sintezei ir dėl to žymiai sumažina sistemos jautrumą. Dėl to elektroforezės metu sunku arba neįmanoma nuskaityti reakcijos rezultatų.

3.3 Reakcijos rezultatų įvertinimas

Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai atskirų tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktai gali būti aptikti naudojant elektroforezę po 30-35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta idealioms artimomis sąlygomis, kas gyvenime nedažnai būna. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis, t.y. reakcijos mišinyje yra tam tikrų inhibitorių, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo nepavyksta amplifikuoti net dešimtys tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio.

3.3.1 Horizontaliosios elektroforezės metodas

Amplifikacijos rezultatams vizualizuoti naudojami įvairūs metodai. Šiandien labiausiai paplitęs metodas yra elektroforezė, pagrįsta DNR molekulių atskyrimu pagal dydį. Norėdami tai padaryti, paruoškite agarozės gelio plokštelę, kuri sutvirtinama 1,5–2,5% koncentracijos elektroforezės buferyje, pridedant specialių DNR dažų, pavyzdžiui, etidžio bromido. Sustingusi agarozė sudaro erdvinę gardelę. Pilant naudojant šukes, gelyje susidaro specialūs šuliniai, į kuriuos vėliau pridedami amplifikacijos produktai. Gelio plokštelė dedama į horizontalų gelio elektroforezės aparatą ir prijungiamas pastovios įtampos šaltinis. Neigiamai įkrauta DNR pradeda judėti gelyje nuo minuso iki pliuso. Šiuo atveju trumpesnės DNR molekulės juda greičiau nei ilgesnės. DNR judėjimo greitį gelyje įtakoja agarozės koncentracija, elektrinio lauko stiprumas, temperatūra, elektroforezės buferio sudėtis ir, kiek mažesniu mastu, DNR GC sudėtis. Visos vienodo dydžio molekulės juda tuo pačiu greičiu. Dažai yra įtraukiami į DNR molekules plokščiomis grupėmis. Baigus elektroforezę, kuri trunka nuo 10 minučių iki 1 valandos, gelis dedamas ant transiliuminatoriaus filtro, kuris skleidžia šviesą ultravioletinių spindulių diapazone (254 - 310 nm). Ultravioletinė energija, kurią sugeria DNR ties 260 nm, perduodama dažui, todėl jis fluorescuoja oranžinės-raudonoje matomo spektro srityje (590 nm).

Stiprinimo produktų juostų ryškumas gali skirtis. Tačiau tai negali būti siejama su pradiniu tikslinės DNR kiekiu mėginyje.

3.3.2 Vertikalios elektroforezės metodas

Vertikalios elektroforezės metodas iš esmės panašus į horizontaliąją elektroforezę. Jų skirtumas tas, kad šiuo atveju vietoj agarozės naudojami poliakrilamido geliai. Jis atliekamas specialioje vertikalios elektroforezės kameroje. Poliakrilamido gelio elektroforezė pasižymi didesne skiriamąja geba lyginant su agarozės elektroforeze ir leidžia atskirti įvairaus dydžio DNR molekules vieno nukleotido tikslumu. Poliakrilamido gelio paruošimas yra šiek tiek sudėtingesnis nei agarozės gelio. Be to, akrilamidas yra toksiška medžiaga. Kadangi poreikis nustatyti amplifikacijos produkto dydį 1 nukleotido tikslumu iškyla retai, įprastame darbe naudojamas horizontalios elektroforezės metodas.

3.4 Amplifikacijos reakcijos eigos stebėjimas

3.4.1 Teigiami valdikliai

Norimo mikroorganizmo DNR preparatas naudojamas kaip „teigiama kontrolė“. Nespecifiniai amplikonai dydžiu skiriasi nuo amplikonų, susidarančių amplifikuojant kontroliniu DNR preparatu. Nespecifiniai produktai gali būti didesni arba mažesni, palyginti su teigiama kontrole. Blogiausiu atveju šie dydžiai gali sutapti ir elektroforezės metu skaitomi kaip teigiami.

Norėdami kontroliuoti gauto amplifikacijos produkto specifiškumą, galite naudoti hibridizacijos zondus (DNR sekcijas, esančias amplifikuotoje sekoje), paženklintus fermentų žymėmis arba radioaktyviais izotopais ir sąveikaujančius su DNR pagal tuos pačius principus, kaip ir pradmenys. Tai žymiai apsunkina ir pailgina analizę, o jos kaina žymiai padidėja.

3.4.2 Vidaus kontrolė

Būtina stebėti amplifikacijos eigą kiekviename mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu. Šiuo tikslu naudojama papildoma, vadinamoji „vidinė kontrolė“. Tai bet koks DNR preparatas, nepanašus į norimo mikroorganizmo DNR. Jei į reakcijos mišinį bus pridėta vidinė kontrolė, ji taps tuo pačiu pradmenų susijungimo taikiniu kaip ir norimo infekcinio agento chromosominė DNR. Vidinės kontrolės amplifikacijos produkto dydis parenkamas taip, kad jis būtų 2 ar daugiau kartų didesnis už amplikonus, susidariusius amplifikuojant norimą mikroorganizmo DNR. Dėl to, jei į reakcijos mišinį kartu su tiriamuoju mėginiu pridedama vidinės kontrolinės DNR, tada, nepaisant mikroorganizmo buvimo biologiniame mėginyje, vidinė kontrolė sukels specifinių amplikonų susidarymą, bet žymiai ilgesnį (sunkesnį). nei mikroorganizmo amplikonas. Sunkiųjų amplikonų buvimas reakcijos mišinyje parodys normalią amplifikacijos reakcijos eigą ir inhibitorių nebuvimą. Jei nesusidaro reikiamo dydžio amplikonai, bet nesusidaro ir vidinės kontrolės amplikonai, galime daryti išvadą, kad tiriamame mėginyje yra nepageidaujamų priemaišų, kurias reikėtų pašalinti, bet ne apie norimos DNR nebuvimą.

Deja, nepaisant viso šio metodo patrauklumo, jis turi reikšmingą trūkumą. Jei reakcijos mišinyje yra norimos DNR, jos amplifikacijos efektyvumas smarkiai sumažėja dėl konkurencijos su vidine pradmenų kontrole. Tai ypač svarbu, kai DNR koncentracija tiriamajame mėginyje gali būti klaidingai neigiama.

Tačiau jei bus išspręsta konkurencijos dėl pradmenų problema, šis stiprinimo efektyvumo stebėjimo metodas tikrai bus labai naudingas.

4. Metodai, pagrįsti polimerazės grandinine reakcija

4.1 Kokybinė analizė

Klasikinis PGR atlikimo metodas, kurio principai buvo aprašyti aukščiau, buvo sukurtas kai kuriomis modifikacijomis, kuriomis siekiama įveikti PGR apribojimus ir padidinti reakcijos efektyvumą.

4.1.1 PGR atlikimo metodas naudojant „karštą paleidimą“

Siekiant sumažinti nespecifinių amplifikacijos reakcijos produktų susidarymo riziką, taikomas metodas, vadinamas „karštu paleidimu“, kurio esmė yra užkirsti kelią reakcijai, kol mėgintuvėlyje bus pasiektos sąlygos, užtikrinančios specifinį pradmenų atkaitinimą.

Faktas yra tas, kad, priklausomai nuo GC sudėties ir dydžio, gruntai turi tam tikrą lydymosi temperatūrą (Tm). Jei sistemos temperatūra viršija Tm, pradmenys negali prilipti prie DNR grandinės ir denatūruojasi. Esant optimalioms sąlygoms, t.y. Kai atkaitinimo temperatūra yra artima lydymosi temperatūrai, pradmuo sudaro dvigrandę molekulę tik tada, kai ji visiškai papildo ir taip užtikrina reakcijos specifiškumą.

Yra įvairių „karštojo paleidimo“ įgyvendinimo variantų:

Taq polimerazės pridėjimas į reakcijos mišinį per pirmąjį ciklą po to, kai mėgintuvėlis kaitinamas iki denatūravimo temperatūros.

Reakcijos mišinio ingredientų atskyrimas parafino sluoksniu į sluoksnius (apatinėje dalyje - pradmenys, viršutinėje - Taq polimerazė ir DNR taikiniai), kurie sumaišomi parafinui tirpstant (~ 65-75 0 C).

Monokloninių antikūnų prieš Taq polimerazę naudojimas. Monokloninių antikūnų surištas fermentas suaktyvėja tik po pirmosios denatūracijos stadijos, kai monokloniniai antikūnai negrįžtamai denatūruojami ir atpalaiduoja aktyviąsias Taq polimerazės vietas.

Visais minėtais atvejais, net jei nespecifinis atkaitinimas įvyko prieš temperatūros ciklą, pailgėjimas nevyksta, o kaitinant pradmenų-DNR kompleksai denatūruojami, todėl nesusidaro nespecifiniai produktai. Vėliau temperatūra mėgintuvėlyje nenukrenta žemiau lydymosi temperatūros, o tai užtikrina specifinio amplifikacijos produkto susidarymą.

4.1.2 RNR molekulių aptikimas

Galimybė naudoti RNR kaip PGR taikinį žymiai išplečia šio metodo taikymo sritį. Pavyzdžiui, daugelio virusų (hepatito C, gripo viruso, pikornavirusų ir kt.) genomus reprezentuoja RNR. Be to, jų gyvavimo cikluose nėra tarpinės transformacijos į DNR fazės. Norint aptikti RNR, ji pirmiausia turi būti paversta DNR forma. Tam naudojama atvirkštinė transkriptazė, kuri yra išskirta iš dviejų skirtingų virusų: paukščių mieloblastozės viruso ir Moloney pelių leukemijos viruso. Šių fermentų naudojimas yra susijęs su tam tikrais sunkumais. Visų pirma, jie yra termolabūs, todėl gali būti naudojami ne aukštesnėje kaip 42° C temperatūroje. Kadangi šioje temperatūroje RNR molekulės lengvai formuoja antrines struktūras, reakcijos efektyvumas ženkliai sumažėja ir, įvairiais vertinimais, yra maždaug 5%. Šį trūkumą bandoma apeiti naudojant termostabilią polimerazę, gautą iš termofilinio mikroorganizmo Thermus Thermophilus, kuri, esant Mn 2+, demonstruoja transkriptazės aktyvumą, kaip atvirkštinę transkriptazę. Tai vienintelis žinomas fermentas, galintis parodyti polimerazės ir transkriptazės aktyvumą.

Norint atlikti atvirkštinės transkripcijos reakciją, reakcijos mišinyje, kaip ir PGR, turi būti pradmenų kaip pradmenų ir 4 dNTP mišinio kaip statybinės medžiagos.

Atlikus atvirkštinės transkripcijos reakciją, gautos cDNR molekulės gali būti PGR taikinys.

5. PGR atlikimo technologinio proceso organizavimas

Dėl potencialiai didelio polimerazės grandininės reakcijos jautrumo PGR laboratorijos projektavimas yra būtinas. Taip yra dėl opiausios metodo problemos – užterštumo.

Užteršimas yra specifinių DNR molekulių patekimas iš išorinės aplinkos į reakcijos mišinį, kuris gali būti amplifikacijos reakcijos taikinys ir duoti klaidingai teigiamus rezultatus.

Yra keletas būdų, kaip kovoti su šiuo nemaloniu reiškiniu. Vienas iš jų – fermento N-uracilo glikozilazės (UG) naudojimas. Šis metodas pagrįstas UG gebėjimu skaidyti DNR molekules su įterptu uracilu. Amplifikacijos reakcija atliekama naudojant dNTP mišinį, kuriame dTTP pakeičiamas uracilu, o po terminio ciklo visuose mėgintuvėlyje susidariusiuose amplikonuose bus uracilo. Jei į reakcijos mišinį prieš amplifikaciją pridedama CG, tada į reakcijos mišinį patenkantys amplikonai bus sunaikinti, o natūrali DNR išliks nepažeista ir vėliau bus amplifikacijos taikinys.

Taigi šis metodas tik tam tikru mastu pašalina užteršimo šaltinį ir negarantuoja klaidingų teigiamų rezultatų.

Kitas būdas kovoti su užteršimo rezultatais yra žymiai sumažinti reakcijos ciklų skaičių (iki 25-30 ciklų). Tačiau net ir taikant šį metodą, rizika gauti klaidingai teigiamus rezultatus yra didelė, nes tokiu atveju, nesant inhibitorių, dėl užteršimo lengva gauti amplifikacijos produktą.

Taigi, nepaisant išankstinio amplifikacijos priemonių, kuriomis siekiama inaktyvuoti klaidingai teigiamus rezultatus sukeliančias DNR molekules, pranašumų, radikaliausia priemonė yra gerai apgalvota laboratorijos organizacija.

Išvada

PGR metodas šiuo metu plačiausiai naudojamas kaip įvairių infekcinių ligų diagnostikos metodas. PGR leidžia nustatyti infekcijos etiologiją, net jei analizei paimtame mėginyje yra tik kelios patogeno DNR molekulės. PGR plačiai taikoma ankstyvai ŽIV infekcijų, virusinio hepatito ir kt. Šiandien beveik nėra infekcijos sukėlėjo, kurio nebūtų galima aptikti naudojant PGR.

Neseniai buvo sukurtas patikimas, labai jautrus ir greitas įvairių žmonių infekcinių ligų diagnostikos metodas. Šis metodas vadinamas „PGR analize“. Kas tai yra, kokia jo esmė, kokius mikroorganizmus jis gali atpažinti ir kaip teisingai jį vartoti, mes jums pasakysime mūsų straipsnyje.

Atradimų istorija

PGR metodai taip pat naudojami diagnozuojant vėžį.

Metodo privalumai

PGR diagnostika turi keletą privalumų:

Didelis jautrumas. Net jei yra tik kelios mikroorganizmo DNR molekulės, PGR analizė nustato infekcijos buvimą. Metodas padės sergant lėtinėmis ir latentinėmis ligomis. Dažnai tokiais atvejais mikroorganizmas nėra kitaip kultivuojamas.
Tyrimui tinka bet kokia medžiaga, pavyzdžiui, seilės, kraujas, lytinių organų išskyros, plaukai, epitelio ląstelės. Dažniausias yra kraujo ir urogenitalinio tepinėlio PGR tyrimas.
Nereikia ilgai auginti pasėlių. Automatizuotas diagnostikos procesas leidžia gauti tyrimo rezultatus po 4-5 valandų.
Metodas yra beveik šimtu procentų patikimas. Užregistruoti tik pavieniai klaidingai neigiami rezultatai.
Galimybė identifikuoti kelių tipų patogenus iš vieno medžiagos mėginio. Tai ne tik pagreitina ligos diagnozavimo procesą, bet ir žymiai sumažina materialines išlaidas. Dažnai gydytojas skiria sudėtingą PGR tyrimą. Tyrimo, kurį sudaro šeši patogenai, kaina yra apie 1500 rublių.

Kad PGR tyrimo rezultatai būtų patikimi, turite atlikti testą, vadovaudamiesi rekomendacijomis dėl išankstinio pasirengimo diagnozei:

Prieš dovanojant seiles, likus 4 valandoms iki medžiagos rinkimo reikia susilaikyti nuo valgymo ir vaistų vartojimo. Prieš pat procedūrą praskalaukite burną virintu vandeniu.
Aukščiau pateiktų taisyklių reikėtų laikytis ir imant mėginį iš vidinio skruosto paviršiaus. Po skalavimo rekomenduojama atlikti lengvą odos masažą, kad išsiskirtų liaukos sekretas.
Šlapimas dažniausiai renkamas namuose. Norėdami tai padaryti, turite kruopščiai išvalyti genitalijas. 50-60 ml šlapimo reikia surinkti į sterilų plastikinį indą. Siekiant užtikrinti medžiagos grynumą, moterims rekomenduojama į makštį įkišti tamponą, o vyrams kiek įmanoma atitraukti odos raukšlę. Jūs negalite dovanoti medžiagos menstruacijų metu.
Norėdami paaukoti spermą, turite susilaikyti nuo lytinių santykių 3 dienas prieš rinkdami medžiagą. Gydytojai taip pat pataria vengti lankytis pirtyje ir maudytis karštoje vonioje, gerti alkoholį ir aštrų maistą. 3 valandas prieš tyrimą turėtumėte susilaikyti nuo šlapinimosi.
Pavyzdžiui, jei atliekamas PGR tyrimas dėl chlamidijų, tiek moterims, tiek vyrams rekomenduojama 3 dienas seksualiai pailsėti. Likus 2 savaitėms iki tyrimo negalima vartoti antibakterinių vaistų. Savaitę reikia nustoti naudoti intymius gelius, tepalus, makšties žvakutes ir dušo plovimą. Likus 3 valandoms iki tyrimo reikia susilaikyti nuo šlapinimosi. Menstruacijų metu medžiaga nerenkama, tik praėjus 3 dienoms po kraujavimo pabaigos, galima paimti urogenitalinį tepinėlį.

PGR nėštumo metu

Besilaukiant kūdikio daugelis lytiniu keliu plintančių infekcinių ligų yra itin pavojingos normaliam vaisiaus vystymuisi. LPL gali sukelti intrauterinį augimo sulėtėjimą, persileidimą ar priešlaikinį gimdymą ir įgimtus vaiko defektus. Todėl labai svarbu atlikti PGR tyrimą ankstyvosiose nėštumo stadijose. Testą reikia laikyti registruojantis – iki 12 sav.

Medžiaga surenkama iš gimdos kaklelio kanalo naudojant specialų šepetėlį. Procedūra neskausminga ir nekelia pavojaus kūdikiui. Paprastai nėštumo metu PGR metodu atliekama chlamidijų analizė, taip pat ureaplazmozė, mikoplazmozė, citomegalovirusas, herpesas ir papilomos virusas. Šis tyrimų rinkinys vadinamas PGR-6.

PGR ŽIV diagnozei

Dėl to, kad metodas yra labai jautrus organizmo pokyčiams ir diagnostinėms sąlygoms, rezultatui įtakos gali turėti daug veiksnių. Todėl PGR analizė ŽIV infekcijai nustatyti nėra patikimas metodas, jos efektyvumas siekia 96-98%. Likusiais 2–4% atvejų testas duoda klaidingai teigiamus rezultatus.

Tačiau kai kuriose situacijose jūs negalite išsiversti be PGR diagnostikos ŽIV. Paprastai tai atliekama žmonėms, kurių ELISA rezultatas yra klaidingai neigiamas. Tokie rodikliai rodo, kad žmogus dar nesusikūrė antikūnų prieš virusą ir jų negalima aptikti daugkartiniam jų skaičiaus padidėjimui. Būtent tai galima pasiekti atlikus kraujo tyrimą PGR metodu.

Tokia diagnostika būtina ir pirmųjų gyvenimo metų vaikams, gimusiems iš ŽIV užsikrėtusios motinos. Šis metodas yra vienintelis būdas patikimai nustatyti vaiko statusą.

PGR hepatitui diagnozuoti

Polimerazės grandininės reakcijos metodas leidžia aptikti hepatito A, B, C viruso DNR dar gerokai prieš susiformuojant antikūnams prieš infekciją ar pasireiškiant ligos simptomams. PGR tyrimas dėl hepatito C yra ypač efektyvus, nes 85% atvejų ši liga yra besimptomė ir laiku negydant tampa lėtine.

Laiku aptiktas patogenas padės išvengti komplikacijų ir ilgalaikio gydymo.

Išsamus PGR tyrimas

Išsami PGR analizė: tyrimas naudojant polimezinės grandininės reakcijos metodą, kuris apima kelių tipų infekcijų nustatymą vienu metu: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirusas, 1 ir 2 tipo herpes, gonorėja, papilomos virusas. Tokios diagnostikos kaina svyruoja nuo 2000 iki 3500 rublių. priklausomai nuo klinikos, naudojamų medžiagų ir įrangos, taip pat analizės tipo: kokybinė ar kiekybinė. Gydytojas nuspręs, kuris iš jų yra būtinas jūsų atveju. Kai kuriais atvejais pakanka tiesiog nustatyti patogeno buvimą, kitais, pavyzdžiui, užsikrėtus ŽIV, svarbų vaidmenį atlieka kiekybinis titras. Diagnozuojant visus aukščiau išvardintus patogenus, tyrimas vadinamas „PGR-12 analize“.

Analizės rezultatų dekodavimas

Iššifruoti PGR analizę nėra sunku. Yra tik 2 rodiklių skalės - „teigiamas rezultatas“ ir „neigiamas rezultatas“. Jei aptinkamas patogenas, gydytojai gali 99% pasitikėjimo patvirtinti ligos buvimą ir pradėti gydyti pacientą. Taikant kiekybinį infekcijos nustatymo metodą, atitinkamame stulpelyje bus nurodytas aptiktų bakterijų skaičius. Tik gydytojas gali nustatyti ligos mastą ir paskirti reikiamą gydymą.

Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, nustatant ŽIV infekciją PGR metodu, jei rezultatas yra neigiamas, norint patvirtinti gautus rodiklius, reikia atlikti papildomus tyrimus.

Kur galiu išsitirti?

Kur atlikti PGR testą: valstybinėje klinikoje ar privačioje laboratorijoje? Deja, savivaldybių gydymo įstaigose įranga ir metodai dažnai yra pasenę. Todėl geriau teikti pirmenybę privačioms laboratorijoms su modernia įranga ir aukštos kvalifikacijos personalu. Be to, privačioje klinikoje rezultatų pasieksite daug greičiau.

Maskvoje daugelis privačių laboratorijų siūlo PGR tyrimus dėl įvairių infekcijų. Pavyzdžiui, tokiose klinikose kaip „Vita“, „Complex Clinic“, „Happy Family“, „Uro-Pro“ atliekama PGR analizė. Tyrimo kaina nuo 200 rublių. identifikuoti vieną patogeną.

Galima daryti išvadą, kad infekcinių ligų diagnostika PGR metodu daugeliu atvejų yra greitas ir patikimas būdas nustatyti patogeną organizme ankstyvose infekcijos stadijose. Tačiau tam tikrais atvejais verta rinktis kitus diagnostikos metodus. Tik specialistas gali nustatyti tokio tyrimo poreikį. PGR analizės iššifravimas taip pat reikalauja profesionalaus požiūrio. Laikykitės gydytojo rekomendacijų ir patys nesiimkite nereikalingų tyrimų.