Virkningen av cytokiner på celler utføres gjennom. Cytokiner. Antiviral immunitet molekylære og cellulære mekanismer, utviklingsmønstre og immunopatho

Inntil nylig var kreft i stadium 4 faktisk en dødsdom for pasienten. Tradisjonelle behandlingsmetoder hjalp lite, all terapi var begrenset til å lindre symptomer. Imidlertid begynte de for flere tiår siden å aktivt utvikle immunonkologi og spesielt cytokinbehandling - en metode for behandling med legemidler basert på kroppsproteiner, som ifølge anmeldelser er veldig effektiv. Klinikken for onkoimmunologi og cytokinbehandling i Moskva regnes som en av de beste i verden for sine positive indikatorer.

Hva er cytokinbehandling

Denne behandlingsmetoden har utviklet seg på grunnlag av immunonkologi, en gren av onkologi som studerer immunsystemets funksjon i kreft. Metoden er basert på behandling av kreft og andre sykdommer med legemidler basert på proteiner (cytokiner) i menneskekroppen. Under visse forhold kan de ødelegge forskjellige patogener: fremmede celler, virus, antigener, endotoksiner, etc. Hvordan cytokiner fungerer:

• aktivering av kroppens immunologiske respons på angrep av patogener;
• kontroll av immunsystemets arbeid, drepeceller (elementer som direkte bekjemper sykdommen);
• provosere fornyelse av cellemassen til en sunn en;
• normalisering av kroppssystemene.

Positiv handling

Å legge til arbeid med cytokiner i den komplekse behandlingen av onkologi bidrar til å oppnå absolutt positiv terapi hos 10-30% av pasientene, og delvis suksess når 90%. Det kan virke som om dette ikke er nok, men for alvorlige kreftsvulster i de siste stadiene er dette en enorm prestasjon. Videre kan og bør teknikken kombineres med tradisjonelle metoder (medisiner, cellegift).

Cytokinbehandling virker kvalitativt og punktvis mot svulster, metastaser og har samtidig ingen toksisk effekt på kroppen. Hver for seg er det verdt å merke seg en positiv økning i kvaliteten på cellegift. Teknikken har allerede bevist sin effektivitet i kliniske studier (i Russland kan mer enn 50 patologier av forskjellige typer behandles med denne teknikken). I tillegg til onkologiske sykdommer, kjemper cytokinbehandling vellykket mot andre patologier:

• onkologi opp til trinn 4;
• viral hepatitt B, C;
• melanom;
• Kaposis sarkom på bakgrunn av HIV;
• AIDS og HIV;
• SARS, influensa, bakterielle tarm- og rotavirusinfeksjoner;
• tuberkulose;
• helvetesild;
• schizofreni;
• multippel sklerose.

Oncoimmunologi og cytokinbehandling

Faktisk forekommer alle ondartede svulster med alvorlig forløp på bakgrunn av undertrykt immunitet. Oncoimmunologer (spesialister i immuno-onkologi) utvikler, på bakgrunn av kliniske studier, nye metoder og medisiner for behandling av kreft, basert på immunsystemets handlinger. Metoden for cytokinbehandling er basert på bruk av cytokiner, spesielle proteiner, og selve teknikken dukket opp på 80 -tallet av 1900 -tallet. Hovedproblemet var den høye toksisiteten til stoffene. Moderne medisiner basert på cytokiner har en toksisitet 100 ganger lavere.

Funksjoner av cytokiner i kroppen

Det er en enorm mengde cytokiner i menneskekroppen, de utfører alle forskjellige funksjoner. Cytokinbehandling bruker dette mangfoldet til å behandle et bredt spekter av sykdommer og for å aktivere kroppens indre prosesser. Det er bevist at menneskelige systemer faktisk kan bekjempe ethvert problem. Det viktigste er å starte de nødvendige prosessene. Funksjoner av cytokiner i kroppen:

• kontroll over varigheten og kvaliteten på immunresponsen;
• antiinflammatoriske cytokiner kontrollerer betennelse;
• stimulere utviklingen av autoimmune reaksjoner (antiinflammatoriske og proinflammatoriske cytokiner);
• deltakelse i mekanikken for allergi;
• reduksjon av svulsten eller dens ødeleggelse;
• stimulering eller undertrykkelse av cellevekst;
• bremse utviklingen av onkologi;
• koordinering av immunsystemet, det endokrine og nervesystemet;
• forebygging av tilbakefall av svulster;
• opprettholde homeostase (sunn konstant) i kroppen.

Antall undersøkte cytokinproteiner har allerede overskredet 200 navn. Interaksjonene mellom cytokiner er komplekse med forskjellige funksjoner. I utgangspunktet er de delt inn i henhold til type aktivitet. En forenklet klassifisering forutsetter en inndeling i henhold til biologiske effekter: inflammatoriske regulatorer (antiinflammatoriske og proinflammatoriske cytokiner), regulering av cellulær immunitet og humoral immundeling. En mer presis systematisering bryter ned proteiner i henhold til deres virkning. Typer cytokiner:

• regulatorer av immunaktivitet (interleukiner og deres biologiske funksjoner sikrer riktig interaksjon av immunitet med andre kroppssystemer);
• antivirale regulatorer - interferoner;
• TNF (tumornekrosefaktorer) - regulatoriske eller toksiske effekter på celler;
• kjemokiner - kontroll av bevegelsen av alle typer leukocytter, andre celler;
• vekstfaktorer - kontroll av cellevekst;
• kolonistimulerende faktorer - stimulerer utviklingen av hematopoietiske celler.

Cytokiner som medisiner

Ingaron er et cytokin terapeutisk middel for å forsterke effekten av cellegift, samtidig som det beskytter kroppen mot toksiske effekter. I tillegg reduserer det mulig forekomst av metastaser og svulster. Ingaron -stoff provoserer utviklingen av immunitet, som etter kjemoterapi ikke tillater utvikling av smittsomme sykdommer, vil redusere behovet for antibakterielle legemidler. Verktøyet har minimal toksisitet sammenlignet med vestlige kolleger.

Legemidlet Refnot er rettet mot å begrense utviklingen av neoplasmer på grunn av TNF -cytokinet i sammensetningen. Midlet har også en kvalitativt redusert toksisitet, som tillater subkutan eller intravenøs administrering, stimulerer ødeleggelse av ondartede svulster uten å påvirke de medfølgende vevene. For å bestemme behandlingsdynamikken kreves 1-2 kurs. For å oppnå maksimal effekt brukes begge legemidlene i kombinasjon for å aktivere nødvendige cytokiner i onkologi.

Bivirkninger

Behandling med cytokiner kan forårsake negative effekter avhengig av sykdommens morfologi, pasientens generelle tilstand og kombinasjonen av legemidler. For det meste utgjør bivirkninger ikke en fare for pasienten, men indikerer en reaksjon av svulsten på stoffet. Når sekundære reaksjoner oppstår, blir behandlingsforløpet suspendert eller behandlingsregimet justert. Mulige negative manifestasjoner av kroppen:

• en økning i kroppstemperatur med 2-3 grader 4-6 timer etter introduksjon av cytokiner;
• ømhet og rødhet på injeksjonsstedet;
• forgiftning av kroppen med svulstforfallsprodukter (ved stor formasjon).

Hvem metoden for cytokinbehandling ikke er egnet for

Cytokinbaserte legemidler har praktisk talt ingen kontraindikasjoner og kan brukes for enhver pasient. Som med andre medisiner er det imidlertid en rekke pasienter som ikke anbefales å bruke denne behandlingsmetoden. Ikke bruk cytokinbehandling for gravide, under amming, i nærvær av autoimmune sykdommer, en sjelden personlig allergi mot legemidler.

Kostnad for cytokinbehandling

Effektiv bruk av cytokinmedisiner oppnås i spesialiserte sentre (for eksempel er Center for Oncoimmunology and Cytokine Therapy i Moskva den beste klinikken etter redning av pasienter). Kostnaden for denne typen behandling varierer sterkt avhengig av hvilken type medisin som brukes og den spesifikke sykdommen. Omtrentlige priser for noen cytokinmedisiner i Moskva.

Dette kapitlet vil vurdere en integrert tilnærming til vurdering av cytokinsystemet ved bruk av de tidligere beskrevne moderne forskningsmetodene.

Først skisserer vi de grunnleggende konseptene til cytokinsystemet.

Cytokiner regnes for tiden som protein-peptidmolekyler produsert av forskjellige celler i kroppen og utfører intercellulære og intersysteminteraksjoner. Cytokiner er universelle regulatorer av cellers livssyklus, de styrer prosessene med differensiering, spredning, funksjonell aktivering og apoptose av sistnevnte.

Cytokiner produsert av celler i immunsystemet kalles immunocytokiner; de er en klasse med oppløselige peptidmediatorer av immunsystemet som er nødvendige for dets utvikling, funksjon og interaksjon med andre systemer i kroppen (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Som regulatoriske molekyler spiller cytokiner en viktig rolle i reaksjonene av medfødt og adaptiv immunitet, sikrer deres sammenkobling, kontrollerer hematopoiesis, betennelse, sårheling, dannelse av nye blodkar (angiogenese) og mange andre vitale prosesser.

For tiden er det flere forskjellige klassifiseringer av cytokiner, med tanke på deres struktur, funksjonelle aktivitet, opprinnelse, type cytokinreseptorer. Tradisjonelt, i samsvar med biologiske effekter, er det vanlig å skille mellom følgende grupper av cytokiner.

1. Interleukiner(IL-1-IL-33) er sekretoriske regulatoriske proteiner i immunsystemet som gir mediatorinteraksjoner i immunsystemet og dets forbindelse med andre systemer i kroppen. Interleukiner er klassifisert i henhold til deres funksjonelle aktivitet i pro- og antiinflammatoriske cytokiner, lymfocyttvekstfaktorer, regulatoriske cytokiner, etc.

3. Tumornekrosefaktorer (TNF)- cytokiner med cytotoksiske og regulatoriske handlinger: TNFa og lymfotoksiner (LT).

4. Hematopoietiske cellevekstfaktorer-stamcellevekstfaktor (Kit-ligand), IL-3, IL-7, IL-11, erytropoietin, trobopoietin, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor-GM-CSF, granulocytt CSF-G-CSF, makrofag-

ny KSF - M -KSF).

5. Kemokiner- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - regulatorer av kjemotaksier av forskjellige celletyper.

6. Ikke-lymfoide cellevekstfaktorer- regulatorer for vekst, differensiering og funksjonell aktivitet av celler i forskjellige vev som tilhører (fibroblastvekstfaktor - FGF, vekstfaktor for endotelceller, epidermal vekstfaktor - EGF i epidermis) og transformerende vekstfaktorer (TGFβ, TGFα).

Blant annet har de siste årene en faktor som hemmer migreringen av makrofager (migrasjonshemmende faktor - MIF), som regnes som et nevrohormon med cytokin og enzymatisk aktivitet, blitt aktivt studert (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Cytokiner er forskjellige i struktur, biologisk aktivitet og andre egenskaper. Imidlertid har cytokiner sammen med forskjellene generelle egenskaper, karakteristisk for denne klassen av bioregulerende molekyler.

1. Cytokiner er som regel glykosylerte polypeptider med gjennomsnittlig molekylvekt (mindre enn 30 kD).

2. Cytokiner produseres av celler i immunsystemet og andre celler (for eksempel endotel, fibroblaster, etc.) som respons på en aktiverende stimulus (patogenassosierte molekylstrukturer, antigener, cytokiner, etc.) og deltar i reaksjonene av medfødt og adaptiv immunitet, som regulerer deres styrke og varighet. Noen cytokiner syntetiseres konstitutivt.

3. Sekresjon av cytokiner er en kortsiktig prosess. Cytokiner lagres ikke som forhåndsformede molekyler, men deres

syntese begynner alltid med gentranskripsjon. Celler produserer cytokiner i lave konsentrasjoner (pikogram per milliliter).

4. I de fleste tilfeller produseres cytokiner og virker på målceller i umiddelbar nærhet (kortdistansevirkning). Hovedstedet for cytokinvirkning er den intercellulære synapsen.

5. Overflødighet system av cytokiner manifesteres i det faktum at hver celletype er i stand til å produsere flere cytokiner, og hvert cytokin kan skilles ut av forskjellige celler.

6. Alle cytokiner er preget av pleiotropi, eller polyfunksjonaliteten til handlingen. Dermed skyldes manifestasjonen av tegn på betennelse påvirkning av IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Duplisering av funksjoner sikrer påliteligheten til cytokinsystemet.

7. Virkningen av cytokiner på målcellene formidles av høyspesifikke membraner med høy affinitet, som er transmembrane glykoproteiner, vanligvis bestående av mer enn én underenhet. Den ekstracellulære delen av reseptorene er ansvarlig for cytokinbinding. Det er reseptorer som eliminerer overskytende cytokiner i det patologiske fokuset. Dette er de såkalte trap-reseptorene. Løselige reseptorer er det ekstracellulære domenet til membranreseptoren, atskilt med et enzym. Løselige reseptorer er i stand til å nøytralisere cytokiner, delta i transporten til betennelsesfokuset og i utskillelsen fra kroppen.

8. Cytokiner arbeide etter prinsippet om et nettverk. De kan opptre sammen. Mange funksjoner som opprinnelig ble tilskrevet et enkelt cytokin ser ut til å være formidlet av den samordnede virkningen av flere cytokiner. (synergi handlinger). Eksempler på synergistiske interaksjoner mellom cytokiner er stimulering av inflammatoriske reaksjoner (IL-1, IL-6 og TNF-a), samt IgE-syntese

(IL-4, IL-5 og IL-13).

Noen cytokiner induserer syntesen av andre cytokiner (kaskade). Kaskadevirkningen av cytokiner er nødvendig for utvikling av inflammatoriske og immunresponser. Noen cytokiners evne til å forbedre eller svekke produksjonen av andre bestemmer viktige positive og negative reguleringsmekanismer.

Den antagonistiske effekten av cytokiner er kjent, for eksempel kan produksjonen av IL-6 som respons på en økning i konsentrasjonen av TNFα være

en negativ reguleringsmekanisme for å kontrollere produksjonen av denne mediatoren under betennelse.

Cytokinregulering av målcellefunksjoner utføres ved bruk av autokrine, parakrin eller endokrine mekanismer. Noen cytokiner (IL-1, IL-6, TNFα, etc.) er i stand til å delta i implementeringen av alle de ovennevnte mekanismene.

Cellens respons på påvirkning av et cytokin avhenger av flere faktorer:

Fra typen celler og deres første funksjonelle aktivitet;

Fra den lokale konsentrasjonen av cytokinet;

Fra nærvær av andre mediatormolekyler.

Dermed danner produsentceller, cytokiner og deres spesifikke reseptorer på målceller et enkelt mediatornettverk. Det er settet med regulatoriske peptider, ikke individuelle cytokiner, som bestemmer den endelige celleresponsen. For tiden regnes cytokinsystemet som et universelt reguleringssystem på nivået av hele organismen, som sikrer utvikling av beskyttende reaksjoner (for eksempel under infeksjon).

I de siste årene har ideen om et cytokinsystem som kombinerer:

1) produsentceller;

2) oppløselige cytokiner og deres antagonister;

3) målceller og deres reseptorer (fig. 7.1).

Brudd på forskjellige komponenter i cytokinsystemet fører til utvikling av mange patologiske prosesser, og derfor er identifisering av defekter i dette reguleringssystemet viktig for riktig diagnose og utnevnelse av adekvat terapi.

La oss først vurdere hovedkomponentene i cytokinsystemet.

Cytokinproduserende celler

I. Hovedgruppen av cytokinproduserende celler i den adaptive immunresponsen er lymfocytter. Hvileceller skiller ikke ut cytokiner. Med antigengjenkjenning og med deltakelse av reseptorinteraksjoner (CD28-CD80 / 86 for T-lymfocytter og CD40-CD40L for B-lymfocytter) oppstår celleaktivering, noe som fører til transkripsjon av cytokingener, translasjon og sekresjon av glykosylerte peptider til intercellulære rom.

Ris. 7.1. Cytokinesystem

CD4 T-hjelpere er representert ved subpopulasjoner: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, som er forskjellige i spekteret av utskilte cytokiner som respons på forskjellige antigener.

Th0 produserer et bredt spekter av cytokiner ved svært lave konsentrasjoner.

Differensieringsretning Th0 bestemmer utviklingen av to former for immunrespons med en overvekt av humorale eller cellulære mekanismer.

Antigenets natur, konsentrasjon, lokalisering i cellen, typen antigenpresenterende celler og et bestemt sett med cytokiner regulerer retningen for Th0-differensiering.

Etter fangst og behandling av antigen presenterer dendritiske celler antigeniske peptider for Th0 -celler og produserer cytokiner som regulerer retningen for deres differensiering til effektorceller. Rollen til individuelle cytokiner i denne prosessen er vist i fig. 7.2. IL-12 induserer syntese av IFNy av T-lymfocytter og] ​​HGC. IFNu gir differensiering av Th1, som begynner å utskille cytokiner (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, lymfotoksiner), som regulerer utviklingen av reaksjoner på intracellulære patogener

(forsinket type overfølsomhet (HRT) og forskjellige typer cellulær cytotoksisitet).

IL-4 sikrer differensiering av Th0 til Th2. Aktiverte Th2 produserer cytokiner (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, etc.), som bestemmer spredning av B-lymfocytter, deres videre differensiering til plasmaceller og utvikling av antistoffresponser, hovedsakelig mot ekstracellulære patogener.

IFNu regulerer Th2-cellers funksjon negativt, og omvendt hemmer IL-4, IL-10 utskilt av Th2 Th1-funksjonen (figur 7.3). Den molekylære mekanismen for denne forskriften er forbundet med transkripsjonsfaktorer. Uttrykket av T-bet og STAT4, bestemt av IFNy, leder differensiering av T-celler langs Th1-banen og undertrykker utviklingen av Th2. IL-4 induserer ekspresjonen av GATA-3 og STAT6, som henholdsvis sikrer omdannelse av naiv THO til Th2-celler (figur 7.2).

De siste årene har en spesiell delpopulasjon av T-hjelperceller (Th17), som produserer IL-17, blitt beskrevet. Medlemmer av IL-17-familien kan uttrykkes av aktiverte minneceller (CD4CD45RO), y5T-celler, NKT-celler, nøytrofiler, monocytter under påvirkning av IL-23, IL-6, TGFβ produsert av makrofager og dendritiske celler. Den viktigste differensierende faktoren hos mennesker er ROR-C, hos mus-ROR-γ l Kardinalrollen til IL-17 i utviklingen av kronisk betennelse og autoimmun patologi er vist (se figur 7.2).

I tillegg kan T-lymfocytter i thymus differensiere til naturlige regulatoriske celler (Treg) som uttrykker overflatemarkører CD4 + CD25 + og transkripsjonsfaktoren FOXP3. Disse cellene er i stand til å undertrykke immunresponsen formidlet av Th1 og Th2 celler gjennom direkte intercellulær kontakt og syntese av TGFβ og IL-10.

Differensieringsordninger for Th0 -kloner og cytokiner som skilles ut av dem er vist på fig. 7.2 og 7.3 (se også fargeinnsats).

T-cytotoksiske celler (CD8 +), naturlige drepeceller er svake produsenter av cytokiner som interferoner, TNF-a og lymfotoksiner.

Overdreven aktivering av en av Th -underpopulasjonene kan bestemme utviklingen av en av variantene av immunresponsen. Kronisk ubalanse av Th -aktivering kan føre til dannelse av immunopatologiske tilstander forbundet med manifestasjonen av

allergi, autoimmun patologi, kroniske inflammatoriske prosesser, etc.

Ris. 7.2. Ulike subpopulasjoner av T-lymfocytter som produserer cytokiner

II. I det medfødte immunitetssystemet er de viktigste produsentene av cytokiner myeloide celler. Ved hjelp av tolllignende reseptorer (TLR) gjenkjenner de lignende molekylære strukturer av forskjellige patogener, de såkalte patogenassosierte molekylære mønstrene (RAMP), for eksempel lipopolysakkarid (LPS) av gramnegative bakterier, lipoteichoinsyrer, peptidoglykaner av grampositive mikroorganismer, flagellin, DNA rikt på G-repetisjoner, etc. Som et resultat

Denne interaksjonen med TLR utløser en intracellulær signaltransduksjonskaskade som fører til uttrykk for gener i to hovedgrupper av cytokiner: proinflammatorisk og IFN type 1 (figur 7.4, se også fargeinnsats). Hovedsakelig fremkaller disse cytokinene (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, kjemokiner, etc.) utvikling av betennelse og er involvert i å beskytte kroppen mot bakterielle og virusinfeksjoner.

Ris. 7.3. Spekteret av cytokiner som utskilles av TH1 og TH2 celler

III. Celler som ikke tilhører immunsystemet (celler i bindevev, epitel, endotel) utskiller konstitutivt autokrine vekstfaktorer (FGF, EGF, TGFR, etc.). og cytokiner som støtter spredning av hematopoietiske celler.

Cytokiner og deres antagonister er beskrevet i detalj i en rekke monografier (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ris. 7.4. TLR-mediert induksjon av cytokinproduksjon av medfødte immunceller

Overuttrykk av cytokiner er utrygt for kroppen og kan føre til utvikling av overdreven inflammatorisk respons, en akutt fase -respons. Ulike hemmere er involvert i reguleringen av produksjonen av proinflammatoriske cytokiner. Således er det beskrevet en rekke stoffer som ikke-spesifikt binder cytokinet IL-1 og forhindrer manifestasjon av dets biologiske virkning (a2-makroglobulin, C3-komponent av komplement, uromodulin). Spesifikke hemmere av IL-1 inkluderer oppløselige lokkemiddelreseptorer, antistoffer og en IL-1-reseptorantagonist (IL-1RA). Med utviklingen av betennelse er det en økning i ekspresjonen av IL-1RA-genet. Men selv normalt er denne antagonisten tilstede i blodet i høye konsentrasjoner (opptil 1 ng / ml eller mer), og blokkerer virkningen av endogen IL-1.

Målceller

Virkningen av cytokiner på målceller formidles gjennom spesifikke reseptorer som binder cytokiner med veldig høy affinitet, og individuelle cytokiner kan bruke

vanlige reseptorunderenheter. Hvert cytokin binder seg til sin spesifikke reseptor.

Cytokinreseptorer er transmembrane proteiner og er delt inn i 5 hovedtyper. Den vanligste er den såkalte hematopoietin-typen reseptor, som har to ekstracellulære domener, hvorav den ene inneholder en vanlig sekvens av aminosyrerester av to gjentakelser av tryptofan og serin, atskilt med en hvilken som helst aminosyre (WSXWS-motiv). Den andre typen reseptor kan ha to ekstracellulære domener med et stort antall konserverte cystein. Dette er reseptorer for IL-10 og IFN-familien. Den tredje typen er representert av cytokinreseptorer som tilhører TNF -gruppen. Den fjerde typen cytokinreseptorer tilhører superfamilien til immunglobulinreseptorer med ekstracellulære domener som i struktur ligner domenene til immunglobulinmolekyler. Den femte typen reseptor som binder molekyler i kjemokinfamilien er representert av transmembrane proteiner som krysser cellemembranen på 7 steder. Cytokinreseptorer kan eksistere i en løselig form, og beholde evnen til å binde ligander (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Cytokiner er i stand til å påvirke spredning, differensiering, funksjonell aktivitet og apoptose av målceller (se figur 7.1). Manifestasjonen av den biologiske aktiviteten til cytokiner i målceller avhenger av deltakelse av forskjellige intracellulære systemer i signaloverføring fra reseptoren, som er knyttet til egenskapene til målcellene. Signalet til apoptose utføres blant annet ved hjelp av en bestemt region i TNF-reseptorfamilien, det såkalte "død" -domenet (figur 7.5, se fargeinnsats). Differensiering og aktiveringssignaler overføres gjennom de intracellulære Jak -STAT -proteinene - signaltransdusere og aktivatorer for transkripsjon (figur 7.6, se fargeinnsats). G-proteiner er involvert i signalering fra kjemokiner, noe som fører til økt migrasjon og celleadhesjon.

En omfattende analyse av cytokinsystemet inkluderer følgende.

I. Evaluering av produsentceller.

1. Bestemmelse av uttrykk:

Reseptorer som gjenkjenner et patogen eller antigen TCR, TLR) på nivået av gener og proteinmolekyler (PCR, flowcytometri);

Adaptermolekyler som leder et signal som utløser transkripsjon av cytokingener (PCR, etc.);

Ris. 7.5. Signaloverføring fra TNF -reseptoren

Ris. 7.6. Jak -STAT - signalvei fra cytokinreseptorer av type 1

Cytokin -gener (PCR); proteinmolekyler av cytokiner (vurdering av cytokinsyntetiseringsfunksjonen til menneskelige mononukleære celler).

2. Kvantifisering av subpopulasjoner av celler som inneholder visse cytokiner: Th1, Th2 Th17 (metode for intracellulær farging av cytokiner); bestemmelse av antall celler som utskiller visse cytokiner (ELISPOT -metode, se kap. 4).

II. Evaluering av cytokiner og deres antagonister i biologiske medier av kroppen.

1. Testing av den biologiske aktiviteten til cytokiner.

2. Kvantitativ bestemmelse av cytokiner ved bruk av ELISA.

3. Immunhistokjemisk farging av cytokiner i vev.

4. Bestemmelse av forholdet mellom motsatte cytokiner (pro- og antiinflammatoriske), cytokiner og cytokinreseptorantagonister.

III. Evaluering av målceller.

1. Bestemmelse av ekspresjonen av cytokinreseptorer på nivået av gener og proteinmolekyler (PCR, flowcytometri -metode).

2. Bestemmelse av signalmolekyler i det intracellulære innholdet.

3. Bestemmelse av den funksjonelle aktiviteten til målceller.

For tiden er det utviklet mange metoder for å vurdere cytokinsystemet, som gir mangfoldig informasjon. Blant dem skiller de seg ut:

1) molekylærbiologiske metoder;

2) metoder for kvantitativ bestemmelse av cytokiner ved bruk av immunanalyse;

3) testing av den biologiske aktiviteten til cytokiner;

4) intracellulær farging av cytokiner;

5) ELISPOT-metode, som gjør det mulig å påvise cytokiner rundt en enkelt cytokinproduserende celle;

6) immunfluorescens.

Her er en kort beskrivelse av disse metodene.

Ved bruk av molekylærbiologiske metoder det er mulig å studere uttrykk for gener av cytokiner, deres reseptorer, signalmolekyler, for å studere polymorfismen til disse genene. De siste årene har det blitt utført et stort antall studier som avslørte sammenhenger mellom varianter av alleler av gener av molekyler i cytokinsystemet og predisposisjon

til en rekke sykdommer. Studiet av allelle varianter av cytokingener kan gi informasjon om den genetisk programmerte produksjonen av et bestemt cytokin. Den mest følsomme er sanntids polymerasekjedereaksjonen-RT-PCR (se kapittel 6). Hybridiseringsmetode in situ gjør det mulig å klargjøre vev og mobil lokalisering av ekspresjonen av cytokingener.

Den kvantitative bestemmelsen av cytokiner i biologiske væsker og i kulturer av peronale blodmononukleære celler ved hjelp av ELISA kan karakteriseres som følger. Siden cytokiner er lokale mediatorer, er det mer hensiktsmessig å måle nivåene i de tilsvarende vevene etter ekstraksjon av vevsproteiner eller i naturlige væsker, for eksempel i tårer, skylling fra hulrom, urin, fostervann, cerebrospinalvæske, etc. Cytokinnivåer i serum eller andre kroppsvæsker gjenspeiler den nåværende tilstanden til immunsystemet, dvs. syntese av cytokiner av kroppens celler in vivo.

Bestemmelse av nivåer av cytokinproduksjon av mononukleære celler i perifert blod (MNC) viser cellens funksjonelle tilstand. Spontan produksjon av MNC -cytokiner i kultur indikerer at celler allerede er aktivert in vivo. Syntesen av cytokiner indusert (av forskjellige sentralstimulerende midler, mitogener) gjenspeiler cellers potensielle reserveevne til å reagere på en antigen stimulans (spesielt på virkningen av legemidler). Redusert indusert produksjon av cytokiner kan tjene som et av tegnene på en immunsviktstilstand. Cytokiner er ikke spesifikke for et bestemt antigen. Derfor er den spesifikke diagnosen smittsomme, autoimmune og allergiske sykdommer ved å bestemme nivået av visse cytokiner umulig. Samtidig tillater vurderingen av cytokinnivåer å innhente data om alvorlighetsgraden av den inflammatoriske prosessen, overgangen til det systemiske nivået og prognosen, den funksjonelle aktiviteten til cellene i immunsystemet, forholdet mellom Th1- og Th2 -celler, som er svært viktig i differensialdiagnosen for en rekke smittsomme og immunopatologiske prosesser.

I biologiske medier kan cytokiner kvantifiseres ved bruk av en rekke immunoassay -metoder, bruk av polyklonale og monoklonale antistoffer (se kapittel 4). ELISA lar deg finne ut hva som er de eksakte konsentrasjonene av cytokiner i bio-

logiske kroppsvæsker. Enzymbundet immunosorbentanalyse av cytokiner har en rekke fordeler i forhold til andre metoder (høy sensitivitet, spesifisitet, uavhengighet fra tilstedeværelse av antagonister, muligheten for nøyaktig automatisert regnskap, regnskapsstandardisering). Imidlertid har denne metoden også sine begrensninger: ELISA karakteriserer ikke den biologiske aktiviteten til cytokiner, den kan gi falske resultater på grunn av kryssreagerende epitoper.

Biologisk testing utført på grunnlag av kunnskap om de grunnleggende egenskapene til cytokiner, deres virkning på målceller. Studien av de biologiske effektene av cytokiner har tillatt utvikling av fire typer cytokintesting:

1) ved induksjon av proliferasjon av målceller;

2) ved cytotoksisk effekt;

3) ved induksjon av differensiering av benmargsforfedre;

4) for antiviral virkning.

IL-1 bestemmes av den stimulerende effekten på spredning av murine tymocytter aktivert av mitogen in vitro; IL -2 - ved evnen til å stimulere den proliferative aktiviteten til lymfoblaster; TNFα og lymfotoksiner er testet for cytotoksisk virkning på musefibroblaster (L929). Kolonistimulerende faktorer evalueres for deres evne til å støtte veksten av benmargsforfedre i form av kolonier i agar. Den antivirale aktiviteten til IFN påvises ved inhibering av den cytopatiske virkningen av virus i kulturen av humane diploide fibroblaster og tumorlinjen til fibroblaster fra mus L-929.

Det er opprettet cellelinjer hvis vekst avhenger av tilstedeværelsen av visse cytokiner. Bord 7.1 er en liste over cellelinjer som brukes til cytokintesting. I henhold til evnen til å indusere spredning av sensitive målceller, blir biotesting av IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, etc. utført. Imidlertid er disse testmetodene er ikke tilstrekkelig sensitive og informative. Inhibitor- og antagonistmolekyler kan maskere den biologiske aktiviteten til cytokiner. Flere cytokiner viser generell biologisk aktivitet. Likevel er disse metodene ideelle for å teste den spesifikke aktiviteten til rekombinante cytokiner.

Tabell 7.1. Cellelinjer som brukes til å teste den biologiske aktiviteten til cytokiner

Slutten på bordet. 7.1

Lab 7-1

Bestemmelse av den biologiske aktiviteten til IL-1 ved den komitogene effekten på spredning av musetymocytter

Metoden for biologisk testing av IL-1 er basert på evnen til et cytokin til å stimulere spredning av murine tymocytter.

IL-1 kan bestemmes i kulturen av monocytter stimulert med LPS, så vel som i enhver biologisk væske i kroppen. Det er nødvendig å ta hensyn til en rekke detaljer.

1. Thymocytter av C3H / HeJ -mus stimulert til spredning av mitogener (concanavalin A - ConA og phytohemagglutinin - PHA) brukes til testing. Thymocytter C3H / HeJ ble ikke valgt ved en tilfeldighet: mus av denne innavlede linjen reagerer ikke på LPS, som kan være tilstede i testmaterialet og forårsake IL-1-produksjon.

2. Thymocytter reagerer på IL-2 og mitogener, derfor bør tilstedeværelsen av IL-2 og mitogener også bestemmes i preparater testet for IL-1.

Operasjons prosedyre

1. Få en suspensjon av tymocytter i en konsentrasjon på 12 × 106 / ml medium RPMI 1640 inneholdende 10% serum av embryoer til kyr og 2 -merkaptoetanol (5 × 10 -5 M).

2. Forbered en serie suksessive to ganger fortynninger av eksperimentelle (biologiske kroppsvæsker) og kontrollprøver. Biologiske væsker som inneholder IL-1 eller prøver hentet ved inkubasjon av mononukleære celler uten LPS og laboratoriestandard IL-1-holdig preparat brukes som kontroller. I 96-brønns runde bunnplater overføres 50 ul fra hver fortynning til 6 brønner.

3. I tre brønner i hver fortynning tilsettes 50 ul renset PHA (Wellcome) oppløst i fullstendig medium i en konsentrasjon på 3 ug / ml, og i de andre 3 brønnene - 50 ul medium.

4. Tilsett 50 ul tymocyttsuspensjon i hver brønn og inkuber i 48 timer ved 37 ° C.

6. Før slutten av dyrkingen tilsettes 50 ul av en løsning (1 μCi / ml) ["3H] -tymidin til brønnene og inkuberes i ytterligere 20 timer.

7. For å bestemme nivået av radioaktivitet, overføres kulturcellene til filterpapir ved hjelp av en automatisk celleoppsamler, filtrene tørkes og inkluderingen av etiketten bestemmes av en væskescintillasjonsteller.

8. Resultatene er uttrykt som en stimuleringsfaktor.

hvor m cp er gjennomsnittlig antall pulser i 3 hull.

Hvis tymocytter reagerer på stimulering med standard IL-1, indikerer stimuleringsindeksen for testprøven som overstiger 3 pålitelig IL-1-aktivitet.

Bioassay er den eneste metoden for å vurdere cytokinfunksjon, men denne metoden må suppleres med forskjellige typer passende kontroll for spesifisitet ved bruk av monoklonale antistoffer. Tilsetning av visse monoklonale antistoffer til cytokinet inn i kulturen blokkerer den biologiske aktiviteten til cytokinet, noe som viser at det påviste cytokinet fungerer som et signal for cellelinjespredning.

Bruk av bioassay for påvisning av interferon. Prinsippet om vurdering av den biologiske aktiviteten til IFN er basert på dets antivirale effekt, som bestemmes av graden av inhibering av multiplikasjonen av testviruset i cellekultur.

Celler som er følsomme for virkningen av IFN kan brukes i arbeidet: hovedsakelig trypsiniserte fibroblastceller fra kylling og menneskelige embryoer, transplanterte celler fra humane diploide fibroblaster og musecellekultur (L929).

Når du vurderer den antivirale effekten av IFN, er det tilrådelig å bruke virus med kort reproduksjonssyklus, høy følsomhet for virkningen av IFN: musencefalomyelittvirus, mus vesikulær stomatitt, etc.

Lab 7-2

Bestemmelse av interferonaktivitet

1. En suspensjon av diploide fibroblaster fra et menneskelig foster på et medium med 10% serum av storfeembryoer (cellekonsentrasjon-15-20 × 106 / ml) helles i sterile 96-brønns flatbunnede plater, 100 ul per brønn og plasseres i en CO 2 -inkubator ved en temperatur på 37 ° C.

2. Etter dannelsen av et komplett monolag fjernes vekstmediet fra brønnene og 100 ul av bærermediet tilsettes til hver brønn.

3. Titrering av IFN-aktivitet i testprøvene utføres ved metoden for tofoldige fortynninger på et monolag av fibroblaster.

Samtidig med prøvene blir musencefalomyelittvirus (VEM) introdusert i brønnene i en dose som forårsaker 100% celleskade 48 timer etter infeksjon.

4. For kontroll, bruk brønner med intakte (ubehandlede) celler infisert med viruset.

I hver studie brukes referanse -IFN -prøver med kjent aktivitet som referansemedisiner.

5. Plater med prøvefortynninger inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en atmosfære med 5% CO 2.

6. Nivået av IFN -aktivitet bestemmes av det gjensidige av den maksimale fortynning av testprøven, som hemmer den cytopatiske virkningen av viruset med 50%, og uttrykkes i aktivitetsenheter per ml.

7. For å bestemme typen IFN, legges antiserum mot IFNα, IFNβ eller IFNγ til systemet. Antiserum avbryter virkningen av det tilsvarende cytokinet, noe som gjør det mulig å identifisere typen IFN.

Bestemmelse av den biologiske aktiviteten til migrering av den hemmende faktoren. Foreløpig har det blitt dannet helt nye ideer om MYTENes natur og egenskaper, som ble oppdaget på 60 -tallet i forrige århundre som en formidler av mobil immunitet og forble uten behørig oppmerksomhet i mange år (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; David JR, 1966). Bare de siste 10-15 årene har det blitt klart: MYTE er en av de viktigste biologiske mediatorene i kroppen med et bredt spekter av biologiske funksjoner av et cytokin, hormon og enzym. Virkningen av MYTH på målceller realiseres gjennom CD74 - reseptoren eller gjennom den ikke -klassiske endocytosebanen.

MYTE regnes som en viktig mediator for betennelse, som aktiverer funksjonen til makrofager (cytokinproduksjon, fagocytose, cytotoksisitet, etc.), samt et endogent immunregulerende hormon som modulerer glukokortikoidaktivitet.

Mer og mer informasjon akkumuleres om MIFs rolle i patogenesen av mange inflammatoriske sykdommer, inkludert sepsis, revmatoid artritt (RA), glomerulonefrit, etc. I RA øker konsentrasjonen av MIF i væsken i de berørte leddene betydelig, som korrelerer med alvorlighetsgraden av sykdommen. Under påvirkning av MYTH øker produksjonen av proinflammatoriske cytokiner av både makrofager og synovialceller.

Ulike metoder er kjent for å teste aktiviteten til MIF, når migrerende celler (målceller for MIF) plasseres i et glass kapillær (kapillartest), i en dråpe agarose eller i en agarosebrønn.

Vi presenterer en relativt enkel screeningmetode basert på dannelse av cellemikrokulturer (leukocytter eller makrofager) standard i areal og antall celler i bunnen av brønnene i en 96-brønns flatbunnet plate, etterfulgt av dyrking i et næringsmedium og bestemme endringen i området til disse mikrokulturene under virkningen av MIF (Suslov A.P., 1989).

Lab 7-3

Definisjon av MYTH -aktivitet

Bestemmelse av den biologiske aktiviteten til MIF utføres ved hjelp av en enhet for dannelse av cellemikrokulturer (figur 7.7) - MIGROSKRIN (Research Institute of Epidemiology and Microbiology oppkalt etter NF Gamaleya RAMS).

1. I brønnene på en 96-brønns plate (Flow, UK eller lignende) tilsett 100 ul av en prøve fortynnet i kulturmedium, der MYTH-aktiviteten bestemmes (hver fortynning i 4 paralleller, eksperimentelle prøver). Kulturmediet inneholder RPMI 1640, 2 mM L-glutamin, 5% føtalt bovint serum, 40 μg / ml gentamicin.

2. Tilsett kulturmedium (i 4 paralleller) for å kontrollere brønner, 100 ul hver.

3. Forbered en cellesuspensjon av peritoneale makrofager, for hvilke 2 hybridmus (CBAxC57B1 / 6) F1 injiseres intraperitonealt med 10 ml Hanks-løsning med heparin (10 U / ml), massér forsiktig magen i 2-3 minutter. Deretter slaktes dyret ved halshugging, bukveggen brytes forsiktig i lysken og ekssudatet suges ut gjennom en nål med en sprøyte. Celler av peritonealt ekssudat vaskes to ganger med Hanks-løsning, sentrifugeres i 10-15 minutter ved 200 g. Deretter fremstilles en cellesuspensjon med en konsentrasjon på 10 ± 1 million / ml RPMI 1640 -medium. Telling utføres i et Goryaev -kammer.

4. Monter MIGROSKRIN-systemet, som er et stativ for rettet og standard fiksering av spisser med cellekulturer i en strengt vertikal posisjon i en gitt høyde over midten av en brønn på en 96-brønns kulturplate, og inneholder også 92 tips for en automatisk pipette fra Costar, USA (fig. 7.7).

Sett stativbeina inn i hjørnebrønnene på platen. Cellesuspensjonen tas med en automatisk pipette inn i spissene - 5 μl hver, skylles fra overflødige celler ved en enkel senking i mediet og settes vertikalt inn i stikkontaktene på systemstativet. Det fylte stativet med tips holdes ved romtemperatur i 1 time på en strengt horisontal overflate. I løpet av denne tiden legger cellene i suspensjonen seg til bunnen av brønnene, der standard cellemikrokulturer dannes.

5. Spissstativet fjernes forsiktig fra tallerkenen. En plate med en mikrokultur av celler plasseres i en strengt horisontal posisjon i en CO 2 -inkubator, der den dyrkes i 20 timer. Under dyrking migrerer celler langs bunnen av brønnen.

6. Kvantitativ registrering av resultater etter inkubasjon utføres på en kikkertforstørrelsesglass, som visuelt vurderer størrelsen på kolonien på skalaen inne i okularet. Mikrokulturer er sirkulære. Forskerne bestemmer deretter gjennomsnittlig kolonidiameter fra målingene av koloniene i 4 test- eller kontrollbrønner. Målefeilen er ± 1 mm.

Migrasjonsindeksen (MI) beregnes med formelen:

Prøven har MYTH-aktivitet hvis MI-verdiene er like

For en konvensjonell enhet (U) for MYTH -aktivitet tas det gjensidige, lik verdien av den høyeste fortynning av prøven (prøven), der migrasjonsindeksen er 0,6 ± 0,2.

Biologisk aktivitet av FEOα vurderes av dens cytotoksiske effekt på linjen av transformerte fibroblaster L-929. Rekombinant TNFα ble brukt som en positiv kontroll, og celler i et kulturmedium ble brukt som en negativ kontroll.

Beregn den cytotoksiske indeksen (CI):

hvor en- antall levende celler i kontrollen; b- antall levende celler i forsøket.

Ris. 7.7. MIGROSKRIN -opplegg - Enheter for kvantifisering av migrering av cellekulturer

Cellene er farget med et fargestoff (metylenblått), som bare er inkorporert i døde celler.

Verdien av den gjensidige fortynning av prøven som kreves for å oppnå 50% cellulær cytotoksisitet er tatt som en konvensjonell enhet for TNF -aktivitet. Spesifikk aktivitet for en prøve er forholdet mellom aktivitet i vilkårlige enheter per ml og konsentrasjonen av proteiner i prøven.

Intracellulær cytokinfarging. En endring i forholdet mellom celler som produserer forskjellige cytokiner kan gjenspeile patogenesen av sykdommen og tjene som et kriterium for prognosen for sykdommen og vurdering av behandlingen.

Ved metoden for intracellulær farging bestemmes ekspresjonen av et cytokin på nivået til en celle. Flowcytometri lar deg telle antall celler som uttrykker et bestemt cytokin.

La oss liste hovedstadiene i bestemmelsen av intracellulære cytokiner.

Ustimulerte celler produserer små mengder cytokiner, som vanligvis ikke deponeres; derfor er stimulering av lymfocytter og blokkering av frigjøring av disse produktene fra celler et viktig trinn i vurderingen av intracellulære cytokiner.

Den mest brukte cytokininduktoren er proteinkinase C-aktivatoren phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) i kombinasjon med kalsiumionoforionomycinet (IN). Bruken av en slik kombinasjon forårsaker syntese av et bredt spekter av cytokiner: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Ulempen med å bruke PMA-IN er problemet med å påvise CD4-molekyler på overflaten av lymfocytter etter slik aktivering. Produksjonen av cytokiner av T-lymfocytter induseres også av mitogener (PHA). B -celler og monocytter stimulerer

Mononukleære celler inkuberes i nærvær av induktorer av cytokinproduksjon og en blokkering av deres intracellulære transport, brefeldin A eller monensin, i 2-6 timer.

Cellene resuspenderes deretter i bufret saltvann. For fiksering, tilsett 2% formaldehyd, inkuber i 10-15 minutter ved romtemperatur.

Deretter behandles cellene med saponin, noe som øker permeabiliteten til cellemembranen og farges med monoklonale antistoffer som er spesifikke for de påviste cytokinene. Forfarging av overflatemarkører (CD4, CD8) øker mengden informasjon som er innhentet om cellen, og lar deg bestemme dens populasjonsidentitet mer nøyaktig.

Det er noen begrensninger i anvendelsen av metodene beskrevet ovenfor. Så med deres hjelp er det umulig å analysere syntesen av cytokiner med en enkelt celle, det er umulig å bestemme antall cytokinproduserende celler i en subpopulasjon, det er umulig å avgjøre om cytokinproduserende celler uttrykker unike markører, om forskjellige cytokiner syntetiseres av forskjellige celler eller av de samme cellene. Svaret på disse spørsmålene oppnås ved hjelp av andre forskningsmetoder. For å bestemme frekvensen av cytokinproduserende celler i en populasjon, brukes metoden for å begrense fortynninger og en variant av ELISPOT-enzymbundet immunosorbentanalyse (se kapittel 4).

In situ hybridiseringsmetode. Metoden inkluderer:

2) fiksering med paraformaldehyd;

3) påvisning av mRNA ved bruk av merket cDNA. I noen tilfeller bestemmes cytokin -mRNA på seksjoner ved bruk av radioisotop -PCR.

Immunfluorescens. Metoden inkluderer:

1) frysing av orgelet og forberedelse av kryostatseksjoner;

2) fiksering;

3) behandling av seksjonene med fluorescein-merkede anticytokinantistoffer;

4) visuell observasjon av fluorescens.

Disse teknikkene (hybridisering in situ og immunfluorescens) er raske og avhenger ikke av terskelkonsentrasjonene til det utskilte produktet. Imidlertid kvantifiserer de ikke mengden cytokin som skilles ut og kan være teknisk kompleks. En rekke nøye overvåking for uspesifikke reaksjoner er nødvendig.

Ved hjelp av de presenterte metodene for vurdering av cytokiner ble patologiske prosesser assosiert med forstyrrelser i cytokinsystemet på forskjellige nivåer identifisert.

Dermed er vurderingen av cytokinsystemet ekstremt viktig for å karakterisere tilstanden til kroppens immunsystem. Studiet av forskjellige nivåer av cytokinsystemet gir informasjon om funksjonell aktivitet av forskjellige typer immuncompetente celler, om alvorlighetsgraden av den inflammatoriske prosessen, om overgangen til det systemiske nivået og om prognosen for sykdommen.

Spørsmål og oppgaver

1. Oppgi de generelle egenskapene til cytokiner.

2. Gi klassifiseringen av cytokiner.

3. Oppgi hovedkomponentene i cytokinsystemet.

4. Liste opp de cytokinproduserende cellene.

5. Beskriv familiene til cytokinreseptorer.

6. Hva er mekanismene for cytokinnettverkets funksjon?

7. Fortell oss om produksjonen av cytokiner i det medfødte immunsystemet.

8. Hva er de viktigste tilnærmingene til en omfattende vurdering av cytokinsystemet?

9. Hva er metodene for testing av cytokiner i kroppsvæsker?

10. Hva er feilene i cytokinsystemet i ulike patologier?

11. Hva er hovedmetodene for biologisk testing av IL-1, IFN, MIF, TNFa i biologiske væsker?

12. Beskriv prosessen for å bestemme det intracellulære innholdet i cytokiner.

13. Beskriv prosessen med å bestemme cytokinene som utskilles av en enkelt celle.

14. Beskriv sekvensen av metoder som brukes for å påvise en defekt på nivået av cytokinreseptoren.

15. Beskriv sekvensen av metoder som brukes for å oppdage en defekt på nivået av cytokinproduserende celler.

16. Hvilken informasjon kan fås ved å undersøke produksjonen av cytokiner i kulturen av mononukleære celler, i blodserumet?

Proinflammatoriske cytokiner syntetiseres, utskilles og virker gjennom sine reseptorer på målceller på et tidlig stadium av betennelse, og deltar i utløsningen av en bestemt immunrespons, så vel som i effektorfasen. Nedenfor gir vi en kort beskrivelse av de viktigste proinflammatoriske cytokinene.

IL-1 -en forbindelse utskilt under antigen stimulering av monocytter, makrofager, Langerhans-celler, dendritiske celler, keratinocytter, cerebrale astrocytter og mikroglia, endotel, epitel, mesotelceller, fibroblaster, NK-lymfocytter, nøytrofiler, B-cellelymfocytter, C-celler et al. Omtrent 10% av basofiler og mastceller produserer også IL-1. Disse fakta indikerer at IL-1 kan skilles ut direkte i blod, vevsvæske og lymfe. Alle celler der dette cytokinet dannes, er ikke i stand til spontan syntese av IL-1 og reagerer med dets produksjon og sekresjon som reaksjon på virkningen av smittsomme og inflammatoriske midler, mikrobielle toksiner, forskjellige cytokiner, aktive komplementfragmenter, noen aktive blodkoagulasjonsfaktorer , og andre. I det figurative uttrykket til A. Bellau er IL-1 en familie av molekyler for alle anledninger. IL -1 er delt inn i 2 fraksjoner - a og b, som er produkter av forskjellige gener, men som har lignende biologiske egenskaper. Begge disse formene er dannet av de tilsvarende forløpermolekylene med samme molekylvekt - 31 kDa. Som et resultat av biokjemiske transformasjoner dannes til slutt biologisk aktive polypeptider med én kjede med en molekylvekt på 17,5 kDa. Nesten all IL-1a forblir inne i cellen eller binder seg til membranen. I motsetning til IL-1a, skilles IL-1b aktivt ut av celler og er den viktigste sekretoriske formen for IL-1 hos mennesker. Samtidig har begge interleukiner det samme spekteret av biologisk aktivitet og konkurrerer om binding til den samme reseptoren. Det skal imidlertid tas i betraktning at IL-1a hovedsakelig er en formidler av lokale forsvarsreaksjoner, mens IL-1b virker både på lokalt og systemisk nivå. Eksperimenter med rekombinant IL-1 har vist at dette cytokinet har minst 50 forskjellige funksjoner, og målene er celler i nesten alle organer og vev. Påvirkningen av IL-1 er hovedsakelig rettet mot Th1, selv om den er i stand til å stimulere Th2 og B-lymfocytter. I beinmargen, under påvirkning, øker antallet hematopoietiske celler i mitosetrinnet. IL-1 kan virke på nøytrofiler, forbedre deres bevegelsesaktivitet og dermed fremme fagocytose. Dette cytokinet er involvert i reguleringen av funksjonene til endotelet og blodkoagulasjonssystemet, som induserer prokoagulantaktivitet, syntesen av proinflammatoriske cytokiner og uttrykket på overflaten av endotelet av limmolekyler som gir rulling og festing av nøytrofile og lymfocytter, som et resultat av hvilket leukopeni og nøytropeni utvikler seg i vaskulærsengen. Virker på leverceller og stimulerer dannelsen av proteiner i akutt fase. Det ble funnet at IL-1 er hovedformidler av utviklingen av lokal betennelse og akutt faserespons på nivået av kroppen. I tillegg akselererer det veksten av blodkar etter skade. Under påvirkning av IL-1 i blodet reduseres konsentrasjonen av jern og sink og utskillelsen av natrium øker. Til slutt har det nylig blitt funnet at IL-1 er i stand til å øke mengden av sirkulerende nitrogenoksid. Sistnevnte er kjent for å spille en ekstremt viktig rolle i reguleringen av blodtrykk, fremmer blodplateskille og forbedrer fibrinolyse. Det skal bemerkes at under påvirkning av IL-1 forbedres dannelsen av rosetter av nøytrofile og lymfocytter med blodplater, noe som spiller en viktig rolle i implementeringen av uspesifikk resistens, immunitet og hemostase (Yu.A. Vitkovsky). Alt dette antyder at IL-1 stimulerer utviklingen av et helt kompleks av beskyttende reaksjoner i kroppen med sikte på å begrense spredning av infeksjon, eliminere invaderende mikroorganismer og gjenopprette integriteten til skadede vev. IL-1 påvirker kondrocytter, osteoklaster, fibroblaster og b-celler i bukspyttkjertelen. Under påvirkning øker sekresjonen av insulin, ACTH og kortisol. Tilsetningen av IL-1b eller TNFa til den primære kulturen av hypofyseceller reduserer utskillelsen av skjoldbruskstimulerende hormon.

IL-1 produseres i sentralnervesystemet, hvor det kan fungere som en sender. Under påvirkning av IL-1 oppstår søvn, ledsaget av tilstedeværelse av a-rytme (langsom bølgesøvn). Det fremmer også syntese og utskillelse av nervevekstfaktor av astrocytter. Det er vist at innholdet av IL-1 øker med muskelarbeid. Under påvirkning av IL-1 forbedres produksjonen av IL-1 selv, så vel som IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 og TNFa. Sistnevnte induserer i tillegg syntesen av IL-1, IL-6 og IL-8.

Mange pro-inflammatoriske effekter av IL-1 utføres i kombinasjon med TNFa og IL-6: feberinduksjon, anoreksi, påvirkning av hematopoiesis, deltakelse i uspesifikk anti-infeksjonsbeskyttelse, sekresjon av akuttfaseproteiner og andre (AS Simbirtsev) .

IL-6- en monomer med en molekylvekt på 19-34 kDa. Den produseres av stimulerte monocytter, makrofager, endoteliocytter, Th2, fibroblaster, hepatocytter, Sertoli-celler, celler i nervesystemet, tyrocytter, celler på øyer i Langerhans, etc. Sammen med IL-4 og IL-10 gir den vekst og differensiering av B-lymfocytter, noe som letter overgangen sistnevnte i antistoffer. I tillegg stimulerer det, som IL-1, hepatocytter, noe som fører til dannelse av proteiner i akuttfase. IL-6 virker på hematopoietiske stamceller og stimulerer spesielt megakaryocytopoiesis. Denne forbindelsen har antiviral aktivitet. Det er cytokiner som tilhører IL-6-familien-onkostatin M (OnM), en faktor som hemmer leukemi, ciliær nevrotropisk faktor, kardiotropin-1. Deres innflytelse påvirker ikke immunsystemet. IL-6-familien har effekt på embryonale stamceller, forårsaker myokardhypertrofi, CWA-syntese, vedlikehold av spredning av myelomceller og hematopoietiske forfedre, differensiering av makrofager, osteoklaster, nerveceller, økt trombocytopoese, etc.

Det skal bemerkes at mus med målrettet inaktivering (knockout) av genet som koder for en vanlig reseptorkomponent for IL-6-familien av cytokiner, utvikler mange abnormiteter i forskjellige kroppssystemer som er uforenlige med livet. Sammen med forstyrrelsen av kardiogenese i embryoene til slike mus, er det en kraftig nedgang i antall stamceller i forskjellige hematopoietiske rader, samt en kraftig nedgang i størrelsen på thymus. Disse fakta indikerer den ekstreme betydningen av IL-6 i reguleringen av fysiologiske funksjoner (A.A. Yarilin).

Det er et veldig komplekst gjensidig regulerende forhold mellom proinflammatoriske cytokiner, som fungerer som synergister. Således hemmer IL-6 produksjonen av IL-1 og TNFa, selv om begge disse cytokinene er indusere av IL-6-syntese. I tillegg fører IL-6, som virker på hypotalamus-hypofysen, til en økning i produksjonen av kortisol, som hemmer ekspresjonen av IL-6-genet, samt gener av andre proinflammatoriske cytokiner.

IL-6-familien inkluderer også onkostatin M (På M), har et ekstremt bredt spekter av handlinger. Molekylvekten er 28 kDa. Det ble funnet at OnM er i stand til å hemme veksten av en rekke svulster. Det stimulerer dannelsen av IL-6, en plasminogenaktivator, vasoaktive tarmpeptider og CWA. Det følger av det ovenstående at OnM skal spille en viktig rolle i reguleringen av immunresponsen, blodkoagulering og fibrinolyse.

IL-8 tilhører den såkalte familien av kjemokiner som stimulerer kjemotaksi og kjemokinesis og teller opptil 60 individuelle stoffer med sine egne strukturelle og biologiske egenskaper. Modent IL-8 eksisterer i flere former, forskjellig i lengden på polypeptidkjeden. Dannelsen av en eller annen form avhenger av spesifikke proteaser som virker på N-terminalen til det ikke-glykosylerte forløpermolekylet. Avhengig av hvilke celler som syntetiserer IL-8, inneholder den et annet antall aminosyrer. Den største biologiske aktiviteten er i form av IL-8, bestående av 72 aminosyrer (A.S. Simbirtsev).

IL-8 frigjøres av polymorfonukleære leukocytter, monocytter, makrofager, megakaryocytter, nøytrofiler, T-lymfocytter (Tx), fibroblaster, kondrocytter, keratinocytter, endotel- og epitelceller, hepatocytter og mikroglia.

IL-8 produseres som respons på virkningen av biologisk aktive forbindelser, inkludert proinflammatoriske cytokiner, så vel som IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, forskjellige mitogener, lipopolysakkarider, lektiner og virale forfallsprodukter, mens antiinflammatoriske cytokiner (IL-4, IL-10) reduserer produksjonen av IL-8. Aktiveringen og frigjøringen skjer også under påvirkning av trombin, en plasminogenaktivator, streptokinase og trypsin, noe som indikerer et nært forhold mellom funksjonen til dette cytokinet og det hemostatiske systemet.

Syntesen av IL-8 utføres på virkningen av en rekke endogene eller eksogene stimuli som oppstår i fokus for betennelse under utviklingen av en lokal forsvarsreaksjon på introduksjonen av et patogent middel. I denne forbindelse har IL-8-produksjonen mange likheter med andre proinflammatoriske cytokiner. Samtidig undertrykkes syntesen av IL-8 av steroidhormoner, IL-4, IL-10, Ifa og Ifg.

IL-8 stimulerer kjemotaksi og kjemokinesi av nøytrofile, basofile, T-lymfocytter (i mindre grad) og keratinocytter, noe som forårsaker degranulering av disse cellene. Med intravaskulær injeksjon av IL-8 er det en rask og skarp granulocytopeni, som strengt følges av en økning i nivået av nøytrofiler i det perifere blodet. I dette tilfellet migrerer nøytrofiler til leveren, milten, lungene, men ikke til skadet vev. Videre har eksperimentet vist at intravenøs administrering av IL-8 blokkerer migreringen av nøytrofile til de intradermale betennelsesområdene.

I ustimulerte nøytrofiler forårsaker IL-8 frigjøring av et protein assosiert med vitamin B 12 fra spesifikke granulater og gelatinase fra sekretoriske vesikler. Degranulering av azurofile granulater i nøytrofile skjer bare etter stimulering med cytokalasin-B. Samtidig frigjøres elastase, myeloperoksidase, b-glukuronidase og andre elastaser, og ekspresjonen av limmolekyler på leukocyttmembranen oppstår, noe som sikrer samspillet mellom nøytrofilen og endotelet. Det skal bemerkes at IL-8 ikke er i stand til å utløse et respirasjonsutbrudd, men kan øke effekten av andre kjemokiner på denne prosessen.

IL-8 er i stand til å stimulere angiogenese ved å aktivere proliferative prosesser i endotelceller og glatte muskelceller, som spiller en viktig rolle i vevsreparasjon. I tillegg kan det hemme IL-4-indusert IgE-syntese.

Tilsynelatende spiller IL-8 en viktig rolle i den lokale immuniteten til slimhinnene. Hos friske mennesker finnes det i sekresjonene fra spytt, tårekreft, svettekjertler, i råmelk. Det har blitt funnet at glattmuskelceller i den menneskelige luftrøret er i stand til å produsere ubetydelige mengder IL-8. Under påvirkning av bradykinin øker produksjonen av IL-8 50 ganger. Proteinsynteseblokkere hemmer syntesen av IL-8. Det er all grunn til å tro at lokalt IL-8 gir forløp av beskyttende reaksjoner når den utsettes for patogen flora i øvre luftveier.

IL-12 oppdaget for mer enn ti år siden, men egenskapene har blitt studert bare de siste årene. Den produseres av makrofager, monocytter, nøytrofiler, dendritiske celler og aktiverte B-lymfocytter. I mye mindre grad er IL-12 i stand til å utskille keratinocytter, Langerhans-celler og hvile B-lymfocytter. I tillegg produseres det av mikroglialceller og astrocytter, noe som krever deres samarbeid. IL-12 er en heterodimer som består av to kovalent koblede polypeptidkjeder: tunge (45 kDa) og lette (35 kDa). Biologisk aktivitet er bare iboende i dimeren; hver av de enkelte kjedene har ikke lignende egenskaper.

Likevel er NK, T-lymfocytter (CD4 + og CD8 +) og i mindre grad B-lymfocytter de viktigste målcellene for IL-12. Det kan anses at det fungerer som en kobling mellom makrofager og monocytter, noe som bidrar til en økning i aktiviteten til Th1 og cytotoksiske celler. Dermed gir dette cytokinet et betydelig bidrag til tilbudet av antiviral og antitumorbeskyttelse. Induktorer av IL-12-syntese er mikrobielle komponenter og proinflammatoriske cytokiner.

IL-12 tilhører heparinbindende cytokiner, noe som antyder dets deltakelse i hemostaseprosessen.

De siste årene har det blitt vist at IL-12 er et sentralt cytokin for å styrke den cellemedierte immunresponsen og effektiv anti-smittsom beskyttelse mot virus, bakterier, sopp og protozoer. De beskyttende effektene av IL-12 ved infeksjoner formidles av Ifg-avhengige mekanismer, forbedret nitrogenoksidproduksjon og T-celleinfiltrasjon. Imidlertid er dens viktigste effekt å syntetisere Ifg. Sistnevnte, mens det akkumuleres i kroppen, fremmer syntesen av IL-12 ved makrofager. Den viktigste funksjonen til IL-12 er retningen for Tx0-differensiering mot Tx1. I denne prosessen er IL-12 en synergist for Ifg. I mellomtiden, etter differensiering, slutter Th1 å trenge IL-12 som et ko-stimulerende molekyl. Immunresponsens art avhenger i stor grad av IL-12: om den vil utvikle seg i henhold til cellulær eller humoristisk immunitet.

En av de viktigste funksjonene til IL-12 er en kraftig økning i differensiering av B-lymfocytter til antistoffproduserende celler. Dette cytokinet brukes til å behandle pasienter med allergi og bronkial astma.

IL-12 har en hemmende effekt på produksjonen av IL-4 av T-lymfocytter i minnet, mediert gjennom APC. På sin side undertrykker IL-4 produksjonen og utskillelsen av IL-12.

IL-12-synergister er IL-2 og IL-7, selv om begge disse cytokinene ofte virker på forskjellige målceller. Den fysiologiske antagonisten og hemmeren av IL-12 er IL-10, et typisk antiinflammatorisk cytokin som hemmer Th1-funksjonen.

IL-16- utskilles av T-lymfocytter, hovedsakelig stimulert av CD4 +, CD8 +, eosinofiler og bronkiale epitelceller. Økt sekresjon av IL-16 ble funnet da T-celler ble behandlet med histamin. Av kjemisk natur er det en homotetramer med en molekylvekt på 56000-80000 D. Det er et immunmodulerende og proinflammatorisk cytokin, fordi det er en kjemotaktisk faktor for monocytter og eosinofiler, samt T-lymfocytter (CD4 +), forbedrer vedheftet.

Det skal bemerkes at forbehandling av CD4 + med rekombinant IL-16 undertrykker HIV-1-promotoraktivitet med omtrent 60%. Basert på de ovennevnte fakta har en hypotese blitt fremmet, ifølge hvilken effekten av IL-16 på HIV-1-replikasjon observeres på nivået av virusuttrykk.

IL-17 dannet av makrofager. Foreløpig er rekombinant IL-17 blitt oppnådd og dens egenskaper er studert. Det viste seg at under påvirkning av IL-17 syntetiserer og utskiller menneskelige makrofager pro-inflammatoriske cytokiner-IL-1b og TNFa, som er i direkte forhold til dosen av det undersøkte cytokinet. Maksimal effekt observeres omtrent 9 timer etter starten av inkubasjon av makrofager med rekombinant IL-17. I tillegg stimulerer IL-17 syntese og sekresjon av IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1-antagonist og stromalysin. Antiinflammatoriske cytokiner-IL-4 og IL-10-fullstendig opphever IL-17-indusert frigjøring av IL-1b, mens GTFb 2 og IL-13 bare delvis blokkerer denne effekten. IL-10 undertrykker den induserte frigjøringen av TNFa, mens IL-4, IL-13 og GTFb 2 undertrykker utskillelsen av dette cytokinet i mindre grad. De presenterte fakta tyder sterkt på at IL-17 bør spille en viktig rolle i initiering og vedlikehold av den inflammatoriske prosessen.

IL-18 når det gjelder biologiske effekter, er det en funksjonell dobler og synergist av IL-12. Hovedprodusentene av IL-18 er makrofager og monocytter. Strukturen er ekstremt lik IL-1. IL-18 syntetiseres i form av et inaktivt forløpermolekyl, som krever deltakelse av et IL-1b-konverterende enzym for å omdanne det til en aktiv form.

Under påvirkning av IL-18 øker kroppens antimikrobielle motstand. Ved bakteriell infeksjon regulerer IL-18 sammen med IL-12 eller Ifa / b produksjonen av Ifg av Tx- og NK-celler og forbedrer ekspresjonen av Fas-ligand på NK- og T-lymfocytter. Nylig har det blitt funnet at IL-18 er en CTL-aktivator. Under påvirkning øker aktiviteten til CD8 + -celler i forhold til celler av ondartede svulster.

I likhet med IL-12 fremmer IL-18 den foretrukne differensiering av Th0 til Th1. I tillegg fører IL-18 til dannelsen av GM-CSF og forbedrer derved leukopoiesis og hemmer dannelsen av osteoklaster.

IL-23 består av 2 underenheter (p19 og p40) som er en del av IL-12. Hver for seg har hver av de listede underenhetene ingen biologisk aktivitet, men sammen forbedrer de, i likhet med IL-12, den proliferative aktiviteten til T-lymfoblaster og Ifg-sekresjon. IL-23 er mindre kraftig enn IL-12.

TNF er et polypeptid med en molekylvekt på ca 17 kDa (består av 157 aminosyrer) og er delt inn i 2 fraksjoner - a og b. Begge fraksjonene har omtrent de samme biologiske egenskapene og virker på de samme cellulære reseptorene. TNFa skilles ut av monocytter og makrofager, Th1, endotel- og glattmuskelceller, keratinocytter, NK -lymfocytter, nøytrofiler, astrocytter, osteoblaster, etc. I mindre grad produseres TNFa av noen tumorceller. Hovedinducatoren for TNFa -syntese er bakteriell lipopolysakkarid, så vel som andre komponenter av bakteriell opprinnelse. I tillegg stimuleres syntesen og sekresjonen av TNFa av cytokiner: IL-1, IL-2, Ifa og b, GM-CSF, etc. Epstein-Barr-virus, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb, etc.

Hovedmanifestasjonen av den biologiske aktiviteten til TNFa er effekten på noen tumorceller. I dette tilfellet fører TNFa til utvikling av hemoragisk nekrose og trombose i blodtilførselen. Samtidig, under påvirkning av TNFa, øker den naturlige cytotoksisiteten til monocytter, makrofager og NK -celler. Regresjonen av tumorceller skjer spesielt intensivt med den kombinerte virkningen av TNFa og Ifg.

Under påvirkning av TNFa hemmes syntesen av lipoproteinkinase, et av hovedenzymene som regulerer lipogenese.

TNFa, som en formidler av cytotoksisitet, er i stand til å hemme celleproliferasjon, differensiering og funksjonell aktivitet av mange celler.

TNFa er direkte involvert i immunresponsen. Det spiller en ekstremt viktig rolle i de tidlige øyeblikkene av begynnelsen av den inflammatoriske reaksjonen, fordi det aktiverer endotelet og fremmer uttrykk for limmolekyler, noe som fører til vedheft av granulocytter til den indre overflaten av fartøyet. Under påvirkning av TNFa skjer transendotelial migrasjon av leukocytter til det inflammatoriske fokuset. Dette cytokinet aktiverer granulocytter, monocytter og lymfocytter og induserer produksjonen av andre proinflammatoriske cytokiner-IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, som er TNFa-synergister.

Formet lokalt øker TNFa i fokus for betennelse eller en smittsom prosess den fagocytiske aktiviteten til monocytter og nøytrofiler kraftig, og forbedrer prosessene for peroksidasjon til utvikling av fullstendig fagocytose. Sammen med IL-2 øker TNFa Ifg-produksjonen betydelig med T-lymfocytter.

TNFa er også involvert i ødeleggelses- og reparasjonsprosessene, ettersom det forårsaker vekst av fibroblaster og stimulerer angiogenese.

De siste årene har det blitt fastslått at TNF er en viktig regulator for hematopoiesis. Direkte eller i forbindelse med andre cytokiner påvirker TNF alle typer hematopoietiske celler.

Under dens innflytelse forbedres funksjonen til hypothalamus-hypofyse-binyresystemet, samt noen endokrine kjertler-skjoldbruskkjertelen, testikler, eggstokkene, bukspyttkjertelen og andre (A.F. Vozianov).

Interferoner er dannet av nesten alle celler i menneskekroppen, men deres produksjon utføres hovedsakelig av blod- og benmargsceller. Syntesen av interferoner skjer under påvirkning av antigen stimulering, selv om en svært liten konsentrasjon av disse forbindelsene normalt finnes i beinmargen, bronkiene, forskjellige organer i mage -tarmkanalen, hud og andre. Nivået av interferonsyntese er alltid høyere i ikke-delende celler enn i raskt delende celler.

Introduksjon.

1. Generelle egenskaper og klassifisering av cytokiner.

1.1 Virkningsmekanismer.

1.2 Egenskaper for cytokiner.

1.3 Cytokines rolle i reguleringen av kroppens fysiologiske funksjoner.

2.Spesielle studier av cytokiner.

2.1 Cytokines rolle i patogenesen av inflammatoriske sykdommer i tykktarmen hos barn.

2.2 Nitrogenoksid og cytokines rolle i utviklingen av akutt lungeskadesyndrom.

3. Metoder for bestemmelse av cytokiner

3.1 Bestemmelse av den biologiske aktiviteten til cytokiner

3.2 Kvantifisering av cytokiner ved bruk av antistoffer

3.3 Bestemmelse av cytokiner ved enzymimmunoassay.

3.3.1 Tumornekrosefaktor-alfa.

3.3.2 Gamma -interferon.

3.3.3 Interleukin-4

3.3.4 Interleukin-8

3.3.5 Interleukin-1 reseptorantagonist.

3.3.6 Alpha-interferon.

3.3.7 Antistoffer mot alfa-IFN.

4. Immunotrope legemidler basert på cytokiner.

Liste over brukt litteratur.

Konklusjon.

Introduksjon.

Litt tid har gått siden beskrivelsen av de første cytokinene. Forskningen deres førte imidlertid til isolering av en omfattende kunnskapsdel ​​- cytokinologi, som er en integrert del av ulike kunnskapsfelt og først og fremst immunologi, noe som ga en kraftig drivkraft til studiet av disse meklerne. Cytokineologi gjennomsyrer alle kliniske disipliner, fra etiologi og patogenese av sykdommer til forebygging og behandling av ulike patologiske tilstander. Følgelig må vitenskapelige forskere og klinikere navigere i mangfoldet av regulatoriske molekyler og ha en klar forståelse av hver av cytokiners rolle i prosessene som studeres. Alle celler i immunsystemet har visse funksjoner og fungerer i et klart koordinert samspill, som leveres av spesielle biologisk aktive stoffer - cytokiner - regulatorer av immunreaksjoner. Cytokiner er spesifikke proteiner ved hjelp av hvilke forskjellige celler i immunsystemet kan utveksle informasjon med hverandre og koordinere handlinger. Mengden og mengden av cytokiner som virker på celleoverflatereseptorer - "cytokinmiljøet" - representerer en matrise av interagerende og ofte skiftende signaler. Disse signalene er komplekse på grunn av det store utvalget av cytokinreseptorer og på grunn av det faktum at hver av cytokinene kan aktivere eller undertrykke flere prosesser, inkludert sin egen syntese og syntese av andre cytokiner, samt dannelse og utseende av cytokinreseptorer på celleoverflaten. Målet med vårt arbeid er å studere cytakiner, deres funksjoner og egenskaper, samt deres mulige anvendelse i medisin. Cytokiner er små proteiner (molekylvekt fra 8 til 80 KDa) som virker autokrine (dvs. på cellen som produserer dem) eller parakrin (på celler i nærheten). Dannelsen og frigjøringen av disse svært aktive molekylene er kortvarig og tett regulert.

Litteraturanmeldelse.

Generelle egenskaper og klassifisering av cytokiner.

Cytokiner er en gruppe polypeptidmediatorer for intercellulær interaksjon, som hovedsakelig er involvert i dannelsen og reguleringen av kroppens forsvarsreaksjoner under introduksjon av patogener og forstyrrelse av vevsintegritet, samt i reguleringen av en rekke normale fysiologiske funksjoner. Cytokiner kan isoleres til et nytt uavhengig reguleringssystem som eksisterer sammen med de nervøse og endokrine systemene for å opprettholde homeostase, og alle tre systemene er tett sammenkoblet og avhengige av hverandre. I løpet av de siste to tiårene har genene til de fleste cytokiner blitt klonet og det er oppnådd rekombinante analoger som fullstendig gjentar de biologiske egenskapene til naturlige molekyler. Mer enn 200 individuelle stoffer som tilhører cytokinfamilien er nå kjent. Historien om studiet av cytokiner begynte på 40 -tallet på 1900 -tallet. Det var da de første effektene av kakektin, en faktor som er tilstede i blodserumet og som er i stand til å forårsake kakeksi eller vekttap, ble beskrevet. Deretter ble denne mediatoren isolert og vist å være identisk med tumornekrosefaktor (TNF). På den tiden fant studien av cytokiner sted på prinsippet om å oppdage en hvilken som helst biologisk effekt, som fungerte som utgangspunkt for navnet på den tilsvarende mekleren. Så på 50 -tallet ble interferon (IFN) kalt på grunn av dets evne til å forstyrre eller øke motstanden under gjentatt virusinfeksjon. Interleukin-1 (IL-1) ble også opprinnelig kalt endogent pyrogen i motsetning til bakterielle lipopolysakkarider, som ble ansett som eksogene pyrogener. Den neste fasen i studiet av cytokiner, som går tilbake til 60-70 år, er forbundet med rensing av naturlige molekyler og en omfattende karakterisering av deres biologiske virkning. På dette tidspunktet ble funnet av T-cellevekstfaktoren, nå kjent som IL-2, og en rekke andre molekyler som stimulerer vekst og funksjonell aktivitet av T-, B-lymfocytter og andre typer leukocytter. I 1979, for deres betegnelse og systematisering, ble begrepet "interleukiner" foreslått, det vil si mediatorer som kommuniserer mellom leukocytter. Imidlertid ble det snart klart at de biologiske effektene av cytokiner strekker seg langt utover immunsystemet, og derfor ble det tidligere foreslåtte uttrykket "cytokiner", som har overlevd til i dag, mer akseptabelt. En revolusjonerende vending i studiet av cytokiner fant sted på begynnelsen av 1980 -tallet etter kloning av mus- og menneskelige interferongener og produksjon av rekombinante molekyler som fullstendig gjentok de biologiske egenskapene til naturlige cytokiner. Etter dette var det mulig å klone gener til andre mediatorer fra denne familien. En viktig milepæl i cytokinens historie var den kliniske bruken av rekombinante interferoner, og spesielt rekombinant IL-2, for behandling av kreft. 90 -tallet ble preget av oppdagelsen av underenhetsstrukturen til cytokinreseptorer og dannelsen av begrepet "cytokinnettverk", og begynnelsen av XXI -tallet - oppdagelsen av mange nye cytokiner gjennom genetisk analyse. Cytokiner inkluderer interferoner, kolonistimulerende faktorer (CSF), kjemokiner som transformerer vekstfaktorer; svulstnekrosefaktor; interleukiner med etablerte historisk serienumre og noen andre endogene meklere. Interleukiner med serienumre som starter fra 1 tilhører ikke den samme undergruppen av cytokiner relatert til vanlige funksjoner. De kan igjen deles inn i proinflammatoriske cytokiner, vekst- og differensieringsfaktorer for lymfocytter og individuelle regulatoriske cytokiner. Navnet "interleukin" tildeles en nyoppdaget mekler hvis følgende kriterier utviklet av nomenklaturkomiteen i International Union of Immunological Societies er oppfylt: molekylær kloning og uttrykk for genet til den undersøkte faktoren, tilstedeværelsen av et unikt nukleotid og tilsvarende aminosyresekvens, oppnåelse av nøytraliserende monoklonale antistoffer. I tillegg må det nye molekylet produseres av celler i immunsystemet (lymfocytter, monocytter eller andre typer leukocytter), ha en viktig biologisk funksjon i reguleringen av immunresponsen, samt tilleggsfunksjoner, og det er derfor det ikke kan få et funksjonelt navn. Til slutt bør de oppførte egenskapene til det nye interleukinet publiseres i et fagfellevurdert vitenskapelig tidsskrift. Klassifiseringen av cytokiner kan utføres i henhold til deres biokjemiske og biologiske egenskaper, samt etter hvilke typer reseptorer som cytokiner utfører sine biologiske funksjoner gjennom. Klassifiseringen av cytokiner etter struktur (tabell 1) tar ikke bare hensyn til aminosyresekvensen, men fremfor alt proteinets tertiære struktur, som mer nøyaktig gjenspeiler molekylenes evolusjonære opprinnelse.

Tabell 1. Klassifisering av cytokiner etter struktur.

Genkloning og analyse av strukturen til cytokinreseptorer viste at, akkurat som selve cytokinene, kan disse molekylene deles inn i flere typer i henhold til likheten mellom aminosyresekvenser og særegenheter ved organisering av ekstracellulære domener (tabell 2). En av de største familiene av cytokinreseptorer kalles hematopoietinreseptorfamilien eller type I cytokinreseptorfamilien. Et strukturelt trekk ved denne gruppen av reseptorer er tilstedeværelsen i molekylet til 4 cystein og aminosyresekvensen Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), som ligger i kort avstand fra cellemembranen. Klasse II cytokinreseptorer samhandler med interferoner og IL-10. Begge de første reseptortypene har homologi med hverandre. Følgende grupper av reseptorer formidler interaksjon med cytokiner fra tumornekrosefaktorfamilien og IL-1-familien. For tiden er mer enn 20 forskjellige kjemokinreseptorer kjent for å samhandle med varierende grad av affinitet med en eller flere ligander i kjemokinfamilien. Chemokinreseptorer tilhører superfamilien til rhodopsinreseptorer, har 7 transmembrane domener og leder et signal med deltakelse av G-proteiner.

Tabell 2. Klassifisering av cytokinreseptorer.

Mange cytokinreseptorer består av 2-3 underenheter som er kodet av forskjellige gener og uttrykt uavhengig. I dette tilfellet krever dannelsen av en reseptor med høy affinitet samtidig interaksjon mellom alle underenheter. Et eksempel på en slik organisering av cytokinreseptorer er strukturen til IL-2-reseptorkomplekset. Overraskende var oppdagelsen av det faktum at individuelle underenheter av IL-2-reseptorkomplekset er felles for IL-2 og noen andre cytokiner. Således er β-kjeden samtidig en komponent i reseptoren for IL-15, og y-kjeden fungerer som en felles underenhet av reseptorene for IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 og IL-21. Dette betyr at alle de nevnte cytokiner, hvis reseptorer også består av 2-3 individuelle polypeptider, bruker y-kjeden som en komponent i deres reseptorer, dessuten en komponent som er ansvarlig for signaloverføring. I alle tilfeller er spesifisiteten til interaksjonen for hvert cytokin levert av andre underenheter som er forskjellige i struktur. Blant cytokinreseptorer er det 2 flere vanlige reseptorunderenheter som leder et signal etter interaksjon med forskjellige cytokiner. Det er en vanlig reseptorsubenhet βc (gp140) for IL-3, IL-5 og GM-CSF-reseptorene, samt gp130-reseptorsubenheten, som er felles for medlemmer av IL-6-familien. Tilstedeværelsen av en felles signalunderenhet i cytokinreseptorer fungerer som en av tilnærmingene for deres klassifisering, siden den lar en finne fellestrekk både i strukturen til ligander og i biologiske effekter.

Tabell 3 viser den kombinerte strukturelle og funksjonelle klassifiseringen, hvor alle cytokiner er delt inn i grupper, først og fremst med tanke på deres biologiske aktivitet, så vel som de ovennevnte strukturelle egenskapene til molekylene til cytokiner og deres reseptorer.

Tabell 3. Strukturell og funksjonell klassifisering av cytokiner.

	Familier av cytokiner	Undergrupper og ligander	Grunnleggende biologiske funksjoner
	Type I interferoner	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Antiviral aktivitet, antiproliferativ, immunmodulerende virkning
	Hematopoietiske cellevekstfaktorer	Stamcellefaktor (kit-ligand, stålfaktor), Flt-3-ligand, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 GP140 ligander: IL-3, IL-5, GM-KSF	Stimulering av spredning og differensiering av ulike typer stamceller i benmargen, aktivering av hematopoiesis Erythropoietin, Thrombopoietin
	Superfamilien til interleukin-1 og FRF	FRF -familien: Surt FRF, grunnleggende FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) familie: IL-1α, IL-1β, IL-1 reseptorantagonist, IL-18, IL-33, etc.	Aktivering av spredning av fibroblaster og epitelceller Pro-inflammatorisk virkning, aktivering av spesifikk immunitet
	Tumor nekrose faktor familie	TNF, lymfotoksiner α og β, Fas ligand, etc.	Proinflammatorisk virkning, regulering av apoptose og intercellulær interaksjon av immunkompetente celler
	Interleukin-6 familie	GP130 ligander: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Cardiotropin-1, leukemihemmende faktor, ciliær nevrotrofisk faktor	Pro-inflammatoriske og immunregulerende effekter
	Kemokiner	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Regulering av kjemotaksi av forskjellige typer leukocytter
	Interleukin-10 familie	IL-10,19,20,22,24,26	Immunsuppressiv virkning
	Interleukin-12 familie		Regulering av differensiering av hjelper-T-lymfocytter
	Cytokiner av T-hjelperkloner og regulatoriske funksjoner til lymfocytter	T-hjelpere type 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-hjelpere type 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2-reseptor y-kjede ligander: IL-7 TSLP	Aktivering av cellulær immunitet Aktivering av humoral immunitet, immunmodulerende effekt Stimulering av differensiering, spredning og funksjonelle egenskaper til forskjellige typer lymfocytter, DC, NK -celler, makrofager, etc.
	Interleukin 17 familie	IL-17A, B, C, D, E, F	Aktivering av syntesen av proinflammatoriske cytokiner
	Superfamilie av nervevekstfaktor, blodplatevekstfaktor og transformerende vekstfaktorer	Nervevekstfaktorfamilie: NGF, hjernens nevrotrofiske faktor Blodplateavledede vekstfaktorer (PDGF), angiogene vekstfaktorer (VEGF) TRF -familien: TPPb, activins, inhibins, Nodal, Bone morfogene proteiner, Mullerian hemmende stoff	Regulering av betennelse, angiogenese, nevronfunksjon, embryonal utvikling og vevsregenerering
	Epidermal vekstfaktorfamilie	ERF, TRFα, etc.
	Familie av insulinlignende vekstfaktorer	IRF-I, IRF-II	Stimulering av spredning av forskjellige celletyper

Den første gruppen inkluderer interferoner av type I og er den enkleste i organisering, siden alle molekylene som er inkludert i den har en lignende struktur og på mange måter de samme funksjonene knyttet til antiviral beskyttelse. Den andre gruppen inkluderte vekst- og differensieringsfaktorer for hematopoietiske celler, og stimulerte utviklingen av hematopoietiske stamceller, fra stamcellen. Denne gruppen inkluderer cytokiner som er smalt spesifikke for individuelle differensieringslinjer for hematopoietiske celler (erytropoietin, trombopoietin og IL-7, som virker på forløperne til TB-lymfocytter), samt cytokiner med et bredere spekter av biologisk aktivitet, som f.eks. IL-3, IL-11, kolonistimulerende faktorer. Innenfor denne gruppen av cytokiner har ligander gp140, som har en felles reseptorsubenhet, så vel som trombopoietin og erytropoietin blitt isolert på grunn av likheten av molekylenes strukturelle organisering. Cytokiner fra FGF- og IL-1-superfamiliene har en høy grad av homologi og en lignende struktur av proteiner, noe som bekrefter den vanlige opprinnelsen. Når det gjelder manifestasjoner av biologisk aktivitet, skiller FGF seg imidlertid på mange måter fra agonistene i IL-1-familien. Familien av IL-1-molekyler har i dag, i tillegg til funksjonelle navn, betegnelsene F1-F11, hvor F1 tilsvarer IL-1α, F2 til IL-1β, F3 til reseptorantagonisten til IL-1, F4 til IL- 18. Resten av familiemedlemmene har blitt oppdaget som et resultat av genetisk analyse og har en ganske høy homologi med IL-1-molekyler; deres biologiske funksjoner er imidlertid ikke fullstendig belyst. Ytterligere grupper av cytokiner inkluderer IL-6-familiene (ligander til den vanlige reseptorunderenheten gp130), tumornekrosefaktor og kjemokiner, som er representert med det største antallet individuelle ligander og er oppført i sin helhet i de respektive kapitlene. Familien med tumornekrosefaktor dannes hovedsakelig på grunnlag av likheten i strukturen til ligander og deres reseptorer, bestående av tre ikke-kovalent koblede identiske underenheter som danner biologisk aktive molekyler. Samtidig, når det gjelder biologiske egenskaper, inkluderer denne familien cytokiner med ganske forskjellige aktiviteter. For eksempel er TNF en av de lyseste proinflammatoriske cytokinene, Fas -ligand induserer apoptose av målceller, og CD40 -ligand gir et stimulerende signal under intercellulær interaksjon av T- og B -lymfocytter. Slike forskjeller i den biologiske aktiviteten til strukturelt like molekyler bestemmes først og fremst av trekkene ved uttrykket og strukturen til deres reseptorer, for eksempel tilstedeværelsen eller fraværet av et intracellulært "død" -domene, som bestemmer celleapoptose. De siste årene har familiene IL-10 og IL-12 også blitt etterfylt med nye medlemmer som har fått serienumre på interleukiner. Dette etterfølges av en veldig kompleks gruppe cytokiner, som er mediatorer for den funksjonelle aktiviteten til T-hjelperlymfocytter. Inkludering i denne gruppen er basert på to grunnleggende prinsipper: 1) tilhørende cytokiner syntetisert av Th1 eller Th2, som bestemmer utviklingen av overveiende humorale eller cellulære immunologiske reaksjoner, 2) tilstedeværelsen av en felles reseptorsubenhet - gammakjeden av IL-2-reseptorkomplekset. Blant ligandene i gammakjeden ble IL-4 i tillegg isolert, som også har vanlige reseptorsubenheter med IL-13, som i stor grad bestemmer den delvis overlappende biologiske aktiviteten til disse cytokinene. IL-7, som har en felles struktur av reseptorer med TSLP, ble isolert på en lignende måte. Fordelene ved klassifiseringen ovenfor er forbundet med samtidig vurdering av de biologiske og biokjemiske egenskapene til cytokiner. Muligheten for denne tilnærmingen bekreftes for tiden av oppdagelsen av nye cytokiner ved genetisk analyse av genomet og søket etter strukturelt like gener. Takket være denne metoden har familien av type I interferoner, IL-1, IL-10, IL-12, utvidet seg betydelig, en ny familie av IL-17 analoge cytokiner har dukket opp, som allerede består av 6 medlemmer. Tilsynelatende vil fremkomsten av nye cytokiner i nær fremtid skje mye saktere, siden analysen av det menneskelige genomet er nesten fullført. Endringer er mest sannsynlig mulig på grunn av avklaring av varianter av ligand-reseptor-interaksjoner og biologiske egenskaper, noe som vil tillate klassifisering av cytokiner å få en endelig form.

Handlingsmekanismer.

B. Reseptorer for cytokiner. Cytokiner er hydrofile signalstoffer, hvis virkning medieres av spesifikke reseptorer på utsiden av plasmamembranen. Bindingen av cytokiner til reseptoren (1) fører gjennom en rekke mellomtrinn (2-5) til aktivering av transkripsjon av visse gener (6). Cytokinreseptorer selv besitter ikke tyrosinkinaseaktivitet (med noen få unntak). Etter binding til cytokin (1) forbinder reseptormolekylene å danne homodimerer. I tillegg kan de danne heterodimerer ved assosiasjon med signaloverføringsproteiner [STPs] eller stimulere dimerisering av BPS -ene selv (2). Klasse I cytokinreseptorer kan aggregeres med tre typer BPS: proteiner GP130, βc eller γc. Disse hjelpeproteinene selv er ikke i stand til å binde cytokiner, men de utfører signaltransduksjon til tyrosinkinaser (3). Det samme spektret av biologisk aktivitet for mange cytokiner forklares med at forskjellige cytokin-reseptorkomplekser kan aktivere det samme BPS.

Som et eksempel på signaltransduksjon fra cytokiner, viser diagrammet hvordan IL-6-reseptoren (IL-6), etter binding til liganden (1), stimulerer dimeriseringen av GP130 (2). Dimeren til membranproteinet GP130 binder og aktiverer den cytoplasmatiske tyrosinkinasen til YK -familien (Janus kinaser med to aktive steder) (3). Janus kinaser fosforylerer cytokinreseptorer, BPS og forskjellige cytoplasmatiske proteiner, som utfører ytterligere signaltransduksjon; de fosforylerer også transkripsjonsfaktorer - signaltransdusere og aktivatorer av transkripsjon [PSAT (STAT, fra engelske signaltransdusere og aktivatorer for transkripsjon)]. Disse proteinene tilhører BPS -familien, som har et SH3 -domene i sin struktur som gjenkjenner fosfotyrosinrester (se s. 372). Derfor har de egenskapen til å assosiere seg med en fosforylerte cytokinreseptor. Hvis fosforylering av PSAT -molekylet (4) skjer, transformeres faktoren til en aktiv form og danner en dimer (5). Etter translokasjon til kjernen, binder dimeren som transkripsjonsfaktor til promotoren (se s. 240) til det initierte genet og induserer dets transkripsjon (6). Noen cytokinreseptorer kan miste det ekstracellulære ligandbindende domenet på grunn av proteolyse (ikke vist i diagrammet). Domenet kommer inn i blodet, hvor det konkurrerer om binding med et cytokin, noe som reduserer konsentrasjonen av cytokiner i blodet. Sammen danner cytokiner et regulatorisk nettverk (cytokinkaskade) med en multifunksjonell effekt. Overlapping mellom cytokiner fører til det faktum at synergisme observeres i virkningen av mange av dem, og noen cytokiner er antagonister. Hele cytokinkaskaden med komplekse tilbakemeldinger kan ofte observeres i kroppen.

Egenskaper til cytokiner.

Generelle egenskaper til cytokiner, på grunn av hvilke disse mediatorene kan kombineres til et uavhengig reguleringssystem.

1. Cytokiner er polypeptider eller proteiner, ofte glykosylerte, de fleste av dem har en MW på 5 til 50 kDa. Biologisk aktive molekyler av cytokiner kan bestå av en, to, tre eller flere identiske eller forskjellige underenheter.

2. Cytokiner har ikke antigenspesifikk biologisk virkning. De påvirker den funksjonelle aktiviteten til celler som er involvert i reaksjonene av medfødt og ervervet immunitet. Likevel, ved å virke på T- og B-lymfocytter, er cytokiner i stand til å stimulere antigeninduserte prosesser i immunsystemet.

3. For cytokingener er det tre varianter av uttrykk: a) scenespesifikt uttrykk på visse stadier av embryonal utvikling, b) konstitutivt uttrykk for regulering av en rekke normale fysiologiske funksjoner, c) induserbar uttrykksform som er karakteristisk for de fleste cytokiner. De fleste cytokiner utenfor den inflammatoriske responsen og immunresponsen blir ikke syntetisert av celler. Uttrykk av cytokingener begynner som respons på inntrengning av patogener i kroppen, antigen irritasjon eller vevsskade. Patogenassosierte molekylære strukturer er blant de mest potente induktorer for syntese av proinflammatoriske cytokiner. For å utløse syntesen av T-celle-cytokiner, er det nødvendig med aktivering av celler av et spesifikt antigen med deltagelse av en T-celle-antigenreseptor.

4. Cytokiner syntetiseres som respons på stimulering i en kort periode. Syntesen avsluttes på grunn av en rekke autoregulatoriske mekanismer, inkludert økt RNA -ustabilitet, og på grunn av eksistensen av negative tilbakemeldinger formidlet av prostaglandiner, kortikosteroidhormoner og andre faktorer.

5. Ett og samme cytokin kan produseres av forskjellige celletyper i kroppen i forskjellige organer av histogenetisk opprinnelse.

6. Cytokiner kan assosieres med membranene i cellene som syntetiserer dem, og som har en fullstendig spektrum av biologisk aktivitet og som manifesterer deres biologiske virkning under intercellulær kontakt.

7. De biologiske effektene av cytokiner formidles gjennom spesifikke cellulære reseptorkomplekser som binder cytokiner med svært høy affinitet, og individuelle cytokiner kan bruke vanlige reseptorsubenheter. Cytokinreseptorer kan eksistere i en løselig form, og beholder evnen til å binde ligander.

8. Cytokiner har pleiotrop biologisk virkning. Det samme cytokinet kan virke på mange celletyper og forårsake forskjellige effekter avhengig av typen målceller (fig. 1). Den pleiotropiske virkningen av cytokiner sikres ved uttrykk for cytokinreseptorer på celletyper av forskjellig opprinnelse og funksjoner og signaloverføring ved bruk av flere forskjellige intracellulære budbringere og transkripsjonsfaktorer.

9. Cytokiner er preget av utskiftbarhet av biologisk virkning. Flere forskjellige cytokiner kan forårsake den samme biologiske effekten eller ha lignende aktiviteter. Cytokiner induserer eller undertrykker syntesen av seg selv, andre cytokiner og deres reseptorer.

10. Som svar på aktiveringssignalet syntetiserer cellene samtidig flere cytokiner som deltar i dannelsen av cytokinnettverket. Biologiske effekter i vev og på kroppsnivå avhenger av tilstedeværelse og konsentrasjon av andre cytokiner med synergistiske, additive eller motsatte effekter.

11. Cytokiner kan påvirke proliferasjon, differensiering og funksjonell aktivitet av målceller.

12. Cytokiner virker på celler på forskjellige måter: autokrine - på cellen som syntetiserer og utskiller dette cytokinet; parakrin - på celler som ligger i nærheten av produsentcellen, for eksempel i fokus på betennelse eller i lymfoide organet; endokrine - fjernt til celler i organer og vev etter at de har kommet inn i sirkulasjonen. I sistnevnte tilfelle ligner virkningen av cytokiner virkningen av hormoner (fig. 2).

Ris. 1. Ett og samme cytokin kan produseres av forskjellige typer celler i kroppen i forskjellige organer av histogenetisk opprinnelse og virke på mange typer celler, noe som forårsaker forskjellige effekter avhengig av typen målceller.

Ris. 2. Tre varianter av manifestasjonen av den biologiske virkningen av cytokiner.

Tilsynelatende fant dannelsen av cytokinreguleringssystemet evolusjonært sted sammen med utviklingen av flercellede organismer og skyldtes behovet for dannelse av mediatorer for intercellulær interaksjon, som kan inkludere hormoner, nevropeptider, adhesjonsmolekyler og noen andre. I denne forbindelse er cytokiner det mest allsidige reguleringssystemet, siden de er i stand til å utvise biologisk aktivitet både fjernt etter sekresjon av den produserende cellen (lokalt og systemisk), og under intercellulær kontakt, og er biologisk aktive i form av en membranform. Slik skiller cytokinsystemet seg fra adhesjonsmolekyler, som utfører smalere funksjoner bare når celler er i direkte kontakt. Samtidig skiller cytokinsystemet seg fra hormoner, som hovedsakelig syntetiseres av spesialiserte organer og virker etter at de har kommet inn i sirkulasjonssystemet.

Cytokiners rolle i reguleringen av kroppens fysiologiske funksjoner.

Cytokiners rolle i reguleringen av kroppens fysiologiske funksjoner kan deles inn i 4 hovedkomponenter:

1. Regulering av embryogenese, etablering og utvikling av organer, inkl. immunsystemets organer.

2. Regulering av visse normale fysiologiske funksjoner.

3. Regulering av kroppens forsvarsreaksjoner på lokalt og systemisk nivå.

4. Regulering av prosesser for vevsregenerering.

Uttrykk for gener av individuelle cytokiner skjer scenespesifikt på visse stadier av embryonal utvikling. Stamcellefaktor, transformerende vekstfaktorer, cytokiner fra TNF -familien og kjemokiner regulerer differensiering og migrering av forskjellige celler og etablering av immunsystemets organer. Etter dette kan det hende at syntesen av noen cytokiner ikke gjenopptas, mens andre fortsetter å regulere normale fysiologiske prosesser eller delta i utviklingen av beskyttende reaksjoner.

Til tross for at de fleste cytokiner er typiske induserbare mediatorer og i postnatal perioden ikke blir syntetisert av celler utenfor den inflammatoriske responsen og immunresponsen, faller noen cytokiner ikke under denne regelen. Som et resultat av konstitutivt uttrykk for gener, blir noen av dem konstant syntetisert og i tilstrekkelig store mengder er i sirkulasjon, som regulerer spredning og differensiering av visse celletyper gjennom livet. Eksempler på denne typen fysiologisk regulering av funksjoner av cytokiner kan være et konstant høyt nivå av erytropoietin og noen CSF for å sikre hematopoiesis. Reguleringen av kroppens forsvarsreaksjoner av cytokiner skjer ikke bare i immunsystemet, men også ved å organisere forsvarsreaksjoner på nivået av hele organismen ved å regulere nesten alle aspekter ved utvikling av betennelse og immunrespons. Denne funksjonen, som er viktigst for hele cytokinsystemet, er knyttet til to hovedretninger for den biologiske virkningen av cytokiner - beskyttelse mot smittestoffer og restaurering av skadet vev. Cytokiner regulerer først og fremst utviklingen av lokale forsvarsreaksjoner i vev med deltakelse av forskjellige typer blodceller, endotel, bindevev og epitel. Beskyttelse på lokalt nivå utvikler seg ved dannelsen av en typisk inflammatorisk reaksjon med sine klassiske manifestasjoner: hyperemi, utvikling av ødem, utseende av smerte og dysfunksjon. Syntesen av cytokiner begynner når patogener kommer inn i vevet eller deres integritet krenkes, som vanligvis fortsetter parallelt. Produksjonen av cytokiner er en integrert del av den cellulære responsen assosiert med gjenkjenning av celler i den myelomonocytiske serien av lignende strukturelle komponenter i forskjellige patogener, kalt patogenassosierte molekylære mønstre. Eksempler på slike patogene strukturer er lipopolysakkarider av gramnegative bakterier, peptidoglykaner av grampositive mikroorganismer, flagellin eller DNA rikt på CpolyG-sekvenser, som er typisk for DNA for alle typer bakterier. Leukocytter uttrykker korresponderende mønstergjenkjenningsreseptorer, også kalt tolllignende reseptorer (TLR), og spesifikke for visse strukturelle mønstre av mikroorganismer. Etter samspillet mellom mikroorganismer eller deres komponenter med TLR, utløses en intracellulær signaltransduksjonskaskade, noe som fører til en økning i funksjonell aktivitet av leukocytter og ekspresjon av cytokingener.

TLR-aktivering fører til syntese av to hovedgrupper av cytokiner: proinflammatoriske cytokiner og type I-interferoner, hovedsakelig IFNα / ß. Utvikling av en inflammatorisk reaksjon og gir en viftelignende utvidelse av aktiveringen av forskjellige typer celler som er involvert i vedlikehold og regulering av betennelse, inkludert alle typer leukocytter, dendritiske celler, T- og B-lymfocytter, NK-celler, endotel- og epitelceller, fibroblaster og andre. Dette gir konsistente stadier i utviklingen av den inflammatoriske responsen, som er hovedmekanismen for implementering av medfødt immunitet. I tillegg begynner dendritiske celler å syntetisere cytokiner fra IL-12-familien, og stimulerer differensiering av hjelper-T-lymfocytter, som fungerer som en slags bro til begynnelsen av utviklingen av spesifikke immunitetsreaksjoner forbundet med gjenkjenning av spesifikke antigeniske strukturer av mikroorganismer.

Den andre ikke mindre viktige mekanismen knyttet til syntesen av IFN sikrer implementering av antiviral beskyttelse. Type I -interferoner har fire viktigste biologiske egenskaper:

1. Direkte antiviral virkning ved å blokkere transkripsjon.

2. Undertrykkelse av celleproliferasjon, nødvendig for å blokkere spredning av viruset.

3. Aktivering av funksjonene til NK-celler, som har evnen til å lysere virusinfiserte kroppsceller.

4. Forbedret uttrykk for komplekse molekyler av histokompatibilitet i klasse I som kreves for å øke effektiviteten av presentasjon av virale antigener fra infiserte celler til cytotoksiske T-lymfocytter. Dette fører til aktivering av spesifikk gjenkjenning av virusinfiserte celler av T-lymfocytter-den første fasen av lyse av virusinfiserte målceller.

Som et resultat, i tillegg til den direkte antivirale virkningen, aktiveres mekanismene for både medfødt (NK-celler) og ervervet (T-lymfocytter) immunitet. Dette er et eksempel på hvordan et lite cytokinmolekyl med MM 10 ganger mindre enn MM av antistoffmolekyler er i stand til å aktivere helt forskjellige mekanismer for forsvarsreaksjoner på grunn av den pleiotropiske typen biologisk virkning, rettet mot å oppfylle ett mål - å fjerne viruset som har kom inn i kroppen.

På vevsnivå er cytokiner ansvarlig for utvikling av betennelse og deretter vevsregenerering. Med utviklingen av en systemisk inflammatorisk respons (akutt fase -respons) påvirker cytokiner nesten alle organer og systemer i kroppen som er involvert i reguleringen av homeostase. Virkningen av proinflammatoriske cytokiner på sentralnervesystemet fører til redusert appetitt og en endring i hele komplekset av atferdsreaksjoner. Å midlertidig stoppe søket etter mat og redusere seksuell aktivitet er gunstig når det gjelder å spare energi for bare en oppgave - å bekjempe det invaderende patogenet. Dette signalet er gitt av cytokiner, siden deres inntreden i sirkulasjonen absolutt betyr at det lokale forsvaret ikke har taklet patogenet, og aktivering av en systemisk inflammatorisk respons er nødvendig. En av de første manifestasjonene av en systemisk inflammatorisk reaksjon forbundet med virkningen av cytokiner på hypothalamus termoregulatoriske senter er en økning i kroppstemperatur. En temperaturøkning er en effektiv beskyttende reaksjon, siden ved forhøyede temperaturer reduseres evnen til en rekke bakterier til å reprodusere, men tvert imot øker spredningen av lymfocytter.

I leveren, under påvirkning av cytokiner, øker syntesen av akuttfase-proteiner og komponenter i komplementsystemet som er nødvendig for å bekjempe patogenet, men samtidig reduseres syntesen av albumin. Et annet eksempel på den selektive virkningen av cytokiner er endringen i den ioniske sammensetningen av blodplasma under utviklingen av en systemisk inflammatorisk reaksjon. I dette tilfellet er det en nedgang i nivået av jernioner, men en økning i nivået av sinkioner, og det er velkjent at å frata en bakteriecelle av jernioner betyr å redusere dets proliferative potensial (virkningen av laktoferrin er basert på dette). På den annen side er en økning i sinknivåer nødvendig for normal funksjon av immunsystemet, spesielt er det nødvendig for dannelsen av biologisk aktiv serum -tymfaktor - et av de viktigste tymiske hormonene som sikrer lymfocyttdifferensiering. Effekten av cytokiner på det hematopoietiske systemet er forbundet med en betydelig aktivering av hematopoiesis. En økning i antall leukocytter er nødvendig for å fylle opp tapet og øke antallet celler, hovedsakelig nøytrofile granulocytter, i fokus for purulent betennelse. Handlingen på blodkoagulasjonssystemet er rettet mot å øke koaguleringsevnen, noe som er nødvendig for å stoppe blødning og for å blokkere patogenet direkte.

Således, med utviklingen av systemisk betennelse, viser cytokiner et stort spekter av biologiske aktiviteter og forstyrrer arbeidet til nesten alle kroppssystemer. Imidlertid er ingen av endringene som skjer tilfeldig: alle er enten nødvendige for direkte aktivering av forsvarsreaksjoner eller er fordelaktige når det gjelder å bytte energistrømmer for bare en oppgave - å bekjempe det invaderende patogenet. I form av regulering av uttrykk for individuelle gener, hormonelle skift og endringer i atferdsreaksjoner, sikrer cytokiner aktivering og maksimal effektivitet av arbeidet til de kroppssystemene som kreves på et gitt tidspunkt for utvikling av beskyttende reaksjoner. På nivå med hele organismen kommuniserer cytokiner mellom immunsystemet, nervøse, endokrine, hematopoietiske og andre systemer og tjener til å involvere dem i organisering og regulering av en enkelt forsvarsreaksjon. Cytokiner er nettopp det organiserende systemet som danner og regulerer hele komplekset av kroppens beskyttende reaksjoner under introduksjonen av patogener. Tilsynelatende ble et slikt reguleringssystem utviklet evolusjonært og gir ubetingede fordeler for den mest optimale beskyttende responsen til en makroorganisme. Derfor er det tilsynelatende umulig å begrense begrepet forsvarsreaksjoner bare til deltakelse av uspesifikke motstandsmekanismer og en spesifikk immunrespons. Hele kroppen og alle systemer som ved første øyekast ikke er relatert til opprettholdelse av immunitet, deltar i en enkelt beskyttende reaksjon.

Spesielle studier av cytokiner.

Betydningen av cytokiner i patogenesen av inflammatoriske sykdommer i tykktarmen hos barn.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mikhailova. Russian State Medical University, State Research Center of Coloproctology, Moskva og State Research Institute of Highly Pure Biologicals, St. Petersburg, jobber med å studere viktigheten av cytokiner i patogenesen av inflammatoriske sykdommer i tykktarmen hos barn. Kroniske inflammatoriske sykdommer i mage -tarmkanalen inntar for tiden en av de ledende stedene i patologien i fordøyelsessystemet hos barn. Spesiell betydning er knyttet til inflammatoriske sykdommer i tykktarmen (IBD), forekomsten av disse øker jevnt og trutt over hele verden. Et langt forløp med hyppige, og i noen tilfeller dødelige tilbakefall, utvikling av lokale og systemiske komplikasjoner - alt dette krever en grundig studie av sykdommens patogenese på jakt etter nye tilnærminger til behandling av IBD. I de siste tiårene var forekomsten av ulcerøs kolitt (UC) 510 tilfeller per år per 100 tusen innbyggere, med Crohns sykdom (CD) 16 tilfeller per år per 100 tusen innbyggere. Prevalensrater i Russland, i Moskva -regionen tilsvarer gjennomsnittlige europeiske data, men betydelig lavere enn i de skandinaviske landene, Amerika, Israel og England. For NUC er forekomsten 19,3 per 100 tusen, forekomsten er 1,2 per 100 tusen mennesker per år. For CD er forekomsten 3,0 per 100 tusen, forekomsten er 0,2 per 100 tusen mennesker per år. Det faktum at den høyeste frekvensen er notert i høyt utviklede land skyldes ikke bare sosiale og økonomiske faktorer, men også de genetiske og immunologiske egenskapene til pasienter som bestemmer predisposisjonen for IBD. Disse faktorene er grunnleggende i den immunopatogenetiske teorien om opprinnelsen til IBD. Virale og / eller bakterielle teorier forklarer bare det akutte sykdomsutbruddet, og kroniseringen av prosessen skyldes både en genetisk disposisjon og egenskapene til immunresponsen, som også er genetisk bestemt. Det skal bemerkes at IBTC for tiden er klassifisert som en sykdom med en genetisk heterogen kompleks disposisjon. Mer enn 15 antatte kandidatgener fra 2 grupper (immunspesifikk og immunregulerende), som forårsaker arvelig disposisjon, er identifisert. Mest sannsynlig er predisposisjonen bestemt av flere gener som bestemmer arten av immunologiske og inflammatoriske reaksjoner. Basert på resultatene fra mange studier kan det konkluderes med at den mest sannsynlige lokaliseringen av gener assosiert med utviklingen av IBT er kromosomer 3, 7, 12 og 16. For tiden er det mye oppmerksomhet rundt studiet av funksjonene til funksjonen til T- og B -lymfocytter, samt cytokinemediatorer av betennelse. Rollen til interleukiner (IL), interferoner (IFN), tumornekrosefaktor-a (TNF-a), makrofager og autoantistoffer mot proteiner i slimhinnen i tykktarmen og til auto-mikroflora studeres aktivt. Funksjonene ved deres lidelser i CD og UC ble avslørt, men det er fremdeles uklart om disse endringene skjer hovedsakelig eller sekundært. For å forstå mange aspekter ved patogenese, ville studier utført i det prekliniske stadiet av IBD, så vel som hos førstegrads slektninger, være svært viktig. Blant mediatorene for betennelse tilhører en spesiell rolle cytokiner, som er en gruppe polypeptidmolekyler med en masse på 5 til 50 kDa, som deltar i dannelsen og reguleringen av kroppens forsvarsreaksjoner. På kroppsnivå kommuniserer cytokiner mellom immunsystemet, nervøse, endokrine, hematopoietiske og andre systemer og tjener til å involvere dem i organisering og regulering av forsvarsreaksjoner. Klassifiseringen av cytokiner er vist i tabell 2. De fleste cytokiner syntetiseres ikke av celler utenfor den inflammatoriske responsen og immunresponsen. Uttrykk av cytokingener begynner som respons på inntrengning av patogener i kroppen, antigen irritasjon eller vevsskade. En av de kraftigste induktorer for cytokinsyntese er komponentene i bakterielle cellevegger: LPS, peptidoglykaner og muramyldipeptider. Produsentene av proinflammatoriske cytokiner er hovedsakelig monocytter, makrofager, T-celler, etc. Avhengig av effekten på den inflammatoriske prosessen, er cytokiner delt inn i to grupper: proinflammatoriske (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g) og antiinflammatorisk (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukin-1 (IL-1) er en immunregulerende mediator som frigjøres under inflammatoriske reaksjoner, vevsskader og infeksjoner (proinflammatorisk cytokin). IL-1 spiller en viktig rolle i aktiveringen av T-celler når de interagerer med antigen. Det er to typer IL-1: IL-1a og IL-1b, produkter av to forskjellige genlokaliteter lokalisert på humant kromosom 2. IL-1a forblir inne i cellen eller kan være i membranform, og vises i små mengder i det ekstracellulære rommet. Rollen til membranformen til IL-1a er overføring av aktiverende signaler fra makrofagen til T-lymfocytter og andre celler under intercellulær kontakt. IL-1a er den viktigste kortdistansemegleren. IL-1b, i motsetning til IL-1a, utskilles aktivt av celler, som virker både systemisk og lokalt. I dag er det kjent at IL-1 er en av de viktigste mediatorene for inflammatoriske reaksjoner, stimulerer spredning av T-celler, øker ekspresjonen av IL-2-reseptoren på T-celler og deres produksjon av IL-2. IL-2 sammen med antigenet induserer aktivering og vedheft av nøytrofiler, stimulerer dannelsen av andre cytokiner (IL-2, IL-3, IL-6, etc.) av aktiverte T-celler og fibroblaster, stimulerer spredning av fibroblaster og endotelceller. Systemisk virker IL-1 synergistisk med TNF-a og IL-6. Med en økning i konsentrasjonen i blodet påvirker IL-1 cellene i hypothalamus og forårsaker økning i kroppstemperatur, feber, døsighet, redusert appetitt, og stimulerer også leverceller til å produsere proteiner i akuttfase (CRP, amyloid A, a-2 makroglobulin og fibrinogen). IL4 (kromosom 5). Det hemmer aktiveringen av makrofager og blokkerer mange av effektene stimulert av IFNg, for eksempel produksjon av IL1, nitrogenoksid og prostaglandiner, spiller en viktig rolle i antiinflammatoriske reaksjoner, har en immunsuppressiv effekt. IL6 (kromosom 7), en av de viktigste proinflammatoriske cytokinene, er hovedinducatoren for det siste stadiet av differensiering av B -celler og makrofager, en kraftig stimulator for produksjon av akutte faseproteiner av leverceller. En av hovedfunksjonene til IL6 er å stimulere produksjonen av antistoffer in vivo og in vitro. IL8 (kromosom 4). Refererer til kjemokinemediatorer som forårsaker rettet migrasjon (kjemotaksi) av leukocytter til betennelsesfokus. Hovedfunksjonen til IL10 er inhibering av cytokinproduksjon etter type I Thelpers (TNFb, IFNg) og aktiverte makrofager (TNF-a, IL1, IL12). Det er nå kjent at typer immunrespons er forbundet med en av variantene av lymfocyttaktivering med den dominerende deltakelsen av kloner av T -lymfocytthjelpere av den første typen (TH2) eller den andre typen (TH3). Produktene TH2 og TH3 påvirker aktiveringen av motsatte kloner negativt. Overdreven aktivering av noen av typer Th -kloner kan lede immunresponsen i henhold til et av utviklingsalternativene. Kronisk ubalanse i aktiveringen av Th -kloner fører til utvikling av immunopatologiske tilstander. Endringer i cytokiner ved IBTD kan studeres på forskjellige måter med bestemmelse av nivået i blodet eller in situ. IL1 -nivået er forhøyet ved alle inflammatoriske tarmsykdommer. Forskjellene mellom NNC og CD er i det økte uttrykket for IL2. Hvis det i NUC blir funnet et redusert eller normalt nivå av IL2, så oppdages dets økte nivå på CD. IL4 -innholdet øker i NUC, mens det på CD forblir normalt eller til og med synker. Nivået av IL6, som formidler akutte fasereaksjoner, er også økt ved alle former for betennelse. Dataene som er oppnådd angående profilen til cytokiner gjorde det mulig å antyde at de to hovedformene for kronisk IBD er preget av ulik aktivering og ekspresjon av cytokiner. Resultatene av studiene indikerer at cytokinprofilen observert hos pasienter med UC er mer konsistent med TH3 -profilen, mens TH2 -profilen bør betraktes som mer karakteristisk for pasienter med CD. Attraktiviteten til denne hypotesen om TH2- og TH3 -profilers rolle er også at bruk av cytokiner kan endre immunresponsen i en eller annen retning og føre til remisjon med restaurering av cytokinbalansen. Dette kan spesielt bekreftes ved bruk av IL10. Ytterligere studier skal vise om cytokinresponsen er et sekundært fenomen som respons på stimulering eller tvert imot uttrykk for de tilsvarende cytokinene bestemmer organismens reaktivitet med utviklingen av påfølgende kliniske manifestasjoner. Studien av nivået av cytokiner i IBD hos barn har ennå ikke blitt utført. Dette arbeidet er den første delen av en vitenskapelig studie viet til studiet av cytokinstatus i IBD hos barn. Målet med dette arbeidet var å studere den humorale aktiviteten til makrofager med bestemmelse av nivåene (IL1a, IL8) i blodet til barn med NUC og CD, samt deres dynamikk under behandlingen. Fra 2000 til 2002 ble 34 barn med NUC og 19 barn med CD i alderen 4 til 16 år undersøkt på gastroenterologisk avdeling på Russian Children's Clinical Hospital. Diagnosen ble verifisert anamnestisk, endoskopisk og morfologisk. Studien av nivåene av proinflammatoriske cytokiner IL1a, IL8 ble utført ved metoden for enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). For å bestemme konsentrasjonen av IL1a, IL8 brukte vi testsystemer produsert av OOO Cytokin (St. Petersburg, Russland). Analysen ble utført i laboratoriet for immunofarmakologi ved State Scientific Center ved Research Institute of Highly Pure Biopreparations (laboratorieleder, MD, prof. AS Simbirtsev). Resultatene oppnådd i løpet av studien avslørte en signifikant økning i nivåene av IL1a, IL8 i forverringsperioden, mer uttalt hos barn med NUC enn hos barn med CD. Uten forverring reduseres nivåene av proinflammatoriske cytokiner, men når ikke normen. I UC ble nivåene av IL-1a, IL-8 økt i forverringsperioden hos 76,2% og hos 90% av barna, og i remisjonsperioden-henholdsvis 69,2% og 92,3%. På CD er nivåene av IL-1a, IL-8 økt i eksaserbasjonsperioden hos 73,3% og 86,6% av barna, og i remisjonsperioden-henholdsvis 50% og 75%.

Avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen, fikk barna behandling med aminosalicylater eller glukokortikoider. Terapiens art påvirket dynamikken i cytokinnivået betydelig. Under behandling med aminosalicylater var nivåene av proinflammatoriske cytokiner i gruppen av barn med NUC og CD betydelig høyere enn i kontrollgruppen. Samtidig ble det observert høyere frekvenser i gruppen av barn med UC. I NUC på bakgrunn av aminosalicylatbehandling øker IL1a, IL8 hos henholdsvis 82,4% og 100% av barna, mens under glukokortikoidbehandling hos 60% av barna for begge cytokiner. I CD, IL1a, IL8 økes under behandling med aminosalicylater hos alle barn, og under glukokortikoidbehandling hos henholdsvis 55,5% og 77,7% av barna. Resultatene av denne studien indikerer således en signifikant involvering av makrofagforbindelsen til immunsystemet i den patogenetiske prosessen hos de fleste barn med UC og CD. Dataene innhentet i denne studien skiller seg ikke grunnleggende fra dataene som ble oppnådd under undersøkelsen av voksne pasienter. Forskjellene i nivåene av IL1a og IL8 hos pasienter med UC og CD er kvantitative, men ikke kvalitative, noe som tyder på en uspesifikk karakter av disse endringene på grunn av løpet av en kronisk inflammatorisk prosess. Derfor har disse indikatorene ingen diagnostisk verdi. Resultatene av en dynamisk studie av nivåene av IL1a og IL8 underbygger den høyere effektiviteten av terapi med glukokortikoidmedisiner sammenlignet med behandling med aminosalicyler. De presenterte dataene er resultatet av den første fasen av studien av cytokinstatusen til barn med IBT. Ytterligere studier av problemet er nødvendig, med tanke på indikatorene for andre proinflammatoriske og antiinflammatoriske cytokiner.

Nitrogenoksid og cytokines rolle i utviklingen av akutt lungeskadesyndrom.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya studerer dette problemet: Institutt for anestesiologi og reanimatologi, Vladivostok State Medical University. Akutt lungeskadesyndrom (voksen respiratorisk nødsyndrom, ARDS) er en av de alvorligste formene for akutt respirasjonssvikt som oppstår hos pasienter med alvorlig traume, sepsis, peritonitt, pankreatitt, kraftig blodtap, aspirasjon, etter omfattende kirurgiske inngrep og hos 50 60% av tilfellene er dødelige. Dataene fra studier av patogenesen til ARDS, utvikling av kriterier for tidlig diagnose og prognose for syndromet er få, ganske motstridende, noe som ikke tillater utvikling av et sammenhengende diagnostisk og terapeutisk konsept. Det ble funnet at ARDS er basert på skade på endotelet i lungekapillærene og alveolært epitel, brudd på de reologiske egenskapene til blod, noe som fører til ødem i interstitielt og alveolært vev, betennelse, atelektase, pulmonal hypertensjon. I litteraturen de siste årene er det nok informasjon om den universelle regulatoren for cellulær og vevsmetabolisme - nitrogenoksid. Interessen for nitrogenoksid (NO) skyldes først og fremst det faktum at det er involvert i reguleringen av mange funksjoner, inkludert vaskulær tone, hjertets kontraktilitet, blodplateaggregering, nevrotransmisjon, ATP og proteinsyntese og immunforsvar. I tillegg, avhengig av valget av det molekylære målet og egenskapene til interaksjon med det, har NO også en skadelig effekt. Det antas at den utløsende mekanismen for celleaktivering er ubalansert cytokinemi. Cytokiner er oppløselige peptider som fungerer som mediatorer av immunsystemet og gir cellulært samarbeid, positiv og negativ immunregulering. Vi prøvde å systematisere informasjonen som er tilgjengelig i litteraturen om NO og cytokines rolle i utviklingen av akutt lungeskadesyndrom. NO er ​​en vann- og fettløselig gass. Molekylet er et ustabilt frie radikaler, diffunderer lett inn i vev, absorberes og ødelegges så raskt at det bare kan påvirke cellene i nærmiljøet. NO -molekylet har alle egenskapene som ligger i klassiske budbringere: det produseres raskt, virker i svært lave konsentrasjoner, etter at det eksterne signalet opphører, blir det raskt til andre forbindelser som oksiderer til stabile uorganiske nitrogenoksider: nitritt og nitrat. Levetiden til NO i vev er, ifølge forskjellige kilder, fra 5 til 30 sekunder. De viktigste molekylære målene for NO er ​​jernholdige enzymer og proteiner: løselig guanylatsyklase, riktig nitrooksidsyntase (NOS), hemoglobin, mitokondrielle enzymer, enzymer i Krebs-syklusen, protein og DNA-syntese. Syntesen av NO i kroppen skjer gjennom enzymatiske transformasjoner av den nitrogenholdige delen av aminosyren L-arginin under påvirkning av et spesifikt enzym NOS og medieres av samspillet mellom kalsiumioner og calmodulin. Enzymet inaktiveres ved lave konsentrasjoner og er maksimalt aktivt ved 1 μM fritt kalsium. To isoformer av NOS er identifisert: konstitutiv (cNOS) og indusert (iNOS), som er produkter av forskjellige gener. Kalsiumkalmodulinavhengig cNOS er konstant tilstede i cellen og fremmer frigjøring av små mengder NO som respons på reseptor og fysisk stimulering. NO, generert under påvirkning av denne isoformen, fungerer som bærer i en rekke fysiologiske responser. Kalsium-kalmodulin-uavhengig iNOS dannes i forskjellige celletyper som respons på proinflammatoriske cytokiner, endotoksiner og oksidanter. Denne NOS -isoformen transkriberes av spesifikke gener på kromosom 17 og fremmer syntesen av store mengder NO. Enzymet er også klassifisert i tre typer: NOS-I (neuronal), NOS-II (makrofag), NOS-III (endotel). Enzymfamilien som syntetiserer NO finnes i en rekke lungeceller: i bronkiale epitelceller, i alveolocytter, i alveolære makrofager, i mastceller, i endotelceller i bronkialarterier og vener, i glatte myocytter i bronkier og blodårer, i ikke-adrenerge ikke-kolinerge nevroner. Den konstituerende evnen til epitelceller i bronkiene og alveolene til mennesker og pattedyr til å utskille NO er ​​bekreftet i mange studier. Det er fastslått at de øvre delene av det menneskelige luftveiene, så vel som de nedre delene, er involvert i dannelsen av NO. Studier utført på pasienter med trakeostomi har vist at mengden gass i luften som pustes ut gjennom trakeostomien er betydelig mindre enn i nese- og munnhulen. Syntesen av endogent NO hos pasienter på mekanisk ventilasjon lider betydelig. Forskning bekrefter at NO -frigjøring skjer på tidspunktet for bronkodilatasjon og styres av vagus -nervesystemet. Det er innhentet data om at dannelsen av NO i epitelet i menneskelige luftveier øker i inflammatoriske sykdommer i luftveiene. Gassyntesen økes på grunn av aktiveringen av indusert NOS under påvirkning av cytokiner, så vel som endotoksiner og lipopolysakkarider.

For tiden er mer enn hundre cytokiner kjent, som tradisjonelt er delt inn i flere grupper.

1. Interleukiner (IL -1 - IL18) - sekretoriske regulatoriske proteiner som gir mediatorinteraksjoner i immunsystemet og dets forbindelse med andre kroppssystemer.

2. Interferoner (IFN -alfa, beta, gamma) - antivirale cytokiner med en uttalt immunregulerende effekt.

3. Svulstnekrosefaktorer (TNF alfa, beta) er cytokiner med cytotoksiske og regulatoriske effekter.

4. Kolonistimulerende faktorer (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-stimulatorer for vekst og differensiering av hematopoietiske celler, som regulerer hematopoiesis.

5. Chemokines (IL-8, IL-16)-kjemoattraktanter for leukocytter.

6. Vekstfaktorer - regulatorer for vekst, differensiering og funksjonell aktivitet av celler i forskjellige vevs tilhørende (fibroblastvekstfaktor, endotelcellevekstfaktor, epidermal vekstfaktor) og transformerende vekstfaktorer (TGF beta).

Disse bioregulatoriske molekylene bestemmer typen og varigheten av den inflammatoriske og immunresponsen, kontrollcelleproliferasjon, hematopoiesis, angiogenese, sårheling og mange andre prosesser. Alle forskere understreker at cytokiner mangler spesifisitet for antigener. Eksperimenter med dyrkede lungemakrofager og mastceller har vist dannelse av iNOS som respons på interferon gamma, interleukin-1, tumornekrosefaktor og lipopolysakkarider. Ekspresjon av iNOS og cNOS for proinflammatoriske cytokiner ble funnet i dyre- og humane alveolocytter. Tilsetningen av epidermal vekstfaktor, en regulator av epitelcellefunksjonen til kulturen, reduserte aktiviteten til bare det induserte enzymet. Det er kjent at, avhengig av naturen, virker cytokiner autokrine - på de produserende cellene selv, parakrin - på andre målceller eller endokrine - på forskjellige celler utenfor produksjonsstedet. Samtidig kan de samhandle med hverandre i henhold til et agonistisk eller antagonistisk prinsipp, endre den funksjonelle tilstanden til målceller og danne et cytokinnettverk. Således er cytokiner ikke isolerte peptider, men et integrert system, hvis hovedkomponenter er produsentceller, selve proteinet er et cytokin, dets reseptor og en målcelle. Det ble funnet at med utviklingen av akutt lungeskade øker nivået av proinflammatoriske cytokiner: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Deres effekt er forbundet med vasodilatasjon, en økning i deres permeabilitet og opphopning av væske i lungevevet. I tillegg har studier vist evnen til IFN gamma og TNF alfa til å indusere uttrykk for adhesjonsmolekyler - ICAM -1 på humane endoteliocytter. Adhesjonsmolekyler, som fester seg til leukocytter, blodplater og endotelceller, danner "rullende" nøytrofiler og fremmer aggregering av fibrinpartikler. Disse prosessene bidrar til brudd på kapillær blodstrøm, øker kapillær permeabilitet og induserer lokalt vevsødem. Bremsing av kapillær blodstrøm fremmes av aktivering av NO, noe som forårsaker utvidelse av arterioler. Ytterligere migrasjon av leukocytter til betennelsesfokus styres av spesielle cytokiner - kjemokiner, som produseres og utskilles ikke bare av aktiverte makrofager, men også av endotelceller, fibroblaster, glatte myocytter. Deres hovedfunksjon er å tilføre neutrofiler til det inflammatoriske fokuset og aktivere deres funksjonelle aktivitet. Hovedkjemokinet for nøytrofiler er Il-8. Dens mest potente indusere er bakterielle lipopolysakkarider, IL-1 og TNFalpha. R. Bahra et al. tror at hvert trinn i transendotelial migrasjon av nøytrofile er regulert av stimulerende konsentrasjoner av TNF alfa. Med utviklingen av akutt lungeskade aktiveres vaskulære endoteliocytter, bronkiale epitelceller og alveolære makrofager og er involvert i faseinteraksjoner. Som et resultat oppstår på den ene siden mobilisering og forbedring av beskyttende egenskaper, og på den annen side er skade på cellene selv og omkringliggende vev mulig. En rekke studier har vist at produktet av delvis oksygenreduksjon, superoksid, kan akkumuleres i betennelsesfokuset, noe som inaktiverer den vasoaktive effekten av NO. NO og superoksydanion reagerer raskt for å danne celleskadelig peroksynitritt. Denne reaksjonen fremmer fjerning av NO fra de vaskulære og bronkiale veggene, så vel som fra overflaten av alveolocytter. Studier som viser at peroksynitritt tradisjonelt betraktes som en mediator for NO-toksisitet, kan ha en fysiologisk effekt og indusere vaskulær avslapning gjennom en NO-mediert økning i cGMP i det vaskulære endotelet er av interesse. På sin side er peroksynitritt en kraftig oksidant som er i stand til å skade alveolært epitel og lungeoverflateaktivt middel. Det forårsaker ødeleggelse av membranproteiner og lipider, skader endotelet, øker aggregering av blodplater og deltar i endotoksemi. Den økte formasjonen ble notert ved akutt lungeskadesyndrom. Forskerne mener at NO produsert som et resultat av aktiveringen av det induserte enzymet er ment for ikke-spesifikk beskyttelse av kroppen mot et bredt spekter av patogene midler, hemmer blodplateaggregering og forbedrer lokal blodsirkulasjon. Det ble funnet at overdreven mengde NO undertrykker aktiviteten til cNOS i celler på grunn av interaksjon med superoksid og muligens som et resultat av desensibilisering av guanylatsyklase, noe som fører til en reduksjon i cGMP i cellen og til en økning i intracellulært kalsium . Brett et al. og Kooy et al., som analyserte viktigheten av nitrooksidergiske mekanismer i patogenesen av ARDS, antydet at iNOS, peroksynitritt og nitrotyrosin, hovedproduktet av effekten av peroksynitritt på protein, kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av syndromet. Cuthbertson et al. tror at grunnlaget for akutt lungeskade er effekten av NO og peroksynitritt på elastase og interleukin-8. Kobayashi et al. registrerte også en økning i innholdet av iNOS, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-8 i bronkoalveolær væske hos pasienter med akutt lungeskadesyndrom. Meldrum et al. viste en nedgang i produksjonen av inflammatoriske cytokiner av lungemakrofager i ARDS under påvirkning av substratet for lokal produksjon av NO - L -arginin. Det ble funnet at i utviklingen av akutt lungeskadesyndrom spilles en betydelig rolle av nedsatt vaskulær permeabilitet forårsaket av virkningen av cytokiner-TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monoklonale antistoffer mot CD3-lymfocytter på vaskulære endotelceller i lungene og immunocyttene. En rask og sterk økning i permeabiliteten til lungekarene fører til migrasjon av nøytrofile inn i lungevevet og frigjøring av cytotoksiske mediatorer av dem, noe som fører til utvikling av patologisk lungeforandring. Under utviklingen av akutt lungeskade øker TNF alfa vedheft av neutrofiler til vaskulær vegg, forbedrer migrasjonen til vev, fremmer strukturelle og metabolske endringer i endoteliocytter, forstyrrer permeabiliteten til cellemembraner, aktiverer dannelsen av andre cytokiner og eikosanoider, og forårsaker apoptose og nekrose av lungeepitelceller. De innhentede dataene indikerer at apoptose av makrofager indusert ved innføring av LPS i stor grad er assosiert med IFN gamma og reduseres ved virkningen av IL-4, IL-10, TGF beta. Kobayashi et al. innhentet data som indikerer at IFN gamma kan være involvert i reparasjonen av epitelet i luftveisslimhinnen. Hagimotos studier inneholder informasjon om at epitelceller i bronkiene og alveolene som respons på TNF alfa eller Fas ligand frigjør IL-8, IL-12. Denne prosessen er assosiert med aktiveringen av kjernefaktoren Carr-B av Fas-liganden.

Det antas at IL-8 er en av de viktigste cytokinene i patofysiologien ved akutt lungeskade. Miller et al. i studien av bronko-alveolær væske hos pasienter med ARDS på bakgrunn av sesis, ble det funnet en signifikant økning i nivået av IL-8, sammenlignet med pasienter med kardiogent lungeødem. Det har blitt antydet at den viktigste kilden til Il-8 er lungene, og dette kriteriet kan brukes i differensialdiagnosen av syndromet. Grau et al. tror at endotelceller i lungekapillærene er en viktig kilde til cytokiner-IL-6, IL-8 i utviklingen av akutt lungeskade. Goodman et al. Når man studerer dynamikken i nivået av cytokiner i væsken i bronko-alveolær skylling hos pasienter med ARDS, en signifikant økning i IL-1beta, IL-8, monocytisk kjemotaktisk peptid-1, epitelcellulær nøytrofil aktivator, makrofag inflammatorisk peptid -1 alfa ble funnet. Samtidig tror forfatterne at en økning i innholdet av IL-1 beta kan tjene som en markør for et ugunstig utfall av syndromet. Bauer et al. det ble vist at kontroll over innholdet av IL-8 i bronkoalveolær væske hos pasienter med ARDS kan brukes til overvåking, en reduksjon i nivået av IL-8 indikerer et ugunstig forløp av prosessen. En rekke studier inneholder også informasjon om at nivået av cytokinproduksjon av det vaskulære endotelet i lungene påvirker utviklingen av akutt lungeskade og kontrollen kan brukes i klinisk praksis for tidlig diagnose. De mulige negative konsekvensene av en økning i nivået av proinflammatoriske cytokiner hos pasienter med ARDS, viser studier av Martin et al., Warner et al. Aktiveres av cytokiner og bakterielle endotoksiner, alveolære makrofager øker syntesen av NO. Nivået av NO-produksjon av bronkiale og alveolære epitelceller, nøytrofiler, mastceller, endotelceller og glatte myocytter i lungekar øker også, sannsynligvis gjennom aktivering av kjernefaktor Carr-B. Forfatterne mener at nitrogenoksydet som produseres som et resultat av aktiveringen av indusert NOS først og fremst er beregnet på det uspesifikke forsvaret av organismen. NO frigjør seg fra makrofager og trenger raskt inn i bakterier og sopp, der den hemmer tre vitale grupper av enzymer: H-elektrontransport, Krebs-syklus og DNA-syntese. NO er ​​involvert i kroppens forsvar i de siste stadiene av immunresponsen og blir i overført betydning betraktet som "straffesverdet" i immunsystemet. Imidlertid akkumuleres i cellen i utilstrekkelig store mengder, har NO også en skadelig effekt. Således, med utviklingen av syndromet for akutt lungeskade, utløser cytokiner og NO en sekvensiell kjede av reaksjoner som kommer til uttrykk i nedsatt mikrosirkulasjon, vevshypoksi, alveolært og interstitielt ødem og skade på metabolsk funksjon av lungene. Derfor kan det slås fast at studiet av de fysiologiske og patofysiologiske mekanismene for virkningen av cytokiner og NO er ​​et lovende område for forskning og vil tillate i fremtiden ikke bare å utvide forståelsen av patogenesen til ARDS, men også å bestemme diagnostiske og prognostiske markører for syndromet, for å utvikle alternativer for patogenetisk basert terapi med sikte på å redusere dødelighet.

Metoder for bestemmelse av cytokiner.

Gjennomgangen er viet hovedmetodene for studier av cytokiner som for tiden brukes. Metodenes evner og formål er kort beskrevet. Fordelene og ulempene ved ulike tilnærminger til analyse av ekspresjonen av cytokingener på nivået av nukleinsyrer og på nivået av proteinproduksjon presenteres. (Cytokiner og betennelse. 2005. T. 4, nr. 1. S. 22-27.)

Cytokiner er regulatoriske proteiner som danner et universelt nettverk av mediatorer, karakteristisk for både immunsystemet og celler i andre organer og vev. Alle mobilhendelser finner sted under kontroll av denne klassen av regulatoriske proteiner: spredning, differensiering, apoptose og spesialisert funksjonell aktivitet av celler. Virkningene av hvert cytokin på celler er preget av pleiotropi, effektspekteret av forskjellige mediatorer overlapper hverandre, og generelt er den endelige funksjonelle tilstanden til cellen avhengig av påvirkning av flere cytokiner som virker synergistisk. Således er cytokinsystemet et universelt, polymorft regulatorisk nettverk av mediatorer designet for å kontrollere prosessene for spredning, differensiering, apoptose og funksjonell aktivitet av cellulære elementer i de hematopoietiske, immun- og andre homeostatiske systemene i kroppen. Metoder for bestemmelse av cytokiner har gjennomgått en veldig rask utvikling over 20 års intensiv studie og representerer i dag et helt område av vitenskapelig kunnskap. Forskere innen cytokineologi i begynnelsen av arbeidet sitt står overfor spørsmålet om å velge metode. Og her må forskeren vite nøyaktig hvilken informasjon han trenger å innhente for å nå det fastsatte målet. For tiden har hundrevis av forskjellige metoder for å vurdere cytokinsystemet blitt utviklet, som gir mangfoldig informasjon om dette systemet. Evaluering av cytokiner i forskjellige biologiske medier kan være basert på spesifikk biologisk aktivitet. De kan kvantifiseres ved bruk av en rekke immunoanalysemetoder ved bruk av poly- og monoklonale antistoffer. I tillegg til å studere de sekretoriske former for cytokiner, er det mulig å studere deres intracellulære innhold og produksjon i vev ved hjelp av flytcytometri, Western blotting og in situ immunhistokjemi. Svært viktig informasjon kan fås ved å studere ekspresjonen av cytokin -mRNA, mRNA -stabilitet, tilstedeværelsen av cytokin -mRNA -isoformer, naturlige antisense -nukleotidsekvenser. Studiet av allelle varianter av cytokingener kan gi viktig informasjon om genetisk programmert høy eller lav produksjon av en eller annen mediator. Hver metode har sine egne ulemper og fordeler, sin egen oppløsning og bestemmelsesnøyaktighet. Forskerens uvitenhet og misforståelse av disse nyansene kan føre ham til falske konklusjoner.

Bestemmelse av den biologiske aktiviteten til cytokiner.

Oppdagelsens historie og de første trinnene i studiet av cytokiner var nært knyttet til dyrking av immunkompetente celler og cellelinjer. Deretter ble det vist de regulatoriske effektene (biologisk aktivitet) av en rekke oppløselige faktorer av proteinkarakter på lymfocyters proliferative aktivitet, på syntesen av immunglobuliner, på utviklingen av immunresponser in vitro -modeller. En av de første metodene for å bestemme den biologiske aktiviteten til mediatorer er bestemmelse av migreringsfaktoren for humane lymfocytter og faktoren for dens inhibering. Etter hvert som de biologiske effektene av cytokiner har blitt studert, har det dukket opp forskjellige metoder for å vurdere deres biologiske aktivitet. Således ble IL-1 bestemt ved å vurdere spredning av murine tymocytter in vitro, IL-2-av evnen til å stimulere proliferativ aktivitet av lymfoblaster, IL-3-ved vekst av hematopoietiske kolonier in vitro, IL-4-ved den komitogene effekten, ved økt ekspresjon av Ia-proteiner, ved induksjon av dannelsen av IgG1 og IgE, etc. Listen over disse metodene kan fortsettes, den oppdateres kontinuerlig etter hvert som nye biologiske aktiviteter av oppløselige faktorer blir oppdaget. Deres største ulempe er de ikke-standardiserte metodene, umuligheten av deres forening. Videre utvikling av metoder for å bestemme den biologiske aktiviteten til cytokiner førte til opprettelsen av et stort antall cellelinjer som er følsomme for en eller annen cytokin, eller multisensitive linjer. De fleste av disse cytokinsensitive cellene kan nå bli funnet på kommersielle cellelinjelister. For eksempel, for testing av IL-1a og b, brukes D10S-cellelinjen, for IL-2 og IL-15-CTLL-2-cellelinjen, for IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL -13, GM -CSF - cellelinje TF -1, for IL -6 - cellelinje B9, for IL -7 - cellelinje 2E8, for TNFa og TNFb - cellelinje L929, for IFNg - cellelinje WiDr, for IL-18-cellelinjelinje KG-1. Imidlertid har denne tilnærmingen til studiet av immunoaktive proteiner, sammen med kjente fordeler som måling av den virkelige biologiske aktiviteten til modne og aktive proteiner, høy reproduserbarhet under standardiserte forhold, sine ulemper. Disse inkluderer først og fremst sensitiviteten til cellelinjer ikke for ett cytokin, men for flere relaterte cytokiner, hvis biologiske effekter overlapper hverandre. I tillegg kan det ikke utelukkes at induksjon av produksjon av andre cytokiner av målceller, som kan forvride den testede parameteren (som regel spredning, cytotoksisitet, kjemotaksi). Vi kjenner ennå ikke alle cytokiner og ikke alle deres effekter, derfor vurderer vi ikke selve cytokinet, men den totale spesifikke biologiske aktiviteten. Således er vurderingen av biologisk aktivitet som den totale aktiviteten til forskjellige mediatorer (mangel på spesifisitet) en av ulempene med denne metoden. I tillegg er det umulig å identifisere inaktiverte molekyler og tilhørende proteiner ved bruk av cytokinsensitive linjer. Dette betyr at slike metoder ikke gjenspeiler den faktiske produksjonen for en rekke cytokiner. En annen viktig ulempe ved bruk av cellelinjer er behovet for et laboratorium for cellekultur. I tillegg er alle prosedyrer for dyrking av celler, inkubasjon av dem med proteiner og medier som studeres tidkrevende. Det bør også bemerkes at langvarig bruk av cellelinjer krever fornyelse eller re-sertifisering, siden de som følge av dyrking kan mutere og modifisere, noe som kan føre til en endring i deres følsomhet overfor meklere og en reduksjon i nøyaktigheten til bestemme biologisk aktivitet. Imidlertid er denne metoden ideell for å teste den spesifikke biologiske aktiviteten til rekombinante mediatorer.

Kvantifisering av cytokiner ved bruk av antistoffer.

Cytokiner produsert av immunkompetente og andre celletyper frigjøres til det ekstracellulære rommet for parakrin og autokrine signalinteraksjoner. Ved konsentrasjonen av disse proteinene i blodserumet eller i et betinget miljø kan man bedømme arten av den patologiske prosessen og overskudd eller mangel på visse cellefunksjoner hos pasienten. Metoder for bestemmelse av cytokiner ved bruk av spesifikke antistoffer er i dag de vanligste systemene for påvisning av disse proteinene. Disse metodene har gått gjennom en hel serie modifikasjoner ved bruk av forskjellige etiketter (radioisotop, fluorescerende, elektrokjemiluminescerende, enzym, etc.). Hvis radioisotopmetoder har en rekke ulemper forbundet med bruk av en radioaktiv etikett og begrenset tids mulighet for bruk av merkede reagenser (halveringstid), har enzymkoblede immunosorbentmetoder funnet den mest utbredte bruken. De er basert på visualisering av uløselige produkter fra en enzymatisk reaksjon, som absorberer lys med en kjent bølgelengde, i mengder som tilsvarer konsentrasjonen av analytten. For å binde stoffene som skal måles, brukes antistoffer påført en fast polymerbase, og for visualisering brukes antistoffer konjugert til enzymer, vanligvis alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase. Fordelene med metoden er åpenbare: høy nøyaktighet ved bestemmelse under standardiserte lagringsforhold for reagenser og prosedyrer, kvantitativ analyse og reproduserbarhet. Ulempene inkluderer et begrenset område av bestemte konsentrasjoner, som et resultat av at alle konsentrasjoner som overstiger en viss terskel anses å være lik den. Det bør bemerkes at tiden som kreves for å fullføre metoden varierer avhengig av produsentens anbefalinger. Imidlertid snakker vi uansett om flere timer som kreves for inkubasjoner og vaske med reagenser. I tillegg bestemmes latente og bundne former for cytokiner, som i konsentrasjonen kan overstige frie former, hovedsakelig ansvarlig for meklerens biologiske aktivitet. Derfor er det ønskelig å bruke denne metoden i forbindelse med metoder for å vurdere meklerens biologiske aktivitet. En annen modifikasjon av immunanalysemetoden som har funnet bred anvendelse er elektrokjemiluminescensmetoden (ECL) for bestemmelse av proteiner med antistoffer merket med rutenium og biotin. Denne metoden har følgende fordeler i forhold til radioisotoper og enzymimmunanalyser: enkel implementering, kort utførelsestid for metoden, ingen vaskeprosedyrer, lite prøvevolum, et bredt spekter av bestemte konsentrasjoner av cytokiner i serum og i et betinget miljø, høy følsomhet for metoden og reproduserbarheten. Metoden som vurderes er akseptabel for bruk i både vitenskapelig forskning og kliniske studier. Den neste metoden for vurdering av cytokiner i biologiske medier er utviklet basert på teknologien for strømningsfluorimetri. Den lar deg samtidig evaluere opptil hundrevis av proteiner i en prøve. For tiden er det laget kommersielle sett for bestemmelse av opptil 17 cytokiner. Imidlertid bestemmer fordelene med denne metoden også ulempene. For det første er dette møysommelighet ved valg av optimale betingelser for bestemmelse av flere proteiner, og for det andre er produksjonen av cytokiner av kaskade -karakter med produksjonstopper på forskjellige tidspunkter. Derfor er bestemmelsen av et stort antall proteiner på en gang ikke alltid informativ. Det generelle kravet til immunoassay-metoder ved bruk av den såkalte. "sandwich", er et nøye utvalg av et par antistoffer, som gjør det mulig å bestemme enten den frie eller bundne formen for det analyserte proteinet, som pålegger begrensninger for denne metoden, og som alltid må tas i betraktning når man tolker dataene som er oppnådd. Disse metodene bestemmer den totale produksjonen av cytokiner av forskjellige celler, samtidig er det mulig å bedømme om antigenspesifikk produksjon av cytokiner av immuncompetente celler bare hypotetisk. ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) -systemet er nå utviklet, noe som i stor grad eliminerer disse ulempene. Metoden gjør det mulig å semi-kvantitativt vurdere produksjonen av cytokiner på nivået til individuelle celler. Den høye oppløsningen til denne metoden lar en vurdere antigenstimulert produksjon av cytokiner, noe som er svært viktig for å vurdere en spesifikk immunrespons. Den neste, mye brukte for vitenskapelige formål, er intracellulær bestemmelse av cytokiner ved hjelp av flowcytometri. Fordelene er åpenbare. Vi kan fenotypisk karakterisere populasjonen av cytokinproduserende celler og / eller bestemme spekteret av cytokiner produsert av individuelle celler, med mulighet for en relativ kvantitativ karakterisering av denne produksjonen. Samtidig er den beskrevne metoden ganske komplisert og krever dyrt utstyr. Den neste serien med metoder, som hovedsakelig brukes til vitenskapelige formål, er immunhistokjemiske metoder ved bruk av merkede monoklonale antistoffer. Fordelene er åpenbare - bestemmelse av cytokinproduksjon direkte i vev (in situ), hvor forskjellige immunologiske reaksjoner finner sted. Imidlertid er de vurderte metodene svært arbeidskrevende og gir ikke nøyaktige kvantitative data.

Bestemmelse av cytokiner ved enzymimmunoassay.

Vector-Best CJSC under ledelse av T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov jobber aktivt med å bestemme cytokiner. Cytokiner er en gruppe polypeptidmediatorer, ofte glykosylerte, med molekylvekter fra 8 til 80 kDa. Cytokiner er involvert i dannelsen og reguleringen av kroppens forsvarsreaksjoner og dens homeostase. De er involvert i alle koblinger av den humorale og cellulære immunresponsen, inkludert differensiering av immunkompetente stamceller, antigenpresentasjon, cellulær aktivering og spredning, uttrykk for vedheftsmolekyler og akutt faserespons. Noen av dem er i stand til å utvise mange biologiske effekter på forskjellige målceller. Virkningen av cytokiner på celler utføres på følgende måter: autokrine - på en celle som syntetiserer og utskiller dette cytokinet; parakrin - på celler som ligger i nærheten av produsentcellen, for eksempel i fokus på betennelse eller i lymfoide organet; endokrin -eksternt - på celler i alle organer og vev etter at cytokinet kommer inn i blodsirkulasjonen. Dannelse og frigjøring av cytokiner er vanligvis kortvarig og tett regulert. Cytokiner virker på cellen ved å binde seg til spesifikke reseptorer på den cytoplasmatiske membranen, og forårsaker derved en kaskade av reaksjoner som fører til induksjon, forbedring eller undertrykkelse av aktiviteten til en rekke gener som reguleres av dem. Cytokiner er preget av en kompleks nettverksfunksjon, der produksjonen av en av dem påvirker dannelsen eller manifestasjonen av aktiviteten til en rekke andre. Cytokiner er lokale meklere; derfor er det tilrådelig å måle nivåene i de tilsvarende vevene etter ekstraksjon av vevsproteiner fra biopsier av de tilsvarende organene eller i naturlige væsker: urin, tårevæske, gingival lommevæske, bronkoalveolar skylling, vaginale sekreter, ejakulat , vasker fra hulrommene, ryggmargen eller leddvæsker, etc. Tilleggsinformasjon om tilstanden til kroppens immunsystem kan fås ved å studere blodcellenes evne til å produsere cytokiner in vitro. Plasmacytokinnivåer gjenspeiler den nåværende tilstanden til immunsystemet og utviklingen av forsvarsresponser in vivo. Spontan produksjon av cytokiner ved en kultur av peronale blodmononukleære celler gjør det mulig å vurdere tilstanden til de tilsvarende cellene. Den økte spontane produksjonen av cytokiner indikerer at cellene allerede er aktivert av antigenet in vivo. Indusert produksjon av cytokiner gjør det mulig å vurdere de tilsvarende cellers potensielle evne til å reagere på antigen stimulering. Redusert induksjon av cytokiner in vitro, for eksempel, kan tjene som et av tegnene på en immunsviktstilstand. Derfor er begge alternativene for å studere nivåene av cytokiner både i sirkulerende blod og under produksjonen av cellekulturer viktige med tanke på å karakterisere immunoreaktiviteten til hele organismen og funksjonen til individuelle koblinger i immunsystemet. Inntil nylig, i Russland, var noen få grupper av forskere engasjert i studier av cytokiner, siden biologiske forskningsmetoder er svært tidkrevende, og importerte immunokjemiske sett er veldig dyre. Med ankomsten av tilgjengelige innenlandske enzymkoblede immunosorbent-sett, viser praktiserende leger økende interesse for å studere cytokinprofilen. For øyeblikket er den diagnostiske betydningen av å vurdere nivået av cytokiner å opplyse om en økning eller reduksjon i konsentrasjonen hos en gitt pasient med en bestemt sykdom. For å vurdere alvorlighetsgraden og forutsi sykdomsforløpet, er det tilrådelig å bestemme konsentrasjonen av både anti- og pro-inflammatoriske cytokiner i dynamikken i utviklingen av patologi. For eksempel er innholdet av cytokiner i det perifere blodet bestemt av tidspunktet for forverring, gjenspeiler dynamikken i den patologiske prosessen ved magesår og andre sykdommer i mage -tarmkanalen. I de tidligste stadiene av forverring er det en økning i innholdet av interleukin-1beta (IL-1beta), interleukin-8 (IL-8), deretter konsentrasjonen av interleukin-6 (IL-6), gamma-interferon (gamma -INF), tumornekrosefaktor øker -alfa (alfa -TNF). Konsentrasjonen av interleukin-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF nådde sitt maksimum på høyden av sykdommen, mens innholdet av markører for den akutte fasen i denne perioden nærmet seg normale verdier. På toppen av forverringen overgikk nivået av alfa-TNF signifikant innholdet av interleukin-4 (IL-4) både i blodserumet og direkte i det berørte vevet i peri-ulcer sonen, hvoretter det begynte å gradvis avta. Etter hvert som fenomenene i den akutte fasen avtok og reparasjonsprosessene intensiverte, økte IL-4-konsentrasjonen. Ved endringen i cytokinprofilen kan man bedømme effektiviteten og gjennomførbarheten av cellegift. Når du utfører cytokinbehandling, for eksempel under behandling med alfa-interferon (alfa-IFN), er det nødvendig å kontrollere både nivået av innholdet i sirkulerende blod og produksjonen av antistoffer mot alfa-IFN. Det er kjent at når en stor mengde av disse antistoffene produseres, slutter interferonterapi ikke bare å være effektivt, men kan også føre til autoimmune sykdommer. Nylig har nye medisiner blitt utviklet og introdusert i praksis, som på en eller annen måte endrer cytokinstatusen i kroppen. For eksempel, for behandling av revmatoid artritt, foreslås et legemiddel basert på antistoffer mot alfa-TNF, designet for å fjerne alfa-TNF, som er involvert i ødeleggelse av bindevev. Imidlertid, ifølge både våre data og litteraturen, har ikke alle pasienter med kronisk revmatoid artritt et økt nivå av TNF-alfa, derfor kan en reduksjon i nivået av TNF-alfa for denne gruppen pasienter forverre ubalansen ytterligere immunsystemet. Dermed forutsetter korrekt cytokinbehandling kontroll av organismens cytokinstatus under behandlingen. Den beskyttende rollen til proinflammatoriske cytokiner manifesteres lokalt, i fokus på betennelse, men deres systemiske produksjon fører ikke til utvikling av anti-smittsom immunitet og forhindrer ikke utvikling av bakterietoksisk sjokk, som er årsaken til tidlig dødelighet hos kirurgiske pasienter med purulent-septiske komplikasjoner. Grunnlaget for patogenesen av kirurgiske infeksjoner er utløsningen av cytokinkaskaden, som på den ene siden inkluderer proinflammatoriske og på den andre siden antiinflammatoriske cytokiner. Balansen mellom disse to motstridende gruppene bestemmer i stor grad forløpets art og utfallet av purulent-septiske sykdommer. Bestemmelsen av konsentrasjonen i blodet for ett cytokin fra disse gruppene (for eksempel TNF alfa eller IL-4) vil imidlertid ikke tilstrekkelig gjenspeile tilstanden til hele cytokinbalansen. Derfor er en ett-trinns vurdering av nivået til flere meklere (minst 2-3 av de motsatte undergruppene) nødvendig. For øyeblikket har CJSC "Vector-Best" utviklet og serieprodusert reagenssett for kvantitativ bestemmelse av: tumornekrosefaktor-alfa (sensitivitet-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gamma -interferon (sensitivitet - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukin -4 (sensitivitet - 2 pg / ml, 0–400 pg / ml); interleukin-8 (sensitivitet-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); reseptorantagonist av interleukin-1 (IL-1RA) (sensitivitet-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa interferon (følsomhet - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimmune antistoffer mot alfa-interferon (sensitivitet-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Alle settene er designet for å bestemme konsentrasjonen av disse cytokiner i humane biologiske væsker, i kultursupernatanter når man studerer evnen til menneskelige cellekulturer til å produsere cytokiner in vitro. Analysens prinsipp er en "sandwich" -variant av en fastfaset tretrinns (inkubasjonstid-4 timer) eller totrinns (inkubasjonstid-3,5 timer) enzymbundet immunosorbentanalyse på plater. Analysen krever 100 ul biologisk væske eller kultursupernatant per brønn. Regnskap av resultater - spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. I alle sett er kromogenet tetrametylbenzidin. Holdbarheten til settene våre er forlenget til 18 måneder fra utstedelsesdatoen og 1 måned etter bruk. Analyse av litteraturdata viste at innholdet av cytokiner i blodplasmaet hos friske mennesker avhenger både av settene som ble brukt for å bestemme dem og av regionen der disse menneskene bor. Derfor, for å finne ut verdiene av normale cytokinkonsentrasjoner hos innbyggere i regionen vår, analyserte vi tilfeldige prøver av plasma (fra 80 til 400 prøver) av praktisk talt friske blodgivere, representanter for forskjellige sosiale grupper i alderen 18 til 60 år uten kliniske manifestasjoner av grov somatisk patologi og fravær av HBsAg. antistoffer mot HIV-, hepatitt B- og C -virus.

Svulstnekrosefaktor-alfa.

TNF-alfa er et pleiotropisk proinflammatorisk cytokin som består av to langstrakte b-kjeder med en molekylvekt på 17 kDa og som utfører regulatoriske og effektorfunksjoner i immunresponsen og betennelsen. Hovedprodusentene av alfa-TNF er monocytter og makrofager. Dette cytokinet skilles også ut av blodlymfocytter og granulocytter, naturlige drepeceller og T-lymfocytiske cellelinjer. Hovedinduktorene for alfa-TNF er virus, mikroorganismer og deres metabolisme, inkludert bakteriell lipopolysakkarid. I tillegg kan noen cytokiner, som IL-1, IL-2, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor, alfa- og beta-INF, også spille rollen som indusere. Hovedretningene for den biologiske aktiviteten til alfa-TNF: viser selektiv cytotoksisitet i forhold til noen tumorceller; aktiverer granulocytter, makrofager, endotelceller, hepatocytter (produksjon av proteiner i akutt fase), osteoklaster og kondrocytter (resorpsjon av bein og bruskvev), syntese av andre proinflammatoriske cytokiner; stimulerer spredning og differensiering: nøytrofiler, fibroblaster, endotelceller (angiogenese), hematopoietiske celler, T- og B-lymfocytter; forbedrer strømmen av nøytrofiler fra beinmargen inn i blodet; har antitumor og antiviral aktivitet in vivo og in vitro; deltar ikke bare i forsvarsreaksjoner, men også i ødeleggelses- og reparasjonsprosessene som følger med betennelse; fungerer som en av mediatorene for vevsdestruksjon, som er vanlig ved langvarig, kronisk betennelse.

Ris. 1. Fordeling av nivået av alfa-TNF

i plasmaet av friske givere.

Et økt nivå av alfa-TNF observeres i blodserumet under posttraumatisk tilstand, med lungedysfunksjoner, brudd på normal graviditet, kreft, bronkial astma. Nivået av alfa-TNF er 5-10 ganger høyere enn normen under forverring av den kroniske formen for viral hepatitt C. I perioden med forverring av sykdommer i mage-tarmkanalen overstiger konsentrasjonen av alfa-TNF i serum normen gjennomsnittlig 10 ganger, og hos noen pasienter - 75–80 ganger. Høye konsentrasjoner av alfa -TNF finnes i cerebrospinalvæsken hos pasienter med multippel sklerose og cerebrospinal meningitt, og hos pasienter med revmatoid artritt - i leddvæsken. Dette antyder involvering av TNF alfa i patogenesen av en rekke autoimmune sykdommer. Frekvensen for påvisning av alfa -TNF i blodserum, selv med alvorlig betennelse, overstiger ikke 50%, med indusert og spontan produksjon - opptil 100%. Konsentrasjonsområdet for alfa-TNF var 0-6 pg / ml, gjennomsnittet-1,5 pg / ml (fig. 1).

Gamma interferon.

Ris. 2. Fordeling av IFN-gamma nivåer

i plasmaet av friske givere.

Interleukin-4

IL-4 er et glykoprotein med en molekylvekt på 18–20 kDa, en naturlig hemmer av betennelse. Sammen med IFN-gamma er IL-4 et sentralt cytokin produsert av T-celler (hovedsakelig TH-2-lymfocytter). Den støtter TH-1 / TH-2 balanse. Hovedretningene for den biologiske aktiviteten til IL-4: forbedrer eosinofili, akkumulering av mastceller, sekresjon av IgG4, TH-2-mediert humoralt immunrespons; besitter lokal antitumoraktivitet, stimulerer populasjonen av cytotoksiske T-lymfocytter og tumorinfiltrering av eosinofiler; hemmer frigjøring av inflammatoriske cytokiner (alfa-TNF, IL-1, IL-8) og prostaglandiner fra aktiverte monocytter, produksjon av cytokiner av TH-1 lymfocytter (IL-2, gamma-INF, etc.).

Ris. 3. Fordeling av nivået av IL-4 i plasma

friske givere.

Et økt nivå av IL-4 både i serum og i stimulerte lymfocytter kan observeres ved allergiske sykdommer (spesielt på tidspunktet for forverring), som bronkial astma, allergisk rhinitt, høysnue, atopisk dermatitt, ved sykdommer i mage-tarmkanalen. Nivået av IL-4 er også markant økt hos pasienter med kronisk hepatitt C (CHC). I perioder med forverring av CHC øker mengden nesten 3 ganger sammenlignet med normen, og under remisjon av CHC reduseres nivået av IL-4, spesielt på bakgrunn av behandling med rekombinant IL-2. Intervallet for IL-4-konsentrasjoner var 0–162 pg / ml, gjennomsnittet var 6,9 pg / ml, det normale området var 0–20 pg / ml (fig. 3).

Interleukin-8

IL-8 tilhører kjemokiner, det er et protein med en molekylvekt på 8 kDa. IL-8 produseres av mononukleære fagocytter, polymorfonukleære leukocytter, endotelceller og andre celletyper som respons på forskjellige stimuli, inkludert bakterier og virus og deres metabolske produkter, inkludert proinflammatoriske cytokiner (for eksempel IL-1, alfa-TNF). Hovedrollen til interleukin-8 er å forbedre kjemotaksen til leukocytter. Det spiller en viktig rolle i både akutt og kronisk betennelse. Et økt nivå av IL-8 observeres hos pasienter med bakterielle infeksjoner, kroniske lungesykdommer og sykdommer i mage-tarmkanalen. Plasmanivåene av IL-8 er forhøyet hos pasienter med sepsis, og høye konsentrasjoner er forbundet med økt dødelighet. Resultatene av måling av innholdet av IL-8 kan brukes til å overvåke behandlingsforløpet og forutsi utfallet av sykdommen. Dermed ble det funnet et økt innhold av IL-8 i tårevæsken hos alle pasienter med et gunstig forløp av hornhinnesår. Hos alle pasienter med et komplisert forløp av hornhinnesår var konsentrasjonen av IL-8 8 ganger høyere enn hos pasienter med et gunstig sykdomsforløp. Således kan innholdet av proinflammatoriske cytokiner (spesielt IL-8) i tårevæsken i hornhinnesår brukes som et prognostisk kriterium for sykdomsforløpet.

Ris. 4. Fordeling av IL-8-nivået i

plasma av friske donorer (Novosibirsk).

I henhold til våre og publiserte data, hos friske mennesker, oppdages IL-8 ekstremt sjelden i blodserumet; spontan produksjon av IL-8 av mononukleære blodceller observeres hos 62%, og indusert produksjon hos 100% av friske donorer. Intervallet for IL-8-konsentrasjoner var 0–34 pg / ml, gjennomsnittet var 2 pg / ml, det normale området var 0–10 pg / ml (fig. 4).

Ris. 5. Fordeling av nivået av IL-8 i plasma

friske givere (Rubtsovsk).

Interleukin-1 reseptorantagonist.

IL-1RA tilhører cytokiner, er et oligopeptid med en molekylvekt på 18-22 kDa. IL-1RA er en endogen hemmer av IL-1, produsert av makrofager, monocytter, nøytrofiler, fibroblaster og epitelceller. IL-1RA hemmer den biologiske aktiviteten til interleukinene IL-1alfa og IL-1beta, og konkurrerer med dem om binding til cellereseptoren.

Ris. 6. Fordeling av IL-1RA-nivået

i plasmaet av friske givere

Produksjonen av IL-1RA stimuleres av mange cytokiner, virusprodukter og proteiner i akuttfase. IL-1RA kan aktivt uttrykkes i inflammatoriske foci ved mange kroniske sykdommer: revmatoid og ung kronisk artritt, systemisk lupus erythematosus, iskemiske hjerneskader, inflammatoriske tarmsykdommer, bronkial astma, pyelonefrit, psoriasis og andre. Ved sepsis er den høyeste økningen i IL-1RA notert-opptil 55 ng / ml i noen tilfeller, og det ble funnet at økte konsentrasjoner av IL-1RA korrelerer med en gunstig prognose. Høye nivåer av IL-1RA observeres hos svært overvektige kvinner, og dette nivået synker markant innen 6 måneder etter fettsuging. Intervallet for IL-1RA-konsentrasjoner var 0–3070 pg / ml, gjennomsnittet var 316 pg / ml. Normalområdet er 50–1000 pg / ml (fig. 6).

Alpha interferon.

Alpha-IFN er et monomert ikke-glykosylert protein med en molekylvekt på 18 kDa, som hovedsakelig syntetiseres av leukocytter (B-lymfocytter, monocytter). Dette cytokinet kan også produseres av praktisk talt hvilken som helst celletype som svar på passende eksitasjon, og intracellulære virusinfeksjoner kan være sterke stimulatorer for IFN-alfa-syntese. Alpha-IFN-indusere inkluderer: virus og deres produkter, blant annet er det ledende stedet opptatt av dobbeltstrengede RNA produsert under viral replikasjon, samt bakterier, mykoplasmer og protozoer, cytokiner og vekstfaktorer (som IL-1, IL- 2, alfa -FNO, kolonistimulerende faktorer, etc.). Den første forsvarsreaksjonen til kroppens uspesifikke antibakterielle immunrespons inkluderer induksjon av alfa og beta IFN. I dette tilfellet produseres det av antigenpresenterende celler (makrofager) som har invadert bakterier. Interferoner (inkludert alfa-IFN) spiller en viktig rolle i den uspesifikke koblingen til den antivirale immunresponsen. De forbedrer antiviral resistens ved å indusere i celler syntesen av enzymer som undertrykker dannelsen av nukleinsyrer og proteiner av virus. I tillegg har de en immunmodulerende effekt, forbedrer ekspresjonen av antigener i det viktigste histokompatibilitetskomplekset i celler. En endring i innholdet av alfa-IFN ble påvist ved hepatitt og skrumplever i viral etiologi. På tidspunktet for forverring av virusinfeksjoner øker konsentrasjonen av dette cytokinet betydelig hos de fleste pasienter, og i løpet av rekonvalesensperioden synker det til et normalt nivå. Det er vist et forhold mellom serumnivået av alfa-INF og alvorlighetsgraden og varigheten av influensainfeksjonen.

Ris. 7. Fordeling av nivået av alfa-IFN

i plasmaet av friske givere.

En økning i konsentrasjonen av alfa-IFN er notert i serum hos de fleste pasienter som lider av autoimmune sykdommer som polyartritt, revmatoid artritt, spondylose, psoriasisartritt, polymyalgia rheumatica og sklerodermi, systemisk lupus erythematosus og systemisk vaskulitt. Et høyt nivå av dette interferon er også observert hos noen pasienter under en forverring av magesår og kolelithiasis. Konsentrasjonen av alfa-INF var 0–93 pg / ml, gjennomsnittet var 20 pg / ml. Normalområdet er opptil 45 pg / ml (fig. 7).

Antistoffer mot alfa-IFN.

Antistoffer mot alfa-IFN kan påvises i sera til pasienter med somatisk erytematøs lupus. Spontan induksjon av antistoffer mot alfa-IFN observeres også i sera til pasienter med ulike former for kreft. I noen tilfeller ble det funnet antistoffer mot alfa-IFN i sera til HIV-infiserte pasienter, så vel som i cerebrospinalvæsken og sera hos pasienter med meningitt i den akutte fasen, i sera til pasienter med kronisk polyartritt.

Ris. 8. Fordeling av nivået av antistoffer mot alfa-IFN

i plasmaet av friske givere.

Alpha-IFN er et av de effektive antivirale og antitumor terapeutiske legemidlene, men langvarig bruk kan føre til produksjon av spesifikke antistoffer mot alfa-IFN. Dette reduserer effektiviteten av behandlingen, og forårsaker i noen tilfeller forskjellige bivirkninger: fra influensalignende til utvikling av autoimmune sykdommer. På grunn av dette, under INF-terapi, er det viktig å kontrollere nivået av antistoffer mot alfa-INF i pasientens kropp. Dannelsen avhenger av hvilken type legemiddel som brukes i terapi, varigheten av behandlingen og typen sykdom. Konsentrasjonen av antistoffer mot alfa-IFN var 0–126 ng / ml, gjennomsnittet var 6,2 ng / ml. Normalområdet er opptil 15 ng / ml (fig. 8). Evaluering av nivået av cytokiner ved bruk av reagenssett som er kommersielt tilgjengelige på CJSC "Vector-Best" tillater en ny tilnærming til studiet av tilstanden til kroppens immunsystem i klinisk praksis.

Immunotrope legemidler basert på cytokiner.

Interessant arbeid S. Simbirtseva, State Research Institute of Highly Pure Biological Products, Ministry of Health of Russia, St. Petersburg). Cytokiner kan isoleres til et nytt uavhengig system for regulering av kroppens hovedfunksjoner, som eksisterer sammen med nervøse og endokrine regulering og er først og fremst forbundet med å opprettholde homeostase under introduksjon av patogener og brudd på vevets integritet. Denne nye klassen av regulatoriske molekyler ble skapt av naturen i løpet av millioner av år med evolusjon og har et ubegrenset potensial for bruk som medisiner. Innenfor immunsystemet formidler cytokiner forholdet mellom uspesifikke forsvarsresponser og spesifikk immunitet, og virker i begge retninger. På kroppsnivå kommuniserer cytokiner mellom immunsystemet, nervøse, endokrine, hematopoietiske og andre systemer og tjener til å involvere dem i organisering og regulering av forsvarsreaksjoner. Drivkraften bak den intensive studien av cytokiner har alltid vært den lovende utsikten for deres kliniske bruk for behandling av utbredte sykdommer, inkludert kreft, smittsomme og immunsviktssykdommer. Flere cytokinpreparater er registrert i Russland, inkludert interferoner, kolonistimulerende faktorer, interleukiner og deres antagonister og tumornekrosefaktor. Alle cytokinpreparater kan deles inn i naturlige og rekombinante. Naturlige preparater er preparater av varierende grad av rensing, hentet fra kulturmediet til stimulerte eukaryote celler, hovedsakelig humane celler. De største ulempene er den lave rensegraden, umuligheten av standardisering på grunn av det store antallet komponenter og bruk av blodkomponenter i produksjonen. Tilsynelatende er fremtiden for cytokinterapi assosiert med genetisk manipulerte legemidler oppnådd ved hjelp av de siste fremskrittene innen bioteknologi. I løpet av de siste to tiårene har genene til de fleste cytokiner blitt klonet og det er oppnådd rekombinante analoger som fullstendig gjentar de biologiske egenskapene til naturlige molekyler. I klinisk praksis er det tre hovedområder for bruk av cytokin:

1) cytokinbehandling for å aktivere kroppens forsvarsreaksjoner, immunmodulering eller påfyll av mangel på endogene cytokiner,

2) anti-cytokin immunsuppressiv behandling rettet mot å blokkere den biologiske virkningen av cytokiner og deres reseptorer,

3) cytokin genterapi med sikte på å øke antitumorimmuniteten eller korrigere genetiske defekter i cytokinsystemet.

En rekke cytokiner kan brukes klinisk for systemisk og lokal bruk. Systemisk administrasjon er berettiget i tilfeller der det er nødvendig å sikre virkningen av cytokiner i flere organer for mer effektiv aktivering av immunitet, eller for å aktivere målceller som ligger i forskjellige deler av kroppen. I andre tilfeller har aktuell applikasjon en rekke fordeler, siden den lar deg oppnå en høy lokal konsentrasjon av det aktive prinsippet, målorgan-mål og unngå uønskede systemiske manifestasjoner. For tiden regnes cytokiner som et av de mest lovende stoffene for bruk i klinisk praksis.

Konklusjon.

For øyeblikket er det derfor ingen tvil om at cytokiner er de viktigste faktorene i immunopatogenese. Studien av nivået av cytokiner gir informasjon om den funksjonelle aktiviteten til forskjellige typer immuncompetente celler, forholdet mellom aktiveringsprosessene til T-hjelpere av type I og II, noe som er svært viktig i differensialdiagnosen av en rekke smittsomme og immunopatologiske prosesser. Cytokiner er spesifikke proteiner gjennom hvilke cellene i immunsystemet kan utveksle informasjon og samhandle med hverandre. I dag har mer enn hundre forskjellige cytokiner blitt oppdaget, som konvensjonelt er delt inn i pro-inflammatorisk (provoserende betennelse) og antiinflammatorisk (forhindrer utvikling av betennelse). Så de forskjellige biologiske funksjonene til cytokiner er delt inn i tre grupper: de styrer utvikling og homeostase av immunsystemet, styrer veksten og differensieringen av blodceller (hematopoietisk system) og deltar i uspesifikke beskyttende reaksjoner i kroppen, som påvirker inflammatoriske prosesser, blodkoagulasjon, blodtrykk.

Liste over brukt litteratur.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mikhailova. / Russian State Medical University, State Scientific Center of Coloproctology, Moskva og State Research Institute of Highly Pure Biological Products, St. Petersburg.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Journal "Cytokines and inflammation", 2005, nr. 1 T. 4, nr. 1. S.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov, arbeidsmaterialer fra JSC "Vector-Best".

A.Simbirtsev, State Research Institute of Highly Pure Biologicals, Russlands helsedepartement, St. Petersburg.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg.

T.A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Tørrvarm. Institutt for anestesiologi og reanimatologi, Vladivostok State Medical University.

I arbeidet brukte materialer fra nettstedet http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

visse patogener av smittsomme sykdommer. Så, norsulfazol ...

1. Antiviral immunitet molekylære og cellulære mekanismer, utviklingsmønstre og immunopatho

   Abstract >> Medisin, helse

   ... "nettsted" refererer til et bestemt nettsted en viss polypeptid (antigen) som ... sine tidlige stadier med. Cytokiner og kjemokiner. Annen cytokiner, i tillegg til interferoner, ... produsert av dem per tidsenhet cytokiner bestemmer intensiteten av spredning og ...

2. Studie av årsakene til utvikling av beinmargsfibrose ved myeloproliferative sykdommer ved å analysere effekten av blodplatefaktorer på mesenkymale stamceller

   Lekser >> Medisin, helse

   Ulike konsentrasjoner; - kvantitativt definisjon protein i eksperimentelle systemer ... føre til langvarig handling cytokin, som forbedrer prosessen med fibrose ... blodplater. Også økt innhold cytokin ble funnet i urinen ...

3. Patogenese av tuberkulose hos mennesker

   Abstract >> Medisin, helse

   Men mat er også mulig. En viss spiller en rolle i aerogen infeksjon ... skuespill, utskilt av makrofager og monocytter cytokin- tumornekrosefaktor (TNF). ... ioner, hver celle besitter sikker et system som sikrer transport av stoffer ...

Cytokiner er viktige humorale faktorer for betennelse som er nødvendige for implementering av beskyttelsesfunksjonene til medfødt immunitet. Tre grupper av cytokiner er involvert i utviklingen av betennelse-inflammatoriske eller proinflammatoriske cytokiner, kjemokiner, kolonistimulerende faktorer, samt funksjonelt relaterte faktorer IL-12 og IFNy. Cytokiner spiller også en viktig rolle i å undertrykke og kontrollere den inflammatoriske responsen. Antiinflammatoriske cytokiner inkluderer transformerende vekstfaktor β (TGFp), IL-10; ofte spiller rollen som antiinflammatorisk faktor IL-4.
Det er 3 hovedrepresentanter for gruppen av proinflammatoriske cytokiner-TNFa, IL-1 og IL-6; relativt nylig har IL-17 og IL-18 blitt lagt til disse. Disse cytokinene produseres hovedsakelig av aktiverte monocytter og makrofager, hovedsakelig på stedet for betennelse. Proinflammatoriske cytokiner kan også produseres av nøytrofiler, dendritiske celler, aktiverte B-, NK- og T-lymfocytter. I fokus for patogenpenetrasjon er cytokiner de første som syntetiserer noen få lokale inflammatoriske makrofager. I emigrasjonsprosessen av leukocytter fra blodet øker antallet produsentceller og spekteret deres utvides. Spesielt er epitel, endotel, synovial, glialceller og fibroblaster stimulert av produktene fra mikroorganismer og betennelsesfaktorer knyttet til syntesen av proinflammatoriske cytokiner. Cytokin -gener er klassifisert som induserbare. Naturlige indusere av uttrykket er patogener og deres produkter, som virker gjennom TLR og andre patogene reseptorer. Den klassiske induktoren er bakteriell LPS. Samtidig er noen proinflammatoriske cytokiner (IL-1, TNFa) selv i stand til å indusere syntese av proinflammatoriske cytokiner.
Proinflammatoriske cytokiner syntetiseres og utskilles ganske raskt, selv om kinetikken for syntese av forskjellige cytokiner i denne gruppen ikke er den samme. I typiske tilfeller (raskt alternativ) er uttrykket for deres mRNA notert 15-30 minutter etter induksjon, utseendet til et proteinprodukt i cytoplasma-etter 30-60 minutter når innholdet i det ekstracellulære miljøet et maksimum på 3- 4 timer. Syntesen av cytokiner av en bestemt celle fortsetter ganske kort tid - vanligvis litt mer enn en dag. Ikke alt syntetisert materiale skilles ut. En viss mengde cytokiner uttrykkes på celleoverflaten eller finnes i cytoplasmatiske granuler. Frigjøring av granulat kan forårsake de samme aktiverende signalene som produksjon av cytokiner. Dette gir en rask (innen 20 minutter) strøm av cytokiner til lesjonsfokuset.
Proinflammatoriske cytokiner har mange funksjoner. Deres hovedrolle er "organisering" av den inflammatoriske responsen (fig. 2.55). En av de viktigste og tidlige effektene av proinflammatoriske cytokiner er en økning i uttrykk for adhesjonsmolekyler på endotelceller, så vel som på leukocytter selv, noe som fører til migrasjon av leukocytter fra blodet til betennelsesfokuset (se avsnitt 2.3.3 ). I tillegg induserer cytokiner en økning i oksygenmetabolismen i celler, uttrykk for reseptorer for cytokiner og andre betennelsesfaktorer, stimulering av produksjon av cytokiner, bakteriedrepende peptider, etc. Proinflammatoriske cytokiner har en overveiende lokal effekt. Inntak av overdreven utskilte proinflammatoriske cytokiner i sirkulasjonen bidrar til manifestasjon av systemiske effekter av betennelse, og stimulerer også produksjon av cytokiner av celler som er fjernt fra betennelsesfokus. På systemisk nivå stimulerer proinflammatoriske cytokiner produksjonen av proteiner i akuttfase, forårsaker økning i kroppstemperatur og virker på

Ris. 2.55. Intracellulær signalering utløst av proinflammatoriske cytokiner og mekanismer for proinflammatorisk genaktivering

endokrine og nervesystem, og i høye doser føre til utvikling av patologiske effekter (kjøtt til sjokk, ligner septisk).
IL-1 er den kollektive betegnelsen for en proteinfamilie som inneholder mer enn 11 molekyler. Funksjonen til de fleste av dem er ukjent, men 5 molekyler-IL-1a (i henhold til moderne klassifisering-IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) og IL-33 (IL-1F11) er aktive cytokiner.
IL-1a og IL-1P kalles tradisjonelt IL-1 fordi de interagerer med den samme reseptoren og virkningen deres ikke kan skilles. Genene for disse cytokinene er lokalisert i den lange armen på humant kromosom 2. Homologien mellom dem på nukleotidnivået er 45%, på aminosyrenivået - 26%. Begge molekylene har en p-brettet struktur: de inneholder 6 par antiparallelle p-lag og har en trefoil-form. Cellene syntetiserer et forløpermolekyl med en molekylvekt på ca. 30 kDa, uten signalpeptider, noe som indikerer en uvanlig måte å behandle IL-1-molekylet på. Molekylvekten til modne proteiner er omtrent 18 kDa.
IL -1a eksisterer i tre former - intracellulær (et løselig molekyl er tilstede i cytosolen og utfører regulatoriske funksjoner), membran (molekylet leveres til celleoverflaten gjennom en mekanisme som ligner reseptorresirkulering og er forankret i membranen) og sekresjon (molekylet utskilles i sin opprinnelige form, men gjennomgår behandling - spaltning av ekstracellulære proteaser med dannelse av et aktivt cytokin som veier 18 kDa). Hovedvarianten av IL-1a-molekylet hos mennesker er membranvarianten. I denne formen er effekten av cytokinet mer uttalt, men manifesterer seg bare lokalt.
Behandlingen av IL-1P skjer inne i cellen med deltagelse av et spesialisert enzym, IL-1-konvertase (caspase 1), lokalisert i lysosomer.
Dette enzymet aktiveres som en del av inflammosomet - en midlertidig supramolekylær struktur som inkluderer, i tillegg til inaktiv caspase 1, intracellulære reseptorer fra NLR -familien (se avsnitt 2.2.3) - NOD1, NOD2, IPAF, etc. som forårsaker utviklingen av et aktiveringssignal. Dette resulterer i dannelsen av transkripsjonsfaktoren NF-kB og induksjon av proinflammatoriske gener, samt aktivering av inflammosomet og caspase 1. Det inneholder det aktiverte enzymet som klyver IL-1P-forløpermolekylet, og resulterende modent cytokin med en molekylvekt på 18 kDa utskilles av cellen.
IL-1a, IL-1P og reseptorantagonisten til IL-1 deler vanlige reseptorer som spontant uttrykkes på mange celletyper. Når celler aktiveres, øker antallet membranreseptorer for IL-1 på dem. Den viktigste, IL-1RI, inneholder 3 immunglobulinlignende domener i den ekstracellulære delen. Den intracellulære delen er TIR -domenet, som strukturelt ligner analoge TLR -domener og utløser de samme signalveiene (se avsnitt 2.2.1). Antallet av disse reseptorene er lite (200-300 per celle), men de har en høy affinitet for IL-1 (Kd er 10-11 M). En annen reseptor, IL-1RII, mangler en signalkomponent i den cytoplasmatiske delen, sender ikke et signal og fungerer som lokkingsreseptor. Signaltransduksjonen fra IL-1RI involverer de samme faktorene som for TLR (for eksempel MyD88, IRAK og TRAF6), noe som fører til lignende resultater-dannelsen av transkripsjonsfaktorer NF-kB og AP-1, som forårsaker uttrykk for det samme settet med gener (se fig. 2.12). Disse genene er ansvarlige for syntesen av proinflammatoriske cytokiner, kjemokiner, adhesjonsmolekyler, enzymer som gir baktericid virkning av fagocytter og andre gener hvis produkter er involvert i utviklingen av den inflammatoriske responsen. IL-1 tilhører selve produktene, hvis sekresjon induseres av IL-1, dvs. i dette tilfellet utløses en positiv tilbakemeldingssløyfe.
Alle celler i kroppen kan potensielt være mål for IL-1. I størst grad påvirker dets virkning endotelceller, alle typer leukocytter, celler i brusk og beinvev, synoviale og epitelceller, mange typer nerveceller. Under påvirkning av IL-1 induseres uttrykk for mer enn 100 gener; mer enn 50 forskjellige biologiske reaksjoner realiseres med sin deltakelse. Hovedeffektene av IL-1 er emigrasjon av leukocytter og aktivering av deres fagocytiske og bakteriedrepende aktivitet. De påvirker også koagulasjonssystemet og vaskulær tone, og bestemmer egenskapene til hemodynamikk i fokus på betennelse. IL-1 har en mangefasettert effekt på celler av ikke bare medfødt, men også adaptiv immunitet, som vanligvis stimulerer manifestasjonene til begge.
IL-1 har mange systemiske effekter. Det stimulerer produksjonen av akutte faseproteiner av hepatocytter, når det virker i sentrum av termoregulering av hypothalamus, forårsaker utvikling av feber, deltar i utviklingen av systemiske manifestasjoner av den inflammatoriske prosessen (for eksempel ubehag, nedsatt appetitt, døsighet, adynamia), som er assosiert med virkningen av IL-1 på sentralnervesystemet. Ved å øke ekspresjonen av reseptorer for kolonistimulerende faktorer, forbedrer IL-1 hematopoiesis, som er assosiert med dets radiobeskyttende effekt. IL-1 stimulerer frigjøring av leukocytter fra beinmargen, først og fremst nøytrofile, inkludert umodne, noe som fører til utseende av leukocytose under betennelse og en forskyvning av leukocyttformelen til venstre (akkumulering av umodne celleformer). Effektene av IL-1 påvirker autonome funksjoner og enda høyere nervøs aktivitet (endringer i atferdsresponser, etc.). Kondrocytter og osteocytter kan også være mål for IL-1, som er forbundet med IL-1s evne til å forårsake ødeleggelse av brusk og bein når de er involvert i den inflammatoriske prosessen, og omvendt, hyperplasi av patologiske vev (pannus i revmatoid leddgikt). Den skadelige effekten av IL-1 manifesteres også i septisk sjokk, leddskade ved revmatoid artritt og en rekke andre patologiske prosesser.
Duplisering av IL-1-effekter av bakterielle produkter er forbundet med behovet for multippel reproduksjon av den aktiverende effekten av patogener uten spredning. Mikroorganismer stimulerer bare celler i umiddelbar nærhet av inngangsstedet, hovedsakelig lokale makrofager. Deretter gjengis den samme effekten mange ganger av IL-1p-molekylene. Oppfyllelsen av denne funksjonen med IL-1 blir lettere ved at nesten alle cellene i kroppen uttrykker deres reseptorer ved aktivering (skjer hovedsakelig i fokus for betennelse).
IL-1-reseptorantagonisten (IL-1RA) er homolog med IL-1a og IL-1P (homologi er henholdsvis 26% og 19%). Den interagerer med IL-1-reseptorer, men klarer ikke å overføre et signal til cellen. Som et resultat fungerer IL-1RA som en spesifikk antagonist av IL-1. IL-1RA skilles ut av de samme cellene som IL-1, denne prosessen krever ikke deltakelse av caspase 1. Produksjonen av IL-1RA induseres av de samme faktorene som syntesen av IL-1, men noe av det er spontant produsert av makrofager og hepatocytter. Som et resultat er denne faktoren konstant tilstede i blodserumet. Dette er sannsynligvis nødvendig for å forhindre de negative konsekvensene av den systemiske virkningen av IL-1, som produseres i betydelige mengder ved akutt betennelse. Rekombinant IL-1RA testes for tiden som et legemiddel for behandling av kroniske inflammatoriske sykdommer (revmatoid artritt, etc.)
IL-18 er et proinflammatorisk cytokin relatert til IL-f: det syntetiseres også som en forløper omdannet av caspase 1; samhandler med en reseptor, hvis cytoplasmatiske del inneholder TIR-domenet og sender et signal som fører til aktivering av NF-kB. Som et resultat skjer aktivering av alle proinflammatoriske gener, men det er mindre uttalt enn med virkningen av IL-1. En egen egenskap for IL-18 er induksjon (spesielt i kombinasjon med IL-12) av IFNy-syntese av celler. I fravær av IL-12 induserer IL-18 syntesen av IFNy-antagonisten, IL-4, og fremmer utviklingen av allergiske reaksjoner. Virkningen av IL-18 er begrenset av den oppløselige antagonisten som binder den i væskefasen.
IL-33 er strukturelt veldig lik IL-18. Behandlingen av IL-33 skjer også med deltagelse av caspase 1. Dette cytokinet skiller seg imidlertid fra andre medlemmer av IL-1-familien i funksjonene den utfører. Det unike ved virkningen av IL-33 skyldes i stor grad at dens reseptor uttrykkes selektivt på Ig2-celler. I denne forbindelse fremmer IL-33 utskillelsen av ^ 2-cytokiner IL-4, IL-5, IL-13 og utvikling av allergiske prosesser. Det har ingen signifikant pro-inflammatorisk effekt.
Tumornekrosefaktor a (TNFa eller TNFa) er medlem av en annen familie av immunologisk signifikante proteiner. Det er et proinflammatorisk cytokin med et bredt spekter av aktivitet. TNFa har en b-fold struktur. Det syntetiseres som et funksjonelt aktivt membranmolekyl pro-TNFa med en molekylvekt på 27 kDa, som er et type II transmembranprotein (det vil si at den N-terminale delen er rettet inn i cellen). Som et resultat av proteolyse dannes en oppløselig monomer med en molekylvekt på 17 kDa i det ekstracellulære domenet. TNFa -monomerer danner spontant en 52 kDa trimer som representerer hovedformen av dette cytokinet. Trimeren har en klokkeformet form, og underenhetene er forbundet med sine C-ender, som hver inneholder 3 bindingssteder med reseptoren, mens N-endene ikke er koblet til hverandre og ikke deltar i interaksjon med reseptorer (og derfor i utførelsen av sine funksjoner av cytokinet). Ved sure pH-verdier får TNFa en a-spiralformet struktur, noe som forårsaker en endring i noen av funksjonene, spesielt økt cytotoksisitet. TNF er et prototypisk medlem av den store familien av molekyler i TNF -superfamilien (tabell 2.31). Det inkluderer lymfotoksiner a og b (bare det første finnes i en løselig form), samt mange membranmolekyler involvert i intercellulære interaksjoner (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), som vil bli nevnt nedenfor i forskjellige sammenhenger. I følge den moderne nomenklaturen består navnet på medlemmene av superfamilien av en forkortelse TNFSF og et serienummer (for TNFa - TNFSF2, for lymfotoksin a - TNFSF1).
Tabell 2.31. Hovedrepresentantene for familiene til tumornekrosefaktor og dens reseptorer

Faktor (ligand)	Chro mosoma	Molekylvekt, kDa	Reseptor
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimer - 52; glykosylert form - 25.6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Lymfotoksin (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Lymfotoksin B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
TRAIL (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
APRIL (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
LYS (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Hovedprodusentene av TNFa, som IL-1, er monocytter og makrofager. Det skilles også ut av nøytrofiler, endotel- og epitelceller, eosinofiler, mastceller, B- og T-lymfocytter når de er involvert i den inflammatoriske prosessen. TNFa oppdages i blodet tidligere enn andre proinflammatoriske cytokiner - allerede 20-30 minutter etter induksjon av betennelse, som er forbundet med "dumping" av membranformen til molekylet av cellene, og muligens også med frigjøring av TNFa i granulatinnholdet.
Det er to typer TNF -reseptorer, vanlige for TNFa og lymfotoksin a - TNFRI (fra tumornekrosefaktorreseptor I) og TNFRII med molekylvekter på henholdsvis 55 og 75 kDa. TNFRI er tilstede på nesten alle celler i kroppen, bortsett fra erytrocytter, og TNFRII er hovedsakelig tilstede på celler i immunsystemet. TNFR danner en stor familie, som inkluderer molekyler involvert i celleinteraksjoner og induksjon av celledød - apoptose. Affiniteten til TNFa for TNFRI er lavere enn for TNFRII (henholdsvis ca. 5x10-10 M og 55x10-11 M.) Når TNFa-trimeren binder seg, skjer trimeriseringen av dens reseptorer, nødvendig for signaloverføring.
Funksjonene ved signaloverføring fra disse reseptorene bestemmes i stor grad av strukturen til deres intracellulære del. Den cytoplasmatiske delen av TNFRI er representert av det såkalte dødsdomenet, hvorfra det mottas signaler som fører til aktivering av apoptosemekanismen; TNFRII mangler et dødsdomene. Signalering fra TNFRI skjer med deltagelse av adapterproteiner TRADD (TNFR-assosiert dødsdomene) og FADD (Fas-assosiert dødsdomene), som også inneholder dødsdomener. I tillegg til banen som fører til utvikling av apoptose (gjennom aktivering av caspase 8 eller syntesen av ceramid), skilles det ut flere signalveier, som aktiveres med deltakelse av faktorene TRAF2 / 5 og RIP-1. Den første av disse faktorene sender et signal langs banen som fører til aktivering av NF-kB-faktoren, dvs. ved den klassiske induksjonsveien for proinflammatoriske gener (se figur 2.55). Signalveien aktivert av faktor RIP-1 fører til aktivering av MAP-kaskaden med sluttproduktet, transkripsjonsfaktoren AP-1. Denne faktoren inkluderer gener som sikrer celleaktivering og forhindrer utvikling av apoptose. Dermed bestemmes celleskjebnen av balansen mellom pro- og anti-apoptotiske mekanismer som utløses når TNFa binder seg til TNFRI.
Implementeringen av funksjonene til TNFa er hovedsakelig forbundet med virkningen gjennom TNFRI - deaktivering av det tilsvarende genet fører til utvikling av alvorlig immunsvikt, mens konsekvensene av inaktivering av TNFRII -genet er ubetydelige. På toppen av den inflammatoriske responsen kan TNFa-reseptorer "dumpes" fra membranen og slippes ut i det intercellulære rommet, hvor de binder TNFa, og utøver en antiinflammatorisk effekt. I denne forbindelse brukes oppløselige former for TNFR ved behandling av kroniske inflammatoriske sykdommer. Det viste seg at stoffet basert på løselig TNFRII viste seg å være det mest effektive klinisk.
I likhet med IL-1 forbedrer TNFa ekspresjonen av vedheftsmolekyler, syntesen av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner, proteiner i akuttfase, enzymer fra fagocytiske celler, etc. Sammen med IL-1 er TNFa involvert i dannelsen av alle de store lokale, så vel som noen systemiske manifestasjoner av betennelse. Det aktiverer endotelceller, stimulerer angiogenese, forbedrer migrasjon og aktiverer leukocytter. TNFa påvirker aktivering og spredning av lymfocytter i større grad enn IL-1. I kombinasjon med IFNy induserer TNFa aktiviteten til NO -syntase i fagocytter, noe som forbedrer deres bakteriedrepende potensial betydelig. TNFa stimulerer spredning av fibroblast og fremmer sårheling. Med økt lokal produksjon av TNFa råder vevsskadeprosesser, manifestert av utvikling av hemoragisk nekrose. I tillegg hemmer TNFa aktiviteten til lipoproteinlipase, noe som svekker lipogenesen og fører til utvikling av kakeksi (et av de opprinnelige navnene på TNFa er kakeksin). En økt frigjøring av TNFa og dens akkumulering i sirkulasjonen, for eksempel under påvirkning av høye doser av bakterielle superantigener, forårsaker utvikling av alvorlig patologi - septisk sjokk. Dermed kan virkningen av TNFa, rettet mot å utføre en beskyttende funksjon og opprettholde homeostase, ledsages av alvorlige toksiske effekter (lokale og systemiske), som ofte forårsaker død.
IL-6 er et bredspektret proinflammatorisk cytokin. Det fungerer også som en prototypisk faktor i cytokinfamilien, som i tillegg til IL-6 i seg selv inkluderer onkostatin M (OSM), leukemihemmende faktor (LIF), ciliær nevrotrofisk faktor (CNTF), kardiotropin-1 (CT-1) ), og IL-11 og IL-31. Molekylvekten til IL-6 er 21 kDa. IL-6 produseres av monocytter og makrofager, endotel, epitel, glial, glatte muskelceller, fibroblaster, T-lymfocytter av Th2-typen, samt mange tumorceller. Produksjonen av IL-6 av myeloide celler induseres av interaksjonen mellom deres TLRer med mikroorganismer og deres produkter, samt av påvirkning av IL-1 og TNFa. I dette tilfellet, innen 2 timer, øker innholdet av IL-6 i blodplasma 1000 ganger.
Reseptorene for alle faktorene i IL -6 -familien inneholder en felles komponent - gp130 -kjeden, som er tilstede i nesten alle cellene i kroppen. Den andre komponenten i reseptoren er individuell for hvert cytokin. Den spesifikke kjeden til IL-6-reseptoren (gp80) er ansvarlig for bindingen av dette cytokinet, mens gp130 er involvert i signaltransduksjon, ettersom det er assosiert med tyrosinkinasene Jak1 og Jak2. Når IL-6 interagerer med reseptoren, utløses følgende hendelsesrekkefølge: IL-6-monomer interagerer med gp80-kjeden, dimerisering av kompleksene oppstår (2 cytokinmolekyler-2 gp80-kjeder), hvoretter 2 gp130-kjeder er festet til komplekset, som fører til fosforylering av Jakkinase. Sistnevnte fosforylerer faktorene STAT1 og STAT3, som dimererer, beveger seg inn i kjernen og binder promotorene til målgenene. Gp80 -kjeden vaskes lett av cellen; i fri form, interagerer det med cytokinet, inaktiverer det, dvs. fungerer som en spesifikk hemmer av IL-6.
IL-6 er involvert i induksjon av nesten hele komplekset av lokale manifestasjoner av betennelse. Det påvirker migreringen av fagocytter, øker produksjonen av CC-kjemokiner som tiltrekker seg monocytter og lymfocytter, og svekker produksjonen av CX-kjemokiner som tiltrekker seg nøytrofile. De proinflammatoriske effektene av IL-6 er svakere enn IL-1 og TNFa, i motsetning til at den ikke øker, men hemmer produksjonen av proinflammatoriske cytokiner (IL-1, TNFa og IL-6) og kjemokiner av involverte celler i den inflammatoriske prosessen. Dermed kombinerer IL-6 egenskapene til pro- og antiinflammatoriske cytokiner og er ikke bare involvert i utviklingen, men også i begrensningen av den inflammatoriske responsen.
IL-6 er hovedfaktoren som induserer ekspresjon av proteiner i akuttfase i hepatocytter. IL-6 påvirker ulike stadier av hematopoiesis, inkludert spredning og differensiering av stamceller. Det fungerer som en vekstfaktor for umodne plasmaceller, og forbedrer den humorale immunresponsen betydelig. IL-6 påvirker også T-lymfocytter, noe som øker aktiviteten til cytotoksiske T-celler.
IL-17 og relaterte cytokiner. Gruppen av cytokiner, inkludert IL-17-artene, har tiltrukket seg stor oppmerksomhet i forbindelse med oppdagelsen av en spesiell type T-hjelpere-Th17, som er involvert i utviklingen av noen skadelige former for inflammatoriske reaksjoner, spesielt i autoimmune prosesser (se avsnitt 3.4.3.2). Rollen til disse cytokinene i responsene til den adaptive immunresponsen vil bli diskutert nedenfor. Her gir vi bare en generell beskrivelse av cytokiner og vurderer kort deres rolle i reaksjonene av medfødt immunitet.
IL-17-familien inkluderer 6 proteiner, angitt med bokstavene fra A til F. Egenskapene til pro-inflammatoriske cytokiner av dem er IL-17A og IL-17F. De er disulfidbundne homodimerer; deres molekylvekt er 17,5 kDa. Disse cytokinene produseres av de nevnte Th17, så vel som CD8 + T -celler, eosinofiler, nøytrofiler. IL-23 stimulerer utviklingen av TH7-celler og produksjonen av IL-17.
Reseptorer for IL -17 uttrykkes av mange celler - epitelceller, fibroblaster, celler i immunsystemet, spesielt nøytrofile. Hovedresultatet av interaksjonen mellom IL-17 og reseptoren er, som med virkningen av andre proinflammatoriske cytokiner, i induksjonen av NF-kB-faktoren og uttrykk for mange NF-KB-avhengige betennelsesgener.
En av de viktige biologiske effektene av IL-17 (sammen med IL-23) er vedlikehold av nøytrofil homeostase. Disse cytokinene forbedrer nøytrofilproduksjonen ved å stimulere produksjonen av G-CSF. Samtidig reguleres en økning eller reduksjon i produksjonen av IL-17 og IL-23 av antall nøytrofiler i perifert vev: en reduksjon i antallet av disse cellene som følge av apoptose fører til en økning i produksjon av cytokiner.
Den proinflammatoriske effekten av IL-17 realiseres hovedsakelig gjennom en økning i produksjonen av andre cytokiner (IL-8, IL-6, y-CSF, en rekke kjemokiner) og uttrykk for adhesjonsmolekyler. Hos mus transgene for IL-17 eller IL-23 utvikler det seg systemisk kronisk betennelse av interstitiell art, med infiltrasjon av nøytrofile, eosinofiler, makrofager og lymfocytter i forskjellige organer. Disse cytokinene er anerkjent som en ledende rolle i utviklingen av kroniske autoimmune sykdommer.
IL-12 familie
IL-12 er identifisert for sin evne til å aktivere NK-celler, indusere spredning av T-lymfocytter og indusere IFNy-syntese. IL-12 inntar en spesiell plass blant cytokinene som produseres av cellene i det medfødte immunsystemet, siden det (i likhet med hovedprodusentene, dendritiske celler) fungerer som en kobling mellom medfødt og adaptiv immunitet. På den annen side er IL-12 en del av IL-12-IFNy-tandem, som spiller en nøkkelrolle i immunforsvaret mot intracellulære patogener.
IL-12 er en dimer sammensatt av underenhetene p40 og p35. Den totale molekylvekten er 75 kDa. Den funksjonelle aktiviteten til IL-12 er assosiert med p40-underenheten. "Fullskala" IL-12 utskilles av aktiverte monocytter, makrofager, myeloide dendritiske celler, nøytrofiler og epitelceller i barrierevev (de produserer både Ig-12p35 og IL-12p40 cytokinunderenheter). De fleste av kroppens celler syntetiserer bare den funksjonelt inaktive underenheten ^ -12p35. Mengden av IL-12 heterodimer utskilt av cellen er begrenset av p35-underenheten. IL-12p40 syntetiseres i overskudd og kan dimeriseres for å danne en homodimer som fungerer som en IL-12-antagonist så vel som et kjemoattraktant. IL-12 produksjonsinduktorer er først og fremst patogener gjenkjent av TLR og andre mønstergjenkjenningsreseptorer. Produksjonen av IL-12 forsterkes av IL-1, IFNy, samt intercellulære interaksjoner formidlet av CD40-CD154 og andre par molekyler i TNFR-familiene.
IL-12-reseptoren uttrykkes sterkest på NK-celler, aktiverte TH-celler og cytotoksiske T-lymfocytter, og i mindre grad på dendritiske celler. Ekspresjonen av IL-12-reseptoren med aktiverte T-celler forsterkes under påvirkning av IL-12, IFNy, IFNa, TNFa, og ved kostimulering gjennom CD28-reseptoren. Reseptoren for IL-12 er en dimer dannet av underenhetene til IL-12RP1 (100 kDa) og IL-12RP2 (130 kDa, CD212), som et 85 kDa protein er assosiert med. Både Pj- og p2-kjedene er involvert i IL-12-binding, mens IL-12RP2-underenheten hovedsakelig er involvert i signaltransduksjon. Det intracellulære domenet til Pj -kjeden er assosiert med JAK2 -kinasen, det intracellulære domenet til P2 -kjeden er assosiert med Tyk2 -kinasen. Kinaser fosforylerer transkripsjonsfaktorene STAT1, STAT3, STAT4 og STAT5.
Hovedfunksjonen til IL-12, på grunn av dets evne til å stimulere cytotoksiske lymfocytter (NK og T) og indusere differensiering av Thl-celler (se avsnitt 3.4.3.1), er å utløse cellulære forsvarsmekanismer mot intracellulære patogener. IL-12 virker på NK- og NKT-celler allerede i de tidlige stadiene av immunprosesser, og forbedrer spredning og cytotoksisk aktivitet av NK-celler, og senere på cytotoksiske T-lymfocytter og syntesen av IFNy av alle disse cellene. Noe senere induserer IL-12 differensiering av Thl-celler, som også produserer IFNy. Betingelsen for induksjon av Thl-celler er det foreløpige uttrykket for IL-12RP2-reseptorunderenheten av aktiverte CD4 + T-celler. Etter det får cellene muligheten til å binde IL-12, noe som fører til aktivering av STAT4-faktoren, som regulerer ekspresjonen av gener som er karakteristiske for Thl-celler (for uttrykk for IFNG-genet, virkningen av transkripsjonsfaktoren T -bet er viktigere). Samtidig undertrykker IL-12 differensiering av ^ 2 celler og svekker produksjonen av celler
B-serie av antistoffer fra IgE- og IgA-klassene. IL-12, som virker på dendrittiske og andre APC, induserer ekspresjon av kostimulatoriske molekyler (CD80 / 86, etc.), så vel som MHC-II APC-produkter. Dermed spiller IL-12 en koblingsrolle mellom medfødt og adaptiv immunitet og forbedrer immunmekanismene som er ansvarlige for beskyttelse mot intracellulære patogener og svulster.
IL-12-familien inkluderer IL-23, IL-27 og IL-35. Disse cytokinene er heterodimerer: IL-23 dannes av to underenheter-I-23p19 og IL-12p40 (identisk med den tilsvarende underenheten til IL-12), IL-27-av underenhetene Ebi3 og IL-27p28, IL-35-av underenheter Ebi3 og IL-12p35. Disse cytokinene produseres hovedsakelig av dendritiske celler. Produksjonen av cytokiner fra IL-12-familien utløses av PAMP og cytokiner som er tilstede på patogener, spesielt GM-CSF.
Mottak av IL-23 utføres av to forskjellige strukturer: IL-12p40-underenheten gjenkjennes av p-kjeden til reseptoren for IL-12, og R-23p19-underenheten gjenkjennes av en spesiell reseptor, IL-23R. STAT4 spiller hovedrollen i signaloverføring fra IL-23. Reseptoren for IL-27 aktiverer molekylene WSX-1 (en homolog for p2-underenheten til IL-12R) og gp130 (en polypeptidkjede som er en del av reseptorene for cytokiner fra IL-6-familien).
Som IL-12, virker IL-23 og IL-27 hovedsakelig på CD4 + T-celler, og fremmer deres differensiering langs Th1-banen. Funksjoner av IL-23-en dominerende effekt på minne-T-celler, samt evnen til å støtte utviklingen av T-hjelpere av typen Th17. IL-27 skiller seg fra de to andre cytokinene i familien i sin evne til å indusere spredning av ikke bare aktiverte, men også hvilende CD4 + T-celler. Nylig ble det vist at IL-27 og IL-35 kan fungere som regulatoriske (suppressor) faktorer, siden deres Ebi3-underenhet er målet for nøkkelfaktoren for FOXP3 regulatoriske T-celler.
Kolonistimulerende faktorer (CSF) (tabell 2.32) eller hematopoietiner er representert av tre cytokiner-GM-CSF, G-CSF og M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) er funksjonelt nær dem. Disse faktorene kalles kolonistimulerende faktorer, siden de først ble identifisert ved deres evne til å støtte veksten in vitro av hematopoietiske cellekolonier av den korresponderende sammensetningen. IL-3 har det bredeste virkningsspekteret, siden det støtter veksten av en hvilken som helst hematopoietisk cellekoloni, bortsett fra lymfoide celler. GM-CSF støtter veksten av både blandede granulocytt-monocyttkolonier og separat granulocytt- og monocytt- / makrofagkolonier. G-CSF og M-CSF spesialiserer seg på å opprettholde vekst og differensiering av sine respektive kolonier. Disse faktorene sikrer ikke bare overlevelse og spredning av hematopoietiske celler av denne typen, men er også i stand til å aktivere allerede modne differensierte celler (M -CSF - makrofager, G -CSF - nøytrofiler). M-CSF er involvert i differensiering av monocytter til makrofager og hemmer differensiering av monocytter til dendritiske celler. G-CSF, i tillegg til å virke på den granulocytiske grenen av hematopoiesis, forårsaker mobilisering av hematopoietiske stamceller fra benmargen inn i blodet.
Tabell 2.32. Karakterisering av kolonistimulerende faktorer

Navn nie	Chromo steinbit	Molekylvekt, kDa	Celler produsenter	Celler mål	Oppskrift tori
GM-CSF	5q	22	Makrofager, T -celler, NK -celler, stromaceller, epitelceller	Makrofager, nøytrofiler, eosinofiler, T -celler, dendritiske celler, hematopoietiske celler	GM- CSFR a / R
G-CSF	17q	18-22		Neutrofiler, eosinofiler, T -celler, hematopoietiske celler	G-CSFR (1 kjede)
M-CSF	5q	45/70 (dimer)	Makrofager, stromaceller, epitelceller	Makrofager, hematopoietisk celler	c-Fms
Stamcellefaktor	12q	32	Stromal celler	Hematopoietiske celler, B -celler, mastceller	c-sett
Flt-3- ligand	19q	26,4	Stromal celler	Hematopoietiske celler, mastceller	Flt-3

G-CSF, GM-CSF og IL-3 er strukturelt karakterisert som hematopoietiner som inneholder 4 a-spiralformede domener. Reseptorene deres inneholder 2 polypeptidkjeder, de tilhører familien av hematopoietinreseptorer. M-CSF er forskjellig fra andre CSF. Det er et dimert molekyl og eksisterer i både oppløselige og membranbundne former. Reseptoren har ekstracellulære Ig-lignende domener og et intracellulært domene med tyrosinkinaseaktivitet (navnet på denne proto-onkogen kinasen-c-Fms-blir noen ganger overført til hele reseptoren). Når M-CSF binder seg til reseptorer, skjer deres dimerisering og kinaseaktivering.
Kolonistimulerende faktorer produseres av endotelceller og fibroblaster samt monocytter / makrofager. GM-CSF og IL-3 syntetiseres også av T-lymfocytter. Under påvirkning av bakterielle produkter (gjennom mønstergjenkjenningsreseptorer) og proinflammatoriske cytokiner øker syntesen og sekresjonen av kolonistimulerende faktorer betydelig, noe som fører til en økning i myelopoiesis. Granulocytopoiesis er spesielt sterkt stimulert, som ledsages av akselerert emigrasjon av celler, inkludert umodne, til periferien. Dette skaper et bilde av nøytrofil leukocytose med et skift i formelen til høyre, noe som er veldig karakteristisk for betennelse. Preparater basert på GM- og G-CSF brukes i klinisk praksis for å stimulere granulocytopoiesis svekket av cytotoksiske effekter (stråling, kjemoterapi for behandling av tumorsykdommer, etc.). G-CSF brukes til å mobilisere hematopoietiske stamceller, etterfulgt av bruk av indusert leukomasse for å gjenopprette nedsatt hematopoiesis.
Stamcellefaktor (SCF - stamcellefaktor, c -kit ligand) utskilles av benmargstromale celler (fibroblaster, endotelceller), samt forskjellige celletyper under embryonal utvikling. SCF eksisterer som et transmembrant og løselig molekyl (sistnevnte dannes som et resultat av proteolytisk spaltning av den ekstracellulære delen). SCF oppdages i blodplasma. Molekylet har to disulfidbindinger. SCF-reseptoren, c-Kk, har tyrosinkinaseaktivitet og er strukturelt lik Flt-3 og c-Fms (M-CSF-reseptor). Når SCF binder, dimeriseres og fosforyleres reseptorer. Signaloverføring skjer med deltakelse av PI3K og MAP -kaskaden.
Mutasjoner i SCF -genet og dets reseptor har lenge blitt beskrevet (stålmutasjoner); hos mus manifesteres de ved en endring i pelsens farge og brudd på hematopoiesis. Mutasjoner som forstyrrer syntesen av faktorens membranform forårsaker grove defekter i utviklingen av embryoet. Sammen med andre faktorer er SCF involvert i å opprettholde levedyktigheten til hematopoietiske stamceller, sikrer deres spredning og støtter de tidlige stadiene av hematopoiesis. SCF er spesielt viktig for erytropoies og mastcelleutvikling, og fungerer også som en vekstfaktor for tymocytter i DN1- og DN2 -stadiene.
Når det gjelder struktur og biologisk aktivitet, har Flt-3L-faktoren (Fms-lignende thyrosinkinase 3-ligand) egenskaper som ligner på SCF, i kombinasjon med andre faktorer som støtter de tidlige stadiene av myelopoiesis og utvikling av B-lymfocytter. SCF spiller rollen som en vekstfaktor for leukemiske myeloblaster.
Kjemokiner, som er en viktig humoral faktor ved betennelse og medfødt immunitet, diskuteres ovenfor i beskrivelsen av kjemotaksi av leukocytter (se avsnitt 2.3.2).