Ievads.

1. Citokīnu vispārīgais raksturojums un klasifikācija.

1.1.Darbības mehānismi.

1.2 Citokīnu īpašības.

1.3. Citokīnu nozīme organisma fizioloģisko funkciju regulēšanā.

2. Speciālie citokīnu pētījumi.

2.1. Citokīnu nozīme bērnu resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē.

2.2.Slāpekļa oksīda un citokīnu nozīme akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā.

3.Citokīnu noteikšanas metodes

3.1.Citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšana

3.2.Citokīnu kvantitatīvā noteikšana, izmantojot antivielas

3.3.Citokīnu noteikšana ar enzīmu imūntestu.

3.3.1. Audzēja nekrozes faktors-alfa.

3.3.2. Gamma interferons.

3.3.3. Interleikīns-4

3.3.4. Interleikīns-8

3.3.5. Interleikīna-1 receptoru antagonists.

3.3.6. Alfa interferons.

3.3.7. Antivielas pret alfa INF.

4. Imunotropās zāles, kuru pamatā ir citokīni.

Izmantotās literatūras saraksts.

Secinājums.

Ievads.

Ir pagājis maz laika kopš pirmo citokīnu aprakstīšanas. Taču viņu pētījumi ļāva identificēt plašu zināšanu sadaļu – citokinoloģiju, kas ir neatņemama dažādu zināšanu jomu sastāvdaļa un, pirmkārt, imunoloģiju, kas deva spēcīgu impulsu šo mediatoru izpētei. Citokinoloģija caurstrāvo visas klīniskās disciplīnas, sākot no slimību etioloģijas un patoģenēzes līdz dažādu patoloģisku stāvokļu profilaksei un ārstēšanai. Līdz ar to zinātniskajiem pētniekiem un klīnicistiem ir jāorientējas regulējošo molekulu daudzveidībā un skaidri jāsaprot katra citokīna loma pētāmajos procesos. Visām imūnsistēmas šūnām ir specifiskas funkcijas un tās darbojas skaidri saskaņotā mijiedarbībā, ko nodrošina īpašas bioloģiski aktīvas vielas - citokīni - imūnreakciju regulatori. Citokīni ir specifiski proteīni, ar kuru palīdzību dažādas imūnsistēmas šūnas var apmainīties ar informāciju savā starpā un koordinēt darbības. Citokīnu kopums un daudzumi, kas iedarbojas uz šūnu virsmas receptoriem — “citokīnu vide” — atspoguļo mijiedarbīgu un bieži mainīgu signālu matricu. Šie signāli ir sarežģīti, jo ir daudz dažādu citokīnu receptoru un tāpēc, ka katrs citokīns var aktivizēt vai nomākt vairākus procesus, tostarp savu sintēzi un citu citokīnu sintēzi, kā arī citokīnu receptoru veidošanos un parādīšanos uz šūnas virsmas. Mūsu darba mērķis ir pētīt citakīnus, to funkcijas un īpašības, kā arī to iespējamo izmantošanu medicīnā. Citokīni ir mazi proteīni (molekulārā masa no 8 līdz 80 KDa), kas iedarbojas autokrīni (t.i., uz šūnu, kas tos ražo) vai parakrīni (šūnās, kas atrodas blakus). Šo ļoti aktīvo molekulu veidošanās un izdalīšanās ir pārejoša un stingri regulēta.

Literatūras apskats.

Citokīnu vispārīgie raksturojumi un klasifikācija.

Citokīni ir starpšūnu mijiedarbības polipeptīdu mediatoru grupa, kas galvenokārt ir iesaistīta organisma aizsargreakciju veidošanā un regulēšanā patogēnu ievadīšanas un audu integritātes traucējumu laikā, kā arī vairāku normālu fizioloģisko funkciju regulēšanā. Citokīnus var iedalīt jaunā neatkarīgā regulējošā sistēmā, kas pastāv kopā ar nervu un endokrīno sistēmu homeostāzes uzturēšanai, un visas trīs sistēmas ir cieši savstarpēji saistītas un savstarpēji atkarīgas. Pēdējo divu desmitgažu laikā lielākās daļas citokīnu gēni ir klonēti un ir iegūti rekombinantie analogi, kas pilnībā atkārto dabisko molekulu bioloģiskās īpašības. Šobrīd ir zināmas vairāk nekā 200 atsevišķas vielas, kas pieder citokīnu saimei. Citokīnu izpētes vēsture aizsākās divdesmitā gadsimta 40. gados. Toreiz tika aprakstīta pirmā kahektīna, asins serumā esošā faktora, kas var izraisīt kaheksiju vai ķermeņa svara zudumu, iedarbība. Pēc tam šis mediators tika izolēts un pierādīts, ka tas ir identisks audzēja nekrozes faktoram (TNF). Tolaik citokīnu izpēte balstījās uz jebkura viena bioloģiskā efekta noteikšanas principu, kas kalpoja par sākumpunktu atbilstošā mediatora nosaukšanai. Tas ir tas, ko interferonu (IFN) sauca 50. gados, jo tas spēja traucēt vai palielināt rezistenci atkārtotas vīrusu infekcijas laikā. Interleikīns-1 (IL-1) sākotnēji tika saukts arī par endogēnu pirogēnu, pretstatā baktēriju lipopolisaharīdiem, kas tika uzskatīti par eksogēniem pirogēniem. Nākamais citokīnu izpētes posms, kas datēts ar 60-70 gadiem, ir saistīts ar dabisko molekulu attīrīšanu un to bioloģiskās darbības visaptverošu raksturojumu. Šoreiz tika atklāts T-šūnu augšanas faktors, kas tagad pazīstams kā IL-2, un vairākas citas molekulas, kas stimulē T-, B-limfocītu un citu veidu leikocītu augšanu un funkcionālo aktivitāti. 1979. gadā tika ierosināts termins "interleikīni", lai apzīmētu un sistematizētu tos, tas ir, mediatorus, kas sazinās starp leikocītiem. Taču drīz vien kļuva skaidrs, ka citokīnu bioloģiskā iedarbība sniedzas daudz tālāk par imūnsistēmu, un tāpēc iepriekš piedāvātais termins “citokīni” kļuva pieņemamāks un ir saglabājies līdz mūsdienām. Revolucionārs pavērsiens citokīnu izpētē notika 80. gadu sākumā pēc peles un cilvēka interferona gēnu klonēšanas un rekombinanto molekulu ražošanas, kas pilnībā atkārto dabisko citokīnu bioloģiskās īpašības. Pēc tam bija iespējams klonēt citu mediatoru gēnus no šīs ģimenes. Svarīgs pavērsiens citokīnu vēsturē bija rekombinanto interferonu un īpaši rekombinantā IL-2 klīniskā izmantošana vēža ārstēšanā. 90. gadi iezīmējās ar citokīnu receptoru apakšvienību struktūras atklāšanu un “citokīnu tīkla” jēdziena veidošanu, un 21. gadsimta sākums iezīmējās ar daudzu jaunu citokīnu atklāšanu, izmantojot ģenētisko analīzi. Citokīni ir interferoni, koloniju stimulējošie faktori (CSF), kemokīni, transformējošie augšanas faktori; audzēja nekrozes faktors; interleikīni ar vēsturiski izveidotiem sērijas numuriem un daži citi endogēni mediatori. Interleikīni, kuru sērijas numuri sākas no 1, nepieder pie vienas citokīnu apakšgrupas, kas saistītas ar kopīgām funkcijām. Tos savukārt var iedalīt pro-iekaisuma citokīnos, limfocītu augšanas un diferenciācijas faktoros un atsevišķos regulējošos citokīnos. Nosaukums “interleikīns” tiek piešķirts jaunatklātam mediatoram, ja tiek ievēroti šādi Starptautiskās imunoloģisko biedrību savienības nomenklatūras komitejas izstrādātie kritēriji: pētāmā faktora gēna molekulārā klonēšana un ekspresija, unikāla nukleotīda klātbūtne. un atbilstošo aminoskābju secību, un neitralizējošu monoklonālo antivielu veidošanos. Turklāt jaunajai molekulai ir jārada imūnsistēmas šūnas (limfocīti, monocīti vai cita veida leikocīti), tai ir svarīga bioloģiska funkcija imūnās atbildes regulēšanā, kā arī papildu funkcijas, tāpēc to nevar dot. funkcionāls nosaukums. Visbeidzot, uzskaitītās jaunā interleikīna īpašības ir jāpublicē recenzētā zinātniskā publikācijā. Citokīnu klasifikāciju var veikt pēc to bioķīmiskajām un bioloģiskajām īpašībām, kā arī pēc receptoru veidiem, caur kuriem citokīni veic savas bioloģiskās funkcijas. Citokīnu klasifikācijā pēc struktūras (1. tabula) tiek ņemta vērā ne tikai aminoskābju secība, bet galvenokārt proteīna terciārā struktūra, kas precīzāk atspoguļo molekulu evolūcijas izcelsmi.

1. tabula. Citokīnu klasifikācija pēc struktūras.

Gēnu klonēšana un citokīnu receptoru struktūras analīze parādīja, ka, tāpat kā pašus citokīnus, arī šīs molekulas var iedalīt vairākos veidos pēc aminoskābju secību līdzības un ekstracelulāro domēnu organizācijas īpatnībām (2. tabula). Vienu no lielākajām citokīnu receptoru saimēm sauc par hematopoetīna receptoru saimi vai I tipa citokīnu receptoru saimi. Šīs receptoru grupas strukturāla iezīme ir 4 cisteīnu un aminoskābju secības Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) klātbūtne molekulā, kas atrodas nelielā attālumā no šūnas membrānas. II klases citokīnu receptori mijiedarbojas ar interferoniem un IL-10. Abiem pirmajiem receptoru veidiem ir homoloģija vienam ar otru. Sekojošās receptoru grupas nodrošina mijiedarbību ar audzēja nekrozes faktoru saimes un IL-1 saimes citokīniem. Pašlaik ir zināmi vairāk nekā 20 dažādi ķīmokīnu receptori, kas mijiedarbojas ar dažādu afinitātes pakāpi ar vienu vai vairākiem ķemokīnu saimes ligandiem. Ķīmokīna receptori pieder rodopsīna receptoru virsģimenei, tiem ir 7 transmembrānu domēni un tie pārraida signālus, izmantojot G proteīnus.

2. tabula. Citokīnu receptoru klasifikācija.

Daudzi citokīnu receptori sastāv no 2-3 apakšvienībām, ko kodē dažādi gēni un ekspresē neatkarīgi. Turklāt, lai izveidotu augstas afinitātes receptoru, ir nepieciešama vienlaicīga visu apakšvienību mijiedarbība. Šādas citokīnu receptoru organizācijas piemērs ir IL-2 receptoru kompleksa struktūra. Pārsteidzošs bija atklājums, ka atsevišķas IL-2 receptoru kompleksa apakšvienības ir kopīgas IL-2 un vairākiem citiem citokīniem. Tādējādi β-ķēde vienlaikus ir IL-15 receptora sastāvdaļa, un γ-ķēde kalpo kā kopēja IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- receptoru apakšvienība. 15 un IL-21. Tas nozīmē, ka visi minētie citokīni, kuru receptori arī sastāv no 2-3 atsevišķiem polipeptīdiem, kā savu receptoru sastāvdaļu izmanto γ-ķēdi, turklāt par signāla pārraidi atbildīgo komponentu. Visos gadījumos katra citokīna mijiedarbības specifiku nodrošina citas apakšvienības, kas atšķiras pēc struktūras. Starp citokīnu receptoriem ir 2 biežāk sastopamas receptoru apakšvienības, kas pārraida signālus pēc mijiedarbības ar dažādiem citokīniem. Šī ir βc receptoru apakšvienība (gp140), kas ir kopīga IL-3, IL-5 un GM-CSF receptoriem, un gp130 receptoru apakšvienība, kas ir kopīga IL-6 saimes locekļiem. Kopīgas signalizācijas apakšvienības klātbūtne citokīnu receptoros kalpo kā viena no pieejām to klasifikācijai, jo ļauj atrast kopību gan ligandu struktūrā, gan bioloģiskajos efektos.

3. tabulā parādīta kombinēta strukturālā un funkcionālā klasifikācija, kur visi citokīni ir sadalīti grupās, primāri ņemot vērā to bioloģisko aktivitāti, kā arī iepriekš minētās citokīnu molekulu un to receptoru strukturālās īpatnības.

3. tabula. Citokīnu strukturālā un funkcionālā klasifikācija.

	Citokīnu ģimenes	Apakšgrupas un ligandi	Bioloģiskās pamatfunkcijas
	I tipa interferoni	IFN a,b,d,k,w,t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Pretvīrusu aktivitāte, antiproliferatīva, imūnmodulējoša iedarbība
	Hematopoētisko šūnu augšanas faktori	Cilmes šūnu faktors (komplekts-ligands, tērauda faktors), Flt-3 ligands, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 gp140 ligandi: IL-3, IL-5, GM-CSF	Dažādu veidu cilmes šūnu proliferācijas un diferenciācijas stimulēšana kaulu smadzenēs, hematopoēzes aktivizēšana Eritropoetīns, trombopoetīns
	Interleikīns-1 un FGF virsģimene	FRF ģimene: Skābā FGF, bāziskā FGF, FGF3 – FGF23 IL-1 saime (F1-11): IL-1α, IL-1β, IL-1 receptoru antagonists, IL-18, IL-33 utt.	Fibroblastu un epitēlija šūnu proliferācijas aktivizēšana Pro-iekaisuma efekts, specifiskas imunitātes aktivizēšana
	Audzēja nekrozes faktoru ģimene	TNF, limfotoksīni α un β, Fas ligands utt.	Iekaisuma efekts, apoptozes regulēšana un imūnkompetentu šūnu starpšūnu mijiedarbība
	Interleikīnu-6 ģimene	gp130 ligandi: IL-6, IL-11, IL-31, onkostatīns-M, kardiotropīns-1, leikēmiju inhibējošais faktors, ciliāru neirotrofiskais faktors	Iekaisuma un imūnregulācijas iedarbība
	Ķīmokīni	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Dažādu veidu leikocītu ķīmijakses regulēšana
	Interleikīnu-10 ģimene	IL-10,19,20,22,24,26	Imūnsupresīva iedarbība
	Interleikīnu-12 ģimene		Helper T-limfocītu diferenciācijas regulēšana
	T-helperu klonu citokīni un limfocītu regulējošās funkcijas	T-palīdzības veids 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg 2. tipa palīga T šūnas: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 receptoru γ-ķēdes ligandi: IL-7 TSLP	Šūnu imunitātes aktivizēšana Humorālās imunitātes aktivizēšana, imūnmodulējoša iedarbība Dažādu veidu limfocītu, DC, NK šūnu, makrofāgu u.c. diferenciācijas, proliferācijas un funkcionālo īpašību stimulēšana.
	Interleikīnu 17 ģimene	IL-17A, B, C, D, E, F	Pro-iekaisuma citokīnu sintēzes aktivizēšana
	Nervu augšanas faktora, trombocītu izcelsmes augšanas faktora un transformējošo augšanas faktoru virsdzimta	Nervu augšanas faktoru saime: NGF, no smadzenēm iegūts neirotrofiskais faktors Trombocītu izcelsmes augšanas faktori (PDGF), angiogēnie augšanas faktori (VEGF) TRF saime: TRFb, aktivīni, inhibīni, mezgli, kaulu morfogēnie proteīni, Mullera inhibējošā viela	Iekaisuma, angioģenēzes, neironu funkcijas, embriju attīstības un audu reģenerācijas regulēšana
	Epidermas augšanas faktoru ģimene	ERF, TRFα utt.
	Insulīnam līdzīgu augšanas faktoru saime	IRF-I, IRF-II	Dažādu šūnu tipu proliferācijas stimulēšana

Pirmajā grupā ietilpst I tipa interferoni, un tā ir visvienkāršākā pēc organizācijas, jo visām tajā iekļautajām molekulām ir līdzīga struktūra un lielākoties tādas pašas funkcijas, kas saistītas ar pretvīrusu aizsardzību. Otrajā grupā bija hematopoētisko šūnu augšanas un diferenciācijas faktori, kas stimulē asinsrades cilmes šūnu attīstību, sākot no cilmes šūnas. Šajā grupā ietilpst citokīni, kas ir šauri specifiski atsevišķām hematopoētisko šūnu diferenciācijas līnijām (eritropoetīns, trombopoetīns, kā arī IL-7, kas iedarbojas uz T-B limfocītu prekursoriem), kā arī citokīni ar plašāku bioloģiskās aktivitātes spektru, piemēram, IL-3, IL-11, koloniju stimulējošie faktori. Šajā citokīnu grupā gp140 ligandi, kuriem ir kopīga receptoru apakšvienība, kā arī trombopoetīns un eritropoetīns, ir izolēti molekulu strukturālās organizācijas līdzības dēļ. FGF un IL-1 virsģimenes citokīniem ir augsta homoloģijas pakāpe un līdzīga olbaltumvielu struktūra, kas apstiprina to kopīgo izcelsmi. Tomēr bioloģiskās aktivitātes izpausmju ziņā FGF daudzos aspektos atšķiras no IL-1 saimes agonistiem. IL-1 molekulu saimei šobrīd papildus funkcionālajiem nosaukumiem ir apzīmējumi F1-F11, kur F1 atbilst IL-1α, F2 atbilst IL-1β, F3 atbilst IL-1 receptoru antagonistam, F4 atbilst IL-18. . Atlikušie ģimenes locekļi tika atklāti ģenētiskās analīzes rezultātā, un tiem ir diezgan augsta homoloģija ar IL-1 molekulām, tomēr to bioloģiskās funkcijas nav pilnībā noskaidrotas. Sekojošās citokīnu grupas ietver IL-6 ģimenes (kopējās receptoru apakšvienības gp130 ligandi), audzēja nekrozes faktoru un ķemokīnus, ko pārstāv lielākais skaits atsevišķu ligandu un pilnībā uzskaitītas to attiecīgajās nodaļās. Audzēja nekrozes faktoru saime veidojas galvenokārt uz ligandu un to receptoru struktūras līdzību pamata, kas sastāv no trim nekovalenti nesaistītām identiskām apakšvienībām, kas veido bioloģiski aktīvas molekulas. Tajā pašā laikā to bioloģisko īpašību dēļ šajā ģimenē ietilpst citokīni ar diezgan atšķirīgu darbību. Piemēram, TNF ir viens no ievērojamākajiem iekaisuma veicinošiem citokīniem, Fas ligands izraisa mērķa šūnu apoptozi, un CD40 ligands nodrošina stimulējošu signālu T un B limfocītu starpšūnu mijiedarbības laikā. Šādas atšķirības strukturāli līdzīgu molekulu bioloģiskajā aktivitātē galvenokārt nosaka to receptoru ekspresijas un struktūras īpatnības, piemēram, šūnu apoptozi noteicošā intracelulārā “nāves” domēna esamība vai neesamība. Arī IL-10 un IL-12 ģimenes pēdējos gados ir papildinātas ar jauniem dalībniekiem, kuri saņēmuši sērijas numurus interleikīnus. Tam seko ļoti sarežģīta citokīnu grupa, kas ir palīgu T-limfocītu funkcionālās aktivitātes mediatori. Iekļaušana šajā grupā balstās uz diviem galvenajiem principiem: 1) piederība pie citokīniem, ko sintezē Th1 vai Th2, kas nosaka pārsvarā humorāla vai šūnu tipa imunoloģisko reakciju attīstību, 2) kopīgas receptoru apakšvienības - gamma ķēdes - klātbūtne. IL-2 receptoru komplekss. No gamma ķēdes ligandiem papildus tika izolēts IL-4, kuram ir arī kopīgas receptoru apakšvienības ar IL-13, kas lielā mērā nosaka šo citokīnu daļēji pārklājošo bioloģisko aktivitāti. Līdzīgi tika izolēts IL-7, kam ir kopīga receptoru struktūra ar TSLP. Iepriekš minētās klasifikācijas priekšrocības ir saistītas ar citokīnu bioloģisko un bioķīmisko īpašību vienlaicīgu apsvēršanu. Šīs pieejas iespējamību pašlaik apstiprina jaunu citokīnu atklāšana, izmantojot genoma ģenētisko analīzi un strukturāli līdzīgu gēnu meklēšanu. Pateicoties šai metodei, I tipa interferonu IL-1, IL-10, IL-12 saime ir ievērojami paplašinājusies, un ir parādījusies jauna IL-17 citokīnu analogu saime, kas jau sastāv no 6 locekļiem. Acīmredzot tuvākajā nākotnē jaunu citokīnu parādīšanās notiks daudz lēnāk, jo cilvēka genoma analīze ir gandrīz pabeigta. Izmaiņas, visticamāk, iespējamas, noskaidrojot ligandu-receptoru mijiedarbības variantus un bioloģiskās īpašības, kas ļaus citokīnu klasifikācijai iegūt galīgo formu.

Darbības mehānismi.

B. Citokīnu receptori. Citokīni ir hidrofilas signalizācijas vielas, kuru darbību mediē specifiski receptori plazmas membrānas ārējā pusē. Citokīnu saistīšanās ar receptoru (1) noved pie virknes starpposmu (2-5) līdz noteiktu gēnu transkripcijas aktivizēšanai (6). Citokīnu receptoriem pašiem nav tirozīna kināzes aktivitātes (ar dažiem izņēmumiem). Pēc saistīšanās ar citokīnu (1) receptoru molekulas asociējas, veidojot homodimērus. Turklāt tie var veidot heterodimērus, saistot tos ar signālu transportēšanas proteīniem [STP], vai stimulēt pašu STP dimerizāciju (2). I klases citokīnu receptori var agregēties ar trīs veidu BPS: GP130, βc vai γc proteīniem. Šie palīgproteīni paši nav spējīgi saistīt citokīnus, bet tie pārraida signālu tirozīna kināzēm (3).Daudzu citokīnu identiskie bioloģiskās aktivitātes spektri ir izskaidrojami ar to, ka dažādi citokīnu-receptoru kompleksi var aktivizēt vienu un to pašu BPS.

Kā citokīnu signalizācijas piemērs diagramma parāda, kā IL-6 receptors (IL-6), saistoties ar ligandu (1), stimulē GP130 (2) dimerizāciju. Membrānas proteīna dimērs GP130 saistās un aktivizē JA ģimenes citoplazmas tirozīna kināzes (Janus kināzes ar divām aktīvām vietām) (3). Janus kināzes fosforilē citokīnu receptorus, BPS un dažādus citoplazmas proteīnus, kas veic turpmāku signālu pārraidi; tie arī fosforilē transkripcijas faktorus – signālu devējus un transkripcijas aktivatorus [PSAT (signal Transducers and activators of transscription)]. Šīs olbaltumvielas pieder pie BPS saimes, kuru struktūrā ir SH3 domēns, kas atpazīst fosfotirozīna atlikumus (sk. 372. lpp.). Tāpēc tiem ir iespēja saistīties ar fosforilēto citokīnu receptoru. Ja pēc tam notiek PSAT molekulas (4) fosforilēšanās, faktors kļūst aktīvs un veido dimēru (5). Pēc translokācijas kodolā dimērs kā transkripcijas faktors saistās ar iniciētā gēna promotoru (sk. 240. lpp.) un inducē tā transkripciju (6) Daži citokīnu receptori proteolīzes dēļ var zaudēt ekstracelulāro ligandu saistošo domēnu. (nav parādīts diagrammā). Domēns nonāk asinīs, kur sacenšas par saistīšanos ar citokīnu, kas samazina citokīna koncentrāciju asinīs.Kopā citokīni veido regulējošo tīklu (citokīnu kaskādi) ar daudzfunkcionālu efektu. Citokīnu pārklāšanās noved pie tā, ka daudzu no tiem darbība ir sinerģiska, un daži citokīni ir antagonisti. Bieži vien organismā var novērot veselu citokīnu kaskādi ar sarežģītu atgriezenisko saiti.

Citokīnu īpašības.

Citokīnu vispārīgās īpašības, pateicoties kurām šos mediatorus var apvienot neatkarīgā regulējošā sistēmā.

1. Citokīni ir polipeptīdi vai proteīni, bieži vien glikozilēti, vairumam no tiem MW ir no 5 līdz 50 kDa. Bioloģiski aktīvās citokīnu molekulas var sastāvēt no vienas, divām, trim vai vairākām identiskām vai atšķirīgām apakšvienībām.

2. Citokīniem nav antigēnu specifiskas bioloģiskās iedarbības. Tie ietekmē šūnu funkcionālo aktivitāti, kas piedalās iedzimtas un iegūtās imunitātes reakcijās. Taču, iedarbojoties uz T un B limfocītiem, citokīni spēj stimulēt antigēnu izraisītus procesus imūnsistēmā.

3. Citokīnu gēniem ir trīs ekspresijas iespējas: a) stadijai specifiska ekspresija noteiktos embrionālās attīstības posmos, b) konstitutīva ekspresija vairāku normālu fizioloģisko funkciju regulēšanai, c) inducējams ekspresijas veids, kas raksturīgs lielākajai daļai citokīni. Patiešām, lielāko daļu citokīnu ārpus iekaisuma reakcijas un imūnās atbildes šūnas nesintezē. Citokīnu gēnu ekspresija sākas, reaģējot uz patogēnu iekļūšanu organismā, antigēnu kairinājumu vai audu bojājumu. Viens no spēcīgākajiem proinflammatorisko citokīnu sintēzes induktoriem ir ar patogēniem saistītas molekulārās struktūras. Lai aktivizētu T-šūnu citokīnu sintēzi, ir nepieciešama šūnu aktivācija ar specifisku antigēnu, piedaloties T-šūnu antigēna receptoram.

4. Citokīni tiek sintezēti, reaģējot uz stimulāciju īsu laika periodu. Sintēze tiek pārtraukta dažādu autoregulācijas mehānismu dēļ, tostarp palielinātas RNS nestabilitātes dēļ, kā arī tāpēc, ka pastāv negatīvas atgriezeniskās saites cilpas, ko mediē prostaglandīni, kortikosteroīdu hormoni un citi faktori.

5. Vienu un to pašu citokīnu var ražot dažādas histoģenētiskas izcelsmes ķermeņa šūnu veidi dažādos orgānos.

6. Citokīnus var saistīt ar to šūnu membrānām, kas tos sintezē, kam piemīt pilns bioloģiskās aktivitātes spektrs membrānas formā un izpaužas starpšūnu kontaktā.

7. Citokīnu bioloģiskā iedarbība ir saistīta ar specifiskiem šūnu receptoru kompleksiem, kas saista citokīnus ar ļoti augstu afinitāti, un atsevišķi citokīni var izmantot kopīgas receptoru apakšvienības. Citokīnu receptori var pastāvēt šķīstošā formā, vienlaikus saglabājot spēju saistīt ligandus.

8. Citokīniem ir pleiotropiska bioloģiska iedarbība. Viens un tas pats citokīns var iedarboties uz daudzu veidu šūnām, izraisot dažādus efektus atkarībā no mērķa šūnu veida (1. att.). Citokīnu darbības pleiotropiju nodrošina citokīnu receptoru ekspresija uz dažādas izcelsmes un funkcijas šūnu tipiem un signālu pārraide, izmantojot vairākus dažādus intracelulāros sūtņus un transkripcijas faktorus.

9. Citokīniem ir raksturīga bioloģiskās iedarbības savstarpēja aizstājamība. Vairāki dažādi citokīni var izraisīt tādu pašu bioloģisko efektu vai tiem var būt līdzīga aktivitāte. Citokīni inducē vai nomāc savu, citu citokīnu un to receptoru sintēzi.

10. Reaģējot uz aktivācijas signālu, šūnas vienlaikus sintezē vairākus citokīnus, kas iesaistīti citokīnu tīkla veidošanā. Bioloģiskā iedarbība audu un ķermeņa līmenī ir atkarīga no citu citokīnu klātbūtnes un koncentrācijas ar sinerģisku, aditīvu vai pretēju iedarbību.

11. Citokīni var ietekmēt mērķa šūnu proliferāciju, diferenciāciju un funkcionālo aktivitāti.

12. Citokīni iedarbojas uz šūnām dažādos veidos: autokrīnās – uz šūnu, kas sintezē un izdala šo citokīnu; parakrīns - uz šūnām, kas atrodas netālu no ražotāja šūnas, piemēram, iekaisuma fokusā vai limfoīdā orgānā; endokrīnās - attālināti uz jebkuru orgānu un audu šūnām pēc nonākšanas cirkulācijā. Pēdējā gadījumā citokīnu darbība atgādina hormonu darbību (2. att.).

Rīsi. 1. Vienu un to pašu citokīnu var ražot dažādas histoģenētiskas izcelsmes ķermeņa šūnu veidi dažādos orgānos un iedarboties uz daudzu veidu šūnām, izraisot dažādus efektus atkarībā no mērķa šūnu veida.

Rīsi. 2. Trīs iespējas citokīnu bioloģiskās iedarbības izpausmei.

Acīmredzot citokīnu regulēšanas sistēmas veidošanās notika evolucionāri līdz ar daudzšūnu organismu attīstību, un tas bija saistīts ar nepieciešamību veidot starpšūnu mijiedarbības mediatorus, kas var ietvert hormonus, neiropeptīdus, adhēzijas molekulas un dažas citas. Šajā sakarā citokīni ir visuniversālākā regulējošā sistēma, jo tie spēj izrādīt bioloģisku aktivitāti gan tālu pēc sekrēcijas no ražotājšūnas (lokāli un sistēmiski), gan starpšūnu kontakta laikā, būdami bioloģiski aktīvi membrānas formā. Šī citokīnu sistēma atšķiras no adhēzijas molekulām, kas šaurākas funkcijas veic tikai šūnu tiešā saskarē. Tajā pašā laikā citokīnu sistēma atšķiras no hormoniem, kurus galvenokārt sintezē specializēti orgāni un kuri iedarbojas pēc nonākšanas cirkulācijas sistēmā.

Citokīnu nozīme organisma fizioloģisko funkciju regulēšanā.

Citokīnu lomu ķermeņa fizioloģisko funkciju regulēšanā var iedalīt 4 galvenajos komponentos:

1. Embrioģenēzes, orgānu veidošanās un attīstības regulēšana, t.sk. imūnsistēmas orgāni.

2. Dažu normālu fizioloģisko funkciju regulēšana.

3. Organisma aizsardzības reakciju regulēšana lokālā un sistēmiskā līmenī.

4. Audu reģenerācijas procesu regulēšana.

Atsevišķu citokīnu gēnu ekspresija notiek stadijai raksturīgā veidā noteiktos embrija attīstības posmos. Cilmes šūnu faktors, transformējošie augšanas faktori, TNF ģimenes citokīni un kemokīni regulē dažādu šūnu diferenciāciju un migrāciju un imūnsistēmas orgānu veidošanos. Pēc tam dažu citokīnu sintēze var neatsākties, bet citi turpina regulēt normālus fizioloģiskos procesus vai piedalīties aizsargreakciju attīstībā.

Neskatoties uz to, ka lielākā daļa citokīnu ir tipiski inducējami mediatori, un šūnas tos nesintezē ārpus iekaisuma un imūnās atbildes reakcijas pēcdzemdību periodā, uz dažiem citokīniem šis noteikums neattiecas. Konstitutīvās gēnu ekspresijas rezultātā daži no tiem tiek pastāvīgi sintezēti un ir apritē pietiekami lielos daudzumos, regulējot atsevišķu šūnu tipu proliferāciju un diferenciāciju dzīves laikā. Šāda veida citokīnu fizioloģiskās funkciju regulēšanas piemēri var būt pastāvīgi augsts eritropoetīna līmenis un daži CSF, lai nodrošinātu asinsradi. Ķermeņa aizsardzības reakciju regulēšana ar citokīniem notiek ne tikai imūnsistēmā, bet arī organizējot aizsardzības reakcijas visa organisma līmenī, jo tiek regulēti gandrīz visi iekaisuma attīstības un imūnās atbildes aspekti. Šī funkcija, kas ir vissvarīgākā visai citokīnu sistēmai, ir saistīta ar diviem galvenajiem citokīnu bioloģiskās darbības virzieniem - aizsardzību pret infekcijas izraisītājiem un bojāto audu atjaunošanu. Citokīni galvenokārt regulē lokālu aizsargreakciju attīstību audos, kas ietver dažāda veida asins šūnas, endotēliju, saistaudus un epitēliju. Aizsardzība vietējā līmenī attīstās, veidojot tipisku iekaisuma reakciju ar tās klasiskajām izpausmēm: hiperēmiju, tūskas attīstību, sāpju parādīšanos un disfunkciju. Citokīnu sintēze sākas, kad patogēni iekļūst audos vai izjauc to integritāti, kas parasti notiek paralēli. Citokīnu veidošanās ir daļa no šūnu reakcijas, kas saistīta ar to, ka mielomonocītu šūnas atpazīst dažādu patogēnu līdzīgus strukturālos komponentus, ko sauc par ar patogēniem saistītiem molekulāriem modeļiem. Šādu patogēnu struktūru piemēri ir gramnegatīvu baktēriju lipopolisaharīdi, grampozitīvu mikroorganismu peptidoglikāni, flagellīns vai ar CpolyG sekvencēm bagāta DNS, kas raksturīga visu veidu baktēriju DNS. Leikocīti ekspresē atbilstošus modeļa atpazīšanas receptorus, ko sauc arī par Toll līdzīgiem receptoriem (TLR) un ir specifiski noteiktiem mikroorganismu struktūras modeļiem. Pēc mikroorganismu vai to komponentu mijiedarbības ar TLR tiek iedarbināta intracelulāra signāla transdukcijas kaskāde, kas izraisa paaugstinātu leikocītu funkcionālo aktivitāti un citokīnu gēnu ekspresiju.

TLR aktivizēšana noved pie divu galveno citokīnu grupu sintēzes: proinflammatorisko citokīnu un I tipa interferonu, galvenokārt IFNα/β. Galvenais notikums ir proinflammatorisku citokīnu kompleksa sintēze no IL-1, IL-6 ģimenēm, TNF un kemokīni, kas stimulē lielāko daļu turpmāko notikumu iekaisuma reakcijas attīstībā un nodrošina dažādu veidu šūnu aktivācijas paplašināšanos, kas iesaistītas iekaisuma uzturēšanā un regulēšanā, tostarp visu veidu leikocītu, dendritisko šūnu, T. un B limfocīti, NK šūnas, endotēlija un epitēlija šūnas, fibroblasti un citi. Tas nodrošina secīgus posmus iekaisuma reakcijas attīstībā, kas ir galvenais iedzimtās imunitātes īstenošanas mehānisms. Turklāt dendrītiskās šūnas sāk sintezēt IL-12 saimes citokīnus, kas stimulē palīgu T-limfocītu diferenciāciju, kas kalpo kā sava veida tilts uz specifisku imūnreakciju attīstības sākumu, kas saistīts ar specifiska antigēna atpazīšanu. mikroorganismu struktūras.

Otrs ne mazāk svarīgais mehānisms, kas saistīts ar IFN sintēzi, nodrošina pretvīrusu aizsardzības ieviešanu. I tipa interferoniem ir 4 galvenās bioloģiskās īpašības:

1. Tieša pretvīrusu iedarbība, bloķējot transkripciju.

2. Šūnu proliferācijas nomākšana, kas nepieciešama, lai bloķētu vīrusa izplatīšanos.

3. NK šūnu funkciju aktivizēšana, kurām ir spēja lizēt ar vīrusu inficētas ķermeņa šūnas.

4. I klases galveno histokompatibilitātes kompleksa molekulu pastiprināta ekspresija, kas nepieciešama, lai palielinātu inficēto šūnu vīrusa antigēnu prezentācijas efektivitāti citotoksiskajiem T limfocītiem. Tas noved pie T limfocītu specifiskās ar vīrusu inficēto šūnu atpazīšanas aktivizēšanas - ar vīrusu inficēto mērķa šūnu līzes pirmo posmu.

Rezultātā papildus tiešajai pretvīrusu iedarbībai tiek aktivizēti gan iedzimtās (NK šūnas), gan iegūtās (T-limfocīti) imunitātes mehānismi. Šis ir piemērs tam, kā viena maza citokīna molekula, kuras MW ir 10 reizes mazāka par antivielu molekulu MW, pleiotropa veida bioloģiskās iedarbības dēļ spēj aktivizēt pilnīgi atšķirīgus aizsargreakciju mehānismus, kuru mērķis ir sasniegt vienu mērķi - likvidēt antivielu molekulas. vīruss, kas iekļuvis organismā.

Audu līmenī citokīni ir atbildīgi par iekaisuma attīstību un pēc tam audu reģenerāciju. Attīstoties sistēmiskai iekaisuma reakcijai (akūtās fāzes reakcijai), citokīni ietekmē gandrīz visus ķermeņa orgānus un sistēmas, kas iesaistītas homeostāzes regulēšanā. Pro-iekaisuma citokīnu ietekme uz centrālo nervu sistēmu izraisa apetītes samazināšanos un izmaiņas visā uzvedības reakciju kompleksā. Pārtikas meklēšanas īslaicīga pārtraukšana un seksuālo aktivitāšu samazināšana ir izdevīga enerģijas taupīšanas ziņā tikai vienam uzdevumam - cīņai ar iebrukušo patogēnu. Šo signālu nodrošina citokīni, jo to iekļūšana cirkulācijā noteikti nozīmē, ka vietējā aizsardzība nav spējusi tikt galā ar patogēnu, un ir nepieciešama sistēmiska iekaisuma reakcija. Viena no pirmajām sistēmiskās iekaisuma reakcijas izpausmēm, kas saistīta ar citokīnu iedarbību uz hipotalāma termoregulācijas centru, ir ķermeņa temperatūras paaugstināšanās. Temperatūras paaugstināšanās ir efektīva aizsargreakcija, jo paaugstinātā temperatūrā dažu baktēriju vairošanās spēja samazinās, bet, gluži pretēji, palielinās limfocītu proliferācija.

Aknās citokīnu ietekmē palielinās akūtās fāzes proteīnu un komplementa sistēmas komponentu sintēze, kas nepieciešama cīņai ar patogēnu, bet tajā pašā laikā albumīna sintēze samazinās. Vēl viens citokīnu selektīvās darbības piemērs ir izmaiņas asins plazmas jonu sastāvā sistēmiskas iekaisuma reakcijas attīstības laikā. Šajā gadījumā dzelzs jonu līmenis samazinās, bet cinka jonu līmenis palielinās, taču ir labi zināms, ka atņemt baktēriju šūnai dzelzs jonus nozīmē samazināt tās proliferācijas potenciālu (uz to balstās laktoferīna iedarbība). Savukārt cinka līmeņa paaugstināšanās ir nepieciešama normālai imūnsistēmas darbībai, jo īpaši tas ir nepieciešams bioloģiski aktīva seruma aizkrūts dziedzera faktora - viena no galvenajiem aizkrūts dziedzera hormoniem, kas nodrošina limfocītu diferenciāciju - veidošanai. Citokīnu ietekme uz hematopoētisko sistēmu ir saistīta ar ievērojamu hematopoēzes aktivāciju. Leikocītu skaita palielināšanās ir nepieciešama, lai papildinātu zaudējumus un palielinātu šūnu, galvenokārt neitrofilo granulocītu, skaitu strutainā iekaisuma fokusā. Ietekme uz asins koagulācijas sistēmu ir vērsta uz koagulācijas uzlabošanu, kas nepieciešama asiņošanas apturēšanai un patogēna tiešai bloķēšanai.

Tādējādi, attīstoties sistēmiskam iekaisumam, citokīni uzrāda milzīgu bioloģisko aktivitāšu klāstu un traucē gandrīz visu ķermeņa sistēmu darbību. Tomēr neviena no notiekošajām izmaiņām nav nejauša: tās visas ir vai nu vajadzīgas tiešai aizsargreakciju aktivizēšanai, vai arī ir labvēlīgas enerģijas plūsmu pārslēgšanai tikai vienam uzdevumam - cīņai ar iebrūkošo patogēnu. Atsevišķu gēnu ekspresijas, hormonālo izmaiņu un uzvedības reakciju izmaiņu regulēšanas veidā citokīni nodrošina to organisma sistēmu iekļaušanu un maksimālu efektivitāti, kas konkrētajā brīdī nepieciešamas aizsargreakciju attīstībai. Visa organisma līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, hematopoētisko un citām sistēmām un kalpo, lai tās iesaistītu vienas aizsargreakcijas organizēšanā un regulēšanā. Citokīni kalpo kā organizatoriskā sistēma, kas veido un regulē visu organisma aizsargreakciju kompleksu patogēnu ievadīšanas laikā. Acīmredzot šāda regulēšanas sistēma tika izveidota evolucionāri, un tai ir beznosacījuma priekšrocības makroorganisma optimālākās aizsardzības reakcijai. Tāpēc acīmredzot nav iespējams ierobežot aizsardzības reakciju jēdzienu tikai ar nespecifisku rezistences mehānismu līdzdalību un specifisku imūnreakciju. Viss ķermenis un visas sistēmas, kas no pirmā acu uzmetiena nav saistītas ar imunitātes uzturēšanu, piedalās vienā aizsargreakcijā.

Specifiski citokīnu pētījumi.

Citokīnu nozīme resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē bērniem.

S.V. Belmers, A.S. Simbircevs, O.V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mihailova. Krievijas Valsts Medicīnas universitātes Valsts Koloproktoloģijas pētniecības centrs Maskavā un Valsts Augsti tīru bioloģisko preparātu pētniecības institūts Sanktpēterburgā strādā, lai pētītu citokīnu nozīmi resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē bērniem. Hroniskas kuņģa-zarnu trakta iekaisuma slimības šobrīd ieņem vienu no vadošajām vietām bērnu gremošanas sistēmas patoloģijā. Īpaša nozīme ir resnās zarnas iekaisuma slimībām (IBD), kuru sastopamība nepārtraukti pieaug visā pasaulē. Ilgstošs kurss ar biežiem un dažos gadījumos letāliem recidīviem, lokālu un sistēmisku komplikāciju attīstība - tas viss liek rūpīgi izpētīt slimības patoģenēzi, meklējot jaunas pieejas ITD ārstēšanai. Pēdējās desmitgadēs saslimstība ar čūlaino kolītu (UC) ir 510 gadījumi gadā uz 100 tūkstošiem iedzīvotāju, ar Krona slimību (CD) 16 gadījumi gadā uz 100 tūkstošiem iedzīvotāju. Izplatības rādītāji Krievijā un Maskavas reģionā atbilst vidējiem Eiropas datiem, taču ir ievērojami zemāki nekā Skandināvijas valstīs, Amerikā, Izraēlā un Anglijā. UC izplatība ir 19,3 uz 100 tūkstošiem cilvēku, saslimstība ir 1,2 uz 100 tūkstošiem cilvēku gadā. CD izplatība ir 3,0 uz 100 tūkstošiem cilvēku, saslimstība ir 0,2 uz 100 tūkstošiem cilvēku gadā. Tas, ka visaugstākais biežums tiek atzīmēts augsti attīstītajās valstīs, ir saistīts ne tikai ar sociāliem un ekonomiskiem faktoriem, bet arī ar pacientu ģenētiskajām un imunoloģiskajām īpašībām, kas nosaka noslieci uz ITD. Šie faktori ir būtiski ITD izcelsmes imūnpatoģenētiskajā teorijā. Vīrusu un/vai baktēriju teorijas izskaidro tikai akūtu slimības sākšanos, un procesa hroniskums ir saistīts gan ar ģenētisko predispozīciju, gan imūnās atbildes īpatnībām, kuras arī ir ģenētiski noteiktas. Jāpiebilst, ka ITD šobrīd tiek klasificēta kā slimība ar ģenētiski neviendabīgu kompleksu predispozīciju. Ir identificēti vairāk nekā 15 iespējamie kandidātgēni no 2 grupām (imūnspecifiski un imūnregulējoši), kas izraisa iedzimtu predispozīciju. Visticamāk, predispozīciju nosaka vairāki gēni, kas nosaka imunoloģisko un iekaisuma reakciju raksturu. Pamatojoties uz daudzu pētījumu rezultātiem, mēs varam secināt, ka visticamākā gēnu lokalizācija, kas saistīta ar ITD attīstību, ir 3., 7., 12. un 16. hromosomas. Šobrīd liela uzmanība tiek pievērsta T un B limfocītu, kā arī citokīnu un iekaisuma mediatoru funkciju īpašību izpētei. Aktīvi tiek pētīta interleikīnu (IL), interferonu (IFN), audzēja nekrozes faktora-a (TNF-a), makrofāgu un autoantivielu loma pret resnās zarnas gļotādas un automikrofloras olbaltumvielām. Ir identificētas to traucējumu pazīmes CD un UC, taču joprojām nav skaidrs, vai šīs izmaiņas notiek primāri vai sekundāri. Lai izprastu daudzus patoģenēzes aspektus, ļoti svarīgi būtu pētījumi, kas veikti ITD preklīniskajā stadijā, kā arī pirmās pakāpes radiniekiem. Starp iekaisuma mediatoriem īpaša loma ir citokīniem, kas ir polipeptīdu molekulu grupa ar masu no 5 līdz 50 kDa, kas iesaistītas organisma aizsargreakciju veidošanā un regulēšanā. Ķermeņa līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, hematopoētisko un citām sistēmām un kalpo, lai tās iesaistītu aizsargreakciju organizēšanā un regulēšanā. Citokīnu klasifikācija ir parādīta 2. tabulā. Lielāko daļu citokīnu nesintezē šūnas ārpus iekaisuma reakcijas un imūnās atbildes reakcijas. Citokīnu gēnu ekspresija sākas, reaģējot uz patogēnu iekļūšanu organismā, antigēnu kairinājumu vai audu bojājumu. Viens no spēcīgākajiem citokīnu sintēzes induktoriem ir baktēriju šūnu sieniņu sastāvdaļas: LPS, peptidoglikāni un muramildipeptīdi. Pro-iekaisuma citokīnu ražotāji galvenokārt ir monocīti, makrofāgi, T šūnas u.c. Atkarībā no ietekmes uz iekaisuma procesu citokīnus iedala divās grupās: pro-iekaisuma citokīni (IL-1, IL-6, IL-8, TNF). -a, IFN-g ) un pretiekaisuma (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleikīns-1 (IL-1) ir imūnregulācijas mediators, kas izdalās iekaisuma reakciju, audu bojājumu un infekciju laikā (pro-iekaisuma citokīns). IL-1 ir svarīga loma T šūnu aktivizēšanā, kad tās mijiedarbojas ar antigēnu. Ir zināmi 2 IL-1 veidi: IL-1a un IL-1b, divu dažādu gēnu lokusu produkti, kas atrodas cilvēka 2. hromosomā. IL-1a paliek šūnā vai var būt membrānas formā, nelielos daudzumos parādās ārpusšūnu telpā. IL-1a membrānas formas loma ir aktivējošo signālu pārraide no makrofāga uz T limfocītiem un citām šūnām starpšūnu kontakta laikā. IL-1a ir galvenais īstermiņa starpnieks. IL-1b, atšķirībā no IL-1a, aktīvi izdala šūnas, iedarbojoties gan sistēmiski, gan lokāli. Mūsdienās ir zināms, ka IL-1 ir viens no galvenajiem iekaisuma reakciju mediatoriem, stimulē T šūnu proliferāciju, palielina IL-2 receptoru ekspresiju uz T šūnām un IL-2 veidošanos. IL-2 kopā ar antigēnu inducē neitrofilu aktivāciju un adhēziju, stimulē citu citokīnu (IL-2, IL-3, IL-6 u.c.) veidošanos ar aktivētām T šūnām un fibroblastiem, stimulē fibroblastu proliferāciju. un endotēlija šūnas. Sistēmiski IL-1 darbojas sinerģiski ar TNF-a un IL-6. Palielinoties koncentrācijai asinīs, IL-1 ietekmē hipotalāma šūnas un izraisa ķermeņa temperatūras paaugstināšanos, drudzi, miegainību, apetītes samazināšanos, kā arī stimulē aknu šūnas ražot akūtās fāzes proteīnus (CRP, amiloīdu A, a- 2 makroglobulīns un fibrinogēns). IL4 (5. hromosoma). Inhibē makrofāgu aktivāciju un bloķē daudzus IFNg stimulētos efektus, piemēram, IL1, slāpekļa oksīda un prostaglandīnu veidošanos, spēlē svarīgu lomu pretiekaisuma reakcijās, un tai ir imūnsupresīva iedarbība. IL6 (7. hromosoma), viens no galvenajiem iekaisuma veicinošajiem citokīniem, ir galvenais B šūnu un makrofāgu diferenciācijas pēdējā posma induktors, kas ir spēcīgs aknu šūnu akūtās fāzes proteīnu ražošanas stimulators. Viena no galvenajām IL6 funkcijām ir antivielu ražošanas stimulēšana in vivo un in vitro. IL8 (4. hromosoma). Attiecas uz ķemokīna mediatoriem, kas izraisa leikocītu virzītu migrāciju (ķīmotaksi) uz iekaisuma vietu. IL10 galvenā funkcija ir nomākt 1. tipa T helpera (TNFb, IFNg) un aktivēto makrofāgu (TNF-a, IL1, IL12) citokīnu veidošanos. Tagad ir atzīts, ka imūnās atbildes veidi ir saistīti ar vienu no limfocītu aktivācijas variantiem, kurā dominē 1. tipa (TH2) vai 2. tipa (TH3) palīga T-limfocītu kloni. Produkti TH2 un TH3 negatīvi ietekmē pretējo klonu aktivāciju. Pārmērīga viena no Th klonu veidiem aktivizēšana var virzīt imūnreakciju vienā no attīstības iespējām. Hroniska Th klonu aktivācijas nelīdzsvarotība izraisa imūnpatoloģisku stāvokļu attīstību. Citokīnu izmaiņas ITD var pētīt dažādos veidos, nosakot to līmeni asinīs vai in situ. IL1 līmenis ir paaugstināts visu iekaisīgo zarnu slimību gadījumā. Atšķirības starp UC un CD ietver palielinātu IL2 ekspresiju. Ja UC konstatē pazeminātu vai normālu IL2 līmeni, tad CD konstatē tā paaugstinātu līmeni. IL4 saturs UC palielinās, savukārt CD tas paliek normāls vai pat samazinās. IL6 līmenis, kas mediē akūtās fāzes reakcijas, ir paaugstināts arī visu veidu iekaisuma gadījumā. Iegūtie citokīnu profila dati liecināja, ka divām galvenajām hroniskās ITD formām ir raksturīga atšķirīga citokīnu aktivācija un ekspresija. Pētījumu rezultāti liecina, ka pacientiem ar UC novērotais citokīnu profils vairāk atbilst TH3 profilam, savukārt pacientiem ar CD TH2 profils jāuzskata par raksturīgāku. Šīs hipotēzes par TH2 un TH3 profilu lomu pievilcība ir arī tāda, ka citokīnu lietošana var mainīt imūnreakciju vienā vai otrā virzienā un novest pie remisijas, atjaunojot citokīnu līdzsvaru. To jo īpaši var apstiprināt, izmantojot IL10. Turpmākajos pētījumos jāparāda, vai citokīnu reakcija ir sekundāra parādība, reaģējot uz kairinājumu, vai, gluži pretēji, atbilstošo citokīnu ekspresija nosaka organisma reaktivitāti ar turpmāku klīnisku izpausmju attīstību. Citokīnu līmenis ITD bērniem vēl nav pētīts. Šis darbs ir pirmā daļa no zinātniskā pētījuma, kas veltīts citokīnu statusa izpētei ITD bērniem. Šī darba mērķis bija izpētīt makrofāgu humorālo aktivitāti ar līmeņu (IL1a, IL8) noteikšanu bērniem ar UC un CD, kā arī to dinamiku terapijas laikā. No 2000. līdz 2002. gadam Krievijas Bērnu klīniskās slimnīcas gastroenteroloģijas nodaļā tika izmeklēti 34 bērni ar UC un 19 bērni ar CD vecumā no 4 līdz 16 gadiem. Diagnoze tika pārbaudīta anamnestiski, endoskopiski un morfoloģiski. Pro-iekaisuma citokīnu IL1a, IL8 līmeņa izpēte tika veikta, izmantojot ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu (ELISA). IL1a, IL8 koncentrācijas noteikšanai tika izmantotas Cytokin LLC (Sanktpēterburga, Krievija) ražotās testa sistēmas. Analīze tika veikta Valsts zinātniskā centra Augsti tīru bioloģisko preparātu pētniecības institūta imūnfarmakoloģijas laboratorijā (laboratorijas vadītājs, medicīnas zinātņu doktors, prof. A.S. Simbircevs). Pētījuma laikā iegūtie rezultāti atklāja būtisku IL1a, IL8 līmeņa paaugstināšanos paasinājuma periodā, kas bērniem ar UC bija izteiktāks nekā bērniem ar CD. Ārpus paasinājuma pro-iekaisuma citokīnu līmenis samazinās, bet nesasniedz normālu līmeni. UC gadījumā IL-1a, IL-8 līmenis paasinājuma periodā bija paaugstināts attiecīgi 76,2% un 90% bērnu, bet remisijas periodā - attiecīgi 69,2% un 92,3%. CD gadījumā IL-1a, IL-8 līmenis paasinājuma periodā ir paaugstināts attiecīgi 73,3% un 86,6% bērnu, bet remisijas periodā - attiecīgi 50% un 75%.

Atkarībā no slimības smaguma pakāpes bērni saņēma terapiju ar aminosalicilātiem vai glikokortikoīdiem. Terapijas raksturs būtiski ietekmēja citokīnu līmeņa dinamiku. Ārstēšanas laikā ar aminosalicilātiem pro-iekaisuma citokīnu līmenis bērnu grupā ar UC un CD bija ievērojami augstāks nekā kontroles grupā. Turklāt augstāki rādītāji tika novēroti bērnu grupā ar UC. UC terapijas laikā ar aminosalicilātiem IL1a, IL8 palielinās attiecīgi 82,4% un 100% bērnu, savukārt terapijas laikā ar glikokortikoīdiem 60% bērnu abiem citokīniem. CD gadījumā IL1a, IL8 paaugstinās terapijas laikā ar aminosalicilātiem visiem bērniem un terapijas laikā ar glikokortikoīdiem attiecīgi 55,5% un 77,7% bērnu. Tādējādi šī pētījuma rezultāti liecina par būtisku imūnsistēmas makrofāgu komponenta iesaistīšanos patoģenētiskajā procesā lielākajai daļai bērnu ar UC un CD. Šajā pētījumā iegūtie dati būtiski neatšķiras no datiem, kas iegūti pieaugušo pacientu izmeklēšanā. IL1a un IL8 līmeņa atšķirības pacientiem ar UC un CD ir kvantitatīvas, bet ne kvalitatīvas, kas liecina par šo izmaiņu nespecifisko raksturu hroniska iekaisuma procesa gaitas dēļ. Tāpēc šiem rādītājiem nav diagnostiskas vērtības. IL1a un IL8 līmeņa dinamiskā pētījuma rezultāti pamato augstāku terapijas efektivitāti ar glikokortikoīdu zālēm, salīdzinot ar terapiju ar aminosaliciliem. Iesniegtie dati ir bērnu ar ITD citokīnu statusa pētījuma pirmā posma rezultāts. Nepieciešama turpmāka problēmas izpēte, ņemot vērā citu pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīnu rādītājus.

Slāpekļa oksīda un citokīnu loma akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā.

Šo problēmu pēta T.A.Šumatova, V.B.Šumatovs, E.V.Markelova, L.G.Sukhotepleja: Vladivostokas Valsts medicīnas universitātes Anestezioloģijas un reanimatoloģijas nodaļa. Akūta plaušu trauma sindroms (pieaugušo respiratorā distresa sindroms, ARDS) ir viena no smagākajām akūtas elpošanas mazspējas formām, kas rodas pacientiem smagas traumas, sepses, peritonīta, pankreatīta, liela asins zuduma, aspirācijas, pēc plašas ķirurģiskas iejaukšanās un 50-60% gadījumu izraisa nāvi. Dati no ARDS patoģenēzes pētījumiem, sindroma agrīnas diagnostikas un prognozes kritēriju izstrādes ir maz un diezgan pretrunīgi, kas neļauj izstrādāt saskaņotu diagnostikas un ārstēšanas koncepciju. Ir konstatēts, ka ARDS pamatā ir plaušu kapilāru endotēlija un alveolārā epitēlija bojājumi, asins reoloģisko īpašību pārkāpums, kas izraisa intersticiālo un alveolāro audu pietūkumu, iekaisumu, atelektāzi un plaušu hipertensiju. Pēdējo gadu literatūrā ir parādījusies pietiekama informācija par universālo šūnu un audu metabolisma regulatoru - slāpekļa oksīdu. Interese par slāpekļa oksīdu (NO) galvenokārt ir saistīta ar to, ka tas ir iesaistīts daudzu funkciju regulēšanā, tostarp asinsvadu tonusa, sirds kontraktilitātes, trombocītu agregācijas, neirotransmisijas, ATP un olbaltumvielu sintēzes un imūnās aizsardzības regulēšanā. Turklāt, atkarībā no molekulārā mērķa izvēles un mijiedarbības ar to īpašībām, NO ir arī kaitīga iedarbība. Tiek uzskatīts, ka šūnu aktivācijas izraisītājs ir nelīdzsvarota citokinēmija. Citokīni ir šķīstoši peptīdi, kas darbojas kā imūnsistēmas mediatori un nodrošina šūnu sadarbību, pozitīvu un negatīvu imūnregulāciju. Mēģinājām sistematizēt literatūrā pieejamo informāciju par NO un citokīnu lomu akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā. NO ir ūdenī un taukos šķīstoša gāze. Tā molekula ir nestabils brīvais radikālis, viegli izkliedējas audos, uzsūcas un iznīcina tik ātri, ka spēj ietekmēt tikai tuvākās vides šūnas. NO molekulai piemīt visas klasiskajiem vēstnešiem raksturīgās īpašības: tā ātri veidojas, iedarbojas ļoti zemās koncentrācijās un pēc ārējā signāla pārtraukšanas ātri pārvēršas citos savienojumos, oksidējoties līdz stabiliem neorganiskiem slāpekļa oksīdiem: nitrītiem un nitrātiem. Saskaņā ar dažādiem avotiem NO dzīves ilgums audos ir no 5 līdz 30 sekundēm. Galvenie NO molekulārie mērķi ir dzelzi saturoši enzīmi un olbaltumvielas: šķīstošā guanilāta ciklāze, nitrooksīda sintāze (NOS), hemoglobīns, mitohondriju enzīmi, Krebsa cikla fermenti, proteīnu un DNS sintēze. NO sintēze organismā notiek aminoskābes L-arginīna slāpekli saturošās daļas fermentatīvās transformācijās specifiskā enzīma NOS ietekmē un notiek kalcija jonu mijiedarbībā ar kalmodulīnu. Ferments tiek inaktivēts zemās koncentrācijās un ir maksimāli aktīvs pie 1 µM brīvā kalcija. Ir identificētas divas NOS izoformas: konstitutīvā (cNOS) un inducētā (iNOS), kas ir dažādu gēnu produkti. No kalcija kalmodulīna atkarīgā cNOS pastāvīgi atrodas šūnā un veicina nelielu NO daudzumu izdalīšanos, reaģējot uz receptoru un fizisko stimulāciju. Šīs izoformas ražotais NO darbojas kā transportētājs vairākās fizioloģiskās reakcijās. No kalcija kalmodulīna neatkarīgs iNOS tiek ražots dažādos šūnu veidos, reaģējot uz proinflammatoriskajiem citokīniem, endotoksīniem un oksidētājiem. Šo NOS izoformu transkribē specifiski gēni 17. hromosomā un veicina liela daudzuma NO sintēzi. Fermentu iedala arī trīs veidos: NOS-I (neironāls), NOS-II (makrofāgs), NOS-III (endoteliālais). Fermentu saime, kas sintezē NO, ir atrodama dažādās plaušu šūnās: bronhu epitēlija šūnās, alveolocītos, alveolārajos makrofāgos, tuklo šūnās, bronhu artēriju un vēnu endotēlija šūnās, gludos bronhu un asinsvadu miocītos. , neadrenerģiskos neholīnerģiskos neironos. Cilvēku un zīdītāju bronhu un alveolu epitēlija šūnu konstitutīvā spēja izdalīt NO ir apstiprināta daudzos pētījumos. Noskaidrots, ka NO veidošanā ir iesaistītas cilvēka elpceļu augšējās daļas, kā arī apakšējās daļas. Pētījumi, kas veikti pacientiem ar traheostomiju, ir parādījuši, ka gāzu daudzums gaisā, kas izelpots caur traheostomiju, ir ievērojami mazāks nekā deguna un mutes dobumā. Endogēnā NO sintēze pacientiem ar mehānisko ventilāciju ir būtiski ietekmēta. Pētījumi apstiprina, ka NO izdalīšanās notiek bronhodilatācijas laikā un to kontrolē vagusa nervu sistēma. Iegūti dati, ka NO veidošanās cilvēka elpceļu epitēlijā palielinās pie elpošanas sistēmas iekaisuma slimībām. Gāzu sintēze tiek palielināta, jo citokīnu, kā arī endotoksīnu un lipopolisaharīdu ietekmē aktivizējas inducētais NOS.

Šobrīd ir zināmi vairāk nekā simts citokīnu, kurus tradicionāli iedala vairākās grupās.

1. Interleikīni (IL-1 - IL18) ir sekrēcijas regulējošie proteīni, kas nodrošina mediatoru mijiedarbību imūnsistēmā un tās saziņu ar citām ķermeņa sistēmām.

2. Interferoni (IFN-alfa, beta, gamma) ir pretvīrusu citokīni ar izteiktu imūnregulācijas efektu.

3. Audzēja nekrozes faktori (TNF alfa, beta) - citokīni ar citotoksisku un regulējošu iedarbību.

4. Koloniju stimulējošie faktori (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - hematopoēzes šūnu augšanas un diferenciācijas stimulatori, kas regulē asinsradi.

5. Ķīmokīni (IL-8, IL-16) - leikocītu ķīmijatraktanti.

6. Augšanas faktori - dažādu audu izcelsmes šūnu (fibroblastu augšanas faktors, endotēlija šūnu augšanas faktors, epidermas augšanas faktors) un transformējošo augšanas faktoru (TGF beta) augšanas, diferenciācijas un funkcionālās aktivitātes regulatori.

Šīs bioregulējošās molekulas nosaka iekaisuma un imūnreakcijas veidu un ilgumu, kontrolē šūnu proliferāciju, hematopoēzi, angiogēzi, brūču dzīšanu un daudzus citus procesus. Visi pētnieki uzsver, ka citokīniem trūkst specifiskuma pret antigēniem. Eksperimenti ar kultivētiem plaušu makrofāgiem un tuklo šūnām ir parādījuši iNOS veidošanos, reaģējot uz gamma interferonu, interleikīnu-1, audzēja nekrozes faktoru un lipopolisaharīdiem. Dzīvnieku un cilvēku alveolocītos ir konstatēta iNOS un cNOS ekspresija uz proinflammatoriskajiem citokīniem. Epitēlija šūnu funkcijas regulatora epidermas augšanas faktora pievienošana kultūrai samazināja tikai inducētā enzīma aktivitāti. Ir zināms, ka atkarībā no to rakstura citokīni iedarbojas autokrīni – uz pašām producējošām šūnām, parakrīni – uz citām mērķa šūnām vai endokrīni – uz dažādām šūnām ārpus to ražošanas vietas. Turklāt tie var mijiedarboties viens ar otru saskaņā ar agonistisku vai antagonistisku principu, mainot mērķa šūnu funkcionālo stāvokli un veidojot citokīnu tīklu. Tādējādi citokīni nav izolēti peptīdi, bet gan neatņemama sistēma, kuras galvenās sastāvdaļas ir ražotājšūnas, pats proteīns – citokīns, receptors, kas to uztver, un mērķa šūna. Konstatēts, ka, attīstoties akūtam plaušu bojājumam, paaugstinās pro-iekaisuma citokīnu līmenis: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. To iedarbība ir saistīta ar asinsvadu paplašināšanos, palielinot to caurlaidību un šķidruma uzkrāšanos plaušu audos. Turklāt pētījumi ir parādījuši IFN gamma un TNF alfa spēju izraisīt adhēzijas molekulu - ICAM -1 ekspresiju uz cilvēka endotēlija šūnām. Adhēzijas molekulas, pieķeroties leikocītiem, trombocītiem un endotēlija šūnām, veido “ripojošus” neitrofilus un veicina fibrīna daļiņu agregāciju. Šie procesi veicina kapilāro asinsrites traucējumus, palielina kapilāru caurlaidību un izraisa lokālu audu tūsku. Kapilārās asinsrites palēnināšanos veicina NO aktivizēšanās, kas izraisa arteriolu paplašināšanos. Turpmāko leikocītu migrāciju uz iekaisuma vietu kontrolē īpaši citokīni – kemokīni, kurus ražo un izdala ne tikai aktivētie makrofāgi, bet arī endotēlija šūnas, fibroblasti, gludie miocīti. To galvenā funkcija ir neitrofilu piegāde iekaisuma vietai un to funkcionālās aktivitātes aktivizēšana. Galvenais neitrofilu ķīmokīns ir Il-8. Tās spēcīgākie induktori ir baktēriju lipopolisaharīdi, IL-1 un TNFalfa. R. Bahra et al. uzskata, ka katru neitrofilu transendoteliālās migrācijas posmu regulē, stimulējot TNF alfa koncentrāciju. Attīstoties akūtam plaušu bojājumam, tiek aktivizētas un iesaistītas fāzes mijiedarbībā asinsvadu endotēlija šūnas, bronhu epitēlija šūnas un alveolārie makrofāgi. Rezultātā, no vienas puses, notiek to mobilizācija un aizsargājošo īpašību nostiprināšanās, un, no otras puses, ir iespējami pašu šūnu un apkārtējo audu bojājumi. Vairāki pētījumi liecina, ka iekaisuma vietā var uzkrāties skābekļa daļējas reducēšanās produkts superoksīds, kas inaktivē NO vazoaktīvo efektu. NO un superoksīda anjons ātri reaģē, veidojot peroksinitrītu, kas bojā šūnas. Šī reakcija veicina NO izvadīšanu no asinsvadu un bronhu sieniņām, kā arī no alveolocītu virsmas. Interesanti ir pētījumi, kas liecina, ka peroksinitritam, ko tradicionāli uzskata par NO toksicitātes mediatoru, var būt fizioloģiska iedarbība un tas var izraisīt asinsvadu relaksāciju, paaugstinot cGMP līmeni asinsvadu endotēlijā ar NO starpniecību. Savukārt peroksinitrīts ir spēcīgs oksidētājs, kas var bojāt alveolu epitēliju un plaušu virsmaktīvās vielas. Tas izraisa membrānas proteīnu un lipīdu iznīcināšanu, bojā endotēliju, palielina trombocītu agregāciju un piedalās endotoksēmijas procesos. Tā palielināta veidošanās ir novērota akūta plaušu trauma sindroma gadījumā. Pētnieki uzskata, ka NO, kas rodas inducētā enzīma aktivācijas rezultātā, ir paredzēts nespecifiskai organisma aizsardzībai no plaša spektra patogēniem aģentiem, kavē trombocītu agregāciju un uzlabo lokālo asinsriti. Ir konstatēts, ka pārmērīgs NO daudzums nomāc cNOS aktivitāti šūnās mijiedarbības ar superoksīdu dēļ un, iespējams, guanilāta ciklāzes desensibilizācijas rezultātā, izraisot cGMP samazināšanos šūnā un intracelulārā kalcija palielināšanos. Brett et al. un Kooy et al., analizējot nitrooksiderģisko mehānismu nozīmi ARDS patoģenēzē, pauda viedokli, ka iNOS, peroksinitrīts, kā arī nitrotirozīns, kas ir galvenais peroksinitrīta ietekmes uz olbaltumvielām produkts, var spēlēt galveno lomu attīstībā. no sindroma. Katbertsons u.c. Tiek uzskatīts, ka akūtu plaušu bojājumu pamatā ir NO un peroksinitrīta ietekme uz elastāzi un interleikīnu-8. Kobajaši et al. arī reģistrēts iNOS, interleikīna-1, interleikīna-6, interleikīna-8 satura pieaugums bronhoalveolārajā šķidrumā pacientiem ar akūtu plaušu traumas sindromu. Meldrum et al. parādīja plaušu makrofāgu iekaisuma citokīnu ražošanas samazināšanos ARDS gadījumā NO - L-arginīna vietējās ražošanas substrāta ietekmē. Konstatēts, ka akūtu plaušu bojājumu sindroma ģenēzē nozīmīga loma ir asinsvadu caurlaidības traucējumiem, ko izraisa citokīnu - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monoklonālo antivielu pret CD3 limfocītiem darbība uz plaušu asinsvadu endotēlija. šūnas un imunocīti. Straujš un spēcīgs plaušu asinsvadu caurlaidības pieaugums izraisa neitrofilu migrāciju plaušu audos un citotoksisko mediatoru izdalīšanos, kas izraisa plaušu patoloģisku izmaiņu attīstību. Akūta plaušu bojājuma rašanās laikā TNF alfa palielina neitrofilu adhēziju pie asinsvadu sieniņām, veicina to migrāciju audos, veicina strukturālās un vielmaiņas izmaiņas endotēlija šūnās, izjauc šūnu membrānu caurlaidību, aktivizē citu citokīnu un eikozanoīdu veidošanos. , un izraisa plaušu epitēlija šūnu apoptozi un nekrozi. Ir iegūti dati, kas liecina, ka LPS izraisītā makrofāgu apoptoze lielā mērā ir saistīta ar IFN gamma un to samazina IL-4, IL-10 un TGF beta. Tomēr Kobayashi et al. iegūti dati, kas liecina, ka IFN gamma var būt iesaistīts elpceļu gļotādas epitēlija atjaunošanās procesos. Hagimoto pētījumi sniedz pierādījumus tam, ka bronhu un alveolu epitēlija šūnas, reaģējot uz TNF alfa vai Fas ligandu, izdala IL-8, IL-12. Šis process ir saistīts ar kodolfaktora Carr-B aktivizēšanu ar Fas ligandu.

Tiek uzskatīts, ka IL-8 ir viens no svarīgākajiem citokīniem akūtu plaušu bojājumu patofizioloģijā. Millers et al. Pētot bronho-alveolāro šķidrumu pacientiem ar ARDS uz sepses fona, tika konstatēts ievērojams IL-8 līmeņa pieaugums, salīdzinot ar pacientiem ar kardiogēnu plaušu tūsku. Ir ierosināts, ka primārais Il-8 avots ir plaušas, un šo kritēriju var izmantot sindroma diferenciāldiagnozē. Grau et al. Tiek uzskatīts, ka plaušu kapilāru endotēlija šūnas kalpo kā nozīmīgs citokīnu - IL-6, IL-8 avots akūtu plaušu bojājumu attīstības laikā. Gudmens u.c. Pētot citokīnu līmeņa dinamiku bronho-alveolārajā skalošanas šķidrumā pacientiem ar ARDS, ievērojami palielinājās IL-1beta, IL-8, monocītu ķīmijtaktiskais peptīds-1, epitēlija šūnu neitrofilu aktivators, makrofāgu iekaisuma peptīds-1 alfa. tika izveidota. Tajā pašā laikā autori uzskata, ka IL-1 beta satura palielināšanās var kalpot par sindroma nelabvēlīga iznākuma marķieri. Bauers et al. Ir pierādīts, ka monitoringam var izmantot IL-8 satura monitoringu bronhoalveolārajā šķidrumā pacientiem ar ARDS, IL-8 līmeņa pazemināšanās liecina par nelabvēlīgu procesa gaitu. Vairāki pētījumi arī sniedz pierādījumus tam, ka plaušu asinsvadu endotēlija citokīnu ražošanas līmenis ietekmē akūtu plaušu bojājumu attīstību, un to uzraudzību var izmantot klīniskajā praksē agrīnai diagnostikai. Par iespējamām negatīvajām sekām paaugstināta proinflammatorisko citokīnu līmeņa paaugstināšanās pacientiem ar ARDS liecina pētījumi, ko veica Martin et al., Warner et al.. Citokīnu un baktēriju endotoksīnu aktivētie alveolārie makrofāgi palielina NO sintēzi. Paaugstinās arī bronhu un alveolu epitēlija šūnu, neitrofilu, tuklo šūnu, endotēlija šūnu un plaušu asinsvadu gludo miocītu NO ražošanas līmenis, iespējams, aktivizējoties kodolfaktoram Carr-B. Autori uzskata, ka slāpekļa oksīds, kas rodas NOS izraisītas aktivācijas rezultātā, galvenokārt ir paredzēts nespecifiskai ķermeņa aizsardzībai. Atbrīvots no makrofāgiem, NO ātri iekļūst baktērijās un sēnēs, kur tas inhibē trīs dzīvībai svarīgas enzīmu grupas: H-elektronu transportu, Krebsa ciklu un DNS sintēzi. NO ir iesaistīts organisma aizsardzībā imūnās atbildes reakcijas pēdējās stadijās un tēlaini tiek uzskatīts par imūnsistēmas “soda zobenu”. Taču, ja NO uzkrājas šūnā neadekvāti lielos daudzumos, tam ir arī kaitīga iedarbība. Tādējādi, attīstoties akūtu plaušu bojājumu sindromam, citokīni un NO izraisa secīgu reakciju ķēdi, kā rezultātā tiek traucēta mikrocirkulācija, rodas audu hipoksija, alveolāra un intersticiāla tūska, kā arī tiek bojāta plaušu vielmaiņas funkcija. Līdz ar to var apgalvot, ka citokīnu un NO fizioloģisko un patofizioloģisko darbības mehānismu izpēte ir perspektīvs pētniecības virziens un ļaus nākotnē ne tikai paplašināt izpratni par ARDS patoģenēzi, bet arī noteikt diagnostisko. un sindroma prognostiskie marķieri, lai izstrādātu iespējas patoģenētiski pamatotai terapijai, kuras mērķis ir samazināt letalitāti.

Citokīnu noteikšanas metodes.

Pārskats ir veltīts galvenajām pašlaik izmantotajām citokīnu izpētes metodēm. Īsumā aprakstītas metožu iespējas un mērķis. Tiek prezentētas dažādu metožu priekšrocības un trūkumi citokīnu gēnu ekspresijas analīzei nukleīnskābju un olbaltumvielu ražošanas līmenī. (Citokīni un iekaisumi. 2005. T. 4, Nr. 1. P. 22-27.)

Citokīni ir regulējoši proteīni, kas veido universālu mediatoru tīklu, kas raksturīgs gan imūnsistēmai, gan citu orgānu un audu šūnām. Šīs regulējošo proteīnu klases kontrolē notiek visi šūnu notikumi: proliferācija, diferenciācija, apoptoze, specializēta šūnu funkcionālā aktivitāte. Katra citokīna ietekmi uz šūnām raksturo pleiotropija, dažādu mediatoru iedarbības spektrs pārklājas un būtībā šūnas galīgais funkcionālais stāvoklis ir atkarīgs no vairāku sinerģiski darbojošos citokīnu ietekmes. Tādējādi citokīnu sistēma ir universāls, polimorfs regulējošs mediatoru tīkls, kas paredzēts, lai kontrolētu šūnu elementu proliferācijas, diferenciācijas, apoptozes un funkcionālās aktivitātes procesus hematopoētiskajās, imūnās un citās ķermeņa homeostatiskajās sistēmās. Citokīnu noteikšanas metodes ir ļoti strauji attīstījušās 20 gadu intensīvas izpētes laikā, un šodien tās ir vesela zinātnisko zināšanu joma. Sava darba sākumā citokinoloģijas pētnieki saskaras ar jautājumu par metodes izvēli. Un šeit pētniekam precīzi jāzina, kāda informācija viņam ir jāiegūst, lai sasniegtu savu mērķi. Šobrīd ir izstrādāti simtiem dažādu metožu citokīnu sistēmas novērtēšanai, kas sniedz daudzveidīgu informāciju par šo sistēmu. Citokīnus var novērtēt dažādās bioloģiskās vidēs, pamatojoties uz to specifisko bioloģisko aktivitāti. Tos var kvantitatīvi noteikt, izmantojot dažādas imūnanalīzes metodes, izmantojot poli- un monoklonālās antivielas. Papildus citokīnu sekrēcijas formu izpētei, to intracelulāro saturu un veidošanos audos var pētīt, izmantojot plūsmas citometriju, Western blotēšanu un in situ imūnhistoķīmiju. Ļoti svarīgu informāciju var iegūt, pētot citokīnu mRNS ekspresiju, mRNS stabilitāti, citokīnu mRNS izoformu klātbūtni un dabiskās antisense nukleotīdu sekvences. Citokīnu gēnu alēlo variantu izpēte var sniegt svarīgu informāciju par ģenētiski ieprogrammētu augsta vai zema konkrēta mediatora ražošanu. Katrai metodei ir savi trūkumi un priekšrocības, sava izšķirtspēja un noteikšanas precizitāte. Pētnieka nezināšana un pārpratums par šīm niansēm var novest pie nepatiesiem secinājumiem.

Citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšana.

Atklāšanas vēsture un pirmie soļi citokīnu izpētē bija cieši saistīti ar imūnkompetentu šūnu un šūnu līniju kultivēšanu. Pēc tam tika demonstrēta vairāku šķīstošo olbaltumvielu faktoru regulējošā ietekme (bioloģiskā aktivitāte) uz limfocītu proliferācijas aktivitāti, imūnglobulīnu sintēzi un imūnreakciju attīstību in vitro modeļos. Viena no pirmajām metodēm mediatoru bioloģiskās aktivitātes noteikšanai ir cilvēka limfocītu migrācijas faktora un tā inhibīcijas faktora noteikšana. Tā kā citokīnu bioloģiskā iedarbība ir pētīta, ir radušās dažādas metodes to bioloģiskās aktivitātes novērtēšanai. Tādējādi IL-1 tika noteikts, novērtējot peļu timocītu proliferāciju in vitro, IL-2 - pēc spējas stimulēt limfoblastu proliferatīvo aktivitāti, IL-3 - ar hematopoētisko koloniju augšanu in vitro, IL-4 - ar asinsrades koloniju augšanu. komitogēnā iedarbība, palielinot Ia proteīnu ekspresiju, izraisot IgG1 un IgE veidošanos utt. Šo metožu sarakstu var turpināt, tas tiek pastāvīgi atjaunināts, atklājot jaunas šķīstošo faktoru bioloģiskās aktivitātes. To galvenais trūkums ir metožu nestandarta raksturs un to unifikācijas neiespējamība. Citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšanas metožu tālāka izstrāde noveda pie liela skaita šūnu līniju, kas ir jutīgas pret konkrētu citokīnu, vai multisensitīvu līniju izveidošanas. Lielāko daļu šo šūnu, kas reaģē uz citokīniem, tagad var atrast komerciāli izplatīto šūnu līniju sarakstos. Piemēram, lai pārbaudītu IL-1a un b, tiek izmantota D10S šūnu līnija, IL-2 un IL-15 - CTLL-2 šūnu līnija, IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL-13, GM-CSF - TF-1 šūnu līnija, IL-6 - B9 šūnu līnijai, IL-7 - 2E8 šūnu līnija, TNFa un TNFb - L929 šūnu līnija, IFNg - WiDr šūnu līnija, IL-18 - šūnu līnija KG-1. Tomēr šādai pieejai imūnaktīvo proteīnu izpētē līdzās labi zināmām priekšrocībām, piemēram, nobriedušu un aktīvo proteīnu reālās bioloģiskās aktivitātes mērīšanai, augstai reproducējamībai standartizētos apstākļos, ir arī savi trūkumi. Tie, pirmkārt, ietver šūnu līniju jutību nevis pret vienu citokīnu, bet vairākiem saistītiem citokīniem, kuru bioloģiskā iedarbība pārklājas. Turklāt mēs nevaram izslēgt iespēju, ka mērķa šūnas var izraisīt citu citokīnu ražošanu, kas var izkropļot testa parametru (parasti proliferāciju, citotoksicitāti, ķemotaksi). Mēs vēl nezinām visus citokīnus un ne visas to sekas, tāpēc mēs vērtējam nevis pašu citokīnu, bet kopējo specifisko bioloģisko aktivitāti. Tādējādi bioloģiskās aktivitātes kā dažādu mediatoru kopējās aktivitātes novērtējums (nepietiekama specifika) ir viens no šīs metodes trūkumiem. Turklāt, izmantojot pret citokīniem jutīgas līnijas, nav iespējams noteikt neaktivētas molekulas un saistītos proteīnus. Tas nozīmē, ka šādas metodes neatspoguļo reālu vairāku citokīnu ražošanu. Vēl viens svarīgs šūnu līniju izmantošanas trūkums ir nepieciešamība pēc laboratorijas šūnu kultūrai. Turklāt visas procedūras šūnu audzēšanai un to inkubācijai ar pētāmajiem proteīniem un barotnēm prasa daudz laika. Jāņem vērā arī tas, ka ilgstošas ​​lietošanas šūnu līnijām ir nepieciešama atjaunināšana vai atkārtota sertifikācija, jo kultivēšanas rezultātā tās var mutēt un tikt modificētas, kas var izraisīt to jutības izmaiņas pret mediatoriem un precizitātes samazināšanos. bioloģiskās aktivitātes noteikšanai. Tomēr šī metode ir ideāli piemērota rekombinanto mediatoru specifiskās bioloģiskās aktivitātes pārbaudei.

Citokīnu kvantitatīvā noteikšana, izmantojot antivielas.

Citokīni, ko ražo imūnkompetentas un cita veida šūnas, tiek izlaisti starpšūnu telpā, lai veiktu parakrīnas un autokrīnas signālu mijiedarbības. Pēc šo proteīnu koncentrācijas asins serumā vai kondicionētā vidē var spriest par patoloģiskā procesa būtību un atsevišķu šūnu funkciju pārpalikumu vai deficītu pacientam. Mūsdienās visizplatītākās šo proteīnu noteikšanas sistēmas ir metodes citokīnu noteikšanai, izmantojot specifiskas antivielas. Šīs metodes ir izgājušas cauri virknei modifikāciju, izmantojot dažādas etiķetes (radioizotopu, fluorescējošu, elektroķīmiluminiscējošu, fermentatīvu utt.). Ja radioizotopu metodēm ir vairāki trūkumi, kas saistīti ar radioaktīvās etiķetes izmantošanu un ierobežotu iespēju izmantot marķētus reaģentus (pusperiods), tad visplašāk tiek izmantotas ar enzīmu saistītās imūnsorbcijas metodes. Tie ir balstīti uz fermentatīvās reakcijas nešķīstošu produktu vizualizāciju, kas absorbē zināma viļņa garuma gaismu daudzumos, kas līdzvērtīgi analizējamās vielas koncentrācijai. Mērāmo vielu saistīšanai izmanto antivielas, kas pārklātas uz cietas polimēra bāzes, un vizualizācijai izmanto antivielas, kas konjugētas ar fermentiem, parasti sārmainās fosfatāzes vai mārrutku peroksidāzi. Metodes priekšrocības ir acīmredzamas: augsta noteikšanas precizitāte standartizētos reaģentu uzglabāšanas un procedūru veikšanas apstākļos, kvantitatīvā analīze un reproducējamība. Trūkumi ietver ierobežoto nosakāmo koncentrāciju diapazonu, kā rezultātā visas koncentrācijas, kas pārsniedz noteiktu slieksni, tiek uzskatītas par līdzvērtīgām. Jāņem vērā, ka metodes izpildei nepieciešamais laiks atšķiras atkarībā no ražotāja ieteikumiem. Tomēr jebkurā gadījumā mēs runājam par vairākām stundām, kas nepieciešamas reaģentu inkubācijai un mazgāšanai. Turklāt tiek noteiktas latentās un saistītās citokīnu formas, kas savā koncentrācijā var ievērojami pārsniegt brīvās formas, kas galvenokārt ir atbildīgas par mediatora bioloģisko aktivitāti. Tāpēc šo metodi vēlams izmantot kopā ar mediatora bioloģiskās aktivitātes novērtēšanas metodēm. Vēl viena imūntesta metodes modifikācija, kas ir plaši pielietota, ir elektroķīmiluminiscējošā metode (ECL) proteīnu noteikšanai, izmantojot antivielas, kas marķētas ar rutēniju un biotīnu. Šai metodei ir šādas priekšrocības salīdzinājumā ar radioizotopu un enzīmu imūnsorbcijas metodēm: ieviešanas vienkāršība, īss metodes izpildes laiks, mazgāšanas procedūru trūkums, mazs parauga tilpums, liels nosakāmo citokīnu koncentrāciju diapazons serumā un kondicionētajā vidē, metodes augsta jutība un tās reproducējamība. Apskatāmā metode ir pieņemama izmantošanai gan zinātniskos, gan klīniskos pētījumos. Sekojošā metode citokīnu novērtēšanai bioloģiskajos barotnēs ir izstrādāta, pamatojoties uz plūsmas fluorimetrijas tehnoloģiju. Tas ļauj vienlaikus novērtēt līdz pat simtiem olbaltumvielu paraugā. Šobrīd ir izveidoti komerciāli komplekti līdz 17 citokīnu noteikšanai. Tomēr šīs metodes priekšrocības nosaka arī tās trūkumus. Pirmkārt, ir darbietilpīgi izvēlēties optimālus apstākļus vairāku proteīnu noteikšanai, otrkārt, citokīnu ražošanai dabā ir kaskādes ar ražošanas maksimumiem dažādos laikos. Tāpēc liela skaita olbaltumvielu vienlaicīga noteikšana ne vienmēr ir informatīva. Vispārēja prasība pēc imūnanalīzes metodēm, izmantojot t.s. “Sendvičs” ir rūpīga antivielu pāra atlase, kas ļauj noteikt analizējamā proteīna brīvo vai saistīto formu, kas nosaka šīs metodes ierobežojumus un kas vienmēr ir jāņem vērā, interpretējot iegūtos datus. Šīs metodes nosaka kopējo citokīnu veidošanos dažādās šūnās, bet tajā pašā laikā imūnkompetentu šūnu antigēnu specifisko citokīnu ražošanu var spriest tikai provizoriski. Tagad ir izstrādāta ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) sistēma, kas lielā mērā novērš šos trūkumus. Metode ļauj daļēji kvantitatīvi novērtēt citokīnu veidošanos atsevišķu šūnu līmenī. Šīs metodes augstā izšķirtspēja ļauj novērtēt antigēnu stimulētu citokīnu ražošanu, kas ir ļoti svarīgi specifiskas imūnās atbildes novērtēšanai. Nākamā zinātniskos nolūkos plaši izmantotā metode ir citokīnu intracelulāra noteikšana ar plūsmas citometriju. Tās priekšrocības ir acīmredzamas. Mēs varam fenotipiski raksturot citokīnus ražojošo šūnu populāciju un/vai noteikt atsevišķu šūnu ražoto citokīnu spektru, ar iespēju relatīvi kvantitatīvi raksturot šo produkciju. Tomēr aprakstītā metode ir diezgan sarežģīta un prasa dārgu aprīkojumu. Nākamā metožu sērija, ko galvenokārt izmanto zinātniskiem nolūkiem, ir imūnhistoķīmiskās metodes, kurās izmanto marķētas monoklonālās antivielas. Priekšrocības ir acīmredzamas - citokīnu ražošanas noteikšana tieši audos (in situ), kur notiek dažādas imunoloģiskas reakcijas. Tomēr aplūkotās metodes ir ļoti darbietilpīgas un nesniedz precīzus kvantitatīvus datus.

Citokīnu noteikšana ar enzīmu imūntestu.

CJSC "Vector-Best" T.G. vadībā. Rjabičeva, N.A. Varaksins, N.V. Timofejeva, M.Ju. Rukavišņikovs aktīvi strādā citokīnu noteikšanas virzienā. Citokīni ir polipeptīdu mediatoru grupa, bieži vien glikozilēti, ar molekulmasu no 8 līdz 80 kDa. Citokīni ir iesaistīti ķermeņa aizsardzības reakciju un tā homeostāzes veidošanā un regulēšanā. Tie ir iesaistīti visos humorālās un šūnu imūnās atbildes aspektos, ieskaitot imūnkompetentu cilmes šūnu diferenciāciju, antigēnu prezentāciju, šūnu aktivāciju un proliferāciju, adhēzijas molekulu ekspresiju un akūtās fāzes reakciju. Dažas no tām spēj radīt vairākas bioloģiskas iedarbības uz dažādām mērķa šūnām. Citokīnu iedarbība uz šūnām tiek veikta šādos veidos: autokrīna - uz šūnu, kas sintezē un izdala šo citokīnu; parakrīns - uz šūnām, kas atrodas netālu no ražotāja šūnas, piemēram, iekaisuma fokusā vai limfoīdā orgānā; endokrīnās-tālvadības - uz jebkuru orgānu un audu šūnām pēc citokīna nonākšanas asinsritē. Citokīnu ražošana un izdalīšanās parasti ir īslaicīga un stingri regulēta. Citokīni ietekmē šūnu, saistoties ar specifiskiem receptoriem uz citoplazmas membrānas, tādējādi izraisot reakciju kaskādi, kas izraisa vairāku to regulēto gēnu aktivitātes indukciju, pastiprināšanu vai nomākšanu. Citokīniem ir raksturīgs sarežģīts funkcionēšanas tīkla raksturs, kurā viena no tiem veidošanās ietekmē vairāku citu aktivitāšu veidošanos vai izpausmes. Citokīni ir lokāli mediatori, tāpēc ir ieteicams izmērīt to līmeni attiecīgajos audos pēc audu proteīnu ekstrakcijas no attiecīgo orgānu biopsijām vai dabīgos šķidrumos: urīnā, asaru šķidrumā, smaganu kabatas šķidrumā, bronhoalveolārā skalošanā, maksts sekrēcijā, ejakulātā, skalošana no dobumiem, muguras smadzenēm vai sinoviālā šķidruma šķidrumi uc Papildu informāciju par organisma imūnsistēmas stāvokli var iegūt, pētot asins šūnu spēju ražot citokīnus in vitro. Citokīnu līmenis plazmā atspoguļo pašreizējo imūnsistēmas stāvokli un aizsardzības reakciju attīstību in vivo. Spontāna citokīnu veidošanās ar perifēro asiņu mononukleāro šūnu kultūru ļauj novērtēt attiecīgo šūnu stāvokli. Paaugstināta spontāna citokīnu veidošanās liecina, ka šūnas jau ir aktivizējušas antigēns in vivo. Inducētā citokīnu ražošana ļauj novērtēt attiecīgo šūnu potenciālo spēju reaģēt uz antigēnu stimulāciju. Piemēram, samazināta citokīnu indukcija in vitro var kalpot kā viena no imūndeficīta stāvokļa pazīmēm. Tāpēc no visa organisma imūnreaktivitātes un atsevišķu imūnsistēmas daļu darbības raksturošanas viedokļa ir svarīgas abas iespējas pētīt citokīnu līmeni gan cirkulējošās asinīs, gan to ražošanas laikā ar šūnu kultūrām. Vēl nesen Krievijā citokīnus pētīja tikai dažas pētnieku grupas, jo bioloģiskās izpētes metodes ir ļoti darbietilpīgas, bet importētie imūnķīmiskie komplekti ir ļoti dārgi. Līdz ar vietējo ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas komplektu parādīšanos praktizējošie ārsti izrāda arvien lielāku interesi par citokīnu profila izpēti. Pašlaik citokīnu līmeņa novērtēšanas diagnostiskā nozīme ir fakta konstatēšanā par to koncentrācijas palielināšanos vai samazināšanos konkrētam pacientam ar noteiktu slimību. Turklāt, lai novērtētu slimības smagumu un prognozētu slimības gaitu, ir vēlams noteikt gan pretiekaisuma, gan pro-iekaisuma citokīnu koncentrāciju patoloģijas attīstības dinamikā. Piemēram, citokīnu saturu perifērajās asinīs nosaka paasinājuma laiks, un tas atspoguļo patoloģiskā procesa dinamiku peptiskās čūlas un citu kuņģa-zarnu trakta slimību gadījumā. Agrīnās saasināšanās stadijās dominē interleikīna-1beta (IL-1beta), interleikīna-8 (IL-8) satura palielināšanās, tad interleikīna-6 (IL-6), gamma-interferona (gamma) koncentrācija. -INF), un audzēja nekrozes faktors palielinās -alfa (alfa-TNF). Interleikīna-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF koncentrācija sasniedza maksimumu slimības augstumā, savukārt akūtās fāzes marķieru saturs šajā periodā tuvojās normālām vērtībām. Paasinājuma maksimumā alfa-TNF līmenis ievērojami pārsniedza interleikīna-4 (IL-4) saturu gan asins serumā, gan tieši skartajos periulcer zonas audos, pēc tam tas sāka pakāpeniski samazināties. Akūtās fāzes parādībām mazinoties un atjaunošanās procesiem pastiprinoties, IL-4 koncentrācija palielinājās. Citokīnu profila izmaiņas var izmantot, lai spriestu par ķīmijterapijas efektivitāti un piemērotību. Veicot citokīnu terapiju, piemēram, terapijas laikā ar alfa interferonu (alfa-INF), ir jāuzrauga gan tā satura līmenis cirkulējošās asinīs, gan antivielu veidošanās pret alfa-IFN. Ir zināms, ka tad, kad tiek ražots liels šo antivielu daudzums, interferona terapija ne tikai pārstāj būt efektīva, bet arī var izraisīt autoimūnas slimības. Nesen ir izstrādātas un praksē ieviestas jaunas zāles, kas kaut kādā veidā maina ķermeņa citokīnu stāvokli. Piemēram, reimatoīdā artrīta ārstēšanai tiek piedāvātas zāles, kuru pamatā ir antivielas pret alfa-TNF, kas paredzētas alfa-TNF noņemšanai, kas ir iesaistīts saistaudu iznīcināšanā. Taču gan saskaņā ar mūsu datiem, gan literatūru, ne visiem pacientiem ar hronisku reimatoīdo artrītu ir paaugstināts TNF alfa līmenis, tāpēc šai pacientu grupai TNF alfa līmeņa pazemināšanās var vēl vairāk saasināt imūnsistēmas nelīdzsvarotību. Tādējādi pareiza citokīnu terapija ietver organisma citokīnu stāvokļa uzraudzību ārstēšanas laikā. Pro-iekaisuma citokīnu aizsargājošā loma izpaužas lokāli, iekaisuma vietā, taču to sistēmiskā veidošanās neizraisa pretinfekcijas imunitātes veidošanos un neaizkavē bakteriāla toksiska šoka attīstību, kas ir agrīnas attīstības cēlonis. mirstība ķirurģiskiem pacientiem ar strutojošu-septiskām komplikācijām. Ķirurģisko infekciju patoģenēzes pamatā ir citokīnu kaskādes palaišana, kas ietver, no vienas puses, pro-iekaisuma un, no otras puses, pretiekaisuma citokīnus. Līdzsvars starp šīm divām pretējām grupām lielā mērā nosaka strutojošu-septisko slimību gaitu un iznākumu. Tomēr, nosakot viena citokīna koncentrāciju asinīs no šīm grupām (piemēram, TNF alfa vai IL-4), netiks pietiekami atspoguļots visa citokīnu līdzsvara stāvoklis. Līdz ar to nepieciešams vienlaicīgs vairāku mediatoru līmeņa novērtējums (vismaz 2–3 no pretējām apakšgrupām). A/s Vector-Best šobrīd ir izstrādājis un sērijveidā ražo reaģentu komplektus, lai kvantitatīvi noteiktu: audzēja nekrozes faktors-alfa (jutība - 2 pg/ml, 0-250 pg/ml); gamma interferons (jutība - 5 pg/ml, 0-2000 pg/ml); interleikīns-4 (jutība - 2 pg/ml, 0-400 pg/ml); interleikīns-8 (jutība - 2 pg/ml, 0-250 pg/ml); interleikīna-1 receptoru antagonists (IL-1RA) (jutība - 20 pg/ml, 0-2500 pg/ml); alfa interferons (jutība - 10 pg/ml, 0-1000 pg/ml); autoimūnas antivielas pret interferonu alfa (jutība - 2 ng/ml, 0-500 ng/ml). Visi komplekti ir paredzēti, lai noteiktu šo citokīnu koncentrāciju cilvēka bioloģiskajos šķidrumos un kultūru supernatantos, pētot cilvēka šūnu kultūru spēju ražot citokīnus in vitro. Analīzes princips ir cietās fāzes trīspakāpju (inkubācijas laiks - 4 stundas) vai divpakāpju (inkubācijas laiks - 3,5 stundas) enzīmu imūntesta "sviestmaizes" versija tabletēm. Analīzei nepieciešami 100 μl bioloģiskā šķidruma vai kultūras supernatanta katrā iedobē. Rezultātu uzskaite - spektrofotometriski pie viļņa garuma 450 nm. Visās kopās hromogēns ir tetrametilbenzidīns. Mūsu komplektu glabāšanas laiks ir palielināts līdz 18 mēnešiem no izdošanas datuma un 1 mēnesi pēc lietošanas sākuma. Literatūras datu analīze parādīja, ka citokīnu saturs veselu cilvēku asins plazmā ir atkarīgs gan no to noteikšanai izmantotajiem komplektiem, gan no reģiona, kurā šie cilvēki dzīvo. Tāpēc, lai noteiktu normālās citokīnu koncentrācijas vērtības mūsu reģiona iedzīvotājiem, tika veikta praktiski veselu asins donoru, dažādu sociālo grupu pārstāvju vecumā no 18 līdz 60 gadiem nejaušu plazmas paraugu analīze (no 80 līdz 400 paraugiem). gadus bez smagas somatiskas patoloģijas klīniskām izpausmēm un HBsAg, antivielu pret HIV, B un C hepatīta vīrusiem neesamības.

Audzēja nekrozes faktors-alfa.

TNF alfa ir pleiotrops proinflammatorisks citokīns, kas sastāv no divām iegarenām b-ķēdēm ar molekulmasu 17 kDa un veic regulējošas un efektora funkcijas imūnreakcijā un iekaisumā. Galvenie alfa-TNF ražotāji ir monocīti un makrofāgi. Šo citokīnu izdala arī asins limfocīti un granulocīti, dabiskās killer šūnas un T-limfocītu šūnu līnijas. Galvenie TNF alfa induktori ir vīrusi, mikroorganismi un to vielmaiņas produkti, tostarp baktēriju lipopolisaharīds. Turklāt daži citokīni, piemēram, IL-1, IL-2, granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošais faktors, alfa- un beta-INF, var būt arī induktori. Alfa-TNF bioloģiskās aktivitātes galvenie virzieni: uzrāda selektīvu citotoksicitāti pret noteiktām audzēja šūnām; aktivizē granulocītus, makrofāgus, endotēlija šūnas, hepatocītus (akūtās fāzes proteīnu ražošanu), osteoklastus un hondrocītus (kaulu un skrimšļa audu rezorbciju), citu pro-iekaisuma citokīnu sintēzi; stimulē: neitrofilu, fibroblastu, endotēlija šūnu (angioģenēzes), hematopoētisko šūnu, T- un B-limfocītu proliferāciju un diferenciāciju; palielina neitrofilu plūsmu no kaulu smadzenēm asinīs; ir pretaudzēju un pretvīrusu aktivitāte in vivo un in vitro; piedalās ne tikai aizsargreakcijās, bet arī iznīcināšanas un labošanas procesos, kas pavada iekaisumu; kalpo kā viens no audu iznīcināšanas mediatoriem, bieži sastopams ilgstoša, hroniska iekaisuma gadījumā.

Rīsi. 1. Alfa-TNF līmeņu sadalījums

veselu donoru plazmā.

Paaugstināts alfa-TNF līmenis asins serumā tiek novērots pēctraumatiskā stāvoklī, ar plaušu disfunkciju, normālas grūtniecības gaitas traucējumiem, vēzi un bronhiālo astmu. Vīrushepatīta C hroniskās formas saasināšanās laikā tiek novērots 5–10 reizes augstāks alfa-TNF līmenis nekā parasti. Kuņģa-zarnu trakta slimību saasināšanās periodā alfa-TNF koncentrācija serumā pārsniedz normu. vidēji 10 reizes, bet dažiem pacientiem - 75–75 80 reizes. Augstas TNF alfa koncentrācijas ir atrodamas cerebrospinālajā šķidrumā pacientiem ar multiplo sklerozi un cerebrospinālo meningītu, kā arī sinoviālajā šķidrumā pacientiem ar reimatoīdo artrītu. Tas liecina par TNF alfa iesaistīšanos vairāku autoimūnu slimību patoģenēzē. Alfa-TNF noteikšanas biežums asins serumā pat ar smagu iekaisumu nepārsniedz 50%, ar inducētu un spontānu ražošanu - līdz 100%. TNF alfa koncentrācijas diapazons bija 0–6 pg/ml, vidēji 1,5 pg/ml (1. att.).

Gamma interferons.

Rīsi. 2. Gamma-INF līmeņa sadalījums

veselu donoru plazmā.

Interleikīns-4

IL-4 ir glikoproteīns ar molekulmasu 18–20 kDa, dabisks iekaisuma inhibitors. Kopā ar gamma INF IL-4 ir galvenais citokīns, ko ražo T šūnas (galvenokārt TH-2 limfocīti). Tā atbalsta TH-1/TH-2 līdzsvaru. IL-4 bioloģiskās aktivitātes galvenie virzieni: pastiprina eozinofiliju, tuklo šūnu uzkrāšanos, IgG4 sekrēciju, TH-2 šūnu mediētu humorālo imūnreakciju; piemīt vietēja pretvēža aktivitāte, stimulējot citotoksisko T-limfocītu populāciju un audzēju infiltrāciju ar eozinofiliem; nomāc iekaisuma citokīnu (alfa-TNF, IL-1, IL-8) un prostaglandīnu izdalīšanos no aktivētajiem monocītiem, TH-1 limfocītu citokīnu veidošanos (IL-2, gamma-INF utt.).

Rīsi. 3. IL-4 līmeņu sadalījums plazmā

veseliem donoriem.

Paaugstinātu IL-4 līmeni gan serumā, gan stimulētajos limfocītos var novērot alerģisku slimību (īpaši paasinājuma laikā), piemēram, bronhiālās astmas, alerģiskā rinīta, siena drudža, atopiskā dermatīta un kuņģa-zarnu trakta slimību gadījumos. IL-4 līmenis ievērojami palielinās arī pacientiem ar hronisku C hepatītu (CHC). CHC saasināšanās periodos tā daudzums palielinās gandrīz 3 reizes, salīdzinot ar normu, un CHC remisijas laikā IL-4 līmenis samazinās, īpaši ārstēšanas laikā ar rekombinanto IL-2. IL-4 koncentrācijas diapazons bija 0–162 pg/ml, vidējais – 6,9 pg/ml, normas robežās – 0–20 pg/ml (3. att.).

Interleikīns-8

IL-8 ir ķīmokīns un proteīns ar molekulmasu 8 kDa. IL-8 ražo mononukleāri fagocīti, polimorfonukleāri leikocīti, endotēlija šūnas un citi šūnu tipi, reaģējot uz dažādiem stimuliem, tostarp baktērijām un vīrusiem un to vielmaiņas produktiem, tostarp proinflammatoriskajiem citokīniem (piemēram, IL-1, TNF-alfa). Interleikīna-8 galvenā loma ir palielināt leikocītu ķīmisko aktivitāti. Tam ir svarīga loma gan akūtu, gan hronisku iekaisumu gadījumā. Paaugstināts IL-8 līmenis tiek novērots pacientiem ar bakteriālām infekcijām, hroniskām plaušu slimībām un kuņģa-zarnu trakta slimībām. IL-8 līmenis plazmā ir paaugstināts pacientiem ar sepsi, un augsta koncentrācija ir saistīta ar palielinātu mirstību. IL-8 satura mērīšanas rezultātus var izmantot, lai uzraudzītu ārstēšanas gaitu un prognozētu slimības iznākumu. Tādējādi visiem pacientiem ar labvēlīgu radzenes čūlas gaitu tika konstatēts paaugstināts IL-8 saturs asaru šķidrumā. Visiem pacientiem ar sarežģītu radzenes čūlas gaitu IL-8 koncentrācija bija 8 reizes lielāka nekā pacientiem ar labvēlīgu slimības gaitu. Tādējādi proinflammatorisko citokīnu (īpaši IL-8) saturu radzenes čūlas asaru šķidrumā var izmantot kā prognostisko kritēriju šīs slimības gaitai.

Rīsi. 4. IL-8 līmeņu sadalījums iekšā

plazma no veseliem donoriem (Novosibirska).

Saskaņā ar mūsu un literatūras datiem veselu cilvēku asins serumā IL-8 tiek konstatēts ārkārtīgi reti; Spontāna IL-8 ražošana ar asins mononukleārajām šūnām tiek novērota 62% un inducēta ražošana 100% veselu donoru. IL-8 koncentrācijas diapazons bija 0-34 pg/ml, vidēji 2 pg/ml, normas robežās 0-10 pg/ml (4. att.).

Rīsi. 5. IL-8 līmeņa sadalījums plazmā

veseliem donoriem (Rubcovska).

Interleikīna-1 receptoru antagonists.

IL-1RA ir citokīns un oligopeptīds ar molekulmasu 18–22 kDa. IL-1RA ir endogēns IL-1 inhibitors, ko ražo makrofāgi, monocīti, neitrofīli, fibroblasti un epitēlija šūnas. IL-1RA nomāc interleikīnu IL-1alfa un IL-1beta bioloģisko aktivitāti, konkurējot ar tiem par saistīšanos ar šūnu receptoriem.

Rīsi. 6. IL-1RA līmeņa sadalījums

veselu donoru plazmā

IL-1RA ražošanu stimulē daudzi citokīni, vīrusu produkti un akūtās fāzes proteīni. IL-1RA var aktīvi izpausties iekaisuma perēkļos pie daudzām hroniskām slimībām: reimatoīdā un juvenīlā hroniskā artrīta, sistēmiskā sarkanā vilkēde, išēmiski smadzeņu bojājumi, iekaisīgas zarnu slimības, bronhiālā astma, pielonefrīts, psoriāze u.c. Sepses gadījumā tiek novērots vislielākais IL-1RA pieaugums - atsevišķos gadījumos līdz 55 ng/ml, un tika konstatēts, ka paaugstināta IL-1RA koncentrācija korelē ar labvēlīgu prognozi. Augsts IL-1RA līmenis tiek novērots sievietēm ar augstu aptaukošanos, un šis līmenis ievērojami samazinās 6 mēnešu laikā pēc tauku atsūkšanas. IL-1RA koncentrācijas diapazons bija 0–3070 pg/ml, vidēji 316 pg/ml. Normālais diapazons ir 50–1000 pg/ml (6. att.).

Alfa interferons.

Alfa-INF ir monomērs neglikozilēts proteīns ar molekulmasu 18 kDa, ko galvenokārt sintezē leikocīti (B-limfocīti, monocīti). Šo citokīnu var ražot arī praktiski jebkura veida šūnas, reaģējot uz atbilstošu stimulāciju; intracelulāras vīrusu infekcijas var būt spēcīgi alfa-INF sintēzes stimulatori. Alfa-INF induktori ir: vīrusi un to produkti, starp kuriem vadošo vietu ieņem dubultpavedienu RNS, kas veidojas vīrusu replikācijas laikā, kā arī baktērijas, mikoplazmas un vienšūņi, citokīni un augšanas faktori (piemēram, IL-1, IL). -2, alfa -TNF, koloniju stimulējošie faktori utt.). Ķermeņa nespecifiskās antibakteriālās imūnās atbildes sākotnējā aizsardzības reakcija ietver alfa un beta INF indukciju. Šajā gadījumā to ražo antigēnu prezentējošās šūnas (makrofāgi), kas ir notvērušas baktērijas. Interferoniem (ieskaitot alfa-INF) ir svarīga loma pretvīrusu imūnās atbildes nespecifiskajā daļā. Tie uzlabo pretvīrusu rezistenci, inducējot šūnās enzīmu sintēzi, kas nomāc nukleīnskābju un vīrusu proteīnu veidošanos. Turklāt tiem piemīt imūnmodulējoša iedarbība un tie uzlabo galveno histokompatibilitātes kompleksu antigēnu ekspresiju šūnās. Alfa-INF satura izmaiņas konstatētas vīrusu etioloģijas hepatīta un aknu cirozes gadījumā. Vīrusu infekciju saasināšanās laikā vairumam pacientu šī citokīna koncentrācija ievērojami palielinās, un atveseļošanās periodā tā samazinās līdz normālam līmenim. Ir pierādīta saistība starp alfa-INF līmeni serumā un gripas infekcijas smagumu un ilgumu.

Rīsi. 7. Alfa-INF līmeņa sadalījums

veselu donoru plazmā.

Lielākajai daļai pacientu, kas slimo ar autoimūnām slimībām, piemēram, poliartrītu, reimatoīdo artrītu, spondilozi, psoriātisko artrītu, reimatisko polimialģiju un sklerodermiju, sistēmisku sarkano vilkēdi un sistēmisku vaskulītu, serumā tiek novērota alfa-INF koncentrācijas palielināšanās. Augsts šī interferona līmenis tiek novērots arī atsevišķiem pacientiem peptiskās čūlas un holelitiāzes saasināšanās laikā. Alfa-INF koncentrācijas diapazons bija no 0 līdz 93 pg/ml, vidēji 20 pg/ml. Normālais diapazons ir līdz 45 pg/ml (7. att.).

Antivielas pret alfa INF.

Antivielas pret alfa-IFN var noteikt pacientu ar somatisko eritematozo vilkēdi serumos. Spontāna antivielu indukcija pret alfa-INF tiek novērota arī dažādu vēža formu pacientu serumos. Atsevišķos gadījumos antivielas pret alfa-INF tika konstatētas HIV inficētu pacientu serumos, kā arī smadzeņu šķidrumā un serumos pacientiem ar meningītu akūtā fāzē, kā arī hroniska poliartrīta pacientu serumos.

Rīsi. 8. Alfa-INF antivielu līmeņa sadalījums

veselu donoru plazmā.

Alfa-INF ir viena no efektīvākajām pretvīrusu un pretaudzēju terapeitiskajām zālēm, taču tās ilgstoša lietošana var izraisīt specifisku antivielu veidošanos pret alfa-INF. Tas samazina ārstēšanas efektivitāti un dažos gadījumos izraisa dažādas blakusparādības: no gripai līdzīgas līdz autoimūnu slimību attīstībai. Ņemot to vērā, INF terapijas laikā ir svarīgi kontrolēt alfa INF antivielu līmeni pacienta organismā. To veidošanās ir atkarīga no terapijā izmantoto zāļu veida, ārstēšanas ilguma un slimības veida. Anti-IFN antivielu koncentrācijas diapazons bija 0–126 ng/ml, vidēji 6,2 ng/ml. Normālais diapazons ir līdz 15 ng/ml (8. att.). Citokīnu līmeņa novērtēšana, izmantojot reaģentu komplektus, ko komerciāli ražo Vector-Best CJSC, ļauj izmantot jaunu pieeju organisma imūnsistēmas stāvokļa izpētei klīniskajā praksē.

Imunotropās zāles, kuru pamatā ir citokīni.

Interesants darbs A. S. Simbirceva, Krievijas Veselības ministrijas Augsti tīru bioloģisko preparātu valsts pētniecības institūts, Sanktpēterburga). Citokīnus var izolēt jaunā, neatkarīgā ķermeņa pamatfunkciju regulēšanas sistēmā, kas pastāv kopā ar nervu un endokrīno regulējumu. un galvenokārt saistīts ar homeostāzes uzturēšanu patogēnu ievadīšanas laikā un audu integritātes pārkāpšanu. Šo jauno regulējošo molekulu klasi ir radījusi daba miljoniem gadu ilgas evolūcijas laikā, un tai ir neierobežots potenciāls lietošanai kā zāles. Imūnsistēmā citokīni ir starpnieks starp nespecifiskām aizsardzības reakcijām un specifisko imunitāti, iedarbojoties abos virzienos. Ķermeņa līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, hematopoētisko un citām sistēmām un kalpo, lai tās iesaistītu aizsargreakciju organizēšanā un regulēšanā. Citokīnu intensīvās izpētes virzītājspēks vienmēr ir bijusi daudzsološa to klīniskās izmantošanas iespēja plaši izplatītu slimību, tostarp vēža, infekcijas slimību un imūndeficīta slimību, ārstēšanai. Krievijā ir reģistrēti vairāki citokīnu preparāti, tostarp interferoni, koloniju stimulējošie faktori, interleikīni un to antagonisti un audzēja nekrozes faktors. Visus citokīnu preparātus var iedalīt dabiskajos un rekombinantos. Dabiskās zāles ir dažādas attīrīšanas pakāpes preparāti, kas iegūti no stimulētu eikariotu šūnu, galvenokārt cilvēka šūnu, barotnes. Galvenie trūkumi ir zemā attīrīšanas pakāpe, standartizācijas neiespējamība lielā komponentu skaita dēļ un asins komponentu izmantošana ražošanā. Acīmredzot citokīnu terapijas nākotne ir saistīta ar ģenētiski modificētām zālēm, kas iegūtas, izmantojot jaunākos sasniegumus biotehnoloģijā. Pēdējo divu desmitgažu laikā lielākās daļas citokīnu gēni ir klonēti un ir iegūti rekombinantie analogi, kas pilnībā atkārto dabisko molekulu bioloģiskās īpašības. Klīniskajā praksē ir trīs galvenās citokīnu izmantošanas jomas:

1) citokīnu terapija, lai aktivizētu organisma aizsardzības reakcijas, imūnmodulāciju vai papildinātu endogēno citokīnu trūkumu,

2) anti-citokīnu imūnsupresīvā terapija, kuras mērķis ir bloķēt citokīnu un to receptoru bioloģisko iedarbību,

3) citokīnu gēnu terapija, lai uzlabotu pretvēža imunitāti vai labotu ģenētiskos defektus citokīnu sistēmā.

Vairākus citokīnus var klīniski izmantot sistēmiskai un vietējai lietošanai. Sistēmiskā ievadīšana ir attaisnojama gadījumos, kad nepieciešams nodrošināt citokīnu darbību vairākos orgānos efektīvākai imūnsistēmas aktivizēšanai vai aktivizēt mērķa šūnas, kas atrodas dažādās ķermeņa daļās. Citos gadījumos vietējai lietošanai ir vairākas priekšrocības, jo tas ļauj sasniegt augstu aktīvās vielas lokālo koncentrāciju, īpaši ietekmēt mērķa orgānu un izvairīties no nevēlamām sistēmiskām izpausmēm. Pašlaik citokīni tiek uzskatīti par vienu no daudzsološākajiem medikamentiem lietošanai klīniskajā praksē.

Secinājums.

Tādējādi pašlaik nav šaubu, ka citokīni ir vissvarīgākie imūnpatoģenēzes faktori. Citokīnu līmeņa izpēte ļauj iegūt informāciju par dažāda veida imūnkompetentu šūnu funkcionālo aktivitāti, I un II tipa T-helperu aktivācijas procesu attiecību, kas ir ļoti svarīga vairāku infekciozu un imūnpatoloģisku slimību diferenciāldiagnozē. procesi. Citokīni ir specifiski proteīni, ar kuru palīdzību imūnsistēmas šūnas var savstarpēji apmainīties ar informāciju un mijiedarboties. Mūsdienās ir atklāti vairāk nekā simts dažādu citokīnu, kurus nosacīti iedala pro-iekaisuma (provocē iekaisumu) un pretiekaisuma (novērš iekaisuma attīstību). Tātad citokīnu dažādās bioloģiskās funkcijas iedala trīs grupās: tās kontrolē imūnsistēmas attīstību un homeostāzi, kontrolē asins šūnu augšanu un diferenciāciju (hematopoētisko sistēmu) un piedalās nespecifiskās ķermeņa aizsardzības reakcijās, ietekmējot iekaisumu. procesi, asins koagulācija, asinsspiediens.

Izmantotās literatūras saraksts.

S.V. Belmers, A.S. Simbircevs, O.V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mihailova. /Krievijas Valsts medicīnas universitātes Valsts koloproktoloģijas pētniecības centrs, Maskava un Valsts Augsti tīru bioloģisko preparātu pētniecības institūts, Sanktpēterburga.

S.V. Seņņikovs, A.N. Silkovs // Žurnāls "Cytokines and Inflammation", 2005, Nr. 1 T. 4, Nr. 1. P.22-27.

T.G. Rjabičeva, N.A. Varaksins, N.V. Timofejeva, M.Ju. Rukavišņikovs, materiāli no a/s Vector-Best darba.

A. S. Simbircevs, Krievijas Veselības ministrijas Augsti tīru bioloģisko preparātu valsts pētniecības institūts, Sanktpēterburga.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.. Valsts ļoti tīru bioloģisko preparātu pētniecības institūts, Sanktpēterburga.

T.A. Šumatova, V.B. Šumatovs, E.V. Markelova, L.G. Suhotepleja. Vladivostokas Valsts medicīnas universitātes Anestezioloģijas un reanimatoloģijas katedra.

Darbā izmantoti materiāli no vietnes http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

daži infekcijas slimību patogēni. Jā, norsulfazols...

1. Pretvīrusu imunitāte, molekulārie šūnu mehānismi, attīstības modeļi un imūnpato

   Abstract >> Medicīna, veselība

   ... "vietne" attiecas uz noteiktu apgabalu noteikti polipeptīds (antigēns), ar kuru... tā sākuma stadijas. Citokīni un ķīmokīni. Cits citokīni, papildus interferoniem ..., ko tie ražo laika vienībā citokīni nosaka proliferācijas intensitāti un...

2. Kaulu smadzeņu fibrozes cēloņu izpēte mieloproliferatīvās slimībās, analizējot trombocītu faktoru ietekmi uz mezenhimālajām cilmes šūnām

   Mājas darbi >> Medicīna, veselība

   Dažādas koncentrācijas; - kvantitatīvs definīcija olbaltumvielas eksperimentālās sistēmās, ... noved pie ilgstošas ​​darbības citokīns, kas pastiprina fibrozes procesu... trombocīti. Arī palielināts saturs citokīns tika atrasts urīnā...

3. Tuberkulozes patoģenēze cilvēkiem

   Abstract >> Medicīna, veselība

   Bet ir iespējama arī uztura. Noteikti loma aerogēnās infekcijas laikā spēlē... spēlē, ko izdala makrofāgi un monocīti citokīns– audzēja nekrozes faktors (TNFα). ... joni, katrā šūnā ir noteikti sistēma, kas nodrošina vielu transportēšanu...

). Sakarā ar to, ka tie aktivizēja vai modulēja šīs klases šūnu proliferācijas īpašības, tos sauca par imūncitokīniem. Kad tika atklāts, ka šie savienojumi mijiedarbojas ne tikai ar imūnsistēmas šūnām, to nosaukums tika saīsināts līdz citokīniem, kas ietvēra arī koloniju stimulējošu faktoru (CSF) un daudzus citus (skatīt Vasoaktīvie līdzekļi un iekaisums).

Citokīni (citokīni) [grieķu val. kytos- trauks, šeit - šūna un kineo- kustināt, iedrošināt] - liela un daudzveidīga maza izmēra (molekulārā masa no 8 līdz 80 kDa) proteīna rakstura mediatoru grupa - starpmolekulas (“komunikācijas proteīni”), kas iesaistītas starpšūnu signālu pārraidē galvenokārt imūnsistēmā. Citokīni ietver audzēja nekrozes faktoru, interferonus, vairākus interleikīnus utt. Citokīnus, ko sintezē limfocīti un kuri ir proliferācijas un diferenciācijas regulatori, jo īpaši hematopoētiskās šūnas un imūnsistēmas šūnas, sauc par limfokīniem. Terminu “citokīni” ierosināja S. Koens et al. 1974. gadā

Visām imūnsistēmas šūnām ir specifiskas funkcijas un tās darbojas skaidri saskaņotā mijiedarbībā, ko nodrošina īpašas bioloģiski aktīvas vielas - citokīni - imūnreakciju regulatori. Citokīni ir specifiski proteīni, ar kuru palīdzību dažādas imūnsistēmas šūnas var apmainīties ar informāciju savā starpā un koordinēt darbības. Citokīnu kopums un daudzumi, kas iedarbojas uz šūnu virsmas receptoriem — “citokīnu vide” — atspoguļo mijiedarbīgu un bieži mainīgu signālu matricu. Šie signāli ir sarežģīti, jo ir daudz dažādu citokīnu receptoru un tāpēc, ka katrs citokīns var aktivizēt vai nomākt vairākus procesus, tostarp savu sintēzi un citu citokīnu sintēzi, kā arī citokīnu receptoru veidošanos un parādīšanos uz šūnas virsmas. Dažādiem audiem ir sava veselīga "citokīnu vide". Ir atklāti vairāk nekā simts dažādu citokīnu.

Citokīni ir svarīgs elements dažādu limfocītu savstarpējā mijiedarbībā un ar fagocītiem (4. att.). Tieši ar citokīnu palīdzību T palīgšūnas palīdz koordinēt dažādu imūnreakcijā iesaistīto šūnu darbu.

Kopš interleikīnu atklāšanas 70. gados līdz šim ir atklātas vairāk nekā simts bioloģiski aktīvo vielu. Dažādi citokīni regulē imūnkompetentu šūnu proliferāciju un diferenciāciju. Un, lai gan citokīnu ietekme uz šiem procesiem ir diezgan labi pētīta, dati par citokīnu ietekmi uz apoptozi parādījās salīdzinoši nesen. Tie jāņem vērā arī citokīnu klīniskajā lietošanā.

Starpšūnu signalizācija imūnsistēmā tiek veikta ar tiešu kontakta mijiedarbību starp šūnām vai ar starpšūnu mijiedarbības mediatoru palīdzību. Pētot imūnkompetento un hematopoētisko šūnu diferenciāciju, kā arī starpšūnu mijiedarbības mehānismus, kas veido imūnreakciju, tika atklāta liela un daudzveidīga proteīna rakstura šķīstošo mediatoru grupa - starpšūnu molekulas ("komunikācijas proteīni"). signāla pārraide - citokīni. Hormoni parasti tiek izslēgti no šīs kategorijas, pamatojoties uz to darbības endokrīno (nevis parakrīno vai autokrīnās) raksturu. (skat. Citokīni: hormonālo signālu pārraides mehānismi). Kopā ar hormoniem un neirotransmiteriem tie veido ķīmiskās signālu valodas pamatu, ar kuras palīdzību daudzšūnu organismā tiek regulēta morfoģenēze un audu reģenerācija. Viņiem ir galvenā loma imūnās atbildes pozitīvā un negatīvā regulēšanā. Līdz šim vairāk nekā simts citokīnu ir atklāti un dažādās pakāpēs pētīti cilvēkiem, kā minēts iepriekš, un pastāvīgi parādās ziņojumi par jaunu citokīnu atklāšanu. Dažiem ir iegūti ģenētiski modificēti analogi. Citokīni iedarbojas, aktivizējot citokīnu receptorus.

Diezgan bieži citokīnu sadalīšana vairākās ģimenēs tiek veikta nevis pēc to funkcijām, bet gan pēc trīsdimensiju struktūras rakstura, kas atspoguļo grupas iekšējo līdzību specifisku šūnu citokīnu receptoru konformācijā un aminoskābju secībā ( skatīt “Citokīnu receptori”). Dažus no tiem ražo T šūnas (skatīt "T šūnu ražotie citokīni"). Citokīnu galvenā bioloģiskā aktivitāte ir imūnās atbildes regulēšana visos tās attīstības posmos, kurā tiem ir galvenā loma. Kopumā šī lielā endogēno regulatoru grupa nodrošina plašu procesu klāstu, piemēram:

Citotoksicitātes indukcija makrofāgos,

Daudzas smagas slimības izraisa ievērojamu IL-1 un TNF alfa līmeņa paaugstināšanos. Šie citokīni veicina fagocītu aktivāciju, to migrāciju uz iekaisuma vietu, kā arī iekaisuma mediatoru - lipīdu atvasinājumu, tas ir, prostaglandīna E2, tromboksānu un trombocītu aktivējošā faktora, izdalīšanos. Turklāt tie tieši vai netieši izraisa arteriolu paplašināšanos, adhezīvu glikoproteīnu sintēzi un aktivizē T- un B-limfocītus. IL-1 izraisa IL-8 sintēzi, kas veicina monocītu un neitrofilu ķīmotaksi un enzīmu izdalīšanos no neitrofiliem. Aknās tiek samazināta albumīna sintēze un palielināta iekaisuma akūtās fāzes proteīnu sintēze, tostarp proteāzes inhibitori, komplementa komponenti, fibrinogēns, ceruloplazmīns, feritīns un haptoglobīns. C reaktīvā proteīna līmenis, kas saistās ar bojātām un atmirušajām šūnām, kā arī dažiem mikroorganismiem, var palielināties 1000 reizes. Ir iespējama arī ievērojama amiloīda A koncentrācijas palielināšanās serumā un tā nogulsnēšanās dažādos orgānos, izraisot sekundāru amiloidozi. Iekaisuma akūtās fāzes svarīgākais mediators ir IL-6, lai gan aprakstītās aknu darbības izmaiņas var izraisīt arī IL-1 un TNF alfa. IL-1 un TNF alfa pastiprina viens otra ietekmi uz lokālām un vispārējām iekaisuma izpausmēm, tāpēc šo divu citokīnu kombinācija pat nelielās devās var izraisīt vairāku orgānu mazspēju un pastāvīgu arteriālo hipotensiju. Jebkuras no tām aktivitātes nomākšana novērš šo mijiedarbību un ievērojami uzlabo pacienta stāvokli. IL-1 aktivizē T- un B-limfocītus spēcīgāk 39*C nekā 37*C. IL-1 un TNF alfa izraisa liesās ķermeņa masas samazināšanos un apetītes zudumu, izraisot kaheksiju ilgstoša drudža laikā. Šie citokīni nonāk asinsritē tikai īsu laiku, taču ar to pietiek, lai izraisītu IL-6 veidošanos. IL-6 pastāvīgi atrodas asinīs, tāpēc tā koncentrācija vairāk atbilst drudža un citu infekcijas izpausmju smagumam. Tomēr IL-6, atšķirībā no IL-1 un TNF alfa, netiek uzskatīts par letālu citokīnu.

Kopsavilkums. Citokīni ir mazi proteīni, kas darbojas autokrīni (tas ir, uz šūnu, kas tos ražo) vai parakrīni (uz šūnām, kas atrodas tuvumā). Šo ļoti aktīvo molekulu veidošanās un izdalīšanās ir pārejoša un stingri regulēta. Citokīnus, ko sintezē limfocīti un kuri ir proliferācijas un diferenciācijas regulatori, jo īpaši hematopoētiskās šūnas un imūnsistēmas šūnas, sauc arī par limfokīniem un

Šajā nodaļā tiks aplūkota integrēta pieeja citokīnu sistēmas novērtēšanai, izmantojot iepriekš aprakstītās mūsdienu pētījumu metodes.

Pirmkārt, mēs izklāstīsim citokīnu sistēmas pamatjēdzienus.

Citokīni pašlaik tiek uzskatīti par proteīnu-peptīdu molekulām, ko ražo dažādas ķermeņa šūnas un kas veic starpšūnu un starpsistēmu mijiedarbību. Citokīni ir universāli šūnu dzīves cikla regulatori, tie kontrolē pēdējo diferenciācijas, proliferācijas, funkcionālās aktivācijas un apoptozes procesus.

Citokīnus, ko ražo imūnsistēmas šūnas, sauc par imūncitokīniem; tie ir imūnsistēmas šķīstošo peptīdu mediatoru klase, kas nepieciešama tās attīstībai, darbībai un mijiedarbībai ar citām ķermeņa sistēmām (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Citokīniem kā regulējošām molekulām ir liela nozīme iedzimtu un adaptīvu imūnreakciju īstenošanā, tie nodrošina to mijiedarbību, kontrolē asinsradi, iekaisumus, brūču dzīšanu, jaunu asinsvadu veidošanos (angioģenēzi) un daudzus citus dzīvībai svarīgus procesus.

Pašlaik ir vairākas dažādas citokīnu klasifikācijas, ņemot vērā to struktūru, funkcionālo aktivitāti, izcelsmi un citokīnu receptoru veidu. Tradicionāli atbilstoši to bioloģiskajai iedarbībai ir ierasts izšķirt šādas citokīnu grupas.

1. Interleikīni(IL-1-IL-33) - imūnsistēmas sekrēcijas regulējošie proteīni, kas nodrošina mediatoru mijiedarbību imūnsistēmā un tās saistību ar citām ķermeņa sistēmām. Interleikīnus pēc funkcionālās aktivitātes iedala pro- un pretiekaisuma citokīnos, limfocītu augšanas faktoros, regulējošos citokīnos u.c.

3. Audzēja nekrozes faktori (TNF)- citokīni ar citotoksisku un regulējošu darbību: TNFa un limfotoksīni (LT).

4. Hematopoētisko šūnu augšanas faktori- cilmes šūnu augšanas faktors (Kit - ligands), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetīns, trobopoetīns, granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošais faktors - GM-CSF, granulocītu CSF - G-CSF, makrofāgu-

ny CSF — M-CSF).

5. Ķīmokīni- C, CC, CXC (IL-8), CX3C - dažādu šūnu tipu ķīmiskās reakcijas regulatori.

6. Nelimfoīdo šūnu augšanas faktori- dažādu audu šūnu augšanas, diferenciācijas un funkcionālās aktivitātes regulatori (fibroblastu augšanas faktors – FGF, endotēlija šūnu augšanas faktors, epidermas augšanas faktors – epidermas EGF) un transformējošie augšanas faktori (TGFβ, TGFα).

Cita starpā pēdējos gados ir aktīvi pētīts faktors, kas kavē makrofāgu migrāciju (migrāciju inhibējošais faktors – MIF), kas tiek uzskatīts par neirohormonu ar citokīnu un enzīmu aktivitāti (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Citokīni atšķiras pēc struktūras, bioloģiskās aktivitātes un citām īpašībām. Tomēr līdz ar atšķirībām citokīniem ir vispārīgas īpašības, raksturīga šai bioregulējošo molekulu klasei.

1. Citokīni parasti ir glikozilēti polipeptīdi ar vidēju molekulmasu (mazāku par 30 kD).

2. Citokīnus ražo imūnsistēmas šūnas un citas šūnas (piemēram, endotēlijs, fibroblasti u.c.), reaģējot uz aktivizējošu stimulu (ar patogēnu saistītās molekulārās struktūras, antigēnus, citokīnus utt.), un tie piedalās reakcijās. iedzimtu un adaptīvu imunitāti, regulējot to spēku un ilgumu. Daži citokīni tiek sintezēti konstitutīvi.

3. Citokīnu sekrēcija ir īss process. Citokīni netiek uzglabāti kā iepriekš izveidotas molekulas, bet gan tās

sintēze vienmēr sākas ar gēnu transkripciju. Šūnas ražo citokīnus zemā koncentrācijā (pikogramos uz mililitru).

4. Vairumā gadījumu citokīni tiek ražoti un iedarbojas uz mērķa šūnām, kas atrodas tiešā tuvumā (īsa darbības rādiusa darbība). Galvenā citokīnu darbības vieta ir starpšūnu sinapse.

5. Atlaišana Citokīnu sistēma izpaužas faktā, ka katrs šūnu tips spēj ražot vairākus citokīnus, un katru citokīnu var izdalīt dažādas šūnas.

6. Visiem citokīniem ir raksturīgi pleiotropija, vai darbības daudzfunkcionalitāte. Tādējādi iekaisuma pazīmju izpausme ir saistīta ar IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 ietekmi. Funkciju dublēšanās nodrošina uzticamu citokīnu sistēmas darbību.

7. Citokīnu iedarbību uz mērķa šūnām veicina ļoti specifiski, augstas afinitātes membrānas receptori, kas ir transmembrānas glikoproteīni, kas parasti sastāv no vairāk nekā vienas apakšvienības. Receptoru ekstracelulārā daļa ir atbildīga par citokīnu saistīšanos. Ir receptori, kas novērš lieko citokīnu patoloģiskajā fokusā. Tie ir tā sauktie mānekļu receptori. Šķīstošie receptori ir membrānas receptoru ārpusšūnu domēns, ko atdala enzīms. Šķīstošie receptori spēj neitralizēt citokīnus, piedalīties to transportēšanā uz iekaisuma vietu un izvadīšanā no organisma.

8. Citokīni strādāt pēc tīkla principa. Viņi var darboties saskaņoti. Šķiet, ka daudzas funkcijas, kas sākotnēji tika attiecinātas uz vienu citokīnu, ir saistītas ar vairāku citokīnu koordinētu darbību. (sinerģija darbības). Citokīnu sinerģiskās mijiedarbības piemēri ir iekaisuma reakciju stimulēšana (IL-1, IL-6 un TNFa), kā arī IgE sintēze.

(IL-4, IL-5 un IL-13).

Daži citokīni inducē citu citokīnu sintēzi (kaskāde). Citokīnu kaskādes darbība ir nepieciešama iekaisuma un imūnreakciju attīstībai. Dažu citokīnu spēja pastiprināt vai vājināt citu citokīnu ražošanu nosaka svarīgus pozitīvos un negatīvos regulējošos mehānismus.

Citokīnu antagonistiskā iedarbība ir zināma, piemēram, IL-6 veidošanās, reaģējot uz TNFa koncentrācijas palielināšanos, var būt

negatīvs regulēšanas mehānisms šī mediatora ražošanas kontrolei iekaisuma laikā.

Mērķa šūnu funkciju citokīnu regulēšana tiek veikta, izmantojot autokrīnus, parakrīnos vai endokrīnos mehānismus. Daži citokīni (IL-1, IL-6, TNFα u.c.) spēj piedalīties visu šo mehānismu ieviešanā.

Šūnas reakcija uz citokīna ietekmi ir atkarīga no vairākiem faktoriem:

Par šūnu tipu un to sākotnējo funkcionālo aktivitāti;

No citokīna vietējās koncentrācijas;

No citu mediatoru molekulu klātbūtnes.

Tādējādi ražotājšūnas, citokīni un to specifiskie receptori uz mērķa šūnām veido vienu mediatoru tīklu. Šūnas galīgo reakciju nosaka regulējošo peptīdu kopums, nevis atsevišķi citokīni. Šobrīd citokīnu sistēma tiek uzskatīta par universālu regulējošu sistēmu visa organisma līmenī, nodrošinot aizsargreakciju attīstību (piemēram, infekcijas laikā).

Pēdējos gados ir radusies ideja par citokīnu sistēmu, kas apvieno:

1) ražotāju šūnas;

2) šķīstošie citokīni un to antagonisti;

3) mērķa šūnas un to receptori (7.1. att.).

Dažādu citokīnu sistēmas komponentu traucējumi izraisa daudzu patoloģisku procesu attīstību, un tāpēc šīs regulējošās sistēmas defektu identificēšana ir svarīga pareizai diagnostikai un adekvātas terapijas nozīmēšanai.

Vispirms apskatīsim galvenās citokīnu sistēmas sastāvdaļas.

Citokīnus ražojošās šūnas

I. Galvenā citokīnus ražojošo šūnu grupa adaptīvajā imūnreakcijā ir limfocīti. Atpūtas šūnas neizdala citokīnus. Pēc antigēna atpazīšanas un ar receptoru mijiedarbības līdzdalību (CD28-CD80/86 T limfocītiem un CD40-CD40L B limfocītiem) notiek šūnu aktivācija, kas izraisa citokīnu gēnu transkripciju, glikozilētu peptīdu translāciju un sekrēciju starpšūnu telpā.

Rīsi. 7.1. Citokīnu sistēma

CD4 T palīgšūnas ir attēlotas ar apakšpopulācijām: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, kas viena no otras atšķiras ar izdalīto citokīnu spektru, reaģējot uz dažādiem antigēniem.

Th0 ražo plašu citokīnu klāstu ļoti zemās koncentrācijās.

Diferenciācijas virziens Th0 nosaka divu imūnās atbildes formu attīstību ar humorālo vai šūnu mehānismu pārsvaru.

Antigēna raksturs, tā koncentrācija, lokalizācija šūnā, antigēnu prezentējošo šūnu veids un noteikts citokīnu kopums regulē Th0 diferenciācijas virzienu.

Dendritiskās šūnas pēc antigēna uzņemšanas un apstrādes prezentē antigēnus peptīdus Th0 šūnām un ražo citokīnus, kas regulē to diferenciācijas virzienu efektoršūnās. Atsevišķu citokīnu loma šajā procesā ir parādīta attēlā. 7.2. IL-12 inducē IFNγ sintēzi ar T limfocītiem un hGC. IFN nodrošina Th1 diferenciāciju, kas sāk izdalīt citokīnus (IL-2, IFN, IL-3, TNFa, limfotoksīnus), kas regulē reakciju attīstību pret intracelulāriem patogēniem.

(aizkavēta paaugstināta jutība (DTH) un dažādi šūnu citotoksicitātes veidi).

IL-4 nodrošina Th0 diferenciāciju par Th2. Aktivētais Th2 ražo citokīnus (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 u.c.), kas nosaka B limfocītu proliferāciju, to tālāku diferenciāciju plazmas šūnās un antivielu reakciju attīstību, galvenokārt pret ekstracelulāriem patogēniem. .

IFN negatīvi regulē Th2 šūnu darbību un, gluži pretēji, IL-4, IL-10, ko izdala Th2, kavē Th1 darbību (7.3. att.). Šīs regulas molekulārais mehānisms ir saistīts ar transkripcijas faktoriem. T-bet un STAT4 ekspresija, ko nosaka IFNu, virza T šūnu diferenciāciju pa Th1 ceļu un nomāc Th2 attīstību. IL-4 inducē GATA-3 un STAT6 ekspresiju, kas attiecīgi nodrošina naivā Th0 pārvēršanos par Th2 šūnām (7.2. att.).

Pēdējos gados ir aprakstīta īpaša palīgu T šūnu (Th17) apakšpopulācija, kas ražo IL-17. IL-17 saimes locekļus var ekspresēt aktivētas atmiņas šūnas (CD4CD45RO), γ5T šūnas, NKT šūnas, neitrofīli, monocīti IL-23, IL-6, TGFβ ietekmē, ko ražo makrofāgi un dendrītiskās šūnas. Galvenais diferenciācijas faktors cilvēkiem ir ROR-C, pelēm tas ir ROR-γ l Ir pierādīta IL-17 galvenā loma hroniska iekaisuma un autoimūno patoloģiju attīstībā (sk. 7.2. att.).

Turklāt T šūnas aizkrūts dziedzerī var diferencēties dabiskās regulējošās šūnās (Tregs), kas ekspresē CD4 + CD25 + virsmas marķierus un transkripcijas faktoru FOXP3. Šīs šūnas spēj nomākt imūnreakciju, ko mediē Th1 un Th2 šūnas, izmantojot tiešu šūnu-šūnu kontaktu un TGFβ un IL-10 sintēzi.

Th0 klonu un to izdalīto citokīnu diferenciācijas shēmas ir parādītas attēlā. 7.2 un 7.3 (skatīt arī krāsu ieliktni).

T-citotoksiskās šūnas (CD8+), dabiskās killer šūnas, ir vāji citokīnu, piemēram, interferonu, TNF-a un limfotoksīnu, ražotāji.

Pārmērīga vienas no Th apakšpopulāciju aktivizēšanās var noteikt kāda imūnās atbildes varianta attīstību. Hroniska Th aktivācijas nelīdzsvarotība var izraisīt imūnpatoloģisku stāvokļu veidošanos, kas saistīti ar

mi alerģijām, autoimūnām patoloģijām, hroniskiem iekaisuma procesiem u.c.

Rīsi. 7.2. Dažādas T limfocītu apakšgrupas, kas ražo citokīnus

II. Iedzimtajā imūnsistēmā galvenie citokīnu ražotāji ir mieloīdās šūnas. Izmantojot Toll līdzīgus receptorus (TLR), tie atpazīst dažādu patogēnu līdzīgas molekulārās struktūras, tā sauktos ar patogēniem saistītos molekulāros modeļus (PAMP), piemēram, gramnegatīvo baktēriju lipopolisaharīdu (LPS), lipoteicoīnskābes, grama peptidoglikānus. -pozitīvi mikroorganismi, flagellīns, DNS, kas bagāta ar nemetilētiem CpG atkārtojumiem utt. Rezultātā

Šī mijiedarbība ar TLR izraisa intracelulāro signālu transdukcijas kaskādi, kas izraisa gēnu ekspresiju divām galvenajām citokīnu grupām: pro-iekaisuma un 1. tipa IFN (7.4. att., skatīt arī krāsu ieliktni). Galvenokārt šie citokīni (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokīni u.c.) izraisa iekaisuma attīstību un ir iesaistīti organisma aizsardzībā no baktēriju un vīrusu infekcijām.

Rīsi. 7.3. Th1 un Th2 šūnu izdalīto citokīnu spektrs

III. Šūnas, kas nav saistītas ar imūnsistēmu (saistaudu šūnas, epitēlijs, endotēlijs) konstitutīvi izdala autokrīnus augšanas faktorus (FGF, EGF, TGFr utt.). un citokīni, kas atbalsta hematopoētisko šūnu proliferāciju.

Citokīni un to antagonisti ir sīki aprakstītas vairākās monogrāfijās (Kovaļčuks L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Rīsi. 7.4. TLR mediēta citokīnu ražošanas indukcija ar iedzimtām imūnšūnām

Pārmērīga citokīnu ekspresija ir nedroša organismam un var izraisīt pārmērīgas iekaisuma reakcijas, akūtas fāzes reakcijas attīstību. Proiekaisuma citokīnu ražošanas regulēšanā ir iesaistīti dažādi inhibitori. Tādējādi ir aprakstītas vairākas vielas, kas nespecifiski saistās ar citokīnu IL-1 un novērš tā bioloģiskās iedarbības izpausmi (a2-makroglobulīns, komplementa C3-komponents, uromodulīns). Konkrēti IL-1 inhibitori ietver šķīstošos mānekļu receptorus, antivielas un IL-1 receptoru antagonistus (IL-1RA). Attīstoties iekaisumam, palielinās IL-1RA gēna ekspresija. Bet pat parasti šis antagonists atrodas asinīs augstā koncentrācijā (līdz 1 ng/ml vai vairāk), bloķējot endogēnā IL-1 darbību.

Mērķa šūnas

Citokīnu iedarbība uz mērķa šūnām notiek caur specifiskiem receptoriem, kas saista citokīnus ar ļoti augstu afinitāti, un atsevišķi citokīni var izmantot

kopējās receptoru apakšvienības. Katrs citokīns saistās ar savu specifisko receptoru.

Citokīnu receptori ir transmembrānas proteīni, un tie ir sadalīti 5 galvenajos veidos. Visizplatītākie ir tā sauktie hematopoetīna tipa receptori, kuriem ir divi ārpusšūnu domēni, no kuriem viens satur kopīgu aminoskābju atlieku secību diviem triptofāna un serīna atkārtojumiem, kas atdalīti ar jebkuru aminoskābi (WSXWS motīvs). Otrajam receptoru tipam var būt divi ārpusšūnu domēni ar lielu skaitu konservētu cisteīnu. Tie ir IL-10 un IFN saimes receptori. Trešo veidu pārstāv citokīnu receptori, kas pieder TNF grupai. Ceturtais citokīnu receptoru veids pieder imūnglobulīna receptoru virsdzimtai, kam ir ekstracelulāri domēni, kas pēc struktūras atgādina imūnglobulīna molekulu domēnus. Piektais receptoru veids, kas saista chemokīnu saimes molekulas, ir pārstāvēts ar transmembrānu proteīniem, kas šķērso šūnu membrānu 7 vietās. Citokīnu receptori var pastāvēt šķīstošā formā, saglabājot spēju saistīt ligandus (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokīni var ietekmēt mērķa šūnu proliferāciju, diferenciāciju, funkcionālo aktivitāti un apoptozi (sk. 7.1. att.). Citokīnu bioloģiskās aktivitātes izpausme mērķa šūnās ir atkarīga no dažādu intracelulāro sistēmu līdzdalības signālu pārraidē no receptora, kas ir saistīta ar mērķa šūnu īpašībām. Apoptozes signāls tiek veikts, cita starpā, izmantojot īpašu TNF receptoru saimes reģionu, tā saukto “nāves” domēnu (7.5. att., sk. krāsu ieliktni). Diferenciācijas un aktivizējošie signāli tiek pārraidīti caur intracelulāriem Jak-STAT proteīniem – signālu devējiem un transkripcijas aktivatoriem (7.6. att., sk. krāsu ieliktni). G proteīni ir iesaistīti signālu transdukcijā no ķīmokīniem, kas palielina šūnu migrāciju un adhēziju.

Visaptverošā citokīnu sistēmas analīze ietver sekojošo.

I. Ražotāju šūnu novērtējums.

1. Izteiksmes noteikšana:

Receptori, kas atpazīst patogēnu vai antigēnu TCR, TLR) gēnu un olbaltumvielu molekulu līmenī (PCR, plūsmas citometrijas metode);

Adaptera molekulas, kas vada signālu, kas izraisa citokīnu gēnu transkripciju (PCR utt.);

Rīsi. 7.5. Signāla pārraide no TNF receptora

Rīsi. 7.6. Jak-STAT – 1. tipa citokīnu receptoru signalizācijas ceļš

Citokīnu gēni (PCR); citokīnu proteīnu molekulas (cilvēka mononukleāro šūnu citokīnu sintezējošās funkcijas novērtējums).

2. Šūnu apakšpopulāciju kvantitatīvā noteikšana, kas satur noteiktus citokīnus: Th1, Th2 Th17 (citokīnu intracelulārās krāsošanas metode); noteiktus citokīnus izdalošo šūnu skaita noteikšana (ELISPOT metode, sk. 4. nodaļu).

II. Citokīnu un to antagonistu novērtējums organisma bioloģiskajā vidē.

1. Citokīnu bioloģiskās aktivitātes pārbaude.

2. Citokīnu kvantitatīva noteikšana, izmantojot ELISA.

3. Citokīnu imūnhistoķīmiskā krāsošana audos.

4. Pretējo citokīnu (pro- un pretiekaisuma), citokīnu un citokīnu receptoru antagonistu attiecības noteikšana.

III. Mērķa šūnu novērtēšana.

1. Citokīnu receptoru ekspresijas noteikšana gēnu un olbaltumvielu molekulu līmenī (PCR, plūsmas citometrijas metode).

2. Signālmolekulu noteikšana intracelulārajā saturā.

3. Mērķa šūnu funkcionālās aktivitātes noteikšana.

Pašlaik ir izstrādātas daudzas metodes, lai novērtētu citokīnu sistēmu, kas sniedz daudzveidīgu informāciju. Starp tiem ir:

1) molekulāri bioloģiskās metodes;

2) citokīnu kvantitatīvās noteikšanas metodes, izmantojot imūntestus;

3) citokīnu bioloģiskās aktivitātes pārbaude;

4) intracelulārā citokīnu krāsošana;

5) ELISPOT metode, kas ļauj noteikt citokīnus ap vienu citokīnus producējošu šūnu;

6) imunofluorescence.

Mēs sniedzam šo metožu īsu aprakstu.

Izmantojot molekulāri bioloģiskās metodes Var pētīt citokīnu gēnu ekspresiju, to receptorus, signalizācijas molekulas un pētīt šo gēnu polimorfismu. Pēdējos gados ir veikts liels skaits pētījumu, kas atklāja saistību starp citokīnu sistēmas molekulu gēnu alēļu variantiem un predispozīciju

pret vairākām slimībām. Citokīnu gēnu alēlo variantu izpēte var sniegt informāciju par konkrēta citokīna ģenētiski ieprogrammētu ražošanu. Visjutīgākā tiek uzskatīta par reāllaika polimerāzes ķēdes reakciju - RT-PCR (skat. 6. nodaļu). Hibridizācijas metode uz vietasļauj noskaidrot citokīnu gēnu ekspresijas audu un šūnu lokalizāciju.

Citokīnu kvantitatīvo noteikšanu bioloģiskajos šķidrumos un perifēro asiņu mononukleāro šūnu kultūrās ar ELISA metodi var raksturot šādi. Tā kā citokīni ir lokāli mediatori, piemērotāk ir izmērīt to līmeni attiecīgajos audos pēc audu proteīnu ekstrakcijas vai dabīgos šķidrumos, piemēram, asarās, dobumos, urīnā, amnija šķidrumā, cerebrospinālajā šķidrumā utt. Citokīnu līmenis serumā vai citos ķermeņa šķidrumos atspoguļo pašreizējo imūnsistēmas stāvokli, t.i. citokīnu sintēze ķermeņa šūnās in vivo.

Citokīnu ražošanas līmeņa noteikšana ar perifēro asiņu mononukleāro šūnu (PBMC) palīdzību parāda šūnu funkcionālo stāvokli. MNC spontāna citokīnu ražošana kultūrā norāda, ka šūnas jau ir aktivizētas in vivo. Citokīnu sintēze, ko izraisa dažādi stimulanti, mitogēni, atspoguļo šūnu potenciālo, rezerves spēju reaģēt uz antigēnu stimulu (jo īpaši uz zāļu iedarbību). Samazināta inducēta citokīnu ražošana var kalpot kā viena no imūndeficīta stāvokļa pazīmēm. Citokīni nav specifiski konkrētam antigēnam. Tāpēc specifiska infekcijas, autoimūnu un alerģisku slimību diagnostika, nosakot noteiktu citokīnu līmeni, nav iespējama. Tajā pašā laikā citokīnu līmeņu novērtēšana ļauj iegūt datus par iekaisuma procesa smagumu, tā pāreju uz sistēmisku līmeni un prognozi, imūnsistēmas šūnu funkcionālo aktivitāti, Th1 un Th2 šūnu attiecību, kas ir ļoti svarīgi vairāku infekcijas un imūnpatoloģisku procesu diferenciāldiagnozē.

Bioloģiskā vidē citokīnus var kvantitatīvi noteikt, izmantojot dažādus imūnās analīzes metodes, izmantojot poliklonālās un monoklonālās antivielas (sk. 4. nodaļu). ELISA ļauj noskaidrot, kāda ir precīza citokīnu koncentrācija bio-

ķermeņa loģiskie šķidrumi. Ar enzīmu saistītā citokīnu imūnsorbcijas noteikšanai ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar citām metodēm (augsta jutība, specifiskums, neatkarība no antagonistu klātbūtnes, precīzas automatizētas reģistrēšanas iespēja, ierakstīšanas standartizācija). Tomēr šai metodei ir arī savi ierobežojumi: ELISA neraksturo citokīnu bioloģisko aktivitāti un var sniegt nepatiesus rezultātus krusteniski reaģējošu epitopu dēļ.

Bioloģiskā pārbaude veikta, pamatojoties uz zināšanām par citokīnu pamatīpašībām un to ietekmi uz mērķa šūnām. Citokīnu bioloģiskās iedarbības izpēte ir novedusi pie četru veidu citokīnu testēšanas:

1) izraisot mērķa šūnu proliferāciju;

2) ar citotoksisku iedarbību;

3) izraisot kaulu smadzeņu prekursoru diferenciāciju;

4) pretvīrusu iedarbībai.

IL-1 nosaka tā stimulējošā iedarbība uz mitogēna aktivēto peles timocītu proliferāciju in vitro; IL-2 - ar spēju stimulēt limfoblastu proliferatīvo aktivitāti; TNF-α un limfotoksīni tiek pārbaudīti, lai noteiktu citotoksisko ietekmi uz peļu fibroblastiem (L929). Koloniju stimulējošie faktori tiek novērtēti pēc to spējas atbalstīt kaulu smadzeņu prekursoru kā koloniju augšanu agarā. IFN pretvīrusu aktivitāti nosaka vīrusu citopātiskās iedarbības inhibīcija cilvēka diploīdu fibroblastu kultūrā un peļu fibroblastu L-929 audzēja līnijā.

Ir izveidotas šūnu līnijas, kuru augšana ir atkarīga no noteiktu citokīnu klātbūtnes. Tabulā 7.1. tabulā ir sniegts citokīnu testēšanai izmantoto šūnu līniju saraksts. Pamatojoties uz spēju izraisīt jutīgu mērķa šūnu proliferāciju, tiek veikta IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 utt. biotestēšana. Tomēr šīs testēšanas metodes ir raksturotas. nepietiekama jutīguma un informācijas satura dēļ. Inhibitoru un antagonistu molekulas var maskēt citokīnu bioloģisko aktivitāti. Dažiem citokīniem ir vispārēja bioloģiskā aktivitāte. Tomēr šīs metodes ir ideāli piemērotas rekombinanto citokīnu specifiskās aktivitātes pārbaudei.

7.1. tabula.Šūnu līnijas, ko izmanto, lai pārbaudītu citokīnu bioloģisko aktivitāti

Tabulas beigas. 7.1

Laboratorijas 7-1

IL-1 bioloģiskās aktivitātes noteikšana pēc tā komitogēnās ietekmes uz peles timocītu proliferāciju

IL-1 bioloģiskās pārbaudes metode ir balstīta uz citokīna spēju stimulēt peles timocītu proliferāciju.

IL-1 var noteikt ar LPS stimulētā monocītu kultūrā, kā arī jebkurā ķermeņa bioloģiskajā šķidrumā. Ir nepieciešams pievērst uzmanību vairākām detaļām.

1. Testēšanai tiek izmantoti C3H/HeJ līnijas peļu timocīti, kas stimulēti uz proliferāciju ar mitogēniem (konkanavalīns A - ConA un fitohemaglutinīns - PHA). C3H/HeJ timocīti netika izvēlēti nejauši: šī inbred celma peles nereaģē uz LPS, kas var būt testa materiālā un izraisīt IL-1 veidošanos.

2. Timocīti reaģē uz IL-2 un mitogēniem, tāpēc IL-2 un mitogēnu klātbūtne jānosaka arī IL-1 pārbaudītajos preparātos.

Darbības procedūra

1. Timocītu suspensiju iegūst koncentrācijā 12×10 6 /ml RPMI 1640 barotnes, kas satur 10% liellopu augļa serumu un 2-merkaptoetanolu (5×10 -5 M).

2. Sagatavo eksperimentālo (bioloģisko ķermeņa šķidrumu) un kontroles paraugu sērijas divkāršu atšķaidījumu sēriju. Kā kontroles izmanto bioloģiskos šķidrumus, kas satur IL-1, vai paraugus, kas iegūti, inkubējot mononukleāras šūnas bez LPS, un laboratorijas standarta IL-1 saturošu preparātu. 96 iedobju plāksnēs ar apaļdibenu 50 µl katra atšķaidījuma pārnes 6 iedobēs.

3. Pievienojiet 50 μl attīrītas PHA (Wellcome), kas izšķīdināts pilnīgā barotnē ar koncentrāciju 3 μg/ml, trīs katra atšķaidījuma iedobēs un 50 μl barotnes pārējām 3 iedobēm.

4. Katrai iedobei pievieno 50 μl timocītu suspensijas un inkubē 48 stundas 37 °C temperatūrā.

6. Pirms kultivēšanas iedobēm pievieno 50 μl ["3H]-timidīna šķīduma (1 μCi/ml) un inkubē vēl 20 stundas.

7. Radioaktivitātes līmeņa noteikšanai kultūras šūnas, izmantojot automātisko šūnu savācēju, pārnes uz filtrpapīru, filtrus izžāvē un marķējuma iekļaušanu nosaka ar šķidruma scintilācijas skaitītāju.

8. Rezultātus izsaka kā stimulācijas faktoru.

kur m cp ir vidējais impulsu skaits 3 iedobēs.

Ja timocīti reaģē uz stimulāciju ar standarta IL-1, tad testa parauga stimulācijas indekss, kas pārsniedz 3, droši norāda uz IL-1 aktivitāti.

Biotests ir vienīgā metode, lai novērtētu citokīna darbību, taču šī metode ir jāpapildina ar dažāda veida atbilstošu specifiskuma uzraudzību, izmantojot monoklonālās antivielas. Noteiktu monoklonālo antivielu pievienošana citokīnam kultūrā bloķē citokīna bioloģisko aktivitāti, kas pierāda, ka signāls šūnu līnijas proliferācijai ir nosakāmais citokīns.

Biotestu izmantošana interferona noteikšanai. IFN bioloģiskās aktivitātes novērtēšanas princips ir balstīts uz tā pretvīrusu iedarbību, ko nosaka testa vīrusa proliferācijas inhibīcijas pakāpe šūnu kultūrā.

Darbā var izmantot šūnas, kas ir jutīgas pret IFN iedarbību: primāri tripsinizētas vistas un cilvēka embrionālo fibroblastu šūnas, cilvēka diploīdu fibroblastu nepārtrauktas šūnas un peles šūnu kultūra (L929).

Novērtējot IFN pretvīrusu iedarbību, vēlams izmantot vīrusus ar īsu vairošanās ciklu un augstu jutību pret IFN darbību: peļu encefalomielīta vīrusu, peļu vezikulārā stomatīta vīrusu u.c.

Laboratorijas 7-2

Interferona aktivitātes noteikšana

1. Diploīdu cilvēka augļa fibroblastu suspensiju uz barotnes ar 10% liellopu augļa serumu (šūnu koncentrācija - 15-20×10 6 /ml) ielej sterilās 96 bedrīšu plakandibena plāksnēs, 100 µl katrā iedobē un ievieto CO 2 inkubators 37 °C temperatūrā.

2. Pēc pilnīga viena slāņa izveidošanās no iedobēm izņem augšanas barotni un katrai iedobei pievieno 100 μl uzturēšanas barotnes.

3. IFN aktivitātes titrēšana pētītajos paraugos veikta, izmantojot divkāršu atšķaidījumu metodi uz fibroblastu monoslāņa.

Vienlaikus ar paraugiem iedobēs ievada peles encefalomielīta vīrusu (MEV) tādā devā, kas 48 stundas pēc inficēšanās izraisa 100% šūnu bojājumu.

4. Kontrolei izmantojiet iedobes ar neskartām (neapstrādātām) ar vīrusu inficētām šūnām.

Katrā pētījumā kā atsauces zāles tiek izmantoti atsauces IFN paraugi ar zināmu aktivitāti.

5. Plāksnes ar paraugu atšķaidījumiem inkubē 24 stundas 37 °C temperatūrā atmosfērā ar 5% CO 2 saturu.

6. IFN aktivitātes līmeni nosaka pētāmā parauga maksimālā atšķaidījuma apgrieztā vērtība, kas aizkavē vīrusa citopātisko iedarbību par 50%, un to izsaka aktivitātes vienībās uz 1 ml.

7. Lai noteiktu IFN veidu, sistēmai tiek pievienots antiserums pret IFNα, IFNβ vai IFNγ. Antiserums atceļ atbilstošā citokīna darbību, kas ļauj noteikt IFN veidu.

Inhibējošo faktoru migrācijas bioloģiskās aktivitātes noteikšana.Šobrīd ir izveidojušās pilnīgi jaunas idejas par MIF būtību un īpašībām, kas tika atklātas pagājušā gadsimta 60. gados kā šūnu imunitātes starpnieks un kas ilgus gadus palika bez pienācīgas uzmanības (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R., 1966). Tikai pēdējo 10-15 gadu laikā ir kļuvis skaidrs: MIF ir viens no svarīgākajiem bioloģiskajiem mediatoriem organismā ar plašu bioloģisko funkciju klāstu kā citokīns, hormons un ferments. MIF ietekme uz mērķa šūnām tiek realizēta caur CD74 receptoru vai caur neklasisko endocitozes ceļu.

MIF tiek uzskatīts par svarīgu iekaisuma mediatoru, kas aktivizē makrofāgu funkcijas (citokīnu veidošanos, fagocitozi, citotoksicitāti utt.), kā arī par endogēnu imūnregulējošo hormonu, kas modulē glikokortikoīdu aktivitāti.

Arvien vairāk uzkrājas informācija par MIF lomu daudzu iekaisuma slimību, tai skaitā sepses, reimatoīdā artrīta (RA), glomerulonefrīta u.c. patoģenēzē. RA gadījumā būtiski palielinās MIF koncentrācija skarto locītavu šķidrumā, kas korelē ar slimības smagumu. MIF ietekmē palielinās gan makrofāgu, gan sinoviālo šūnu pro-iekaisuma citokīnu ražošana.

MIF aktivitātes pārbaudei ir zināmas dažādas metodes, kur migrējošās šūnas (MIF mērķa šūnas) ievieto stikla kapilārā (kapilāra tests), agarozes pilē vai agarozes iedobē.

Mēs piedāvājam salīdzinoši vienkāršu skrīninga metodi, kuras pamatā ir šūnu mikrokultūru (leikocītu vai makrofāgu) veidošanās, standarta pēc platības un šūnu skaita, 96 iedobju plakandibena plāksnes iedobju apakšā, kam seko to kultivēšana uzturvielu barotne un šo mikrokultūru apgabala izmaiņu noteikšana MIF ietekmē (Suslov A.P., 1989).

Laboratorijas 7-3

MIF darbības definīcija

MIF bioloģiskās aktivitātes noteikšana tiek veikta, izmantojot ierīci šūnu mikrokultūru veidošanai (7.7. att.) - MIGROSKRIN (Krievijas Medicīnas zinātņu akadēmijas Epidemioloģijas un mikrobioloģijas pētniecības institūts N.F. Gamaleja).

1. Pievienojiet 100 µl parauga, kas atšķaidīts ar barotni, kurā nosaka MIF aktivitāti (katrs atšķaidījums 4 paralēlēs, eksperimentālie paraugi), 96 iedobju plāksnes (Flow, UK vai līdzīgas) iedobēs. Barotnē ietilpst RPMI 1640, 2 mM L-glutamīns, 5% liellopu augļa seruma, 40 μg/ml gentamicīna.

2. Pievienojiet 100 μl barotni (pa 4 paralēlēm) kontroles iedobēm.

3. Sagatavo peritoneālo makrofāgu šūnu suspensiju, kurai 2 hibrīdpelēm (CBAxC57B1/6)F1 intraperitoneāli injicē 10 ml Henksa šķīduma ar heparīnu (10 V/ml), un vēderu maigi masē 2-3 minūtes. Pēc tam dzīvnieku nogalina ar dekapitāciju, vēdera sienu rūpīgi caurdur cirkšņa zonā un caur adatu ar šļirci izsūc eksudātu. Peritoneālā eksudāta šūnas divas reizes mazgā ar Henksa šķīdumu, centrifugējot tās 10-15 minūtes ar 200 g. Pēc tam pagatavo šūnu suspensiju ar koncentrāciju 10±1 milj./ml barotnes RPMI 1640. Skaitīšanu veic Gorjajeva kamerā.

4. Samontējiet sistēmu MIGROSKRIN, kas ir statīvs virziena un standarta uzgaļu fiksācijai ar šūnu kultūrām stingri vertikālā stāvoklī noteiktā augstumā virs 96 bedrīšu kultūras plāksnes iedobes centra, un tajā ir iekļauti arī 92 uzgaļi automātiskās pipetes no Costar, ASV (7.7. att.).

Ievietojiet statīva kājas planšetdatora stūra iedobēs. Šūnu suspensiju ievelk uzgaļos ar automātisko pipeti - pa 5 μl katrā, noskalo, lai noņemtu liekās šūnas, vienreiz tās pilinot barotnē un vertikāli ievieto sistēmas statīva ligzdās. Piepildīto statīvu ar uzgaļiem 1 stundu tur istabas temperatūrā uz stingri horizontālas virsmas. Šajā laikā suspensijas šūnas nosēžas aku apakšā, kur veidojas standarta šūnu mikrokultūras.

5. Statīvu ar uzgaļiem uzmanīgi noņem no planšetdatora. Šūnu mikrokultūras plāksni ievieto stingri horizontālā stāvoklī CO 2 inkubatorā, kur to kultivē 20 stundas.. Kultivēšanas laikā šūnas migrē pa iedobes dibenu.

6. Rezultātu kvantitatīvo reģistrēšanu pēc inkubācijas veic, izmantojot binokulāro palielināmo stiklu, vizuāli novērtējot kolonijas lielumu uz skalas okulāra iekšpusē. Mikrokultūrām ir apļa forma. Pēc tam pētnieki nosaka vidējo koloniju diametru, mērot kolonijas 4 testa vai kontroles iedobēs. Mērījumu kļūda ir ±1 mm.

Migrācijas indeksu (MI) aprēķina pēc formulas:

Paraugam ir MIF aktivitāte, ja MI vērtības ir vienādas

Par MIF aktivitātes nosacīto vienību (AU) pieņem apgriezto vērtību, kas vienāda ar parauga (parauga) lielākā atšķaidījuma vērtību, pie kuras migrācijas indekss ir 0,6 ± 0,2.

PEO bioloģiskā aktivitāteα tiek novērtēts pēc tā citotoksiskās iedarbības uz transformēto fibroblastu L-929 līniju. Rekombinanto TNF-α izmanto kā pozitīvu kontroli, un šūnas barotnē izmanto kā negatīvu kontroli.

Aprēķiniet citotoksisko indeksu (CI):

Kur a- dzīvo šūnu skaits kontrolē; b- dzīvo šūnu skaits eksperimentā.

Rīsi. 7.7. Shēma MIGROSKRIN - ierīces šūnu kultūru migrācijas kvantitatīvai novērtēšanai

Šūnas tiek iekrāsotas ar krāsvielu (metilēnzilu), kas ir iekļauta tikai atmirušajās šūnās.

Par TNF aktivitātes standarta vienību uzskata parauga abpusējo atšķaidījumu, kas nepieciešams, lai iegūtu 50% šūnu citotoksicitāti. Parauga īpatnējā aktivitāte ir aktivitātes attiecība patvaļīgās vienībās uz 1 ml pret proteīna koncentrāciju paraugā.

Intracelulārā citokīnu krāsošana. Izmaiņas dažādu citokīnu producējošo šūnu proporcijās var atspoguļot slimības patoģenēzi un kalpot par kritēriju slimības prognozēšanai un terapijas izvērtēšanai.

Intracelulārās krāsošanas metodi izmanto, lai noteiktu citokīnu ekspresiju vienas šūnas līmenī. Plūsmas citometrija ļauj saskaitīt šūnu skaitu, kas ekspresē noteiktu citokīnu.

Uzskaitīsim galvenos intracelulāro citokīnu noteikšanas posmus.

Nestimulētas šūnas ražo nelielu daudzumu citokīnu, kas, kā likums, netiek uzglabāti, tāpēc svarīgs solis intracelulāro citokīnu novērtēšanā ir limfocītu stimulēšana un šo produktu izdalīšanās no šūnām bloķēšana.

Visbiežāk izmantotais citokīnu induktors ir proteīna kināzes C aktivators forbola 12-miristāta 13-acetāts (PMA) kombinācijā ar kalcija jonoforu jonomicīnu (IN). Šīs kombinācijas izmantošana izraisa plaša spektra citokīnu sintēzi: IFN, IL-4, IL-2, TNFα. FMA-IN lietošanas trūkums ir problēma ar CD4 molekulu identificēšanu uz limfocītu virsmas pēc šādas aktivācijas. Arī T limfocītu citokīnu ražošana tiek ierosināta, izmantojot mitogēnus (PHA). B šūnas un monocīti stimulē

Mononukleārās šūnas 2-6 stundas inkubē citokīnu ražošanas induktoru un to intracelulārā transporta bloķētāja brefeldīna A vai monensīna klātbūtnē.

Pēc tam šūnas atkārtoti suspendē buferšķīdumā. Fiksācijai pievieno 2% formaldehīda un inkubē 10-15 minūtes istabas temperatūrā.

Pēc tam šūnas apstrādā ar saponīnu, kas palielina šūnu membrānas caurlaidību, un krāso ar monoklonālām antivielām, kas ir specifiskas konstatētajiem citokīniem. Virsmas marķieru (CD4, CD8) iepriekšēja iekrāsošana palielina par šūnu iegūtās informācijas apjomu un ļauj precīzāk noteikt tās populācijas piederību.

Iepriekš aprakstīto metožu pielietošanai ir daži ierobežojumi. Tādējādi ar to palīdzību nav iespējams analizēt vienas šūnas citokīnu sintēzi, nav iespējams noteikt citokīnus ražojošo šūnu skaitu apakšpopulācijā, nav iespējams noteikt, vai citokīnus producējošās šūnas ekspresē unikālus marķierus, vai dažādus citokīnus sintezē dažādas šūnas vai tās pašas šūnas. Atbilde uz šiem jautājumiem tiek iegūta, izmantojot citas izpētes metodes. Lai noteiktu citokīnus producējošo šūnu biežumu populācijā, tiek izmantota ierobežojošā atšķaidīšanas metode un ELISPOT enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa variants (sk. 4. nodaļu).

In situ hibridizācijas metode. Metode ietver:

2) fiksācija ar paraformaldehīdu;

3) mRNS noteikšana, izmantojot marķētu cDNS. Dažos gadījumos citokīnu mRNS nosaka sekcijās, izmantojot radioizotopu PCR.

Imunofluorescence. Metode ietver:

1) orgāna sasaldēšana un kriostata sekciju sagatavošana;

2) fiksācija;

3) sekciju apstrāde ar fluoresceīnu iezīmētām anticitokīnu antivielām;

4) fluorescences vizuāla novērošana.

Šīs metodes (hibridizācija uz vietas un imunofluorescence) ir ātras un nav atkarīgas no izdalītā produkta sliekšņa koncentrācijas. Tomēr tie nemēra izdalīto citokīnu daudzumu un var būt tehniski sarežģīti. Nepieciešama dažāda rūpīga nespecifisku reakciju uzraudzība.

Izmantojot piedāvātās citokīnu novērtēšanas metodes, tika identificēti patoloģiski procesi, kas saistīti ar citokīnu sistēmas traucējumiem dažādos līmeņos.

Tādējādi citokīnu sistēmas novērtējums ir ārkārtīgi svarīgs, lai raksturotu organisma imūnsistēmas stāvokli. Dažādu citokīnu sistēmas līmeņu izpēte ļauj iegūt informāciju par dažāda veida imūnkompetentu šūnu funkcionālo aktivitāti, iekaisuma procesa smagumu, tā pāreju uz sistēmisku līmeni un slimības prognozi.

Jautājumi un uzdevumi

1. Uzskaitiet citokīnu vispārīgās īpašības.

2. Norādiet citokīnu klasifikāciju.

3. Uzskaitiet galvenās citokīnu sistēmas sastāvdaļas.

4. Uzskaitiet šūnas, kas ražo citokīnus.

5. Aprakstiet citokīnu receptoru ģimenes.

6. Kādi ir citokīnu tīkla funkcionēšanas mehānismi?

7. Izskaidrojiet citokīnu veidošanos iedzimtajā imūnsistēmā.

8. Kādas ir galvenās pieejas visaptverošam citokīnu sistēmas novērtējumam?

9. Kādas ir metodes citokīnu testēšanai ķermeņa šķidrumos?

10. Kādi ir citokīnu sistēmas defekti dažādu patoloģiju gadījumā?

11. Kādas ir galvenās metodes IL-1, IFN, MIF, TNFa bioloģiskajai pārbaudei bioloģiskajos šķidrumos?

12. Aprakstiet citokīnu intracelulārā satura noteikšanas procesu.

13. Aprakstiet vienas šūnas izdalīto citokīnu noteikšanas procesu.

14. Aprakstiet izmantoto metožu secību defekta identificēšanai citokīnu receptoru līmenī.

15. Aprakstiet to metožu secību, kuras izmanto, lai identificētu defektu citokīnus producējošo šūnu līmenī.

16. Kādu informāciju var iegūt, pētot citokīnu veidošanos mononukleāro šūnu kultūrā asins serumā?

Ievads

Galvenā informācija

Citokīnu klasifikācija

Citokīnu receptori

Citokīni un imūnās atbildes regulēšana

Secinājums

Literatūra

Ievads

Citokīni ir viena no svarīgākajām imūnsistēmas daļām. Imūnsistēmai ir nepieciešama brīdinājuma sistēma no ķermeņa šūnām, piemēram, sauciens pēc palīdzības. Šī, iespējams, ir labākā citokīnu definīcija. Kad šūnu bojā vai uzbrūk patogēns organisms, makrofāgi un bojātās šūnas atbrīvo citokīnus. Tie ietver tādus faktorus kā interleikīns, interferons un audzēja nekrozes faktors-alfa. Pēdējais arī pierāda, ka audzēja audu iznīcināšanu kontrolē imūnsistēma. Kad tiek atbrīvoti citokīni, tie piesaista specifiskas imūnās šūnas, piemēram, baltās asins šūnas un T un B šūnas.

Citokīni arī norāda uz konkrētu mērķi, kas šīm šūnām ir jāizpilda. Citokīni un antivielas ir pilnīgi atšķirīgas, jo antivielas ir tās, kas ir saistītas ar antigēniem, un tās ļauj imūnsistēmai identificēt svešus organismus. Tādējādi var izdarīt analoģiju: citokīni ir galvenais trauksmes signāls iebrucējiem, un antivielas ir izlūki. Citokīnu analīzes procesu sauc par citokīnu noteikšanu.

Galvenā informācija

Citokīni (citokīni) [grieķu val. kytos - trauks, šeit - šūna un kineo - kustina, iedrošina] - liela un daudzveidīga maza izmēra (molekulārā masa no 8 līdz 80 kDa) proteīna rakstura mediatoru grupa - starpšūnu molekulas (“komunikācijas proteīni”). signāla pārraide galvenokārt imūnsistēmā.

Citokīni ietver audzēja nekrozes faktoru, interferonus, vairākus interleikīnus utt. Citokīnus, ko sintezē limfocīti un kuri ir proliferācijas un diferenciācijas regulatori, jo īpaši hematopoētiskās šūnas un imūnsistēmas šūnas, sauc par limfokīniem.

Visām imūnsistēmas šūnām ir specifiskas funkcijas un tās darbojas skaidri saskaņotā mijiedarbībā, ko nodrošina īpašas bioloģiski aktīvas vielas - citokīni - imūnreakciju regulatori. Citokīni ir specifiski proteīni, ar kuru palīdzību dažādas imūnsistēmas šūnas var apmainīties ar informāciju savā starpā un koordinēt darbības.

Citokīnu kopums un daudzumi, kas iedarbojas uz šūnu virsmas receptoriem — “citokīnu vide” — atspoguļo mijiedarbīgu un bieži mainīgu signālu matricu. Šie signāli ir sarežģīti, jo ir daudz dažādu citokīnu receptoru un tāpēc, ka katrs citokīns var aktivizēt vai nomākt vairākus procesus, tostarp savu sintēzi un citu citokīnu sintēzi, kā arī citokīnu receptoru veidošanos un parādīšanos uz šūnas virsmas.

Starpšūnu signalizācija imūnsistēmā tiek veikta ar tiešu kontakta mijiedarbību starp šūnām vai ar starpšūnu mijiedarbības mediatoru palīdzību. Pētot imūnkompetento un hematopoētisko šūnu diferenciāciju, kā arī starpšūnu mijiedarbības mehānismus, kas veido imūnreakciju, tika atklāta liela un daudzveidīga proteīna rakstura šķīstošo mediatoru grupa - starpšūnu molekulas ("komunikācijas proteīni"). signāla pārraide - citokīni.

Hormoni parasti tiek izslēgti no šīs kategorijas, pamatojoties uz to darbības endokrīno (nevis parakrīno vai autokrīnās) raksturu. (skat. Citokīni: hormonālo signālu pārraides mehānismi). Kopā ar hormoniem un neirotransmiteriem tie veido ķīmiskās signālu valodas pamatu, ar kuras palīdzību daudzšūnu organismā tiek regulēta morfoģenēze un audu reģenerācija.

Viņiem ir galvenā loma imūnās atbildes pozitīvā un negatīvā regulēšanā. Līdz šim vairāk nekā simts citokīnu ir atklāti un dažādās pakāpēs pētīti cilvēkiem, kā minēts iepriekš, un pastāvīgi parādās ziņojumi par jaunu citokīnu atklāšanu. Dažiem ir iegūti ģenētiski modificēti analogi. Citokīni iedarbojas, aktivizējot citokīnu receptorus.

A. Interferoni (IFN):

1. Dabiski IFN (1. paaudze):

2. Rekombinants IFN (2. paaudze):

a) īslaicīga darbība:

IFN a2b: introns-A

IFN β: Avonex utt.

(pegilēts IFN): peginterferons

B. Interferona induktori (interferonogēni):

1. Sintētisks- cikloferons, tilorons, dibazols un utt.

2. Dabisks– Ridostins utt.

IN. Interleikīni : rekombinantais interleikīns-2 (ronkoleikīns, aldesleikīns, proleikīns, ) , rekombinantais interleikīns 1-beta (betaleikīns).

G. Koloniju stimulējošie faktori (molgramostīms utt.)

Peptīdu preparāti

Aizkrūts dziedzera peptīdu preparāti .

Peptīdu savienojumi, ko ražo aizkrūts dziedzeris stimulē T limfocītu nobriešanu(timopoetīni).

Ar sākotnēji zemu līmeni tipisko peptīdu preparāti palielina T šūnu skaitu un to funkcionālo aktivitāti.

Pirmās paaudzes aizkrūts dziedzera zāļu dibinātājs Krievijā bija Taktivin, kas ir peptīdu komplekss, kas iegūts no liellopu aizkrūts dziedzera. Preparāti, kas satur aizkrūts dziedzera peptīdu kompleksu, ietver arī Timalins, Timoptins un citiem, un tiem, kas satur aizkrūts dziedzera ekstraktus - Timostimulīns un Vilosens.

Peptīdu preparāti no liellopu aizkrūts dziedzera Timalīns, timostimulīns ievada intramuskulāri, un taktivīns, timoptīns- zem ādas, galvenokārt šūnu imunitātes nepietiekamības gadījumā:

T-imūndeficīta gadījumā,

Vīrusu infekcijas,

Infekciju profilaksei staru terapijas un audzēju ķīmijterapijas laikā.

Pirmās paaudzes aizkrūts dziedzera zāļu klīniskā efektivitāte nav apšaubāma, taču tām ir viens trūkums: tie ir bioloģiski aktīvo peptīdu neatdalīts maisījums, ko ir diezgan grūti standartizēt.

Progress aizkrūts dziedzera izcelsmes zāļu jomā notika, radot otrās un trešās paaudzes zāles - dabisko aizkrūts dziedzera hormonu sintētiskos analogus vai šo hormonu fragmentus ar bioloģisku aktivitāti.

Mūsdienu zāles Imunofāns - heksapeptīdu, timopoetīna aktīvā centra sintētisku analogu, izmanto imūndeficītu un audzēju ārstēšanai. Zāles stimulē imūnkompetentu šūnu IL-2 veidošanos, palielina limfoīdo šūnu jutību pret šo limfokīnu, samazina TNF (audzēja nekrozes faktora) veidošanos un regulē imūnmediatoru (iekaisumu) un imūnglobulīnu veidošanos. .

Kaulu smadzeņu peptīdu preparāti

Mielopīds iegūts no zīdītāju (teļu, cūku) kaulu smadzeņu šūnu kultūras. Zāļu darbības mehānisms ir saistīts ar B un T šūnu proliferācijas un funkcionālās aktivitātes stimulēšanu.

Organismā šīs zāles mērķis tiek uzskatīts par B limfocīti. Ja ir traucēta imūnsistēma vai hematopoēze, mielopīdu ievadīšana izraisa kaulu smadzeņu šūnu vispārējās mitotiskās aktivitātes palielināšanos un to diferenciācijas virzienu uz nobriedušiem B-limfocītiem.

Myelopid lieto kompleksā terapijā sekundāra imūndeficīta stāvokļiem ar dominējošiem humorālās imunitātes bojājumiem, infekciozu komplikāciju profilaksei pēc operācijām, traumām, osteomielītu, nespecifiskām plaušu slimībām, hronisku piodermu. Zāļu blakusparādības ir reibonis, vājums, slikta dūša, hiperēmija un sāpes injekcijas vietā.

Visas šīs grupas zāles ir kontrindicētas grūtniecēm, mielopīdi un imunofāns ir kontrindicēti, ja ir Rh konflikts starp māti un augli.

Imūnglobulīna preparāti

Cilvēka imūnglobulīni

a) Imūnglobulīni intramuskulārai ievadīšanai

Nespecifisks: normāls cilvēka imūnglobulīns

Konkrēts: imūnglobulīns pret cilvēka B hepatītu, cilvēka imūnglobulīns pretstafilokoku, cilvēka imūnglobulīns pretstingumkrampjiem, cilvēka imūnglobulīns pret ērču encefalītu, cilvēka imūnglobulīns pret trakumsērgas vīrusu u.c.

b) Imūnglobulīni intravenozai ievadīšanai

Nespecifisks: normāls cilvēka imūnglobulīns intravenozai ievadīšanai (gabriglobīns, imūnvenīns, intraglobīns, humaglobīns)

Konkrēts: imūnglobulīns pret cilvēka B hepatītu (neohepatect), pentaglobīns (satur antibakteriālo IgM, IgG, IgA), imūnglobulīns pret citomegalovīrusu (citotekts), cilvēka imūnglobulīns pret ērču encefalītu, prettrakumsērgas IG u.c.

c) Imūnglobulīni iekšķīgai lietošanai: imūnglobulīna kompleksa preparāts (ICP) enterālai lietošanai akūtu zarnu infekciju gadījumā; pretrotavīrusu imūnglobulīns iekšķīgai lietošanai.

Heteroloģiskie imūnglobulīni:

prettrakumsērgas imūnglobulīns no zirga seruma, polivalentais zirga antigangrenozes serums u.c.

Primāro un sekundāro imūndeficītu lieto nespecifisko imūnglobulīnu preparātus, atbilstošām infekcijām (ārstnieciskos vai profilaktiskiem) lieto specifisko imūnglobulīnu preparātus.

Citokīni un uz tiem balstītas zāles

Izstrādātās imūnās atbildes regulēšanu veic citokīni - komplekss endogēno imūnregulējošo molekulu komplekss, kas ir pamats lielas gan dabisko, gan rekombinanto imūnmodulējošo zāļu grupas izveidei.

Interferoni (IFN):

1. Dabiski IFN (1. paaudze):

Alfaferoni: cilvēka leikocītu IFN utt.

Betaferoni: cilvēka fibroblastu IFN utt.

2. Rekombinants IFN (2. paaudze):

a) īslaicīga darbība:

IFN a2a: reaferons, viferons utt.

IFN a2b: introns-A

IFN β: Avonex utt.

b) ilgstoša darbība(pegilēts IFN): peginterferons (IFN a2b + polietilēnglikols) utt.

IFN zāļu galvenais darbības virziens ir T-limfocīti (dabiskās killer šūnas un citotoksiskie T-limfocīti).

Dabiskos interferonus iegūst leikocītu šūnu kultūrā no donoru asinīm (limfoblastoīdu un citu šūnu kultūrā) induktora vīrusa ietekmē.

Rekombinantos interferonus iegūst, izmantojot gēnu inženierijas metodi - kultivējot baktēriju celmus, kuru ģenētiskajā aparātā ir integrēta cilvēka interferona gēna rekombinantā plazmīda.

Interferoniem ir pretvīrusu, pretaudzēju un imūnmodulējoša iedarbība.

Interferona preparāti kā pretvīrusu līdzekļi ir visefektīvākie herpetisku acu slimību ārstēšanā (lokāli pilienu veidā, subkonjunktivāli), herpes simplex, kas lokalizēts uz ādas, gļotādām un dzimumorgāniem, herpes zoster (lokāli hidrogēla veidā). uz ziedes bāzes), akūts un hronisks vīrusu hepatīts B un C (parenterāli, rektāli svecītēs), gripas un ARVI ārstēšanā un profilaksē (intranazāli pilienu veidā). HIV infekcijas gadījumā rekombinantie interferona preparāti normalizē imunoloģiskos parametrus, samazina slimības smagumu vairāk nekā 50% gadījumu un izraisa virēmijas līmeņa un slimības seruma marķieru satura samazināšanos. AIDS gadījumā tiek veikta kombinēta terapija ar azidotimidīnu.

Interferona zāļu pretvēža iedarbība ir saistīta ar antiproliferatīvu efektu un dabisko killer šūnu aktivitātes stimulāciju. Kā pretvēža līdzekļus izmanto IFN-alfa, IFN-alfa-2a, IFN-alfa-2b, IFN-alfa-n1, IFN-beta.

IFN-beta-lb tiek izmantots kā imūnmodulators multiplās sklerozes gadījumā.

Interferona zāles izraisa līdzīgu blakus efekti. Raksturīgs: gripai līdzīgs sindroms; izmaiņas centrālajā nervu sistēmā: reibonis, neskaidra redze, apjukums, depresija, bezmiegs, parestēzija, trīce. No kuņģa-zarnu trakta: apetītes zudums, slikta dūša; no sirds un asinsvadu sistēmas puses var rasties sirds mazspējas simptomi; no urīnceļu sistēmas - proteīnūrija; no hematopoētiskās sistēmas - pārejoša leikopēnija. Var rasties arī izsitumi, nieze, alopēcija, īslaicīga impotence un deguna asiņošana.

Interferona induktori (interferonogēni):

1. Sintētisks – cikloferons, tilorons, poludāns utt.

2. Dabiski – Ridostins utt.

Interferona induktori ir zāles, kas uzlabo endogēnā interferona sintēzi. Šīm zālēm ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar rekombinantajiem interferoniem. Viņiem nav antigēnas aktivitātes. Stimulētā endogēnā interferona sintēze neizraisa hiperinterferonēmiju.

Tilorons(amiksīns) ir zemas molekulmasas sintētisks savienojums un perorāls interferona induktors. Tam ir plašs pretvīrusu darbības spektrs pret DNS un RNS vīrusiem. Kā pretvīrusu un imūnmodulējošu līdzekli lieto gripas, ARVI, A hepatīta profilaksei un ārstēšanai, vīrusu hepatīta, herpes simplex (ieskaitot uroģenitālo) un herpes zoster ārstēšanai, kompleksā hlamīdiju infekciju, neirovīrusu infekciju terapijā. infekcijas-alerģiskas slimības un sekundāri imūndeficīti. Zāles ir labi panesamas. Iespējami dispepsijas simptomi, īslaicīgi drebuļi un paaugstināts vispārējais tonuss, kas neprasa zāļu lietošanas pārtraukšanu.

Poludāns ir biosintētisks poliribonukleotīdu komplekss no poliadenilskābes un poliuridilskābes (ekvimolārās attiecībās). Zāles ir izteikta inhibējoša iedarbība uz herpes simplex vīrusiem. To lieto acu pilienu un injekciju veidā zem konjunktīvas. Zāles ir parakstītas pieaugušajiem vīrusu acu slimību ārstēšanai: herpetisks un adenovīrusu konjunktivīts, keratokonjunktivīts, keratīts un keratoiridociklīts (keratouveīts), iridociklīts, horioretinīts, optiskais neirīts.

Blakus efekti rodas reti un izpaužas kā alerģisku reakciju attīstība: nieze un svešķermeņa sajūta acī.

Cikloferons- zemas molekulmasas interferona induktors. Tam ir pretvīrusu, imūnmodulējoša un pretiekaisuma iedarbība. Cikloferons ir efektīvs pret ērču encefalīta vīrusiem, herpes, citomegalovīrusu, HIV uc Tam ir antihlamīdijas iedarbība. Efektīva sistēmiskām saistaudu slimībām. Ir konstatēta zāļu radioaizsargājošā un pretiekaisuma iedarbība.

Arbidol parakstītas iekšēji gripas un citu akūtu elpceļu vīrusu infekciju, kā arī herpetisku slimību profilaksei un ārstēšanai.

Interleikīni:

rekombinantais IL-2 (aldesleikīns, proleikīns, ronkoleikīns ) , rekombinantā IL-1beta ( betaleikīns).

Dabas izcelsmes citokīnu preparātiem, kas satur diezgan lielu iekaisuma citokīnu kopumu un imūnās atbildes reakcijas pirmo fāzi, ir raksturīga daudzpusīga ietekme uz cilvēka ķermeni. Šīs zāles iedarbojas uz šūnām, kas iesaistītas iekaisumos, reģenerācijas procesos un imūnreakcijā.

Aldesleikins- IL-2 rekombinants analogs. Ir imūnmodulējoša un pretvēža iedarbība. Aktivizē šūnu imunitāti. Uzlabo T-limfocītu un no IL-2 atkarīgo šūnu populāciju proliferāciju. Palielina limfocītu un killer šūnu citotoksicitāti, kas atpazīst un iznīcina audzēja šūnas. Uzlabo gamma interferona, TNF, IL-1 ražošanu. Lieto nieru vēža ārstēšanai.

Betaleikins- rekombinantā cilvēka IL-1 beta. Stimulē leikopoēzi un imūno aizsardzību. Injicē subkutāni vai intravenozi pie strutojošiem procesiem ar imūndeficītu, pret leikopēniju ķīmijterapijas rezultātā, pie audzējiem.

Ronkoleikins- rekombinantās zāles interleikīns-2 - ievada intravenozi sepsei ar imūndeficītu, kā arī nieru vēža gadījumā.

Koloniju stimulējošie faktori:

Molgramostim(Leukomax) ir cilvēka granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošā faktora rekombinants preparāts. Stimulē leikopoēzi un ir imūntropiska aktivitāte. Uzlabo prekursoru proliferāciju un diferenciāciju, palielina nobriedušu šūnu saturu perifērajās asinīs, granulocītu, monocītu, makrofāgu augšanu. Palielina nobriedušu neitrofilu funkcionālo aktivitāti, uzlabo fagocitozi un oksidatīvo metabolismu, nodrošinot fagocitozes mehānismus, palielina citotoksicitāti pret ļaundabīgām šūnām.

Filgrastims(Neupogen) ir cilvēka granulocītu koloniju stimulējošā faktora rekombinants preparāts. Filgrastīms regulē neitrofilu veidošanos un to iekļūšanu asinīs no kaulu smadzenēm.

Lenograstims- cilvēka granulocītu koloniju stimulējošā faktora rekombinants preparāts. Tas ir ļoti attīrīts proteīns. Tas ir imūnmodulators un leikopoēzes stimulators.

Sintētiskie imūnstimulatori: levamizols, izoprinosīna polioksidonijs, galavīts.

Levamizols(decaris), imidazola atvasinājumu, izmanto kā imūnstimulējošu līdzekli, kā arī kā prettārpu līdzekli askaridozei. Levamizola imūnstimulējošās īpašības ir saistītas ar palielinātu makrofāgu un T-limfocītu aktivitāti.

Levamizols tiek parakstīts iekšķīgi atkārtotu herpetisku infekciju, hroniska vīrusu hepatīta, autoimūnu slimību (reimatoīdais artrīts, sistēmiskā sarkanā vilkēde, Krona slimība) gadījumā. Zāles lieto arī resnās zarnas audzējiem pēc audzēju ķirurģiskas, staru vai medikamentozas terapijas.

Izoprinosīns- zāles, kas satur inozīnu. Stimulē makrofāgu darbību, interleikīnu veidošanos un T-limfocītu proliferāciju.

Izrakstīts iekšķīgi pret vīrusu infekcijām, hroniskām elpceļu un urīnceļu infekcijām, imūndeficītu.

Polioksidonijs- sintētisks ūdenī šķīstošs polimēru savienojums. Zāles ir imūnstimulējoša un detoksikācijas iedarbība, palielina organisma imūno pretestību pret lokālām un ģeneralizētām infekcijām. Polioksidonijs aktivizē visus dabiskos rezistences faktorus: monocītu-makrofāgu sistēmas šūnas, neitrofilus un dabiskās killer šūnas, palielinot to funkcionālo aktivitāti ar sākotnēji samazinātu līmeni.

Galavit- ftalhidrazīda atvasinājums. Šo zāļu īpatnība ir ne tikai imūnmodulējošu, bet arī izteiktu pretiekaisuma īpašību klātbūtne.

Citu farmakoloģisko klašu zāles ar imūnstimulējošu iedarbību

1. Adaptogēni un augu izcelsmes preparāti (augu izcelsmes zāles): ehinacejas (immunālas), eleuterokoka, žeņšeņa, Rhodiola rosea u.c.

2. Vitamīni: askorbīnskābe (C vitamīns), tokoferola acetāts (E vitamīns), retinola acetāts (A vitamīns) (skatīt sadaļu “Vitamīni”).

Ehinacejas preparāti piemīt imūnstimulējošas un pretiekaisuma īpašības. Lietojot iekšķīgi, šīs zāles palielina makrofāgu un neitrofilu fagocītisko aktivitāti, stimulē interleikīna-1 veidošanos, T-helper šūnu aktivitāti un B-limfocītu diferenciāciju.

Ehinācijas preparātus lieto imūndeficīta un hronisku iekaisuma slimību gadījumā. It īpaši, imūns parakstītas iekšķīgi pilienu veidā akūtu elpceļu infekciju profilaksei un ārstēšanai, kā arī kopā ar antibakteriāliem līdzekļiem ādas, elpceļu un urīnceļu infekcijām.

Vispārīgi principi imūnstimulantu lietošanai pacientiem ar sekundāru imūndeficītu

Vispamatotākā imūnstimulantu lietošana šķiet imūndeficīta gadījumos, kas izpaužas kā paaugstināta infekciozā saslimstība. Imūnstimulējošu zāļu galvenais mērķis joprojām ir sekundāri imūndeficīti, kas izpaužas kā biežas recidivējošas, grūti ārstējamas infekcijas un iekaisuma slimības visās lokalizācijās un jebkurā etioloģijā. Katra hroniska infekciozi-iekaisuma procesa pamatā ir izmaiņas imūnsistēmā, kas ir viens no šī procesa noturības iemesliem.

· Imūnmodulatori tiek nozīmēti kompleksā terapijā vienlaikus ar antibiotikām, pretsēnīšu līdzekļiem, pretprotozoāļiem vai pretvīrusu līdzekļiem.

· Veicot imūnrehabilitācijas pasākumus, īpaši nepilnīgas atveseļošanās gadījumā pēc akūtas infekcijas slimības, imūnmodulatorus var izmantot kā monoterapiju.

· Vēlams lietot imūnmodulatorus uz imunoloģiskās uzraudzības fona, kas jāveic neatkarīgi no sākotnējo imūnsistēmas izmaiņu esamības vai neesamības.

· Imunomodulatorus, kas iedarbojas uz imunitātes fagocītisko komponentu, var ordinēt pacientiem gan ar identificētiem, gan nediagnosticētiem imūnstāvokļa traucējumiem, t.i. to izmantošanas pamats ir klīniskā aina.

Jebkura imunitātes parametra samazināšanās, kas atklāta imūndiagnostikas pētījuma laikā praktiski veselam cilvēkam, Nav Obligāti ir pamats imūnmodulējošas terapijas izrakstīšanai.

Kontroles jautājumi:

1. Kas ir imūnstimulatori, kādas ir imūnterapijas indikācijas, kādos imūndeficīta stāvokļus iedala?

2. Imūnmodulatoru klasifikācija pēc to preferenciālās darbības selektivitātes?

3. Mikrobu izcelsmes imūnstimulatori un to sintētiskie analogi, to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

4. Endogēni imūnstimulanti un to sintētiskie analogi, to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

5. Aizkrūts dziedzera peptīdu un kaulu smadzeņu peptīdu preparāti: to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

6. Imūnglobulīnu preparāti un interferoni (IFN), to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

7. Interferona induktoru (interferonogēnu) preparāti, to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

8. Interleikīnu un koloniju stimulējošu faktoru preparāti, to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

9. Sintētiskie imūnstimulatori, to farmakoloģiskās īpašības, lietošanas indikācijas, kontrindikācijas, blakusparādības?

10. Citu farmakoloģisko klašu zāles ar imūnstimulējošu aktivitāti un imūnstimulantu lietošanas vispārīgie principi pacientiem ar sekundāru imūndeficītu?