Citokīnu iedarbība uz šūnām tiek veikta caur. Citokīni. Pretvīrusu imunitātes molekulārie un šūnu mehānismi, attīstības modeļi un imunopato

Vēl nesen vēža 4. stadija patiesībā bija pacienta nāves spriedums. Tradicionālās ārstēšanas metodes maz palīdzēja; visa terapija aprobežojās ar simptomu mazināšanu. Tomēr pirms vairākām desmitgadēm viņi sāka aktīvi attīstīt imuno -onkoloģiju un jo īpaši citokīnu terapiju - ārstēšanas metodi ar zālēm, kuru pamatā ir ķermeņa olbaltumvielas, kas, pēc atsauksmēm, ir ļoti efektīva. Onkimunoloģijas un citokīnu terapijas klīnika Maskavā pēc pozitīvajiem rādītājiem tiek uzskatīta par vienu no labākajām pasaulē.

Kas ir citokīnu terapija

Šī ārstēšanas metode ir izstrādāta, pamatojoties uz imūno onkoloģiju-onkoloģijas nozari, kas pēta vēža imūnsistēmas darbību. Metodes pamatā ir vēža un citu slimību ārstēšana ar zālēm, kuru pamatā ir cilvēka ķermeņa proteīni (citokīni). Noteiktos apstākļos tie var iznīcināt dažādus patogēnus: svešas šūnas, vīrusus, antigēnus, endotoksīnus utt. Kā darbojas citokīni:

ķermeņa imunoloģiskās reakcijas aktivizēšana pret patogēnu uzbrukumu;
imūnsistēmas darba kontrole, slepkavas šūnas (elementi, kas tieši cīnās ar slimību);
provocējot šūnu masas atjaunošanos uz veselīgu;
ķermeņa sistēmu normalizēšana.

Pozitīva rīcība

Darba ar citokīniem pievienošana onkoloģijas kompleksā ārstēšanā palīdz sasniegt absolūti pozitīvu terapiju 10-30% pacientu, un daļēji panākumi sasniedz 90%. Var šķist, ka ar to ir par maz, bet smagiem vēža audzējiem pēdējos posmos tas ir milzīgs sasniegums. Turklāt šo tehniku var un vajadzētu apvienot ar tradicionālajām metodēm (medikamenti, ķīmijterapija).

Citokīnu terapija darbojas kvalitatīvi un precīzi pret audzējiem, metastāzēm un tajā pašā laikā nerada toksisku ietekmi uz ķermeni. Atsevišķi ir vērts atzīmēt pozitīvu ķīmijterapijas kvalitātes pieaugumu. Šī metode jau ir pierādījusi savu efektivitāti klīniskajos pētījumos (Krievijas Federācijā ar šo paņēmienu ir atļauts ārstēt vairāk nekā 50 dažāda veida patoloģijas). Papildus onkoloģiskām slimībām citokīnu terapija veiksmīgi cīnās pret citām patoloģijām:

onkoloģija līdz 4. posmam;
vīrusu hepatīts B, C;
melanoma;
Kapoši sarkoma uz HIV fona;
AIDS un HIV;
SARS, gripa, bakteriālas zarnu un rotavīrusu infekcijas;
tuberkuloze;
jostas roze;
šizofrēnija;
multiplā skleroze.

Onkoimunoloģija un citokīnu terapija

Praktiski visi ļaundabīgi audzēji ar smagu gaitu rodas uz nomāktas imunitātes fona. Onkimunologi (imuno-onkoloģijas speciālisti), pamatojoties uz klīniskajiem pētījumiem, izstrādā jaunas metodes un zāles vēža ārstēšanai, pamatojoties uz imūnsistēmas darbību. Citokīnu terapijas metodes pamatā ir citokīnu, īpašu proteīnu izmantošana, un pati tehnika parādījās 20. gadsimta 80. gados. Galvenā problēma bija zāļu augstā toksicitāte. Mūsdienu zāļu, kuru pamatā ir citokīni, toksicitāte ir 100 reizes zemāka.

Citokīnu funkcijas organismā

Cilvēka ķermenī ir milzīgs daudzums citokīnu, tie visi veic dažādas funkcijas. Citokīnu terapija izmanto šo daudzveidību, lai ārstētu dažādas slimības un aktivizētu ķermeņa iekšējos procesus. Ir pierādīts, ka patiesībā cilvēku sistēmas spēj cīnīties ar jebkuru problēmu. Galvenais ir uzsākt nepieciešamos procesus. Citokīnu funkcijas organismā:

imūnās atbildes ilguma un kvalitātes kontrole;
pretiekaisuma citokīni kontrolē iekaisumu;
stimulējot autoimūnu reakciju attīstību (pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīni);
piedalīšanās alerģijas mehānikā;
audzēja samazināšana vai tā iznīcināšana;
šūnu augšanas stimulēšana vai nomākšana;
palēninot onkoloģijas attīstību;
imūnsistēmas, endokrīnās un nervu sistēmas koordinācija;
audzēja atkārtošanās novēršana;
ķermeņa homeostāzes (veselīgas noturības) saglabāšana.

Pētīto citokīnu proteīnu skaits jau pārsniedzis 200 nosaukumus. Citokīnu mijiedarbība ir sarežģīta ar dažādām funkcijām. Sākotnēji tie ir sadalīti pēc darbības veida. Vienkāršotā klasifikācijā tiek pieņemts sadalījums pēc bioloģiskās iedarbības: iekaisuma regulatori (pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīni), kas regulē šūnu imunitāti un humorālo imūno sadalījumu. Precīzāka sistematizācija sadala olbaltumvielas atbilstoši to darbības raksturam. Citokīnu veidi:

imūnās aktivitātes regulatori (interleikīni un to bioloģiskās funkcijas nodrošina pareizu imunitātes mijiedarbību ar citām ķermeņa sistēmām);
pretvīrusu regulatori - interferoni;
TNF (audzēja nekrozes faktori) - regulējoša vai toksiska ietekme uz šūnām;
chemokīni - visu veidu leikocītu, citu šūnu kustības kontrole;
augšanas faktori - šūnu augšanas kontrole;
kolonijas stimulējošie faktori - asinsrades šūnu attīstības stimulēšana.

Citokīni kā zāles

Ingaron ir citokīnu terapeitiskais līdzeklis, lai uzlabotu ķīmijterapijas efektu, vienlaikus aizsargājot ķermeni no toksiskas iedarbības. Turklāt tas samazina iespējamo metastāžu un audzēju rašanos. Ingaron zāles provocē imunitātes veidošanos, kas pēc ķīmijterapijas neļaus attīstīties infekcijas slimībām, samazinās nepieciešamību pēc antibakteriāliem līdzekļiem. Instrumentam ir minimāla toksicitāte salīdzinājumā ar Rietumu kolēģiem.

Zāļu Refnot mērķis ir ierobežot jaunveidojumu attīstību TNF citokīna dēļ sastāvā. Līdzeklim ir arī kvalitatīvi samazināta toksicitāte, kas ļauj to ievadīt subkutāni vai intravenozi, stimulē ļaundabīgo audzēju iznīcināšanu, neietekmējot pavadošos audus. Lai noteiktu ārstēšanas dinamiku, ir nepieciešami 1-2 kursi. Lai iegūtu maksimālu efektu, abas zāles lieto kombinācijā, lai aktivizētu nepieciešamos citokīnus onkoloģijā.

Blakus efekti

Ārstēšana ar citokīniem var izraisīt negatīvas sekas atkarībā no slimības morfoloģijas, pacienta vispārējā stāvokļa un zāļu kombinācijas. Lielākoties blakusparādības nerada briesmas pacientam, bet norāda uz audzēja reakciju uz zālēm. Kad parādās sekundāras reakcijas, terapijas kurss tiek pārtraukts vai ārstēšanas režīms tiek koriģēts. Iespējamās ķermeņa negatīvās izpausmes:

ķermeņa temperatūras paaugstināšanās par 2-3 grādiem 4-6 stundas pēc citokīnu ievadīšanas;
sāpīgums un apsārtums injekcijas vietā;
ķermeņa saindēšanās ar audzēja sabrukšanas produktiem (liela veidojuma gadījumā).

Kam citokīnu terapijas metode nav piemērota

Citokīnu saturošām zālēm praktiski nav kontrindikāciju, un tās var lietot jebkuram pacientam. Tomēr, tāpat kā ar citām zālēm, ir vairāki pacienti, kuriem nav ieteicams izmantot šo ārstēšanas metodi. Nelietojiet citokīnu terapiju grūtniecēm, zīdīšanas laikā, ja ir autoimūnas slimības, reta ķermeņa alerģija pret zālēm.

Citokīnu terapijas izmaksas

Efektīva citokīnu zāļu lietošana tiek panākta specializētos centros (piemēram, Maskavas onkoimunoloģijas un citokīnu terapijas centrs ir labākā klīnika pēc izglābto pacientu domām). Šāda veida ārstēšanas izmaksas ir ļoti atšķirīgas atkarībā no izmantoto zāļu veida un konkrētās slimības. Aptuvenās cenas dažām citokīnu zālēm Maskavā.

Šajā nodaļā tiks aplūkota integrēta pieeja citokīnu sistēmas novērtēšanai, izmantojot iepriekš aprakstītās mūsdienu pētījumu metodes.

Pirmkārt, mēs ieskicējam citokīnu sistēmas pamatjēdzienus.

Citokīni pašlaik tiek uzskatīti par olbaltumvielu-peptīdu molekulām, ko ražo dažādas ķermeņa šūnas un kas veic starpšūnu un starpsistēmu mijiedarbību. Citokīni ir universāli šūnu dzīves cikla regulatori, tie kontrolē pēdējo diferenciācijas, proliferācijas, funkcionālās aktivācijas un apoptozes procesus.

Citokīnus, ko ražo imūnsistēmas šūnas, sauc par imunocitokīniem; tie ir imūnsistēmas šķīstošo peptīdu mediatoru klase, kas nepieciešama tās attīstībai, darbībai un mijiedarbībai ar citām ķermeņa sistēmām (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Citokīniem kā regulējošām molekulām ir svarīga loma iedzimtas un adaptīvas imunitātes reakcijās, tie nodrošina savstarpēju savienojumu, kontrolē asinsradi, iekaisumu, brūču dzīšanu, jaunu asinsvadu veidošanos (angioģenēzi) un daudzus citus dzīvībai svarīgus procesus.

Pašlaik pastāv vairākas dažādas citokīnu klasifikācijas, ņemot vērā to struktūru, funkcionālo aktivitāti, izcelsmi, citokīnu receptoru veidu. Tradicionāli saskaņā ar bioloģisko iedarbību ir ierasts atšķirt šādas citokīnu grupas.

1. Interleikins(IL-1-IL-33) ir imūnsistēmas sekrēcijas regulējošie proteīni, kas nodrošina starpnieka mijiedarbību imūnsistēmā un tās saistību ar citām ķermeņa sistēmām. Interleikīnus pēc to funkcionālās aktivitātes klasificē kā pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīnus, limfocītu augšanas faktorus, regulējošos citokīnus utt.

3. Audzēja nekrozes faktori (TNF)- citokīni ar citotoksisku un regulējošu iedarbību: TNFa un limfotoksīni (LT).

4. Hematopoētisko šūnu augšanas faktori-cilmes šūnu augšanas faktors (komplekts-ligands), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetīns, trobopoetīns, granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošais faktors-GM-CSF, granulocītu CSF-G-CSF, makrofāgi-

ny KSF - M -KSF).

5. Chemokīni- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - dažāda veida šūnu ķīmotakses regulatori.

6. Ne limfoīdo šūnu augšanas faktori- dažādu audu piederības šūnu augšanas, diferenciācijas un funkcionālās aktivitātes regulatori (fibroblastu augšanas faktors - FGF, endotēlija šūnu augšanas faktors, epidermas augšanas faktors - epidermas EGF) un augšanas faktoru pārveidotāji (TGFβ, TGFα).

Cita starpā pēdējos gados ir aktīvi pētīts faktors, kas kavē makrofāgu migrāciju (migrāciju kavējošs faktors - MIF), kas tiek uzskatīts par neirohormonu ar citokīnu un fermentatīvu aktivitāti (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Citokīni atšķiras pēc struktūras, bioloģiskās aktivitātes un citām īpašībām. Tomēr kopā ar atšķirībām citokīniem ir vispārējās īpašības, raksturīga šai bioregulējošo molekulu klasei.

1. Citokīni parasti ir glikozilēti polipeptīdi ar vidējo molekulmasu (mazāk nekā 30 kD).

2. Citokīnus ražo imūnsistēmas šūnas un citas šūnas (piemēram, endotēlijs, fibroblasti utt.), Reaģējot uz aktivizējošu stimulu (ar patogēnu saistītās molekulārās struktūras, antigēni, citokīni u.c.), un piedalās reakcijās iedzimtas un adaptīvas imunitātes, regulējot to spēku un ilgumu. Daži citokīni tiek sintezēti konstitutīvi.

3. Citokīnu sekrēcija ir īslaicīgs process. Citokīni netiek uzglabāti kā iepriekš sagatavotas molekulas, bet gan to

sintēze vienmēr sākas ar gēnu transkripciju. Šūnas ražo citokīnus zemā koncentrācijā (pikogrammas uz mililitru).

4. Vairumā gadījumu tiek ražoti citokīni, kas iedarbojas uz mērķa šūnām tiešā tuvumā (neliela attāluma darbība). Galvenā citokīnu darbības vieta ir starpšūnu sinapse.

5. Atlaišana citokīnu sistēma izpaužas faktā, ka katrs šūnu veids spēj ražot vairākus citokīnus, un katru citokīnu var izdalīt dažādas šūnas.

6. Visus citokīnus raksturo pleiotropija, vai darbības polifunkcionalitāte. Tādējādi iekaisuma pazīmju izpausme ir saistīta ar IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 ietekmi. Funkciju dublēšanās nodrošina citokīnu sistēmas uzticamību.

7. Citokīnu iedarbību uz mērķa šūnām nodrošina ļoti specifiski augstas afinitātes membrānas receptori, kas ir transmembrāni glikoproteīni, kas parasti sastāv no vairākām apakšvienībām. Receptoru ārpusšūnu daļa ir atbildīga par citokīnu saistīšanos. Ir receptori, kas patoloģiskā fokusā likvidē lieko citokīnu daudzumu. Tie ir tā sauktie slazdu receptori. Šķīstošie receptori ir membrānas receptoru ārpusšūnu domēns, ko atdala enzīms. Šķīstošie receptori spēj neitralizēt citokīnus, piedalīties to transportēšanā uz iekaisuma fokusu un izvadīt no organisma.

8. Citokīni strādāt pēc tīkla principa. Viņi var rīkoties koncertā. Šķiet, ka daudzas funkcijas, kas sākotnēji tika piešķirtas vienam citokīnam, ir saistītas ar vairāku citokīnu saskaņotu darbību. (sinerģija darbības). Citokīnu sinerģiskās mijiedarbības piemēri ir iekaisuma reakciju stimulēšana (IL-1, IL-6 un TNF-a), kā arī IgE sintēze

(IL-4, IL-5 un IL-13).

Daži citokīni izraisa citu citokīnu sintēzi (kaskāde). Citokīnu kaskādes darbība ir nepieciešama iekaisuma un imūnās atbildes reakciju attīstībai. Dažu citokīnu spēja uzlabot vai vājināt citu ražošanu nosaka svarīgus pozitīvos un negatīvos regulēšanas mehānismus.

Ir zināms citokīnu antagonistiskais efekts, piemēram, var būt IL-6 ražošana, reaģējot uz TNFα koncentrācijas palielināšanos.

negatīvs regulēšanas mehānisms šī starpnieka ražošanas kontrolei iekaisuma laikā.

Mērķa šūnu funkciju citokīnu regulēšana tiek veikta, izmantojot autokrīnus, parakrīnus vai endokrīnus mehānismus. Daži citokīni (IL-1, IL-6, TNFα uc) spēj piedalīties visu iepriekš minēto mehānismu ieviešanā.

Šūnas reakcija uz citokīna ietekmi ir atkarīga no vairākiem faktoriem:

No šūnu veida un to sākotnējās funkcionālās aktivitātes;

No citokīna lokālās koncentrācijas;

No citu starpnieku molekulu klātbūtnes.

Tādējādi ražotāja šūnas, citokīni un to specifiskie receptori mērķa šūnās veido vienotu starpnieku tīklu. Galīgo šūnu reakciju nosaka regulējošo peptīdu kopums, nevis atsevišķi citokīni. Šobrīd citokīnu sistēma tiek uzskatīta par universālu regulēšanas sistēmu visa organisma līmenī, kas nodrošina aizsargreakciju attīstību (piemēram, infekcijas laikā).

Pēdējos gados ideja par citokīnu sistēmu, kas apvieno:

1) ražotāju šūnas;

2) šķīstošie citokīni un to antagonisti;

3) mērķa šūnas un to receptori (7.1. Att.).

Dažādu citokīnu sistēmas komponentu pārkāpumi izraisa daudzu patoloģisku procesu attīstību, un tāpēc šīs regulējošās sistēmas defektu identificēšana ir svarīga pareizai diagnozei un atbilstošas terapijas iecelšanai.

Pirmkārt, mēs apsvērsim citokīnu sistēmas galvenās sastāvdaļas.

Šūnas, kas ražo citokīnus

I. Galvenā citokīnus ražojošo šūnu grupa adaptīvajā imūnreakcijā ir limfocīti. Atpūtas šūnas neizdala citokīnus. Ar antigēna atpazīšanu un piedaloties receptoru mijiedarbībai (CD28-CD80 / 86 T-limfocītiem un CD40-CD40L B-limfocītiem), notiek šūnu aktivācija, kas noved pie citokīnu gēnu transkripcijas, glikozilēto peptīdu translācijas un sekrēcijas starpšūnu telpa.

Rīsi. 7.1. Citokīnu sistēma

CD4 T-palīgus attēlo apakšpopulācijas: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, kas atšķiras ar izdalīto citokīnu spektru, reaģējot uz dažādiem antigēniem.

Th0 ražo plašu citokīnu klāstu ļoti zemā koncentrācijā.

Diferenciācijas virziens Th0 nosaka divu imūnās atbildes formu attīstību ar humora vai šūnu mehānismu pārsvaru.

Antigēna raksturs, tā koncentrācija, lokalizācija šūnā, antigēnu prezentējošo šūnu veids un noteikts citokīnu komplekts regulē Th0 diferenciācijas virzienu.

Pēc antigēna uztveršanas un apstrādes dendritiskās šūnas Th0 šūnām uzrāda antigēnus peptīdus un ražo citokīnus, kas regulē to diferenciācijas virzienu efektoru šūnās. Atsevišķu citokīnu loma šajā procesā ir parādīta attēlā. 7.2. IL-12 inducē IFNγ sintēzi ar T-limfocītiem un] HGC. IFNu nodrošina Th1 diferenciāciju, kas sāk izdalīt citokīnus (IL-2, IFNu, IL-3, TNF-a, limfotoksīni), kas regulē reakciju attīstību uz intracelulāriem patogēniem

(aizkavēta tipa paaugstināta jutība (HAT) un dažāda veida šūnu citotoksicitāte).

IL-4 nodrošina Th0 diferenciāciju Th2. Aktivizēts Th2 ražo citokīnus (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 uc), kas nosaka B-limfocītu proliferāciju, to tālāku diferenciāciju plazmas šūnās un antivielu reakcijas veidošanos, galvenokārt uz ārpusšūnu patogēni.

IFNu negatīvi regulē Th2 šūnu darbību un, gluži pretēji, IL-4, IL-10, ko izdala Th2, kavē Th1 funkciju (7.3. Att.). Šīs regulas molekulārais mehānisms ir saistīts ar transkripcijas faktoriem. T-bet un STAT4 ekspresija, ko nosaka IFNy, vada T šūnu diferenciāciju pa Th1 ceļu un nomāc Th2 attīstību. IL-4 inducē GATA-3 un STAT6 ekspresiju, kas attiecīgi nodrošina naiva THO pārvēršanu Th2 šūnās (7.2. Att.).

Pēdējos gados ir aprakstīta īpaša palīgu T šūnu (Th17) apakšpopulācija, kas ražo IL-17. IL-17 ģimenes locekļus var ekspresēt ar aktivizētām atmiņas šūnām (CD4 CD45RO), u5T šūnām, NKT šūnām, neitrofiliem, monocītiem IL-23, IL-6, TGFβ ietekmē, ko ražo makrofāgi un dendritiskās šūnas. Galvenais diferencējošais faktors cilvēkiem ir ROR-C, pelēm-ROR-γ l Ir parādīta IL-17 kardinālā loma hroniska iekaisuma un autoimūnas patoloģijas attīstībā (sk. 7.2. Att.).

Turklāt aizkrūts dziedzera T-limfocīti var diferencēties dabiskās regulējošās šūnās (Treg), kas ekspresē virsmas marķierus CD4 + CD25 + un transkripcijas faktoru FOXP3. Šīs šūnas spēj nomākt imūnreakciju, ko mediē Th1 un Th2 šūnas, izmantojot tiešu starpšūnu kontaktu un TGFβ un IL-10 sintēzi.

Diferenciācijas shēmas Th0 kloniem un to izdalītajiem citokīniem ir parādītas attēlā. 7.2 un 7.3 (sk. Arī krāsu ieliktni).

T-citotoksiskās šūnas (CD8 +), dabiskās slepkavas šūnas ir vāji citokīnu, piemēram, interferonu, TNF-a un limfotoksīnu, ražotāji.

Pārmērīga vienas Th apakšpopulācijas aktivizēšana var noteikt viena imūnās atbildes varianta attīstību. Hroniska Th aktivācijas nelīdzsvarotība var izraisīt tādu imūnpatoloģisku stāvokļu veidošanos, kas saistīti ar

alerģija, autoimūna patoloģija, hroniski iekaisuma procesi utt.

Rīsi. 7.2. Dažādas T-limfocītu apakšpopulācijas, kas ražo citokīnus

II. Iedzimtajā imunitātes sistēmā galvenie citokīnu ražotāji ir mieloīdās šūnas. Ar Toll līdzīgu receptoru (TLR) palīdzību viņi atpazīst dažādu patogēnu līdzīgas molekulārās struktūras, tā sauktos ar patogēniem saistītos molekulāros modeļus (RAMP), piemēram, gramnegatīvu baktēriju lipopolisaharīdus (LPS), lipoteikoīnskābes, grampozitīvu mikroorganismu peptidoglikāni, flagellīns, DNS, kas bagāta ar G atkārtojumiem utt.

Šī mijiedarbība ar TLR izraisa intracelulāru signālu pārraides kaskādi, kas noved pie divu galveno citokīnu grupu gēnu ekspresijas: pretiekaisuma un IFN tipa 1 (7.4. Att., Skat. Arī krāsu ielaidumu). Galvenokārt šie citokīni (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, chemokines uc) izraisa iekaisuma attīstību un ir iesaistīti ķermeņa aizsardzībā pret baktēriju un vīrusu infekcijām.

Rīsi. 7.3. TH1 un TH2 šūnu izdalīto citokīnu spektrs

III. Šūnas, kas nepieder pie imūnsistēmas (saistaudu šūnas, epitēlijs, endotēlijs) konstitutīvi izdala autokrīnās augšanas faktorus (FGF, EGF, TGFR uc). un citokīni, kas atbalsta asinsrades šūnu proliferāciju.

Citokīni un to antagonisti ir detalizēti aprakstītas vairākās monogrāfijās (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Rīsi. 7.4. TLR mediēta citokīnu ražošanas indukcija ar iedzimtām imūnām šūnām

Citokīnu pārmērīga ekspresija organismam nav droša un var izraisīt pārmērīgu iekaisuma reakciju - akūtas fāzes reakciju. Proinflammatorisku citokīnu ražošanas regulēšanā ir iesaistīti dažādi inhibitori. Tādējādi ir aprakstītas vairākas vielas, kas nespecifiski saista citokīnu IL-1 un novērš tā bioloģiskās iedarbības izpausmi (a2-makroglobulīns, komplementa C3 sastāvdaļa, uromodulīns). Pie specifiskiem IL-1 inhibitoriem pieder šķīstošie mānekļa receptori, antivielas un IL-1 receptoru antagonists (IL-1RA). Attīstoties iekaisumam, palielinās IL-1RA gēna ekspresija. Bet pat normāli šis antagonists asinīs ir augstā koncentrācijā (līdz 1 ng / ml vai vairāk), bloķējot endogēnā IL-1 darbību.

Mērķa šūnas

Citokīnu iedarbību uz mērķa šūnām nodrošina specifiski receptori, kas saistās ar citokīniem ar ļoti augstu afinitāti, un atsevišķi citokīni var izmantot

parastās receptoru apakšvienības. Katrs citokīns saistās ar savu specifisko receptoru.

Citokīnu receptori ir transmembrānas olbaltumvielas, un tie ir sadalīti 5 galvenajos veidos. Visizplatītākais ir tā sauktais hematopoetīna tipa receptors, kuram ir divi ārpusšūnu domēni, no kuriem viens satur kopīgu aminoskābju atlikumu secību divos triptofāna un serīna atkārtojumos, atdalot tos ar jebkuru aminoskābi (WSXWS motīvs). Otrajam receptora tipam var būt divi ārpusšūnu domēni ar lielu skaitu konservētu cisteīnu. Tie ir IL-10 un IFN saimes receptori. Trešo tipu attēlo citokīnu receptori, kas pieder TNF grupai. Ceturtais citokīnu receptoru veids pieder imūnglobulīna receptoru superģimenei ar ārpusšūnu domēniem, kas pēc struktūras atgādina imūnglobulīna molekulu domēnus. Piekto receptora veidu, kas saista ķīmokīnu grupas molekulas, attēlo transmembrānas olbaltumvielas, kas šķērso šūnu membrānu 7 vietās. Citokīnu receptori var pastāvēt šķīstošā formā, saglabājot spēju saistīt ligandus (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokīni spēj ietekmēt mērķa šūnu proliferāciju, diferenciāciju, funkcionālo aktivitāti un apoptozi (sk. 7.1. Attēlu). Citokīnu bioloģiskās aktivitātes izpausme mērķa šūnās ir atkarīga no dažādu intracelulāro sistēmu līdzdalības signāla pārraidē no receptoru, kas ir saistīta ar mērķa šūnu īpašībām. Signāls apoptozei cita starpā tiek veikts, izmantojot īpašu TNF receptoru saimes reģionu, tā saukto “nāves” domēnu (7.5. Att., Skat. Krāsu ielaidumu). Diferenciācijas un aktivizēšanas signāli tiek pārraidīti caur intracelulārajiem Jak -STAT proteīniem - signālu devējiem un transkripcijas aktivatoriem (7.6. Att., Skat. Krāsu ielaidumu). G-proteīni ir iesaistīti signalizācijā no ķīmokīniem, kas palielina migrāciju un šūnu saķeri.

Visaptveroša citokīnu sistēmas analīze ietver sekojošo.

I. Ražotāju šūnu novērtēšana.

1. Izteiksmes noteikšana:

Receptori, kas atpazīst patogēnu vai antigēnu TCR, TLR) gēnu un olbaltumvielu molekulu līmenī (PCR, plūsmas citometrija);

Adaptera molekulas, kas vada signālu, kas izraisa citokīnu gēnu transkripciju (PCR utt.);

Rīsi. 7.5. Signāla pārraide no TNF receptoru

Rīsi. 7.6. Jak -STAT - signalizācijas ceļš no 1. tipa citokīnu receptoriem

Citokīnu gēni (PCR); citokīnu proteīnu molekulas (cilvēka mononukleāro šūnu citokīnu sintēzes funkcijas novērtējums).

2. Šūnu apakšpopulāciju, kas satur noteiktus citokīnus, kvantitatīva noteikšana: Th1, Th2 Th17 (citokīnu intracelulārās krāsošanas metode); šūnu skaita noteikšana, kas izdala noteiktus citokīnus (ELISPOT metode, sk. 4. nodaļu).

II. Citokīnu un to antagonistu novērtēšana ķermeņa bioloģiskajā vidē.

1. Citokīnu bioloģiskās aktivitātes pārbaude.

2. Citokīnu kvantitatīva noteikšana, izmantojot ELISA.

3. Citokīnu imūnhistoķīmiskā krāsošana audos.

4. Pretējo citokīnu (pretiekaisuma un pretiekaisuma), citokīnu un citokīnu receptoru antagonistu attiecības noteikšana.

III. Mērķa šūnu novērtēšana.

1. Citokīnu receptoru ekspresijas noteikšana gēnu un olbaltumvielu molekulu līmenī (PCR, plūsmas citometrijas metode).

2. Signalizējošo molekulu noteikšana intracelulārajā saturā.

3. Mērķa šūnu funkcionālās aktivitātes noteikšana.

Pašlaik ir izstrādātas daudzas metodes citokīnu sistēmas novērtēšanai, kas sniedz daudzveidīgu informāciju. Starp tiem izšķir:

1) molekulārās bioloģiskās metodes;

2) metodes citokīnu kvantitatīvai noteikšanai, izmantojot imūnanalīzi;

3) citokīnu bioloģiskās aktivitātes pārbaude;

4) citokīnu intracelulārā krāsošana;

5) ELISPOT metode, kas ļauj noteikt citokīnus ap vienu citokīnu ražojošu šūnu;

6) imūnfluorescence.

Šeit ir īss šo metožu apraksts.

Izmantojot molekulārās bioloģiskās metodes ir iespējams pētīt citokīnu gēnu ekspresiju, to receptorus, signalizācijas molekulas, pētīt šo gēnu polimorfismu. Pēdējos gados ir veikts liels skaits pētījumu, kas atklāja saistību starp citokīnu sistēmas molekulu gēnu alēļu variantiem un noslieci

pret vairākām slimībām. Citokīnu gēnu alēlisko variantu izpēte var sniegt informāciju par konkrēta citokīna ģenētiski ieprogrammētu ražošanu. Visjutīgākā ir reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija-RT-PCR (sk. 6. nodaļu). Hibridizācijas metode in situļauj noskaidrot citokīnu gēnu ekspresijas audu un šūnu lokalizāciju.

Citokīnu kvantitatīvo noteikšanu bioloģiskajos šķidrumos un perifēro asiņu mononukleāro šūnu kultūrās, izmantojot ELISA, var raksturot šādi. Tā kā citokīni ir vietējie mediatori, ir lietderīgāk izmērīt to līmeni attiecīgajos audos pēc audu proteīnu ekstrakcijas vai dabīgos šķidrumos, piemēram, asarās, skalošanās no dobumiem, urīna, amnija šķidruma, cerebrospināla šķidruma utt. Citokīnu līmenis serumā vai citos ķermeņa šķidrumos atspoguļo imūnsistēmas pašreizējo stāvokli, t.i. citokīnu sintēze ķermeņa šūnās in vivo.

Citokīnu ražošanas līmeņu noteikšana ar perifēro asiņu mononukleārajām šūnām (MNC) parāda šūnu funkcionālo stāvokli. Spontāna MNC citokīnu ražošana kultūrā norāda, ka šūnas jau ir aktivizētas in vivo. Citokīnu sintēze (ko izraisa dažādi stimulatori, mitogēni) atspoguļo šūnu potenciālu, rezerves spēju reaģēt uz antigēnu stimulu (jo īpaši uz zāļu iedarbību). Samazināta inducētā citokīnu ražošana var kalpot kā viena no imūndeficīta stāvokļa pazīmēm. Citokīni nav specifiski konkrētam antigēnam. Tāpēc infekcijas, autoimūnu un alerģisku slimību specifiska diagnoze, nosakot noteiktu citokīnu līmeni, nav iespējama. Tajā pašā laikā citokīnu līmeņa novērtēšana ļauj iegūt datus par iekaisuma procesa smagumu, tā pāreju uz sistēmisko līmeni un prognozi, imūnsistēmas šūnu funkcionālo aktivitāti, Th1 un Th2 šūnu attiecību. ir ļoti svarīga vairāku infekcijas un imūnpatoloģisko procesu diferenciāldiagnozē.

Bioloģiskajā vidē citokīnus var noteikt, izmantojot dažādus imūnanalīzes metodes, izmantojot poliklonālās un monoklonālās antivielas (sk. 4. nodaļu). ELISA ļauj noskaidrot precīzu citokīnu koncentrāciju bioloģiskajā

loģiski ķermeņa šķidrumi. Ar enzīmu saistītam citokīnu imūnsorbcijas testam ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar citām metodēm (augsta jutība, specifiskums, neatkarība no antagonistu klātbūtnes, precīzas automatizētas uzskaites iespēja, grāmatvedības standartizācija). Tomēr šai metodei ir arī ierobežojumi: ELISA neraksturo citokīnu bioloģisko aktivitāti, tā var sniegt nepatiesus rezultātus, reaģējot uz epitopiem.

Bioloģiskā pārbaude veic, pamatojoties uz zināšanām par citokīnu pamatīpašībām, to iedarbību uz mērķa šūnām. Citokīnu bioloģiskās iedarbības izpēte ļāva izstrādāt četru veidu citokīnu testēšanu:

1) izraisot mērķa šūnu proliferāciju;

2) pēc citotoksiskas iedarbības;

3) izraisot kaulu smadzeņu priekšteču diferenciāciju;

4) pretvīrusu iedarbībai.

IL-1 nosaka stimulējošā ietekme uz peles timocītu proliferāciju, ko aktivizē mitogēns in vitro; IL -2 - ar spēju stimulēt limfoblastu proliferācijas aktivitāti; Tiek pārbaudīta TNFα un limfotoksīnu citotoksiskā iedarbība uz peles fibroblastiem (L929). Koloniju stimulējošos faktorus novērtē pēc to spējas atbalstīt kaulu smadzeņu priekšteču augšanu koloniju veidā agarā. IFN pretvīrusu aktivitāti nosaka, kavējot vīrusu citopātisko iedarbību cilvēka diploīdu fibroblastu kultūrā un peļu fibroblastu audzēja līnijā L-929.

Ir izveidotas šūnu līnijas, kuru augšana ir atkarīga no noteiktu citokīnu klātbūtnes. Tabula 7.1 ir šūnu līniju saraksts, ko izmanto citokīnu testēšanai. Atkarībā no spējas izraisīt jutīgu mērķa šūnu proliferāciju, tiek veikta IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 uc biotestēšana. Tomēr šīs testēšanas metodes nav pietiekami jutīgi un informatīvi. Inhibitoru un antagonistu molekulas var maskēt citokīnu bioloģisko aktivitāti. Vairākiem citokīniem piemīt vispārēja bioloģiskā aktivitāte. Tomēr šīs metodes ir ideāli piemērotas rekombinanto citokīnu specifiskās aktivitātes pārbaudei.

7.1. Tabula.Šūnu līnijas, ko izmanto, lai pārbaudītu citokīnu bioloģisko aktivitāti

Tabulas beigas. 7.1

Laboratorija 7-1

IL-1 bioloģiskās aktivitātes noteikšana, izmantojot komitogēnu ietekmi uz peles timocītu proliferāciju

IL-1 bioloģiskās pārbaudes metodes pamatā ir citokīna spēja stimulēt peles timocītu proliferāciju.

IL-1 var noteikt ar LPS stimulētu monocītu kultūrā, kā arī jebkurā ķermeņa bioloģiskajā šķidrumā. Nepieciešams pievērst uzmanību vairākām detaļām.

1. Testēšanai izmanto C3H / HeJ peļu timocītus, ko stimulē proliferācija ar mitogēniem (konkanavalīns A - ConA un fitohemaglutinīns - PHA). Timocīti C3H / HeJ netika izvēlēti nejauši: šīs inbred līnijas peles nereaģē uz LPS, kas var būt testa materiālā un izraisīt IL-1 veidošanos.

2. Timocīti reaģē uz IL-2 un mitogēniem, tādēļ IL-2 un mitogēnu klātbūtne jānosaka arī IL-1 pārbaudītajos preparātos.

Darbības procedūra

1. Iegūstiet timocītu suspensiju koncentrācijā 12 × 10 6 / ml barotnes RPMI 1640, kas satur 10% govju embriju seruma un 2 -merkaptoetanolu (5 × 10 -5 M).

2. Sagatavojiet virkni secīgu divkāršu eksperimentālo (bioloģisko ķermeņa šķidrumu) un kontroles paraugu atšķaidījumu. Par kontroli izmanto bioloģiskos šķidrumus, kas satur IL-1, vai paraugus, kas iegūti, inkubējot mononukleārās šūnas bez LPS, un laboratorijas standarta IL-1 saturošu preparātu. 96 bedrīšu apaļā dibena plāksnēs 50 μl no katra atšķaidījuma pārnes 6 iedobēs.

3. Katrā atšķaidījuma trīs iedobēs pievieno 50 μl attīrīta PHA (Wellcome), kas izšķīdināts pilnā barotnē 3 μg / ml koncentrācijā, bet pārējās 3 iedobēs - 50 μl barotnes.

4. Katrai iedobei pievieno 50 μl timocītu suspensijas un 48 stundas inkubē 37 ° C temperatūrā.

6. Pirms audzēšanas beigām iedobēm pievieno 50 μl ["3H] -timidīna šķīduma (1 μCi / ml) un inkubē vēl 20 stundas.

7. Lai noteiktu radioaktivitātes līmeni, kultūras šūnas, izmantojot automātisko šūnu savācēju, pārnes uz filtrpapīru, filtrus žāvē un marķējuma iekļaušanu nosaka ar šķidruma scintilācijas skaitītāju.

8. Rezultāti tiek izteikti kā stimulējošs faktors.

kur m cp ir vidējais impulsu skaits 3 caurumos.

Ja timocīti reaģē uz stimulāciju ar standarta IL-1, tad testa parauga stimulācijas indekss, kas pārsniedz 3, ticami norāda uz IL-1 aktivitāti.

Biotests ir vienīgā metode citokīnu funkcijas novērtēšanai, taču šī metode jāpapildina ar dažāda veida atbilstošu specifiskuma kontroli, izmantojot monoklonālās antivielas. Dažu monoklonālu antivielu pievienošana citokīnam kultūrā bloķē citokīna bioloģisko aktivitāti, kas pierāda, ka konstatētais citokīns kalpo kā signāls šūnu līnijas proliferācijai.

Biotesta izmantošana interferona noteikšanai. IFN bioloģiskās aktivitātes novērtēšanas princips ir balstīts uz tā pretvīrusu iedarbību, ko nosaka testa vīrusa pavairošanas kavēšanas pakāpe šūnu kultūrā.

Šajā darbā var izmantot šūnas, kas ir jutīgas pret IFN iedarbību: galvenokārt ar vistu un cilvēka embriju tripsinizētām fibroblastu šūnām, transplantētām cilvēka diploīdu fibroblastu šūnām un peles šūnu kultūru (L929).

Novērtējot IFN pretvīrusu iedarbību, ieteicams izmantot vīrusus ar īsu reprodukcijas ciklu, augstu jutību pret IFN darbību: peles encefalomielīta vīruss, peles vezikulārais stomatīts utt.

Laboratorija 7-2

Interferona aktivitātes noteikšana

1. Cilvēka augļa diploīdo fibroblastu suspensiju uz barotnes ar 10% liellopu embriju serumu (šūnu koncentrācija-15-20 × 10 6 / ml) ielej sterilās 96 iedobju plakanas dibena plāksnēs, 100 μl iedobē un ievieto CO 2 inkubatorā 37 ° C temperatūrā.

2. Pēc pilnīga viena slāņa veidošanās augšanas barotni izņem no iedobēm un katrai iedobei pievieno 100 µl nesēja.

3. IFN aktivitātes titrēšanu testa paraugos veic ar divkāršas atšķaidīšanas metodi uz viena fibroblastu slāņa.

Vienlaikus ar paraugiem pelēm encefalomielīta vīruss (VEM) tiek ievadīts iedobēs tādā devā, kas izraisa 100% šūnu bojājumu 48 stundas pēc inficēšanās.

4. Kontrolei izmantojiet iedobes ar neskartām (neapstrādātām) šūnām, kas inficētas ar vīrusu.

Katrā pētījumā kā atsauces zāles tiek izmantoti atsauces IFN paraugi ar zināmu aktivitāti.

5. Plāksnes ar atšķaidītu paraugu 24 stundas inkubē 37 ° C temperatūrā atmosfērā ar 5% CO 2.

6. IFN aktivitātes līmeni nosaka ar testa parauga maksimālā atšķaidījuma reciproku, kas par 50%kavē vīrusa citopātisko iedarbību, un to izsaka aktivitātes vienībās uz ml.

7. Lai noteiktu IFN tipu, sistēmai pievieno antiserumu pret IFNα, IFNβ vai IFNγ. Antiserums atceļ atbilstošā citokīna darbību, kas ļauj identificēt IFN tipu.

Inhibējošā faktora migrācijas bioloģiskās aktivitātes noteikšana. Pašlaik ir izveidojušās pilnīgi jaunas idejas par MĪTA dabu un īpašībām, kas tika atklātas pagājušā gadsimta 60. gados kā šūnu imunitātes starpnieks un daudzus gadus palika bez pienācīgas uzmanības (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; Deivids JR, 1966). Tikai pēdējo 10-15 gadu laikā ir kļuvis skaidrs: MĪTS ir viens no svarīgākajiem organisma bioloģiskajiem mediatoriem ar plašu citokīna, hormona un fermenta bioloģisko funkciju klāstu. MIF iedarbība uz mērķa šūnām tiek realizēta caur CD74 receptoru vai ar neklasisku endocitozes ceļu.

MĪTS tiek uzskatīts par svarīgu iekaisuma starpnieku, kas aktivizē makrofāgu darbību (citokīnu ražošana, fagocitoze, citotoksicitāte utt.), Kā arī endogēnu imūnregulējošu hormonu, kas modulē glikokortikoīdu aktivitāti.

Arvien vairāk tiek uzkrāta informācija par MIF lomu daudzu iekaisuma slimību, tostarp sepse, reimatoīdā artrīta (RA), glomerulonefrīta uc, patoģenēzē. RA gadījumā ievērojami palielinās MIF koncentrācija skarto locītavu šķidrumā, kas korelē ar slimības smagumu. MYTH ietekmē palielinās gan makrofāgu, gan sinoviālo šūnu pro-iekaisuma citokīnu ražošana.

Ir zināmas dažādas metodes MIF aktivitātes pārbaudei, kad migrējošās šūnas (MIF mērķa šūnas) ievieto stikla kapilārā (kapilāru tests), agarozes pilienā vai agarozes iedobē.

Mēs piedāvājam salīdzinoši vienkāršu skrīninga metodi, kuras pamatā ir šūnu mikrokultūru (leikocītu vai makrofāgu) veidošanās standarta platība un šūnu skaits 96 bedrīšu plakanas dibena plāksnes iedobju apakšā, kam seko to audzēšana barības vidē un nosakot izmaiņas šo mikrokultūru apgabalā MIF ietekmē (Suslov A.P., 1989).

Laboratorija 7-3

MĪTA aktivitātes definīcija

MIF bioloģiskās aktivitātes noteikšana tiek veikta, izmantojot ierīci šūnu mikrokultūru veidošanai (7.7.att.) - MIGROSKRIN (NF Gamaleya RAMS nosauktais Epidemioloģijas un mikrobioloģijas pētniecības institūts).

1. 96 iedobju plāksnes iedobēs (Flow, UK vai tamlīdzīgi) pievieno 100 μl parauga, kas atšķaidīts barotnē, kurā nosaka MYTH aktivitāti (katrs atšķaidījums 4 paralēlēs, eksperimentālie paraugi). Barotne satur RPMI 1640, 2 mM L-glutamīnu, 5% liellopu augļa serumu, 40 μg / ml gentamicīna.

2. Pievienojiet barotni (4 paralēlēs) kontrol iedobēm, katrā 100 µl.

3. Sagatavojiet peritoneālo makrofāgu šūnu suspensiju, kurai 2 hibrīda pelēm (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitoneāli injicē 10 ml Hanksa šķīduma ar heparīnu (10 V / ml), maigi iemasējiet vēderu 2-3 minūtes. Pēc tam dzīvnieks tiek nokauts, nokaujot galvu, vēdera sienu uzmanīgi izurbj cirkšņa zonā un eksudātu ar šļirci izsūc caur adatu. Peritoneālās eksudāta šūnas divas reizes mazgā ar Hanksa šķīdumu, centrifugē 10-15 minūtes ar 200 g. Pēc tam sagatavo šūnu suspensiju ar RPMI 1640 barotnes koncentrāciju 10 ± 1 miljons / ml.Skaitīšanu veic Gorjajeva kamerā.

4. Samontējiet MIGROSKRIN sistēmu, kas ir statīvs uzgaļu mērķtiecīgai un standarta fiksēšanai ar šūnu kultūrām stingri vertikālā stāvoklī noteiktā augstumā virs 96 iedobju kultūras plāksnes iedobes centra, kā arī ietver 92 uzgaļus automātiska pipete no Costar, ASV (7.7. att.).

Ievietojiet statīva kājas plāksnes stūra iedobēs. Šūnu suspensiju ar automātisku pipeti ņem galos - katrā 5 μl, noskalo no liekām šūnām ar vienu iegremdēšanu barotnē un ievieto vertikāli sistēmas statīva ligzdās. Piepildītais statīvs ar uzgaļiem tiek turēts istabas temperatūrā 1 stundu uz stingri horizontālas virsmas. Šajā laikā suspensijas šūnas nogulsnējas iedobju apakšā, kur veidojas standarta šūnu mikrokultūras.

5. Uzgaļu plaukts tiek rūpīgi noņemts no plāksnes. Plāksne ar šūnu mikrokultūru tiek ievietota stingri horizontālā stāvoklī CO 2 inkubatorā, kur to kultivē 20 stundas.Audzēšanas laikā šūnas migrē pa iedobes dibenu.

6. Rezultātu kvantitatīvu reģistrēšanu pēc inkubācijas veic ar binokulāro lupu, vizuāli novērtējot kolonijas lielumu skalā okulāra iekšpusē. Mikrokultūras ir apļveida. Pēc tam pētnieki nosaka koloniju vidējo diametru no koloniju mērījumiem 4 testa vai kontroles iedobēs. Mērījumu kļūda ir ± 1 mm.

Migrācijas indeksu (MI) aprēķina pēc formulas:

Paraugam ir MYTH aktivitāte, ja MI vērtības ir vienādas

Parastai MYTH aktivitātes vienībai (U) tiek ņemts reciproks, kas vienāds ar parauga (parauga) augstākā atšķaidījuma vērtību, pie kuras migrācijas indekss ir 0,6 ± 0,2.

FEO bioloģiskā aktivitāteα novērtē pēc tā citotoksiskās iedarbības uz transformēto fibroblastu līniju L-929. Rekombinantā TNFα tika izmantota kā pozitīva kontrole, un šūnas barotnē tika izmantotas kā negatīva kontrole.

Aprēķiniet citotoksisko indeksu (CI):

kur a- dzīvu šūnu skaits kontrolē; b- dzīvo šūnu skaits eksperimentā.

Rīsi. 7.7. MIGROSKRIN shēma - ierīces šūnu kultūru migrācijas kvantitatīvai noteikšanai

Šūnas iekrāso ar krāsvielu (metilēnzilo), kas tiek iestrādāta tikai atmirušajās šūnās.

Parauga savstarpējas atšķaidīšanas vērtību, kas nepieciešama, lai iegūtu 50% šūnu citotoksicitāti, uzskata par parastu TNF aktivitātes vienību. Parauga īpatnējā aktivitāte - aktivitātes attiecība patvaļīgās vienībās uz 1 ml pret paraugā esošā proteīna koncentrāciju.

Starpšūnu citokīnu krāsošana. Dažādu citokīnu ražojošo šūnu attiecības izmaiņas var atspoguļot slimības patoģenēzi un kalpot par kritēriju slimības prognozei un terapijas novērtēšanai.

Ar intracelulārās krāsošanas metodi nosaka citokīna ekspresiju vienas šūnas līmenī. Plūsmas citometrija ļauj saskaitīt šūnu skaitu, kas izsaka noteiktu citokīnu.

Uzskaitīsim galvenos intracelulāro citokīnu noteikšanas posmus.

Nestimulētas šūnas ražo nelielu daudzumu citokīnu, kas parasti netiek nogulsnēti; tāpēc svarīgs posms intracelulāro citokīnu novērtēšanā ir limfocītu stimulēšana un šo produktu izdalīšanās no šūnām bloķēšana.

Visbiežāk izmantotais citokīnu induktors ir proteīna kināzes C aktivators forbol-12-miristāts-13-acetāts (PMA) kombinācijā ar kalcija jonoforu jonomicīnu (IN). Šādas kombinācijas izmantošana izraisa plaša spektra citokīnu sintēzi: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. PMA-IN lietošanas trūkums ir CD4 molekulu noteikšanas problēma uz limfocītu virsmas pēc šādas aktivācijas. Arī T-limfocītu citokīnu ražošanu izraisa mitogēni (PHA). Stimulē B šūnas un monocīti

Mononukleārās šūnas 2-6 stundas inkubē citokīnu ražošanas induktoru un to intracelulārā transporta bloķētāja-brefeldīna A vai monenzīna-klātbūtnē.

Pēc tam šūnas atkārtoti suspendē buferšķīdumā. Fiksēšanai pievieno 2% formaldehīdu, inkubē 10-15 minūtes istabas temperatūrā.

Pēc tam šūnas apstrādā ar saponīnu, kas palielina šūnu membrānas caurlaidību, un iekrāso ar monoklonālajām antivielām, kas raksturīgas konstatētajiem citokīniem. Virsmas marķieru (CD4, CD8) iepriekšēja iekrāsošana palielina par šūnu iegūtās informācijas daudzumu un ļauj precīzāk noteikt tās populācijas identitāti.

Iepriekš aprakstīto metožu piemērošanai ir daži ierobežojumi. Tātad ar viņu palīdzību nav iespējams analizēt citokīnu sintēzi vienā šūnā, nav iespējams noteikt citokīnus ražojošo šūnu skaitu apakšpopulācijā, nav iespējams noteikt, vai citokīnus ražojošās šūnas izsaka unikālus marķierus, vai dažādus citokīnus sintezē dažādas šūnas vai vienas un tās pašas. Atbilde uz šiem jautājumiem tiek iegūta, izmantojot citas pētījumu metodes. Lai noteiktu citokīnus ražojošo šūnu biežumu populācijā, tiek izmantota atšķaidīšanas ierobežošanas metode un ar fermentu saistītā ELISPOT imūnsorbcijas testa variants (sk. 4. nodaļu).

In situ hibridizācijas metode. Metode ietver:

2) fiksācija ar paraformaldehīdu;

3) mRNS noteikšana, izmantojot marķētu cDNS. Dažos gadījumos citokīnu mRNS nosaka sekcijās, izmantojot radioizotopu PCR.

Imunofluorescence. Metode ietver:

1) ērģeļu sasaldēšana un kriostata sekciju sagatavošana;

2) fiksācija;

3) sekciju apstrāde ar fluoresceīnu iezīmētām anti-citokīnu antivielām;

4) vizuāla fluorescences novērošana.

Šīs metodes (hibridizācija in situ un imūnfluorescence) ir ātras un nav atkarīgas no izdalītā produkta sliekšņa koncentrācijas. Tomēr tie nenosaka izdalītā citokīnu daudzumu un var būt tehniski sarežģīti. Nepieciešama dažāda rūpīga nespecifisku reakciju uzraudzība.

Izmantojot piedāvātās citokīnu novērtēšanas metodes, tika identificēti patoloģiski procesi, kas saistīti ar citokīnu sistēmas traucējumiem dažādos līmeņos.

Tādējādi citokīnu sistēmas novērtējums ir ārkārtīgi svarīgs, lai raksturotu ķermeņa imūnsistēmas stāvokli. Dažādu citokīnu sistēmas līmeņu izpēte sniedz informāciju par dažāda veida imūnkompetentu šūnu funkcionālo aktivitāti, par iekaisuma procesa smagumu, par tā pāreju uz sistēmisko līmeni un par slimības prognozi.

Jautājumi un uzdevumi

1. Uzskaitiet citokīnu vispārīgās īpašības.

2. Norādiet citokīnu klasifikāciju.

3. Uzskaitiet citokīnu sistēmas galvenās sastāvdaļas.

4. Uzskaitiet citokīnus ražojošās šūnas.

5. Aprakstiet citokīnu receptoru ģimenes.

6. Kādi ir citokīnu tīkla darbības mehānismi?

7. Pastāstiet mums par citokīnu veidošanos iedzimtajā imūnsistēmā.

8. Kādas ir galvenās pieejas visaptverošam citokīnu sistēmas novērtējumam?

9. Kādas ir metodes citokīnu testēšanai ķermeņa šķidrumos?

10. Kādi ir citokīnu sistēmas defekti dažādās patoloģijās?

11. Kādas ir galvenās IL-1, IFN, MIF, TNFa bioloģisko testēšanas metodes bioloģiskajos šķidrumos?

12. Aprakstiet citokīnu intracelulārā satura noteikšanas procesu.

13. Aprakstiet vienas šūnas izdalīto citokīnu noteikšanas procesu.

14. Aprakstiet metožu secību, kas izmantota defekta noteikšanai citokīnu receptoru līmenī.

15. Aprakstiet metožu secību, kas izmantota defekta noteikšanai citokīnus ražojošo šūnu līmenī.

16. Kādu informāciju var iegūt, pārbaudot citokīnu veidošanos mononukleāro šūnu kultūrā, asins serumā?

Iekaisuma citokīni tiek sintezēti, izdalīti un caur receptoriem iedarbojas uz mērķa šūnām agrīnā iekaisuma stadijā, piedaloties specifiskas imūnreakcijas izraisīšanā, kā arī tās efektorfāzē. Zemāk mēs sniedzam īsu galveno pretiekaisuma citokīnu aprakstu.

IL-1 -savienojums, ko antigēnu stimulācijas laikā izdala monocīti, makrofāgi, Langerhansa šūnas, dendritiskās šūnas, keratinocīti, smadzeņu astrocīti un mikroglijas, endotēlija, epitēlija, mezoteliālās šūnas, fibroblasti, NK-limfocīti, neitrofīli, B-šūnu limfocīti, C šūnas u.c. Aptuveni 10% bazofilu un tuklo šūnu ražo arī IL-1. Šie fakti norāda, ka IL-1 var izdalīties tieši asinīs, audu šķidrumā un limfā. Visas šūnas, kurās veidojas šis citokīns, nespēj spontāni sintezēt IL-1 un reaģē ar tās ražošanu un sekrēciju, reaģējot uz infekcijas un iekaisuma izraisītāju, mikrobu toksīnu, dažādu citokīnu, aktīvo komplementu fragmentu, dažu aktīvo asinsreces faktoru iedarbību. , un citi. A. Bellau figurālajā izteiksmē IL-1 ir molekulu saime visiem gadījumiem. IL -1 ir sadalīts 2 frakcijās - a un b, kas ir dažādu gēnu produkti, bet kurām ir līdzīgas bioloģiskās īpašības. Abas šīs formas veidojas no atbilstošajām prekursoru molekulām ar vienādu molekulmasu - 31 kDa. Bioķīmisko pārvērtību rezultātā galu galā veidojas vienas ķēdes bioloģiski aktīvi polipeptīdi ar molekulmasu 17,5 kDa. Gandrīz viss IL-1a paliek šūnā vai saistās ar membrānu. Atšķirībā no IL-1a, šūnas aktīvi izdala IL-1b, un tā ir galvenā IL-1 sekrēcijas forma cilvēkiem. Tajā pašā laikā abiem interleikīniem ir vienāds bioloģiskās aktivitātes spektrs un tie konkurē par saistīšanos ar vienu un to pašu receptoru. Tomēr jāpatur prātā, ka IL-1a galvenokārt ir vietējo aizsardzības reakciju starpnieks, savukārt IL-1b darbojas gan vietējā, gan sistēmiskā līmenī. Eksperimenti ar rekombinanto IL-1 parādīja, ka šim citokīnam ir vismaz 50 dažādas funkcijas, un mērķi ir gandrīz visu orgānu un audu šūnas. IL-1 ietekme galvenokārt ir vērsta uz Th1, lai gan tā spēj stimulēt Th2 un B-limfocītus. Kaulu smadzenēs tās ietekmē palielinās hematopoētisko šūnu skaits, kas atrodas mitozes stadijā. IL-1 var iedarboties uz neitrofiliem, uzlabojot to kustību aktivitāti un tādējādi veicinot fagocitozi. Šis citokīns ir iesaistīts endotēlija un asins koagulācijas sistēmas funkciju regulēšanā, izraisot prokoagulantu aktivitāti, pretiekaisuma citokīnu sintēzi un lipīgo molekulu ekspresiju uz endotēlija virsmas, kas nodrošina neitrofilu ripināšanu un piesaisti. limfocīti, kā rezultātā asinsvadu gultnē attīstās leikopēnija un neitropēnija. Darbojoties uz aknu šūnām, tas stimulē akūtas fāzes proteīnu veidošanos. Tika konstatēts, ka IL-1 ir galvenais starpnieks vietējā iekaisuma un akūtas fāzes reakcijas attīstībā ķermeņa līmenī. Turklāt tas paātrina asinsvadu augšanu pēc bojājumiem. IL-1 ietekmē asinīs samazinās dzelzs un cinka koncentrācija un palielinās nātrija izdalīšanās. Visbeidzot, nesen tika atklāts, ka IL-1 spēj palielināt cirkulējošā slāpekļa oksīda daudzumu. Ir zināms, ka pēdējam ir ārkārtīgi svarīga loma asinsspiediena regulēšanā, tas veicina trombocītu sadalīšanos un uzlabo fibrinolīzi. Jāatzīmē, ka IL-1 ietekmē tiek pastiprināta neitrofilu un limfocītu rozetu veidošanās ar trombocītiem, kam ir svarīga loma nespecifiskās rezistences, imunitātes un hemostāzes ieviešanā (Yu.A. Vitkovsky). Tas viss liek domāt, ka IL-1 stimulē visa ķermeņa aizsargreakciju kompleksa attīstību, kura mērķis ir ierobežot infekcijas izplatīšanos, iznīcināt iebrukušos mikroorganismus un atjaunot bojāto audu integritāti. IL-1 ietekmē hondrocītus, osteoklastus, fibroblastus un aizkuņģa dziedzera b-šūnas. Tās ietekmē palielinās insulīna, AKTH un kortizola sekrēcija. IL-1b vai TNFa pievienošana hipofīzes šūnu primārajai kultūrai samazina vairogdziedzera stimulējošā hormona sekrēciju.

IL-1 tiek ražots centrālajā nervu sistēmā, kur tas var darboties kā raidītājs. IL-1 ietekmē rodas miegs, ko papildina a-ritma (lēna viļņa miega) klātbūtne. Tas arī veicina nervu augšanas faktora sintēzi un sekrēciju, ko veic astrocīti. Ir pierādīts, ka IL-1 saturs palielinās līdz ar muskuļu darbu. IL-1 ietekmē tiek pastiprināta pati IL-1, kā arī IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 un TNFa ražošana. Pēdējais turklāt izraisa IL-1, IL-6 un IL-8 sintēzi.

Daudzi IL-1 pretiekaisuma efekti tiek veikti kombinācijā ar TNFa un IL-6: drudža indukcija, anoreksija, ietekme uz asinsradi, dalība nespecifiskā pretinfekcijas aizsardzībā, akūtas fāzes proteīnu sekrēcija un citi (AS Simbirtsev ).

IL-6- monomērs ar molekulmasu 19-34 kDa. To ražo stimulēti monocīti, makrofāgi, endoteliocīti, Th2, fibroblasti, hepatocīti, Sertoli šūnas, nervu sistēmas šūnas, tirocīti, Langerhansa saliņu šūnas utt. Kopā ar IL-4 un IL-10 tas nodrošina B-limfocītu augšanu un diferenciāciju, veicinot pēdējo pāreju uz antivielām. Turklāt tas, tāpat kā IL-1, stimulē hepatocītus, izraisot akūtas fāzes proteīnu veidošanos. IL-6 iedarbojas uz asinsrades cilmes šūnām un jo īpaši stimulē megakariocitopoēzi. Šim savienojumam ir pretvīrusu aktivitāte. Ir citokīni, kas pieder pie IL-6 saimes-onkostatīns M (OnM), faktors, kas kavē leikēmiju, ciliārais neirotropiskais faktors, kardiotropīns-1. Viņu ietekme neietekmē imūnsistēmu. IL-6 ģimene ietekmē embriju cilmes šūnas, izraisa miokarda hipertrofiju, CWA sintēzi, mielomas šūnu un asinsrades cilmes šūnu proliferācijas saglabāšanu, makrofāgu, osteoklastu, nervu šūnu diferenciāciju, paaugstinātu trombocitopoēzi utt.

Jāatzīmē, ka pelēm ar mērķtiecīgu gēna, kas kodē IL-6 citokīnu saimes receptoru komponentu, inaktivāciju (nokautēšanu) dažādās ķermeņa sistēmās rodas daudzas novirzes, kas nav saderīgas ar dzīvību. Līdz ar kardioģenēzes traucējumiem šādu peļu embrijos strauji samazinās dažādu asinsrades rindu cilmes šūnu skaits, kā arī strauji samazinās aizkrūts dziedzera izmērs. Šie fakti norāda uz IL-6 ārkārtējo nozīmi fizioloģisko funkciju regulēšanā (A.A. Yarilin).

Starp iekaisuma citokīniem, kas darbojas kā sinerģisti, pastāv ļoti sarežģītas savstarpēji regulējošas attiecības. Tādējādi IL-6 kavē IL-1 un TNFa ražošanu, lai gan abi šie citokīni ir IL-6 sintēzes induktori. Turklāt IL-6, iedarbojoties uz hipotalāma-hipofīzes sistēmu, palielina kortizola ražošanu, kas kavē IL-6 gēna, kā arī citu iekaisuma veicinošu citokīnu gēnu ekspresiju.

IL-6 saime ietver arī onkotostīns M (OnM), kam ir ārkārtīgi plašs darbības spektrs. Tā molekulmasa ir 28 kDa. Tika konstatēts, ka OnM spēj kavēt vairāku audzēju augšanu. Tas stimulē plazminogēna aktivatora, vasoaktīvo zarnu peptīdu un CWA veidošanos IL-6. No iepriekš minētā izriet, ka OnM vajadzētu būt svarīga loma imūnās atbildes, asins koagulācijas un fibrinolīzes regulēšanā.

IL-8 pieder pie tā saukto ķemokīnu saimes, kas stimulē ķīmotaksi un ķīmokinēzi un ir līdz 60 atsevišķām vielām ar savām strukturālajām un bioloģiskajām īpašībām. Nobriedis IL-8 pastāv vairākās formās, kas atšķiras pēc polipeptīda ķēdes garuma. Vienas vai otras formas veidošanās ir atkarīga no specifiskām proteāzēm, kas iedarbojas uz glikozilētās prekursora molekulas N-galu. Atkarībā no tā, kuras šūnas sintezē IL-8, tas satur atšķirīgu skaitu aminoskābju. Vislielākā bioloģiskā aktivitāte ir IL-8 formā, kas sastāv no 72 aminoskābēm (A.S. Simbirtsev).

IL-8 atbrīvo polimorfonukleārie leikocīti, monocīti, makrofāgi, megakariocīti, neitrofīli, T-limfocīti (Tx), fibroblasti, hondrocīti, keratinocīti, endotēlija un epitēlija šūnas, hepatocīti un mikroglijas.

IL-8 tiek ražots, reaģējot uz bioloģiski aktīvo savienojumu darbību, ieskaitot pretiekaisuma citokīnus, kā arī IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, dažādus mitogēnus, lipopolisaharīdus, lektīnus un vīrusu sabrukšanas produktus, savukārt pretiekaisuma citokīni (IL-4, IL-10) samazina IL-8 veidošanos. Tā aktivizēšana un izdalīšanās notiek arī trombīna, plazminogēna aktivatora, streptokināzes un tripsīna ietekmē, kas norāda uz ciešu saistību starp šī citokīna funkciju un hemostatisko sistēmu.

IL-8 sintēze tiek veikta, iedarbojoties uz dažādiem endogēniem vai eksogēniem stimuliem, kas rodas iekaisuma fokusā, attīstoties vietējai aizsardzības reakcijai uz patogēna ierosinātāja ievadīšanu. Šajā ziņā IL-8 ražošanai ir daudz līdzību ar citiem pretiekaisuma citokīniem. Tajā pašā laikā IL-8 sintēzi nomāc steroīdu hormoni-IL-4, IL-10, Ifa un Ifg.

IL-8 stimulē neitrofilu, bazofilu, T-limfocītu (mazākā mērā) un keratinocītu ķīmotaksi un ķīmokinēzi, izraisot šo šūnu degranulāciju. Ievadot intravaskulāri IL-8, rodas strauja un asa granulocitopēnija, kam seko neitrofilu līmeņa paaugstināšanās perifērās asinīs. Šajā gadījumā neitrofīli migrē uz aknām, liesu, plaušām, bet ne uz bojātiem audiem. Turklāt eksperiments ir parādījis, ka IL-8 intravenoza ievadīšana bloķē neitrofilu migrāciju iekaisuma intradermālajās zonās.

Nestimulētos neitrofilos IL-8 izraisa proteīna, kas saistīts ar B 12 vitamīnu, izdalīšanos no specifiskām granulām un želatināzi no sekrēcijas pūslīšiem. Azurofīlo granulu degranulācija neitrofilos notiek tikai pēc to stimulācijas ar citohalazīnu-B. Tajā pašā laikā tiek atbrīvota elastāze, mieloperoksidāze, b-glikoronidāze un citas elastāzes, un uz leikocītu membrānas notiek lipīgu molekulu ekspresija, nodrošinot neitrofilu mijiedarbību ar endotēliju. Jāatzīmē, ka IL-8 nespēj izraisīt elpošanas pārrāvumu, bet var pastiprināt citu ķīmisko vielu ietekmi uz šo procesu.

IL-8 spēj stimulēt angioģenēzi, aktivizējot proliferācijas procesus endotēlija šūnās un gludo muskuļu šūnās, kam ir svarīga loma audu atjaunošanā. Turklāt tas var kavēt IL-4 izraisītu IgE sintēzi.

Acīmredzot IL-8 ir svarīga loma gļotādu vietējā imunitātē. Veseliem cilvēkiem tas atrodams siekalu, asaru, sviedru dziedzeru sekrēcijās, jaunpienā. Ir konstatēts, ka gludās muskuļu šūnas cilvēka trahejā spēj radīt nenozīmīgu daudzumu IL-8. Bradikinīna ietekmē IL-8 ražošana palielinās 50 reizes. Olbaltumvielu sintēzes blokatori kavē IL-8 sintēzi. Ir pamats uzskatīt, ka lokāli IL-8 nodrošina aizsargreakciju gaitu, ja tiek pakļauta patogēnai florai augšējos elpceļos.

IL-12 atklāts pirms vairāk nekā desmit gadiem, bet tā īpašības ir pētītas tikai pēdējos gados. To ražo makrofāgi, monocīti, neitrofīli, dendritiskās šūnas un aktivētie B-limfocīti. Daudz mazākā mērā IL-12 spēj izdalīt keratinocītus, Langerhansa šūnas un atpūsties B-limfocītos. Turklāt to ražo mikrogliju šūnas un astrocīti, kas prasa to sadarbību. IL-12 ir heterodimērs, kas sastāv no divām kovalenti saistītām polipeptīdu ķēdēm: smagās (45 kDa) un vieglās (35 kDa). Bioloģiskā aktivitāte ir raksturīga tikai dimēram; katrai atsevišķai ķēdei nav līdzīgu īpašību.

Neskatoties uz to, NK, T-limfocīti (CD4 + un CD8 +) un, mazākā mērā, B-limfocīti joprojām ir galvenās IL-12 mērķa šūnas. Var uzskatīt, ka tas kalpo kā saikne starp makrofāgiem un monocītiem, veicinot Th1 un citotoksisko šūnu aktivitātes palielināšanos. Tādējādi šis citokīns sniedz būtisku ieguldījumu pretvīrusu un pretvēža aizsardzības nodrošināšanā. IL-12 sintēzes induktori ir mikrobu komponenti un pretiekaisuma citokīni.

IL-12 pieder heparīnu saistošiem citokīniem, kas liecina par tā līdzdalību hemostāzes procesā.

Pēdējos gados ir pierādīts, ka IL-12 ir galvenais citokīns, lai uzlabotu šūnu izraisīto imūnreakciju un efektīvu pretinfekcijas aizsardzību pret vīrusiem, baktērijām, sēnītēm un vienšūņiem. IL-12 aizsargājošo iedarbību uz infekcijām nodrošina ar Ifg atkarīgi mehānismi, pastiprināta slāpekļa oksīda ražošana un T-šūnu infiltrācija. Tomēr tā galvenais efekts ir Ifg sintezēšana. Pēdējais, kamēr uzkrājas organismā, veicina IL-12 sintēzi ar makrofāgiem. IL-12 vissvarīgākā funkcija ir Tx0 diferenciācijas virziens uz Tx1. Šajā procesā IL-12 ir Ifg sinerģists. Tikmēr pēc diferenciācijas Th1 vairs nav vajadzīgs IL-12 kā stimulējoša molekula. Imūnās atbildes raksturs lielā mērā ir atkarīgs no IL-12: vai tā attīstīsies saskaņā ar šūnu vai humorālo imunitāti.

Viena no svarīgākajām IL-12 funkcijām ir straujš B-limfocītu diferenciācijas pieaugums šūnās, kas ražo antivielas. Šo citokīnu lieto, lai ārstētu pacientus ar alerģijām un bronhiālo astmu.

IL-12 inhibējoši ietekmē atmiņas T-limfocītu IL-4 veidošanos, ko nodrošina APC. Savukārt IL-4 nomāc IL-12 veidošanos un sekrēciju.

IL-12 sinerģisti ir IL-2 un IL-7, lai gan abi šie citokīni bieži iedarbojas uz dažādām mērķa šūnām. IL-12 fizioloģiskais antagonists un inhibitors ir IL-10, tipisks pretiekaisuma citokīns, kas kavē Th1 funkciju.

IL-16- to izdala T-limfocīti, galvenokārt stimulē CD4 +, CD8 +, eozinofīli un bronhu epitēlija šūnas. Palielināta IL-16 sekrēcija tika konstatēta, ārstējot T šūnas ar histamīnu. Pēc ķīmiskā rakstura tas ir homotetramērs ar molekulmasu 56000-80000 D. Tas ir imūnmodulējošs un pretiekaisuma citokīns, jo tas ir monotītu un eozinofilu, kā arī T-limfocītu (CD4 +) ķīmotaktiskais faktors, uzlabojot to saķeri.

Jāatzīmē, ka CD4 + pirmapstrāde ar rekombinanto IL-16 samazina HIV-1 promotora aktivitāti par aptuveni 60%. Pamatojoties uz iepriekš minētajiem faktiem, ir izvirzīta hipotēze, saskaņā ar kuru IL-16 ietekme uz HIV-1 replikāciju tiek novērota vīrusa ekspresijas līmenī.

IL-17 ko veido makrofāgi. Pašlaik ir iegūts rekombinants IL-17 un pētītas tā īpašības. Izrādījās, ka IL-17 ietekmē cilvēka makrofāgi intensīvi sintezē un izdala pretiekaisuma citokīnus-IL-1b un TNFa, kas ir tieši proporcionāli pētītā citokīna devai. Maksimālais efekts tiek novērots apmēram 9 stundas pēc makrofāgu inkubācijas sākuma ar rekombinanto IL-17. Turklāt IL-17 stimulē IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1 antagonista un stromalizīna sintēzi un sekrēciju. Pretiekaisuma citokīni-IL-4 un IL-10-pilnībā atceļ IL-17 izraisīto IL-1b izdalīšanos, savukārt GTFb 2 un IL-13 tikai daļēji bloķē šo efektu. IL-10 nomāc izraisīto TNFa izdalīšanos, savukārt IL-4, IL-13 un GTFb 2 mazākā mērā nomāc šī citokīna sekrēciju. Iesniegtie fakti stingri liek domāt, ka IL-17 vajadzētu būt nozīmīgai lomai iekaisuma procesa uzsākšanā un uzturēšanā.

IL-18 bioloģiskās iedarbības ziņā tas ir funkcionāls IL-12 dubultnieks un sinerģists. Galvenie IL-18 ražotāji ir makrofāgi un monocīti. Tās struktūra ir ļoti līdzīga IL-1. IL-18 tiek sintezēts neaktīvas prekursoru molekulas veidā, kam nepieciešama IL-1b konvertējošā enzīma līdzdalība, lai to pārvērstu aktīvā formā.

IL-18 ietekmē palielinās ķermeņa pretmikrobu rezistence. Baktēriju infekcijas gadījumā IL-18 kopā ar IL-12 vai Ifa / b regulē Ifg veidošanos Tx un NK šūnās un uzlabo Fas liganda ekspresiju uz NK un T limfocītiem. Nesen tika atklāts, ka IL-18 ir CTL aktivators. Tās ietekmē palielinās CD8 + šūnu aktivitāte attiecībā pret ļaundabīgo audzēju šūnām.

Tāpat kā IL-12, IL-18 veicina Th0 preferenciālo diferenciāciju Th1. Turklāt IL-18 izraisa GM-CSF veidošanos un tādējādi uzlabo leikopoēzi un kavē osteoklastu veidošanos.

IL-23 sastāv no 2 apakšvienībām (p19 un p40), kas ir daļa no IL-12. Atsevišķi katrai no uzskaitītajām apakšvienībām nav bioloģiskas aktivitātes, tomēr kopā tās, tāpat kā IL-12, palielina T-limfoblastu proliferācijas aktivitāti un Ifg sekrēciju. IL-23 ir mazāk spēcīgs nekā IL-12.

TNF ir polipeptīds ar molekulmasu aptuveni 17 kDa (sastāv no 157 aminoskābēm) un ir sadalīts 2 frakcijās - a un b. Abām frakcijām ir aptuveni vienādas bioloģiskās īpašības un tās iedarbojas uz tiem pašiem šūnu receptoriem. TNFa izdalās monocīti un makrofāgi, Th1, endotēlija un gludo muskuļu šūnas, keratinocīti, NK limfocīti, neitrofīli, astrocīti, osteoblasti utt. Mazākā mērā TNFa ražo dažas audzēja šūnas. Galvenais TNFa sintēzes ierosinātājs ir baktēriju lipopolisaharīds, kā arī citi baktēriju izcelsmes komponenti. Turklāt TNFa sintēzi un sekrēciju stimulē citokīni: IL-1, IL-2, Ifa un b, GM-CSF uc Epšteina-Barra vīruss, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb utt.

TNFa bioloģiskās aktivitātes galvenā izpausme ir ietekme uz dažām audzēja šūnām. Šajā gadījumā TNFa izraisa hemorāģiskās nekrozes un piegādāto asinsvadu trombozes attīstību. Tajā pašā laikā TNFa ietekmē palielinās monocītu, makrofāgu un NK šūnu dabiskā citotoksicitāte. Audzēja šūnu regresija notiek īpaši intensīvi, apvienojot TNFa un Ifg.

TNFa ietekmē tiek kavēta lipoproteīnu kināzes sintēze, kas ir viens no galvenajiem lipoģenēzi regulējošajiem enzīmiem.

TNFa kā citotoksicitātes starpnieks spēj kavēt šūnu proliferāciju, diferenciāciju un daudzu šūnu funkcionālo aktivitāti.

TNFa ir tieši iesaistīts imūnās atbildes reakcijā. Tam ir ārkārtīgi svarīga loma iekaisuma reakcijas sākuma brīžos, jo tas aktivizē endotēliju un veicina adhezīvo molekulu ekspresiju, kas noved pie granulocītu saķeres ar trauka iekšējo virsmu. TNFa ietekmē notiek leikocītu transendoteliālā migrācija uz iekaisuma fokusu. Šis citokīns aktivizē granulocītus, monocītus un limfocītus un izraisa citu pretiekaisuma citokīnu-IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF-ražošanu, kas ir TNFa sinerģisti.

Vietēji veidotais TNFa iekaisuma vai infekcijas procesa fokusā krasi palielina monocītu un neitrofilu fagocītisko aktivitāti un, uzlabojot peroksidācijas procesus, veicina pilnīgas fagocitozes attīstību. Kopā ar IL-2 TNFa ievērojami palielina If limfocītu veidošanos T limfocītos.

TNFa ir iesaistīts arī iznīcināšanas un remonta procesos, jo tas izraisa fibroblastu augšanu un stimulē angioģenēzi.

Pēdējos gados ir konstatēts, ka TNF ir svarīgs asinsrades regulators. Tieši vai kopā ar citiem citokīniem TNF ietekmē visu veidu asinsrades šūnas.

Tās ietekmē tiek uzlabota hipotalāma-hipofīzes-virsnieru sistēmas darbība, kā arī daži endokrīnie dziedzeri-vairogdziedzeris, sēklinieki, olnīcas, aizkuņģa dziedzeris un citi (A.F. Vozianovs).

Interferoni veido gandrīz visas cilvēka ķermeņa šūnas, bet galvenokārt to ražošanu veic asins un kaulu smadzeņu šūnas. Interferonu sintēze notiek antigēnu stimulācijas ietekmē, lai gan ļoti nelielu šo savienojumu koncentrāciju parasti var atrast kaulu smadzenēs, bronhos, dažādos kuņģa -zarnu trakta orgānos, ādā un citos. Interferona sintēzes līmenis šūnās, kas nedalās, vienmēr ir augstāks nekā šūnās, kas ātri dalās.

Ievads.

1. Citokīnu vispārīgās īpašības un klasifikācija.

1.1 Darbības mehānismi.

1.2 Citokīnu īpašības.

1.3 Citokīnu loma ķermeņa fizioloģisko funkciju regulēšanā.

2. Īpaši citokīnu pētījumi.

2.1 Citokīnu loma resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē bērniem.

2.2 Slāpekļa oksīda un citokīnu loma akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā.

3. Metodes citokīnu noteikšanai

3.1 Citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšana

3.2 Citokīnu kvantitatīva noteikšana, izmantojot antivielas

3.3 Citokīnu noteikšana ar fermentu imūnanalīzi.

3.3.1 Audzēja nekrozes faktors-alfa.

3.3.2 Gamma interferons.

3.3.3 Interleikīns-4

3.3.4 Interleikīns-8

3.3.5 Interleikīna-1 receptoru antagonists.

3.3.6 Alfa-interferons.

3.3.7 Antivielas pret alfa-IFN.

4. Imunotropās zāles, kuru pamatā ir citokīni.

Izmantotās literatūras saraksts.

Secinājums.

Ievads.

Kopš pirmo citokīnu apraksta nav pagājis daudz laika. Tomēr viņu pētījumi noveda pie plašas zināšanu sadaļas - citokinoloģijas, kas ir neatņemama sastāvdaļa dažādās zināšanu jomās un, pirmkārt, imunoloģijā, kas deva spēcīgu impulsu šo mediatoru izpētei. Citokineoloģija caurvij visas klīniskās disciplīnas, sākot no slimību etioloģijas un patoģenēzes līdz dažādu patoloģisku stāvokļu profilaksei un ārstēšanai. Līdz ar to zinātniskajiem pētniekiem un ārstiem ir jāpārvalda regulējošo molekulu daudzveidība un skaidri jāsaprot katra citokīna loma pētāmajos procesos. Visām imūnsistēmas šūnām ir noteiktas funkcijas un tās darbojas skaidri saskaņotā mijiedarbībā, ko nodrošina īpašas bioloģiski aktīvas vielas - citokīni - imūnreakciju regulatori. Citokīni ir specifiski proteīni, ar kuru palīdzību dažādas imūnsistēmas šūnas var savstarpēji apmainīties ar informāciju un koordinēt darbības. Citokīnu komplekts un daudzums, kas iedarbojas uz šūnu virsmas receptoriem - "citokīnu vidi" - ir mijiedarbīgu un bieži mainīgu signālu matrica. Šie signāli ir sarežģīti, pateicoties citokīnu receptoru daudzveidībai un tāpēc, ka katrs no citokīniem var aktivizēt vai nomākt vairākus procesus, tostarp savu un citu citokīnu sintēzi, kā arī citokīnu receptoru veidošanos un izskatu. uz šūnas virsmas. Mūsu darba mērķis ir izpētīt citakīnus, to funkcijas un īpašības, kā arī to iespējamo pielietojumu medicīnā. Citokīni ir mazi proteīni (molekulmasa no 8 līdz 80 KDa), kas darbojas autokrīni (t.i., uz šūnu, kas tos ražo) vai parakrīnu (uz šūnām, kas atrodas tuvumā). Šo ļoti aktīvo molekulu veidošanās un izdalīšanās ir īslaicīga un stingri regulēta.

Literatūras apskats.

Citokīnu vispārīgās īpašības un klasifikācija.

Citokīni ir starpšūnu mijiedarbības polipeptīdu mediatoru grupa, kas galvenokārt ir iesaistīti ķermeņa aizsardzības reakciju veidošanā un regulēšanā patogēnu ievadīšanas laikā un audu integritātes traucēšanā, kā arī vairāku normālu fizioloģisko funkciju regulēšanā. Citokīnus var izolēt jaunā neatkarīgā regulēšanas sistēmā, kas pastāv kopā ar nervu un endokrīno sistēmu homeostāzes uzturēšanai, un visas trīs sistēmas ir cieši saistītas un savstarpēji atkarīgas. Pēdējo divu desmitgažu laikā vairuma citokīnu gēni ir klonēti un iegūti rekombinantie analogi, kas pilnībā atkārto dabisko molekulu bioloģiskās īpašības. Tagad ir zināmas vairāk nekā 200 atsevišķas vielas, kas pieder citokīnu saimei. Citokīnu izpētes vēsture sākās 20. gadsimta 40. gados. Tieši tad tika aprakstīti pirmie kachektīna efekti - faktors, kas atrodas asins serumā un var izraisīt kaheksiju vai svara zudumu. Pēc tam šis starpnieks tika izolēts un pierādīts, ka tas ir identisks audzēja nekrozes faktoram (TNF). Tolaik citokīnu izpēte balstījās uz principu noteikt jebkuru bioloģisku efektu, kas kalpoja kā sākumpunkts attiecīgā starpnieka nosaukumam. Tātad 50. gados interferonu (IFN) sauca, jo tas spēj traucēt vai palielināt rezistenci atkārtotas vīrusu infekcijas laikā. Interleikīnu-1 (IL-1) sākotnēji sauca arī par endogēnu pirogēnu, nevis baktēriju lipopolisaharīdus, kurus uzskatīja par eksogēniem pirogēniem. Nākamais citokīnu izpētes posms, kas datēts ar 60-70 gadiem, ir saistīts ar dabisko molekulu attīrīšanu un visaptverošu to bioloģiskās darbības raksturojumu. Līdz tam laikam tika atklāts T-šūnu augšanas faktors, kas tagad pazīstams kā IL-2, un vairākas citas molekulas, kas stimulē T-, B-limfocītu un cita veida leikocītu augšanu un funkcionālo aktivitāti. 1979. gadā to apzīmēšanai un sistematizēšanai tika piedāvāts termins "interleikīni", tas ir, starpnieki, kas sazinās starp leikocītiem. Tomēr drīz vien kļuva skaidrs, ka citokīnu bioloģiskā iedarbība sniedzas daudz tālāk par imūnsistēmu, un tāpēc iepriekš piedāvātais termins "citokīni", kas saglabājies līdz mūsdienām, kļuva pieņemamāks. Revolucionārs pavērsiens citokīnu izpētē notika astoņdesmito gadu sākumā pēc peļu un cilvēka interferona gēnu klonēšanas un rekombinanto molekulu ražošanas, kas pilnībā atkārtoja dabisko citokīnu bioloģiskās īpašības. Pēc tam bija iespējams klonēt citu šīs ģimenes mediatoru gēnus. Svarīgs pavērsiens citokīnu vēsturē bija rekombinanto interferonu, īpaši rekombinantā IL-2, klīniskā izmantošana vēža ārstēšanai. 90. gadi iezīmējās ar citokīnu receptoru apakšvienības struktūras atklāšanu un jēdziena "citokīnu tīkls" veidošanos, un XXI gadsimta sākums - ar ģenētiskās analīzes palīdzību tika atklāti daudzi jauni citokīni. Citokīni ietver interferonus, koloniju stimulējošos faktorus (CSF), ķīmokīnus, kas pārveido augšanas faktorus; audzēja nekrozes faktors; interleikīni ar vēsturiskiem sērijas numuriem un daži citi endogēni mediatori. Interleikīni ar sērijas numuriem, sākot no 1, nepieder tai pašai citokīnu apakšgrupai, kas saistīta ar kopīgām funkcijām. Tos savukārt var iedalīt pretiekaisuma citokīnos, limfocītu augšanas un diferenciācijas faktoros un atsevišķos regulējošos citokīnos. Nosaukums "interleikīns" tiek piešķirts jaunatklātam starpniekam, ja ir izpildīti šādi Starptautiskās imunoloģisko biedrību savienības nomenklatūras komitejas izstrādātie kritēriji: molekulārā klonēšana un pētāmā faktora gēna ekspresija, unikāla nukleotīda klātbūtne un atbilstošo aminoskābju secību, iegūstot neitralizējošas monoklonālas antivielas. Turklāt jaunā molekula jāražo imūnsistēmas šūnām (limfocīti, monocīti vai cita veida leikocīti), tai ir svarīga bioloģiskā funkcija imūnās atbildes regulēšanā, kā arī papildu funkcijas, tāpēc tā nevar piešķirt funkcionālu nosaukumu. Visbeidzot, uzskaitītās jaunā interleikīna īpašības jāpublicē recenzētā zinātniskajā žurnālā. Citokīnu klasifikāciju var veikt atbilstoši to bioķīmiskajām un bioloģiskajām īpašībām, kā arī pēc receptoru veidiem, caur kuriem citokīni pilda savas bioloģiskās funkcijas. Citokīnu klasifikācija pēc struktūras (1. tabula) ņem vērā ne tikai aminoskābju secību, bet galvenokārt proteīna terciāro struktūru, kas precīzāk atspoguļo molekulu evolūcijas izcelsmi.

1. tabula. Citokīnu klasifikācija pēc struktūras.

Gēnu klonēšana un citokīnu receptoru struktūras analīze parādīja, ka, tāpat kā paši citokīni, šīs molekulas var iedalīt vairākos veidos atbilstoši aminoskābju secību līdzībai un ārpusšūnu domēnu organizācijas īpatnībām (2. tabula). Vienu no lielākajām citokīnu receptoru ģimenēm sauc par asinsrades receptoru saimi vai I tipa citokīnu receptoru saimi. Šīs receptoru grupas strukturālā iezīme ir klātbūtne molekulā ar 4 cisteīniem un aminoskābju secību Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), kas atrodas nelielā attālumā no šūnu membrānas. II klases citokīnu receptori mijiedarbojas ar interferoniem un IL-10. Abi pirmie receptoru veidi ir savstarpēji homoloģiski. Tālāk minētās receptoru grupas nodrošina mijiedarbību ar audzēja nekrozes faktoru saimes un IL-1 saimes citokīniem. Pašlaik ir zināms, ka vairāk nekā 20 dažādi ķīmokīna receptori mijiedarbojas ar dažādu afinitātes pakāpi ar vienu vai vairākiem ķīmokīnu grupas ligandiem. Hemokīna receptori pieder pie rodopsīna receptoru superģimenes, tiem ir 7 transmembrānas domēni un tie vada signālu, piedaloties G-proteīniem.

2. tabula. Citokīnu receptoru klasifikācija.

Daudzi citokīnu receptori sastāv no 2-3 apakšvienībām, ko kodē dažādi gēni un izsaka neatkarīgi. Šajā gadījumā augstas afinitātes receptoru veidošanai nepieciešama visu apakšvienību vienlaicīga mijiedarbība. Šādas citokīnu receptoru organizācijas piemērs ir IL-2 receptoru kompleksa struktūra. Pārsteidzoši atklāja faktu, ka atsevišķas IL-2 receptoru kompleksa apakšvienības ir kopīgas IL-2 un dažiem citiem citokīniem. Tādējādi β-ķēde vienlaikus ir IL-15 receptoru sastāvdaļa, un γ-ķēde kalpo kā kopīga IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- receptoru apakšvienība. 15 un IL-21. Tas nozīmē, ka visi iepriekš minētie citokīni, kuru receptori sastāv arī no 2-3 atsevišķiem polipeptīdiem, izmanto γ ķēdi kā savu receptoru sastāvdaļu, turklāt sastāvdaļu, kas atbild par signāla pārraidi. Visos gadījumos mijiedarbības specifiku katram citokīnam nodrošina citas apakšvienības, kas atšķiras pēc struktūras. Starp citokīnu receptoriem ir 2 biežāk sastopamas receptoru apakšvienības, kas vada signālu pēc mijiedarbības ar dažādiem citokīniem. Tā ir izplatīta receptoru apakšvienība βc (gp140) IL-3, IL-5 un GM-CSF receptoriem, kā arī gp130 receptoru apakšvienība, kas ir kopīga IL-6 saimes pārstāvjiem. Kopīgas signalizācijas apakšvienības klātbūtne citokīnu receptoros kalpo kā viena no pieejām to klasificēšanai, jo tā ļauj atrast kopību gan ligandu struktūrā, gan bioloģiskajos efektos.

3. tabulā parādīta kombinētā strukturālā un funkcionālā klasifikācija, kur visi citokīni ir sadalīti grupās, galvenokārt ņemot vērā to bioloģisko aktivitāti, kā arī citokīnu molekulu un to receptoru iepriekš minētās strukturālās iezīmes.

3. tabula. Citokīnu strukturālā un funkcionālā klasifikācija.

Citokīnu ģimenes	Apakšgrupas un ligandi	Bioloģiskās pamatfunkcijas
I tipa interferoni	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Pretvīrusu aktivitāte, antiproliferatīva, imūnmodulējoša darbība
Hematopoētisko šūnu augšanas faktori	Cilmes šūnu faktors (komplekta ligands, tērauda faktors), Flt-3 ligands, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandi: IL-3, IL-5, GM-KSF	Dažādu veidu cilmes šūnu proliferācijas un diferenciācijas stimulēšana kaulu smadzenēs, hematopoēzes aktivizēšana Eritropoetīns, trombopoetīns
Interleikīna-1 un FRF superģimene	FRF ģimene: Skābais FRF, pamata FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) saime: IL-1α, IL-1β, IL-1 receptoru antagonists, IL-18, IL-33 utt.	Fibroblastu un epitēlija šūnu proliferācijas aktivizēšana Pretiekaisuma darbība, specifiskas imunitātes aktivizēšana
Audzēja nekrozes faktoru saime	TNF, limfotoksīni α un β, Fas ligands utt.	Iekaisumu veicinoša darbība, apoptozes regulēšana un imūnkompetentu šūnu starpšūnu mijiedarbība
Interleikīna-6 ģimene	Gp130 ligandi: IL-6, IL-11, IL-31, Onkostatīns-M, Kardiotropīns-1, leikēmiju inhibējošais faktors, žults neirotrofiskais faktors	Pretiekaisuma un imūnregulējoša iedarbība
Chemokīni	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Dažādu veidu leikocītu ķīmijtakses regulēšana
Interleikīna-10 ģimene	IL-10,19,20,22,24,26	Imūnsupresīva darbība
Interleikīna-12 ģimene		Palīg T-limfocītu diferenciācijas regulēšana
T-helperu klonu citokīni un limfocītu regulējošās funkcijas	1. tipa T-palīgi: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg 2. tipa T-palīgi: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 receptoru γ-ķēdes ligandi: IL-7 TSLP	Šūnu imunitātes aktivizēšana Humorālās imunitātes aktivizēšana, imūnmodulējoša iedarbība Dažādu veidu limfocītu, DC, NK šūnu, makrofāgu uc diferenciācijas, proliferācijas un funkcionālo īpašību stimulēšana.
Interleikīna 17 ģimene	IL-17A, B, C, D, E, F	Iekaisuma citokīnu sintēzes aktivizēšana
Nervu augšanas faktora, trombocītu augšanas faktora un pārveidojošo augšanas faktoru superģimene	Nervu augšanas faktoru saime: NGF, smadzeņu neirotrofiskais faktors No trombocītiem iegūti augšanas faktori (PDGF), angiogēni augšanas faktori (VEGF) TRF ģimene: TPPb, aktivīni, inhibīni, mezgli, kaulu morfogēnās olbaltumvielas, Mullerian inhibējošā viela	Iekaisuma, angioģenēzes, neironu funkcijas, embriju attīstības un audu reģenerācijas regulēšana
Epidermas augšanas faktoru saime	ERF, TRFα utt.
Insulīnam līdzīgu augšanas faktoru saime	IRF-I, IRF-II	Dažādu šūnu tipu proliferācijas stimulēšana

Pirmajā grupā ietilpst I tipa interferoni, un tā ir vienkāršākā organizācijā, jo visām tajā iekļautajām molekulām ir līdzīga struktūra un daudzos aspektos tās pašas funkcijas, kas saistītas ar pretvīrusu aizsardzību. Otrajā grupā ietilpa asinsrades šūnu augšanas un diferenciācijas faktori, stimulējot asinsrades cilmes šūnu attīstību, sākot no cilmes šūnām. Šajā grupā ietilpst citokīni, kas ir šauri specifiski atsevišķām asinsrades šūnu diferenciācijas līnijām (eritropoetīns, trombopoetīns un IL-7, kas iedarbojas uz TB limfocītu prekursoriem), kā arī citokīni ar plašāku bioloģiskās aktivitātes spektru, piemēram, IL-3, IL-11, koloniju stimulējošie faktori. Šajā citokīnu grupā molekulu strukturālās organizācijas līdzības dēļ ir izolēti ligandi gp140, kuriem ir kopīga receptoru apakšvienība, kā arī trombopoetīns un eritropoetīns. FGF un IL-1 superģimeņu citokīniem ir augsta homoloģijas pakāpe un līdzīga olbaltumvielu struktūra, kas apstiprina kopējo izcelsmi. Tomēr, ņemot vērā bioloģiskās aktivitātes izpausmes, FGF daudzos aspektos atšķiras no IL-1 ģimenes agonistiem. IL-1 molekulu saimei papildus funkcionālajiem nosaukumiem pašlaik ir apzīmējumi F1-F11, kur F1 atbilst IL-1α, F2-IL-1β, F3-IL-1 receptoru antagonistam, F4-IL- 18. Pārējie ģimenes locekļi ir atklāti ģenētiskās analīzes rezultātā, un tiem ir diezgan augsta homoloģija ar IL-1 molekulām, tomēr to bioloģiskās funkcijas nav pilnībā noskaidrotas. Citas citokīnu grupas ietver IL-6 ģimenes (kopējās receptoru apakšvienības gp130 ligandus), audzēja nekrozes faktoru un ķīmokīnus, ko pārstāv vislielākais atsevišķo ligandu skaits un kas ir pilnībā uzskaitīti attiecīgajās nodaļās. Audzēja nekrozes faktora saime galvenokārt veidojas, pamatojoties uz ligandu un to receptoru struktūras līdzību, kas sastāv no trim nekovalenti saistītām identiskām apakšvienībām, kas veido bioloģiski aktīvas molekulas. Tajā pašā laikā bioloģisko īpašību ziņā šajā ģimenē ietilpst citokīni ar diezgan atšķirīgām aktivitātēm. Piemēram, TNF ir viens no spilgtākajiem pretiekaisuma citokīniem, Fas ligands izraisa mērķa šūnu apoptozi, un CD40 ligands nodrošina stimulējošu signālu T un B limfocītu starpšūnu mijiedarbības laikā. Šādas strukturāli līdzīgu molekulu bioloģiskās aktivitātes atšķirības galvenokārt nosaka to receptoru ekspresijas un struktūras iezīmes, piemēram, intracelulārā “nāves” domēna esamība vai neesamība, kas nosaka šūnu apoptozi. Pēdējo gadu laikā ģimenes IL-10 un IL-12 ir papildinātas ar jauniem dalībniekiem, kuri ir saņēmuši interleikīnu sērijas numurus. Tam seko ļoti sarežģīta citokīnu grupa, kas ir T-helperu limfocītu funkcionālās aktivitātes starpnieki. Iekļaušana šajā grupā balstās uz diviem pamatprincipiem: 1) piederība Th1 vai Th2 sintezētajiem citokīniem, kas nosaka galvenokārt humora vai šūnu tipa imunoloģisko reakciju attīstību, 2) kopējas receptoru apakšvienības - gamma ķēdes - klātbūtne. no IL-2 receptoru kompleksa. Starp gamma ķēdes ligandiem papildus tika izolēts IL-4, kam ir arī kopīgas receptoru apakšvienības ar IL-13, kas lielā mērā nosaka šo citokīnu bioloģisko aktivitāti, kas daļēji pārklājas. IL-7, kam ir kopīga receptoru struktūra ar TSLP, tika izolēts līdzīgā veidā. Iepriekš minētās klasifikācijas priekšrocības ir saistītas ar vienlaicīgu citokīnu bioloģisko un bioķīmisko īpašību izskatīšanu. Šīs pieejas iespējamību pašlaik apstiprina jaunu citokīnu atklāšana ar genoma ģenētisko analīzi un strukturāli līdzīgu gēnu meklēšana. Pateicoties šai metodei, I tipa interferonu saime IL-1, IL-10, IL-12 ir ievērojami paplašinājusies, parādījusies jauna IL-17 analogo citokīnu saime, kas jau sastāv no 6 locekļiem. Acīmredzot tuvākajā nākotnē jaunu citokīnu parādīšanās notiks daudz lēnāk, jo cilvēka genoma analīze ir gandrīz pabeigta. Izmaiņas, visticamāk, ir iespējamas, skaidrojot ligandu-receptoru mijiedarbības variantus un bioloģiskās īpašības, kas ļaus citokīnu klasifikācijai iegūt galīgo formu.

Darbības mehānismi.

B. Citokīnu receptori. Citokīni ir hidrofīlas signālvielas, kuru darbību nodrošina specifiski receptori plazmas membrānas ārpusē. Citokīnu saistīšanās ar receptoru (1) izraisa vairākus starpposmus (2-5), lai aktivizētu noteiktu gēnu transkripciju (6). Citokīnu receptoriem nav tirozīnkināzes aktivitātes (ar dažiem izņēmumiem). Pēc saistīšanās ar citokīnu (1) receptoru molekulas asociējas, veidojot homodimērus. Turklāt tie var veidot heterodimērus, saistoties ar signālu pārneses proteīniem [STP], vai stimulēt pašu BPS dimerizāciju (2). I klases citokīnu receptori var apvienoties ar trīs veidu BPS: proteīniem GP130, βc vai γc. Šie palīgproteīni paši nespēj saistīt citokīnus, bet tie veic signāla pārraidi uz tirozīnkināzēm (3). Tie paši daudzu citokīnu bioloģiskās aktivitātes spektri ir izskaidrojami ar to, ka dažādi citokīnu-receptoru kompleksi var aktivizēt vienu un to pašu BPS.

Kā piemērs signāla pārraidei no citokīniem diagramma parāda, kā IL-6 (IL-6) receptors pēc saistīšanās ar ligandu (1) stimulē GP130 dimerizāciju (2). Membrānas proteīna GP130 dimērs saistās un aktivizē YK ģimenes citoplazmatisko tirozīnkināzi (Janus kināzes ar divām aktīvajām vietām) (3). Janus kināzes fosforilē citokīnu receptorus, BPS un dažādus citoplazmas proteīnus, kas veic tālāku signālu pārraidi; tie arī fosforilē transkripcijas faktorus - signālu devējus un transkripcijas aktivatorus [PSAT (STAT, no angļu valodas signālu devējiem un transkripcijas aktivatoriem)]. Šie proteīni pieder BPS saimei, kuras struktūrā ir SH3 domēns, kas atpazīst fosfotirozīna atlikumus (sk. 372. lpp.). Tāpēc tiem ir īpašība saistīties ar fosforilētu citokīnu receptoru. Ja pēc tam notiek PSAT molekulas (4) fosforilēšana, faktors pārveidojas aktīvā formā un veido dimēru (5). Pēc translokācijas kodolā dimērs kā transkripcijas faktors saistās ar uzsāktā gēna promotoru (sk. 240. lpp.) Un inducē tā transkripciju (6). Daži citokīnu receptori proteolīzes dēļ var zaudēt ārpusšūnu ligandu saistošo domēnu (nav parādīts diagrammā). Domēns nonāk asinīs, kur tas sacenšas par saistīšanos ar citokīnu, kas samazina citokīnu koncentrāciju asinīs.Kopā citokīni veido regulējošu tīklu (citokīnu kaskādi) ar daudzfunkcionālu efektu. Citokīnu pārklāšanās noved pie tā, ka daudzu to darbībā tiek novērots sinerģisms, un daži citokīni ir antagonisti. Visu citokīnu kaskādi ar sarežģītu atgriezenisko saiti bieži var novērot organismā.

Citokīnu īpašības.

Citokīnu vispārīgās īpašības, kuru dēļ šos starpniekus var apvienot neatkarīgā regulēšanas sistēmā.

1. Citokīni ir polipeptīdi vai proteīni, bieži glikozilēti, lielākoties to MW ir no 5 līdz 50 kDa. Bioloģiski aktīvās citokīnu molekulas var sastāvēt no vienas, divām, trim vai vairākām identiskām vai atšķirīgām apakšvienībām.

2. Citokīniem nav bioloģiskas iedarbības antigēna specifiskuma. Tie ietekmē iedzimtas un iegūtās imunitātes reakcijās iesaistīto šūnu funkcionālo aktivitāti. Neskatoties uz to, citokīni, iedarbojoties uz T- un B-limfocītiem, spēj stimulēt antigēnu izraisītos procesus imūnsistēmā.

3. Citokīnu gēniem ir trīs izteiksmes varianti: a) stadijai raksturīga ekspresija noteiktos embriju attīstības posmos, b) konstitutīva izteiksme vairāku normālu fizioloģisko funkciju regulēšanai, c) inducējams izteiksmes veids, kas raksturīgs vairumam citokīni. Patiešām, lielāko daļu citokīnu ārpus iekaisuma reakcijas un imūnās atbildes šūnas nesintezē. Citokīnu gēnu ekspresija sākas, reaģējot uz patogēnu iekļūšanu organismā, antigēnu kairinājumu vai audu bojājumiem. Ar patogēniem saistītās molekulārās struktūras ir vieni no spēcīgākajiem proinflammatorisko citokīnu sintēzes induktoriem. Lai aktivizētu T-šūnu citokīnu sintēzi, nepieciešama šūnu aktivizēšana ar specifisku antigēnu, piedaloties T-šūnu antigēna receptoriem.

4. Citokīni tiek sintezēti, reaģējot uz stimulāciju īsā laika periodā. Sintēze tiek pārtraukta dažādu autoregulācijas mehānismu dēļ, ieskaitot paaugstinātu RNS nestabilitāti, un tāpēc, ka pastāv negatīvas atsauksmes, ko izraisa prostaglandīni, kortikosteroīdu hormoni un citi faktori.

5. Vienu un to pašu citokīnu var ražot dažāda veida ķermeņa šūnas dažādos orgānos histoģenētiskās izcelsmes ziņā.

6. Citokīnus var saistīt ar to sintezējošo šūnu membrānām, kam membrānas formā ir pilns bioloģiskās aktivitātes spektrs un izpaužas to bioloģiskā darbība starpšūnu kontakta laikā.

7. Citokīnu bioloģisko iedarbību ietekmē specifiski šūnu receptoru kompleksi, kas saistās ar citokīniem ar ļoti augstu afinitāti, un atsevišķi citokīni var izmantot kopīgas receptoru apakšvienības. Citokīnu receptori var pastāvēt šķīstošā formā, saglabājot spēju saistīt ligandus.

8. Citokīniem piemīt pleiotropiska bioloģiskā iedarbība. Tas pats citokīns var iedarboties uz daudzu veidu šūnām, izraisot dažādus efektus atkarībā no mērķa šūnu veida (1. att.). Citokīnu pleiotropo iedarbību nodrošina citokīnu receptoru ekspresija uz dažādu veidu un funkciju šūnu tipiem un signālu vadīšana, izmantojot vairākus dažādus intracelulārus kurjerus un transkripcijas faktorus.

9. Citokīniem raksturīga bioloģiskās darbības savstarpēja aizstājamība. Vairāki dažādi citokīni var izraisīt tādu pašu bioloģisko efektu vai tiem var būt līdzīgas aktivitātes. Citokīni inducē vai nomāc savu, citu citokīnu un to receptoru sintēzi.

10. Atbildot uz aktivācijas signālu, šūnas vienlaikus sintezē vairākus citokīnus, kas piedalās citokīnu tīkla veidošanā. Bioloģiskā iedarbība audos un ķermeņa līmenī ir atkarīga no citu citokīnu klātbūtnes un koncentrācijas ar sinerģisku, papildinošu vai pretēju iedarbību.

11. Citokīni var ietekmēt mērķa šūnu proliferāciju, diferenciāciju un funkcionālo aktivitāti.

12. Citokīni iedarbojas uz šūnām dažādi: autokrīni - uz šūnu, kas sintezē un izdala šo citokīnu; parakrīns - uz šūnām, kas atrodas netālu no ražotāja šūnas, piemēram, iekaisuma fokusā vai limfoīdajā orgānā; endokrīnā sistēma - tālu no jebkādu orgānu un audu šūnām pēc iekļūšanas asinsritē. Pēdējā gadījumā citokīnu darbība atgādina hormonu darbību (2. att.).

Rīsi. 1. Vienu un to pašu citokīnu var ražot dažāda veida ķermeņa šūnas dažādos histoģenētiskas izcelsmes orgānos un iedarboties uz daudzu veidu šūnām, izraisot atšķirīgus efektus atkarībā no mērķa šūnu veida.

Rīsi. 2. Trīs citokīnu bioloģiskās darbības izpausmes varianti.

Acīmredzot citokīnu regulēšanas sistēmas veidošanās evolucionāri notika līdz ar daudzšūnu organismu attīstību, un tas bija saistīts ar nepieciešamību veidot starpšūnu mijiedarbības starpniekus, kas var ietvert hormonus, neiropeptīdus, adhēzijas molekulas un dažus citus. Šajā sakarā citokīni ir vispusīgākā regulējošā sistēma, jo tie spēj uzrādīt bioloģisko aktivitāti gan tālu pēc sekrēcijas, ko veic ražotāja šūna (lokāli un sistēmiski), gan starpšūnu kontakta laikā, būdami bioloģiski aktīvi membrānas formā. Tādējādi citokīnu sistēma atšķiras no adhēzijas molekulām, kas šaurākas funkcijas veic tikai tad, kad šūnas ir tiešā kontaktā. Tajā pašā laikā citokīnu sistēma atšķiras no hormoniem, kurus galvenokārt sintezē specializēti orgāni un darbojas pēc iekļūšanas cirkulācijas sistēmā.

Citokīnu loma ķermeņa fizioloģisko funkciju regulēšanā.

Citokīnu lomu ķermeņa fizioloģisko funkciju regulēšanā var iedalīt 4 galvenajās sastāvdaļās:

1. Embrioģenēzes regulēšana, orgānu izveidošana un attīstība, t.sk. imūnsistēmas orgāni.

2. Noteiktu normālu fizioloģisko funkciju regulēšana.

3. Organisma aizsardzības reakciju regulēšana vietējā un sistēmiskā līmenī.

4. Audu reģenerācijas procesu regulēšana.

Atsevišķu citokīnu gēnu ekspresija notiek konkrētā stadijā noteiktos embriju attīstības posmos. Cilmes šūnu faktors, pārveidojošie augšanas faktori, TNF saimes citokīni un ķīmokīni regulē dažādu šūnu diferenciāciju un migrāciju, kā arī imūnsistēmas orgānu izveidi. Pēc tam dažu citokīnu sintēze var netikt atsākta, bet citi turpina regulēt normālus fizioloģiskos procesus vai ir iesaistīti aizsargreakciju attīstībā.

Neskatoties uz to, ka lielākā daļa citokīnu ir tipiski inducējami mediatori un pēcdzemdību periodā šūnas netiek sintezētas ārpus iekaisuma reakcijas un imūnās atbildes, uz dažiem citokīniem šis noteikums neattiecas. Gēnu konstitutīvās ekspresijas rezultātā daži no tiem tiek pastāvīgi sintezēti un pietiekami lielos daudzumos atrodas apritē, regulējot noteiktu šūnu tipu izplatīšanos un diferenciāciju visā dzīves laikā. Šāda veida funkciju fizioloģiskās regulēšanas, ko veic citokīni, piemēri var būt pastāvīgi augsts eritropoetīna līmenis un daži CSF, lai nodrošinātu asinsradi. Organisma aizsardzības reakciju regulēšana ar citokīnu palīdzību notiek ne tikai imūnsistēmas ietvaros, bet arī organizējot aizsardzības reakcijas visa organisma līmenī, regulējot gandrīz visus iekaisuma un imūnās atbildes attīstības aspektus. Šī funkcija, kas ir vissvarīgākā visai citokīnu sistēmai, ir saistīta ar diviem galvenajiem citokīnu bioloģiskās darbības virzieniem - aizsardzību pret infekcijas izraisītājiem un bojāto audu atjaunošanu. Citokīni galvenokārt regulē vietējo aizsardzības reakciju attīstību audos, piedaloties dažāda veida asins šūnām, endotēlijam, saistaudiem un epitēlijam. Aizsardzība vietējā līmenī attīstās, veidojot tipisku iekaisuma reakciju ar tās klasiskajām izpausmēm: hiperēmiju, tūskas attīstību, sāpju parādīšanos un disfunkciju. Citokīnu sintēze sākas, kad patogēni iekļūst audos vai tiek pārkāpta to integritāte, kas parasti notiek paralēli. Citokīnu ražošana ir šūnu reakcijas neatņemama sastāvdaļa, kas saistīta ar šūnu atpazīšanu no dažādu patogēnu līdzīgu strukturālo komponentu mielomonocītu sērijas, ko sauc par patogēniem saistītiem molekulāriem modeļiem. Šādu patogēnu struktūru piemēri ir gramnegatīvu baktēriju lipopolisaharīdi, grampozitīvu mikroorganismu peptidoglikāni, flagellīns vai ar CpolyG sekvencēm bagāta DNS, kas raksturīga visu veidu baktēriju DNS. Leikocīti izsaka atbilstošos modeļa atpazīšanas receptorus, ko sauc arī par Toll līdzīgiem receptoriem (TLR), un ir specifiski noteiktiem mikroorganismu strukturālajiem modeļiem. Pēc mikroorganismu vai to sastāvdaļu mijiedarbības ar TLR tiek iedarbināta intracelulārā signāla pārraides kaskāde, kā rezultātā palielinās leikocītu funkcionālā aktivitāte un citokīnu gēnu ekspresija.

TLR aktivācija noved pie divu galveno citokīnu grupu sintēzes: proinflammatoriski citokīni un I tipa interferoni, galvenokārt IFNα / β. Iekaisuma reakcijas attīstība un ventilatoram līdzīga dažādu veidu šūnu aktivācijas paplašināšana, kas iesaistītas uzturēšanā un iekaisuma regulēšana, ieskaitot visu veidu leikocītus, dendrītiskās šūnas, T un B limfocītus, NK šūnas, endotēlija un epitēlija šūnas, fibroblastus un citus. Tas nodrošina konsekventus iekaisuma reakcijas attīstības posmus, kas ir galvenais iedzimtas imunitātes īstenošanas mehānisms. Turklāt dendritiskās šūnas sāk sintezēt IL-12 saimes citokīnus, stimulējot palīgu T-limfocītu diferenciāciju, kas kalpo kā tilts uz specifisku imunitātes reakciju attīstības sākumu, kas saistīts ar specifisku antigēnu struktūru atpazīšanu. no mikroorganismiem.

Otrs ne mazāk svarīgais mehānisms, kas saistīts ar IFN sintēzi, paredz pretvīrusu aizsardzības ieviešanu. I tipa interferoniem piemīt 4 galvenās bioloģiskās īpašības:

1. Tieša pretvīrusu darbība, bloķējot transkripciju.

2. Šūnu proliferācijas nomākšana, kas nepieciešama, lai bloķētu vīrusa izplatīšanos.

3. NK šūnu funkciju aktivizēšana, kurām ir spēja lizēt ar vīrusu inficētās ķermeņa šūnas.

4. Pastiprināta I klases galveno histo-saderības kompleksa molekulu ekspresija, kas nepieciešama, lai palielinātu inficēto šūnu vīrusu antigēnu prezentācijas efektivitāti citotoksiskiem T-limfocītiem. Tas noved pie T-limfocītu vīrusu inficēto šūnu specifiskas atpazīšanas aktivizēšanas-vīrusu inficēto mērķa šūnu līzes pirmais posms.

Tā rezultātā papildus tiešai pretvīrusu iedarbībai tiek aktivizēti gan iedzimto (NK šūnu), gan iegūtās (T-limfocītu) imunitātes mehānismi. Šis ir piemērs tam, kā viena maza citokīnu molekula, kuras MM ir 10 reizes mazāka par MM antivielu molekulām, pleiotropās bioloģiskās darbības dēļ spēj aktivizēt pilnīgi atšķirīgus aizsardzības reakciju mehānismus, kuru mērķis ir sasniegt vienu mērķi - noņemt vīrusu, kuram ir iekļuva ķermenī.

Audu līmenī citokīni ir atbildīgi par iekaisuma attīstību un pēc tam audu atjaunošanos. Attīstoties sistēmiskai iekaisuma reakcijai (akūtas fāzes reakcija), citokīni ietekmē gandrīz visus ķermeņa orgānus un sistēmas, kas iesaistītas homeostāzes regulēšanā. Pretiekaisuma citokīnu iedarbība uz centrālo nervu sistēmu izraisa apetītes samazināšanos un izmaiņas visā uzvedības reakciju kompleksā. Īslaicīga pārtikas meklēšanas pārtraukšana un seksuālo aktivitāšu samazināšana ir izdevīga enerģijas taupīšanas ziņā vienam uzdevumam - cīnīties ar iebrūkošo patogēnu. Šo signālu nodrošina citokīni, jo to iekļūšana apritē noteikti nozīmē, ka vietējā aizsardzība nav tikusi galā ar patogēnu, un ir jāaktivizē sistēmiska iekaisuma reakcija. Viena no pirmajām sistēmiskās iekaisuma reakcijas izpausmēm, kas saistīta ar citokīnu iedarbību uz hipotalāma termoregulācijas centru, ir ķermeņa temperatūras paaugstināšanās. Temperatūras paaugstināšanās ir efektīva aizsargreakcija, jo paaugstinātā temperatūrā vairāku baktēriju spēja vairoties samazinās, bet, gluži pretēji, palielinās limfocītu proliferācija.

Aknās citokīnu ietekmē palielinās akūtas fāzes olbaltumvielu un komplementa sistēmas sastāvdaļu sintēze, kas nepieciešama cīņai pret patogēnu, bet vienlaikus samazinās albumīna sintēze. Vēl viens citokīnu selektīvās darbības piemērs ir asins plazmas jonu sastāva izmaiņas sistēmiskas iekaisuma reakcijas attīstības laikā. Tajā pašā laikā samazinās dzelzs jonu līmenis, bet palielinās cinka jonu līmenis, un ir labi zināms, ka atņemt dzelzs jonu baktēriju šūnai nozīmē samazināt tās proliferācijas potenciālu (laktoferīna darbība ir pamatojoties uz šo). No otras puses, cinka līmeņa paaugstināšana ir nepieciešama normālai imūnsistēmas darbībai, jo īpaši tas ir nepieciešams bioloģiski aktīva seruma aizkrūts dziedzera faktora - viena no galvenajiem aizkrūts dziedzera hormoniem, kas nodrošina limfocītu diferenciāciju, veidošanai. Citokīnu ietekme uz asinsrades sistēmu ir saistīta ar ievērojamu hematopoēzes aktivizēšanu. Ir nepieciešams palielināt leikocītu skaitu, lai papildinātu zaudējumus un palielinātu šūnu, galvenokārt neitrofilo granulocītu, skaitu strutaina iekaisuma fokusā. Darbība uz asins koagulācijas sistēmu ir vērsta uz asinsreces uzlabošanu, kas nepieciešama asiņošanas apturēšanai un patogēna tiešai bloķēšanai.

Tādējādi, attīstoties sistēmiskam iekaisumam, citokīniem piemīt milzīgs bioloģisko aktivitāšu klāsts un tie traucē gandrīz visu ķermeņa sistēmu darbu. Tomēr neviena no notiekošajām izmaiņām nav nejauša: tās visas ir vai nu nepieciešamas tiešai aizsardzības reakciju aktivizēšanai, vai arī ir izdevīgas, mainot enerģijas plūsmas tikai vienam uzdevumam - cīnīties ar iebrūkošo patogēnu. Atsevišķu gēnu ekspresijas regulēšanas, hormonālo pārmaiņu un uzvedības reakciju izmaiņu veidā citokīni nodrošina to ķermeņa sistēmu aktivizēšanu un maksimālu efektivitāti, kas noteiktā laikā ir nepieciešamas aizsargreakciju attīstībai. Visa organisma līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, asinsrades un citām sistēmām un kalpo, lai tos iesaistītu vienas aizsardzības reakcijas organizēšanā un regulēšanā. Citokīni ir tieši organizējošā sistēma, kas veido un regulē visu ķermeņa aizsargreakciju kompleksu patogēnu ievadīšanas laikā. Acīmredzot šāda regulēšanas sistēma tika izveidota evolucionāri un nes beznosacījumu priekšrocības makroorganisma optimālākajai aizsargreakcijai. Tāpēc acīmredzot nav iespējams ierobežot aizsardzības reakciju jēdzienu tikai ar nespecifisku rezistences mehānismu un specifiskas imūnās atbildes reakciju. Viss ķermenis un visas sistēmas, kas no pirmā acu uzmetiena nav saistītas ar imunitātes saglabāšanu, piedalās vienā aizsargreakcijā.

Īpaši citokīnu pētījumi.

Citokīnu nozīme resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē bērniem.

S.V. Belmers, A.S. Simbirtsevs, O.V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mihailova. Krievijas Valsts medicīnas universitāte, Valsts koloproktoloģijas zinātniskais centrs, Maskava un Valsts ļoti tīro bioloģisko vielu pētniecības institūts Sanktpēterburgā strādā, lai izpētītu citokīnu nozīmi resnās zarnas iekaisuma slimību patoģenēzē bērniem. Kuņģa -zarnu trakta hroniskas iekaisuma slimības pašlaik ieņem vienu no vadošajām vietām bērnu gremošanas sistēmas patoloģijā. Īpaša nozīme tiek piešķirta resnās zarnas iekaisuma slimībām (IBD), kuru sastopamība nepārtraukti pieaug visā pasaulē. Ilgs kurss ar biežiem un dažos gadījumos letāliem recidīviem, lokālu un sistēmisku komplikāciju attīstību - tas viss liek rūpīgi izpētīt slimības patoģenēzi, meklējot jaunas pieejas IBD ārstēšanai. Pēdējās desmitgadēs čūlainā kolīta (UC) sastopamība bija 510 gadījumi gadā uz 100 tūkstošiem iedzīvotāju, bet Krona slimība (CD) - 16 gadījumi gadā uz 100 tūkstošiem iedzīvotāju. Izplatības rādītāji Krievijā, Maskavas reģionā atbilst vidējiem Eiropas datiem, bet ievērojami zemāki nekā Skandināvijas valstīs, Amerikā, Izraēlā un Anglijā. NUC izplatība ir 19,3 uz 100 tūkstošiem, sastopamība ir 1,2 uz 100 tūkstošiem cilvēku gadā. CD gadījumā izplatība ir 3,0 uz 100 tūkstošiem, sastopamība ir 0,2 uz 100 tūkstošiem cilvēku gadā. Fakts, ka visaugstākais biežums tika atzīmēts augsti attīstītās valstīs, ir saistīts ne tikai ar sociālajiem un ekonomiskajiem faktoriem, bet arī ar pacientu ģenētiskajām un imunoloģiskajām īpašībām, kas nosaka noslieci uz IBD. Šie faktori ir būtiski IBD izcelsmes imunopatoģenētiskajā teorijā. Vīrusu un / vai baktēriju teorijas izskaidro tikai akūtu slimības sākumu, un procesa hronizācija ir saistīta gan ar ģenētisku noslieci, gan imūnās atbildes īpašībām, kas arī ir ģenētiski noteiktas. Jāatzīmē, ka IBTC pašlaik tiek klasificēta kā slimība ar ģenētiski neviendabīgu kompleksu noslieci. Ir identificēti vairāk nekā 15 iespējamie gēni kandidāti no 2 grupām (imūnspecifiski un imūnregulējoši), kas izraisa iedzimtu noslieci. Visticamāk, noslieci nosaka vairāki gēni, kas nosaka imunoloģisko un iekaisuma reakciju raksturu. Pamatojoties uz daudzu pētījumu rezultātiem, var secināt, ka visticamākā ar IBD attīstību saistīto gēnu lokalizācija ir 3., 7., 12. un 16. hromosoma. Pašlaik liela uzmanība tiek pievērsta T un B limfocītu, kā arī iekaisuma mediatoru citokīnu funkcijas funkciju izpētei. Aktīvi tiek pētīta interleikīnu (IL), interferonu (IFN), audzēja nekrozes faktora-a (TNF-a), makrofāgu un autoantivielu loma resnās zarnas gļotādas proteīnos un auto mikroflorā. Tika atklātas viņu traucējumu pazīmes CD un UC, taču joprojām nav skaidrs, vai šīs izmaiņas notiek galvenokārt vai sekundāri. Lai izprastu daudzus patoģenēzes aspektus, pētījumi, kas veikti IBD pirmsklīniskajā stadijā, kā arī pirmās pakāpes radiniekiem, būtu ļoti svarīgi. Starp iekaisuma mediatoriem īpaša loma pieder citokīniem, kas ir polipeptīdu molekulu grupa ar masu no 5 līdz 50 kDa, piedaloties ķermeņa aizsardzības reakciju veidošanā un regulēšanā. Ķermeņa līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, asinsrades un citām sistēmām un kalpo, lai iesaistītu viņus aizsardzības reakciju organizēšanā un regulēšanā. Citokīnu klasifikācija ir parādīta 2. tabulā. Lielāko daļu citokīnu nesintezē šūnas ārpus iekaisuma reakcijas un imūnās atbildes. Citokīnu gēnu ekspresija sākas, reaģējot uz patogēnu iekļūšanu organismā, antigēnu kairinājumu vai audu bojājumiem. Viens no spēcīgākajiem citokīnu sintēzes ierosinātājiem ir baktēriju šūnu sienu sastāvdaļas: LPS, peptidoglikāni un muramildipeptīdi. Pretiekaisuma citokīnu ražotāji galvenokārt ir monocīti, makrofāgi, T-šūnas utt. Atkarībā no ietekmes uz iekaisuma procesu citokīni ir sadalīti divās grupās: pretiekaisuma (IL-1, IL-6, IL-8) , TNF-a, IFN-g) un pretiekaisuma (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleikīns-1 (IL-1) ir imūnregulācijas starpnieks, kas izdalās iekaisuma reakciju, audu bojājumu un infekciju laikā (iekaisuma citokīns). IL-1 ir svarīga loma T šūnu aktivizēšanā, kad tās mijiedarbojas ar antigēnu. Ir divu veidu IL-1: IL-1a un IL-1b, divu dažādu gēnu lokusu produkti, kas atrodas cilvēka 2. hromosomā. IL-1a paliek šūnā vai var būt membrānas formā, un nelielos daudzumos parādās ārpusšūnu telpā. IL -1a membrānas formas loma ir aktivējošo signālu pārraide no makrofāga uz T -limfocītiem un citām šūnām starpšūnu kontakta laikā. IL-1a ir galvenais tuvās darbības starpnieks. IL-1b, atšķirībā no IL-1a, šūnas aktīvi izdala, darbojoties gan sistēmiski, gan lokāli. Mūsdienās ir zināms, ka IL-1 ir viens no galvenajiem iekaisuma reakciju starpniekiem, stimulē T-šūnu proliferāciju, palielina IL-2 receptoru ekspresiju uz T-šūnām un to ražošanu. IL-2 kopā ar antigēnu inducē neitrofilu aktivāciju un adhēziju, stimulē citu citokīnu (IL-2, IL-3, IL-6 uc) veidošanos, ko aktivizē T-šūnas un fibroblasti, stimulē fibroblastu proliferāciju un endotēlija šūnas. Sistēmiski IL-1 darbojas sinerģiski ar TNF-a un IL-6. Palielinoties koncentrācijai asinīs, IL-1 ietekmē hipotalāmu šūnas un izraisa ķermeņa temperatūras paaugstināšanos, drudzi, miegainību, samazinātu apetīti, kā arī stimulē aknu šūnas ražot akūtas fāzes proteīnus (CRP, amiloid A, a-2 makroglobulīns un fibrinogēns). IL4 (5. hromosoma). Tas kavē makrofāgu aktivāciju un bloķē daudzus IFNg stimulētos efektus, piemēram, IL1, slāpekļa oksīda un prostaglandīnu ražošanu, ir svarīga loma pretiekaisuma reakcijās, tai ir imūnsupresīva iedarbība. IL6 (7. hromosoma), kas ir viens no galvenajiem pretiekaisuma citokīniem, ir galvenais B šūnu un makrofāgu diferenciācijas beigu posma galvenais ierosinātājs, kas ir spēcīgs akūtas fāzes proteīnu ražošanas stimulators aknu šūnās. Viena no IL6 galvenajām funkcijām ir stimulēt antivielu veidošanos in vivo un in vitro. IL8 (4. hromosoma). Attiecas uz ķemokīnu starpniekiem, kas izraisa leikocītu virzītu migrāciju (ķīmotaksi) uz iekaisuma fokusu. IL10 galvenā funkcija ir citokīnu ražošanas kavēšana, izmantojot I tipa Thelpers (TNFb, IFNg) un aktivētos makrofāgus (TNF-a, IL1, IL12). Tagad ir atzīts, ka imūnās atbildes veidi ir saistīti ar vienu no limfocītu aktivācijas variantiem, pārsvarā piedaloties pirmā tipa (TH2) vai otrā tipa (TH3) T limfocītu palīgu kloniem. Produkti TH2 un TH3 negatīvi ietekmē pretējo klonu aktivāciju. Jebkura veida Th klonu pārmērīga aktivizēšana var novirzīt imūnreakciju atbilstoši kādai no attīstības iespējām. Hroniska nelīdzsvarotība Th klonu aktivācijā izraisa imūnpatoloģisku stāvokļu attīstību. Izmaiņas citokīnos IBTD var pētīt dažādos veidos, nosakot to līmeni asinīs vai in situ. IL1 līmenis ir paaugstināts visās iekaisuma zarnu slimībās. Atšķirības starp NNC un CD ir palielinātā IL2 ekspresijā. Ja NUC tiek konstatēts pazemināts vai normāls IL2 līmenis, tad CD tiek konstatēts tā paaugstinātais līmenis. IL4 saturs palielinās NUC, savukārt CD tas paliek normāls vai pat samazinās. IL6 līmenis, kas veicina akūtas fāzes reakcijas, ir paaugstināts arī visos iekaisuma veidos. Iegūtie dati par citokīnu profilu ļāva domāt, ka abas galvenās hroniskas IBD formas raksturo atšķirīga citokīnu aktivācija un ekspresija. Pētījumu rezultāti liecina, ka pacientiem ar UC novērotais citokīnu profils vairāk atbilst TH3 profilam, savukārt TH2 profils jāuzskata par raksturīgāku pacientiem ar CD. Šīs hipotēzes par TH2 un TH3 profilu lomu pievilcība slēpjas faktā, ka citokīnu izmantošana var mainīt imūnreakciju vienā vai otrā virzienā un izraisīt remisiju, atjaunojot citokīnu līdzsvaru. To jo īpaši var apstiprināt, izmantojot IL10. Turpmākajos pētījumos jāparāda, vai citokīnu reakcija ir sekundāra parādība, reaģējot uz stimulāciju, vai, gluži pretēji, atbilstošo citokīnu ekspresija nosaka organisma reaktivitāti, attīstoties turpmākajām klīniskajām izpausmēm. Pētījums par citokīnu līmeni IBD bērniem vēl nav veikts. Šis darbs ir zinātniskā pētījuma pirmā daļa, kas veltīta bērnu citokīnu stāvokļa izpētei IBD. Šī darba mērķis bija izpētīt makrofāgu humorālo aktivitāti, nosakot līmeni (IL1a, IL8) asinīs bērniem ar NUC un CD, kā arī to dinamiku terapijas laikā. No 2000. līdz 2002. gadam Krievijas Bērnu klīniskās slimnīcas gastroenteroloģijas nodaļā tika pārbaudīti 34 bērni ar NUC un 19 bērni ar CD vecumā no 4 līdz 16 gadiem. Diagnoze tika pārbaudīta anamnestiski, endoskopiski un morfoloģiski. Iekaisumu veicinošo citokīnu IL1a, IL8 līmeņa izpēte tika veikta, izmantojot enzīmu imūnsorbcijas testa (ELISA) metodi. Lai noteiktu IL1a, IL8 koncentrāciju, mēs izmantojām OOO Cytokin (Sanktpēterburga, Krievija) ražotās testa sistēmas. Analīze tika veikta ļoti tīru biopreparātu pētniecības institūta Valsts zinātniskā centra imunofarmakoloģijas laboratorijā (laboratorijas vadītājs, MD, prof. AS Simbirtsev). Pētījuma gaitā iegūtie rezultāti atklāja ievērojamu IL1a, IL8 līmeņa paaugstināšanos paasinājuma periodā, kas bija izteiktāks bērniem ar NUC nekā bērniem ar CD. Bez paasinājuma proinflammatorisko citokīnu līmenis samazinās, bet nesasniedz normu. UC IL-1a, IL-8 līmenis paasinājuma periodā palielinājās 76,2% un 90% bērnu, bet remisijas periodā-attiecīgi 69,2% un 92,3%. CD gadījumā IL-1a, IL-8 līmenis paasinājuma periodā ir paaugstināts 73,3% un 86,6% bērnu, bet remisijas periodā-attiecīgi 50% un 75%.

Atkarībā no slimības smaguma bērni saņēma terapiju ar aminosalicilātiem vai glikokortikoīdiem. Terapijas raksturs būtiski ietekmēja citokīnu līmeņa dinamiku. Ārstēšanas laikā ar aminosalicilātiem pretiekaisuma citokīnu līmenis bērnu grupā ar NUC un CD bija ievērojami augstāks nekā kontroles grupā. Tajā pašā laikā augstāki rādītāji tika novēroti bērnu grupā ar UC. NUC uz aminosalicilāta terapijas fona IL1a, IL8 palielinās attiecīgi 82,4% un 100% bērnu, savukārt glikokortikoīdu terapijas laikā 60% bērnu abiem citokīniem. CD gadījumā IL1a, IL8 palielinās terapijas laikā ar aminosalicilātiem visiem bērniem un glikokortikoīdu terapijas laikā attiecīgi 55,5% un 77,7% bērnu. Tādējādi šī pētījuma rezultāti liecina par imūnsistēmas makrofāgu saites nozīmīgu iesaistīšanos patoģenētiskajā procesā lielākajā daļā bērnu ar UC un CD. Šajā pētījumā iegūtie dati būtiski neatšķiras no datiem, kas iegūti pieaugušo pacientu pārbaudes laikā. Atšķirības IL1a un IL8 līmeņos pacientiem ar UC un CD ir kvantitatīvas, bet ne kvalitatīvas, kas liecina par šo izmaiņu nespecifisko raksturu hroniska iekaisuma procesa gaitā. Tāpēc šiem rādītājiem nav diagnostiskas vērtības. Dinamiska IL1a un IL8 līmeņa pētījuma rezultāti apstiprina augstāku terapijas efektivitāti ar glikokortikoīdu zālēm, salīdzinot ar terapiju ar aminosaliciliem. Iesniegtie dati ir pirmā posma pētījuma par bērnu ar IBT citokīnu stāvokli pētījuma rezultāts. Nepieciešama turpmāka problēmas izpēte, ņemot vērā citu pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīnu rādītājus.

Slāpekļa oksīda un citokīnu loma akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā.

T. A. Šumatova, V. B. Šumatovs, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya pēta šo problēmu: Vladivostokas Valsts medicīnas universitātes Anestezioloģijas un reanimatoloģijas katedra. Akūts plaušu traumas sindroms (pieaugušo elpošanas distresa sindroms, ARDS) ir viena no smagākajām akūtas elpošanas mazspējas formām, kas rodas pacientiem ar smagu traumu, sepsi, peritonītu, pankreatītu, bagātīgu asins zudumu, aspirāciju, pēc plašas ķirurģiskas iejaukšanās un 50. 60% gadījumu ir letāli. Pētījumu dati par ARDS patoģenēzi, sindroma agrīnas diagnostikas un prognozēšanas kritēriju izstrāde ir maz, drīzāk pretrunīgi, kas neļauj izstrādāt saskaņotu diagnostikas un terapeitisko koncepciju. Tika konstatēts, ka ARDS pamatā ir plaušu kapilāru un alveolārā epitēlija endotēlija bojājums, asins reoloģisko īpašību pārkāpums, izraisot intersticiālu un alveolāro audu tūsku, iekaisumu, atelektāzi, plaušu hipertensiju. Pēdējo gadu literatūrā ir pietiekami daudz informācijas par šūnu un audu metabolisma universālo regulatoru - slāpekļa oksīdu. Interese par slāpekļa oksīdu (NO) galvenokārt ir saistīta ar faktu, ka tā ir iesaistīta daudzu funkciju regulēšanā, ieskaitot asinsvadu tonusu, sirds kontraktilitāti, trombocītu agregāciju, neirotransmisiju, ATP un olbaltumvielu sintēzi, kā arī imūno aizsardzību. Turklāt, atkarībā no molekulārā mērķa izvēles un mijiedarbības ar to īpašībām, NO ir arī kaitīgs efekts. Tiek uzskatīts, ka šūnu aktivācijas iedarbināšanas mehānisms ir nelīdzsvarota citokinēmija. Citokīni ir šķīstoši peptīdi, kas darbojas kā imūnsistēmas mediatori un nodrošina šūnu sadarbību, pozitīvu un negatīvu imūnregulāciju. Mēs centāmies sistematizēt literatūrā pieejamo informāciju par NO un citokīnu lomu akūta plaušu bojājuma sindroma attīstībā. NO ir ūdenī un taukos šķīstoša gāze. Tās molekula ir nestabils brīvais radikālis, viegli izkliedējas audos, uzsūcas un iznīcinās tik ātri, ka var ietekmēt tikai tuvākās vides šūnas. NO molekulai piemīt visas īpašības, kas raksturīgas klasiskajiem kurjeriem: tā tiek ātri ražota, darbojas ļoti zemā koncentrācijā, pēc ārējā signāla pārtraukšanas tā ātri pārvēršas citos savienojumos, oksidējoties līdz stabiliem neorganiskiem slāpekļa oksīdiem: nitrītiem un nitrātiem. Saskaņā ar dažādiem avotiem NO kalpošanas laiks audos ir no 5 līdz 30 sekundēm. Galvenie NO molekulārie mērķi ir dzelzi saturoši enzīmi un olbaltumvielas: šķīstošā guanilāta ciklāze, pati nitrooksīda sintāze (NOS), hemoglobīns, mitohondriju enzīmi, Krebsa cikla enzīmi, olbaltumvielu sintēze un DNS sintēze. NO sintēze organismā notiek, fermentatīvi pārveidojot aminoskābi L-arginīnu saturošo daļu specifiska enzīma NOS ietekmē, un to ietekmē kalcija jonu mijiedarbība ar kalmodulīnu. Ferments ir inaktivēts zemās koncentrācijās un ir maksimāli aktīvs pie 1 μM brīva kalcija. Ir identificētas divas NOS izoformas: konstitutīva (cNOS) un inducēta (iNOS), kas ir dažādu gēnu produkti. Šūnā pastāvīgi atrodas no kalcija-kalmodulīna atkarīgs cNOS un veicina nelielu NO daudzumu izdalīšanos, reaģējot uz receptoru un fizisko stimulāciju. NO, kas radīts šīs izoforma ietekmē, darbojas kā nesējs vairākās fizioloģiskās reakcijās. No kalcija-kalmodulīna neatkarīgais iNOS veidojas dažādos šūnu veidos, reaģējot uz pretiekaisuma citokīniem, endotoksīniem un oksidētājiem. Šo NOS izoformu 17. hromosomā pārraksta specifiski gēni un tas veicina liela NO daudzuma sintēzi. Fermentu klasificē arī trīs veidos: NOS-I (neironu), NOS-II (makrofāgi), NOS-III (endotēlijs). Fermentu saime, kas sintezē NO, ir sastopama dažādās plaušu šūnās: bronhu epitēlija šūnās, alveolocītos, alveolārajos makrofāgos, tuklajās šūnās, bronhu artēriju un vēnu endotēlija šūnās, gludos bronhu un asinsvadu miocītos, neadrenerģiskos neholīnerģiskos neironos. Cilvēku un zīdītāju bronhu un alveolu epitēlija šūnu konstitutīvā spēja izdalīt NO ir apstiprināta daudzos pētījumos. Ir konstatēts, ka cilvēka elpošanas ceļu augšējās daļas, kā arī apakšējās daļas ir iesaistītas NO veidošanā. Pētījumi, kas veikti ar pacientiem ar traheostomiju, parādīja, ka gāzes daudzums gaisā, kas izelpots caur traheostomiju, ir ievērojami mazāks nekā deguna un mutes dobumā. Ievērojami cieš endogēnā NO sintēze pacientiem ar mehānisku ventilāciju. Pētījumi apstiprina, ka NO izdalīšanās notiek bronhodilatācijas laikā un to kontrolē klejotājnervu sistēma. Ir iegūti dati, ka NO veidošanās cilvēka elpceļu epitēlijā palielinās elpošanas sistēmas iekaisuma slimību gadījumā. Gāzu sintēze tiek pastiprināta, jo citokīnu, kā arī endotoksīnu un lipopolisaharīdu ietekmē tiek aktivizēts inducētais NOS.

Pašlaik ir zināmi vairāk nekā simts citokīnu, kas tradicionāli ir sadalīti vairākās grupās.

1. Interleikīni (IL -1 - IL18) - sekrēcijas regulējošie proteīni, kas nodrošina starpnieku mijiedarbību imūnsistēmā un tās saistību ar citām ķermeņa sistēmām.

2. Interferoni (IFN -alfa, beta, gamma) - pretvīrusu citokīni ar izteiktu imūnregulējošu efektu.

3. Audzēja nekrozes faktori (alfa TNF, beta) ir citokīni ar citotoksisku un regulējošu iedarbību.

4. Koloniju stimulējošie faktori (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-asinsrades šūnu augšanas un diferenciācijas stimulatori, kas regulē asinsradi.

5. Hemokīni (IL-8, IL-16)-leikocītu ķīmijatraktanti.

6. Augšanas faktori - dažādu audu piederības šūnu augšanas, diferenciācijas un funkcionālās aktivitātes regulatori (fibroblastu augšanas faktors, endotēlija šūnu augšanas faktors, epidermas augšanas faktors) un transformējošie augšanas faktori (TGF beta).

Šīs bioregulējošās molekulas nosaka iekaisuma un imūnās atbildes veidu un ilgumu, kontrolē šūnu proliferāciju, asinsradi, angioģenēzi, brūču dzīšanu un daudzus citus procesus. Visi pētnieki uzsver, ka citokīniem trūkst specifiskuma attiecībā uz antigēniem. Eksperimenti ar kultivētiem plaušu makrofāgiem un tuklajām šūnām ir parādījuši iNOS veidošanos, reaģējot uz gamma interferonu, interleikīnu-1, audzēja nekrozes faktoru un lipopolisaharīdiem. INOS un cNOS ekspresija pretiekaisuma citokīniem tika konstatēta dzīvnieku un cilvēku alveolocītos. Epidermas augšanas faktora, epitēlija šūnu funkcijas regulatora, pievienošana kultūrai samazināja tikai inducētā enzīma aktivitāti. Ir zināms, ka atkarībā no rakstura citokīni iedarbojas autokrīni - uz pašām ražotājšūnām, parakrīni - uz citām mērķa šūnām vai endokrīno sistēmu - uz dažādām šūnām ārpus to ražošanas vietas. Tajā pašā laikā tie var mijiedarboties viens ar otru saskaņā ar agonistisku vai antagonistisku principu, mainot mērķa šūnu funkcionālo stāvokli un veidojot citokīnu tīklu. Tādējādi citokīni nav izolēti peptīdi, bet gan neatņemama sistēma, kuras galvenās sastāvdaļas ir ražotāja šūnas, pats proteīns ir citokīns, tā receptors un mērķa šūna. Tika konstatēts, ka, attīstoties akūtiem plaušu bojājumiem, palielinās pretiekaisuma citokīnu līmenis: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. To iedarbība ir saistīta ar asinsvadu paplašināšanos, to caurlaidības palielināšanos un šķidruma uzkrāšanos plaušu audos. Turklāt pētījumi ir parādījuši IFN gamma un TNF alfa spēju izraisīt adhēzijas molekulu - ICAM -1 - ekspresiju uz cilvēka endotēlija šūnām. Adhēzijas molekulas, pieķeroties leikocītiem, trombocītiem un endotēlija šūnām, veido "ripojošus" neitrofilus un veicina fibrīna daļiņu agregāciju. Šie procesi veicina kapilāru asins plūsmas pārkāpumu, palielina kapilāru caurlaidību un izraisa lokālu audu tūsku. Kapilāro asinsrites palēnināšanos veicina NO aktivizēšana, kas izraisa arteriolu paplašināšanos. Leikocītu tālāku migrāciju uz iekaisuma fokusu kontrolē īpaši citokīni - ķīmokīni, kurus ražo un izdala ne tikai aktivētie makrofāgi, bet arī endotēlija šūnas, fibroblasti, gludie miocīti. To galvenā funkcija ir piegādāt neitrofilus iekaisuma fokusam un aktivizēt to funkcionālo aktivitāti. Galvenais neitrofilu ķīmokīns ir Il-8. Tās spēcīgākie induktori ir baktēriju lipopolisaharīdi, IL-1 un TNFalpha. R. Bahra u.c. uzskatu, ka katru neitrofilu transendoteliālās migrācijas posmu regulē, stimulējot TNF alfa koncentrāciju. Attīstoties akūtiem plaušu bojājumiem, tiek aktivizēti asinsvadu endotheliocīti, bronhu epitēlija šūnas un alveolārie makrofāgi, kas ir iesaistīti fāzes mijiedarbībā. Tā rezultātā, no vienas puses, notiek to mobilizācija un aizsargājošo īpašību uzlabošanās, un, no otras puses, ir iespējami pašu šūnu un apkārtējo audu bojājumi. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka daļējas skābekļa samazināšanas produkts, superoksīds, var uzkrāties iekaisuma fokusā, kas inaktivē NO vazoaktīvo efektu. NO un superoksīda anjons ātri reaģē, veidojot šūnas bojājošu peroksinitrītu. Šī reakcija veicina NO noņemšanu no asinsvadu un bronhu sieniņām, kā arī no alveolocītu virsmas. Interesanti ir pētījumi, kas liecina, ka tradicionāli peroksinitrīts tiek uzskatīts par NO toksicitātes starpnieku, un tam var būt fizioloģiska iedarbība, un tas var izraisīt asinsvadu relaksāciju, izmantojot NO starpniecību palielinātu cGMP asinsvadu endotēlijā. Savukārt peroksinitrīts ir spēcīgs oksidētājs, kas spēj sabojāt alveolāro epitēliju un plaušu virsmaktīvo vielu. Tas izraisa membrānas proteīnu un lipīdu iznīcināšanu, bojā endotēliju, palielina trombocītu agregāciju un piedalās endotoksēmijā. Tā pastiprināta veidošanās tika novērota akūta plaušu bojājuma sindroma gadījumā. Pētnieki uzskata, ka inducētā enzīma aktivācijas rezultātā radītais NO ir paredzēts nespecifiskai ķermeņa aizsardzībai pret plašu patogēnu klāstu, kavē trombocītu agregāciju un uzlabo vietējo asinsriti. Tika konstatēts, ka pārmērīgs NO daudzums kavē cNOS aktivitāti šūnās mijiedarbības ar superoksīdu dēļ un, iespējams, guanilāta ciklāzes desensibilizācijas rezultātā, kā rezultātā samazinās cGMP šūnā un palielinās intracelulārais kalcijs . Brett et al. un Kooy et al., analizējot nitrooksidērisko mehānismu nozīmi ARDS patoģenēzē, ierosināja, ka sindroma attīstībā galvenā loma var būt iNOS, peroksinitrītam un nitrotirozīnam, kas ir galvenais peroksinitrīta ietekmes uz proteīnu produkts. Cuthbertson et al. uzskata, ka akūta plaušu bojājuma pamatā ir NO un peroksinitrīta ietekme uz elastāzi un interleikīnu-8. Kobayashi u.c. reģistrēja arī iNOS, interleikīna-1, interleikīna-6, interleikīna-8 satura palielināšanos bronhu-alveolārajā šķidrumā pacientiem ar akūtu plaušu traumu sindromu. Meldrum u.c. parādīja iekaisuma citokīnu ražošanas samazināšanos ar plaušu makrofāgiem ARDS vietējās NO - L -arginīna ražošanas substrāta ietekmē. Ir konstatēts, ka akūta plaušu bojājuma sindroma ģenēzē nozīmīgu lomu spēlē asinsvadu caurlaidības traucējumi, ko izraisa citokīnu darbība-TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monoklonālās antivielas pret CD3 limfocītiem uz asinsvadu endotēlija šūnām. plaušās un imūncītos. Strauja un spēcīga plaušu asinsvadu caurlaidības palielināšanās noved pie neitrofilu migrācijas plaušu audos un citotoksisko mediatoru izdalīšanās, kas izraisa patoloģisku plaušu izmaiņu attīstību. Akūtas plaušu traumas attīstības laikā TNF alfa palielina neitrofilu saķeri ar asinsvadu sieniņām, uzlabo to migrāciju audos, veicina strukturālās un vielmaiņas izmaiņas endoteliocītos, izjauc šūnu membrānu caurlaidību, aktivizē citu citokīnu un eikosanoīdu veidošanos, un izraisa plaušu epitēlija šūnu apoptozi un nekrozi. Iegūtie dati liecina, ka makrofāgu apoptoze, ko izraisa LPS ieviešana, lielā mērā ir saistīta ar IFN gamma un to samazina IL-4, IL-10, TGF beta darbība. Tomēr Kobayashi et al. iegūti dati, kas norāda, ka IFN gamma var būt iesaistīta elpceļu gļotādas epitēlija atjaunošanā. Hagimoto pētījumi satur informāciju, ka bronhu un alveolu epitēlija šūnas, reaģējot uz TNF alfa vai Fas ligandu, atbrīvo IL-8, IL-12. Šis process ir saistīts ar kodolfaktora Carr-B aktivizēšanu ar Fas ligandu.

Tiek uzskatīts, ka IL-8 ir viens no svarīgākajiem citokīniem akūtu plaušu bojājumu patofizioloģijā. Millers u.c. pētot bronhu-alveolāro šķidrumu pacientiem ar ARDS pret sesijas fona, tika konstatēts ievērojams IL-8 līmeņa paaugstināšanās, salīdzinot ar pacientiem ar kardiogēnu plaušu tūsku. Ir ierosināts, ka primārais Il-8 avots ir plaušas, un šo kritēriju var izmantot sindroma diferenciāldiagnozē. Grau u.c. uzskata, ka plaušu kapilāru endotēlija šūnas ir svarīgs citokīnu-IL-6, IL-8-avots akūtu plaušu bojājumu attīstībā. Gudmens u.c. Pētot citokīnu līmeņa dinamiku bronhu-alveolāro skalošanas šķidrumā pacientiem ar ARDS, ievērojami palielinājās IL-1beta, IL-8, monocītiskais ķīmotaktiskais peptīds-1, epitēlija šūnu neitrofīlais aktivators, makrofāgu iekaisuma peptīds -1 alfa tika atrasts. Tajā pašā laikā autori uzskata, ka IL-1 beta satura palielināšanās var kalpot kā sindroma nelabvēlīgā iznākuma marķieris. Bauer et al. tika pierādīts, ka kontroli pār IL-8 saturu bronhu-alveolārajā šķidrumā pacientiem ar ARDS var izmantot uzraudzībai, IL-8 līmeņa pazemināšanās norāda uz nelabvēlīgu procesa gaitu. Vairāki pētījumi satur arī informāciju, ka plaušu asinsvadu endotēlija citokīnu ražošanas līmenis ietekmē akūtu plaušu bojājumu attīstību un kuru kontroli var izmantot klīniskajā praksē agrīnai diagnostikai. Par iespējamām negatīvām sekām, ko izraisa proinflammatorisku citokīnu līmeņa paaugstināšanās pacientiem ar ARDS, liecina Martin et al., Warner et al. Pētījumi. Aktivizēti ar citokīniem un baktēriju endotoksīniem, alveolārie makrofāgi palielina NO sintēzi. Palielinās arī NO ražošanas līmenis bronhu un alveolu epitēlija šūnās, neitrofilos, tuklajās šūnās, endotēlija šūnās un plaušu asinsvadu gludajos miocītos, iespējams, aktivizējot kodolfaktoru Carr-B. Autori uzskata, ka slāpekļa oksīds, kas rodas indukētās NOS aktivācijas rezultātā, galvenokārt ir paredzēts nespecifiskai organisma aizsardzībai. No makrofāgiem atbrīvotais NO ātri iekļūst baktērijās un sēnītēs, kur tas inhibē trīs vitāli svarīgas enzīmu grupas: H-elektronu transportu, Krebsa ciklu un DNS sintēzi. NĒ ir iesaistīts ķermeņa aizsardzībā imūnās atbildes pēdējās stadijās un tiek tēlaini uzskatīts par imūnsistēmas "sodošo zobenu". Tomēr, uzkrājoties šūnā neadekvāti lielos daudzumos, NO ir arī kaitīgs efekts. Tādējādi, attīstoties akūta plaušu bojājuma sindromam, citokīni un NO izraisa secīgu reakciju ķēdi, kas izpaužas kā mikrocirkulācijas traucējumi, audu hipoksija, alveolāra un intersticiāla tūska, kā arī plaušu vielmaiņas funkcijas bojājumi. Tāpēc var apgalvot, ka citokīnu un NO fizioloģisko un patofizioloģisko darbības mehānismu izpēte ir daudzsološs pētījumu virziens un nākotnē ļaus ne tikai paplašināt izpratni par ARDS patoģenēzi, bet arī noteikt un sindroma prognostiskie marķieri, lai izstrādātu iespējas patogēniski balstītai terapijai, kuras mērķis ir samazināt letalitāti.

Citokīnu noteikšanas metodes.

Pārskats ir veltīts pašreiz izmantoto citokīnu pētīšanas galvenajām metodēm. Īsi aprakstītas metožu iespējas un mērķis. Tiek parādītas dažādu pieeju priekšrocības un trūkumi citokīnu gēnu ekspresijas analīzei nukleīnskābju līmenī un olbaltumvielu ražošanas līmenī. (Citokīni un iekaisums. 2005. T. 4, Nr. 1. S. 22-27.)

Citokīni ir regulējoši proteīni, kas veido universālu mediatoru tīklu, kas raksturīgs gan imūnsistēmai, gan citu orgānu un audu šūnām. Visi šūnu notikumi notiek šīs regulējošo olbaltumvielu klases kontrolē: proliferācija, diferenciācija, apoptoze un specializēta šūnu funkcionālā aktivitāte. Katra citokīna ietekmi uz šūnām raksturo pleiotropija, dažādu mediatoru iedarbības spektrs pārklājas un kopumā šūnas galīgais funkcionālais stāvoklis ir atkarīgs no vairāku sinerģiski iedarbīgu citokīnu ietekmes. Tādējādi citokīnu sistēma ir universāls, polimorfs mediatoru regulatīvais tīkls, kas paredzēts šūnu elementu proliferācijas, diferenciācijas, apoptozes un funkcionālās aktivitātes procesu kontrolei asinsrades, imūnās un citās ķermeņa homeostatiskajās sistēmās. Citokīnu noteikšanas metodes 20 gadu intensīvās izpētes laikā ir ļoti strauji attīstījušās, un mūsdienās tās ir vesela zinātnisko zināšanu joma. Citokineoloģijas pētnieki sava darba sākumā saskaras ar jautājumu par metodes izvēli. Un šeit pētniekam precīzi jāzina, kāda informācija viņam jāiegūst, lai sasniegtu izvirzīto mērķi. Pašlaik ir izstrādāti simtiem dažādu metožu citokīnu sistēmas novērtēšanai, kas sniedz daudzveidīgu informāciju par šo sistēmu. Citokīnu novērtējumu dažādās bioloģiskās barotnēs var balstīt uz specifisku bioloģisko aktivitāti. Tos var kvantitatīvi noteikt, izmantojot dažādas imūnanalīzes metodes, izmantojot poli- un monoklonālās antivielas. Papildus citokīnu sekrēcijas formu izpētei ir iespējams izpētīt to intracelulāro saturu un ražošanu audos, izmantojot plūsmas citometriju, Western blotēšanu un in situ imūnhistoķīmiju. Ļoti svarīgu informāciju var iegūt, pētot citokīnu mRNS ekspresiju, mRNS stabilitāti, citokīnu mRNS izoformu klātbūtni, dabiskas antisensu nukleotīdu sekvences. Citokīnu gēnu alēlisko variantu izpēte var sniegt svarīgu informāciju par ģenētiski ieprogrammētu augsta vai zema viena vai otra starpnieka ražošanu. Katrai metodei ir savi trūkumi un priekšrocības, sava izšķirtspēja un noteikšanas precizitāte. Pētnieka nezināšana un šo nianšu neizpratne var novest pie kļūdainiem secinājumiem.

Citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšana.

Atklāšanas vēsture un pirmie soļi citokīnu izpētē bija cieši saistīti ar imūnkompetentu šūnu un šūnu līniju audzēšanu. Pēc tam tika parādīta vairāku olbaltumvielu šķīstošo faktoru regulējošā ietekme (bioloģiskā aktivitāte) uz limfocītu proliferācijas aktivitāti, imūnglobulīnu sintēzi un imūnās atbildes reakciju attīstību in vitro modeļos. Viena no pirmajām metodēm mediatoru bioloģiskās aktivitātes noteikšanai ir cilvēka limfocītu migrācijas faktora un tā inhibīcijas faktora noteikšana. Tā kā citokīnu bioloģiskā iedarbība ir pētīta, ir parādījušās dažādas metodes to bioloģiskās aktivitātes novērtēšanai. Tādējādi IL-1 tika noteikts, novērtējot peles timocītu proliferāciju in vitro, IL-2-ar spēju stimulēt limfoblastu proliferācijas aktivitāti, IL-3-ar asinsrades koloniju augšanu in vitro, IL-4-ar komitogēno efektu, palielinot Ia proteīnu ekspresiju, izraisot IgG1 un IgE veidošanos utt. Šo metožu sarakstu var turpināt, tas tiek pastāvīgi atjaunināts, atklājot jaunas šķīstošo faktoru bioloģiskās aktivitātes. To galvenais trūkums ir nestandarta metodes, to apvienošanas neiespējamība. Tālāk attīstot metodes citokīnu bioloģiskās aktivitātes noteikšanai, tika izveidots liels skaits šūnu līniju, kas jutīgas pret vienu vai otru citokīnu, vai daudzjutīgas līnijas. Lielāko daļu šo citokīnu jutīgo šūnu tagad var atrast komerciālos šūnu līniju sarakstos. Piemēram, IL-1a un b testēšanai tiek izmantota D10S šūnu līnija, IL-2 un IL-15-CTLL-2 šūnu līnija, IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL -13, GM -CSF - šūnu līnija TF -1, IL -6 - šūnu līnija B9, IL -7 - šūnu līnija 2E8, TNFa un TNFb - šūnu līnija L929, IFNg - šūnu līnija WiDr, IL-18-šūnu līnijas līnija KG-1. Tomēr šai pieejai imūnaktīvo proteīnu pētīšanai, kā arī labi zināmām priekšrocībām, piemēram, nobriedušu un aktīvu proteīnu reālās bioloģiskās aktivitātes mērīšanai, augsta reproducējamība standartizētos apstākļos, ir savi trūkumi. Tie ietver, pirmkārt, šūnu līniju jutību nevis pret vienu citokīnu, bet gan pret vairākiem saistītiem citokīniem, kuru bioloģiskā iedarbība pārklājas. Turklāt nevar izslēgt iespēju, ka mērķa šūnas var izraisīt citu citokīnu veidošanos, kas var izkropļot pārbaudīto parametru (parasti proliferācija, citotoksicitāte, ķīmotaksis). Mēs vēl nezinām visus citokīnus un ne visus to efektus, tāpēc mēs vērtējam nevis pašu citokīnu, bet kopējo specifisko bioloģisko aktivitāti. Tādējādi bioloģiskās aktivitātes novērtēšana kā dažādu mediatoru kopējā aktivitāte (specifiskuma trūkums) ir viens no šīs metodes trūkumiem. Turklāt, izmantojot citokīniem jutīgas līnijas, nav iespējams identificēt inaktivētās molekulas un saistītos proteīnus. Tas nozīmē, ka šādas metodes neatspoguļo faktisko vairāku citokīnu ražošanu. Vēl viens svarīgs šūnu līniju izmantošanas trūkums ir nepieciešamība pēc šūnu kultūras laboratorijas. Turklāt visas procedūras šūnu audzēšanai, to inkubēšanai ar pētāmajiem proteīniem un barotnēm ir laikietilpīgas. Jāatzīmē arī tas, ka ilgstošai šūnu līniju izmantošanai nepieciešama atjaunošana vai atkārtota sertifikācija, jo audzēšanas rezultātā tās var mutēt un modificēties, kā rezultātā var mainīties to jutība pret mediatoriem un samazināties bioloģiskās aktivitātes noteikšana. Tomēr šī metode ir ideāli piemērota rekombinanto mediatoru specifiskās bioloģiskās aktivitātes pārbaudei.

Citokīnu kvantitatīva noteikšana, izmantojot antivielas.

Citokīni, ko ražo imūnkompetentas un cita veida šūnas, tiek izlaisti ārpusšūnu telpā, lai veiktu parakrīnas un autokrīnas signalizācijas mijiedarbību. Pēc šo proteīnu koncentrācijas asins serumā vai kondicionētā vidē var spriest par patoloģiskā procesa raksturu un noteiktu šūnu funkciju pārpalikumu vai trūkumu pacientam. Metodes citokīnu noteikšanai, izmantojot specifiskas antivielas, šodien ir visizplatītākās šo proteīnu noteikšanas sistēmas. Šīs metodes ir izgājušas veselu virkni modifikāciju, izmantojot dažādas etiķetes (radioizotopu, fluorescējošu, elektroķīmiski luminiscējošu, fermentu utt.). Ja radioizotopu metodēm ir vairāki trūkumi, kas saistīti ar radioaktīvā marķējuma izmantošanu un ierobežotu iespēju izmantot marķētos reaģentus (pussabrukšanas periods), tad ar enzīmiem saistītās imūnsorbējošās metodes ir atradušas visplašāko pielietojumu. To pamatā ir nešķīstošu fermentatīvas reakcijas produktu vizualizācija, absorbējot gaismu ar zināmu viļņu garumu tādā daudzumā, kas ir līdzvērtīgs analizējamās vielas koncentrācijai. Antivielas, kas uzklātas uz cietas polimēra bāzes, izmanto, lai saistītu mērāmās vielas, un attēlveidošanai tiek izmantotas antivielas, kas konjugētas ar fermentiem, parasti sārmainās fosfatāzes vai mārrutku peroksidāzes palīdzību. Metodes priekšrocības ir acīmredzamas: augsta noteikšanas precizitāte reaģentu un procedūru standartizētos uzglabāšanas apstākļos, kvantitatīvā analīze un reproducējamība. Trūkumi ietver ierobežotu noteikto koncentrāciju diapazonu, kā rezultātā visas koncentrācijas, kas pārsniedz noteiktu slieksni, tiek uzskatītas par vienādām ar to. Jāatzīmē, ka metodes pabeigšanai nepieciešamais laiks atšķiras atkarībā no ražotāja ieteikumiem. Tomēr jebkurā gadījumā mēs runājam par vairākām stundām, kas nepieciešamas inkubācijām un reaģentu mazgāšanai. Turklāt tiek noteiktas slēptās un saistītās citokīnu formas, kuru koncentrācija var ievērojami pārsniegt brīvās formas, kas galvenokārt ir atbildīgas par starpnieka bioloģisko aktivitāti. Tāpēc ir vēlams izmantot šo metodi kopā ar metodēm starpnieka bioloģiskās aktivitātes novērtēšanai. Vēl viena plaša pielietojuma imūnanalīzes metodes modifikācija ir elektroķīmiskās luminiscences metode (ECL) proteīnu noteikšanai ar antivielām, kas marķētas ar rutēniju un biotīnu. Šai metodei ir šādas priekšrocības salīdzinājumā ar radioizotopu un enzīmu imūnanalīzēm: vienkārša ieviešana, īss metodes izpildes laiks, mazgāšanas procedūru neesamība, mazs parauga tilpums, liels noteikto citokīnu koncentrāciju diapazons serumā un kondicionētā vidē, augsta jutība metode un tās reproducējamība. Apskatāmā metode ir pieņemama izmantošanai gan zinātniskos pētījumos, gan klīniskajos pētījumos. Nākamā metode citokīnu novērtēšanai bioloģiskajā vidē ir izstrādāta, pamatojoties uz plūsmas fluorimetrijas tehnoloģiju. Tas ļauj vienlaikus novērtēt līdz simtiem olbaltumvielu paraugā. Pašlaik ir izveidoti komerciāli komplekti līdz 17 citokīnu noteikšanai. Tomēr šīs metodes priekšrocības nosaka arī tās trūkumus. Pirmkārt, tas ir darbietilpīgi, izvēloties optimālus apstākļus vairāku proteīnu noteikšanai, un, otrkārt, citokīnu ražošana ir kaskādes raksturs ar ražošanas maksimumu dažādos laikos. Tāpēc liela skaita olbaltumvielu noteikšana vienlaicīgi ne vienmēr ir informatīva. Vispārējā prasība pēc imūnanalīzes metodēm, izmantojot t.s. "sviestmaize" ir rūpīga antivielu pāra atlase, kas ļauj noteikt analizētā proteīna brīvo vai saistīto formu, kas ierobežo šo metodi un kas vienmēr jāņem vērā, interpretējot iegūtos datus. Šīs metodes nosaka kopējo citokīnu ražošanu dažādās šūnās, tajā pašā laikā ir iespējams tikai hipotētiski spriest par antigēnu specifisko citokīnu veidošanos, ko veic imūnkompetentās šūnas. Tagad ir izstrādāta sistēma ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), kas lielā mērā novērš šos trūkumus. Metode ļauj daļēji kvantitatīvi novērtēt citokīnu ražošanu atsevišķu šūnu līmenī. Šīs metodes augstā izšķirtspēja ļauj novērtēt antigēnu stimulētu citokīnu veidošanos, kas ir ļoti svarīgi, lai novērtētu specifisku imūnreakciju. Nākamā, zinātniskiem nolūkiem plaši izmantota metode ir citokīnu intracelulārā noteikšana ar plūsmas citometriju. Tās priekšrocības ir acīmredzamas. Mēs varam fenotipiski raksturot citokīnus ražojošo šūnu populāciju un / vai noteikt citokīnu spektru, ko ražo atsevišķas šūnas, ar iespēju salīdzinoši kvantitatīvi raksturot šo produkciju. Tajā pašā laikā aprakstītā metode ir diezgan sarežģīta un prasa dārgu aprīkojumu. Nākamā metožu sērija, ko galvenokārt izmanto zinātniskiem mērķiem, ir imūnhistoķīmiskās metodes, izmantojot marķētas monoklonālās antivielas. Priekšrocības ir acīmredzamas - citokīnu ražošanas noteikšana tieši audos (in situ), kur notiek dažādas imunoloģiskas reakcijas. Tomēr apsvērtās metodes ir ļoti darbietilpīgas un nesniedz precīzus kvantitatīvus datus.

Citokīnu noteikšana ar fermentu imūnanalīzi.

Vector-Best CJSC T.G. vadībā. Rjabičeva, N.A. Varaksins, N.V. Timofejeva, M. Ju. Rukavišņikovs aktīvi strādā pie citokīnu noteikšanas. Citokīni ir polipeptīdu mediatoru grupa, bieži glikozilēta, ar molekulmasu no 8 līdz 80 kDa. Citokīni ir iesaistīti ķermeņa aizsardzības reakciju un homeostāzes veidošanā un regulēšanā. Viņi ir iesaistīti visās humorālās un šūnu imūnās atbildes saiknēs, ieskaitot imūnkompetentu cilmes šūnu diferenciāciju, antigēna prezentāciju, šūnu aktivāciju un proliferāciju, adhēzijas molekulu ekspresiju un akūtas fāzes reakciju. Daži no tiem spēj parādīt daudzus bioloģiskus efektus uz dažādām mērķa šūnām. Citokīnu iedarbība uz šūnām tiek veikta šādos veidos: autokrīna - uz šūnu, kas sintezē un izdala šo citokīnu; parakrīns - uz šūnām, kas atrodas netālu no ražotāja šūnas, piemēram, iekaisuma fokusā vai limfoīdajā orgānā; endokrīni attālināti - uz jebkuru orgānu un audu šūnām pēc citokīna nonākšanas asinsritē. Citokīnu veidošanās un izdalīšanās parasti ir īslaicīga un stingri regulēta. Citokīni iedarbojas uz šūnu, saistoties ar specifiskiem citoplazmas membrānas receptoriem, tādējādi izraisot reakciju kaskādi, kas izraisa vairāku to regulētu gēnu aktivitātes indukciju, pastiprināšanos vai nomākšanu. Citokīniem ir raksturīgs sarežģīts funkcionēšanas tīkls, kurā viena no tiem ražošana ietekmē vairāku citu aktivitāšu veidošanos vai izpausmi. Citokīni ir vietējie mediatori; tādēļ ir ieteicams izmērīt to līmeni attiecīgajos audos pēc audu proteīnu ekstrakcijas no attiecīgo orgānu biopsijām vai dabīgos šķidrumos: urīnā, asaru šķidrumā, smaganu kabatas šķidrumā, bronhu -alveolārā skalošanā, maksts sekrēcijās, ejakulātā. , mazgā no dobumiem, muguras smadzenēm vai sinoviālajiem šķidrumiem utt. Papildu informāciju par ķermeņa imūnsistēmas stāvokli var iegūt, pētot asins šūnu spēju ražot citokīnus in vitro. Plazmas citokīnu līmenis atspoguļo imūnsistēmas pašreizējo stāvokli un aizsardzības reakciju attīstību in vivo. Spontāna citokīnu ražošana ar perifēro asiņu mononukleāro šūnu kultūru ļauj novērtēt atbilstošo šūnu stāvokli. Palielināta spontāna citokīnu ražošana norāda, ka šūnas jau ir aktivizētas ar antigēnu in vivo. Indukētā citokīnu ražošana ļauj novērtēt attiecīgo šūnu potenciālo spēju reaģēt uz antigēnu stimulāciju. Samazināta citokīnu indukcija in vitro var kalpot kā viena no imūndeficīta stāvokļa pazīmēm. Tāpēc abas iespējas citokīnu līmeņa izpētei gan cirkulējošās asinīs, gan to ražošanas laikā, izmantojot šūnu kultūras, ir svarīgas no visa organisma imūnreaktivitātes un imūnsistēmas atsevišķu saišu funkcijas raksturošanas viedokļa. Vēl nesen Krievijā dažas pētnieku grupas nodarbojās ar citokīnu izpēti, jo bioloģiskās izpētes metodes ir ļoti laikietilpīgas, un importētie imūnķīmiskie komplekti ir ļoti dārgi. Līdz ar pieejamo vietējo ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas komplektu parādīšanos praktizējošie ārsti izrāda arvien lielāku interesi par citokīnu profila izpēti. Šobrīd citokīnu līmeņa novērtēšanas diagnostiskā nozīme ir konstatēt to koncentrācijas palielināšanās vai samazināšanās faktu konkrētam pacientam ar noteiktu slimību. Turklāt, lai novērtētu slimības smagumu un prognozētu tās gaitu, ir ieteicams noteikt gan pretiekaisuma, gan pretiekaisuma citokīnu koncentrāciju patoloģijas attīstības dinamikā. Piemēram, citokīnu saturu perifērās asinīs nosaka paasinājuma laiks, atspoguļo patoloģiskā procesa dinamiku peptiskās čūlas slimības un citu kuņģa -zarnu trakta slimību gadījumā. Paasinājuma agrīnākajos posmos dominē interleikīna-1beta (IL-1beta), interleikīna-8 (IL-8) satura palielināšanās, pēc tam interleikīna-6 (IL-6), gamma-interferona (gamma) koncentrācija -INF), audzēja nekrozes faktors palielinās -alfa (alfa -TNF). Interleikīna-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF koncentrācija sasniedza maksimumu slimības augstumā, bet akūtās fāzes marķieru saturs šajā periodā tuvojās normālām vērtībām. Paasinājuma maksimuma laikā alfa-TNF līmenis ievērojami pārsniedza interleikīna-4 (IL-4) saturu gan asins serumā, gan tieši skartajos peri-čūlas zonas audos, pēc tam tas sāka pakāpeniski samazināties. samazināt. Samazinoties akūtas fāzes parādībām un pastiprinoties remonta procesiem, IL-4 koncentrācija palielinājās. Izmaiņas citokīnu profilā var izmantot, lai novērtētu ķīmijterapijas efektivitāti un iespējamību. Veicot citokīnu terapiju, piemēram, terapijas laikā ar alfa-interferonu (alfa-IFN), ir nepieciešams kontrolēt gan tā satura līmeni cirkulējošās asinīs, gan antivielu veidošanos pret alfa-IFN. Ir zināms, ka tad, kad tiek ražots liels skaits šo antivielu, terapija ar interferonu ne tikai vairs nav efektīva, bet var izraisīt arī autoimūnas slimības. Nesen tika izstrādātas un praksē ieviestas jaunas zāles, kas vienā vai otrā veidā maina ķermeņa citokīnu stāvokli. Piemēram, reimatoīdā artrīta ārstēšanai tiek piedāvātas zāles, kuru pamatā ir antivielas pret alfa-TNF, un kuras mērķis ir noņemt alfa-TNF, kas ir iesaistīts saistaudu iznīcināšanā. Tomēr saskaņā ar mūsu datiem un literatūru ne visiem pacientiem ar hronisku reimatoīdo artrītu ir paaugstināts TNF-alfa līmenis, tāpēc šai pacientu grupai TNF-alfa līmeņa pazemināšanās var vēl vairāk pasliktināt imūnsistēmu. Tādējādi pareiza citokīnu terapija uzņemas organisma citokīnu stāvokļa kontroli ārstēšanas laikā. Iekaisumu veicinošo citokīnu aizsargājošā loma izpaužas lokāli, iekaisuma fokusā, bet to sistēmiskā ražošana neizraisa pretinfekciozu imunitāti un neaizkavē baktēriju toksiskā šoka attīstību, kas ir agrīna mirstība ķirurģiskiem pacientiem ar strutainām-septiskām komplikācijām. Ķirurģisko infekciju patoģenēzes pamatā ir citokīnu kaskādes iedarbināšana, kas ietver, no vienas puses, pretiekaisuma un, no otras, pretiekaisuma citokīnus. Līdzsvars starp šīm divām pretējām grupām lielā mērā nosaka kursa raksturu un strutaino-septisko slimību iznākumu. Tomēr, nosakot koncentrāciju asinīs vienam citokīnam no šīm grupām (piemēram, alfa-TNF vai IL-4), netiks pienācīgi atspoguļots visa citokīnu līdzsvara stāvoklis. Tāpēc ir nepieciešams vienpakāpes vairāku starpnieku līmeņa novērtējums (vismaz 2-3 no pretējām apakšgrupām). Šobrīd CJSC "Vector-Best" ir izstrādājusi un sērijveidā ražojusi reaģentu komplektus kvantitatīvai noteikšanai: audzēja nekrozes faktors-alfa (jutība-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gamma interferons (jutība - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleikīns -4 (jutība - 2 pg / ml, 0–400 pg / ml); interleikīns-8 (jutība-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interleikīna-1 receptoru antagonists (IL-1RA) (jutība-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa interferons (jutīgums - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimūnas antivielas pret alfa-interferonu (jutība-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Visi komplekti ir paredzēti, lai noteiktu šo citokīnu koncentrāciju cilvēka bioloģiskajos šķidrumos, kultūras supernatantos, pētot cilvēka šūnu kultūru spēju ražot citokīnus in vitro. Analīzes princips ir "sviestmaižu" variants cietfāzes trīspakāpju (inkubācijas laiks-4 h) vai divpakāpju (inkubācijas laiks-3,5 h) ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa uz plāksnēm. Analīzei nepieciešams 100 µl bioloģiskā šķidruma vai kultūras supernatanta katrā iedobē. Rezultātu uzskaite - spektrofotometriski pie viļņa garuma 450 nm. Visos komplektos hromogēns ir tetrametilbenzidīns. Mūsu komplektu glabāšanas laiks ir pagarināts līdz 18 mēnešiem no izdošanas datuma un 1 mēnesis pēc lietošanas sākuma. Literatūras datu analīze parādīja, ka citokīnu saturs veselīgu cilvēku asins plazmā ir atkarīgs gan no to noteikšanai izmantotajiem komplektiem, gan no reģiona, kurā šie cilvēki dzīvo. Tāpēc, lai noskaidrotu normālu citokīnu koncentrāciju vērtības mūsu reģiona iedzīvotājiem, mēs analizējām praktiski veselu asins donoru, dažādu sociālo grupu pārstāvju vecumā no 18 līdz 60 gadiem, nejaušus plazmas paraugus (no 80 līdz 400 paraugiem). rupjas somatiskās patoloģijas klīniskās izpausmes un HBsAg antivielu trūkums pret HIV, B un C hepatīta vīrusiem.

Audzēja nekrozes faktors-alfa.

TNF-alfa ir pleiotropisks pretiekaisuma citokīns, kas sastāv no divām iegarenām b-ķēdēm ar molekulmasu 17 kDa un veic regulējošas un efektoru funkcijas imūnās atbildes un iekaisuma gadījumā. Galvenie alfa-TNF ražotāji ir monocīti un makrofāgi. Šo citokīnu izdala arī asins limfocīti un granulocīti, dabiskās slepkavas šūnas un T-limfocītu šūnu līnijas. Galvenie alfa-TNF induktori ir vīrusi, mikroorganismi un to metabolisma produkti, ieskaitot baktēriju lipopolisaharīdu. Turklāt daži citokīni, piemēram, IL-1, IL-2, granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošais faktors, alfa- un beta-INF, var spēlēt arī induktorus. Galvenie alfa-TNF bioloģiskās aktivitātes virzieni: piemīt selektīva citotoksicitāte attiecībā pret dažām audzēja šūnām; aktivizē granulocītus, makrofāgus, endotēlija šūnas, hepatocītus (akūtas fāzes proteīnu ražošana), osteoklastus un hondrocītus (kaulu un skrimšļa audu rezorbcija), citu pretiekaisuma citokīnu sintēzi; stimulē proliferāciju un diferenciāciju: neitrofīli, fibroblasti, endotēlija šūnas (angioģenēze), asinsrades šūnas, T- un B-limfocīti; uzlabo neitrofilu plūsmu no kaulu smadzenēm asinīs; ir pretvēža un pretvīrusu aktivitāte in vivo un in vitro; piedalās ne tikai aizsardzības reakcijās, bet arī iznīcināšanas un labošanas procesos, kas pavada iekaisumu; kalpo kā viens no audu iznīcināšanas starpniekiem, kas bieži sastopams ilgstošā, hroniskā iekaisumā.

Rīsi. 1. Alfa-TNF līmeņa sadalījums

veselīgu donoru plazmā.

Palielināts alfa-TNF līmenis asins serumā tiek novērots pēctraumatiskā stāvoklī, ar plaušu darbības traucējumiem, normālas grūtniecības gaitas pārkāpumiem, vēzi, bronhiālo astmu. Alfa-TNF līmenis ir 5-10 reizes augstāks par normu vīrusu hepatīta C hroniskās formas saasināšanās laikā. Kuņģa-zarnu trakta slimību saasināšanās laikā alfa-TNF koncentrācija serumā pārsniedz normu vidēji 10 reizes, un dažiem pacientiem - 75–80 reizes. Augsta alfa -TNF koncentrācija ir konstatēta cerebrospinālajā šķidrumā pacientiem ar multiplo sklerozi un cerebrospinālo meningītu, un pacientiem ar reimatoīdo artrītu - sinoviālajā šķidrumā. Tas liecina par TNF alfa iesaistīšanos vairāku autoimūnu slimību patoģenēzē. Alfa -TNF noteikšanas biežums asins serumā pat ar smagu iekaisumu nepārsniedz 50%, ar inducētu un spontānu ražošanu - līdz 100%. Alfa-TNF koncentrācijas diapazons bija 0-6 pg / ml, vidējais-1,5 pg / ml (1. att.).

Gamma interferons.

Rīsi. 2. IFN-gamma līmeņu sadalījums

veselīgu donoru plazmā.

Interleikīns-4

IL-4 ir glikoproteīns ar molekulmasu 18–20 kDa, dabisks iekaisuma inhibitors. Kopā ar gamma IFN IL-4 ir galvenais citokīns, ko ražo T šūnas (galvenokārt TH-2 limfocīti). Tas atbalsta TH-1 / TH-2 līdzsvaru. IL-4 bioloģiskās aktivitātes galvenie virzieni: uzlabo eozinofīliju, tuklo šūnu uzkrāšanos, IgG4 sekrēciju, TH-2 mediētu humorālo imūnreakciju; ir vietēja pretvēža aktivitāte, stimulējot citotoksisko T-limfocītu populāciju un audzēja infiltrāciju ar eozinofiliem; kavē iekaisuma citokīnu (alfa-TNF, IL-1, IL-8) un prostaglandīnu izdalīšanos no aktivētiem monocītiem, citokīnu veidošanos, ko veic TH-1-limfocīti (IL-2, gamma-INF uc).

Rīsi. 3. IL-4 līmeņa sadalījums plazmā

veseliem donoriem.

Palielinātu IL-4 līmeni gan serumā, gan stimulētos limfocītos var novērot alerģisku slimību gadījumā (īpaši saasināšanās laikā), piemēram, bronhiālā astma, alerģisks rinīts, siena drudzis, atopiskais dermatīts, kuņģa-zarnu trakta slimības. IL-4 līmenis ievērojami palielinās arī pacientiem ar hronisku C hepatītu (CHC). CHC paasinājuma periodos tā daudzums palielinās gandrīz 3 reizes, salīdzinot ar normu, un CHC remisijas laikā IL-4 līmenis samazinās, īpaši ņemot vērā ārstēšanu ar rekombinanto IL-2. IL-4 koncentrācijas diapazons bija 0–162 pg / ml, vidējais-6,9 pg / ml, normālais diapazons bija 0–20 pg / ml (3. att.).

Interleikīns-8

IL-8 pieder pie kemokīniem, tas ir proteīns ar molekulmasu 8 kDa. IL-8 ražo mononukleārie fagocīti, polimorfonukleārie leikocīti, endotēlija šūnas un cita veida šūnas, reaģējot uz dažādiem stimuliem, tostarp baktērijām un vīrusiem un to vielmaiņas produktiem, ieskaitot pretiekaisuma citokīnus (piemēram, IL-1, TNF alfa) ). Interleikīna-8 galvenā loma ir uzlabot leikocītu ķīmijtaksi. Tam ir svarīga loma gan akūta, gan hroniska iekaisuma gadījumā. Paaugstināts IL-8 līmenis tiek novērots pacientiem ar bakteriālām infekcijām, hroniskām plaušu slimībām un kuņģa-zarnu trakta slimībām. Pacientiem ar sepsi palielinās IL-8 līmenis plazmā, un augsta koncentrācija ir saistīta ar paaugstinātu mirstību. IL-8 satura mērīšanas rezultātus var izmantot, lai uzraudzītu ārstēšanas gaitu un prognozētu slimības iznākumu. Tādējādi visiem pacientiem ar labvēlīgu radzenes čūlu gaitu asiņu šķidrumā tika konstatēts palielināts IL-8 saturs. Visiem pacientiem ar sarežģītu radzenes čūlas gaitu IL-8 koncentrācija bija 8 reizes lielāka nekā pacientiem ar labvēlīgu slimības gaitu. Tādējādi proinflammatorisko citokīnu (īpaši IL-8) saturu asaru šķidrumā radzenes čūlu gadījumā var izmantot kā šīs slimības gaitas prognostisko kritēriju.

Rīsi. 4. IL-8 līmeņa sadalījums

veselīgu donoru plazma (Novosibirska).

Saskaņā ar mūsu un publicētajiem datiem veseliem cilvēkiem IL-8 asins serumā tiek konstatēts ārkārtīgi reti; spontāna IL-8 ražošana, ko veic asins mononukleārās šūnas, tiek novērota 62%, bet izraisīta ražošana-100% veselīgu donoru. IL-8 koncentrācijas diapazons bija 0–34 pg / ml, vidējais-2 pg / ml, normālais diapazons bija 0–10 pg / ml (4. att.).

Rīsi. 5. IL-8 līmeņa sadalījums plazmā

veseliem donoriem (Rubcovska).

Interleikīna-1 receptoru antagonists.

IL-1RA pieder citokīniem, tas ir oligopeptīds ar molekulmasu 18-22 kDa. IL-1RA ir endogēns IL-1 inhibitors, ko ražo makrofāgi, monocīti, neitrofīli, fibroblasti un epitēlija šūnas. IL-1RA inhibē interleikīnu IL-1alfa un IL-1beta bioloģisko aktivitāti, konkurējot ar tiem par saistīšanos ar šūnu receptoriem.

Rīsi. 6. IL-1RA līmeņa sadalījums

veselīgu donoru plazmā

IL-1RA ražošanu stimulē daudzi citokīni, vīrusu produkti un akūtas fāzes proteīni. IL-1RA var aktīvi izpausties iekaisuma perēkļos daudzās hroniskās slimībās: reimatoīdā un nepilngadīgo hroniskā artrīta, sistēmiskās sarkanās vilkēdes, išēmisku smadzeņu bojājumu, zarnu iekaisuma slimību, bronhiālās astmas, pielonefrīta, psoriāzes u.c. Sepses gadījumā tiek atzīmēts vislielākais IL-1RA pieaugums-dažos gadījumos līdz 55 ng / ml, un tika konstatēts, ka palielināta IL-1RA koncentrācija korelē ar labvēlīgu prognozi. Sievietēm ar augstu aptaukošanos tiek novērots augsts IL-1RA līmenis, un šis līmenis ievērojami samazinās 6 mēnešu laikā pēc tauku atsūkšanas. IL-1RA koncentrācijas diapazons bija 0–3070 pg / ml, vidējais rādītājs bija 316 pg / ml. Parastais diapazons ir 50–1000 pg / ml (6. att.).

Alfa interferons.

Alfa-IFN ir monomēra ne glikozilēts proteīns ar molekulmasu 18 kDa, ko sintezē galvenokārt leikocīti (B-limfocīti, monocīti). Šo citokīnu var ražot arī praktiski jebkurš šūnu tips, reaģējot uz atbilstošu stimulāciju, un intracelulārās vīrusu infekcijas var būt spēcīgi IFN-alfa sintēzes stimulatori. Alfa-INF induktori ir: vīrusi un to produkti, starp kuriem vadošo vietu ieņem divpavedienu RNS, kas rodas vīrusu replikācijas laikā, kā arī baktērijas, mikoplazmas un vienšūņi, citokīni un augšanas faktori (piemēram, IL-1, IL) -2, alfa -FNO, koloniju stimulējošie faktori utt.). Organisma nespecifiskās antibakteriālās imūnās atbildes sākotnējā aizsardzības reakcija ietver alfa un beta IFN indukciju. Šajā gadījumā to ražo antigēnu prezentējošās šūnas (makrofāgi), kas iebrukušas baktērijās. Interferoniem (ieskaitot alfa-IFN) ir svarīga loma pretvīrusu imūnās atbildes nespecifiskajā saitē. Tie uzlabo pretvīrusu rezistenci, inducējot šūnās fermentu sintēzi, kas nomāc vīrusu nukleīnskābju un proteīnu veidošanos. Turklāt tiem ir imūnmodulējoša iedarbība, tie uzlabo galvenā histokompatibilitātes kompleksa antigēnu ekspresiju šūnās. Alfa-IFN satura izmaiņas tika konstatētas vīrusu etioloģijas hepatīta un aknu cirozes gadījumā. Vīrusu infekciju saasināšanās laikā lielākajai daļai pacientu šī citokīna koncentrācija ievērojami palielinās, un atveseļošanās periodā tas nokrītas līdz normālam līmenim. Tika parādīta saistība starp alfa-INF līmeni serumā un gripas infekcijas smagumu un ilgumu.

Rīsi. 7. Alfa-IFN līmeņa sadalījums

veselīgu donoru plazmā.

Alfa-IFN koncentrācijas palielināšanos novēro serumā lielākajai daļai pacientu, kuri slimo ar autoimūnām slimībām, piemēram, poliartrītu, reimatoīdo artrītu, spondilozi, psoriātisko artrītu, reimatisko polimialģiju un sklerodermiju, sistēmisku sarkano vilkēdi un sistēmisko vaskulītu. Augsts šī interferona līmenis dažiem pacientiem tiek novērots arī peptiskās čūlas un holelitiāzes saasināšanās laikā. Alfa-INF koncentrācijas diapazons bija 0–93 pg / ml, vidējais-20 pg / ml. Parastais diapazons ir līdz 45 pg / ml (7. att.).

Antivielas pret alfa-IFN.

Antivielas pret alfa-IFN var noteikt serumā pacientiem ar somatisko eritematozo vilkēdi. Spontāna antivielu indukcija pret alfa-IFN tiek novērota arī serumā pacientiem ar dažādām vēža formām. Dažos gadījumos antivielas pret alfa-IFN tika konstatētas HIV inficēto pacientu serumos, kā arī cerebrospinālajā šķidrumā un serumā pacientiem ar meningītu akūtā fāzē, pacientiem ar hronisku poliartrītu.

Rīsi. 8. Antivielu līmeņa sadalījums pret alfa-IFN

veselīgu donoru plazmā.

Alfa-IFN ir viena no efektīvām pretvīrusu un pretvēža terapijas zālēm, taču tā ilgstoša lietošana var izraisīt specifisku antivielu veidošanos pret alfa-IFN. Tas samazina ārstēšanas efektivitāti un dažos gadījumos izraisa dažādas blakusparādības: no gripai līdzīgas līdz autoimūnu slimību attīstībai. Ņemot to vērā, INF terapijas laikā ir svarīgi kontrolēt antivielu līmeni pret alfa-INF pacienta organismā. To veidošanās ir atkarīga no terapijā izmantoto zāļu veida, ārstēšanas ilguma un slimības veida. Antivielu pret alfa-IFN koncentrācijas diapazons bija 0–126 ng / ml, vidējais-6,2 ng / ml. Parastais diapazons ir līdz 15 ng / ml (8. att.). Citokīnu līmeņa novērtēšana, izmantojot CJSC "Vector-Best" komerciāli pieejamos reaģentu komplektus, ļauj izmantot jaunu pieeju ķermeņa imūnsistēmas stāvokļa izpētei klīniskajā praksē.

Imunotropās zāles, kuru pamatā ir citokīni.

Interesants darbs S. Simbirtseva, Valsts ļoti tīru bioloģisko produktu pētniecības institūts, Krievijas Veselības ministrija, Sanktpēterburga). Citokīnus var izolēt jaunā neatkarīgā ķermeņa galveno funkciju regulēšanas sistēmā, kas pastāv kopā ar nervu un endokrīno sistēmu. regulēšana, un tas galvenokārt ir saistīts ar homeostāzes saglabāšanu patogēnu ievadīšanas laikā un audu integritātes pārkāpumu. Šo jauno regulējošo molekulu klasi daba radīja miljonu gadu evolūcijas gaitā, un tai ir neierobežots potenciāls lietošanai kā zāles. Imūnsistēmā citokīni veido attiecības starp nespecifiskām aizsardzības reakcijām un specifisku imunitāti, darbojoties abos virzienos. Ķermeņa līmenī citokīni sazinās starp imūno, nervu, endokrīno, asinsrades un citām sistēmām un kalpo, lai iesaistītu viņus aizsardzības reakciju organizēšanā un regulēšanā. Intensīvā citokīnu pētījuma virzītājspēks vienmēr ir bijis daudzsološais izredzes to klīniskai izmantošanai plaši izplatītu slimību, tostarp vēža, infekcijas un imūndeficīta slimību, ārstēšanā. Krievijā ir reģistrēti vairāki citokīnu preparāti, tostarp interferoni, koloniju stimulējošie faktori, interleikīni un to antagonisti, kā arī audzēja nekrozes faktors. Visus citokīnu preparātus var iedalīt dabiskos un rekombinantos. Dabiski preparāti ir dažādas attīrīšanas pakāpes preparāti, kas iegūti no stimulētu eikariotu šūnu, galvenokārt cilvēka šūnu, barotnes. Galvenie trūkumi ir zemā attīrīšanas pakāpe, standartizācijas neiespējamība lielā komponentu skaita dēļ un asins komponentu izmantošana ražošanā. Acīmredzot citokīnu terapijas nākotne ir saistīta ar ģenētiski modificētām zālēm, kas iegūtas, izmantojot jaunākos sasniegumus biotehnoloģijā. Pēdējo divu desmitgažu laikā vairuma citokīnu gēni ir klonēti un iegūti rekombinantie analogi, kas pilnībā atkārto dabisko molekulu bioloģiskās īpašības. Klīniskajā praksē ir trīs galvenās citokīnu lietošanas jomas:

1) citokīnu terapija, lai aktivizētu ķermeņa aizsardzības reakcijas, imūnmodulāciju vai papildinātu endogēno citokīnu trūkumu,

2) anti-citokīnu imūnsupresīvā terapija, kuras mērķis ir bloķēt citokīnu un to receptoru bioloģisko darbību,

3) citokīnu gēnu terapija ar mērķi uzlabot pretvēža imunitāti vai labot ģenētiskos defektus citokīnu sistēmā.

Klīniski var izmantot vairākus citokīnus sistēmiskai un lokālai lietošanai. Sistēmiska ievadīšana ir pamatota gadījumos, kad ir jānodrošina citokīnu darbība vairākos orgānos, lai efektīvāk aktivizētu imunitāti, vai lai aktivizētu mērķa šūnas, kas atrodas dažādās ķermeņa daļās. Citos gadījumos lokālai lietošanai ir vairākas priekšrocības, jo tā ļauj sasniegt augstu aktīvās vielas lokālo koncentrāciju, mērķorgānu-mērķi un izvairīties no nevēlamām sistēmiskām izpausmēm. Pašlaik citokīni tiek uzskatīti par vienu no daudzsološākajām zālēm klīniskajā praksē.

Secinājums.

Tādējādi šobrīd nav šaubu, ka citokīni ir vissvarīgākie imūnpatoģenēzes faktori. Citokīnu līmeņa pētījums sniedz informāciju par dažāda veida imūnkompetentu šūnu funkcionālo aktivitāti, I un II tipa T-palīgu aktivācijas procesu attiecību, kas ir ļoti svarīgi vairāku infekciju un imunopatoloģiskie procesi. Citokīni ir specifiski proteīni, caur kuriem imūnsistēmas šūnas var apmainīties ar informāciju un mijiedarboties savā starpā. Mūsdienās ir atklāti vairāk nekā simts dažādu citokīnu, kas parasti tiek iedalīti pretiekaisuma (izraisošs iekaisums) un pretiekaisuma (novērš iekaisuma attīstību). Citokīnu dažādās bioloģiskās funkcijas ir sadalītas trīs grupās: tās kontrolē imūnsistēmas attīstību un homeostāzi, kontrolē asins šūnu (asinsrades sistēmas) augšanu un diferenciāciju un piedalās nespecifiskās ķermeņa aizsargreakcijās, kas ietekmē iekaisuma procesus. procesus, asins recēšanu, asinsspiedienu.

Izmantotās literatūras saraksts.

S.V. Belmers, A.S. Simbirtsevs, O.V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mihailova. / Krievijas Valsts medicīnas universitāte, Valsts koloproktoloģijas zinātniskais centrs, Maskava un Valsts tīri biopreparātu pētniecības institūts, Sanktpēterburga.

S.V. Seņņikovs, A.N. Silkovs // Žurnāls "Citokīni un iekaisums", 2005, Nr. 1 T. 4, Nr. 1. P.22-27.

T.G. Rjabičeva, N.A. Varaksins, N.V. Timofejeva, M. Ju. Rukavišņikovs, AS "Vector-Best" darba materiāli.

A.S.Simbirtsev, Valsts ļoti tīro bioloģisko vielu pētniecības institūts, Krievijas Veselības ministrija, Sanktpēterburga.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Augsti tīru biopreparātu valsts pētniecības institūts, Sanktpēterburga.

T.A. Šumatova, V. B. Šumatovs, E. V. Markelova, L. G. Dry-warm. Vladivostokas Valsts medicīnas universitātes Anestezioloģijas un reanimatoloģijas katedra.

Darbā izmantoti materiāli no vietnes http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

daži infekcijas slimību patogēni. Tātad, norsulfazols ...

Pretvīrusu imunitātes molekulārie un šūnu mehānismi, attīstības modeļi un imunopato
Anotācija >> Medicīna, veselība
... "vietne" attiecas uz konkrētu vietni noteiktu polipeptīds (antigēns), ar kuru ... tā sākuma stadijas. Citokīni un chemokīni. Citi citokīni, papildus interferoniem, ... ko viņi ražo laika vienībā citokīni nosaka proliferācijas intensitāti un ...
Kaulu smadzeņu fibrozes cēloņu izpēte mieloproliferatīvās slimībās, analizējot trombocītu faktoru ietekmi uz mezenhimālajām cilmes šūnām
Mājas darbs >> Medicīna, veselība
Dažāda koncentrācija; - kvantitatīvi definīcija olbaltumvielas eksperimentālās sistēmās ... noved pie ilgstošas darbības citokīns, kas uzlabo fibrozes procesu ... trombocīti. Arī palielināts saturs citokīns tika atrasts urīnā ...
Tuberkulozes patoģenēze cilvēkiem
Anotācija >> Medicīna, veselība
Bet ir iespējams arī ēst. Noteikts spēlē lomu aerogēnā infekcijā ... spēlē, ko izdala makrofāgi un monocīti citokīns- audzēja nekrozes faktors (TNF). ... joni, katrai šūnai ir noteikti sistēma, kas nodrošina vielu transportēšanu ...

Citokīni ir galvenie iekaisuma humorālie faktori, kas nepieciešami iedzimtas imunitātes aizsargfunkciju īstenošanai. Iekaisuma attīstībā ir iesaistītas trīs citokīnu grupas-iekaisuma vai proinflammatoriski citokīni, chemokīni, koloniju stimulējoši faktori, kā arī funkcionāli saistīti faktori IL-12 un IFNy. Citokīniem ir arī svarīga loma iekaisuma reakcijas nomākšanā un kontrolēšanā. Pretiekaisuma citokīni ietver transformējošo augšanas faktoru β (TGFp), IL-10; bieži pretiekaisuma faktora lomu spēlē IL-4.
Ir 3 galvenie pretiekaisuma citokīnu grupas pārstāvji-TNFa, IL-1 un IL-6; salīdzinoši nesen tiem tika pievienoti IL-17 un IL-18. Šos citokīnus ražo galvenokārt aktivēti monocīti un makrofāgi, galvenokārt iekaisuma vietā. Iekaisuma citokīnus var ražot arī neitrofīli, dendritiskās šūnas, aktivētie B-, NK- un T-limfocīti. Patogēnu iekļūšanas fokusā citokīni ir pirmie, kas sintezē dažus vietējos iekaisuma makrofāgus. Tad leikocītu emigrācijas procesā no asinsrites palielinās ražotāju šūnu skaits un paplašinās to spektrs. Jo īpaši epitēlija, endotēlija, sinoviālās, glia šūnas un fibroblasti, ko stimulē mikroorganismu un iekaisuma faktoru produkti, ir saistīti ar proinflammatorisku citokīnu sintēzi. Citokīnu gēni tiek klasificēti kā inducējami. Dabiski to izpausmes ierosinātāji ir patogēni un to produkti, kas darbojas caur TLR un citiem patogēniem receptoriem. Klasiskais induktors ir baktēriju LPS. Tajā pašā laikā daži proinflammatoriski citokīni (IL-1, TNFa) paši spēj izraisīt pretiekaisuma citokīnu sintēzi.
Iekaisuma citokīni tiek sintezēti un izdalīti diezgan ātri, lai gan dažādu šīs grupas citokīnu sintēzes kinētika nav vienāda. Tipiskos gadījumos (ātra iespēja) to mRNS ekspresija tiek novērota 15-30 minūtes pēc indukcijas, olbaltumvielu produkta parādīšanās citoplazmā-pēc 30-60 minūtēm tā saturs ārpusšūnu vidē sasniedz maksimumu 3- 4 stundas.Citokīnu sintēze konkrētā šūnā turpinās diezgan īsu laiku - parasti nedaudz vairāk par dienu. Ne visi sintezētie materiāli tiek izdalīti. Noteikts daudzums citokīnu tiek ekspresēts uz šūnas virsmas vai ietverts citoplazmas granulās. Granulu izdalīšanās var izraisīt tādus pašus aktivizācijas signālus kā citokīnu ražošana. Tas nodrošina ātru (20 minūšu laikā) citokīnu ieplūšanu bojājuma fokusā.
Iekaisuma citokīni pilda daudzas funkcijas. Viņu galvenā loma ir iekaisuma reakcijas "organizācija" (2.55. Att.). Viens no svarīgākajiem un agrīnajiem pretiekaisuma citokīnu efektiem ir adhēzijas molekulu ekspresijas palielināšanās uz endotēlija šūnām, kā arī uz pašiem leikocītiem, kas noved pie leikocītu migrācijas no asinsrites uz iekaisuma fokusu (skatīt 2.3.3. ). Turklāt citokīni izraisa šūnu skābekļa metabolisma palielināšanos, citokīnu receptoru ekspresiju un citus iekaisuma faktorus, stimulē citokīnu, baktericīdu peptīdu ražošanu utt. Iekaisuma citokīniem ir galvenokārt lokāls efekts. Pārmērīgi izdalītu proinflammatorisku citokīnu uzņemšana asinsritē veicina iekaisuma sistēmiskās iedarbības izpausmi, kā arī stimulē citokīnu ražošanu šūnās, kas atrodas tālu no iekaisuma fokusa. Sistēmiskā līmenī pretiekaisuma citokīni stimulē akūtas fāzes proteīnu ražošanu, izraisa ķermeņa temperatūras paaugstināšanos un iedarbojas uz

Rīsi. 2.55. Starpšūnu signalizācija, ko izraisa pretiekaisuma citokīni un iekaisuma gēnu aktivācijas mehānismi

endokrīno un nervu sistēmu, un lielās devās izraisa patoloģisku seku attīstību (miesa līdz šokam, līdzīga septiskajai).
IL-1 ir kolektīvs proteīnu saimes apzīmējums, kurā ietilpst vairāk nekā 11 molekulas. Lielākās daļas to funkcija nav zināma, tomēr 5 molekulas-IL-1a (saskaņā ar mūsdienu klasifikāciju-IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) un IL-33 (IL-1F11) ir aktīvi citokīni.
IL-1a un IL-1P tradicionāli sauc par IL-1, jo tie mijiedarbojas ar vienu un to pašu receptoru un to iedarbība nav atšķirama. Šo citokīnu gēni atrodas cilvēka 2. hromosomas garajā rokā. Homoloģija starp tām nukleotīdu līmenī ir 45%, aminoskābju līmenī - 26%. Abām molekulām ir p salocīta struktūra: tās satur 6 pārus pretparalēļu p slāņu, un tām ir trefoil forma. Šūnas sintezē prekursoru molekulu ar molekulmasu aptuveni 30 kDa, bez signāla peptīdiem, kas norāda uz neparastu IL-1 molekulas apstrādes veidu. Nobriedušu olbaltumvielu molekulmasa ir aptuveni 18 kDa.
IL -1a pastāv trīs veidos - intracelulāra (šķīstoša molekula atrodas citosolā un veic regulējošas funkcijas), membrāna (molekula tiek nogādāta uz šūnas virsmas, izmantojot mehānismu, kas līdzīgs receptoru pārstrādei, un ir nostiprināta membrānā) un sekrēcija (molekula tiek izdalīta sākotnējā formā, bet tiek pakļauta apstrādei - šķelšanās ar ārpusšūnu proteāzēm, veidojot aktīvu citokīnu, kas sver 18 kDa). Galvenais IL-1a molekulas variants cilvēkiem ir membrānas variants. Šajā formā citokīna ietekme ir izteiktāka, bet izpaužas tikai lokāli.
IL-1P apstrāde notiek šūnas iekšienē, piedaloties specializētam enzīmam IL-1 konvertāzei (kaspāze 1), kas atrodas lizosomās.
Šis enzīms tiek aktivizēts kā iekaisuma procesa sastāvdaļa - pagaidu supramolekulāra struktūra, kas papildus neaktīvai kaspāzei 1 ietver NLR saimes intracelulāros receptorus (skatīt 2.2.3. Sadaļu) - NOD1, NOD2, IPAF uc, kas izraisa attīstību. aktivizācijas signālu. Tā rezultātā veidojas transkripcijas faktors NF-kB un tiek ierosināti pretiekaisuma gēni, kā arī tiek aktivizēts iekaisums un tajā esošā kaspāze 1. Aktivētais enzīms šķeļ IL-1P prekursora molekulu un iegūto nobriedušo citokīnu, kura molekulmasa ir 18 kDa, izdala šūna.
IL-1a, IL-1P un IL-1 receptoru antagonistam ir kopīgi receptori, kas spontāni izpaužas daudzos šūnu tipos. Kad šūnas tiek aktivizētas, uz tām palielinās IL-1 membrānas receptoru skaits. Galvenais, IL-1RI, ārpusšūnu daļā satur 3 imūnglobulīniem līdzīgus domēnus. Tā intracelulārā daļa ir TIR domēns, kas strukturāli ir līdzīgs analogiem TLR domēniem un izraisa vienādus signalizācijas ceļus (sk. 2.2.1. Sadaļu). Šo receptoru skaits ir mazs (200-300 uz šūnu), bet tiem ir augsta afinitāte pret IL-1 (Kd ir 10-11 M). Citam receptoram, IL-1RII, citoplazmatiskajā daļā trūkst signalizācijas komponenta, tas nepārraida signālu un kalpo kā mānekļa receptors. Signāla pārraide no IL-1RI ietver tādus pašus faktorus kā TLR (piemēram, MyD88, IRAK un TRAF6), kas noved pie līdzīgiem rezultātiem-veidojas transkripcijas faktori NF-kB un AP-1, kas izraisa tas pats gēnu kopums (skat. 2.12. zīm.). Šie gēni ir atbildīgi par pretiekaisuma citokīnu, ķīmokīnu, adhēzijas molekulu, enzīmu, kas nodrošina fagocītu baktericīdo darbību, un citu gēnu, kuru produkti ir iesaistīti iekaisuma reakcijas attīstībā, sintēzi. IL-1 pats pieder pie produktiem, kuru sekrēciju izraisa IL-1, t.i. šajā gadījumā tiek aktivizēta pozitīvas atgriezeniskās saites cilpa.
Jebkuras ķermeņa šūnas var būt IL-1 mērķi. Tās darbība vislielākajā mērā ietekmē endotēlija šūnas, visu veidu leikocītus, skrimšļa un kaulaudu šūnas, sinoviālās un epitēlija šūnas, daudzus nervu šūnu veidus. IL-1 ietekmē tiek izraisīta vairāk nekā 100 gēnu ekspresija; ar tās piedalīšanos tiek realizētas vairāk nekā 50 dažādas bioloģiskās reakcijas. Galvenais IL-1 efekts ir leikocītu emigrācija un to fagocītiskās un baktericīdās aktivitātes aktivizēšana. Tie ietekmē arī koagulācijas sistēmu un asinsvadu tonusu, nosakot hemodinamikas iezīmes iekaisuma fokusā. IL-1 daudzpusīgi ietekmē ne tikai iedzimtas, bet arī adaptīvas imunitātes šūnas, parasti stimulējot abu izpausmes.
IL-1 ir daudz sistēmisku efektu. Tas stimulē aknu fāzes olbaltumvielu ražošanu hepatocītos, iedarbojoties uz hipotalāma termoregulācijas centru, izraisa drudzi, piedalās iekaisuma procesa sistēmisku izpausmju attīstībā (piemēram, savārgums, samazināta ēstgriba, miegainība). adynamia), kas ir saistīta ar IL-1 iedarbību uz centrālo nervu sistēmu. Uzlabojot koloniju stimulējošo faktoru receptoru ekspresiju, IL-1 uzlabo asinsradi, kas saistīta ar tā radioprotektīvo efektu. IL-1 stimulē leikocītu, galvenokārt neitrofilu, tostarp nenobriedušu, izdalīšanos no kaulu smadzenēm, kas noved pie leikocitozes parādīšanās iekaisuma laikā un leikocītu formulas nobīdes pa kreisi (nenobriedušu šūnu formu uzkrāšanās). IL-1 ietekme ietekmē veģetatīvās funkcijas un vēl augstāku nervu aktivitāti (izmaiņas uzvedības reakcijās utt.). Hondrocīti un osteocīti var būt arī IL-1 mērķi, kas ir saistīts ar IL-1 spēju izraisīt skrimšļa un kaulu iznīcināšanu, kad tie ir iesaistīti iekaisuma procesā, un otrādi, patoloģisku audu hiperplāziju (pannus reimatoīdā stadijā). artrīts). IL-1 postošais efekts izpaužas arī kā septisks šoks, locītavu bojājumi reimatoīdā artrīta gadījumā un vairāki citi patoloģiski procesi.
Baktēriju produktu IL-1 iedarbības dublēšanās ir saistīta ar nepieciešamību atkārtoti reproducēt patogēnu aktivizējošo iedarbību bez to izplatīšanas. Mikroorganismi stimulē tikai šūnas iekļūšanas vietas tiešā tuvumā, galvenokārt vietējos makrofāgus. Tad to pašu efektu daudzas reizes atkārto IL-1p molekulas. Šīs funkcijas izpildi ar IL-1 veicina to receptoru ekspresija gandrīz visās ķermeņa šūnās pēc aktivācijas (notiek galvenokārt iekaisuma fokusā).
IL-1 receptoru antagonists (IL-1RA) ir homologs pret IL-1a un IL-1P (homoloģija ir attiecīgi 26% un 19%). Tas mijiedarbojas ar IL-1 receptoriem, bet nespēj pārraidīt signālu šūnai. Tā rezultātā IL-1RA darbojas kā specifisks IL-1 antagonists. IL-1RA izdalās tās pašas šūnas kā IL-1, šim procesam nav nepieciešama kaspāzes 1. IL-1RA ražošanu izraisa tie paši faktori, kas IL-1 sintēze, bet daži no tiem spontāni ražo makrofāgi un hepatocīti. Tā rezultātā šis faktors pastāvīgi atrodas asins serumā. Tas, iespējams, ir nepieciešams, lai novērstu IL-1 sistēmiskās darbības negatīvās sekas, kas akūtā iekaisumā tiek ražotas ievērojamā daudzumā. Rekombinantā IL-1RA pašlaik tiek pārbaudīta kā zāles hronisku iekaisuma slimību (reimatoīdā artrīta uc) ārstēšanā.
IL-18 ir pretiekaisuma citokīns, kas saistīts ar IL-f: tas tiek sintezēts arī kā prekursors, kas pārveidots ar kaspāzi 1; mijiedarbojas ar receptoru, kura citoplazmatiskā daļa satur TIR domēnu un pārraida signālu, kas noved pie NF-kB aktivācijas. Rezultātā tiek aktivizēti visi iekaisuma veicinošie gēni, bet tas ir mazāk izteikts nekā IL-1 iedarbībā. Atsevišķa IL-18 īpašība ir šūnu IFNy sintēzes indukcija (īpaši kombinācijā ar IL-12). Ja nav IL-12, IL-18 inducē IFNy antagonista IL-4 sintēzi un veicina alerģisku reakciju attīstību. IL-18 darbību ierobežo šķīstošais antagonists, kas to saista šķidrā fāzē.
IL-33 ir strukturāli ļoti līdzīgs IL-18. IL-33 apstrāde notiek arī, piedaloties kaspazei 1. Tomēr šis citokīns atšķiras no citiem IL-1 saimes pārstāvjiem ar funkcijām, ko tas veic. IL-33 darbības īpatnība lielā mērā ir saistīta ar faktu, ka tā receptors ir selektīvi ekspresēts uz Ig2 šūnām. Šajā sakarā IL-33 veicina ^ 2-citokīnu IL-4, IL-5, IL-13 sekrēciju un alerģisku procesu attīstību. Tam nav būtiskas pretiekaisuma iedarbības.
Audzēja nekrozes faktors a (TNFa vai TNFa) ir citas imunoloģiski nozīmīgu olbaltumvielu saimes loceklis. Tas ir pretiekaisuma citokīns ar plašu darbības spektru. TNFa ir b-kārtīga struktūra. Tas tiek sintezēts kā funkcionāli aktīva membrānas molekula pro-TNFa ar molekulmasu 27 kDa, kas ir II tipa transmembrānas proteīns (t.i., tā N-gala daļa ir novirzīta šūnā). Proteolīzes rezultātā ekstracelulārajā domēnā veidojas šķīstošs monomērs ar molekulmasu 17 kDa. TNFa monomēri spontāni veido 52 kDa trimeru, kas pārstāv šī citokīna galveno formu. Trimerim ir zvana formas forma, un apakšvienības ir savienotas ar to C galiem, katrā no tām ir 3 saistīšanās vietas ar receptoru, bet N-gali nav savienoti viens ar otru un nepiedalās mijiedarbībā ar receptoriem (un tāpēc citokīns veic savas funkcijas). Pie skābām pH vērtībām TNFa iegūst a-spirālveida struktūru, kas izraisa izmaiņas dažās tās funkcijās, jo īpaši paaugstinātu citotoksicitāti. TNF ir prototipisks TNF superģimenes lielās molekulu saimes pārstāvis (2.31. Tabula). Tas ietver limfotoksīnus a un b (tikai pirmais eksistē šķīstošā veidā), kā arī daudzas membrānu molekulas, kas iesaistītas starpšūnu mijiedarbībā (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), kas tiks minētas turpmāk dažādos kontekstos. Saskaņā ar mūsdienu nomenklatūru virsģimenes locekļu vārds sastāv no saīsinājuma TNFSF un sērijas numura (TNFa - TNFSF2, limfotoksīnam a - TNFSF1).
2.31. Tabula. Galvenie audzēju nekrozes faktora un tā receptoru ģimeņu pārstāvji

Faktors (ligands)	Chro mosoma	Molekulmasa, kDa	Receptors
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimeris - 52; glikozilēta forma - 25.6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Limfotoksīns (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Limfotoksīns B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
TRAIL (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
APRĪLIS (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
GAISMA (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Galvenie TNFa ražotāji, tāpat kā IL-1, ir monocīti un makrofāgi. To izdalās arī neitrofīli, endotēlija un epitēlija šūnas, eozinofīli, tuklās šūnas, B- un T-limfocīti, kad tie ir iesaistīti iekaisuma procesā. TNFa tiek konstatēts asinsritē agrāk nekā citi pretiekaisuma citokīni - jau 20-30 minūtes pēc iekaisuma ierosināšanas, kas ir saistīta ar molekulas membrānas formas "dempingu" šūnās, un, iespējams, arī ar TNFa izdalīšanos granulu saturā.
Pastāv divu veidu TNF receptori, kas ir kopīgi TNFa un limfotoksīnam a - TNFRI (no audzēja nekrozes faktora I receptoru) un TNFRII, kuru molekulmasa ir attiecīgi 55 un 75 kDa. TNFRI ir gandrīz visās ķermeņa šūnās, izņemot eritrocītus, un TNFRII atrodas galvenokārt uz imūnsistēmas šūnām. TNFR veido lielu ģimeni, kurā ietilpst molekulas, kas iesaistītas šūnu mijiedarbībā un šūnu nāves izraisīšanā - apoptozē. TNFa afinitāte pret TNFRI ir zemāka nekā TNFRII (attiecīgi aptuveni 5x10-10 M un 55x10-11 M). Kad TNFa-trimers saistās, notiek tā receptoru trimerizācija, kas nepieciešama signāla pārraidei.
Signālu pārraides iezīmes no šiem receptoriem lielā mērā nosaka to intracelulārās daļas struktūra. TNFRI citoplazmatisko daļu attēlo tā saucamais nāves domēns, no kura tiek saņemti signāli, kas noved pie apoptozes mehānisma aktivizēšanas; TNFRII trūkst nāves domēna. Signalizācija no TNFRI notiek, piedaloties adaptera proteīniem TRADD (ar TNFR saistītais nāves domēns) un FADD (ar Fas saistītais nāves domēns), kas satur arī nāves domēnus. Papildus apoptozes attīstībai (aktivizējot kaspāzi 8 vai keramīda sintēzi) tiek izdalīti vairāki signalizācijas ceļi, kas tiek aktivizēti, piedaloties faktoriem TRAF2 / 5 un RIP-1. Pirmais no šiem faktoriem pārraida signālu pa ceļu, kas noved pie NF-kB faktora aktivizēšanas, t.i. pēc klasiskā iekaisuma veicinošo gēnu indukcijas ceļa (sk. 2.55. att.). Signalizācijas ceļš, ko aktivizē RIP-1 faktors, noved pie MAP kaskādes aktivizēšanas ar galaproduktu, transkripcijas faktoru AP-1. Šis faktors ietver gēnus, kas nodrošina šūnu aktivāciju un novērš apoptozes attīstību. Tādējādi šūnu likteni nosaka pro- un anti-apoptotisko mehānismu līdzsvars, kas iedarbojas, kad TNFa saistās ar TNFRI.
TNFa funkciju īstenošana galvenokārt ir saistīta ar darbību, izmantojot TNFRI - attiecīgā gēna izslēgšana noved pie smaga imūndeficīta attīstības, savukārt TNFRII gēna inaktivācijas sekas ir nenozīmīgas. Iekaisuma reakcijas maksimuma laikā TNFa receptorus var “izmest” no membrānas un izlaist starpšūnu telpā, kur tie saistās ar TNFa, radot pretiekaisuma iedarbību. Šajā sakarā šķīstošās TNFR formas tiek izmantotas hronisku iekaisuma slimību ārstēšanā. Izrādījās, ka zāles, kuru pamatā ir šķīstošais TNFRII, bija klīniski visefektīvākās.
Tāpat kā IL-1, TNFa uzlabo adhēzijas molekulu ekspresiju, iekaisumu veicinošu citokīnu un ķīmokīnu, akūtas fāzes proteīnu, fagocītu šūnu enzīmu sintēzi utt. Kopā ar IL-1 TNFa ir iesaistīts visu galveno vietējo, kā arī dažu sistēmisku iekaisuma izpausmju veidošanā. Tas aktivizē endotēlija šūnas, stimulē angioģenēzi, uzlabo migrāciju un aktivizē leikocītus. TNFa vairāk nekā IL-1 ietekmē limfocītu aktivāciju un proliferāciju. Kombinācijā ar IFNy TNFa izraisa NO sintāzes aktivitāti fagocītos, kas ievērojami uzlabo to baktericīdu potenciālu. TNFa stimulē fibroblastu proliferāciju, veicinot brūču dzīšanu. Palielinoties vietējai TNFa ražošanai, dominē audu bojājumu procesi, kas izpaužas kā hemorāģiskās nekrozes attīstība. Turklāt TNFa kavē lipoproteīnu lipāzes aktivitāti, kas vājina lipoģenēzi un izraisa kaheksijas attīstību (viens no sākotnējiem TNFa nosaukumiem ir kacheksīns). Palielināta TNFa izdalīšanās un tās uzkrāšanās asinsritē, piemēram, lielu baktēriju superantigēnu devu ietekmē, izraisa smagas patoloģijas - septiska šoka - attīstību. Tādējādi TNFa darbību, kuras mērķis ir aizsargfunkcijas veikšana un homeostāzes uzturēšana, var pavadīt smaga toksiska iedarbība (vietēja un sistēmiska), kas bieži izraisa nāvi.
IL-6 ir plaša spektra pretiekaisuma citokīns. Tas kalpo arī kā prototipisks faktors citokīnu ģimenē, kas papildus IL-6 ietver sevī onkostatīnu M (OSM), leikēmiju inhibējošu faktoru (LIF), ciliāru neirotrofisko faktoru (CNTF), kardiotropīnu-1 (CT-1). ), kā arī IL-11 un IL-31. IL-6 molekulmasa ir 21 kDa. IL-6 ražo monocīti un makrofāgi, endotēlija, epitēlija, glia, gludās muskulatūras šūnas, fibroblasti, Th2 tipa T-limfocīti, kā arī daudzas audzēja šūnas. Mieloīdās šūnas izraisa IL-6 ražošanu, kad to TLR mijiedarbojas ar mikroorganismiem un to produktiem, kā arī IL-1 un TNFa ietekmē. Šajā gadījumā 2 stundu laikā IL-6 saturs asins plazmā palielinās 1000 reizes.
Visu IL -6 saimes faktoru receptori satur kopīgu komponentu - gp130 ķēdi, kas atrodas gandrīz visās ķermeņa šūnās. Otra receptora sastāvdaļa katram citokīnam ir individuāla. IL-6 receptoru specifiskā ķēde (gp80) ir atbildīga par šī citokīna saistīšanos, savukārt gp130 ir iesaistīts signāla pārraidē, jo tas ir saistīts ar tirozīna kināzēm Jak1 un Jak2. Kad IL-6 mijiedarbojas ar receptoru, tiek aktivizēta šāda notikumu secība: IL-6 monomērs mijiedarbojas ar gp80 ķēdi, notiek kompleksu dimerizācija (2 citokīnu molekulas-2 gp80 ķēdes), pēc tam 2 gp130 ķēdes tiek pievienotas komplekss, kas noved pie Jak-kināzes fosforilēšanās. Pēdējie fosforilē faktorus STAT1 un STAT3, kas dimerizējas, pārvietojas kodolā un saista mērķa gēnu promotorus. Gp80 ķēde ir viegli nomazgājama no šūnas; brīvā formā tas mijiedarbojas ar citokīnu, to inaktivējot, t.i. darbojas kā specifisks IL-6 inhibitors.
IL-6 ir iesaistīts gandrīz visa vietējo iekaisuma izpausmju kompleksa ierosināšanā. Tas ietekmē fagocītu migrāciju, palielinot CC-kemokīnu ražošanu, kas piesaista monocītus un limfocītus, un vājina CX-kemokīnu ražošanu, kas piesaista neitrofilus. IL-6 pretiekaisuma iedarbība ir vājāka nekā IL-1 un TNFa, atšķirībā no tā tā nepalielinās, bet kavē iesaistīto šūnu proinflammatorisko citokīnu (IL-1, TNFa un IL-6) un ķīmokīnu veidošanos. iekaisuma procesā. Tādējādi IL-6 apvieno pretiekaisuma un pretiekaisuma citokīnu īpašības un ir iesaistīts ne tikai attīstībā, bet arī iekaisuma reakcijas ierobežošanā.
IL-6 ir galvenais faktors, kas izraisa akūtas fāzes proteīnu gēnu ekspresiju hepatocītos. IL-6 ietekmē dažādus asinsrades posmus, ieskaitot cilmes šūnu proliferāciju un diferenciāciju. Tas kalpo kā augšanas faktors nenobriedušām plazmas šūnām, ievērojami uzlabojot humorālo imūnreakciju. IL-6 ietekmē arī T limfocītus, palielinot citotoksisko T šūnu aktivitāti.
IL-17 un saistītie citokīni. Citokīnu grupa, ieskaitot IL-17 sugas, ir piesaistījusi plašu uzmanību saistībā ar īpaša veida T-palīgu Th17 atklāšanu, kas ir iesaistīts dažu kaitīgu iekaisuma reakciju formu izstrādē, jo īpaši autoimūni procesi (sk. 3.4.3.2. sadaļu). Šo citokīnu loma adaptīvās imūnās atbildes reakcijās tiks aplūkota turpmāk. Šeit mēs sniedzam tikai vispārīgu citokīnu aprakstu un īsi apsveram to lomu iedzimtas imunitātes reakcijās.
IL-17 saime ietver 6 proteīnus, kas apzīmēti ar burtiem no A līdz F. To iekaisuma citokīnu īpašības ir IL-17A un IL-17F. Tie ir ar disulfīdu saistīti homodimēri; to molekulmasa ir 17,5 kDa. Šos citokīnus ražo minētie Th17, kā arī CD8 + T šūnas, eozinofīli un neitrofīli. IL-23 stimulē TH7 šūnu attīstību un IL-17 ražošanu.
IL -17 receptorus ekspresē daudzas šūnas - epitēlija šūnas, fibroblasti, imūnsistēmas šūnas, jo īpaši neitrofīli. Galvenais IL-17 mijiedarbības ar receptoru rezultāts, tāpat kā citu pretiekaisuma citokīnu darbība, ir NF-KB faktora indukcija un daudzu no NF-KB atkarīgu iekaisuma gēnu ekspresija.
Viens no svarīgiem IL-17 (kopā ar IL-23) bioloģiskajiem efektiem ir neitrofilu homeostāzes uzturēšana. Šie citokīni uzlabo neitrofilu veidošanos, stimulējot G-CSF veidošanos. Tajā pašā laikā IL-17 un IL-23 ražošanas pieaugumu vai samazināšanos regulē neitrofilu skaits perifērajos audos: šo šūnu skaita samazināšanās apoptozes rezultātā palielina citokīnu ražošana.
IL-17 pretiekaisuma iedarbība galvenokārt izpaužas, palielinoties citu citokīnu (IL-8, IL-6, y-CSF, virknei ķīmokīnu) ražošanai un adhēzijas molekulu ekspresijai. Pelēm, kas ir transgēnas pret IL-17 vai IL-23, attīstās sistēmisks hronisks intersticiāla rakstura iekaisums ar infiltrāciju ar dažādu orgānu neitrofiliem, eozinofiliem, makrofāgiem un limfocītiem. Šie citokīni ir atzīti par vadošo lomu hronisku autoimūnu slimību attīstībā.
IL-12 ģimene
Ir identificēts, ka IL-12 spēj aktivizēt NK šūnas, izraisīt T limfocītu proliferāciju un izraisīt IFNy sintēzi. IL-12 ieņem īpašu vietu starp citokīniem, ko ražo iedzimtas imūnsistēmas šūnas, jo tas (tāpat kā tā galvenie ražotāji, dendritiskās šūnas) kalpo kā saikne starp iedzimto un adaptīvo imunitāti. No otras puses, IL-12 ir daļa no IL-12-IFNy tandēma, kam ir galvenā loma imūnsistēmas aizsardzībā pret intracelulāriem patogēniem.
IL-12 ir dimērs, kas sastāv no p40 un p35 apakšvienībām. Tā kopējā molekulmasa ir 75 kDa. IL-12 funkcionālā aktivitāte ir saistīta ar tās p40 apakšvienību. "Pilna mēroga" IL-12 izdala aktivēti monocīti, makrofāgi, mieloīdās dendrītiskās šūnas, neitrofīli un barjeras audu epitēlija šūnas (tie ražo gan Ig-12p35, gan IL-12p40 citokīnu apakšvienības). Lielākā daļa ķermeņa šūnu sintezē tikai funkcionāli neaktīvo apakšvienību ^ -12p35. Šūnas izdalītā IL-12 heterodimēra daudzumu ierobežo p35 apakšvienība. IL-12p40 tiek sintezēts pārmērīgi un var dimerizēties, veidojot homodimēru, kas darbojas kā IL-12 antagonists, kā arī ķīmisko atraktantu. IL-12 ražošanas induktori galvenokārt ir patogēni, ko atpazīst TLR un citi modeļa atpazīšanas receptori. IL-12 ražošanu pastiprina IL-1, IFNy, kā arī starpšūnu mijiedarbība, ko nodrošina CD40-CD154 un citi ģimeņu molekulu pāri-TNFR.
IL-12 receptori visspēcīgāk izpaužas uz NK šūnām, aktivētām TH šūnām un citotoksiskiem T limfocītiem, un mazākā mērā uz dendrītiskām šūnām. IL-12 receptoru ekspresiju aktivētās T šūnas pastiprina IL-12, IFNy, IFNa, TNFa ietekmē un pēc kostimulācijas caur CD28 receptoru. IL-12 receptors ir dimērs, ko veido IL-12RP1 (100 kDa) un IL-12RP2 (130 kDa, CD212) apakšvienības, ar kurām ir saistīts 85 kDa proteīns. Gan Pj, gan p2 ķēdes ir iesaistītas IL-12 saistīšanā, savukārt IL-12RP2 apakšvienība pārsvarā ir iesaistīta signāla pārraidē. Pj ķēdes intracelulārais domēns ir saistīts ar JAK2 kināzi, P2 ķēdes intracelulārais domēns ir saistīts ar Tyk2 kināzi. Kināzes fosforilē transkripcijas faktorus STAT1, STAT3, STAT4 un STAT5.
IL-12 galvenā funkcija, jo tā spēj stimulēt citotoksiskos limfocītus (NK un T) un izraisīt Thl šūnu diferenciāciju (skatīt 3.4.3.1. Sadaļu), ir šūnu aizsardzības mehānismu iedarbināšana pret intracelulāriem patogēniem. IL-12 iedarbojas uz NK un NKT šūnām jau imūnsistēmas sākumposmā, uzlabojot NK šūnu proliferāciju un citotoksisko aktivitāti, vēlāk-uz citotoksiskajiem T limfocītiem un visu šo šūnu IFNy sintēzi. Nedaudz vēlāk IL-12 izraisa Thl šūnu diferenciāciju, kas arī ražo IFNy. Thl šūnu indukcijas nosacījums ir sākotnējā IL-12RP2 receptoru apakšvienības ekspresija, ko veic aktivētās CD4 + T šūnas. Pēc tam šūnas iegūst spēju saistīties ar IL-12, kā rezultātā tiek aktivizēts STAT4 faktors, kas regulē Thl šūnām raksturīgo gēnu ekspresiju (IFNG gēna ekspresijai transkripcijas faktora T darbība -likme ir svarīgāka). Tajā pašā laikā IL-12 nomāc ^ 2 šūnu diferenciāciju un vājina šūnu ražošanu
IgE un IgA klases antivielu B sērija. Darbojoties uz dendrītiskiem un citiem APC, IL-12 izraisa kostimulējošu molekulu (CD80 / 86 uc), kā arī MHC-II APC produktu ekspresiju. Tādējādi IL-12 ir saistoša loma starp iedzimtu un adaptīvu imunitāti un uzlabo imūnos mehānismus, kas ir atbildīgi par aizsardzību pret intracelulāriem patogēniem un audzējiem.
IL-12 saime ietver IL-23, IL-27 un IL-35. Šie citokīni ir heterodimēri: IL-23 veido divas apakšvienības-I-23p19 un IL-12p40 (identiski attiecīgajai IL-12 apakšvienībai), IL-27-apakšvienības Ebi3 un IL-27p28, IL-35-pa apakšvienības Ebi3 un IL-12p35. Šos citokīnus ražo galvenokārt dendritiskās šūnas. IL-12 ģimenes citokīnu ražošanu izraisa PAMP un citokīni, kas atrodas uz patogēniem, jo īpaši GM-CSF.
IL-23 uztveršanu veic divas dažādas struktūras: IL-12p40 apakšvienību atpazīst IL-12 receptoru p-ķēde, bet apakšvienību R-23p19 atpazīst īpašs receptors IL-23R. STAT4 ir galvenā loma signāla pārraidē no IL-23. IL-27 receptors aktivizē molekulas WSX-1 (IL-12R p2 apakšvienības homologs) un gp130 (polipeptīdu ķēde, kas ir daļa no IL-6 saimes citokīnu receptoriem).
Tāpat kā IL-12, IL-23 un IL-27 pārsvarā iedarbojas uz CD4 + T šūnām, veicinot to diferenciāciju pa Th1 ceļu. IL-23 iezīmes-dominējošā ietekme uz atmiņas T-šūnām, kā arī spēja atbalstīt Th17 tipa T-palīgu attīstību. IL-27 atšķiras no pārējiem diviem ģimenes citokīniem ar spēju izraisīt ne tikai aktivētu, bet arī atpūtas CD4 + T šūnu proliferāciju. Nesen tika pierādīts, ka IL-27 un IL-35 var darboties kā regulējoši (nomācoši) faktori, jo to Ebi3 apakšvienība ir FOXP3 regulējošo T šūnu galvenā faktora mērķis.
Koloniju stimulējošos faktorus (CSF) (2.32. Tabula) vai hematopoetīnus attēlo trīs citokīni-GM-CSF, G-CSF un M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) ir funkcionāli tuvu tiem. Šos faktorus sauc par koloniju stimulējošiem faktoriem, jo tie vispirms tika identificēti pēc to spējas atbalstīt atbilstoša sastāva asinsrades šūnu koloniju augšanu in vitro. IL-3 ir visplašākais darbības spektrs, jo tas atbalsta jebkuras asinsrades šūnu kolonijas augšanu, izņemot limfoīdās šūnas. GM-CSF atbalsta gan jauktu granulocītu-monocītu koloniju, gan atsevišķi granulocītu un monocītu / makrofāgu koloniju augšanu. G-CSF un M-CSF specializējas savu koloniju augšanas un diferenciācijas uzturēšanā. Šie faktori ne tikai nodrošina šāda veida asinsrades šūnu izdzīvošanu un vairošanos, bet arī spēj aktivizēt jau nobriedušas diferencētas šūnas (M -CSF - makrofāgi, G -CSF - neitrofīli). M-CSF ir iesaistīts monocītu diferenciācijā makrofāgos un kavē monocītu diferenciāciju dendritiskās šūnās. G-CSF papildus iedarbībai uz hematopoēzes granulocītisko zaru izraisa asinsrades cilmes šūnu mobilizāciju no kaulu smadzenēm asinsritē.
2.32. Tabula. Koloniju stimulējošo faktoru raksturojums

Vārds om	Chromo sams	Molekulmasa, kDa	Šūnas ražotājiem	Šūnas mērķis	Recepte torijs
GM-CSF	5q	22	Makrofāgi, T šūnas, NK šūnas, stromas šūnas, epitēlija šūnas	Makrofāgi, neitrofīli, eozinofīli, T šūnas, dendritiskās šūnas, asinsrades šūnas	GM- CSFR a / lpp
G-CSF	17q	18-22		Neitrofīli, eozinofīli, T šūnas, asinsrades šūnas	G-CSFR (1 ķēde)
M-CSF	5q	45/70 (dimeris)	Makrofāgi, stromas šūnas, epitēlija šūnas	Makrofāgi, asinsrades šūnas	c-Fms
Cilmes šūnu faktors	12q	32	Štromāls šūnas	Hematopoētiskās šūnas, B šūnas, tuklās šūnas	c-komplekts
Flt-3- ligandu	19q	26,4	Štromāls šūnas	Hematopoētiskās šūnas, tuklās šūnas	Flt-3

G-CSF, GM-CSF un IL-3 strukturāli raksturo kā asinsradi, kas satur 4 a-spirālveida domēnus. To receptori satur 2 polipeptīdu ķēdes, tie pieder pie asinsrades receptoru saimes. M-CSF atšķiras no citiem CSF. Tā ir dimēra molekula un pastāv gan šķīstošā, gan ar membrānu saistītā formā. Tās receptorā ir ārpusšūnu Ig līdzīgi domēni un intracelulārs domēns ar tirozīnkināzes aktivitāti (šīs protoonkogēna kināzes nosaukums-c-Fms-dažreiz tiek pārnests uz visu receptoru). Kad M-CSF saistās ar receptoriem, notiek to dimerizācija un kināzes aktivācija.
Koloniju stimulējošos faktorus ražo endotēlija šūnas un fibroblasti, kā arī monocīti / makrofāgi. GM-CSF un IL-3 sintezē arī T limfocīti. Baktēriju produktu (izmantojot modeļa atpazīšanas receptorus) un pretiekaisuma citokīnu ietekmē koloniju stimulējošo faktoru sintēze un sekrēcija ievērojami palielinās, kā rezultātā palielinās mielopoēze. Īpaši spēcīgi tiek stimulēta granulocitopoēze, ko papildina paātrināta šūnu, tostarp nenobriedušu, emigrācija uz perifēriju. Tas rada priekšstatu par neitrofilo leikocitozi ar formulas nobīdi pa labi, kas ir ļoti raksturīga iekaisumam. Preparātus, kuru pamatā ir ĢM un G-CSF, klīniskajā praksē izmanto, lai stimulētu granulocitopoēzi, ko novājina citotoksiskā iedarbība (starojums, ķīmijterapija audzēju slimību ārstēšanai u.c.). G-CSF izmanto, lai mobilizētu asinsrades cilmes šūnas, kam seko inducētās leikomasas izmantošana, lai atjaunotu traucētu asinsradi.
Cilmes šūnu faktoru (SCF - cilmes šūnu faktors, c -kit ligands) izdala kaulu smadzeņu stromas šūnas (fibroblasti, endotēlija šūnas), kā arī dažāda veida šūnas embrionālās attīstības laikā. SCF pastāv kā transmembrāna un šķīstoša molekula (pēdējā veidojas ārpusšūnu daļas proteolītiskās šķelšanās rezultātā). SCF tiek konstatēts asins plazmā. Tās molekulā ir divas disulfīda saites. SCF receptoriem, c-Kk, ir tirozīnkināzes aktivitāte, un tie ir strukturāli līdzīgi Flt-3 un c-Fms (M-CSF receptoriem). Kad SCF saistās, receptori tiek dimerizēti un fosforilēti. Signāla pārraide notiek, piedaloties PI3K un MAP kaskādei.
SCF gēna un tā receptoru mutācijas jau sen ir aprakstītas (tērauda mutācijas); pelēm tie izpaužas kā mēteļa krāsas maiņa un asinsrades pārkāpums. Mutācijas, kas traucē faktora membrānas formas sintēzi, izraisa rupjus defektus embrija attīstībā. Kopā ar citiem faktoriem SCF ir iesaistīts asinsrades cilmes šūnu dzīvotspējas uzturēšanā, nodrošina to proliferāciju un atbalsta agrīnās asinsrades stadijas. SCF ir īpaši svarīgs eritropoēzei un tuklo šūnu attīstībai, kā arī kalpo kā timocītu augšanas faktors DN1 un DN2 stadijās.
Struktūras un bioloģiskās aktivitātes ziņā Flt-3L faktoram (Fms līdzīgais tirozinkināzes 3-ligands) piemīt īpašības, kas līdzīgas SCF, kombinācijā ar citiem faktoriem, kas atbalsta mielopoēzes sākuma stadiju un B-limfocītu attīstību. SCF spēlē leikēmisko mieloblastu augšanas faktora lomu.
Ķemokīni, kas ir svarīgs humorāls iekaisuma un iedzimtas imunitātes faktors, ir aplūkoti iepriekš leikocītu ķīmotakses aprakstā (skatīt 2.3.2. Sadaļu).

Kas ir citokīnu terapija

Pozitīva rīcība

Onkoimunoloģija un citokīnu terapija

Citokīnu funkcijas organismā

Citokīni kā zāles

Blakus efekti

Kam citokīnu terapijas metode nav piemērota

Citokīnu terapijas izmaksas

Pretvīrusu imunitātes molekulārie un šūnu mehānismi, attīstības modeļi un imunopato

Kaulu smadzeņu fibrozes cēloņu izpēte mieloproliferatīvās slimībās, analizējot trombocītu faktoru ietekmi uz mezenhimālajām cilmes šūnām

Tuberkulozes patoģenēze cilvēkiem