Вовед.

1. Општи карактеристики и класификација на цитокините.

1.1.Механизми на дејство.

1.2 Својства на цитокините.

1.3 Улогата на цитокините во регулирањето на физиолошките функции на телото.

2.Специјални студии на цитокини.

2.1 Важноста на цитокините во патогенезата на инфламаторните заболувања на дебелото црево кај децата.

2.2 Улогата на азотен оксид и цитокини во развојот на синдромот на акутна повреда на белите дробови.

3.Методи за одредување на цитокини

3.1.Одредување на биолошката активност на цитокините

3.2.Квантитативно определување на цитокини со користење на антитела

3.3 Определување на цитокини со ензимска имуноанализа.

3.3.1 Фактор на туморска некроза-алфа.

3.3.2 Интерферон гама.

3.3.3 Интерлеукин-4

3.3.4 Интерлеукин-8

3.3.5 Антагонист на рецепторот на интерлеукин-1.

3.3.6Алфа интерферон.

3.3.7 Антитела на алфа INF.

4. Имунотропни лекови базирани на цитокини.

Список на користена литература.

Заклучок.

Вовед.

Помина малку време откако беа опишани првите цитокини. Сепак, нивното истражување доведе до идентификација на обемен дел од знаењето - цитокинологијата, која е составен дел од различни области на знаење и, пред сè, имунологијата, која даде моќен поттик за проучување на овие медијатори. Цитокинологијата ги пробива сите клинички дисциплини, од етиологијата и патогенезата на болестите до превенцијата и лекувањето на различни патолошки состојби. Следствено, научните истражувачи и лекарите треба да се движат низ разновидноста на регулаторните молекули и да имаат јасно разбирање за улогата на секој цитокин во процесите што се проучуваат. Сите клетки на имунолошкиот систем имаат специфични функции и работат во јасно координирана интеракција, која ја обезбедуваат специјални биолошки активни супстанции - цитокини - регулатори на имунолошките реакции. Цитокините се специфични протеини со помош на кои различните клетки на имунолошкиот систем можат да разменуваат информации меѓу себе и да ги координираат дејствата. Множеството и количините на цитокини кои делуваат на рецепторите на клеточната површина - „цитокинското милје“ - претставуваат матрица на сигнали кои комуницираат и често се менуваат. Овие сигнали се сложени поради широката разновидност на цитокински рецептори и затоа што секој цитокин може да активира или потисне неколку процеси, вклучувајќи ја сопствената синтеза и синтезата на други цитокини, како и формирањето и појавата на цитокински рецептори на површината на клетката. Целта на нашата работа е да ги проучуваме цитакините, нивните функции и својства, како и нивната можна употреба во медицината. Цитокините се мали протеини (молекуларна тежина од 8 до 80 KDa) кои делуваат автокрино (т.е. на клетката што ги произведува) или паракрино (на клетките лоцирани во близина). Формирањето и ослободувањето на овие високо активни молекули е минливо и цврсто регулирано.

Литературна критика.

Општи карактеристики и класификација на цитокините.

Цитокините се група полипептидни медијатори на меѓуклеточна интеракција, првенствено вклучени во формирањето и регулирањето на одбрамбените реакции на телото за време на воведувањето на патогени и нарушување на интегритетот на ткивото, како и во регулирањето на голем број нормални физиолошки функции. Цитокините можат да се одвојат во нов независен регулаторен систем кој постои заедно со нервниот и ендокриниот систем за одржување на хомеостазата, а сите три системи се тесно меѓусебно поврзани и меѓусебно зависни. Во текот на изминатите две децении, гените на повеќето цитокини беа клонирани и беа добиени рекомбинантни аналози кои целосно ги реплицираат биолошките својства на природните молекули. Сега се познати повеќе од 200 индивидуални супстанции кои припаѓаат на семејството на цитокини. Историјата на проучувањето на цитокините започна во 40-тите години на дваесеттиот век. Тогаш беа опишани првите ефекти на кахектинот, фактор присутен во крвниот серум и способен да предизвика кахексија или губење на телесна тежина. Последователно, овој медијатор беше изолиран и се покажа дека е идентичен со факторот на туморска некроза (TNF). Во тоа време, проучувањето на цитокините се засноваше на принципот на откривање на кој било биолошки ефект, што служеше како почетна точка за именување на соодветниот медијатор. Така се нарекуваше интерферонот (IFN) во 50-тите години поради неговата способност да попречува или да ја зголеми отпорноста при повторена вирусна инфекција. Интерлеукин-1 (IL-1) првично беше наречен и ендоген пироген, за разлика од бактериските липополисахариди, кои се сметаа за егзогени пирогени. Следната фаза во проучувањето на цитокините, која датира од 60-70 години, е поврзана со прочистување на природните молекули и сеопфатна карактеризација на нивното биолошко дејство. Овој пат вклучуваше откривање на факторот на раст на Т-клетките, сега познат како IL-2, и голем број други молекули кои го стимулираат растот и функционалната активност на Т-, Б-лимфоцитите и другите видови леукоцити. Во 1979 година, терминот „интерлеукини“ беше предложен за нивно назначување и систематизирање, односно медијатори кои комуницираат помеѓу леукоцитите. Сепак, наскоро стана јасно дека биолошките ефекти на цитокините се протегаат многу подалеку од имунолошкиот систем, и затоа претходно предложениот термин „цитокини“ стана поприфатлив и остана до ден-денес. Револуционерен пресврт во проучувањето на цитокините се случи во раните 80-ти по клонирањето на гените за интерферон од глувчето и човекот и производството на рекомбинантни молекули кои целосно ги реплицираа биолошките својства на природните цитокини. По ова, беше можно да се клонираат гените на други медијатори од ова семејство. Важна пресвртница во историјата на цитокините беше клиничката употреба на рекомбинантните интерферони и особено рекомбинантниот IL-2 за третман на рак. 90-тите беа обележани со откривањето на структурата на подединицата на цитокинските рецептори и формирањето на концептот „цитокинска мрежа“, а почетокот на 21 век беше одбележан со откривање на многу нови цитокини преку генетска анализа. Цитокините вклучуваат интерферони, фактори за стимулирање на колониите (CSF), хемокини, трансформирачки фактори на раст; фактор на некроза на туморот; интерлеукини со историски утврдени сериски броеви и некои други ендогени медијатори. Интерлеукините, кои имаат сериски броеви почнувајќи од 1, не припаѓаат на истата подгрупа на цитокини поврзани со заеднички функции. Тие, пак, може да се поделат на проинфламаторни цитокини, фактори на раст и диференцијација на лимфоцитите и индивидуални регулаторни цитокини. Името „интерлеукин“ се доделува на новооткриениот медијатор доколку се исполнети следните критериуми развиени од номенклатурниот комитет на Меѓународната унија на имунолошки здруженија: молекуларно клонирање и изразување на генот на факторот што се проучува, присуство на единствен нуклеотид и соодветната аминокиселинска секвенца и производство на неутрализирачки моноклонални антитела. Покрај тоа, новата молекула мора да биде произведена од клетките на имунолошкиот систем (лимфоцити, моноцити или други видови леукоцити), да има важна биолошка функција во регулирањето на имунолошкиот одговор, а исто така да има дополнителни функции, поради што не може да се даде. функционално име. Конечно, наведените својства на новиот интерлеукин мора да бидат објавени во рецензирана научна публикација. Класификацијата на цитокините може да се врши според нивните биохемиски и биолошки својства, како и според типовите на рецептори преку кои цитокините ги извршуваат своите биолошки функции. Класификацијата на цитокините по структура (Табела 1) ја зема предвид не само низата на аминокиселините, туку првенствено терциерната структура на протеинот, што попрецизно го одразува еволутивното потекло на молекулите.

Табела 1. Класификација на цитокините по структура.

Клонирањето на гените и анализата на структурата на цитокинските рецептори покажаа дека, исто како и самите цитокини, овие молекули можат да се поделат на неколку типови според сличноста на амино киселинските секвенци и особеностите на организацијата на екстрацелуларните домени (Табела 2). Едно од најголемите фамилии на цитокински рецептори се нарекува фамилија на хематопоетински рецептори или фамилија на цитокински рецептори тип I. Структурна карактеристика на оваа група рецептори е присуството во молекулата од 4 цистеини и аминокиселинската секвенца Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), која се наоѓа на кратко растојание од клеточната мембрана. Цитокинските рецептори од класа II комуницираат со интерферони и IL-10. И двата први типа на рецептори имаат хомологија еден со друг. Следниве групи рецептори обезбедуваат интеракција со цитокините од семејството на тумор некроза фактор и семејството IL-1. Во моментов, познати се повеќе од 20 различни рецептори за хемокини, кои имаат интеракција со различни степени на афинитет со еден или повеќе лиганди од семејството на хемокини. Хемокинските рецептори припаѓаат на суперфамилијата на родопсински рецептори, имаат 7 трансмембрански домени и пренесуваат сигнали користејќи G протеини.

Табела 2. Класификација на цитокински рецептори.

Многу цитокински рецептори се состојат од 2-3 подединици, кодирани од различни гени и изразени независно. Покрај тоа, формирањето на рецептор со висок афинитет бара истовремена интеракција на сите подединици. Пример за таква организација на цитокински рецептори е структурата на IL-2 рецепторскиот комплекс. Изненадувачки беше откритието дека поединечните подединици на комплексот на рецепторот IL-2 се заеднички за IL-2 и неколку други цитокини. Така, β-синџирот е истовремено компонента на рецепторот за IL-15, а γ-ланецот служи како заедничка подединица на рецепторите за IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 и IL-21. Ова значи дека сите споменати цитокини, чии рецептори исто така се состојат од 2-3 индивидуални полипептиди, го користат γ-синџирот како компонента на нивните рецептори, згора на тоа, компонентата одговорна за пренос на сигналот. Во сите случаи, специфичноста на интеракцијата за секој цитокин е обезбедена од други подединици кои се разликуваат по структура. Помеѓу цитокинските рецептори, постојат 2 почести рецепторски подединици кои пренесуваат сигнали по интеракција со различни цитокини. Ова е бc рецепторската подединица вообичаена (gp140) за рецепторите на IL-3, IL-5 и GM-CSF, како и за подединицата на рецепторот gp130 вообичаена за членовите на семејството IL-6. Присуството на заедничка сигнална подединица во цитокинските рецептори служи како еден од пристапите за нивната класификација, бидејќи ни овозможува да најдеме заедништво и во структурата на лигандите и во биолошките ефекти.

Табела 3 покажува комбинирана структурна и функционална класификација, каде што сите цитокини се поделени во групи, примарно земајќи ја предвид нивната биолошка активност, како и горенаведените структурни карактеристики на молекулите на цитокините и нивните рецептори.

Табела 3. Структурна и функционална класификација на цитокините.

	Семејства на цитокини	Подгрупи и лиганди	Основни биолошки функции
	Интерферони од тип I	IFN a,b,d,k,w,t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Антивирусно дејство, антипролиферативно, имуномодулаторно дејство
	Фактори за раст на хематопоетските клетки	Фактор на матични клетки (кит-лиганд, челичен фактор), Flt-3 лиганд, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 gp140 лиганди: IL-3, IL-5, GM-CSF	Стимулација на пролиферација и диференцијација на различни типови на прогениторни клетки во коскената срцевина, активирање на хематопоеза Еритропоетин, Тромбопоетин
	Интерлеукин-1 и суперфамилија FGF	Семејство FRF: Киселина FGF, основен FGF, FGF3 – FGF23 Фамилија на IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, антагонист на рецепторот на IL-1, IL-18, IL-33, итн.	Активирање на пролиферација на фибробласти и епителни клетки Проинфламаторно дејство, активирање на специфичен имунитет
	Семејство на фактор на туморска некроза	TNF, лимфотоксини α и β, Fas лиганд, итн.	Проинфламаторно дејство, регулирање на апоптозата и меѓуклеточна интеракција на имунокомпетентните клетки
	Семејство интерлеукин-6	gp130 лиганди: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Cardiotropin-1, инхибиторен фактор на леукемија, цилијарен невротрофичен фактор	Проинфламаторни и имунорегулаторни ефекти
	Хемокини	SS, SXS (IL-8), SX3S, С	Регулирање на хемотаксата на различни видови леукоцити
	Семејство Интерлеукин-10	IL-10,19,20,22,24,26	Имуносупресивен ефект
	Семејство интерлеукин-12		Регулирање на диференцијација на помошни Т-лимфоцити
	Цитокини на Т-помошни клонови и регулаторни функции на лимфоцитите	Т-помошник тип 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg Помошни Т-клетки тип 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Лиганди на г-синџир на рецепторот на IL-2: IL-7 TSLP	Активирање на клеточниот имунитет Активирање на хуморалниот имунитет, имуномодулаторно дејство Стимулација на диференцијација, пролиферација и функционални својства на различни типови на лимфоцити, DCs, NK клетки, макрофаги итн.
	Семејство Интерлеукин 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Активирање на синтезата на проинфламаторни цитокини
	Суперфамилија на фактор на раст на нервите, фактор на раст добиен од тромбоцити и фактори на раст на трансформирање	Фамилија на нервни фактори за раст: NGF, невротрофичен фактор добиен од мозокот Фактори на раст добиени од тромбоцити (PDGF), ангиогени фактори на раст (VEGF) Семејство TRF: TRFb, активини, инхибини, нодални, коскени морфогени протеини, мулерова инхибиторна супстанција	Регулирање на воспаление, ангиогенеза, невронска функција, ембрионален развој и регенерација на ткивото
	Фамилија на епидермален фактор на раст	ERF, TRFα, итн.
	Семејство на фактори на раст сличен на инсулин	IRF-I, IRF-II	Стимулација на размножување на различни типови клетки

Првата група вклучува интерферони од тип I и е наједноставна во организацијата, бидејќи сите молекули вклучени во неа имаат слична структура и во голема мера исти функции поврзани со антивирусна заштита. Втората група вклучувала фактори на раст и диференцијација на хематопоетските клетки кои го стимулираат развојот на хематопоетските прогениторни клетки, почнувајќи од матичните клетки. Оваа група вклучува цитокини кои се тесно специфични за поединечни линии на диференцијација на хематопоетските клетки (еритропоетин, тромбопоетин, како и IL-7, кој делува на прекурсорите на Т-Б-лимфоцитите), како и цитокини со поширок спектар на биолошка активност. како што се IL-3, IL-11, фактори кои стимулираат колонии. Во рамките на оваа група на цитокини, лигандите gp140, кои имаат заедничка рецепторска подединица, како и тромбопоетин и еритропоетин, се изолирани поради сличноста во структурната организација на молекулите. Цитокините од суперфамилијата FGF и IL-1 имаат висок степен на хомологија и слична протеинска структура, што го потврдува нивното заедничко потекло. Сепак, во однос на манифестациите на биолошката активност, FGF во многу аспекти се разликува од агонистите на семејството IL-1. Фамилијата на IL-1 молекули во моментов, покрај функционалните имиња, ги има ознаките F1-F11, каде што F1 одговара на IL-1α, F2 на IL-1β, F3 на антагонистот на IL-1 рецепторот, F4 на IL-18 . Останатите членови на семејството се откриени како резултат на генетска анализа и имаат прилично висока хомологија со молекулите на IL-1, но нивните биолошки функции не се целосно разјаснети. Следниве групи на цитокини ги вклучуваат фамилиите на IL-6 (лиганди на заедничката рецепторска подединица gp130), фактор на некроза на туморот и хемокини, претставени со најголем број поединечни лиганди и целосно наведени во нивните соодветни поглавја. Фамилијата на туморски фактори на некроза се формира главно врз основа на сличностите во структурата на лигандите и нивните рецептори, составена од три не-ковалентно поврзани идентични подединици кои формираат биолошки активни молекули. Во исто време, поради нивните биолошки својства, ова семејство вклучува цитокини со сосема различни активности. На пример, TNF е еден од најистакнатите проинфламаторни цитокини, Fas-лигандот предизвикува апоптоза на целните клетки, а лигандот CD40 обезбедува стимулирачки сигнал за време на меѓуклеточната интеракција на Т и Б-лимфоцитите. Ваквите разлики во биолошката активност на структурно сличните молекули се одредуваат првенствено од карактеристиките на изразот и структурата на нивните рецептори, на пример, присуството или отсуството на интрацелуларен домен на „смрт“ што ја одредува клеточната апоптоза. Семејствата IL-10 и IL-12, исто така, беа надополнети во последниве години со нови членови кои ги добија сериските броеви интерлеукини. Потоа следи многу сложена група на цитокини, кои се посредници на функционалната активност на помошните Т-лимфоцити. Вклучувањето во оваа група се заснова на два главни принципи: 1) припадност на цитокини синтетизирани од Th1 или Th2, што го одредува развојот на претежно хуморалниот или клеточниот тип на имунолошки реакции, 2) присуството на заедничка рецепторска субединица - гама синџирот на IL-2 рецептор комплекс. Меѓу лигандите на гама синџирот, дополнително беше изолиран IL-4, кој исто така има заеднички рецепторски подединици со IL-13, што во голема мера ја одредува делумно преклопувачката биолошка активност на овие цитокини. IL-7, кој има заедничка рецепторна структура со TSLP, беше слично изолиран. Предностите на горната класификација се поврзани со истовремено разгледување на биолошките и биохемиските својства на цитокините. Изводливоста на овој пристап во моментов е потврдена со откривање на нови цитокини преку генетска анализа на геномот и потрага по структурно слични гени. Благодарение на овој метод, семејството на интерферони од типот I, IL-1, IL-10, IL-12, значително се прошири и се појави ново семејство на аналози на цитокини на IL-17, кое веќе се состои од 6 членови. Очигледно, во блиска иднина, појавата на нови цитокини ќе се случи многу побавно, бидејќи анализата на човечкиот геном е речиси завршена. Промените се најверојатно можни со разјаснување на варијантите на интеракциите на лиганд-рецептор и биолошките својства, што ќе овозможи класификацијата на цитокините да ја добие нивната конечна форма.

Механизми на дејствување.

Б. Цитокински рецептори. Цитокините се хидрофилни сигнални супстанции, чие дејство е посредувано од специфични рецептори на надворешната страна на плазма мембраната. Врзувањето на цитокините со рецепторот (1) води низ низа средни фази (2-5) до активирање на транскрипцијата на одредени гени (6).Самите цитокински рецептори немаат активност на тирозин киназа (со неколку исклучоци). По врзувањето за цитокинот (1), молекулите на рецепторот се здружуваат за да формираат хомодимери. Дополнително, тие можат да формираат хетеродимери преку поврзување со протеини транспортер на сигнали [STPs] или да стимулираат димеризација на самите STPs (2). Цитокинските рецептори од класа I може да се агрегираат со три типа на BPS: GP130, βc или γc протеини. Овие помошни протеини сами по себе не се способни да ги врзуваат цитокините, но тие пренесуваат сигнал до тирозин киназите (3).Идентичните спектри на биолошка активност на многу цитокини се објаснуваат со фактот дека различни комплекси на цитокин-рецептор може да го активираат истиот BPS.

Како пример за сигнализирање на цитокини, дијаграмот покажува како рецепторот на IL-6 (IL-6), при врзувањето за лигандот (1), ја стимулира димеризацијата на GP130 (2). Мембранскиот протеински димер GP130 ги врзува и активира цитоплазматските тирозин кинази од семејството ЈА (Јанус кинази со две активни места) (3). Јанус киназите фосфорилираат цитокински рецептори, BPS и разни цитоплазматски протеини, кои вршат понатамошен пренос на сигнал; тие исто така ги фосфорилираат факторите на транскрипција - сигнални трансдуктори и активатори на транскрипцијата [PSAT (сигнални трансдуцери и активатори на транскрипција)]. Овие протеини припаѓаат на семејството BPS, кои имаат SH3 домен во нивната структура што ги препознава остатоците од фосфотирозин (види стр. 372). Затоа, тие имаат способност да се поврзат со фосфорилираниот цитокински рецептор. Ако тогаш дојде до фосфорилација на молекулата PSAT (4), факторот станува активен и формира димер (5). По транслокацијата во јадрото, димерот, како фактор на транскрипција, се врзува за промоторот (види стр. 240) на иницираниот ген и ја индуцира неговата транскрипција (6). Некои цитокински рецептори може да го изгубат својот екстрацелуларен домен за врзување лиганд поради протеолиза (не е прикажано на дијаграмот). Доменот влегува во крвта, каде што се натпреварува за врзување за цитокинот, со што се намалува концентрацијата на цитокинот во крвта.Заедно, цитокините формираат регулаторна мрежа (цитокинска каскада) со мултифункционален ефект. Преклопувањето помеѓу цитокините води до фактот дека дејството на многу од нив е синергетско, а некои цитокини се антагонисти. Често во телото може да се забележи цела каскада на цитокини со сложени повратни информации.

Својства на цитокините.

Општи својства на цитокините, благодарение на што овие медијатори можат да се комбинираат во независен регулаторен систем.

1. Цитокините се полипептиди или протеини, често гликолизирани, повеќето од нив имаат MW од 5 до 50 kDa. Биолошки активните цитокински молекули може да се состојат од една, две, три или повеќе идентични или различни подединици.

2. Цитокините немаат антиген специфично биолошко дејство. Тие влијаат на функционалната активност на клетките кои учествуваат во реакциите на вродениот и стекнатиот имунитет. Меѓутоа, со делување на Т и Б-лимфоцитите, цитокините се способни да ги стимулираат процесите индуцирани од антиген во имунолошкиот систем.

3. За цитокинските гени, постојат три опции за изразување: а) специфична експресија во фаза на одредени фази од ембрионалниот развој, б) конститутивна експресија за регулирање на голем број нормални физиолошки функции, в) индуциран тип на изразување, карактеристичен за повеќето цитокини. Навистина, повеќето цитокини надвор од воспалителната реакција и имунолошкиот одговор не се синтетизираат од клетките. Изразувањето на цитокинските гени започнува како одговор на пенетрација на патогени во телото, антигенска иритација или оштетување на ткивото. Еден од најмоќните поттикнувачи на синтезата на проинфламаторните цитокини се молекуларните структури поврзани со патогенот. За да се активира синтезата на Т-клеточните цитокини, потребно е активирање на клетките од специфичен антиген со учество на Т-клеточниот антиген рецептор.

4. Цитокините се синтетизираат како одговор на стимулација за краток временски период. Синтезата е прекината поради различни авторегулаторни механизми, вклучително и зголемена нестабилност на РНК и поради постоењето на негативни повратни информации посредувани од простагландини, кортикостероидни хормони и други фактори.

5. Истиот цитокин може да биде произведен од типови телесни клетки од различно хистогенетско потекло во различни органи.

6. Цитокините можат да се поврзат со мембраните на клетките кои ги синтетизираат, поседувајќи целосен спектар на биолошка активност во форма на мембранска форма и манифестирајќи го нивниот биолошки ефект при меѓуклеточен контакт.

7. Биолошките ефекти на цитокините се посредувани преку специфични комплекси на клеточни рецептори кои ги врзуваат цитокините со многу висок афинитет, а поединечните цитокини можат да користат заеднички рецепторни подединици. Цитокинските рецептори може да постојат во растворлива форма додека ја задржуваат способноста да ги врзуваат лигандите.

8. Цитокините имаат плеиотропни биолошки ефекти. Истиот цитокин може да дејствува на многу типови на клетки, предизвикувајќи различни ефекти во зависност од типот на целните клетки (сл. 1). Плеиотропијата на дејството на цитокините е обезбедена со изразување на цитокински рецептори на клеточни типови со различно потекло и функции и пренос на сигнал со користење на неколку различни интрацелуларни гласници и фактори на транскрипција.

9. Цитокините се карактеризираат со заменливост на биолошкото дејство. Неколку различни цитокини може да предизвикаат ист биолошки ефект или да имаат слична активност. Цитокините индуцираат или ја потиснуваат синтезата на самите нив, другите цитокини и нивните рецептори.

10. Како одговор на сигналот за активирање, клетките истовремено синтетизираат неколку цитокини вклучени во формирањето на цитокинската мрежа. Биолошките ефекти на ниво на ткиво и тело зависат од присуството и концентрацијата на други цитокини со синергистички, адитивни или спротивставени ефекти.

11. Цитокините можат да влијаат на пролиферацијата, диференцијацијата и функционалната активност на целните клетки.

12. Цитокините делуваат на клетките на различни начини: автокрини - на клетката која го синтетизира и лачи овој цитокин; паракрин - на клетки лоцирани во близина на продуцентската клетка, на пример, во фокусот на воспаление или во лимфоиден орган; ендокриниот - далечински на клетките на сите органи и ткива по влегувањето во циркулацијата. Во вториот случај, дејството на цитокините наликува на дејството на хормоните (сл. 2).

Ориз. 1. Истиот цитокин може да се произведе од типови на телесни клетки со различно хистогенетско потекло во различни органи и да делува на многу типови на клетки, предизвикувајќи различни ефекти во зависност од видот на целните клетки.

Ориз. 2. Три опции за манифестација на биолошкото дејство на цитокините.

Очигледно, формирањето на системот за регулација на цитокините се одвиваше еволутивно заедно со развојот на повеќеклеточни организми и се должи на потребата за формирање на медијатори на меѓуклеточната интеракција, која може да вклучува хормони, невропептиди, молекули на адхезија и некои други. Во овој поглед, цитокините се најуниверзалниот регулаторен систем, бидејќи тие се способни да покажат биолошка активност и далечно по секрецијата од клетката производител (локално и системски), и за време на меѓуклеточниот контакт, биолошки активни во форма на мембранска форма. Овој систем на цитокини се разликува од молекулите на адхезија, кои вршат потесни функции само при директен контакт со клетките. Во исто време, системот на цитокини се разликува од хормоните, кои главно се синтетизираат од специјализирани органи и ги вршат своите ефекти по влегувањето во циркулаторниот систем.

Улогата на цитокините во регулирањето на физиолошките функции на телото.

Улогата на цитокините во регулирањето на физиолошките функции на телото може да се подели на 4 главни компоненти:

1. Регулирање на ембриогенезата, формирање и развој на органи, вкл. органи на имунолошкиот систем.

2. Регулирање на одредени нормални физиолошки функции.

3. Регулирање на одбранбените реакции на организмот на локално и системско ниво.

4. Регулирање на процесите на регенерација на ткивата.

Изразувањето на гените за поединечни цитокини се јавува на специфичен начин за фаза во одредени фази на ембрионалниот развој. Фактор на матични клетки, трансформирачки фактори на раст, цитокини и хемокини од семејството TNF ја регулираат диференцијацијата и миграцијата на различни клетки и формирањето на органи на имунолошкиот систем. По ова, синтезата на некои цитокини може да не продолжи, додека други продолжуваат да ги регулираат нормалните физиолошки процеси или да учествуваат во развојот на заштитни реакции.

И покрај фактот дека повеќето цитокини се типични индуцирани медијатори и не се синтетизираат од клетки надвор од воспалителниот и имунолошкиот одговор во постнаталниот период, некои цитокини не спаѓаат под ова правило. Како резултат на конститутивната генска експресија, некои од нив постојано се синтетизираат и се во оптек во доволно големи количини, регулирајќи ја пролиферацијата и диференцијацијата на одделните типови на клетки во текот на животот. Примери за овој тип на физиолошка регулација на функциите од страна на цитокините може да бидат постојано високо ниво на еритропоетин и некои CSF за да се обезбеди хематопоеза. Регулирањето на одбрамбените реакции на организмот со цитокини се случува не само во рамките на имунолошкиот систем, туку и преку организирање на одбранбени реакции на ниво на целиот организам поради регулирање на речиси сите аспекти на развојот на воспалението и имунолошкиот одговор. Оваа функција, која е најважна за целиот цитокински систем, е поврзана со две главни насоки на биолошкото дејство на цитокините - заштита од инфективни агенси и реставрација на оштетените ткива. Цитокините примарно го регулираат развојот на локални заштитни реакции во ткивата кои вклучуваат различни типови на крвни клетки, ендотел, сврзно ткиво и епители. Заштитата на локално ниво се развива преку формирање на типична воспалителна реакција со нејзините класични манифестации: хиперемија, развој на едем, појава на болка и дисфункција. Синтезата на цитокините започнува кога патогените микроорганизми продираат во ткивата или го нарушуваат нивниот интегритет, што обично се случува паралелно. Производството на цитокини е дел од клеточниот одговор поврзан со препознавањето од страна на миеломоноцитните клетки на слични структурни компоненти на различни патогени, наречени молекуларни обрасци поврзани со патогенот. Примери за такви структури на патогени се липополисахариди на грам-негативни бактерии, пептидогликани на грам-позитивни микроорганизми, флагелин или ДНК богата со CpolyG секвенци, што е типично за ДНК на сите видови бактерии. Леукоцитите изразуваат соодветни рецептори за препознавање на шаблони, наречени и рецептори слични на Toll (TLRs) и специфични за одредени структурни модели на микроорганизми. По интеракцијата на микроорганизмите или нивните компоненти со TLR, се активира каскада на интрацелуларна трансдукција на сигналот, што доведува до зголемена функционална активност на леукоцитите и изразување на гените на цитокините.

Активирањето на TLR води до синтеза на две главни групи цитокини: проинфламаторни цитокини и интерферони тип I, главно IFNα/β. Клучниот настан е синтеза на комплекс на проинфламаторни цитокини од фамилиите на IL-1, IL-6, TNF и хемокини, кои ги стимулираат повеќето од понатамошните настани во развојот на инфламаторниот одговор и обезбедуваат проширување слично на вентилаторот на активирање на различни типови на клетки вклучени во одржување и регулирање на воспалението, вклучувајќи ги сите видови леукоцити, дендритични клетки, Т и Б-лимфоцити, NK-клетки, ендотелијални и епителни клетки, фибробласти и други. Ова обезбедува последователни фази во развојот на инфламаторниот одговор, кој е главниот механизам за спроведување на вродениот имунитет. Покрај тоа, дендритичните клетки почнуваат да синтетизираат цитокини од семејството IL-12, кои ја стимулираат диференцијацијата на помошните Т-лимфоцити, што служи како еден вид мост до почетокот на развојот на специфични имунолошки реакции поврзани со препознавање на специфични антигени структури на микроорганизми.

Вториот не помалку важен механизам поврзан со синтезата на IFN обезбедува спроведување на антивирусна заштита. Интерфероните од тип I покажуваат 4 главни биолошки својства:

1. Директен антивирусен ефект со блокирање на транскрипцијата.

2. Сузбивање на клеточната пролиферација, неопходно за блокирање на ширењето на вирусот.

3. Активирање на функциите на NK-клетките кои имаат способност да ги лизираат телесните клетки инфицирани со вирус.

4. Засилена експресија на молекули на главниот комплекс на хистокомпатибилност од класа I, неопходни за зголемување на ефикасноста на презентација на вирусни антигени од инфицираните клетки до цитотоксични Т-лимфоцити. Ова води до активирање на специфичното препознавање на клетките инфицирани со вирус од Т-лимфоцитите - првата фаза на лиза на целните клетки инфицирани со вирус.

Како резултат на тоа, покрај директниот антивирусен ефект, се активираат механизмите и на вродениот (NK-клетки) и на стекнатиот (Т-лимфоцити) имунитет. Ова е пример за тоа како една мала молекула на цитокин со MW 10 пати помала од MW на молекули на антитела е способна, поради плеиотропниот тип на биолошко дејство, да активира сосема различни механизми на заштитни реакции насочени кон постигнување на една цел - отстранување на вирус кој влегол во телото.

На ниво на ткиво, цитокините се одговорни за развој на воспаление, а потоа и за регенерација на ткивото. Со развојот на системски воспалителен одговор (одговор во акутна фаза), цитокините влијаат на речиси сите органи и системи на телото вклучени во регулирањето на хомеостазата. Ефектот на проинфламаторните цитокини врз централниот нервен систем доведува до намалување на апетитот и промена на целиот комплекс на реакции на однесување. Привремено запирање на потрагата по храна и намалување на сексуалната активност е корисно во смисла на заштеда на енергија само за една задача - борба против патогенот кој напаѓа. Овој сигнал го обезбедуваат цитокините, бидејќи нивното влегување во циркулацијата секако значи дека локалната одбрана не успеала да се справи со патогенот и дека е потребен системски воспалителен одговор. Една од првите манифестации на системски воспалителен одговор, поврзан со дејството на цитокините на терморегулаторниот центар на хипоталамусот, е зголемување на телесната температура. Зголемувањето на температурата е ефикасна заштитна реакција, бидејќи при покачени температури способноста на некои бактерии да се репродуцираат се намалува, но, напротив, се зголемува пролиферацијата на лимфоцитите.

Во црниот дроб, под влијание на цитокините, се зголемува синтезата на протеините во акутната фаза и компонентите на системот на комплементот, неопходни за борба против патогенот, но во исто време се намалува и синтезата на албумин. Друг пример за селективно дејство на цитокините е промената на јонскиот состав на крвната плазма за време на развојот на системски воспалителен одговор. Во овој случај, нивото на железни јони се намалува, но нивото на јони на цинк се зголемува, но добро е познато дека лишувањето на бактериската клетка од железни јони значи намалување на нејзиниот пролиферативен потенцијал (ефектот на лактоферинот се базира на ова). Од друга страна, зголемувањето на нивото на цинк е неопходно за нормално функционирање на имунолошкиот систем, особено, неопходно е за формирање на биолошки активниот серумски тимичен фактор - еден од главните тимусни хормони кои обезбедуваат диференцијација на лимфоцитите. Влијанието на цитокините врз хематопоетскиот систем е поврзано со значително активирање на хематопоезата. Зголемувањето на бројот на леукоцити е неопходно за да се надополнат загубите и да се зголеми бројот на клетки, главно неутрофилни гранулоцити, во фокусот на гнојното воспаление. Ефектот врз системот за коагулација на крвта е насочен кон подобрување на коагулацијата, што е неопходно за да се запре крварењето и директно да се блокира патогенот.

Така, со развојот на системско воспаление, цитокините покажуваат огромен опсег на биолошки активности и го попречуваат функционирањето на речиси сите телесни системи. Сепак, ниту една од промените што се случуваат не е случајна: сите тие се или потребни за директно активирање на заштитните реакции или се корисни во смисла на префрлување на енергетските текови само за една задача - борба против патогенот кој напаѓа. Во форма на регулирање на изразувањето на поединечни гени, хормонални промени и промени во реакциите на однесувањето, цитокините обезбедуваат вклучување и максимална ефикасност на оние телесни системи кои се потребни во дадено време за развој на заштитни реакции. На ниво на целиот организам, цитокините комуницираат помеѓу имунолошкиот, нервниот, ендокриниот, хематопоетскиот и другите системи и служат за нивно вклучување во организацијата и регулирањето на една заштитна реакција. Цитокините служат како организационен систем кој го формира и регулира целиот комплекс на заштитни реакции на телото за време на воведувањето на патогени. Очигледно, таков регулаторен систем е формиран еволутивно и има безусловна корист за најоптималниот заштитен одговор на макроорганизмот. Затоа, очигледно, невозможно е да се ограничи концептот на заштитни реакции само на учество на неспецифични механизми на отпор и специфичен имунолошки одговор. Целото тело и сите системи кои на прв поглед не се поврзани со одржување на имунитетот учествуваат во една заштитна реакција.

Специфични студии за цитокини.

Важноста на цитокините во патогенезата на инфламаторните заболувања на дебелото црево кај децата.

С.В. Белмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Шчиголева, Т.Л. Михајлова. Рускиот државен медицински универзитет Државниот истражувачки центар за колопроктологија, Москва и Државниот истражувачки институт за високо чисти биолошки препарати, Санкт Петербург работат на проучување на важноста на цитокините во патогенезата на воспалителни болести на дебелото црево кај децата. Хроничните воспалителни заболувања на гастроинтестиналниот тракт во моментов заземаат едно од водечките места во патологијата на дигестивниот систем кај децата. Особено значење се придава на инфламаторните заболувања на дебелото црево (IBD), чија инциденца постојано се зголемува низ целиот свет. Долг тек со чести и во некои случаи фатални рецидиви, развој на локални и системски компликации - сето тоа поттикнува темелно проучување на патогенезата на болеста во потрага по нови пристапи за лекување на ИТД. Во последните децении, инциденцата на улцеративен колитис (УК) е 510 случаи годишно на 100 илјади население, со Кронова болест (ЦД) 16 случаи годишно на 100 илјади население. Стапките на преваленца во Русија и Московскиот регион одговараат на просечните европски податоци, но се значително пониски отколку во скандинавските земји, Америка, Израел и Англија. За УЗ, преваленцата е 19,3 на 100 илјади, инциденцата е 1,2 на 100 илјади луѓе годишно. За ЦД, преваленцата е 3,0 на 100 илјади, инциденцата е 0,2 на 100 илјади луѓе годишно. Фактот дека најголемата фреквенција е забележана во високо развиените земји се должи не само на социјалните и економските фактори, туку и на генетските и имунолошките карактеристики на пациентите, кои ја одредуваат предиспозицијата за ИТД. Овие фактори се фундаментални во имунопатогенетската теорија за потеклото на ИТД. Вирусните и/или бактериските теории го објаснуваат само акутниот почеток на болеста, а хроничноста на процесот се должи и на генетската предиспозиција и на карактеристиките на имунолошкиот одговор, кои исто така се генетски детерминирани. Треба да се напомене дека ИТД во моментов е класифицирана како болест со генетски хетерогена комплексна предиспозиција. Идентификувани се повеќе од 15 наводни кандидатски гени од 2 групи (имуно-специфични и имунорегулаторни), кои предизвикуваат наследна предиспозиција. Предиспозицијата најверојатно е одредена од неколку гени кои ја одредуваат природата на имунолошките и воспалителните реакции. Врз основа на резултатите од бројни студии, можеме да заклучиме дека најверојатната локализација на гените поврзани со развојот на ИТД се хромозомите 3, 7, 12 и 16. Во моментов, многу внимание се посветува на проучување на карактеристиките на функцијата на Т и Б-лимфоцитите, како и на цитокините и воспалителните медијатори. Улогата на интерлеукини (IL), интерферони (IFN), тумор некроза фактор-а (TNF-a), макрофаги и автоантитела кон протеините на слузницата на дебелото црево и автомикрофлората активно се проучува. Карактеристиките на нивните нарушувања во ЦД и УК се идентификувани, но останува нејасно дали овие промени се јавуваат примарно или секундарни. За да се разберат многу аспекти на патогенезата, би биле многу важни студиите извршени во претклиничката фаза на ИТД, како и кај роднините од прв степен. Меѓу воспалителните медијатори, посебна улога имаат цитокините, кои се група полипептидни молекули со маса од 5 до 50 kDa, вклучени во формирањето и регулирањето на одбранбените реакции на телото. На ниво на телото, цитокините комуницираат помеѓу имунолошкиот, нервниот, ендокриниот, хематопоетскиот и другите системи и служат за нивно вклучување во организацијата и регулирањето на заштитните реакции. Класификацијата на цитокините е прикажана во Табела 2. Повеќето цитокини не се синтетизираат од клетки надвор од воспалителната реакција и имунолошкиот одговор. Изразувањето на цитокинските гени започнува како одговор на пенетрација на патогени во телото, антигенска иритација или оштетување на ткивото. Еден од најмоќните поттикнувачи на синтезата на цитокините се компонентите на клеточните ѕидови на бактериите: LPS, пептидогликани и мурамил дипептиди. Производителите на проинфламаторни цитокини се главно моноцити, макрофаги, Т-клетки итн. Во зависност од ефектот врз воспалителниот процес, цитокините се поделени во две групи: проинфламаторни (IL-1, IL-6, IL-8, TNF -a, IFN-g) и антиинфламаторно (IL-4, IL-10, TGF-b). Интерлеукин-1 (IL-1) е имунорегулаторен медијатор кој се ослободува за време на воспалителни реакции, оштетување на ткивото и инфекции (проинфламаторен цитокин). IL-1 игра важна улога во активирањето на Т-клетките кога тие се во интеракција со антигенот. Постојат 2 познати типа на IL-1: IL-1a и IL-1b, производи на два различни гени локуси лоцирани на човечкиот хромозом 2. IL-1a останува внатре во клетката или може да биде во мембранска форма, појавувајќи се во мали количини во екстрацелуларниот простор. Улогата на мембранската форма на IL-1a е пренос на активирачки сигнали од макрофагот до Т-лимфоцитите и другите клетки за време на меѓуклеточниот контакт. IL-1a е главниот посредник со краток дострел. IL-1b, за разлика од IL-1a, активно се секретира од клетките, дејствувајќи и системски и локално. Денес е познато дека IL-1 е еден од главните медијатори на воспалителни реакции, ја стимулира пролиферацијата на Т-клетките, ја зголемува експресијата на рецепторот IL-2 на Т-клетките и нивното производство на IL-2. IL-2, заедно со антигенот, индуцира активирање и адхезија на неутрофилите, го стимулира формирањето на други цитокини (IL-2, IL-3, IL-6, итн.) од активираните Т-клетки и фибробласти, ја стимулира пролиферацијата на фибробластите и ендотелијалните клетки. Системски, IL-1 делува синергистички со TNF-a и IL-6. Кога концентрацијата во крвта се зголемува, IL-1 влијае на клетките на хипоталамусот и предизвикува зголемување на телесната температура, треска, поспаност, намален апетит, а исто така ги стимулира клетките на црниот дроб да произведуваат протеини од акутна фаза (CRP, амилоид А, а- 2 макроглобулин и фибриноген). IL4 (хромозом 5). Го инхибира активирањето на макрофагите и блокира многу ефекти стимулирани од IFNg, како што е производството на IL1, азотен оксид и простагландини, игра важна улога во антиинфламаторните реакции и има имуносупресивно дејство. IL6 (хромозом 7), еден од главните проинфламаторни цитокини, е главниот индуктор на последната фаза на диференцијација на Б-клетките и макрофагите, моќен стимулатор на производството на протеини од акутна фаза од клетките на црниот дроб. Една од главните функции на IL6 е стимулирање на производството на антитела in vivo и in vitro. IL8 (хромозом 4). Се однесува на хемокински медијатори кои предизвикуваат насочена миграција (хемотаксија) на леукоцитите до местото на воспаление. Главната функција на IL10 е да го потисне производството на цитокини од Т помошник тип 1 (TNFb, IFNg) и активираните макрофаги (TNF-a, IL1, IL12). Сега е признаено дека типовите на имунолошки одговор се поврзани со една од варијантите на активирање на лимфоцитите со доминантно учество на клонови на помошни Т-лимфоцити од првиот тип (TH2) или вториот тип (TH3). Производите TH2 и TH3 негативно влијаат на активирањето на спротивните клонови. Прекумерното активирање на еден од типовите Th клонови може да го насочи имунолошкиот одговор по една од опциите за развој. Хроничната нерамнотежа на активирањето на клонот Th доведува до развој на имунопатолошки состојби. Промените во цитокините во ИТД може да се проучуваат на различни начини со одредување на нивните нивоа во крвта или на самото место. Нивоата на IL1 се зголемуваат кај сите воспалителни болести на цревата. Разликите помеѓу UC и CD вклучуваат зголемена експресија на IL2. Ако во УЗ се открие намалено или нормално ниво на IL2, тогаш во ЦД се детектира неговото зголемено ниво. Содржината на IL4 се зголемува кај UC, додека кај ЦД останува нормална или дури и се намалува. Нивото на IL6, кое посредува во реакциите на акутната фаза, исто така е зголемено кај сите форми на воспаление. Добиените податоци за профилот на цитокините сугерираат дека двете главни форми на хронична ИТД се карактеризираат со различно активирање и изразување на цитокините. Резултатите од студиите укажуваат дека профилот на цитокин забележан кај пациенти со UC е поконзистентен со профилот на TH3, додека за пациентите со CD профилот на TH2 треба да се смета за покарактеристичен. Атрактивноста на оваа хипотеза за улогата на TH2 и TH3 профилите е и тоа што употребата на цитокини може да го промени имунолошкиот одговор во една или друга насока и да доведе до ремисија со обновување на рамнотежата на цитокините. Ова може да се потврди, особено, со употреба на IL10. Понатамошните студии треба да покажат дали одговорот на цитокините е секундарен феномен како одговор на иритација или, обратно, изразувањето на соодветните цитокини ја одредува реактивноста на телото со развојот на последователните клинички манифестации. Нивото на цитокини кај ИТД кај децата сè уште не е проучено. Ова дело е првиот дел од научната студија посветена на проучувањето на статусот на цитокините кај ИТД кај децата. Целта на оваа работа беше да се проучува хуморалната активност на макрофагите со определување на нивоата (IL1a, IL8) во крвта на децата со UC и CD, како и нивната динамика за време на терапијата. Од 2000 до 2002 година, 34 деца со УЗ и 19 деца со ЦД на возраст од 4 до 16 години биле прегледани во одделот за гастроентерологија на Руската детска клиничка болница. Дијагнозата беше потврдена анамнестички, ендоскопски и морфолошки. Студијата за нивоата на проинфламаторните цитокини IL1a, IL8 беше спроведена со користење на ензимски имуносорбентна анализа (ELISA). За да се одреди концентрацијата на IL1a, IL8, користени се тест системи произведени од Cytokin LLC (Санкт Петербург, Русија). Анализата беше спроведена во лабораторијата за имунофармакологија на Државниот научен центар Истражувачкиот институт за високо чисти биолошки препарати (раководител на лабораторијата, доктор на медицински науки, проф. А.С. Симбирцев). Резултатите добиени во текот на студијата открија значително зголемување на нивоата на IL1a, IL8 за време на периодот на егзацербација, поизразено кај децата со UC отколку кај децата со ЦД. Надвор од егзацербација, нивоата на про-воспалителни цитокини се намалуваат, но не достигнуваат нормални нивоа. Во УЗ, нивоата на IL-1a, IL-8 беа зголемени за време на периодот на егзацербација кај 76,2% и 90% од децата, а за време на периодот на ремисија - кај 69,2% и 92,3%, соодветно. Кај ЦД, нивоата на IL-1a, IL-8 се зголемени за време на периодот на егзацербација кај 73,3% и 86,6% од децата, а за време на периодот на ремисија - кај 50% и 75%, соодветно.

Во зависност од тежината на болеста, децата примале терапија со аминосалицилати или глукокортикоиди. Природата на терапијата значително влијаеше на динамиката на нивоата на цитокините. За време на терапијата со аминосалицилати, нивоата на проинфламаторни цитокини во групата деца со UC и CD беа значително повисоки од оние во контролната група. Згора на тоа, повисоки стапки беа забележани кај групата деца со UC. Во УЗ за време на терапија со аминосалицилати, IL1a, IL8 се зголемени кај 82,4% и 100% од децата, соодветно, додека за време на терапија со глукокортикоиди кај 60% од децата за двата цитокина. Кај ЦД, IL1a, IL8 се зголемени за време на терапијата со аминосалицилати кај сите деца, а за време на терапијата со глукокортикоиди кај 55,5% и 77,7% од децата, соодветно. Така, резултатите од оваа студија укажуваат на значајна вклученост на макрофагите компонента на имунолошкиот систем во патогенетскиот процес кај поголемиот дел од децата со UC и CD. Податоците добиени во оваа студија не се фундаментално различни од податоците добиени при испитувањето на возрасни пациенти. Разликите во нивоата на IL1a и IL8 кај пациенти со UC и CD се квантитативни, но не и квалитативни, што укажува на неспецифичната природа на овие промени, поради текот на хроничен воспалителен процес. Затоа, овие индикатори немаат дијагностичка вредност. Резултатите од една динамична студија за нивоата на IL1a и IL8 ја потврдуваат поголемата ефикасност на терапијата со глукокортикоидни лекови во споредба со терапијата со аминосалицили. Презентираните податоци се резултат на првата фаза од проучувањето на цитокинскиот статус на децата со ИТД. Потребно е дополнително проучување на проблемот земајќи ги предвид индикаторите на други проинфламаторни и антиинфламаторни цитокини.

Улогата на азотен оксид и цитокини во развојот на синдромот на акутна повреда на белите дробови.

Т.А. Шуматова, В.Б. Синдром на акутна повреда на белите дробови (синдром на респираторен дистрес кај возрасни, ARDS) е една од најтешките форми на акутна респираторна инсуфициенција, која се јавува кај пациенти поради тешка траума, сепса, перитонитис, панкреатитис, голема загуба на крв, аспирација, по обемни хируршки интервенции и кај 50-60% од случаите доведуваат до смрт. Податоците од студиите за патогенезата на АРДС, развојот на критериуми за рана дијагноза и прогноза на синдромот се малку и доста контрадикторни, што не дозволува развој на кохерентен дијагностички и третмански концепт. Утврдено е дека ARDS се заснова на оштетување на ендотелот на пулмоналните капилари и епителот на алвеолите, нарушување на реолошките својства на крвта, што доведува до отекување на интерстицијалното и алвеоларното ткиво, воспаление, ателектаза и пулмонална хипертензија. Во литературата од последниве години, се појавија доволно информации за универзалниот регулатор на клеточниот и ткивниот метаболизам - азотен оксид. Интересот за азотен оксид (NO) првенствено се должи на фактот дека тој е вклучен во регулирањето на многу функции, вклучувајќи го васкуларниот тонус, срцевата контрактилност, агрегација на тромбоцити, невротрансмисија, синтезата на АТП и протеините и имунолошката одбрана. Покрај тоа, во зависност од изборот на молекуларната цел и карактеристиките на интеракцијата со неа, NO има и штетно дејство. Се верува дека предизвикувачот за активирање на клетките е неурамнотежена цитокинемија. Цитокините се растворливи пептиди кои функционираат како медијатори на имунолошкиот систем и обезбедуваат клеточна соработка, позитивна и негативна имунорегулација. Се обидовме да ги систематизираме информациите достапни во литературата за улогата на NO и цитокините во развојот на синдромот на акутна повреда на белите дробови. NO е гас растворлив во вода и масти. Неговата молекула е нестабилен слободен радикал, лесно се дифузира во ткивото, се апсорбира и се уништува толку брзо што може да влијае само на клетките од непосредната околина. Молекулата на NO ги има сите својства својствени за класичните гласници: брзо се произведува, делува во многу ниски концентрации и по престанокот на надворешниот сигнал, брзо се претвора во други соединенија, оксидирајќи до стабилни неоргански азотни оксиди: нитрит и нитрат. Животниот век на NO во ткивото е, според различни извори, од 5 до 30 секунди. Главните молекуларни цели на NO се ензими и протеини што содржат железо: растворлива гванилат циклаза, нитрооксид синтаза (NOS), хемоглобин, митохондријални ензими, ензими од циклусот Кребс, синтеза на протеини и ДНК. Синтезата на NO во телото се јавува преку ензимски трансформации на делот што содржи азот од аминокиселината L-аргинин под влијание на специфичниот ензим NOS и е посредувана од интеракцијата на јоните на калциум со калмодулин. Ензимот се инактивира при ниски концентрации и е максимално активен на 1 μM слободен калциум. Идентификувани се две изоформи на NOS: конститутивна (cNOS) и индуцирана (iNOS), кои се производи од различни гени. Калциум-калмодулин-зависен cNOS е постојано присутен во клетката и промовира ослободување на мали количини на NO како одговор на рецепторот и физичката стимулација. NO произведен од оваа изоформа делува како транспортер во голем број физиолошки реакции. iNOS независен од калциум-калмодулин се произведува во различни типови на клетки како одговор на проинфламаторни цитокини, ендотоксини и оксиданти. Оваа NOS изоформа е транскрибирана од специфични гени на хромозомот 17 и промовира синтеза на големи количини на NO. Ензимот исто така е класифициран во три вида: NOS-I (невронски), NOS-II (макрофаг), NOS-III (ендотелијален). Фамилијата на ензими кои синтетизираат NO се наоѓа во различни белодробни клетки: во бронхијалните епителни клетки, во алвеолоцитите, во алвеоларните макрофаги, во мастоцитите, во ендотелните клетки на бронхијалните артерии и вени, во мазните миоцити на бронхијалните цевки и крвните садови , кај не-адренергични не-холинергични неврони. Конститутивната способност на епителните клетки на бронхиите и алвеолите на луѓето и цицачите да лачат NO е потврдена во бројни студии. Утврдено е дека горните делови на човечкиот респираторен тракт, како и долните делови, се вклучени во формирањето на NO. Студиите спроведени кај пациенти со трахеостомија покажаа дека количината на гас во воздухот што се издишува преку трахеостомија е значително помала во споредба со носната и усната шуплина. Синтезата на ендогени NO кај пациенти на механичка вентилација е значително засегната. Истражувањата потврдуваат дека ослободувањето на NO се јавува при бронходилатација и е контролирано од вагусниот нервен систем. Добиени се податоци дека формирањето на NO во епителот на човечкиот респираторен тракт се зголемува кај воспалителни болести на респираторниот систем. Синтезата на гас е зголемена поради активирањето на индуцираните NOS под влијание на цитокините, како и ендотоксините и липополисахаридите.

Во моментов се познати повеќе од сто цитокини, кои традиционално се поделени во неколку групи.

1. Интерлеукини (IL-1 - IL18) се секреторни регулаторни протеини кои обезбедуваат медијаторни интеракции во имунолошкиот систем и негова комуникација со другите телесни системи.

2. Интерфероните (IFN-алфа, бета, гама) се антивирусни цитокини со изразено имунорегулаторно дејство.

3. Фактори на туморска некроза (TNF алфа, бета) - цитокини со цитотоксични и регулаторни ефекти.

4. Колони-стимулирачки фактори (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - стимулатори на раст и диференцијација на хематопоетските клетки кои ја регулираат хематопоезата.

5. Хемокини (IL-8, IL-16) - хемоаттрактанти за леукоцити.

6. Фактори на раст - регулатори на растот, диференцијацијата и функционалната активност на клетките од различно ткивно потекло (фактор на раст на фибробластите, фактор на раст на ендотелијалните клетки, фактор на раст на епидермисот) и трансформирачки фактори на раст (TGF бета).

Овие биорегулаторни молекули го одредуваат видот и времетраењето на воспалителниот и имунолошкиот одговор, ја контролираат клеточната пролиферација, хематопоезата, ангиогенезата, заздравувањето на раните и многу други процеси. Сите истражувачи нагласуваат дека на цитокините им недостасува специфичност за антигени. Експериментите со култивирани пулмонални макрофаги и мастоцити покажаа формирање на iNOS како одговор на интерферон гама, интерлеукин-1, фактор на туморска некроза и липополисахариди. Експресијата на iNOS и cNOS на проинфламаторните цитокини е откриена кај животински и човечки алвеолоцити. Додавањето на епидермален фактор на раст, регулатор на функцијата на епителните клетки, во културата ја намали активноста само на индуцираниот ензим. Познато е дека, во зависност од нивната природа, цитокините делуваат автокрино - на самите клетки кои произведуваат, паракрино - на други целни клетки или ендокрино - на различни клетки надвор од местото на нивното производство. Покрај тоа, тие можат да комуницираат едни со други според агонистички или антагонистички принцип, менувајќи ја функционалната состојба на целните клетки и формирајќи цитокинска мрежа. Така, цитокините не се изолирани пептиди, туку интегрален систем, чии главни компоненти се клетките-производители, самиот протеин - цитокинот, рецепторот што го перцепира и целната клетка. Утврдено е дека со развојот на акутна повреда на белите дробови се зголемува нивото на проинфламаторни цитокини: IL-1, 6, 8, 12, TNF алфа, IFN алфа. Нивниот ефект е поврзан со проширување на крвните садови, зголемување на нивната пропустливост и акумулација на течност во ткивото на белите дробови. Дополнително, студиите ја покажаа способноста на IFN гама и TNF алфа да индуцираат изразување на адхезивните молекули - ICAM-1 на човечки ендотелијални клетки. Молекулите на адхезија, прилепувајќи се до леукоцитите, тромбоцитите и ендотелните клетки, формираат „тркалачки“ неутрофили и промовираат агрегација на фибринските честички. Овие процеси придонесуваат за нарушување на капиларниот проток на крв, ја зголемуваат капиларната пропустливост и предизвикуваат локален едем на ткивото. Забавувањето на капиларниот проток на крв е олеснето со активирање на NO, што предизвикува дилатација на артериолите. Понатамошната миграција на леукоцитите до местото на воспалението е контролирана од специјални цитокини - хемокини, кои се произведуваат и секретираат не само од активираните макрофаги, туку и од ендотелните клетки, фибробластите и мазните миоцити. Нивната главна функција е да снабдуваат неутрофили на местото на воспалението и да ја активираат нивната функционална активност. Главниот хемокин за неутрофили е Ил-8. Неговите најмоќни поттикнувачи се бактериските липополисахариди, IL-1 и TNFalpha. R. Bahra et al. веруваат дека секој чекор на трансендотелната миграција на неутрофилите е регулиран со стимулирање на концентрациите на TNF алфа. Со развојот на акутна повреда на белите дробови, васкуларните ендотелијални клетки, бронхијалните епителни клетки и алвеоларните макрофаги се активираат и се вклучени во фазните интеракции. Како резултат на тоа, од една страна, се јавува нивна мобилизација и зајакнување на заштитните својства, а од друга страна, можно е оштетување на самите клетки и околните ткива. Голем број на студии покажаа дека производот на делумно намалување на кислородот, супероксид, кој го инактивира вазоактивниот ефект на NO, може да се акумулира на местото на воспалението. NO и супероксидниот анјон реагираат брзо за да формираат пероксинитрит, кој ги оштетува клетките. Оваа реакција го промовира отстранувањето на NO од васкуларните и бронхијалните ѕидови, како и од површината на алвеолоцитите. Од интерес се студиите кои покажуваат дека традиционално се смета за медијатор на токсичноста на NO, пероксинитритот може да има физиолошки ефект и да предизвика васкуларна релаксација преку зголемување на cGMP посредувано од NO во васкуларниот ендотел. За возврат, пероксинитритот е моќен оксиданс кој може да го оштети алвеоларниот епител и пулмоналниот сурфактант. Предизвикува уништување на мембранските протеини и липиди, го оштетува ендотелот, ја зголемува тромбоцитната агрегација и учествува во процесите на ендотоксемија. Неговото зголемено формирање е забележано кај синдромот на акутна повреда на белите дробови. Истражувачите веруваат дека NO, произведен како резултат на активирање на индуцираниот ензим, е наменет за неспецифична заштита на телото од широк спектар на патогени агенси, ја инхибира тромбоцитната агрегација и ја подобрува локалната циркулација на крвта. Утврдено е дека вишокот на NO ја потиснува активноста на cNOS во клетките поради интеракција со супероксид и, можеби, како резултат на десензибилизација на гванилат циклазата, што доведува до намалување на cGMP во клетката и зголемување на интрацелуларниот калциум. Брет и сор. и Kooy et al., анализирајќи го значењето на нитрооксидергичните механизми во патогенезата на ARDS, изразија мислење дека iNOS, пероксинитритот, како и нитротирозин, главниот производ на ефектот на пероксинитритот врз протеините, можат да играат клучна улога во развојот на синдромот. Катбертсон и сор. Се верува дека основата на акутната повреда на белите дробови е ефектот на NO и пероксинитрит врз еластазата и интерлеукин-8. Кобајаши и сор. Исто така, забележано е зголемување на содржината на iNOS, интерлеукин-1, интерлеукин-6, интерлеукин-8 во бронхоалвеоларната течност кај пациенти со синдром на акутна повреда на белите дробови. Мелдрум и сор. покажа намалување на производството на инфламаторни цитокини од страна на пулмоналните макрофаги кај ARDS под влијание на подлогата на локално производство на NO - L-аргинин. Утврдено е дека во генезата на синдромот на акутна повреда на белите дробови, значајна улога игра нарушената васкуларна пропустливост предизвикана од дејството на цитокините - TNF алфа, IL-2, GM-CSF, моноклонални антитела на CD3 лимфоцитите на пулмоналната васкуларна ендотелија клетки и имуноцити. Брзото и силно зголемување на пропустливоста на пулмоналните садови доведува до миграција на неутрофилите во ткивото на белите дробови и нивно ослободување на цитотоксични медијатори, што води во развојот на патолошка промена на белите дробови. За време на развојот на акутна повреда на белите дробови, TNF алфа ја зголемува адхезијата на неутрофилите на васкуларниот ѕид, ја подобрува нивната миграција во ткивата, промовира структурни и метаболички промени во ендотелните клетки, ја нарушува пропустливоста на клеточните мембрани, го активира формирањето на други цитокини и еикосаноиди и предизвикува апоптоза и некроза на епителните клетки на белите дробови. Добиени се податоци кои укажуваат дека апоптозата на макрофагите индуцирана од LPS е во голема мера поврзана со IFN гама и е намалена за IL-4, IL-10 и TGF бета. Сепак, Кобајаши и сор. добиени податоци кои укажуваат дека IFN гама може да биде вклучена во процесите на поправка на епителот на мукозата на респираторниот тракт. Студиите на Хагимото обезбедуваат докази дека епителните клетки на бронхиите и алвеолите, како одговор на TNF алфа или Fas лигандот, лачат IL-8, IL-12. Овој процес е поврзан со активирање на нуклеарниот фактор Carr-B од страна на лигандот Fas.

Се верува дека IL-8 е еден од најважните цитокини во патофизиологијата на акутната пулмонална повреда. Милер и сор. При проучување на бронхо-алвеоларната течност кај пациенти со АРДС во однос на позадината на сепса, беше откриено значително зголемување на нивото на IL-8, во споредба со пациентите со кардиоген пулмонален едем. Се претпоставува дека примарен извор на Ил-8 се белите дробови и овој критериум може да се користи при диференцијалната дијагноза на синдромот. Грау и сор. Се верува дека ендотелните клетки на пулмоналните капилари служат како важен извор на цитокини - IL-6, IL-8 за време на развојот на акутна повреда на белите дробови. Гудман и сор. При проучување на динамиката на нивото на цитокини во течноста за бронхо-алвеоларна лаважа кај пациенти со ARDS, значително зголемување на IL-1beta, IL-8, моноцитен хемотактички пептид-1, активатор на неутрофили на епителните клетки, макрофаг воспалителен пептид-1 алфа беше воспоставена. Во исто време, авторите веруваат дека зголемувањето на содржината на IL-1 бета може да послужи како маркер за неповолен исход на синдромот. Бауер и сор. Се покажа дека следењето на содржината на IL-8 во бронхоалвеоларната течност кај пациенти со ARDS може да се користи за следење; намалувањето на нивото на IL-8 укажува на неповолен тек на процесот. Голем број на студии, исто така, обезбедуваат докази дека нивото на производство на цитокини од страна на пулмоналниот васкуларен ендотел влијае на развојот на акутна белодробна повреда и чие следење може да се користи во клиничката пракса за рана дијагноза. Можните негативни последици од зголеменото ниво на проинфламаторни цитокини кај пациенти со АРДС се потврдени од студиите на Мартин и сор., Ворнер и сор.Алвеоларните макрофаги активирани од цитокините и бактериските ендотоксини ја зголемуваат синтезата на NO. Нивото на производство на NO од епителните клетки на бронхиите и алвеолите, неутрофилите, мастоцитите, ендотелните клетки и мазните миоцити на пулмоналните крвни садови исто така се зголемува, веројатно преку активирање на нуклеарниот фактор Carr-B. Авторите веруваат дека азотниот оксид произведен како резултат на активирањето предизвикано од NOS е наменет првенствено за неспецифична одбрана на телото. Ослободено од макрофагите, NO брзо продира во бактериите и габите, каде што инхибира три витални групи на ензими: транспорт на H-електрон, Кребсов циклус и синтеза на ДНК. НО е вклучено во одбраната на телото во последните фази од имунолошкиот одговор и фигуративно се смета како „казнениот меч“ на имунолошкиот систем. Меѓутоа, кога NO се акумулира во ќелијата во несоодветно големи количини, тоа исто така има штетно дејство. Така, со развојот на синдромот на акутна повреда на белите дробови, цитокините и NO предизвикуваат секвенцијален синџир на реакции, што резултира со нарушена микроциркулација, појава на ткивна хипоксија, алвеоларен и интерстицијален едем и оштетување на метаболичката функција на белите дробови. Затоа, може да се каже дека проучувањето на физиолошките и патофизиолошките механизми на дејство на цитокините и NO е ветувачка насока за истражување и ќе овозможи во иднина не само да се прошири разбирањето на патогенезата на ARDS, туку и да се утврди дијагностички и прогностички маркери на синдромот, за да се развијат опции за патогенетски базирана терапија насочена кон намалување на смртноста.

Методи за одредување на цитокини.

Прегледот е посветен на главните методи за проучување на цитокините кои се користат во моментов. Накратко се опишани можностите и целта на методите. Прикажани се предностите и недостатоците на различните методи на пристапи кон анализата на генската експресија на цитокините на ниво на нуклеински киселини и на ниво на производство на протеини. (Цитокини и воспаление. 2005. Т. 4, бр. 1. стр. 22-27.)

Цитокините се регулаторни протеини кои формираат универзална мрежа на медијатори, карактеристични и за имунолошкиот систем и за клетките на другите органи и ткива. Сите клеточни настани се случуваат под контрола на оваа класа на регулаторни протеини: пролиферација, диференцијација, апоптоза, специјализирана функционална активност на клетките. Ефектите на секој цитокин врз клетките се карактеризираат со плејотропија, спектарот на ефекти на различни медијатори се преклопува и, во основа, конечната функционална состојба на клетката зависи од влијанието на неколку цитокини кои делуваат синергистички. Така, цитокинскиот систем е универзална, полиморфна регулаторна мрежа на медијатори дизајнирани да ги контролираат процесите на пролиферација, диференцијација, апоптоза и функционална активност на клеточните елементи во хематопоетскиот, имунолошкиот и другите хомеостатски системи на телото. Методите за определување на цитокините претрпеа многу брза еволуција во текот на 20 години интензивно проучување и денес претставуваат цела област на научно знаење. На почетокот на нивната работа, истражувачите во цитокинологијата се соочуваат со прашањето за избор на метод. И овде истражувачот мора точно да знае кои информации треба да ги добие за да ја постигне својата цел. Во моментов, развиени се стотици различни методи за проценка на цитокинскиот систем, кои обезбедуваат различни информации за овој систем. Цитокините може да се проценат во различни биолошки средини врз основа на нивната специфична биолошка активност. Тие може да се квантифицираат со користење на низа методи на имуноанализа со користење на поли- и моноклонални антитела. Покрај проучувањето на секреторните форми на цитокините, нивната интрацелуларна содржина и производство во ткивата може да се проучуваат со помош на цитометрија на проток, Western blotting и in situ имунохистохемија. Многу важни информации може да се добијат со проучување на експресијата на цитокинската мРНК, стабилноста на мРНК, присуството на изоформите на цитокинската мРНК и природните антисмислени нуклеотидни секвенци. Студијата на алелни варијанти на гените на цитокините може да обезбеди важни информации за генетски програмираното високо или ниско производство на одреден медијатор. Секој метод има свои недостатоци и предности, своја резолуција и точност на определување. Незнаењето и неразбирањето на овие нијанси на истражувачот може да го доведат до лажни заклучоци.

Одредување на биолошката активност на цитокините.

Историјата на откривањето и првите чекори во проучувањето на цитокините беше тесно поврзана со одгледувањето на имунокомпетентни клетки и клеточни линии. Потоа беа демонстрирани регулаторните ефекти (биолошка активност) на голем број фактори на растворливи протеини врз пролиферативната активност на лимфоцитите, врз синтезата на имуноглобулините и врз развојот на имунолошките реакции во ин витро моделите. Еден од првите методи за одредување на биолошката активност на медијаторите е да се одреди миграцискиот фактор на човечките лимфоцити и факторот на неговата инхибиција. Како што се проучуваа биолошките ефекти на цитокините, се појавија различни методи за проценка на нивната биолошка активност. Така, IL-1 беше одреден со проценка на пролиферацијата на тимоцитите на глувчето ин витро, IL-2 - со способноста да се стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3 - со растот на хематопоетските колонии in vitro, IL-4 - со комитогениот ефект, со зголемување на експресијата на Ia протеините, со поттикнување на формирање на IgG1 и IgE, итн. Списокот на овие методи може да се продолжи, тој постојано се ажурира бидејќи се откриваат нови биолошки активности на растворливи фактори. Нивниот главен недостаток е нестандардноста на методите и неможноста за нивно обединување. Понатамошниот развој на методи за одредување на биолошката активност на цитокините доведе до создавање на голем број клеточни линии чувствителни на одреден цитокин, или мултичувствителни линии. Повеќето од овие клетки одговорни на цитокини сега може да се најдат во списоците на комерцијално дистрибуирани клеточни линии. На пример, за тестирање на IL-1a и b, се користи клеточната линија D10S, за IL-2 и IL-15 - клеточната линија CTLL-2, за IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL-13, GM-CSF - TF-1 клеточна линија, за IL-6 - B9 клеточна линија, за IL-7 - 2E8 клеточна линија, за TNFa и TNFb - L929 клеточна линија, за IFNg - WiDr клеточна линија, за IL-18 - клеточна линија KG-1. Сепак, таквиот пристап кон проучувањето на имуноактивни протеини, заедно со добро познатите предности, како што се мерењето на реалната биолошка активност на зрелите и активните протеини, високата репродуктивност во стандардизирани услови, има и свои недостатоци. Тие вклучуваат, пред сè, чувствителноста на клеточните линии не на еден цитокин, туку на неколку поврзани цитокини, чии биолошки ефекти се преклопуваат. Дополнително, не можеме да ја исклучиме можноста за поттикнување на производство на други цитокини од целните клетки, што може да го наруши тест параметарот (обично пролиферација, цитотоксичност, хемотакса). Сè уште не ги знаеме сите цитокини и не сите нивни ефекти, затоа не го оценуваме самиот цитокин, туку вкупната специфична биолошка активност. Така, проценката на биолошката активност како вкупна активност на различни медијатори (недоволна специфичност) е една од недостатоците на овој метод. Покрај тоа, со користење на линии чувствителни на цитокини, не е можно да се детектираат неактивирани молекули и поврзани протеини. Ова значи дека таквите методи не го одразуваат вистинското производство за одреден број цитокини. Друг важен недостаток на користење на клеточни линии е потребата од лабораторија за клеточна култура. Дополнително, сите процедури за растење на клетките и нивно инкубирање со протеините и медиумот што се испитува бараат многу време. Исто така, треба да се забележи дека клеточните линии со долготрајна употреба бараат ажурирање или повторна сертификација, бидејќи како резултат на одгледувањето тие можат да мутираат и да се модифицираат, што може да доведе до промена на нивната чувствителност на медијаторите и намалување на точноста на одредување на биолошката активност. Сепак, овој метод е идеален за тестирање на специфичната биолошка активност на рекомбинантните медијатори.

Квантитативно определување на цитокини со користење на антитела.

Цитокините произведени од имунокомпетентни и други типови на клетки се ослободуваат во меѓуклеточниот простор за да извршат паракрини и автокрини сигнални интеракции. Според концентрацијата на овие протеини во крвниот серум или во условена средина, може да се процени природата на патолошкиот процес и вишокот или недостатокот на одредени клеточни функции кај пациентот. Методите за откривање на цитокини со користење на специфични антитела се денес најчестите системи за откривање на овие протеини. Овие методи поминаа низ цела серија на модификации користејќи различни ознаки (радиоизотоп, флуоресцентен, електрохемилуминисцентен, ензимски итн.). Ако методите на радиоизотоп имаат голем број на недостатоци поврзани со употребата на радиоактивна ознака и временски ограничена можност за користење означени реагенси (полуживот), тогаш најшироко се користат ензимски имуносорбентните методи. Тие се засноваат на визуелизација на нерастворливи производи од ензимска реакција кои апсорбираат светлина со позната бранова должина во количини еквивалентни на концентрацијата на аналитот. Антителата обложени на цврста полимерна основа се користат за врзување на супстанциите што се мерат, а антителата конјугирани со ензими, обично алкална фосфатаза или пероксидаза од рен, се користат за визуелизација. Предностите на методот се очигледни: висока точност на определување во стандардизирани услови за складирање на реагенси и изведување процедури, квантитативна анализа и репродуктивност. Недостатоците вклучуваат ограничен опсег на концентрации што може да се детектираат, како резултат на што сите концентрации што надминуваат одреден праг се сметаат за еднакви на него. Треба да се напомене дека времето потребно за завршување на методот варира во зависност од препораките на производителот. Сепак, во секој случај, зборуваме за неколку часа потребни за инкубација и миење на реагенсите. Дополнително, се одредуваат латентни и врзани форми на цитокини, кои во нивната концентрација можат значително да ги надминат слободните форми, главно одговорни за биолошката активност на медијаторот. Затоа, препорачливо е да се користи овој метод заедно со методи за проценка на биолошката активност на медијаторот. Друга модификација на методот на имуноанализа, кој најде широка примена, е електрохемилуминисцентниот метод (ECL) за одредување на протеините со користење на антитела означени со рутениум и биотин. Овој метод ги има следните предности во однос на методите со радиоизотоп и имуносорбент поврзани со ензим: леснотија на имплементација, кратко време на извршување на методот, отсуство на процедури за перење, мал волумен на примерок, голем опсег на концентрации на цитокини што може да се детектираат во серумот и во условената средина, висока чувствителност на методот и неговата репродуктивност. Методот што се разгледува е прифатлив за употреба и во научни и во клинички истражувања. Следниот метод за проценка на цитокините во биолошките медиуми е развиен врз основа на технологијата на флуориметрија на проток. Тоа ви овозможува истовремено да оцените до стотици протеини во примерокот. Во моментов се создадени комерцијални комплети за определување до 17 цитокини. Сепак, предностите на овој метод ги одредуваат и неговите недостатоци. Прво, трудоинтензивно е да се изберат оптимални услови за определување на неколку протеини, и второ, производството на цитокини е каскадно по природа со производствени врвови во различни периоди. Затоа, истовремено одредување на голем број протеини не е секогаш информативно. Општо барање на методите за имуноанализа со користење на т.н. „сендвич“ е внимателен избор на пар антитела, што овозможува определување или на слободната или на врзаната форма на протеинот што се анализира, што наметнува ограничувања на овој метод и што секогаш мора да се земе предвид при толкување на добиените податоци. Овие методи го одредуваат вкупното производство на цитокини од различни клетки, додека во исто време, антиген-специфичното производство на цитокини од имунокомпетентни клетки може да се процени само привремено. Сега е развиен системот ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), кој во голема мера ги елиминира овие недостатоци. Методот овозможува полуквантитативна проценка на производството на цитокини на ниво на поединечни клетки. Високата резолуција на овој метод овозможува да се оцени производството на цитокини стимулирано од антиген, што е многу важно за проценка на специфичен имунолошки одговор. Следниот метод широко користен за научни цели е интрацелуларното определување на цитокините со цитометрија на проток. Неговите предности се очигледни. Можеме фенотипски да карактеризираме популација на клетки кои произведуваат цитокини и/или да го одредиме спектарот на цитокини произведени од поединечни клетки, со можност за релативна квантитативна карактеризација на ова производство. Сепак, опишаниот метод е доста комплициран и бара скапа опрема. Следната серија на методи, кои се користат главно за научни цели, се имунохистохемиски методи кои користат означени моноклонални антитела. Предностите се очигледни - определување на производството на цитокини директно во ткивата (in situ), каде што се јавуваат различни имунолошки реакции. Сепак, методите што се разгледуваат се многу трудоинтензивни и не даваат точни квантитативни податоци.

Определување на цитокини со ензимска имуноанализа.

ЗАО „Вектор-Бест“ под раководство на Т.Г. Рјабичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ју. Рукавишников активно работи во насока на одредување на цитокини. Цитокините се група полипептидни медијатори, често гликолизирани, со молекуларна тежина од 8 до 80 kDa. Цитокините се вклучени во формирањето и регулирањето на одбранбените реакции на телото и неговата хомеостаза. Тие се вклучени во сите аспекти на хуморалниот и клеточниот имунолошки одговор, вклучувајќи диференцијација на имунокомпетентните прогениторни клетки, презентација на антиген, клеточна активација и пролиферација, изразување на адхезивните молекули и одговор на акутна фаза. Некои од нив се способни да вршат повеќе биолошки ефекти врз различни целни клетки. Дејството на цитокините врз клетките се врши на следниве начини: автокрино - на клетката која го синтетизира и лачи овој цитокин; паракрин - на клетки лоцирани во близина на продуцентската клетка, на пример, во фокус на воспаление или во лимфоиден орган; ендокрино-далечински - на клетките на сите органи и ткива откако цитокинот ќе влезе во циркулацијата на крвта. Производството и ослободувањето на цитокините обично е краткотрајно и цврсто регулирано. Цитокините влијаат на клетката со врзување за специфични рецептори на цитоплазматската мембрана, а со тоа предизвикуваат каскада од реакции што доведуваат до индукција, подобрување или потиснување на активноста на голем број гени што тие ги регулираат. Цитокините се карактеризираат со сложена мрежна природа на функционирање, во која производството на еден од нив влијае на формирањето или манифестацијата на активноста на голем број други. Цитокините се локални медијатори, па затоа е препорачливо да се измерат нивните нивоа во релевантните ткива по екстракција на ткивни протеини од биопсија на соодветните органи или во природни течности: урина, солза течност, течност во гингивата џеб, бронхоалвеоларна лаважа, вагинална секреција, ејакулат, лаважи од шуплини, 'рбетниот мозок или синовијалната течност, течности итн. Дополнителни информации за состојбата на имунолошкиот систем на телото може да се добијат со проучување на способноста на крвните клетки да произведуваат цитокини ин витро. Нивоата на цитокините во плазмата ја одразуваат моменталната состојба на имунолошкиот систем и развојот на заштитни реакции in vivo. Спонтаното производство на цитокини со култура на мононуклеарни клетки од периферната крв овозможува да се процени состојбата на соодветните клетки. Зголеменото спонтано производство на цитокини покажува дека клетките се веќе активирани од антигенот in vivo. Индуцираното производство на цитокини овозможува да се процени потенцијалната способност на соодветните клетки да одговорат на антигенска стимулација. Намалената индукција на цитокини ин витро, на пример, може да послужи како еден од знаците на состојба на имунодефициенција. Затоа, двете опции за проучување на нивоата на цитокини и во циркулирачката крв и за време на нивното производство од клеточни култури се важни од гледна точка на карактеризирање на имунореактивноста на целиот организам и функцијата на одделни делови на имунолошкиот систем. До неодамна, само неколку групи истражувачи ги проучуваа цитокините во Русија, бидејќи методите на биолошко истражување се многу трудоинтензивни, а увезените имунохемиски комплети се многу скапи. Со доаѓањето на достапни домашни имуносорбенти поврзани со ензимски комплети, лекарите од практиката покажуваат зголемен интерес за проучување на профилот на цитокините. Во моментов, дијагностичкото значење на проценката на нивото на цитокините лежи во наведувањето на самиот факт за зголемување или намалување на нивната концентрација кај даден пациент со одредена болест. Покрај тоа, за да се процени сериозноста и да се предвиди текот на болеста, препорачливо е да се одреди концентрацијата и на антиинфламаторните и на проинфламаторните цитокини во динамиката на развојот на патологијата. На пример, содржината на цитокини во периферната крв се одредува според времето на егзацербација и ја одразува динамиката на патолошкиот процес кај пептичните улкуси и други болести на гастроинтестиналниот тракт. Во најраните фази на егзацербација, доминира зголемување на содржината на интерлеукин-1бета (IL-1beta), интерлеукин-8 (IL-8), потоа концентрацијата на интерлеукин-6 (IL-6), гама-интерферон (гама -INF), а факторот на туморска некроза го зголемува -алфа (алфа-TNF). Концентрацијата на интерлеукин-12 (IL-12), гама-INF, алфа-TNF го достигна својот максимум во екот на болеста, додека содржината на маркерите на акутната фаза во овој период се приближи до нормалните вредности. На врвот на егзацербација, нивото на алфа-TNF значително ја надмина содржината на интерлеукин-4 (IL-4) и во крвниот серум и директно во погоденото ткиво на областа на периулкус, по што почна постепено да се намалува. Како што стивнаа феномените на акутната фаза и се интензивираа процесите на поправка, концентрацијата на IL-4 се зголеми. Промените во профилот на цитокините може да се користат за да се процени ефективноста и соодветноста на хемотерапијата. При спроведување на терапија со цитокини, на пример, за време на терапија со алфа-интерферон (алфа-INF), неопходно е да се следи и нивото на неговата содржина во циркулирачката крв и производството на антитела на алфа-IFN. Познато е дека кога се произведува голема количина од овие антитела, интерферонската терапија не само што престанува да биде ефикасна, туку може да доведе и до автоимуни болести. Неодамна се развиени и ставени во пракса нови лекови кои на некој начин го менуваат цитокинскиот статус на телото. На пример, за третман на ревматоиден артритис, се предлага лек базиран на антитела на алфа-TNF, дизајниран да го отстрани алфа-TNF, кој е вклучен во уништувањето на сврзното ткиво. Сепак, и според нашите податоци и според литературата, не сите пациенти со хроничен ревматоиден артритис имаат покачени нивоа на TNF алфа, така што за оваа група на пациенти, намалувањето на нивото на TNF алфа може дополнително да ја влоши нерамнотежата на имунолошкиот систем. Така, правилната терапија со цитокини вклучува следење на цитокинскиот статус на телото за време на третманот. Заштитната улога на проинфламаторните цитокини се манифестира локално, на местото на воспалението, но нивното системско производство не доведува до развој на антиинфективен имунитет и не го спречува развојот на бактериски токсичен шок, кој е причина за рана смртност кај хируршки пациенти со гнојно-септички компликации. Основата на патогенезата на хируршките инфекции е лансирањето на цитокинската каскада, која вклучува, од една страна, проинфламаторни и, од друга, антиинфламаторни цитокини. Рамнотежата помеѓу овие две спротивни групи во голема мера ја одредува природата на текот и исходот на гнојно-септичките заболувања. Меѓутоа, одредувањето на концентрацијата во крвта на еден цитокин од овие групи (на пример, TNF алфа или IL-4) нема соодветно да ја одрази состојбата на целата цитокинска рамнотежа. Затоа, неопходна е симултана проценка на нивото на неколку медијатори (најмалку 2–3 од спротивните подгрупи). АД Вектор-Бест моментално разви и масовно произведува комплети реагенси за квантитативно определување на: фактор на некроза на тумор-алфа (чувствителност - 2 pg/ml, 0–250 pg/ml); интерферон гама (чувствителност - 5 pg/ml, 0–2000 pg/ml); интерлеукин-4 (чувствителност - 2 pg/ml, 0-400 pg/ml); интерлеукин-8 (чувствителност - 2 pg/ml, 0-250 pg/ml); антагонист на рецепторот на интерлеукин-1 (IL-1RA) (чувствителност - 20 pg/ml, 0-2500 pg/ml); алфа интерферон (чувствителност - 10 pg/ml, 0-1000 pg/ml); автоимуни антитела на интерферон алфа (чувствителност - 2 ng/ml, 0-500 ng/ml). Сите комплети се дизајнирани да ја одредат концентрацијата на овие цитокини во човечките биолошки течности и во супернатантите на културата кога се проучува способноста на културите на човечките клетки да произведуваат цитокини ин витро. Принципот на анализата е „сендвич“ верзија на солидна фаза тристепена (време на инкубација - 4 часа) или двостепена (време на инкубација - 3,5 часа) ензимска имуноанализа на таблети. Анализата бара 100 μl биолошка течност или супернатант на култура по бунар. Сметководство на резултатите - спектрофотометриски на бранова должина од 450 nm. Во сите множества хромогенот е тетраметилбензидин. Рокот на траење на нашите комплети е зголемен на 18 месеци од датумот на издавање и 1 месец по почетокот на употребата. Анализата на литературните податоци покажа дека содржината на цитокини во крвната плазма на здрави луѓе зависи и од комплетите што се користат за нивно одредување и од регионот во кој живеат овие луѓе. Затоа, за да се утврдат вредностите на нормалните концентрации на цитокини кај жителите на нашиот регион, беше извршена анализа на случајни примероци од плазма (од 80 до 400 примероци) на практично здрави крводарители, претставници на различни општествени групи на возраст од 18 до 60 години. години без клинички манифестации на груба соматска патологија и отсуство на HBsAg, антитела на ХИВ, вирусите на хепатитис Б и Ц.

Фактор на туморска некроза-алфа.

TNF алфа е плеиотропен проинфламаторен цитокин кој се состои од два издолжени b-синџири со молекуларна тежина од 17 kDa и врши регулаторни и ефекторни функции во имунолошкиот одговор и воспалението. Главните произведувачи на алфа-TNF се моноцитите и макрофагите. Овој цитокин исто така се лачи од крвни лимфоцити и гранулоцити, природни клетки убијци и клеточни линии на Т-лимфоцитите. Главните поттикнувачи на TNF алфа се вирусите, микроорганизмите и нивните метаболички производи, вклучително и бактерискиот липополисахарид. Дополнително, некои цитокини, како што се IL-1, IL-2, факторот за стимулирање на колонијата на гранулоцити-макрофаги, алфа- и бета-INF, исто така можат да играат улога на индуктори. Главните насоки на биолошката активност на алфа-TNF: покажува селективна цитотоксичност против одредени туморски клетки; ги активира гранулоцитите, макрофагите, ендотелните клетки, хепатоцитите (производство на протеини од акутна фаза), остеокластите и хондроцитите (ресорпција на коскеното и рскавичното ткиво), синтезата на други проинфламаторни цитокини; стимулира пролиферација и диференцијација на: неутрофили, фибробласти, ендотелијални клетки (ангиогенеза), хематопоетски клетки, Т- и Б-лимфоцити; го зголемува протокот на неутрофили од коскената срцевина во крвта; има антитуморна и антивирусна активност in vivo и in vitro; учествува не само во заштитни реакции, туку и во процесите на уништување и поправка што го придружуваат воспалението; служи како еден од посредниците за уништување на ткивото, вообичаено за време на долгорочно, хронично воспаление.

Ориз. 1. Распределба на нивоата на алфа-TNF

во плазмата на здрави донатори.

Зголемено ниво на алфа-TNF е забележано во крвниот серум за време на посттрауматска состојба, со пулмонална дисфункција, нарушувања во нормалниот тек на бременоста, рак и бронхијална астма. Нивото на алфа-TNF 5-10 пати повисоко од нормалното е забележано за време на егзацербација на хроничната форма на вирусен хепатитис Ц. За време на периодот на егзацербација на болести на гастроинтестиналниот тракт, концентрацијата на алфа-TNF во серумот ја надминува нормата во просек 10 пати, а кај некои пациенти - 75-75 80 пати. Високи концентрации на TNF алфа се наоѓаат во цереброспиналната течност кај пациенти со мултиплекс склероза и цереброспинален менингитис и во синовијалната течност кај пациенти со ревматоиден артритис. Ова укажува на вклученост на TNF алфа во патогенезата на голем број автоимуни болести. Фреквенцијата на откривање на алфа-TNF во крвниот серум дури и со тешко воспаление не надминува 50%, со индуцирано и спонтано производство - до 100%. Опсегот на концентрации на TNF алфа беше 0-6 pg/ml, со средна вредност од 1,5 pg/ml (сл. 1).

Интерферон гама.

Ориз. 2. Дистрибуција на гама-ИНФ ниво

во плазмата на здрави донатори.

Интерлеукин-4

IL-4 е гликопротеин со молекуларна тежина од 18-20 kDa, природен инхибитор на воспаление. Заедно со гама INF, IL-4 е клучен цитокин произведен од Т-клетките (главно TH-2 лимфоцити). Поддржува рамнотежа TH-1/TH-2. Главните насоки на биолошката активност на IL-4: ја подобрува еозинофилијата, акумулацијата на мастоцитите, секрецијата на IgG4, хуморалниот имунолошки одговор посредуван од TH-2 клетките; има локална антитуморна активност, стимулирајќи ја популацијата на цитотоксични Т-лимфоцити и туморска инфилтрација од еозинофилите; го потиснува ослободувањето на воспалителни цитокини (алфа-TNF, IL-1, IL-8) и простагландини од активираните моноцити, производството на цитокини од TH-1 лимфоцитите (IL-2, гама-INF, итн.).

Ориз. 3. Распределба на нивоата на IL-4 во плазмата

здрави донатори.

Зголемено ниво на IL-4 и во серумот и во стимулираните лимфоцити може да се забележи кај алергиски заболувања (особено во моментот на егзацербација), како што се бронхијална астма, алергиски ринитис, поленска треска, атопичен дерматитис и болести на гастроинтестиналниот тракт. Нивото на IL-4, исто така, значително се зголемува кај пациенти со хроничен хепатитис Ц (CHC). За време на периоди на егзацербација на CHC, неговата количина се зголемува речиси 3 пати во споредба со нормата, а за време на ремисија на CHC, нивото на IL-4 се намалува, особено за време на третман со рекомбинантен IL-2. Опсегот на концентрации на IL-4 беше 0-162 pg/ml, просечната вредност беше 6,9 pg/ml, а нормалниот опсег беше 0-20 pg/ml (сл. 3).

Интерлеукин-8

IL-8 е хемокин и е протеин со молекуларна тежина од 8 kDa. IL-8 се произведува од мононуклеарни фагоцити, полиморфонуклеарни леукоцити, ендотелни клетки и други типови на клетки како одговор на различни стимули, вклучувајќи бактерии и вируси и нивните метаболички производи, вклучително и проинфламаторни цитокини (на пример, IL-1, TNF-алфа). Главната улога на интерлеукин-8 е да ја подобри хемотаксата на леукоцитите. Тој игра важна улога и кај акутно и кај хронично воспаление. Зголемено ниво на IL-8 е забележано кај пациенти со бактериски инфекции, хронични белодробни заболувања и болести на гастроинтестиналниот тракт. Нивоата на IL-8 во плазмата се зголемени кај пациенти со сепса, а високите концентрации се во корелација со зголемена смртност. Резултатите од мерењето на содржината на IL-8 може да се користат за следење на напредокот на третманот и предвидување на исходот на болеста. Така, зголемена содржина на IL-8 беше откриена во солза течност кај сите пациенти со поволен тек на чир на рожницата. Кај сите пациенти со комплициран тек на улкус на рожницата, концентрацијата на IL-8 беше 8 пати поголема отколку кај пациенти со поволен тек на болеста. Така, содржината на проинфламаторни цитокини (особено IL-8) во солза течност на чир на рожницата може да се користи како прогностички критериум за текот на оваа болест.

Ориз. 4. Дистрибуција на нивоата на IL-8 во

плазма од здрави донатори (Новосибирск).

Според нашите и литературни податоци, IL-8 е откриен исклучително ретко во крвниот серум на здрави луѓе; Спонтаното производство на IL-8 од крвните мононуклеарни клетки е забележано кај 62%, а индуцираното производство кај 100% од здравите дарители. Опсегот на концентрации на IL-8 беше 0-34 pg/ml, просекот беше 2 pg/ml, а нормалниот опсег беше 0-10 pg/ml (сл. 4).

Ориз. 5. Распределба на нивото на IL-8 во плазмата

здрави донатори (Рубцовск).

Антагонист на рецепторот на интерлеукин-1.

IL-1RA е цитокин и е олигопептид со молекуларна тежина од 18-22 kDa. IL-1RA е ендоген инхибитор на IL-1, произведен од макрофаги, моноцити, неутрофили, фибробласти и епителни клетки. IL-1RA ја потиснува биолошката активност на интерлеукините IL-1alpha и IL-1beta, натпреварувајќи се со нив за врзување со клеточниот рецептор.

Ориз. 6. Дистрибуција на ниво на IL-1RA

во плазмата на здрави донатори

Производството на IL-1RA е стимулирано од многу цитокини, вирусни производи и протеини од акутна фаза. IL-1RA може активно да се изрази во воспалителни фокуси кај многу хронични заболувања: ревматоиден и јувенилен хроничен артритис, системски лупус еритематозус, исхемични лезии на мозокот, воспалителни болести на цревата, бронхијална астма, пиелонефритис, псоријаза и други. Кај сепсата, забележано е најголемо зголемување на IL-1RA - до 55 ng/ml во некои случаи, и беше откриено дека зголемените концентрации на IL-1RA корелираат со поволна прогноза. Високи нивоа на IL-1RA се забележани кај многу дебели жени, а ова ниво значително се намалува во рок од 6 месеци по липосукцијата. Опсегот на концентрации на IL-1RA беше 0-3070 pg/ml, просечната беше 316 pg/ml. Нормалниот опсег е 50-1000 pg/ml (сл. 6).

Алфа интерферон.

Алфа-ИНФ е мономерен негликолизиран протеин со молекуларна тежина од 18 kDa, кој се синтетизира првенствено од леукоцити (Б-лимфоцити, моноцити). Овој цитокин, исто така, може да биде произведен од речиси секој тип на клетка како одговор на соодветна стимулација; интрацелуларните вирусни инфекции можат да бидат моќни стимулатори на синтезата на алфа-ИНФ. Индукторите на алфа-ИНФ вклучуваат: вируси и нивни производи, меѓу кои водечкото место го зазема двојно-верижна РНК произведена за време на вирусна репликација, како и бактерии, микоплазми и протозои, цитокини и фактори на раст (како што се IL-1, IL -2, алфа -TNF, фактори кои стимулираат колонии, итн.). Првичната заштитна реакција на неспецифичниот антибактериски имунолошки одговор на телото вклучува индукција на алфа и бета ИНФ. Во овој случај, тој се произведува од клетки кои претставуваат антиген (макрофаги) кои ги заробиле бактериите. Интерфероните (вклучувајќи алфа-INF) играат важна улога во неспецифичниот дел од антивирусниот имунолошки одговор. Тие ја подобруваат антивирусна отпорност со поттикнување во клетките на синтеза на ензими кои го потиснуваат формирањето на нуклеински киселини и вирусни протеини. Покрај тоа, тие имаат имуномодулаторно дејство и го подобруваат изразувањето на главните антигени на комплексот за хистокомпатибилност во клетките. Промени во содржината на алфа-ИНФ беа откриени кај хепатитис и цироза на црниот дроб со вирусна етиологија. Во моментот на егзацербација на вирусните инфекции, концентрацијата на овој цитокин значително се зголемува кај повеќето пациенти, а за време на периодот на закрепнување паѓа на нормално ниво. Покажана е врска помеѓу серумското ниво на алфа-ИНФ и сериозноста и времетраењето на инфекцијата со грип.

Ориз. 7. Дистрибуција на ниво на алфа-INF

во плазмата на здрави донатори.

Зголемување на концентрацијата на алфа-ИНФ е забележано во серумот на повеќето пациенти кои страдаат од автоимуни заболувања, како што се полиартритис, ревматоиден артритис, спондилоза, псоријатичен артритис, полимијалгија ревматска и склеродерма, системски лупус еритематозус и системски васкулитис. Високо ниво на овој интерферон е забележано и кај поединечни пациенти за време на егзацербација на пептичен улкус и холелитијаза. Опсегот на концентрации на алфа-INF беше 0-93 pg/ml, просечната беше 20 pg/ml. Нормалниот опсег е до 45 pg/ml (сл. 7).

Антитела на алфа INF.

Антителата на алфа-IFN може да се детектираат во серумот на пациенти со соматски еритематозен лупус. Спонтана индукција на антитела кон алфа-ИНФ е забележана и во серумот на пациенти со различни форми на рак. Во некои случаи, антитела на алфа-ИНФ беа пронајдени во серумот на пациенти инфицирани со ХИВ, како и во цереброспиналната течност и серумите на пациенти со менингитис за време на акутната фаза и во серумот на пациенти со хроничен полиартритис.

Ориз. 8. Распределба на нивото на антитела на алфа-ИНФ

во плазмата на здрави донатори.

Алфа-ИНФ е еден од ефикасните антивирусни и антитуморни терапевтски лекови, но неговата долготрајна употреба може да доведе до производство на специфични антитела за алфа-ИНФ. Ова ја намалува ефикасноста на третманот, а во некои случаи предизвикува различни несакани ефекти: од слични на грип до развој на автоимуни болести. Со оглед на ова, за време на терапијата со ИНФ, важно е да се следи нивото на антитела кон алфа ИНФ во телото на пациентот. Нивното формирање зависи од видот на лекот што се користи во терапијата, времетраењето на третманот и видот на болеста. Опсегот на концентрации на анти-IFN антитела беше 0-126 ng/ml, со средна вредност од 6,2 ng/ml. Нормалниот опсег е до 15 ng/ml (сл. 8). Проценката на нивото на цитокини со користење на комплети за реагенси комерцијално произведени од Vector-Best CJSC овозможува нов пристап за проучување на состојбата на имунолошкиот систем на телото во клиничката пракса.

Имунотропни лекови базирани на цитокини.

Интересна работа А. С. Симбирцева, Државен истражувачки институт за високо чисти биолошки препарати на Министерството за здравство на Русија, Санкт Петербург). а поврзани првенствено со одржување на хомеостазата за време на воведувањето на патогени и нарушување на интегритетот на ткивото. Оваа нова класа на регулаторни молекули е создадена од природата во текот на милиони години еволуција и има неограничен потенцијал за употреба како лекови. Во рамките на имунолошкиот систем, цитокините посредуваат во врската помеѓу неспецифичните заштитни реакции и специфичниот имунитет, дејствувајќи во двете насоки. На ниво на телото, цитокините комуницираат помеѓу имунолошкиот, нервниот, ендокриниот, хематопоетскиот и другите системи и служат за нивно вклучување во организацијата и регулирањето на заштитните реакции. Движечката сила зад интензивното проучување на цитокините отсекогаш била ветувачката перспектива за нивната клиничка употреба за лекување на широко распространети болести, вклучувајќи рак, заразни болести и болести на имунодефициенција. Во Русија се регистрирани неколку цитокински препарати, вклучувајќи интерферони, фактори кои стимулираат колонии, интерлеукини и нивните антагонисти и фактор на туморска некроза. Сите цитокински препарати можат да се поделат на природни и рекомбинантни. Природните лекови се препарати со различен степен на прочистување, добиени од медиумот за култура на стимулирани еукариотски клетки, главно човечки клетки. Главните недостатоци се нискиот степен на прочистување, неможноста за стандардизација поради големиот број на компоненти и употребата на крвни компоненти во производството. Очигледно, иднината на терапијата со цитокини е поврзана со генетски конструирани лекови добиени со користење на најновите достигнувања во биотехнологијата. Во текот на изминатите две децении, гените на повеќето цитокини беа клонирани и беа добиени рекомбинантни аналози кои целосно ги реплицираат биолошките својства на природните молекули. Постојат три главни области на употреба на цитокини во клиничката пракса:

1) терапија со цитокини за активирање на одбранбените реакции на телото, имуномодулација или надополнување на недостатокот на ендогени цитокини,

2) анти-цитокинска имуносупресивна терапија насочена кон блокирање на биолошките ефекти на цитокините и нивните рецептори,

3) генетска терапија со цитокини за подобрување на антитуморниот имунитет или корекција на генетските дефекти во цитокинскиот систем.

Голем број на цитокини може да се користат клинички за системска и локална употреба. Системската администрација е оправдана во случаи кога е неопходно да се обезбеди дејство на цитокините во неколку органи за поефикасно активирање на имунолошкиот систем или да се активираат целните клетки лоцирани во различни делови од телото. Во други случаи, локалната апликација има голем број на предности, бидејќи ви овозможува да постигнете висока локална концентрација на активниот принцип, конкретно да влијаете на целниот орган и да избегнете несакани системски манифестации. Во моментов, цитокините се сметаат за еден од најперспективните лекови за употреба во клиничката пракса.

Заклучок.

Така, во моментов нема сомнеж дека цитокините се најважните фактори во имунопатогенезата. Проучувањето на нивото на цитокини ни овозможува да добиеме информации за функционалната активност на различни типови на имунокомпетентни клетки, односот на процесите на активирање на Т-помошниците типови I и II, што е многу важно во диференцијалната дијагноза на голем број заразни и имунопатолошки процеси. Цитокините се специфични протеини со помош на кои клетките на имунолошкиот систем можат да разменуваат информации меѓу себе и да комуницираат. Денес се откриени повеќе од сто различни цитокини, кои конвенционално се поделени на проинфламаторни (провоцирачки воспаленија) и антиинфламаторни (спречувајќи развој на воспаление). Значи, различните биолошки функции на цитокините се поделени во три групи: тие го контролираат развојот и хомеостазата на имунолошкиот систем, го контролираат растот и диференцијацијата на крвните клетки (хематопоетски систем) и учествуваат во неспецифични одбранбени реакции на телото, кои влијаат на воспалителните процеси, коагулација на крв, крвен притисок.

Список на користена литература.

С.В. Белмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Шчиголева, Т.Л. Михајлова. /Рускиот државен медицински универзитет Државен истражувачки центар за колопроктологија, Москва и Државниот истражувачки институт за високо чисти биолошки препарати, Санкт Петербург.

С.В. Сеников, А.Н. Силков // весник "Цитокини и воспаление", 2005 година, бр. 1 Т. 4, бр. 1. P.22-27.

Т.Г. Рјабичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ју. Рукавишников, материјали од работата на Вектор-Бест АД.

A. S. Simbirtsev, Државен истражувачки институт за високо чисти биолошки препарати на руското Министерство за здравство, Санкт Петербург.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S. Државен истражувачки институт за високо чисти биолошки препарати, Санкт Петербург.

Т.А.Шуматова, В.Б.Шуматов, Е.В.Маркелова, Л.Г.Сухотеплаја. Одделот за анестезиологија и реаниматологија, Државен медицински универзитет во Владивосток.

Работата користеше материјали од страницата http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

одредени патогени на заразни болести. Да, норсулфазол...

1. Антивирусен имунитет, молекуларни клеточни механизми, обрасци на развој и имунопат

   Апстракт >> Медицина, здравје

   ... „локацијата“ се однесува на одредена област одредениполипептид (антиген), со кој... неговите рани фази. Цитокинии хемокини. Друго цитокини, покрај интерфероните ... произведени од нив по единица време цитокиниго одредува интензитетот на пролиферација и...

2. Студија за причините за фиброза на коскената срцевина кај миелопролиферативни болести преку анализа на ефектот на тромбоцитните фактори врз мезенхималните матични клетки

   Домашна работа >> Медицина, здравје

   Различни концентрации; - квантитативни дефиницијапротеинот во експерименталните системи, ... доведува до продолжено дејство цитокин, што го подобрува процесот на фиброза... тромбоцити. Исто така зголемена содржина цитокине пронајден во урината...

3. Патогенеза на туберкулоза кај луѓето

   Апстракт >> Медицина, здравје

   Но, можно е и хранливо. Одредениулога за време на аерогена инфекција игра... игра, излачувана од макрофаги и моноцити цитокин– фактор на туморска некроза (TNFα). ... јони, секоја клетка има одреденисистем кој обезбедува транспорт на супстанции...

). Поради фактот што тие ги активирале или модулирале пролиферативните својства на клетките од оваа класа, тие биле наречени имуноцитокини. Откако беше откриено дека овие соединенија имаат интеракција со повеќе од само клетки на имунолошкиот систем, нивното име беше скратено на цитокини, кои исто така вклучуваат фактор за стимулирање на колониите (CSF) и многу други (види Вазоактивни агенси и воспаление).

Цитокини (цитокини) [грчки. китоси- сад, овде - ќелија и кинео- движење, поттикнување] - голема и разновидна група на посредници со мала големина (молекуларна тежина од 8 до 80 kDa) од протеинска природа - посреднички молекули („комуникациски протеини“) вклучени во преносот на меѓуклеточниот сигнал главно во имунолошкиот систем. Цитокините вклучуваат тумор некроза фактор, интерферони, голем број интерлеукини, итн. Цитокините кои се синтетизираат од лимфоцитите и се регулатори на пролиферацијата и диференцијацијата, особено хематопоетските клетки и клетките на имунолошкиот систем, се нарекуваат лимфокини. Терминот „цитокини“ беше предложен од С. Коен и сор. во 1974 година

Сите клетки на имунолошкиот систем имаат специфични функции и работат во јасно координирана интеракција, која ја обезбедуваат специјални биолошки активни супстанции - цитокини - регулатори на имунолошките реакции. Цитокините се специфични протеини со помош на кои различните клетки на имунолошкиот систем можат да разменуваат информации меѓу себе и да ги координираат дејствата. Множеството и количините на цитокини кои делуваат на рецепторите на клеточната површина - „цитокинското милје“ - претставуваат матрица на сигнали кои комуницираат и често се менуваат. Овие сигнали се сложени поради широката разновидност на цитокински рецептори и затоа што секој цитокин може да активира или потисне неколку процеси, вклучувајќи ја сопствената синтеза и синтезата на други цитокини, како и формирањето и појавата на цитокински рецептори на површината на клетката. Различни ткива имаат своја здрава „цитокинска средина“. Откриени се повеќе од сто различни цитокини.

Цитокините се важен елемент во интеракцијата на различни лимфоцити едни со други и со фагоцити (сл. 4). Преку цитокините помошните Т-клетки помагаат да се координира работата на различните клетки вклучени во имунолошкиот одговор.

Од откривањето на интерлеукини во 1970-тите, до денес се откриени повеќе од сто биолошки активни супстанции. Различни цитокини ја регулираат пролиферацијата и диференцијацијата на имунокомпетентните клетки. И додека влијанието на цитокините врз овие процеси е доста добро проучено, податоците за ефектот на цитокините врз апоптозата се појавија релативно неодамна. Тие треба да се земат предвид и при клиничката употреба на цитокините.

Меѓуклеточната сигнализација во имунолошкиот систем се врши преку директна контактна интеракција помеѓу клетките или со помош на медијатори на меѓуклеточни интеракции. При проучувањето на диференцијацијата на имунокомпетентните и хематопоетските клетки, како и механизмите на меѓуклеточната интеракција што го формираат имунолошкиот одговор, беше откриена голема и разновидна група растворливи медијатори од протеинска природа - посредни молекули („комуникациски протеини“) вклучени во меѓуклеточната пренос на сигнал - цитокини. Хормоните генерално се исклучени од оваа категорија врз основа на ендокрината (наместо паракрината или автокрината) природа на нивното дејство. (види Цитокини: механизми на пренос на хормонски сигнал). Заедно со хормоните и невротрансмитерите, тие ја формираат основата на хемискиот сигнален јазик со кој се регулира морфогенезата и регенерацијата на ткивото во повеќеклеточниот организам. Тие играат централна улога во позитивното и негативното регулирање на имунолошкиот одговор. До денес, повеќе од стотина цитокини се откриени и проучувани кај луѓето во различен степен, како што беше споменато погоре, а извештаите за откривање на нови постојано се појавуваат. За некои, добиени се генетски инженерски аналози. Цитокините дејствуваат преку активирање на цитокинските рецептори.

Доста често, поделбата на цитокините на голем број семејства се врши не според нивните функции, туку според природата на тродимензионалната структура, што ја одразува сличноста во групата во конформацијата и аминокиселинската секвенца на специфичните клеточни цитокински рецептори ( види „Рецептори за цитокини“). Некои од нив се произведени од Т-клетките (види „Цитокини произведени од Т-клетките“). Главната биолошка активност на цитокините е регулирање на имунолошкиот одговор во сите фази од неговиот развој, во кои тие играат централна улога. Општо земено, оваа голема група на ендогени регулатори обезбедува широк спектар на процеси, како што се:

Индукција на цитотоксичност кај макрофагите,

Многу тешки болести доведуваат до значително зголемување на нивоата на IL-1 и TNF алфа. Овие цитокини промовираат активирање на фагоцитите, нивна миграција до местото на воспалението, како и ослободување на воспалителни медијатори - липидни деривати, односно простагландин Е2, тромбоксани и активирачки фактор на тромбоцити. Покрај тоа, тие директно или индиректно предизвикуваат проширување на артериолите, синтеза на адхезивни гликопротеини и ги активираат Т- и Б-лимфоцитите. IL-1 ја активира синтезата на IL-8, што ја промовира хемотаксата на моноцитите и неутрофилите и ослободувањето на ензими од неутрофилите. Во црниот дроб, синтезата на албумин е намалена и синтезата на акутната фаза на протеините на воспалението се зголемува, вклучувајќи инхибитори на протеаза, компоненти на комплементот, фибриноген, церулоплазмин, феритин и хаптоглобин. Нивото на Ц-реактивен протеин, кој се врзува за оштетените и мртвите клетки, како и за некои микроорганизми, може да се зголеми 1000 пати. Исто така, можно е значително зголемување на концентрацијата на серумскиот амилоид А и неговото таложење во различни органи, што доведува до секундарна амилоидоза. Најважниот посредник на акутната фаза на воспаление е IL-6, иако IL-1 и TNF алфа исто така може да предизвикаат опишани промени во функцијата на црниот дроб. IL-1 и TNF алфа го подобруваат меѓусебното влијание врз локалните и општите манифестации на воспаление, така што комбинацијата на овие два цитокини, дури и во мали дози, може да предизвика повеќекратна инсуфициенција на органи и перзистентна артериска хипотензија. Потиснувањето на активноста на било кој од нив ја елиминира оваа интеракција и значително ја подобрува состојбата на пациентот. IL-1 ги активира Т- и Б-лимфоцитите посилно на 39*C отколку на 37*C. IL-1 и TNF алфа предизвикуваат намалување на чистата телесна маса и губење на апетит, што доведува до кахексија за време на продолжена треска. Овие цитокини влегуваат во крвотокот само за кратко време, но тоа е доволно за да се активира производството на IL-6. IL-6 е постојано присутен во крвта, така што неговата концентрација е поконзистентна со сериозноста на треската и другите манифестации на инфекција. Сепак, IL-6, за разлика од IL-1 и TNF алфа, не се смета за смртоносен цитокин.

Резиме. Цитокините се мали протеини кои делуваат автокрино (т.е. на клетката што ги произведува) или паракрино (на клетките лоцирани во близина). Формирањето и ослободувањето на овие високо активни молекули е минливо и цврсто регулирано. Цитокините, кои се синтетизираат од лимфоцитите и се регулатори на пролиферацијата и диференцијацијата, особено хематопоетските клетки и клетките на имунолошкиот систем, се нарекуваат и лимфокини и

Ова поглавје ќе разгледа интегриран пристап за проценка на цитокинскиот систем користејќи ги претходно опишаните современи методи на истражување.

Прво, ќе ги претставиме основните концепти на цитокинскиот систем.

Цитокините во моментов се сметаат како протеинско-пептидни молекули произведени од различни клетки на телото и кои вршат меѓуклеточни и меѓусистемски интеракции. Цитокините се универзални регулатори на клеточниот животен циклус, тие ги контролираат процесите на диференцијација, пролиферација, функционална активација и апоптоза на второто.

Цитокините произведени од клетките на имунолошкиот систем се нарекуваат имуноцитокини; тие претставуваат класа на растворливи пептидни медијатори на имунолошкиот систем, неопходни за неговиот развој, функционирање и интеракција со други телесни системи (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Како регулаторни молекули, цитокините играат важна улога во спроведувањето на вродените и адаптивните имунолошки реакции, обезбедуваат нивна интеракција, ја контролираат хематопоезата, воспалението, заздравувањето на раните, формирањето на нови крвни садови (ангиогенеза) и многу други витални процеси.

Во моментов, постојат неколку различни класификации на цитокини, земајќи ја предвид нивната структура, функционална активност, потекло и тип на цитокински рецептори. Традиционално, во согласност со нивните биолошки ефекти, вообичаено е да се разликуваат следните групи на цитокини.

1. Интерлеукини(IL-1-IL-33) - секреторни регулаторни протеини на имунолошкиот систем, обезбедувајќи медијаторни интеракции во имунолошкиот систем и негова врска со другите системи на телото. Интерлеукините се поделени според нивната функционална активност на про- и антиинфламаторни цитокини, фактори на раст на лимфоцитите, регулаторни цитокини итн.

3. Фактори на туморска некроза (TNF)- цитокини со цитотоксични и регулаторни дејства: TNFa и лимфотоксини (LT).

4. Фактори за раст на хематопоетските клетки- фактор на раст на матични клетки (кит - лиганд), IL-3, IL-7, IL-11, еритропоетин, тробопоетин, фактор за стимулирање на колонијата на гранулоцити-макрофаги - GM-CSF, гранулоцитен CSF - G-CSF, макрофаги-

ny CSF - M-CSF).

5. Хемокини- C, CC, CXC (IL-8), CX3C - регулатори на хемотаксата на различни типови на клетки.

6. Фактори за раст на нелимфоидните клетки- регулатори на раст, диференцијација и функционална активност на клетките од различни ткива (фактор на раст на фибробластите - FGF, фактор на раст на ендотелијалните клетки, фактор на раст на епидермисот - EGF на епидермисот) и фактори на раст на трансформација (TGFβ, TGFα).

Меѓу другото, во последниве години, активно е изучуван фактор кој ја инхибира миграцијата на макрофагите (миграциски инхибиторен фактор - MIF), кој се смета за неврохормон со цитокинска и ензимска активност (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Цитокините се разликуваат по структура, биолошка активност и други својства. Сепак, заедно со разликите, цитокините имаат општи својства,карактеристични за оваа класа на биорегулаторни молекули.

1. Цитокините се, по правило, гликолизирани полипептиди со средна молекуларна тежина (помалку од 30 kD).

2. Цитокините се произведуваат од клетките на имунолошкиот систем и другите клетки (на пример, ендотел, фибробласти итн.) како одговор на активирачки стимул (молекуларни структури поврзани со патогенот, антигени, цитокини итн.) и учествуваат во реакциите на вроден и адаптивен имунитет, регулирајќи ја нивната сила и времетраење. Некои цитокини се синтетизираат конститутивно.

3. Секрецијата на цитокините е краток процес. Цитокините не се складираат како претходно формирани молекули, туку нивни

синтезата секогаш започнува со генска транскрипција. Клетките произведуваат цитокини во ниски концентрации (пикограми на милилитар).

4. Во повеќето случаи, цитокините се произведуваат и дејствуваат на целните клетки лоцирани во непосредна близина (дејство со краток дострел). Главното место на дејство на цитокините е меѓуклеточната синапса.

5. ВишокСистемот на цитокини се манифестира во фактот дека секој тип на клетка е способен да произведе неколку цитокини, а секој цитокин може да се секретира од различни клетки.

6. Сите цитокини се карактеризираат со плејотропија,или мултифункционалност на дејството. Така, манифестацијата на знаци на воспаление се должи на влијанието на IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Умножувањето на функциите обезбедува сигурна работа на цитокинскиот систем.

7. Дејството на цитокините врз целните клетки е посредувано од високо специфични мембрански рецептори со висок афинитет, кои се трансмембрански гликопротеини, кои обично се состојат од повеќе од една подединица. Екстрацелуларниот дел од рецепторите е одговорен за врзувањето на цитокините. Постојат рецептори кои го елиминираат вишокот цитокини во патолошкиот фокус. Тоа се таканаречени рецептори за мамка. Растворливите рецептори се екстрацелуларен домен на мембрански рецептор одделен со ензим. Растворливите рецептори се способни да ги неутрализираат цитокините, да учествуваат во нивниот транспорт до местото на воспалението и во нивното отстранување од телото.

8. Цитокини работа на мрежниот принцип.Тие можат да дејствуваат заедно. Многу функции првично припишани на еден цитокин се чини дека се должат на координираното дејство на неколку цитокини. (синергијаакции). Примери за синергетска интеракција на цитокините се стимулација на воспалителни реакции (IL-1, IL-6 и TNFa), како и синтеза на IgE

(IL-4, IL-5 и IL-13).

Некои цитокини индуцираат синтеза на други цитокини (каскада).Каскадното дејство на цитокините е неопходно за развој на воспалителни и имунолошки реакции. Способноста на некои цитокини да го подобрат или ослабат производството на други одредува важни позитивни и негативни регулаторни механизми.

Познато е антагонистичкиот ефект на цитокините, на пример, производството на IL-6 како одговор на зголемувањето на концентрацијата на TNFa може да биде

негативен регулаторен механизам за контрола на производството на овој медијатор за време на воспаление.

Регулацијата на цитокинските функции на целните клетки се врши со помош на автокрини, паракрини или ендокрини механизми. Некои цитокини (IL-1, IL-6, TNFα, итн.) се способни да учествуваат во спроведувањето на сите овие механизми.

Одговорот на клетката на влијанието на цитокинот зависи од неколку фактори:

За типот на клетките и нивната почетна функционална активност;

Од локалната концентрација на цитокинот;

Од присуството на други молекули на медијатори.

Така, клетките-производители, цитокините и нивните специфични рецептори на целните клетки формираат единствена мрежа на медијатори. Тоа е збир на регулаторни пептиди, а не поединечни цитокини, кои го одредуваат конечниот одговор на клетката. Во моментов, системот на цитокини се смета за универзален регулаторен систем на ниво на целиот организам, обезбедувајќи развој на заштитни реакции (на пример, за време на инфекција).

Во последниве години, се појави идеја за цитокински систем кој комбинира:

1) продуцентски клетки;

2) растворливи цитокини и нивните антагонисти;

3) целните клетки и нивните рецептори (сл. 7.1).

Нарушувањата во различни компоненти на цитокинскиот систем доведуваат до развој на бројни патолошки процеси и затоа идентификацијата на дефектите во овој регулаторен систем е важна за правилна дијагноза и препишување на адекватна терапија.

Прво, да ги погледнеме главните компоненти на системот на цитокини.

Клетките што произведуваат цитокини

I. Главната група на клетки кои произведуваат цитокини во адаптивниот имунолошки одговор се лимфоцитите. Клетките во мирување не лачат цитокини. По препознавањето на антигенот и со учество на интеракции на рецепторите (CD28-CD80/86 за Т-лимфоцитите и CD40-CD40L за Б-лимфоцитите), се јавува клеточна активација, што доведува до транскрипција на гените на цитокините, преведување и секреција на гликолизирани меѓуклеточни пептиди.

Ориз. 7.1.Цитокински систем

ЦД4 Т помошните клетки се претставени со субпопулации: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, кои се разликуваат една од друга во спектарот на секретираните цитокини како одговор на различни антигени.

Th0 произведува широк опсег на цитокини во многу ниски концентрации.

Насока на диференцијација Th0го одредува развојот на две форми на имунолошки одговор со доминација на хуморалните или клеточните механизми.

Природата на антигенот, неговата концентрација, локализацијата во клетката, типот на клетките кои претставуваат антиген и одреден сет на цитокини ја регулираат насоката на диференцијација на Th0.

Дендритските клетки, по навлегувањето и обработката на антигенот, претставуваат антигенски пептиди до Th0 клетките и произведуваат цитокини кои ја регулираат насоката на нивната диференцијација во ефекторни клетки. Улогата на поединечните цитокини во овој процес е прикажана на сл. 7.2. IL-12 индуцира синтеза на IFNγ од Т-лимфоцитите и hGC. IFN обезбедува диференцијација на Th1, кои почнуваат да лачат цитокини (IL-2, IFN, IL-3, TNFa, лимфотоксини) кои го регулираат развојот на реакции на интрацелуларни патогени

(одложена хиперсензитивност (DTH) и различни видови на клеточна цитотоксичност).

IL-4 обезбедува диференцијација на Th0 во Th2. Активираниот Th2 произведува цитокини (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, итн.) кои ја одредуваат пролиферацијата на Б-лимфоцитите, нивната понатамошна диференцијација во плазма клетки и развојот на реакции на антитела, главно на екстрацелуларните патогени .

IFN негативно ја регулира функцијата на Th2 клетките и, обратно, IL-4, IL-10, секретирани од Th2, ја инхибираат функцијата на Th1 (сл. 7.3). Молекуларниот механизам на оваа регулација е поврзан со факторите на транскрипција. Експресијата на T-bet и STAT4, одредена од IFNu, ја насочува диференцијацијата на Т-клетките долж Th1 патеката и го потиснува развојот на Th2. IL-4 индуцира изразување на GATA-3 и STAT6, што соодветно обезбедува конверзија на наивни Th0 во Th2 клетки (сл. 7.2).

Во последниве години, опишана е посебна субпопулација на помошни Т-клетки (Th17) кои произведуваат IL-17. Членовите на семејството IL-17 можат да се изразат со активирани мемориски клетки (CD4CD45RO), γ5T клетки, NKT клетки, неутрофили, моноцити под влијание на IL-23, IL-6, TGFβ произведени од макрофаги и дендритични клетки. Главниот фактор на диференцијација кај луѓето е ROR-C, кај глувците е ROR-γ лКардиналната улога на IL-17 во развојот на хронично воспаление и автоимуна патологија е прикажана (види Сл. 7.2).

Покрај тоа, Т-клетките во тимусот може да се диференцираат во природни регулаторни клетки (Tregs) кои изразуваат површински маркери CD4 + CD25 + и фактор на транскрипција FOXP3. Овие клетки се способни да го потиснат имунолошкиот одговор посредуван од Th1 и Th2 клетките преку директен контакт клетка до клетка и синтеза на TGFβ и IL-10.

Шемите на диференцијација на Th0 клоновите и цитокините што тие ги лачат се претставени на сл. 7.2 и 7.3 (види и вметнување во боја).

Т-цитотоксични клетки (CD8 +), природни клетки убијци, се слаби произведувачи на цитокини како што се интерферони, TNF-a и лимфотоксини.

Прекумерното активирање на една од Th подпопулациите може да го одреди развојот на една од варијантите на имунолошкиот одговор. Хроничната нерамнотежа на активирањето на Th може да доведе до формирање на имунопатолошки состојби поврзани со манифестациите на

ми алергии, автоимуна патологија, хронични воспалителни процеси итн.

Ориз. 7.2.Различни подмножества на Т-лимфоцити кои произведуваат цитокини

II. Во вродениот имунолошки систем, главните производители на цитокини се миелоидните клетки. Користејќи рецептори слични на Toll (TLRs), тие препознаваат слични молекуларни структури на различни патогени, т.н. -позитивни микроорганизми, флагелин, ДНК богата со неметилирани CpG повторувања итн. Како резултат на тоа

Оваа интеракција со TLR предизвикува каскада на интрацелуларна трансдукција на сигнал, што доведува до изразување на гени за две главни групи цитокини: проинфламаторни и тип 1 IFN (сл. 7.4, видете исто така вметнување во боја). Главно овие цитокини (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, хемокини итн.) предизвикуваат развој на воспаление и се вклучени во заштитата на телото од бактериски и вирусни инфекции.

Ориз. 7.3.Спектар на цитокини секретирани од Th1 и Th2 клетките

III. Клетките кои не се поврзани со имунолошкиот систем (клетките на сврзното ткиво, епител, ендотел) конститутивно лачат автокрини фактори за раст (FGF, EGF, TGFr, итн.). и цитокини кои ја поддржуваат пролиферацијата на хематопоетските клетки.

Цитокини и нивните антагонистидетално се опишани во голем број монографии (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ориз. 7.4. TLR-посредувана индукција на производство на цитокини од вродени имунолошки клетки

Прекумерното изразување на цитокините е небезбедно за телото и може да доведе до развој на прекумерна воспалителна реакција, одговор на акутна фаза. Различни инхибитори се вклучени во регулирањето на производството на проинфламаторни цитокини. Така, опишани се голем број на супстанции кои неспецифично го врзуваат цитокинот IL-1 и ја спречуваат манифестацијата на неговото биолошко дејство (а2-макроглобулин, C3-компонента на комплементот, уромодулин). Специфичните инхибитори на IL-1 вклучуваат растворливи рецептори за мамка, антитела и антагонист на рецепторот на IL-1 (IL-1RA). Со развојот на воспалението се зголемува експресијата на генот IL-1RA. Но, дури и нормално, овој антагонист е присутен во крвта во високи концентрации (до 1 ng/ml или повеќе), блокирајќи го дејството на ендогениот IL-1.

Целни клетки

Дејството на цитокините на целните клетки е посредувано преку специфични рецептори кои ги врзуваат цитокините со многу висок афинитет, а поединечните цитокини можат да користат

заеднички рецепторски подединици. Секој цитокин се врзува за неговиот специфичен рецептор.

Цитокинските рецептори се трансмембрански протеини и се поделени на 5 главни типови. Најчест е таканаречениот хематопоетински тип на рецептори, кои имаат два екстрацелуларни домени, од кои едниот содржи заедничка низа од остатоци од аминокиселини од две повторувања на триптофан и серин, одделени со која било амино киселина (мотив WSXWS). Вториот тип на рецептори може да има два екстрацелуларни домени со голем број на конзервирани цистеини. Ова се рецептори од семејството на IL-10 и IFN. Третиот тип е претставен со цитокински рецептори кои припаѓаат на групата TNF. Четвртиот тип на цитокински рецептори припаѓа на суперфамилијата на имуноглобулински рецептори, кои имаат екстрацелуларни домени кои во структурата наликуваат на домените на имуноглобулинските молекули. Петтиот тип на рецептори кои ги врзуваат молекулите од семејството на хемокини е претставен со трансмембрански протеини кои ја преминуваат клеточната мембрана на 7 места. Цитокинските рецептори можат да постојат во растворлива форма, задржувајќи ја способноста да ги врзуваат лигандите (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Цитокините можат да влијаат на пролиферацијата, диференцијацијата, функционалната активност и апоптозата на целните клетки (види Сл. 7.1). Манифестацијата на биолошката активност на цитокините во целните клетки зависи од учеството на различни интрацелуларни системи во преносот на сигналот од рецепторот, што е поврзано со карактеристиките на целните клетки. Сигналот за апоптоза се врши, меѓу другото, со користење на специфичен регион од семејството на рецепторите на TNF, таканаречениот домен „смрт“ (сл. 7.5, видете го вметнувањето во боја). Сигналите за диференцијација и активирање се пренесуваат преку интрацелуларни Jak-STAT протеини - трансдуктори на сигнали и активатори на транскрипција (сл. 7.6, видете го вметнувањето во боја). Г-протеините се вклучени во трансдукцијата на сигналот од хемокините, што доведува до зголемена клеточна миграција и адхезија.

Сеопфатна анализа на цитокинскиот систем го вклучува следново.

I. Евалуација на продуцентските клетки.

1. Определување на изразување:

Рецептори кои препознаваат патоген или антиген TCR, TLR) на ниво на гени и протеински молекули (ПЦР, метод на проточна цитометрија);

Молекули на адаптер кои спроведуваат сигнал што ја активира транскрипцијата на гените на цитокините (PCR, итн.);

Ориз. 7.5.Пренос на сигнал од TNF рецепторот

Ориз. 7.6. Jak-STAT - сигнална патека на цитокински рецептор тип 1

Цитокински гени (PCR); протеински молекули на цитокини (проценка на функцијата за синтетизирање на цитокините на човечките мононуклеарни клетки).

2. Квантитативно определување на клеточни субпопулации кои содржат одредени цитокини: Th1, Th2 Th17 (метод на интрацелуларно боење на цитокините); определување на бројот на клетки кои лачат одредени цитокини (метод ELISPOT, види Поглавје 4).

II. Проценка на цитокините и нивните антагонисти во биолошките средини на телото.

1. Тестирање на биолошката активност на цитокините.

2. Квантитативно определување на цитокини со помош на ELISA.

3. Имунохистохемиско боење на цитокините во ткивата.

4. Определување на односот на спротивни цитокини (про- и антиинфламаторни), цитокини и антагонисти на цитокинските рецептори.

III. Евалуација на целните клетки.

1. Определување на експресијата на цитокинските рецептори на ниво на гени и протеински молекули (ПЦР, метод на проточна цитометрија).

2. Определување на сигнални молекули во интрацелуларна содржина.

3. Определување на функционалната активност на целните клетки.

Во моментов, развиени се бројни методи за проценка на цитокинскиот систем, кои обезбедуваат различни информации. Меѓу нив се:

1) молекуларни биолошки методи;

2) методи за квантитативно определување на цитокини со помош на имуноанализи;

3) тестирање на биолошката активност на цитокините;

4) интрацелуларно боење со цитокини;

5) методот ELISPOT, кој овозможува детекција на цитокини околу една клетка што произведува цитокини;

6) имунофлуоресценција.

Ние даваме краток опис на овие методи.

Со користење на молекуларни биолошки методиМожете да го проучувате изразувањето на гените на цитокините, нивните рецептори, сигналните молекули и да го проучувате полиморфизмот на овие гени. Во последниве години, беа спроведени голем број студии кои открија поврзаност помеѓу варијантните алели на гените за молекулите на цитокинскиот систем и предиспозицијата

на голем број болести. Проучувањето на алелните варијанти на гените на цитокините може да обезбеди информации за генетски програмираното производство на одреден цитокин. Најчувствителна се смета за верижна реакција на полимераза во реално време - RT-PCR (види Поглавје 6). Метод на хибридизација на самото местови овозможува да ја разјасните ткивната и клеточната локализација на изразувањето на гените на цитокините.

Квантитативното определување на цитокините во биолошките течности и во културите на мононуклеарни клетки од периферната крв со ELISA може да се карактеризира на следниов начин. Бидејќи цитокините се локални медијатори, посоодветно е да се измерат нивните нивоа во соодветните ткива по екстракција на ткивни протеини или во природни течности, како што се солзи, шуплини, урина, плодова вода, цереброспинална течност итн. Нивоата на цитокините во серумот или другите телесни течности ја одразуваат моменталната состојба на имунолошкиот систем, т.е. синтеза на цитокини од телесните клетки in vivo.

Одредувањето на нивоата на производство на цитокини од мононуклеарни клетки на периферната крв (PBMCs) ја покажува функционалната состојба на клетките. Спонтаното производство на цитокини од страна на МНК во културата покажува дека клетките се веќе активирани in vivo.Синтезата на цитокини индуцирана (од различни стимуланси, митогени) ја одразува потенцијалната, резервна способност на клетките да одговорат на антигенски стимул (особено, на дејството на лековите). Намалено индуцирано производство на цитокини може да послужи како еден од знаците на состојба на имунодефициенција. Цитокините не се специфични за одреден антиген. Затоа, невозможна е специфична дијагноза на инфективни, автоимуни и алергиски заболувања со одредување на нивото на одредени цитокини. Во исто време, проценката на нивоата на цитокини ни овозможува да добиеме податоци за сериозноста на воспалителниот процес, неговата транзиција на системско ниво и прогнозата, функционалната активност на клетките на имунолошкиот систем, односот на Th1 и Th2 клетките, што е многу важно во диференцијалната дијагноза на низа инфективни и имунопатолошки процеси.

Во биолошките медиуми, цитокините може да се квантифицираат со користење на различни методи на имуноанализа,користење на поликлонални и моноклонални антитела (види Поглавје 4). ELISA ви овозможува да дознаете кои се точните концентрации на цитокините во био-

логични течности на телото. Ензимско имуносорбентното детекција на цитокини има голем број на предности во однос на другите методи (висока чувствителност, специфичност, независност од присуството на антагонисти, можност за точно автоматизирано снимање, стандардизација на снимање). Сепак, овој метод, исто така, има свои ограничувања: ELISA не ја карактеризира биолошката активност на цитокините и може да даде лажни резултати поради епитопите со вкрстено реагирање.

Биолошко тестирањеспроведено врз основа на знаење за основните својства на цитокините и нивните ефекти врз целните клетки. Студијата за биолошките ефекти на цитокините доведе до развој на четири типа на тестирање на цитокини:

1) со поттикнување на пролиферација на целните клетки;

2) со цитотоксичен ефект;

3) со поттикнување на диференцијација на прекурсори на коскената срцевина;

4) за антивирусно дејство.

IL-1 се одредува со неговиот стимулирачки ефект врз пролиферацијата на тимоцитите на глувчето активирани од митоген ин витро; IL-2 - со неговата способност да ја стимулира пролиферативната активност на лимфобластите; TNF-α и лимфотоксините се тестираат за цитотоксични ефекти врз фибробластите на глувчето (L929). Факторите за стимулирање на колонијата се оценуваат според нивната способност да го поддржат растот на прекурсорите на коскената срцевина како колонии во агарот. Антивирусната активност на IFN се открива со инхибиција на цитопатскиот ефект на вирусите во културата на диплоидни човечки фибробласти и туморската линија на фибробластите на глувчето L-929.

Создадени се клеточни линии чиј раст зависи од присуството на одредени цитокини. Во табелата Табела 7.1 дава список на клеточни линии што се користат за тестирање на цитокини. Врз основа на способноста да се индуцира пролиферација на чувствителни целни клетки, биотестирањето се спроведува за IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 итн. Сепак, овие методи на тестирање се карактеризираат поради недоволна чувствителност и информациска содржина. Инхибиторните и антагонистичките молекули можат да ја маскираат биолошката активност на цитокините. Некои цитокини покажуваат општа биолошка активност. Сепак, овие методи се идеални за тестирање на специфичната активност на рекомбинантните цитокини.

Табела 7.1.Клеточни линии кои се користат за тестирање на биолошката активност на цитокините

Крај на табелата. 7.1

Лабораторија 7-1

Определување на биолошката активност на IL-1 со неговиот комитоген ефект врз пролиферацијата на тимоцитите на глувчето

Методот на биолошко тестирање на IL-1 се заснова на способноста на цитокинот да ја стимулира пролиферацијата на тимоцитите на глувчето.

IL-1 може да се одреди во култура на моноцити стимулирани со LPS, како и во која било биолошка течност на телото.Неопходно е да се обрне внимание на голем број детали.

1. За тестирање се користат тимоцити на глувци од линијата C3H/HeJ, стимулирани на пролиферација со митогени (конканавалин А - ConA и фитохемаглутинин - PHA). Тимоцитите C3H/HeJ не беа избрани случајно: глувците од овој вроден сој не реагираат на LPS, што може да биде присутно во материјалот за тестирање и да предизвика производство на IL-1.

2. Тимоцитите реагираат на IL-2 и митогени, затоа, присуството на IL-2 и митогени исто така треба да се утврди во препаратите тестирани за IL-1.

Оперативна процедура

1. Се добива суспензија од тимоцити во концентрација од 12×106/ml RPMI 1640 медиум кој содржи 10% серум од фетален говеда и 2-меркаптоетанол (5×10-5 М).

2. Подгответе серија сериски двократни разредувања на експериментални (биолошки телесни течности) и контролни примероци. Како контроли се користат биолошки течности кои содржат IL-1 или примероци добиени со инкубирање на мононуклеарни клетки без LPS и лабораториски стандарден препарат што содржи IL-1. Во плочи со тркалезно дно со 96 бунари, 50 µl од секое разредување се префрлаат во 6 бунари.

3. Додадете 50 μl прочистен PHA (Добредојдовте) растворен во целосен медиум во концентрација од 3 μg/ml во три бунари од секое разредување и 50 μl медиум во другите 3 бунари.

4. Додадете 50 μl суспензија на тимоцити во секоја буна и инкубирајте 48 часа на 37 °C.

6. Пред да се заврши одгледувањето, 50 μl раствор (1 μCi/ml) од [„3H]-тимидин се додаваат во бунарите и се инкубира уште 20 часа.

7. За да се одреди нивото на радиоактивност, клетките на културата се пренесуваат на филтер-хартија со помош на автоматски колектор на ќелии, филтрите се сушат и вклучувањето на етикетата се одредува со течен бројач за сцинтилација.

8. Резултатите се изразуваат како фактор на стимулација.

каде m cp е просечниот број на импулси во 3 бунари.

Ако тимоцитите реагираат на стимулација со стандарден IL-1, тогаш индексот на стимулација на примерокот за тестирање кој надминува 3 сигурно укажува на активност на IL-1.

Биоанализата е единствениот метод за проценка на функционирањето на цитокинот, но овој метод мора да биде дополнет со различни видови соодветно следење на специфичноста со користење на моноклонални антитела. Додавањето на одредени моноклонални антитела на цитокинот во културата ја блокира биолошката активност на цитокинот, што докажува дека сигналот за пролиферација на клеточната линија е детектибилниот цитокин.

Употреба на биоанализа за откривање на интерферон.Принципот на проценка на биолошката активност на IFN се заснова на неговиот антивирусен ефект, кој се одредува според степенот на инхибиција на пролиферацијата на тест вирусот во клеточна култура.

Клетките кои се чувствителни на дејството на IFN може да се користат во работата: примарни трипсинизирани пилешки и човечки ембрионски фибробластни клетки, континуирани клетки на човечки диплоидни фибробласти и клеточна култура на глушец (L929).

При проценка на антивирусниот ефект на IFN, препорачливо е да се користат вируси со краток циклус на репродукција и висока чувствителност на дејството на IFN: вирус на енцефаломиелитис на глушец, вирус на везикуларен стоматитис на глувци итн.

Лабораторија 7-2

Одредување на активноста на интерферон

1. Суспензија од диплоидни човечки фетални фибробласти на медиум со 10% говедски фетален серум (концентрација на клетки - 15-20×10 6 /ml) се истура во стерилни чинии со рамно дно со 96 бунари, 100 µl по бунар и се става во инкубатор CO 2 на температура од 37 °C.

2. По формирањето на целосен еднослоен, медиумот за раст се отстранува од бунарите и се додава 100 μl медиум за одржување на секоја буна.

3. Титрирање на активноста на IFN во испитуваните примероци се врши со методот на двократно разредување на монобласт на фибробласти.

Истовремено со примероците, вирусот на енцефаломиелитис на глувци (MEV) се внесува во бунарите во доза која предизвикува 100% оштетување на клетките 48 часа по инфекцијата.

4. За контрола, користете бунари со недопрени (нетретирани) клетки инфицирани со вирусот.

Во секоја студија, референтните примероци на IFN со позната активност се користат како референтни лекови.

5. Плочите со разредување на примерокот се инкубираат 24 часа на температура од 37 °C во атмосфера со 5% содржина на CO 2.

6. Нивото на активност на IFN се определува со реципрочното разредување на тест примерокот, што го одложува цитопатскиот ефект на вирусот за 50%, а се изразува во единици на активност на 1 ml.

7. За да се одреди типот на IFN, во системот се додава антисерум против IFNα, IFNβ или IFNγ. Антисерумот го откажува дејството на соодветниот цитокин, што овозможува да се идентификува типот на IFN.

Одредување на биолошка активност на миграција на инхибиторен фактор.Во моментов, формирани се сосема нови идеи за природата и својствата на MIF, откриени во 60-тите години на минатиот век како посредник на клеточниот имунитет и кои останаа без должно внимание многу години (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David Ј.Р., 1966). Само во последните 10-15 години стана јасно: MIF е еден од најважните биолошки медијатори во телото со широк опсег на биолошки функции како цитокин, хормон и ензим. Ефектот на MIF врз целните клетки се реализира преку CD74 - рецепторот или преку некласичната патека на ендоцитоза.

MIF се смета за важен медијатор на воспаление, активирајќи ја функцијата на макрофагите (производство на цитокини, фагоцитоза, цитотоксичност итн.), како и ендоген имунорегулаторен хормон кој ја модулира глукокортикоидна активност.

Сè повеќе информации се акумулираат за улогата на MIF во патогенезата на многу воспалителни болести, вклучувајќи сепса, ревматоиден артритис (РА), гломерулонефритис, итн. Кај РА, концентрацијата на MIF во течноста на зафатените зглобови е значително зголемена. што е во корелација со тежината на болеста. Под влијание на MIF, се зголемува производството на проинфламаторни цитокини и од макрофагите и од синовијалните клетки.

Познати се различни методи за тестирање на активноста на MIF, каде што миграционите клетки (целни клетки за MIF) се ставаат во стаклен капилар (капиларен тест), во капка агароза или во бунар од агароза.

Презентиравме релативно едноставен метод на скрининг базиран на формирање на клеточни микрокултури (леукоцити или макрофаги), стандардни по површина и број на клетки, на дното на бунарите на плоча со рамно дно со 96 бунари, проследено со нивно одгледување во хранлив медиум и определување на промени во областа на овие микрокултури под влијание на МИФ (Суслов А.П., 1989).

Лабораторија 7-3

Дефиниција на MIF активност

Одредувањето на биолошката активност на MIF се врши со помош на уред за формирање на клеточни микрокултури (сл. 7.7) - МИГРОСКРИН (N.F. Gamaleya Истражувачкиот институт за епидемиологија и микробиологија на Руската академија на медицински науки).

1. Додадете 100 µl од примерокот разреден во медиум за култура, во кој се одредува активноста на MIF (секое разредување во 4 паралели, експериментални примероци), во бунарите на плоча со 96 бунари (Flow, UK или слично). Медиумот за култура вклучува RPMI 1640, 2 mM L-глутамин, 5% фетален говедски серум, 40 μg/ml гентамицин.

2. Додадете медиум за култура (во 4 паралели) од 100 μl за контрола на бунарите.

3. Се подготвува клеточна суспензија на перитонеални макрофаги, за кои 2 хибридни глувци (CBAxC57B1/6)F1 се интраперитонеално инјектирани со 10 ml раствор на Хенкс со хепарин (10 U/ml), а стомакот нежно се масира 2-3. минути. Потоа животното се убива со обезглавување, абдоминалниот ѕид внимателно се пробива во пределот на препоните, а ексудатот се вшмукува преку игла со шприц. Клетките на перитонеалниот ексудат се мијат двапати со Хенксовиот раствор, центрифугирајте ги 10-15 минути на 200 g. Потоа се подготвува клеточна суспензија со концентрација од 10±1 милион/ml медиум RPMI 1640. Броењето се врши во комора Горјаев.

4. Склопете го системот МИГРОСКРИН, кој е држач за насочена и стандардна фиксација на врвовите со клеточни култури во строго вертикална положба на дадена висина над центарот на бунарот на плоча за култура со 96 бунари, а исто така вклучува и 92 врвови за автоматски пипети од Костар, САД (сл. 7.7).

Ставете ги ногарките на стативот во аглите на таблетот. Суспензијата на клетките се вовлекува во врвовите со автоматска пипета - по 5 μl, се исплакнува за да се отстранат вишокот ќелии така што ќе се испуштат еднаш во медиумот и се вметнува вертикално во приклучоците на системскиот држач. Наполнетата решетка со врвови се чува на собна температура 1 час на строго хоризонтална површина. За тоа време, суспензивните клетки се таложат на дното на бунарите, каде што се формираат стандардни клеточни микрокултури.

5. Држачот со врвови е внимателно отстранет од таблетот. Плочата за микрокултура на клетките се става во строго хоризонтална положба во инкубатор CO 2, каде што се одгледува 20 часа. За време на одгледувањето, клетките мигрираат по дното на бунарот.

6. Квантитативното снимање на резултатите по инкубацијата се врши со помош на двогледна лупа, визуелно проценувајќи ја големината на колонијата на вага во внатрешноста на окуларот. Микрокултурите имаат облик на круг. Истражувачите потоа го одредуваат просечниот дијаметар на колонијата со мерење на колониите во 4 тест или контролни бунари. Грешката во мерењето е ± 1 mm.

Индексот на миграција (MI) се пресметува со формулата:

Примерокот има MIF активност ако вредностите на MI се еднакви

Конвенционалната единица (AU) на активноста на MIF се зема како инверзна вредност еднаква на вредноста на највисокото разредување на примерокот (примерокот), при што индексот на миграција е 0,6 ± 0,2.

Биолошка активност на ПЕОα се оценува со неговиот цитотоксичен ефект врз линијата на трансформирани фибробласти L-929. Рекомбинантниот TNF-α се користи како позитивна контрола, а клетките во медиумот за култура се користат како негативна контрола.

Пресметајте го цитотоксичниот индекс (CI):

Каде а- број на живи клетки во контролата; б- бројот на живи клетки во експериментот.

Ориз. 7.7.Шема МИГРОСКРИН - уреди за квантитативна проценка на миграција на клеточни култури

Клетките се обоени со боја (метиленско сино), која е вклучена само во мртвите клетки.

Стандардна единица за активност на TNF се зема како реципрочно разредување на примерокот потребен за да се добие 50% клеточна цитотоксичност. Специфична активност на примерокот е односот на активност во произволни единици на 1 ml до концентрацијата на протеинот содржан во примерокот.

Интрацелуларно боење со цитокини.Промените во односот на клетките кои произведуваат различни цитокини може да ја одразуваат патогенезата на болеста и да послужат како критериум за прогноза на болеста и евалуација на терапијата.

Методот на интрацелуларно боење се користи за одредување на експресијата на цитокините на ниво на една клетка. Цитометријата на проток ви овозможува да го броите бројот на клетки кои изразуваат одреден цитокин.

Да ги наведеме главните фази на одредување на интрацелуларните цитокини.

Нестимулираните клетки произведуваат мали количини на цитокини, кои, по правило, не се складираат, така што важен чекор во проценката на интрацелуларните цитокини е стимулацијата на лимфоцитите и блокирањето на ослободувањето на овие производи од клетките.

Најчесто користен цитокински индуктор е протеин киназа C активатор форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) во комбинација со калциум јонофор јономицин (IN). Употребата на оваа комбинација предизвикува синтеза на широк опсег на цитокини: IFN, IL-4, IL-2, TNFα. Недостаток на користење на FMA-IN е проблемот со идентификување на молекулите на CD4 на површината на лимфоцитите по таквото активирање. Исто така, производството на цитокини од Т-лимфоцитите е индуцирано со користење на митогени (PHA). Б-клетките и моноцитите стимулираат

Мононуклеарните клетки се инкубираат во присуство на индуктори на производство на цитокини и блокатор на нивниот меѓуклеточен транспорт, брефелдин А или монензин, 2-6 часа.

Клетките потоа повторно се суспендираат во пуфер раствор. За фиксација, додадете 2% формалдехид и инкубирајте 10-15 минути на собна температура.

Потоа клетките се третираат со сапонин, кој ја зголемува пропустливоста на клеточната мембрана и се обоени со моноклонални антитела специфични за откриените цитокини. Прелиминарното боење на површинските маркери (CD4, CD8) ја зголемува количината на информации добиени за клетката и овозможува попрецизно да се одреди нејзината припадност на населението.

Постојат некои ограничувања во примената на методите опишани погоре. Така, со нивна помош е невозможно да се анализира синтезата на цитокините од една клетка, невозможно е да се одреди бројот на клетки кои произведуваат цитокини во една подпопулација, невозможно е да се утврди дали клетките што произведуваат цитокини изразуваат единствени маркери, дали различни цитокини се синтетизираат од различни клетки или од исти. Одговорот на овие прашања се добива со користење на други методи на истражување. За да се одреди фреквенцијата на клетките што произведуваат цитокини во популацијата, се користат методот на ограничување на разредување и варијанта на имуносорбентната анализа поврзана со ензимот ELISPOT (види Поглавје 4).

In situ метод на хибридизација.Методот вклучува:

2) фиксација со параформалдехид;

3) откривање на mRNA со користење на означена cDNA. Во некои случаи, цитокинската mRNA се одредува на делови со користење на радиоизотоп PCR.

Имунофлуоресценција.Методот вклучува:

1) замрзнување на органот и подготовка на делови за криостати;

2) фиксација;

3) третман на делови со анти-цитокински антитела означени со флуоресцеин;

4) визуелно набљудување на флуоресценција.

Овие техники (хибридизација на самото местои имунофлуоресценција) се брзи и не зависат од праговите концентрации на секретираниот производ. Сепак, тие не ја мерат количината на секретираниот цитокин и може да бидат технички предизвик. Неопходно е различно внимателно следење за неспецифични реакции.

Користејќи ги презентираните методи за проценка на цитокините, идентификувани се патолошки процеси поврзани со нарушувања во цитокинскиот систем на различни нивоа.

Така, проценката на цитокинскиот систем е исклучително важна за карактеризирање на состојбата на имунолошкиот систем на телото. Студијата на различни нивоа на системот на цитокини ни овозможува да добиеме информации за функционалната активност на различни типови на имунокомпетентни клетки, сериозноста на воспалителниот процес, неговата транзиција на системско ниво и прогнозата на болеста.

Прашања и задачи

1. Наброј ги општите својства на цитокините.

2. Наведете ја класификацијата на цитокините.

3. Наведете ги главните компоненти на цитокинскиот систем.

4. Наброј ги клетките кои произведуваат цитокини.

5. Опишете ги фамилиите на цитокинските рецептори.

6. Кои се механизмите на функционирање на цитокинската мрежа?

7. Објаснете го производството на цитокини во вродениот имунолошки систем.

8. Кои се главните пристапи за сеопфатна проценка на цитокинскиот систем?

9. Кои се методите за испитување на цитокините во телесните течности?

10. Кои се дефектите на цитокинскиот систем кај различни патологии?

11. Кои се главните методи за биолошко тестирање на IL-1, IFN, MIF, TNFa во биолошките течности?

12. Опишете го процесот на одредување на интрацелуларната содржина на цитокините.

13. Опишете го процесот на определување на цитокините што се излачуваат од една клетка.

14. Опишете ја низата методи што се користат за идентификување на дефект на ниво на цитокински рецептор.

15. Опишете ја низата методи што се користат за идентификување на дефект на ниво на клетки кои произведуваат цитокини.

16. Какви информации може да се добијат со проучување на производството на цитокини во култура на мононуклеарни клетки во крвниот серум?

Вовед

Генерални информации

Класификација на цитокини

Цитокински рецептори

Цитокини и регулирање на имунолошкиот одговор

Заклучок

Литература

Вовед

Цитокините се еден од најважните делови на имунолошкиот систем. На имунолошкиот систем му треба систем за предупредување од клетките на телото, како крик за помош. Ова е можеби најдобрата дефиниција за цитокини. Кога клетката е оштетена или нападната од патоген организам, макрофагите и оштетените клетки ослободуваат цитокини. Тие вклучуваат фактори како што се интерлеукин, интерферон и фактор на туморска некроза-алфа. Последново, исто така, докажува дека уништувањето на туморското ткиво е контролирано од имунолошкиот систем. Кога се ослободуваат цитокините, тие регрутираат специфични имунолошки клетки, како што се белите крвни зрнца и Т и Б-клетките.

Цитокините, исто така, сигнализираат одредена цел што овие клетки мора да ја исполнат. Цитокините и антителата се сосема различни, бидејќи антителата се она што е поврзано со антигените, тие му овозможуваат на имунолошкиот систем да ги идентификува инвазивните странски организми. Така, може да се направи аналогија: цитокините се главниот алармен сигнал за напаѓачите, а антителата се извидници. Процесот на анализа на цитокините се нарекува определување на цитокини.

Генерални информации

Цитокини (цитокини) [грчки. kytos - сад, тука - клетка и кинео - се движат, поттикнуваат] - голема и разновидна група на мали (молекуларна тежина од 8 до 80 kDa) медијатори од протеинска природа - посредни молекули („комуникациски протеини“) вклучени во меѓуклеточната пренос на сигнал главно во имунолошкиот систем.

Цитокините вклучуваат тумор некроза фактор, интерферони, голем број интерлеукини, итн. Цитокините, кои се синтетизираат од лимфоцитите и се регулатори на пролиферацијата и диференцијацијата, особено на хематопоетските клетки и клетките на имунолошкиот систем, се нарекуваат лимфокини.

Сите клетки на имунолошкиот систем имаат специфични функции и работат во јасно координирана интеракција, која ја обезбедуваат специјални биолошки активни супстанции - цитокини - регулатори на имунолошките реакции. Цитокините се специфични протеини со помош на кои различните клетки на имунолошкиот систем можат да разменуваат информации меѓу себе и да ги координираат дејствата.

Множеството и количините на цитокини кои делуваат на рецепторите на клеточната површина - „цитокинското милје“ - претставуваат матрица на сигнали кои комуницираат и често се менуваат. Овие сигнали се сложени поради широката разновидност на цитокински рецептори и затоа што секој цитокин може да активира или потисне неколку процеси, вклучувајќи ја сопствената синтеза и синтезата на други цитокини, како и формирањето и појавата на цитокински рецептори на површината на клетката.

Меѓуклеточната сигнализација во имунолошкиот систем се врши преку директна контактна интеракција помеѓу клетките или со помош на медијатори на меѓуклеточни интеракции. При проучувањето на диференцијацијата на имунокомпетентните и хематопоетските клетки, како и механизмите на меѓуклеточната интеракција што го формираат имунолошкиот одговор, беше откриена голема и разновидна група растворливи медијатори од протеинска природа - посредни молекули („комуникациски протеини“) вклучени во меѓуклеточната пренос на сигнал - цитокини.

Хормоните генерално се исклучени од оваа категорија врз основа на ендокрината (наместо паракрината или автокрината) природа на нивното дејство. (види Цитокини: механизми на пренос на хормонски сигнал). Заедно со хормоните и невротрансмитерите, тие ја формираат основата на хемискиот сигнален јазик со кој се регулира морфогенезата и регенерацијата на ткивото во повеќеклеточниот организам.

Тие играат централна улога во позитивното и негативното регулирање на имунолошкиот одговор. До денес, повеќе од стотина цитокини се откриени и проучувани кај луѓето во различен степен, како што беше споменато погоре, а извештаите за откривање на нови постојано се појавуваат. За некои, добиени се генетски инженерски аналози. Цитокините дејствуваат преку активирање на цитокинските рецептори.

А. Интерферони (IFN):

1. Природно IFN (1-ва генерација):

2. Рекомбинантна IFN (втора генерација):

а) со кратко дејство:

IFN a2b: интрон-А

IFN β: Авонекс, итн.

(пегилиран IFN): пегинтерферон

Б. Индуктори на интерферон (интерфероногени):

1. Синтетички– циклоферон, тилорон, дибазол и сл.

2. Природно– Ридостин итн.

ВО. Интерлеукини : рекомбинантен интерлеукин-2 (ронколеукин, алдеслеукин, пролеукин, ) , рекомбинантен интерлеукин 1-бета (беталеукин).

Г. Фактори кои стимулираат колонии (молграмостим, итн.)

Пептидни препарати

Тимични пептидни препарати .

Пептидни соединенија произведени од тимусната жлезда го стимулира созревањето на Т-лимфоцитите(тимопоетини).

Со првично ниски нивоа, препаратите на типични пептиди го зголемуваат бројот на Т-клетките и нивната функционална активност.

Основачот на првата генерација на тимусните лекови во Русија беше Тактивин, кој е комплекс од пептиди извлечени од тимусната жлезда на говедата. Подготовките кои содржат комплекс на тимусни пептиди исто така вклучуваат Тималин, Тимоптини други, и на оние кои содржат екстракти од тимусот - Тимостимулин и Вилосен.

Пептидни препарати од говедски тимус Тималин, тимостимулинсе администрира интрамускулно и тактивин, тимоптин- под кожата, главно во случај на недостаток на клеточен имунитет:

За Т-имунодефициенција,

Вирусни инфекции,

За спречување на инфекции при терапија со зрачење и хемотерапија на тумори.

Клиничката ефективност на лековите против тимусот од првата генерација е несомнена, но тие имаат еден недостаток: тие се неодвоена мешавина од биолошки активни пептиди кои се доста тешко да се стандардизираат.

Напредокот во полето на лекови од тимусно потекло се одвиваше преку создавање на лекови од втората и третата генерација - синтетички аналози на природни тимусни хормони или фрагменти од овие хормони со биолошка активност.

Модерен лек Имунофан -хексапептид, синтетички аналог на активниот центар на тимопоетин, се користи за имунодефициенција и тумори. Лекот го стимулира формирањето на IL-2 од страна на имунокомпетентните клетки, ја зголемува чувствителноста на лимфоидните клетки на овој лимфокин, го намалува производството на TNF (фактор на туморска некроза) и има регулаторен ефект врз производството на имунолошки медијатори (воспаление) и имуноглобулини .

Пептидни препарати на коскена срцевина

Миелопиддобиени од култура на клетки на коскената срцевина на цицачи (телиња, свињи). Механизмот на дејство на лекот е поврзан со стимулација на пролиферација и функционална активност на Б и Т-клетките.

Во телото, целта на оваа дрога се смета за Б-лимфоцити.Ако имуно- или хематопоезата е нарушена, администрацијата на миелопид доведува до зголемување на општата митотична активност на клетките на коскената срцевина и насоката на нивната диференцијација кон зрели Б-лимфоцити.

Миелопид се користи во комплексна терапија на секундарни состојби на имунодефициенција со доминантно оштетување на хуморалниот имунитет, за спречување на инфективни компликации по операција, траума, остеомиелитис, неспецифични белодробни заболувања, хронична пиодерма. Несакани ефекти на лекот се вртоглавица, слабост, гадење, хиперемија и болка на местото на инјектирање.

Сите лекови од оваа група се контраиндицирани кај бремени жени, миелопид и имунофан се контраиндицирани во присуство на Rh конфликт помеѓу мајката и фетусот.

Имуноглобулински препарати

Човечки имуноглобулини

а) Имуноглобулини за интрамускулна администрација

Неспецифични:нормален човечки имуноглобулин

Специфично:имуноглобулин против хуман хепатитис Б, хуман имуноглобулин антистафилококен, хуман имуноглобулин антитетанус, човечки имуноглобулин против енцефалитис што го пренесува крлежот, човечки имуноглобулин против вирусот на беснило итн.

б) Имуноглобулини за интравенска администрација

Неспецифични:нормален човечки имуноглобулин за интравенска администрација (габриглобин, имуновенин, интраглобин, хумаглобин)

Специфично:имуноглобулин против хуман хепатитис Б (неохепатект), пентаглобин (содржи антибактериски IgM, IgG, IgA), имуноглобулин против цитомегаловирус (цитотект), човечки имуноглобулин против енцефалитис што го пренесува крлежот, ИГ против беснило итн.

в) Имуноглобулини за орална употреба:подготовка на имуноглобулински комплекс (ICP) за ентерална употреба кај акутни цревни инфекции; анти-ротавирус имуноглобулин за орална администрација.

Хетерологни имуноглобулини:

имуноглобулин против беснило од коњски серум, поливалентен коњски серум против гангреноза итн.

Подготовките на неспецифични имуноглобулини се користат за примарни и секундарни имунодефициенција, препаратите на специфични имуноглобулини се користат за соодветни инфекции (за терапевтски или профилактички цели).

Цитокини и лекови базирани на нив

Регулирањето на развиениот имунолошки одговор го вршат цитокини - комплексен комплекс на ендогени имунорегулаторни молекули, кои се основа за создавање на голема група на природни и рекомбинантни имуномодулаторни лекови.

Интерферони (IFN):

1. Природно IFN (1-ва генерација):

Алфаферони: човечки леукоцити IFN, итн.

Бетаферони: човечки фибробласт IFN, итн.

2. Рекомбинантна IFN (втора генерација):

а) со кратко дејство:

IFN a2a: реаферон, виферон итн.

IFN a2b: интрон-А

IFN β: Авонекс, итн.

б) продолжено дејство(пегилиран IFN): пегинтерферон (IFN a2b + полиетилен гликол) итн.

Главната насока на дејство на IFN лековите се Т-лимфоцитите (природни клетки убијци и цитотоксични Т-лимфоцити).

Природни интерферони се добиваат во култура на леукоцитни клетки од донаторска крв (во култура на лимфобластоидни и други клетки) под влијание на индуктор вирус.

Рекомбинантните интерферони се добиваат со методот на генетски инженеринг - со одгледување бактериски соеви кои во својот генетски апарат содржат интегриран рекомбинантен плазмид на генот на човечкиот интерферон.

Интерфероните имаат антивирусно, антитуморно и имуномодулаторно дејство.

Како антивирусни агенси, препаратите од интерферон се најефективни во третманот на херпетичните заболувања на очите (локално во форма на капки, субконјуктивално), херпес симплекс локализиран на кожата, мукозните мембрани и гениталиите, херпес зостер (локално во форма на хидрогел- маст заснован), акутен и хроничен вирусен хепатитис Б и Ц (парентерален, ректален во супозитории), во третман и превенција на грип и АРВИ (интраназален во форма на капки). Кај ХИВ инфекцијата, препаратите со рекомбинантен интерферон ги нормализираат имунолошките параметри, ја намалуваат сериозноста на болеста во повеќе од 50% од случаите и предизвикуваат намалување на нивото на виремија и содржината на серумските маркери на болеста. За СИДА, се спроведува комбинирана терапија со азидотимидин.

Антитуморното дејство на интерферонските лекови е поврзано со антипролиферативно дејство и стимулација на активноста на природните клетки убијци. IFN-алфа, IFN-алфа 2a, IFN-алфа-2b, IFN-алфа-n1, IFN-бета се користат како антитуморни агенси.

IFN-beta-lb се користи како имуномодулатор за мултиплекс склероза.

Лековите со интерферон предизвикуваат слично несакани ефекти. Карактеристично: синдром сличен на грип; промени во централниот нервен систем: вртоглавица, заматен вид, конфузија, депресија, несоница, парестезија, тремор. Од гастроинтестиналниот тракт: губење на апетит, гадење; од страна на кардиоваскуларниот систем, може да се појават симптоми на срцева слабост; од уринарниот систем - протеинурија; од хематопоетскиот систем - минлива леукопенија. Може да се јават и осип, чешање, алопеција, привремена импотенција и крварење од носот.

Индуктори на интерферон (интерфероногени):

1. Синтетички – циклоферон, тилорон, полудан и др.

2. Природно – Ридостин итн.

Индукторите на интерферон се лекови кои ја подобруваат синтезата на ендогениот интерферон. Овие лекови имаат голем број на предности во споредба со рекомбинантните интерферони. Тие немаат антигенска активност. Стимулираната синтеза на ендогени интерферон не предизвикува хиперинтерферонемија.

Тилорон(амиксин) е синтетичко соединение со ниска молекуларна тежина и е орален индуктор на интерферон. Има широк спектар на антивирусно дејство против ДНК и РНК вирусите. Како антивирусно и имуномодулаторно средство, се користи за превенција и третман на грип, АРВИ, хепатитис А, за третман на вирусен хепатитис, херпес симплекс (вклучувајќи урогенитален) и херпес зостер, во сложената терапија на хламидијални инфекции, невровирусни и заразни-алергиски заболувања и секундарни имунодефициенција. Лекот добро се поднесува. Можни се диспептични симптоми, краткотрајни морници и зголемен општ тонус, што не бара прекинување на лекот.

Полудане биосинтетички полирибонуклеотиден комплекс од полиаденилни и полиуридилни киселини (во еквимоларни соодноси). Лекот има изразен инхибиторен ефект врз вирусите на херпес симплекс. Се користи во форма на капки за очи и инјекции под конјунктивата. Лекот се препишува на возрасни за третман на вирусни заболувања на очите: херпетичен и аденовирусен конјунктивитис, кератоконјуктивитис, кератитис и кератоиридоциклитис (кератувеитис), иридоциклитис, хориоретинитис, оптички невритис.

Несакани ефектисе јавуваат ретко и се манифестираат со развој на алергиски реакции: чешање и чувство на туѓо тело во окото.

Циклоферон- индуктор на интерферон со ниска молекуларна тежина. Има антивирусно, имуномодулаторно и антиинфламаторно дејство. Циклоферон е ефикасен против вирусите на енцефалитис што се пренесуваат преку крлежи, херпес, цитомегаловирус, ХИВ итн. Има антихламидијално дејство. Ефикасно за системски заболувања на сврзното ткиво. Утврдени се радиопротективните и антиинфламаторните ефекти на лекот.

Арбидолсе пропишува орално за превенција и третман на грип и други акутни респираторни вирусни инфекции, како и за херпетични заболувања.

Интерлеукини:

рекомбинантен IL-2 (алдеслеукин, пролеукин, ронколеукин ) , рекомбинантен IL-1beta ( беталеукин).

Цитокинските препарати од природно потекло, кои содржат прилично голем сет на воспалителни цитокини и првата фаза од имунолошкиот одговор, се карактеризираат со повеќеслоен ефект врз човечкото тело. Овие лекови делуваат на клетките вклучени во воспалението, процесите на регенерација и имунолошкиот одговор.

Алдеслејкин- рекомбинантен аналог на IL-2. Има имуномодулаторно и антитуморно дејство. Го активира клеточниот имунитет. Ја подобрува пролиферацијата на Т-лимфоцитите и клеточните популации зависни од IL-2. Ја зголемува цитотоксичноста на лимфоцитите и клетките убијци, кои ги препознаваат и уништуваат клетките на туморот. Го подобрува производството на интерферон гама, TNF, IL-1. Се користи за рак на бубрезите.

Беталеикин- рекомбинантен човечки IL-1 бета. Стимулира леукопоеза и имунолошка одбрана. Се инјектира субкутано или интравенозно за гнојни процеси со имунодефициенција, за леукопенија како резултат на хемотерапија, за тумори.

Ронколеикин- рекомбинантен лек интерлеукин-2 - администриран интравенски за сепса со имунодефициенција, како и за рак на бубрезите.

Фактори кои стимулираат колонии:

Молграмостим(Леукомакс) е рекомбинантен препарат на човечки фактор за стимулирање на колонијата на гранулоцити-макрофаги. Стимулира леукопоеза и има имунотропна активност. Ја подобрува пролиферацијата и диференцијацијата на прекурсорите, ја зголемува содржината на зрели клетки во периферната крв, растот на гранулоцити, моноцити, макрофаги. Ја зголемува функционалната активност на зрелите неутрофили, ја подобрува фагоцитозата и оксидативниот метаболизам, обезбедувајќи механизми за фагоцитоза, ја зголемува цитотоксичноста против малигните клетки.

Филграстим(Неупоген) е рекомбинантен препарат на фактор за стимулирање на колонијата на човечки гранулоцити. Филграстим го регулира производството на неутрофили и нивното влегување во крвта од коскената срцевина.

Ленограстим- рекомбинантна подготовка на фактор за стимулирање на колонијата на човечки гранулоцити. Тоа е високо прочистен протеин. Тој е имуномодулатор и стимулатор на леукопоезата.

Синтетички имуностимуланти: левамизол, изопринозин полиоксидониум, галавит.

Левамизол(декарис), дериват на имидазол, се користи како имуностимулант, а исто така и како антихелминтик за аскаријаза. Имуностимулативните својства на левамизолот се поврзани со зголемена активност на макрофагите и Т-лимфоцитите.

Левамизолот се препишува орално за повторливи херпетични инфекции, хроничен вирусен хепатитис, автоимуни заболувања (ревматоиден артритис, системски лупус еритематозус, Кронова болест). Лекот се користи и за тумори на дебелото црево по хируршка, зрачење или медикаментозна терапија на тумори.

Изопринозин- лек кој содржи инозин. Ја стимулира активноста на макрофагите, производството на интерлеукини и пролиферацијата на Т-лимфоцитите.

Се пропишува орално за вирусни инфекции, хронични инфекции на респираторниот и уринарниот тракт, имунодефициенција.

Полиоксидониум- синтетичко полимерно соединение растворливо во вода. Лекот има имуностимулирачки и детоксикациски ефект, ја зголемува имунолошката отпорност на организмот против локални и генерализирани инфекции. Полиоксидониумот ги активира сите фактори на природна отпорност: клетките на моноцитно-макрофагиот систем, неутрофилите и природните клетки убијци, зголемувајќи ја нивната функционална активност со првично намалени нивоа.

Галавит- дериват на фталхидразид. Особеноста на оваа дрога е присуството на не само имуномодулаторни, туку и изразени антиинфламаторни својства.

Лекови од други фармаколошки класи со имуностимулирачка активност

1. Адаптогени и хербални препарати (хербални лекови):препарати од ехинацеа (имунална), елеутерококус, женшен, Rhodiola rosea итн.

2. Витамини:аскорбинска киселина (витамин Ц), токоферол ацетат (витамин Е), ретинол ацетат (витамин А) (види дел „Витамини“).

Препарати од ехинацеаимаат имуностимулирачки и антиинфламаторни својства. Кога се земаат орално, овие лекови ја зголемуваат фагоцитната активност на макрофагите и неутрофилите, го стимулираат производството на интерлеукин-1, активноста на Т-помошните клетки и диференцијацијата на Б-лимфоцитите.

Препаратите од ехинацеа се користат за имунодефициенција и хронични инфламаторни заболувања. Особено, имуналенсе пропишува орално во капки за превенција и третман на акутни респираторни инфекции, како и заедно со антибактериски агенси за инфекции на кожата, респираторниот и уринарниот тракт.

Општи принципи за употреба на имуностимуланти кај пациенти со секундарна имунодефициенција

Најоправдана употреба на имуностимуланти се чини дека е во случаи на имунодефициенција, манифестирана со зголемен заразен морбидитет. Главната цел на имуностимулативните лекови остануваат секундарните имунодефицити, кои се манифестираат со чести рекурентни, тешко лекувани заразни и воспалителни болести од сите локации и од која било етиологија. Секој хроничен инфективно-воспалителен процес се заснова на промени во имунолошкиот систем, кои се една од причините за упорноста на овој процес.

· Имуномодулаторите се препишуваат во комплексна терапија истовремено со антибиотици, антифунгални, антипротозоали или антивирусни средства.

· При спроведување на мерки за имунорехабилитација, особено во случај на нецелосно закрепнување по акутна инфективна болест, имуномодулаторите може да се користат како монотерапија.

· Препорачливо е да се користат имуномодулатори против позадината на имунолошкиот мониторинг, кој треба да се спроведува без оглед на присуството или отсуството на првични промени во имунолошкиот систем.

· Имуномодулаторите кои делуваат на фагоцитната компонента на имунитетот може да им се препишат на пациенти и со идентификувани и со недијагностицирани нарушувања на имунолошкиот статус, т.е. основа за нивна употреба е клиничката слика.

Намалување на кој било параметар на имунитетот, откриено за време на имунодијагностичка студија кај практично здрава личност, НеЗадолжителное основа за препишување на имуномодулаторна терапија.

Контролни прашања:

1. Што се имуностимуланти, кои се индикациите за имунотерапија, на кои видови состојби на имунодефициенција се поделени?

2. Класификација на имуномодулатори според нивната преференцијална селективност на дејство?

3. Имуностимуланти од микробиско потекло и нивните синтетички аналози, нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

4. Ендогени имуностимуланти и нивни синтетички аналози, нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

5. Препарати од тимусни пептиди и пептиди на коскената срцевина: нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

6. Имуноглобулински препарати и интерферони (IFN), нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

7. Препарати на индуктори на интерферон (интерфероногени), нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

8. Препарати на интерлеукини и фактори кои стимулираат колонии, нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

9. Синтетички имуностимуланти, нивните фармаколошки својства, индикации за употреба, контраиндикации, несакани ефекти?

10. Лекови од други фармаколошки класи со имуностимулирачка активност и општи принципи на употреба на имуностимуланти кај пациенти со секундарни имунодефициенција?