Bestemmelse av aminosyresammensetning. Bestemmelse av aminosyresammensetningen i melk. Bestemmelse av aminosyrer ved tynnsjiktskromatografi

UTDANNINGSHÅNDBOK

FOR UAVHENGIG FORBEREDELSE

TIL KLASSER

I BIOLOGISK KJEMI

for studenter som studerer i spesialiteten

Pediatri

Del I

Sentralt metodisk råd

Smolensk State Medical Academy

Smolensk

UDC: 612.015.

Anmeldere: Doktor i medisinske vitenskaper, professor A.S. Solovyov

Doktor i medisinske vitenskaper, professor O.V. Molotkov

Pedagogisk og metodisk manual for selvforberedelse til klasser i biologisk kjemi for studenter som studerer i spesialiteten pediatri.

Del I / T.G. Makarenko, K.A. Mageenkova

Smolensk SGMA. 2012. - 92 s.

Manualen inneholder en kort oppsummering av biokjemistudiets teoretiske materiale som ikke inngår i forelesningskurset, tester for å teste kunnskap, situasjonsproblemer og spørsmål til eksamen. Manualen inneholder også spesialiserte spørsmål om egenskapene til metabolisme hos barn. Manualen består av to deler i henhold til læreplanen for III og IV semester. Håndboken er beregnet på studenter som studerer i spesialiteten pediatri.

Rådet for den statsbudsjetterte utdanningsinstitusjonen for høyere profesjonsutdanning SGMA Roszdrav i den russiske føderasjonen

Forelesningsemner i biokjemi (43 timer)

1. Introduksjon til biokjemi.

2. Strukturell organisering av proteiner.

3. Fysisk-kjemiske egenskaper til proteiner.

4. Struktur, virkningsmekanisme til enzymer.

5. Egenskaper til enzymer.

6. Intramitokondriell oksidasjon. Energiutveksling.

7. Ekstramitokondriell oksidasjon.

8. Generelle katabolismeveier.

9. Anaerob oksidasjon av karbohydrater.

10. Aerob oksidasjon av karbohydrater. Glukoneogenese.

11. Pentoso - fosfatvei.

12. Metabolisme av triacylglyceroler og glycerofosfolipider

13. Metabolisme av kolesterol, sfingolipider.

14. Sammenheng mellom fett- og karbohydratmetabolisme. Ketonlegemer.

15. Generelle veier for aminosyremetabolisme i vev.

16. Måter å nøytralisere ammoniakk i vev.

17. Utveksling av fenylalanin og tyrosin.

18. Utveksling av purin- og pyrimidinnukleotider.

19. Biokjemi av hormoner.

20. Biokjemi av erytrocytter. Utveksling av hemoproteiner.

21. Fysisk-kjemiske egenskaper av blod. Luftveisfunksjon av blod.

22. Blodkoagulasjons- og antikoagulasjonssystemer.

23. Vann-salt utveksling.

Materiale for selvstendig arbeid av studenter

(72 timer utenomfaglig arbeid)

Manualen er ment for utenomfaglig uavhengig arbeid med biologisk kjemi for studenter ved det pediatriske fakultet.

Manualen inneholder et sammendrag av materiale fra pensum i biologisk kjemi for medisinstudenter som ikke er inkludert i klasseromsforelesningskurset. For studenter som studerer i spesialiteten pediatri, gis tilleggsinformasjon om egenskapene til metabolisme hos barn. Prøveoppgaver for klasseemner brukes til mellom- og sluttkontroll av kunnskap. Drøfting av situasjonsproblemer forventes gjennomført i klassen med deltakelse av lærer. I denne forbindelse er det ikke gitt kommentarer til situasjonelle oppgaver i håndboken. Manualen inneholder en liste over eksamensspørsmål i biokjemi.

Leksjonsemne nr. 1

AMINOSYRE SAMMENSETNING AV PROTEINER. HYDROLYSE AV ENKELT PROTEIN. KROMATOGRAFISK SEPARERING AV AMINOSYRER

2. Mål for selvstendig arbeid: utvide ideer om den strukturelle organiseringen av proteiner

Forstå de biologiske funksjonene til proteiner,

Fullstendig informasjon om den primære, sekundære, tertiære, kvaternære strukturen til proteiner,

For å bli kjent med særegenhetene ved proteinsammensetningen av vev i kroppen til barn,

Utvikle ferdighetene til å bruke tilegnet kunnskap.

4. Liste over spørsmål og oppgaver for selvstendig arbeid

Proteiner er høymolekylære polymere N-holdige organiske stoffer som består av aminosyrer forbundet med peptidbindinger og har en kompleks strukturell organisering.

Begrepet "proteiner" skyldes disse forbindelsenes evne til å produsere hvite bunnfall. Navnet "proteiner" kommer fra protos (gresk) - først, viktig, og gjenspeiler den sentrale rollen til denne klassen av stoffer i kroppen.

Proteininnhold i menneskekroppen høyere enn innholdet av lipider og karbohydrater. Den utgjør 18–20 % av den totale vevsmassen (våt masse). Overvekten av proteiner i vev sammenlignet med andre stoffer avsløres når man beregner proteininnholdet per tørr masse av vev - 40 - 45%. Proteininnholdet i ulike vev svinger innenfor et visst område. Det høyeste proteininnholdet er i skjelettmuskulaturen (18–23 % av våtvekten eller 80 % av tørrvevsvekten). Fettvev har lavt proteininnhold (6 % våtvekt eller 4 % tørrvevsvekt).

I barndommen den totale mengden proteiner i kroppen og deres sammensetning er annerledes enn hos voksne. I fosterkroppen overstiger ikke det totale proteininnholdet 10%. Hos nyfødte utgjør den 10–12 % av kroppsvekten. I løpet av nyfødtperioden er det en økning i prosessene med proteinnedbrytning til energiformål. På grunn av dette reduseres proteininnholdet midlertidig. I tidlig barndom dominerer umodne løselige strukturelle proteiner. Med alderen øker deres differensiering til modne funksjonelle proteiner.

Biologiske funksjoner til proteiner variert. De er assosiert med høy proteinspesifisitet og evnen til å samhandle med ulike ligander, reseptorer og cellestrukturer.

· Plastisk (strukturell) funksjon - proteiner er en del av alle cellulære strukturer sammen med nukleinsyrer, lipider, karbohydrater.

Energi - 1 g protein gir ca 4 kcal

Regulatoriske funksjoner:

a) enzymatisk - mer enn 2000 proteiner er biologiske katalysatorer, som regulerer hastigheten på kjemiske reaksjoner i kroppen

b) hormonelle - noen hormoner som regulerer biokjemiske og fysiologiske prosesser i kroppen er proteiner

c) histonproteiner i kromatin regulerer aktiviteten til DNA-gener

d) intracellulært protein kalmodulin regulerer aktiviteten til ulike enzymer

· Beskyttende (immun) funksjon. Noen proteiner (immunoglobuliner, interferon, lysozym) har evnen til å binde stoffer som er fremmede for kroppen.

· Spesifikke funksjoner:

a) kontraktile (muskelproteiner aktin og myosin)

b) fotoreseptor (retinal protein rhodopsin)

c) blodpropp (blodkoagulasjonsfaktor fibrinogen)

d) reseptor – proteiner er en del av cellulære reseptorer

Kjemisk sammensetning av proteiner

Elementær sammensetning av proteiner ganske variert. De inneholder mange kjemikalier. De obligatoriske kjemiske elementene er imidlertid karbon (51 - 55%), oksygen (21 - 23%), nitrogen (16% - den mest konstante verdien), hydrogen (6-7%) og svovel (0,5 - 2%).

Aminosyresammensetning av proteiner. Naturlige proteiner inneholder α-aminosyrer, som er forskjellige i strukturen til radikalet ved α-karbonatomet.

Tester

1. Sammensetningen av naturlige proteiner inkluderer kjemiske elementer: Kalsium. Karbon. Klor. Hydrogen. Natrium. Nitrogen. Kalium . Oksygen. Svovel .

Karbon. Hydrogen. Nitrogen. Oksygen. Svovel.

3. Substitusjoner av aminosyrer fører til betydelige endringer i de biologiske egenskapene til proteiner:

Glutamat til aspartat. Glutamat til valin Tryptofan til glutamat. Valin til leucin. Glysin til aspartat. Fenylalanin til tryptofan. Serin til treonin. Glysin til alanin.

4. Fullføringen av proteinhydrolyse kan bedømmes ved:

Ved å løse opp sedimentet av denaturert protein. Ved forsvinningen av turbiditeten til hydrolysatet. Basert på en positiv biuretreaksjon. Basert på en positiv ninhydrinreaksjon. Basert på en negativ ninhydrinreaksjon. Ifølge Adamkiewiczs positive reaksjon. Basert på en negativ biuretreaksjon Basert på resultatene av formoltitrering.

5. Den tertiære strukturen til proteinet stabiliseres av bindinger:

Hydrofobisk. Peptid. Disulfid. Ionisk .Hydrogen.

6. Den sekundære strukturen til proteiner stabiliseres av bindinger:

Disulfid. Peptid. Ionisk. Hydrofobisk. Hydrogen.

7. Polare funksjonelle grupper av proteiner er:

Karboksyl. Metyl. Fenolisk . Amin. Karbonyl. Indolisk.

8. Funksjonelle grupper av aminosyrer deltar i dannelsen av en peptidbinding:

Epsilon-amin. Alfa - amin. Beta - karboksyl. Gamma-karboksyl. Alfa - karboksyl. Thiols.

9. Den underliggende strukturen, dvs. å bestemme høyere nivåer av proteinstrukturell organisering er:

Hoved. Sekundær. Tertiær. Kvartær.

10. Den uttalte artsspesifisiteten til proteiner med de samme naturlige biologiske egenskapene skyldes:

Grunnleggende forskjeller i aminosyresammensetning. Betydelige forskjeller i molekylvekt. Funksjoner ved den romlige strukturen til molekyler. Når de primære strukturene er like, er det individuelle ekvivalente aminosyresubstitusjoner. Når de primære strukturene er like, er det individuelle ulik aminosyresubstitusjoner. Forskjeller i sammensetningen av ikke-proteinkomponenter.

11. Aminosyrer er hovedsakelig lokalisert på overflaten av proteinmolekylet:

Ikke-polare aminosyrer. Polare aminosyrer. Begge grupper av aminosyrer. Ingen av disse gruppene

12. Aminosyrer befinner seg hovedsakelig dypt i proteinmolekylet:

Ikke-polare aminosyrer. Polare aminosyrer. Ingen av disse gruppene. Begge grupper av aminosyrer

13. Dannelsen av den tredje proteinstrukturen innebærer:

Ikke-polare aminosyrer. Polare aminosyrer. Begge grupper av aminosyrer . Ingen av disse gruppene

14. Årsaken til endringen i hemoglobins affinitet for oksygen er:

Endringer i den tertiære strukturen til protomerer. Endringer i protomers relative posisjon. Kooperative endringer i protomer-konformasjon

15. Er denne påstanden riktig?

Epsilon - aminogruppen til lysin er involvert i dannelsen av en peptidbinding

Ja. Nei. Det finnes ikke noe riktig svar

16. Er denne påstanden riktig?

Serin- og valinradikaler har hydrofile egenskaper

Ja. Nei. Det finnes ikke noe riktig svar

17. Ledere er hovedsakelig involvert i dannelse og vedlikehold av:

Primær struktur av proteiner . Tertiær struktur av proteiner . Sekundær struktur av nukleinsyrer

20%. 10-12%. 5%

Situasjonsmessige oppgaver

1. På et peptidfragment: Tyr - Cis - Leu - Val - Asp - Ala

Nevn hvilke aminosyreradikaler som kan delta i dannelsen av bindinger:

Hydrofobisk. Ionisk. Disulfid

2. På et peptidfragment: Tyr – Cis – Leu – Val – Asp – Ala

angi i dannelsen av hvilke nivåer av proteinets strukturelle organisering bindingene dannet av radikalene til disse aminosyrene deltar

3. Røde blodlegemer formet som en sigd ble funnet i blodet til en afrikansk student som ble innlagt på klinikken med plager om kortpustethet, svimmelhet, rask hjerterytme og smerter i lemmer.

Forklar årsaken til utviklingen av denne sykdommen.

4. Hemoglobin er et komplekst oligomert hemoproteinprotein. Hvilke post-translasjonelle endringer fører til dannelsen av et funksjonelt aktivt protein?

Hoved

Biokjemi. Ed. E.S. Severina. 2003. s. 9-28, 31-56.

Biokjemi. Et kort kurs med øvelser og oppgaver. 2001. S. 7-25.

OG JEG. Nikolaev Biologisk kjemi. 2004. s. 16-35,38-43.

O.D. Kushmanova. Veiledning til laboratorieøvelser i biologisk kjemi. 1983. s. 15-19, 19-24.

Forelesningsmateriell

Ytterligere

T.T. Berezov, B.F. Korovkin. Biologisk kjemi. 1990. s. 10-41, 49-59.

R. Murray et al. "Human Biochemistry". M. "Fred". 1993. s. 21-51(1)

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Pedagogiske og metodiske manualer "Biokjemiske egenskaper ved barnets kropp." Smolensk 2001. 2007.

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. En lærebok anbefalt av utdanningsinstitusjonen "Funksjoner av metabolisme hos nyfødte og spedbarn." Smolensk 2012.

A.E. Medvedev "Den 22. genetisk kodede aminosyren har blitt oppdaget" // Vopr. honning. kjemi. 2002. nr. 5 -. Med. 432

Leksjonsemne nr. 2

SEDIMENTÆRE REAKSJONER PÅ PROTEINER.

METODER FOR KVANTITATIV BESTEMMELSE AV PROTEINER

2 . Mål for selvstendig arbeid: utvide kunnskap om de grunnleggende fysisk-kjemiske egenskapene til proteiner og deres anvendte medisinske betydning, om metoder brukt i laboratoriepraksis for kvantitativ bestemmelse av proteiner i biologiske væsker

3. Oppgaver for selvstendig arbeid:

Kunne vurdere den biomedisinske betydningen av de grunnleggende fysisk-kjemiske egenskapene til proteinløsninger,

Gjør deg kjent med det normale proteininnholdet i blodserum, med mulige avvik og deres biokjemiske tolkning,

Å utvikle ferdighetene til å jobbe med ny informasjon, dens analyse, logiske presentasjon,

I laboratoriepraksis

Optiske, kolorimetriske og azotometriske metoder brukes for å kvantifisere proteiner.

Optiske metoder basert på de optiske egenskapene til proteiner.

Disse inkluderer:

- spektrofotometriske metoder, estimerer intensiteten av absorpsjon av UV-stråler av proteiner i området rundt 200 nm og 260 nm. Graden av UVL-absorpsjon er proporsjonal med proteinkonsentrasjonen;

- refraktometriske metoder basert på evnen til proteinløsninger til å bryte lys i forhold til deres konsentrasjon;

- nefelometriske metoder basert på evnen til proteinløsninger til å spre lys i forhold til deres konsentrasjon;

- polarimetriske metoder er basert på evnen til proteinløsninger til å rotere planet av polarisert lys i forhold til deres konsentrasjon.

Kolorimetriske metoder basert på fargereaksjoner av proteiner - biuretreaksjon, Lowry-metoden, metode for sorpsjon av visse fargestoffer av proteiner. Intensiteten til fargen bestemmes av konsentrasjonen av proteinløsningen.

Nitrometriske metoder er basert på å bestemme nitrogeninnholdet og konvertere det til proteinkonsentrasjon (proteiner inneholder 16 % nitrogen).

Tester

1. Kolorimetriske metoder inkluderer:

Nitrometrisk. Spektrofotometrisk . Sorpsjon av fargestoffer. Lowry-metoden. Biuret metode. Refraktometrisk.

2. Metodene for deres analyse er basert på proteiners evne til å tilegne seg en ladning:

Røntgendiffraksjonsanalyse. Elektroforese Ionebytterkromatografi Potensiometrisk titrering. Refraktometri. Ultrasentrifugering. Kolonnegelfiltrering.

3. Effekten av å salte ut proteiner fra løsninger er assosiert med:

Med forstyrrelse av sekundære og tertiære strukturer. Med brudd av peptidbindinger. Med tap av ladning av proteiner. Med dehydrering av molekylene deres. Med dannelsen av en kvartær struktur.

4. For den mest komplette utvinningen av proteiner fra vev av animalsk opprinnelse, kan du bruke følgende væsker:

Alkohol-vann blanding. Aceton. 10 % ammoniumsulfatløsning. Destillert vann. 10 % NaCl-løsning 10 % KCl-løsning.

5. Du kan bli kvitt medfølgende lavmolekylære stoffer som er tilstede under proteinekstraksjon uten å miste proteinenes opprinnelige egenskaper ved å bruke følgende metoder:

Elektroforese. Dialyse Kolonnegel - filtrering. Utfelling av proteiner med trikloreddiksyre.

6. Proteiner med forskjellig molekylvekt kan separeres ved hjelp av fysiske og kjemiske analyseteknikker:

Dialyse. Elektroforese. Salter ut. Potensiometrisk titrering. Kolonnegelfiltrering.

7. Ved fysiologiske pH-verdier kan en aminosyre få eller miste ladningen:

Cystein. Arginin. Tyrosin. Serin. Histidin. Treonin.

8. Tilstedeværelsen av globuliner i en løsning kan bevises:

Elektroforese. Kolonnegelfiltrering. Utsalting ved 50 % metning med ammoniumsulfat. Utsalting ved 100 % metning med ammoniumsulfat. Denaturering med urea.

9. Denatureringseffekten er preget av følgende tegn:

Rask dannelse av sediment. Tap av biologisk aktivitet. Bevaring av biologiske egenskaper. Brudd på den primære strukturen til proteinet. Langsom dannelse av sediment. Brudd på sekundær og tertiær struktur (konformasjon). Opprettholde konformasjonen.

10. Utsaltingseffekten er preget av følgende symptomer:

Reversibilitet av effekten. Tap av biologiske egenskaper. Bevaring av biologiske egenskaper. Forstyrrelse av proteinkonformasjon. Opprettholde proteinkonformasjon. Rask dannelse av sediment.

11. Proteindenaturering er forårsaket av:

Natriumklorid. Svovelsyre. Blyacetat. Ammoniumsulfat. Sølvnitrat. Sulfosalisylsyre. Urea. Glukose.

Fra potensialgradienten. Fra molekylvekten til proteiner. Fra pH i miljøet. Fra formen til proteinmolekyler. Fra egenskapene til aminosyresammensetningen til proteiner. Fra tilstedeværelsen av protesegrupper i proteiner.

13. Ved å bruke utsalting fra en blanding av proteiner kan du isolere:

Ovaalbumin. Gamma globulin. Serumalbumin.

14. Løseligheten til proteiner i vann formidles av funksjonelle grupper av polypeptidkjeder:

Karboksyl. Metyl. Fenolisk. Amin. Karbonyl. Indolisk. Hydroksyl. Thiols. Imminous.

15. De mest objektive dataene om molekylvekten til proteiner er gitt av fysisk-kjemiske metoder:

Kryoskopi. Ebullioskopi. Røntgenstrukturanalyse Ultrasentrifugering. Elektronmikroskopi.

16. For nøyaktig å bestemme proteininnholdet i en løsning, kan du bruke den optiske effekten:

Bryting av lysstråler. Lysspredningseffekt. Optisk aktivitet. Absorpsjon av stråler i UV-delen av spekteret.

17. Når du utfører gelfiltrering av proteiner, brukes følgende:

Forskjeller i ladningsstørrelse. Forskjeller i molekylvekt . Forskjeller i optiske egenskaper

18. I proteinelektroforese brukes følgende:

Forskjeller i ladningsstørrelse . Forskjeller i molekylvekt . Forskjeller i optiske egenskaper

19. En blanding av ceruloplasminproteiner (molekylvekt 151 000, isoelektrisk punkt 4,4) og γ - globulin (molvekt 150 000, isoelektrisk punkt 6,3) kan separeres ved hjelp av følgende metoder:

Elektroforese. Gel - filtrering. Ionebyttekromatografi

20. Refraktometriske metoder for kvantitativ bestemmelse av proteiner er basert på effekten av:

Lysspredning. Lysabsorpsjon. Lysbrytning . Rotasjoner av planet for polarisert lys

21. Spektrofotometriske metoder for kvantitativ bestemmelse av proteiner er basert på effekten av:

Lysspredning. Lysabsorpsjon ved en viss bølgelengde. Lysbrytning. Rotasjoner av planet av polarisert lys

22. Ved det isoelektriske punktet, et proteinmolekyl:

De skiller seg ikke fra hverandre. E elektrisk nøytral . Beveger seg mot anoden. Bryt ned til polypeptider

23. Proteiner er i stand til å danne stabile vandige løsninger på grunn av tilstedeværelsen av:

Brownsk bevegelse Tilstedeværelse av hydrofobe radikaler. Tilstedeværelsen av ladning og hydreringsskall i proteinmolekyler. Alle de ovennevnte faktorene

Situasjonsmessige oppgaver

1. Angi bevegelsesretningen (til anoden, til katoden, eller forbli ved starten) til neste peptid

Liz - Gli - Ala - Gli

2. Angi bevegelsesretningen (til anoden, til katoden, eller forbli ved starten) til neste peptid

Liz – Glu – Ala – Gli

3. Angi bevegelsesretningen (til anoden, til katoden, eller forbli ved starten) til neste peptid

Glu - Gli - Ala - Gli

4. Trekk konklusjoner om egenskapene til aminosyresammensetningen til et protein som har et isoelektrisk punkt = 4,7

5. Hvilken ladning i et nøytralt miljø får et protein som har et isoelektrisk punkt = 4,7?

Forklar svaret ditt.

6. Etter utsalting av proteinet med ammoniumsulfat ble det oppnådd et bunnfall inneholdende proteinet som ble undersøkt med en blanding av salt. Hvordan kan du skille protein fra salt?

7. Grunnleggende og tilleggslitteratur om emnet

Hoved

Biokjemi. Ed. E.S. Severina. 2003. s. 67-74

Biokjemi. Et kort kurs med øvelser og oppgaver. 2001. s. 29-31

OG JEG. Nikolaev Biologisk kjemi. 2004. s. 43-60

O.D. Kushmanova. Veiledning til laboratorieøvelser i biologisk kjemi. 1983. s. 7-15, 28-29.

Forelesningsmateriell

Ytterligere

T.T. Berezov, B.F. Korovkin. Biologisk kjemi. 1990. s. 37-41.

R. Murray et al. "Human Biochemistry". M. "Fred". 1993. s. 43-51 (1)

Yu.E. Veltishchev, M.V. Ermolaev, A.A. Ananenko, Yu.A. Knyazev. "Metabolisme hos barn." M.: Medisin. 1983. 462 s.

R.M. Kohn, K.S. Munn. Tidlig diagnose av metabolske sykdommer. M. "Medisin". - 1986.

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Pedagogiske og metodiske manualer "Biokjemiske egenskaper ved barnets kropp." Smolensk 2001. 2007

Makarenko T.G., Stunzhas N.M. Pedagogisk og metodisk manual "Funksjoner ved metabolisme hos nyfødte og spedbarn" (Anbefalt av UMO). Smolensk 2012.

Titov V.N. Metodiske aspekter ved å bestemme innholdet av totalprotein i blodserum // Klin. lab. diagnostikk, 1995, - .№ 2.S. 15-18

Leksjonsemne nr. 3

KLASSIFISERING AV PROTEINER.

ENKLE OG KOMPLEKSE PROTEINER

2. Mål for selvstendig arbeid: konsolidere kunnskap om prinsippene for proteinklassifisering, egenskaper og sammensetning av hovedgruppene av enkle og komplekse proteiner

3. Oppgaver for selvstendig arbeid:

Vurder prinsippene for proteinklassifisering,

For å studere egenskapene til egenskapene, kjemisk sammensetning og biologiske funksjoner til hovedgruppene av enkle og komplekse proteiner,

Å utvikle ferdighetene til å jobbe med ny informasjon, dens analyse, logiske presentasjon,

Å utvikle ferdighetene til å bruke ervervet kunnskap i pedagogiske og profesjonelle aktiviteter.

4. Spørsmålsliste for selvstendig arbeid

Protein klassifisering

Det enorme antallet proteiner i kroppen, mangfoldet av deres egenskaper og biologiske funksjoner bestemmer kompleksiteten til deres taksonomi.

Klassifiseringer av proteiner etter strukturelle og funksjonelle prinsipper foreslås.

"I dag er for mye kjent om proteiner til å være fornøyd med den gamle klassifiseringen, og for lite til å lage en bedre" - denne definisjonen av tilstanden til problemet med proteinklassifisering er fortsatt relevant i dag.

Rent praktisk er klassifiseringen av proteiner ganske praktisk, tatt i betraktning særegenhetene ved deres kjemiske sammensetning og fysisk-kjemiske egenskaper.

I henhold til denne klassifiseringen er alle proteiner delt inn i 2 grupper: enkle (proteiner) og komplekse (proteiner.

TIL proteiner (enkle proteiner) inkluderer proteiner som kun består av aminosyrer.

De er på sin side delt inn i grupper avhengig av de fysisk-kjemiske egenskapene og egenskapene til aminosyresammensetningen. Følgende grupper av enkle proteiner skilles ut:

· albuminer,

· globuliner,

· protaminer,

· histoner,

· prolaminer,

· gluteliner,

· proteinoider.

Albumin – en utbredt gruppe proteiner i vevet i menneskekroppen. De har en relativt lav molekylvekt på 50 – 70 tusen dalton. Albuminer i det fysiologiske pH-området har en negativ ladning, siden de på grunn av det høye innholdet av glutaminsyre i sammensetningen er i en isoelektrisk tilstand ved pH 4,7. Med en lav molekylvekt og en uttalt ladning, beveger albuminer seg under elektroforese med en ganske høy hastighet. Aminosyresammensetningen til albuminer er mangfoldig; de inneholder hele spekteret av essensielle aminosyrer. Albuminer er svært hydrofile proteiner. De er løselige i destillert vann. Et kraftig hydreringsskall dannes rundt albuminmolekylet, så det kreves en høy 100 % konsentrasjon av ammoniumsulfat for å salte dem ut av løsninger. Albuminer utfører en strukturell og transporterende funksjon i kroppen og er involvert i å opprettholde de fysiske og kjemiske konstantene i blodet.

Globuliner– en utbredt gruppe proteiner, vanligvis med albuminer. De har en høyere molekylvekt enn albuminer - omtrent 200 tusen dalton, derfor beveger de seg saktere under elektroforese. Det isoelektriske punktet til globuliner er ved pH 6,3 – 7. De kjennetegnes av et mangfoldig sett med aminosyrer. Globuliner er uløselige i destillert vann; de er løselige i saltløsninger av KCl og NaCl i en konsentrasjon på 5–10 %. Globuliner er mindre hydrert enn albuminer, derfor er de saltet ut av løsninger allerede ved 50% metning med ammoniumsulfat. Globuliner i kroppen utfører strukturelle, beskyttende og transporterende funksjoner.

Histoner– har en liten molekylvekt på 11-24 tusen dalton. De er rike på alkaliske aminosyrer lysin og arginin, derfor er de i en isoelektrisk tilstand i et skarpt alkalisk miljø ved pH 9,5 - 12. Under fysiologiske forhold har histoner en positiv ladning. I ulike typer histoner varierer innholdet av arginin og lysin, og derfor er de delt inn i 5 klasser. Histonene H1 og H2 er rike på lysin, histonene H3 er rike på arginin. Histonmolekyler er polare, svært hydrofile, og derfor vanskelige å salte ut av løsninger. I celler er positivt ladede histoner typisk assosiert med negativt ladet DNA i kromatin. Histoner i kromatin danner et stillas som DNA-molekylet er viklet på. Hovedfunksjonene til histoner er strukturelle og regulatoriske.

Protaminer- lavmolekylære alkaliske proteiner. Molekylvekten deres er 4 – 12 tusen dalton. Protaminer inneholder opptil 80 % arginin og lysin. De er inneholdt i nukleoproteinene til melkefisk - klupein (sild), makrell (makrell).

Prolaminer, gluteliner – vegetabilske proteiner rike på glutaminsyre (opptil 43%) og hydrofobe aminosyrer, spesielt prolin (opptil 10 - 15%). På grunn av særegenhetene ved deres aminosyresammensetning er prolaminer og gluteliner uløselige i vann og saltvannsløsninger, men løselige i 70% etylalkohol. Prolaminer og gluteliner er matproteiner fra korn, som utgjør de såkalte glutenproteinene. Glutenproteiner inkluderer sekalin (rug), gliadin (hvete), hordein (bygg), avenin (havre). I barndommen kan det oppstå intoleranse mot glutenproteiner, som det produseres antistoffer mot i tarmens lymfoide celler. Cøliaki enteropati utvikles og aktiviteten til intestinale enzymer avtar. I denne forbindelse anbefales det å administrere kornavkok til barn etter 4 måneders alder. Ris og mais inneholder ikke glutenproteiner.

Proteinoider(proteinlignende) - fibrillære vannuløselige proteiner. De er en del av støttende vev (bein, brusk, sener, leddbånd). De er representert av kollagen, elastin, keratin, fibroin.

Kollagen ( fødselslim ) – Et vidt distribuert protein i kroppen, det utgjør omtrent en tredjedel av alle proteiner i kroppen. Det er en del av bein, brusk, tenner, sener og annet vev.

Det særegne ved aminosyresammensetningen til kollagen inkluderer først og fremst et høyt innhold av glycin (1/3 av alle aminosyrer), prolin (1/4 av alle aminosyrer) og leucin. Kollagen inneholder sjeldne aminosyrer hydroksyprolin og hydroksylysin, men mangler sykliske aminosyrer.

Polypeptidkjedene til kollagen inneholder omtrent 1000 aminosyrer. Det finnes flere typer kollagen avhengig av kombinasjonen av forskjellige typer polypeptidkjeder i den. De fibrildannende typene kollagen inkluderer type I kollagen (dominerende i huden), type II kollagen (overveiende i brusk) og type III kollagen (overveiende i blodårene). Hos nyfødte er hoveddelen av kollagen type III, hos voksne - type II og I.

Den sekundære strukturen til kollagen er en "ødelagt" alfa-helix, hvis tur inneholder 3,3 aminosyrer. Helix-pitch er 0,29 nm.

Tre polypeptidkjeder av kollagen er arrangert i form av et trippelt vridd tau, festet av hydrogenbindinger, og danner den strukturelle enheten av kollagenfiber - tropokollagen. Tropokollagenstrukturer er arrangert i parallelle, langsgående forskjøvede rader, fiksert med kovalente bindinger, og danner kollagenfiber. I mellomrommene mellom tropokollagen avsettes kalsium i beinvev. Kollagenfibre inneholder karbohydrater som stabiliserer kollagenbunter.

Keratiner - proteiner av hår, negler. De er uløselige i løsninger av salter, syrer og alkalier. Keratiner inneholder en fraksjon som inneholder en stor mengde svovelholdige aminosyrer (opptil 7–12%), og danner disulfidbroer som gir høy styrke til disse proteinene. Molekylvekten til keratiner er veldig høy, og når 2.000.000 dalton. Keratiner kan ha alfa- og betastrukturer. I alfa-keratiner kombineres tre alfa-helikser til en supercoil for å danne protofibriller. Protofibriller forenes til profibriller, deretter til makrofibriller. Et eksempel på beta-keratiner er silkefibroin.

Elastin – protein av elastiske fibre, leddbånd, sener. Elastin er uløselig i vann og kan ikke svelle. Elastin inneholder en høy andel glysin, valin og leucin (opptil 25–30%). Elastin er i stand til å strekke seg under belastning og gjenopprette størrelsen etter at belastningen er fjernet. Elastisitet er assosiert med tilstedeværelsen i elastin av et stort antall interkjede-tverrbindinger med deltakelse av aminosyren lysin. De to proteinkjedene danner en lysyl-norleucinbinding. Fire proteinkjeder danner en binding kalt desmosin.

TIL komplekse proteiner (proteiner) inkluderer proteiner som i tillegg til proteindelen inneholder ikke-proteinstoffer (protesegrupper).

Komplekse proteiner er klassifisert i henhold til den kjemiske sammensetningen av deres protesegruppe. Følgende grupper av komplekse proteiner skilles ut:

· kromoproteiner,

· lipoproteiner,

· glykoproteiner,

· fosfoproteiner,

· metalloproteiner.

Kromoproteiner inneholder fargede ikke-proteinforbindelser som en protesegruppe. Gruppen av kromoproteiner inkluderer hemoproteiner og flavoproteiner.

I hemoporoteider Protesegruppen er hem - et organisk, jernholdig stoff som gir proteinet dens røde farge. Hem binder seg til proteinet globin gjennom koordinering og hydrofobe bindinger. Eksempler på hemoproteiner er erytrocyttprotein hemoglobin, muskelprotein myoglobin, vevsproteiner cytokromer, enzymer katalase, peroksidase. Hemoproteiner er involvert i oksygentransport og oksidative prosesser i vev.

I flavoproteiner inneholder en gul protesegruppe. Nukleotidene FAD og FMN kan representeres som en protesegruppe. Flavoproteiner inkluderer enzymet succinatdehydrogenase. Noen flavoproteiner inneholder metaller - metalloflavoproteiner. Flavoproteiner er involvert i oksidative prosesser i kroppen.

Nukleoproteiner består av en proteindel og nukleinsyrer: DNA eller RNA. Deoksyribonukleoproteiner er lokalisert i kjernen, og ribonukleoproteiner er lokalisert i cytosol. Proteiner i nukleoproteinene i kjernen er hovedsakelig representert av histoner. Protein- og ikke-proteindelene av nukleoproteiner er forbundet med ioniske og hydrofobe bindinger. Med fullstendig hydrolyse av nukleoproteiner dannes aminosyrer, fosforsyre, karbohydrater og en nitrogenholdig base av purin eller pyrimidin. Nukleoproteiner er involvert i lagring og reproduksjon av genetisk informasjon.

Lipoproteiner De inneholder ulike fettstoffer som en protesegruppe (triacylglyceroler, fosfolipider, kolesterol, etc.). Hydrofobe og ioniske bindinger dannes mellom proteinet og lipidet. Lipoproteiner deles vanligvis inn i strukturelle, som er en del av cellemembraner, og transport, som transporterer fett i blodet. Transportlipoproteiner er sfæriske partikler som inneholder hydrofobe fett inni og hydrofile proteiner på overflaten. Et eksempel på et lipoprotein er blodkoagulasjonsfaktoren tromboplastin.

Fosfoproteiner inneholder i sin sammensetning rester av fosforsyre koblet til serinet i proteindelen med esterbindinger. Tilsetningen av fosforsyre til et protein er reversibel og er ledsaget av dannelse eller brudd av ioniske bindinger mellom fosforsyre og ladede grupper av proteinet, noe som endrer den biologiske aktiviteten til fosfoproteinet. Fosfoproteiner inkluderer strukturelle proteiner fra beinvev, melkekaseinogen, eggehvite-ovotellin, noen enzymer (fosforylase, glykogensyntetase, TAG-lipase)

Glykoproteiner vanligvis inneholder , karbohydratrester (monosakkarider, oligosakkarider) fast festet med glykosidbindinger. Glykoproteiner har vanligvis en mosaikkstruktur der karbohydrat- og proteinfragmenter veksler. Karbohydratdelen gir spesifisitet til glykoproteiner og bestemmer deres motstand mot vevsenzymer. Glykoproteiner er bredt representert i menneskekroppen. De finnes både i vev og i biologiske væsker. Spyttmucin inneholder opptil 15 % mannose og galaktose. Glykoproteiner er noen

Det første trinnet i å bestemme den primære strukturen til proteiner er en kvalitativ og kvantitativ vurdering av aminosyresammensetningen til et gitt individuelt protein.

Syrehydrolyse av protein

For å bestemme aminosyresammensetningen er det nødvendig å ødelegge alle peptidbindinger i proteinet. Det analyserte proteinet hydrolyseres i 6 mol/l HC1 ved en temperatur på ca 110 °C i 24 timer.. Som et resultat blir peptidbindinger i proteinet ødelagt, og kun frie aminosyrer er tilstede i hydrolysatet

Separasjon av aminosyrer ved hjelp av ionebytterkromatografi Blandingen av aminosyrer oppnådd ved syrehydrolyse av proteiner separeres i en kolonne med en kationbytterharpiks.

Kvantitativ analyse av de oppnådde fraksjonene. separate fraksjoner av aminosyrer varmes opp med ninhydrin, som danner en rød-fiolett forbindelse. Fargeintensiteten i prøven er proporsjonal med mengden aminosyre som er tilstede i den.

2. Bestemmelse av aminosyresekvensen i et protein

Bestemmelse av den N-terminale aminosyren i et protein og aminosyresekvensen i oligopeptider

Studiet av den primære strukturen til proteiner har viktig generell biologisk og medisinsk betydning. Ved å studere rekkefølgen for veksling av aminosyrerester i individuelle, er det mulig å identifisere generelle fundamentale mønstre i dannelsen av den romlige strukturen til proteiner Mange genetiske sykdommer er et resultat av forstyrrelser i aminosyresekvensen til proteiner. Informasjon om primærstrukturen til normale og mutante proteiner kan være nyttig for å diagnostisere og forutsi utviklingen av sykdommen.

Etablering av den primære strukturen til proteiner inkluderer 2 hovedstadier:

bestemmelse av aminosyresammensetningen til proteinet som studeres;

aminosyresekvens i et protein.

For eksempel, i sigdcelleanemi, erstattes den sjette posisjonen til hemoglobin-β-kjeden glutaminsyre på valin. Dette fører til syntese av hemoglobin S ( HbS) - et hemoglobin som polymeriserer i deoksyform og danner krystaller. Som et resultat blir røde blodceller deformert, får en sigdform, mister elastisitet og blir ødelagt når de passerer gjennom kapillærer. Dette fører til slutt til redusert oksygenering av vev og nekrose.

Sekvensen og forholdet mellom aminosyrer i primærstrukturen bestemmer dannelsen sekundær, tertiær Og kvartær strukturer.

8 . Protein sekundær struktur– romlig struktur dannet som et resultat av interaksjoner mellom de funksjonelle gruppene som utgjør peptidryggraden regulære strukturer av to typer: a-helix og b-struktur.

Den sekundære strukturen er dannet bare med deltagelse av hydrogenbindinger mellom peptidgrupper: oksygenatomet til en gruppe reagerer med hydrogenatomet til den andre, samtidig binder oksygenet til den andre peptidgruppen seg med hydrogenet til den tredje osv.

a-helix

peptidryggraden vrir seg inn i en spiral på grunn av dannelsen av hydrogenbindinger mellom oksygenatomene til karbonylgruppene og nitrogenatomene til aminogruppene. Hydrogenbindinger er orientert langs helix-aksen. Det er 3,6 aminosyrerester per omdreining av α-helixen.

Nesten alle oksygen- og hydrogenatomer i peptidgrupper deltar i dannelsen av hydrogenbindinger. Som et resultat blir α-helixen "trukket sammen" av mange hydrogenbindinger. bindinger er klassifisert som svake; antallet sikrer maksimal stabilitet til α-helixen. hydrofilisiteten til α-helikser avtar, og deres hydrofobisitet øker.

Den spiralformede strukturen er den mest stabile konformasjonen av peptidryggraden, tilsvarende minimum fri energi. Som et resultat av dannelsen av a-helikser blir polypeptidkjeden forkortet.

Aminosyreradikaler er lokalisert på utsiden av α-helixen og er rettet bort fra peptidryggraden; noen av dem kan forstyrre dannelsen av α-helixen. Disse inkluderer:

prolin Dens nitrogenatom er en del av en stiv ring, som eliminerer muligheten for rotasjon rundt -N-CH-bindingen. I tillegg har ikke prolitnitrogenatomet som danner en peptidbinding med en annen aminosyre et hydrogenatom. Som et resultat er prolin ikke i stand til å danne en hydrogenbinding på dette stedet i peptidryggraden, og α-helixstrukturen blir forstyrret. Vanligvis oppstår en løkke eller bøyning på dette punktet i peptidkjeden;

områder hvor flere identisk ladede radikaler er plassert etter hverandre, mellom hvilke elektrostatiske frastøtende krefter oppstår;

områder med tett plasserte store radikaler som mekanisk forstyrrer dannelsen av α-helixen, for eksempel metionin, tryptofan

β-fold lag Strukturen dannes på grunn av dannelsen av mange hydrogenbindinger mellom atomene i peptidgruppene i de lineære områdene i én polypeptidkjede som gjør bøyninger, eller mellom forskjellige polypeptidkjeder, danner β-strukturen en figur som ligner på et ark brettet som en trekkspill Når hydrogenbindinger dannes mellom atomene i peptidryggraden i forskjellige polypeptidkjeder, kalles de interkjedeforbindelser. Hydrogenbindinger som oppstår mellom lineære områder innenfor en polypeptidkjede kalles intrakjede. I β-strukturer er hydrogenbindinger plassert vinkelrett på polypeptidkjeden.

Hvis de sammenkoblede polypeptidkjedene er rettet i motsatte retninger, oppstår en antiparallell β-fold struktur, men hvis N- og C-terminalene til polypeptidkjedene faller sammen, dannes en parallell β-fold struktur.

9. Tertiær struktur– dette er arrangementet av en polypeptidkjede til en kule ("kule"). Det er umulig å trekke en klar grense mellom den sekundære og tertiære strukturen, den tertiære strukturen er basert på steriske forhold mellom aminosyrer som ligger langt fra hverandre i kjeden. Takket være den tertiære strukturen er kjededannelsen enda mer kompakt. Følgende er med på å stabilisere den tertiære strukturen til proteinet:

kovalente bindinger (mellom to cysteinrester - disulfidbroer);

ioniske bindinger mellom motsatt ladede sidegrupper av aminosyrerester;

hydrogenbindinger;

hydrofile-hydrofobe interaksjoner. Når det interagerer med omgivende vannmolekyler, "pleier" proteinmolekylet å folde seg slik at de upolare sidegruppene av aminosyrer isoleres fra den vandige løsningen; polare hydrofile sidegrupper vises på overflaten av molekylet.

Tilknytning til primærstrukturen. Den tertiære strukturen er i stor grad forhåndsbestemt av den primære strukturen. Arbeidet med å forutsi den tertiære strukturen til et protein basert på den primære strukturen er kjent sommet. Miljøet der proteinet folder seg bestemmer imidlertid den endelige formen, men blir vanligvis ikke tatt direkte i betraktning av gjeldende prediksjonsmetoder. De fleste slike metoder er avhengige av sammenligninger med allerede kjente strukturer, og inkorporerer dermed miljøet indirekte Supersekundær struktur av proteiner. sammenligning av konformasjonene til proteiner med forskjellige strukturer og funksjoner avslørte tilstedeværelsen av lignende kombinasjoner av sekundære strukturelementer. Denne spesifikke rekkefølgen for dannelse av sekundære strukturer kalles den supersekundære strukturen til proteiner.Den dannes på grunn av interradikale interaksjoner. Visse karakteristiske kombinasjoner av a-helikser og b-strukturer omtales ofte som "strukturelle motiver".

Bestemmelse av aminosyresammensetningen til proteiner kan utføres ved forskjellige metoder: kjemiske, kromatografiske, mikrobiologiske og isotoper. Kromatografiske metoder brukes oftere.

Papirkromatografi. Papirkromatografi brukes til å identifisere komponentene i en blanding av aminosyrer med di- og tripeptider oppnådd ved delvis hydrolyse av proteiner og polypeptider.

Hydrolyse kan utføres ved sure, alkaliske eller enzymatiske metoder. Syremetoden brukes oftere (6 N HCl, 8 N H 2 SO 4). Hydrolyse utføres ved oppvarming, noen ganger ved forhøyet trykk. Indikatorer på slutten av hydrolysen kan være: opphør av veksten av karboksyl- eller amingrupper i hydrolysatet, eller en negativ biuretreaksjon. Overskuddet av hydrolyserende reagens fjernes: svovelsyre utfelles med Ca(OH)2, saltsyre destilleres av i vakuum, og den gjenværende syren utfelles med sølvnitrat.

Komponentene i hydrolysatet er fordelt mellom vann adsorbert på cellulosen, som er den stasjonære fasen, og et organisk løsningsmiddel, den mobile fasen, som beveger seg opp eller ned langs arket. En blanding av butanol-eddiksyre-vann (4:1:5) brukes som mobil fase. Flere lipofile aminosyrer tiltrekkes sterkere av det organiske løsningsmidlet, mens mer hydrofile viser en større tendens til å binde seg til den stasjonære fasen. Homologe forbindelser som avviker med til og med en metylenenhet beveger seg med forskjellige hastigheter og kan lett skilles. Ved slutten av kromatografien tørkes papiret og behandles med en fremkaller (0,5% løsning av ninhydrin i en blanding av aceton-iseddik-vann) og oppvarmes i flere minutter. Aminosyrer vises som fargede flekker. Mobilitet er en konstant verdi som er karakteristisk for hver forbindelse og øker med økende molekylvekt. For rettkjedede aminosyrer er mobilitetsverdien litt høyere enn for tilsvarende isomerer. Innføringen av polare grupper i molekylet reduserer mobiliteten til forbindelsen. Aminosyrer med voluminøse upolare sidekjeder (leucin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan, etc.) beveger seg raskere enn aminosyrer med kortere upolare sidekjeder (prolin, alanin, glycin) eller med polare sidekjeder (treonin, arginin, cystein, histidin lysin). Dette skyldes den større løseligheten til polare molekyler i den hydrofile stasjonære fasen og av ikke-polare molekyler i organiske løsningsmidler.

Papirkromatografi kan brukes til å kvantifisere aminosyreinnhold. Hver flekk blir skåret ut og eluert med et egnet løsningsmiddel; deretter utføres en kvantitativ kolorimetrisk (ninhydrin) analyse. I en annen utførelse sprayes papiret med ninhydrin, og fargeintensiteten til flekken måles ved bruk av et fotometer i reflektert eller transmittert lys. I en semikvantitativ vurdering vurderes aminosyreinnholdet av arealet av flekker på kromatogrammet, som er proporsjonale med konsentrasjonene av aminosyrer i blandingen som separeres.

Tynnsjiktskromatografi. Tynnsjiktskromatografi kan også brukes til å separere og bestemme aminosyrer. TLC finnes som kjent i to versjoner. Partisjons-TLC ligner på partisjons-TLC på papir, og adsorpsjons-TLC er basert på helt andre prinsipper.

Når man utfører RTLC på cellulosepulver eller andre relativt inerte bærere, kan de samme løsningsmiddelsystemene og de samme fremkallingsreagensene brukes som ved papirkromatografi.

Separasjon ved ATLC bestemmes av evnen til et løsningsmiddel (dette løsningsmidlet er ikke nødvendigvis en binær eller mer kompleks blanding) til å eluere komponentene i prøven fra adsorpsjonsstedet på den aktiverte sorbenten. For eksempel på oppvarmet silikagel. ATLC er nyttig for separasjon av ikke-polare forbindelser som lipider, men ikke for separasjon av aminosyrer og de fleste peptider. For å skille aminosyrer brukes RTLC, som lar deg raskt separere og bestemme 22 aminosyrer av proteinhydrolysater.

Aminosyrer i proteinhydrolysat kan også bestemmes ved gasskromatografi, men før kromatografisk analyse omdannes aminosyrer vanligvis til flyktige forbindelser.

Interaksjon med ninhydrin. De tilsvarende aldehydene dannes.

Dermed oppnås og analyseres en blanding av aldehyder. Dette er det enkleste tilfellet, egnet bare for noen aminosyrer.

Aminosyrer omdannes til flyktige estere (alkylestere, metylestere av hydroksysyrer, metylestere av klorerte syrer, etc.).

Valget av derivater avhenger av blandingen av aminosyrer som studeres.

Ionebyttekromatografi. For tiden bestemmes aminosyresammensetningen til matprodukter utelukkende ved hjelp av automatisk ionebytterkromatografi.

For organiske ioner er den elektrostatiske interaksjonen med faste ladninger av ionebytteren overlagret av den hydrofobe interaksjonen av den organiske delen av ionet med ionebyttermatrisen. For å redusere dets bidrag til retensjon av organiske ioner og oppnå optimal selektivitet for separasjonen deres, tilsettes en organisk komponent (1–25 % metanol, isopropanol, acetonitril) til den vandige eluenten.

Moore og Stein-metoden bruker korte og lange kolonner fylt med sulfonert polystyrenharpiks i Na +-form. Når et surt hydrolysat ved pH = 2 påføres kolonnen, bindes aminosyrer gjennom kationbytte med natriumioner. Kolonnen elueres deretter med natriumcitratløsning ved forhåndsprogrammerte pH- og temperaturverdier. En kort kolonne elueres med én buffer, en lang kolonne med to. Eluatet behandles med ninhydrin, og fargeintensiteten måles med et strømningskolorimeter. Dataene registreres automatisk på en kartskriver og kan overføres til en datamaskin for å beregne arealet under toppen.

Høyspentelektroforese på inerte bærere. I biokjemi har separasjonen av aminosyrer, polypeptider og andre amfolytter (molekyler hvis totale ladning avhenger av pH i miljøet) under påvirkning av et påført konstant elektrisk felt funnet bred anvendelse. Dette er en metode for høyspentelektroforese på inerte bærere. Ved separering av aminosyrer brukes oftest papirstrimler eller tynne lag med cellulosepulver som inerte bærere. Separasjon utføres i 0,5–2 timer ved en spenning på 2000–5000 V, avhengig av de totale ladningene til amfolyttene og deres molekylvekter. Blant molekyler som bærer samme ladning, migrerer lettere molekyler raskere. Men en viktigere parameter under separasjon er den totale ladningen. Metoden brukes til å skille aminosyrer, lavmolekylære peptider, noen proteiner og nukleotider. Prøven plasseres på bæreren, fuktes med en buffer ved passende pH og kobles til bufferreservoaret med en stripe filterpapir. Papiret er dekket med en glassplate eller nedsenket i et hydrokarbonløsningsmiddel for avkjøling. I et elektrisk felt migrerer molekyler som bærer en negativ ladning ved en gitt pH til anoden, og de som bærer en positiv ladning migrerer til katoden. Deretter "utvikles" det tørkede elektroferogrammet med ninhydrin (når du arbeider med aminosyrer, peptider) eller måler absorpsjon i UV-lys (når du arbeider med nukleotider).

Valget av pH bestemmes av pK-verdiene til de dissosierende gruppene inkludert i molekylene i blandingen. Ved pH 6,4 bærer glutamat og aspartat en ladning -1 og beveger seg mot anoden; deres separasjon utføres på grunn av forskjellen i molekylvekt. Lysin, arginin og histidin beveger seg i motsatt retning, og alle andre aminosyrer som utgjør proteinet forblir i nærheten av påføringsstedet. Ved separering av peptider som følge av enzymatisk fordøyelse, øker en reduksjon av pH til 3,5 ladningen til de kationiske gruppene og gir bedre separasjon.

Aminosyrer bærer minst to svakt ioniserte grupper: -COOH og -NH3+. I løsning er disse gruppene i to former, ladet og uladet, mellom hvilke protonlikevekt opprettholdes:

R-COOH ↔ R-COO – + H +

R-NH 3 + ↔ R-NH 2 + H + (konjugerte syrer og baser)

R-COOH og R-NH 3 + er svake syrer, men den første er flere størrelsesordener sterkere. Derfor er karboksylgrupper oftest (blodplasma, intercellulær væske pH 7,1–7,4) i form av karboksylationer, aminogrupper protoneres. Aminosyrer eksisterer ikke i molekylær (ikke-dissosiert) form ved noen pH. De omtrentlige pK-verdiene for en a-aminosyre og a-aminogruppen i en a-aminosyre er henholdsvis 2 og 10.

Den totale (totale) ladningen (algebraisk sum av alle positive og negative ladninger) til en aminosyre avhenger av pH, dvs. på konsentrasjonen av protoner i løsningen. Ladningen til en aminosyre kan endres ved å variere pH. Dette letter den fysiske separasjonen av aminosyrer, peptider og proteiner.

pH-verdien der den totale ladningen til en aminosyre er null og derfor ikke beveger seg i et konstant elektrisk felt kalles det isoelektriske punktet (pI). Det isoelektriske punktet er plassert midt mellom de nærmeste pK-verdiene til dissosierende grupper.

Metoder for papir, tynnsjiktskromatografi, mikrobiologisk, gasskromatografi og en rekke andre er foreløpig praktisk talt ikke brukt på grunn av dårlig reproduserbarhet og lang varighet. Moderne kromatografer gjør det mulig å bestemme aminosyresammensetningen til en blanding som inneholder bare 10 –7 –10 –9 mol av hver komponent med en reproduserbarhet på opptil 5 % på 2-4 timer.

Analyse av aminosyresammensetning inkluderer fullstendig hydrolyse av proteinet eller peptidet som studeres og kvantitativ bestemmelse av alle aminosyrer i hydrolysatet. Siden peptidbindinger er stabile ved nøytral pH, brukes sur eller alkalisk katalyse. Enzymatisk katalyse er mindre egnet for fullstendig hydrolyse. Fullstendig hydrolyse av et protein til dets aminosyrer er uunngåelig ledsaget av et delvis tap av noen aminosyrerester. For hydrolyse brukes vanligvis 6N. vandig løsning av saltsyre (110ºС), i en evakuert ampulle. Kvantitativ bestemmelse av aminosyrer i hydrolysatet utføres ved bruk av en aminosyreanalysator. I de fleste av disse analysatorene separeres en blanding av aminosyrer på sulfoniske kationbyttere, og påvisning utføres spektrofotometrisk ved reaksjon med ninhydrin eller fluorimetrisk med O-ftalisk dialdehyd.

Imidlertid varierer data om aminosyresammensetningen til lignende produkter oppnådd i forskjellige laboratorier for individuelle aminosyrer noen ganger med opptil 50 %.

Disse forskjellene skyldes ikke bare varianter, arter eller teknologiske forskjeller, men hovedsakelig forholdene for hydrolyse av matproduktet. Med standard syrehydrolyse (6 N HСl, 110–120ºС, 22–24 timer) blir noen aminosyrer delvis ødelagt, inkludert treonin, serin (med 10–15 % og jo mer, jo lenger hydrolysen utføres) og spesielt metionin (30–60 %) og cystin 56–60 %, samt nesten fullstendig ødeleggelse av tryptofan og cystein. Denne prosessen forsterkes i nærvær av store mengder karbohydrater i produktet. For kvantitativ bestemmelse av metionin og cystin anbefales det å utføre deres foreløpige oksidasjon med perursyre. I dette tilfellet omdannes cystin til cysteinsyre, og metionin til metioninsulfon, som er svært stabile under påfølgende syrehydrolyse.

En vanskelig oppgave i aminosyreanalyse er bestemmelsen av tryptofan. Som allerede nevnt, under syrehydrolyse blir det nesten fullstendig ødelagt (opptil 90%). Derfor, for å bestemme tryptofan, utføres en av variantene av alkalisk hydrolyse av 2 N. NaOH, 100ºС, 16–18 timer i nærvær av 5 % tinnklorid eller 2 N. bariumhydroksid, der det ødelegges litt (opptil 10%). Minimal nedbrytning skjer i nærvær av tioglykolsyre og pre-hydrolysert stivelse. (Under alkalisk hydrolyse blir serin, treonin, arginin og cystein ødelagt). Etter nøytralisering med en blanding av sitronsyre og saltsyre analyseres hydrolysatet umiddelbart (for å unngå geldannelse) på en aminosyreanalysator. Når det gjelder de mange kjemiske metodene for å bestemme tryptofan, er de som regel dårlig reproduserbare i matvarer, og derfor anbefales ikke bruken av dem.

For kjøttprodukter er en ekstra essensiell aminosyre hydroksyprolin, som karakteriserer mengden bindevevsproteiner i kjøtt. Det kan bestemmes ved ionebytterkromatografi ved bruk av automatiske analysatorer eller ved en kjemisk kolorimetrisk metode. Metoden er basert på nøytralisering av syrehydrolysatet til pH 6,0, påfølgende oksidasjon av hydroksyprolin ved bruk av en 1,4 % løsning av kloramin T (eller kloramin B) i en blanding av propylalkohol og buffer, kolorimetrisk bestemmelse ved 533 nm av oksidasjonsproduktene av hydroksyprolin etter reaksjon med 10% - en løsning av para-dimetylaminobenzaldehyd i en blanding av perklorsyre og propylalkohol (1:2).

På grunn av det faktum at tyrosin, fenylalanin og prolin kan oksideres delvis i nærvær av oksygen, anbefales det å utføre standard syrehydrolyse i en nitrogenatmosfære. En rekke aminosyrer, inkludert leucin, isoleucin og valin, krever lengre syrehydrolyse for fullstendig isolasjon fra proteiner - opptil 72 timer.I biokjemi, når man analyserer proteiner, hydrolyseres parallelle prøver i 24, 48, 72 og 96 timer.

For nøyaktig å kvantifisere alle aminosyrer, er det nødvendig å utføre 5 forskjellige hydrolyse, noe som i stor grad forlenger bestemmelsen. Vanligvis utføres 1–2 hydrolyse (standard med saltsyre og med foreløpig oksidasjon med perursyre).

For å unngå tap av aminosyrer, bør fjerning av overflødig syre under syrehydrolyse utføres umiddelbart ved gjentatt fordampning i en vakuumekssikkator med tilsetning av destillert vann.

Når analysatoren fungerer riktig, fungerer ionebytterkolonner ganske lenge uten å erstatte harpiksen. Imidlertid, hvis prøvene inneholder betydelige mengder fargestoffer og lipider, blir kolonnen raskt tilstoppet og flere regenereringer, noen ganger som involverer ompakking av kolonnen, er nødvendig for å gjenopprette dens separasjonsevne. Derfor, for produkter som inneholder mer enn 5 % fett, anbefales det først å fjerne lipider ved ekstraksjon. Tabell 2.3 viser betingelsene for prøvepreparering av hovedmatprodukter ved analyse av aminosyresammensetningen.

Tabell 2.3. – Vilkår for klargjøring av matprøver for analyse

	Metode for fjerning av lipider	Vektforhold mellom protein: HCl (6M)
Proteinkonsentrater (isolater)	Ikke obligatorisk
Kjøtt, fisk, hermetisert kjøtt og fisk, innmat)	Ekstraksjon med 10 ganger dietyleter 3–4 ganger eller 10 ganger etanol-kloroform (1:2) 2 ganger
Melk og meieriprodukter	Ekstraksjon med en 10 ganger mengde av prøven ved å bruke en blanding av etanol-kloroform (1:2) 2 ganger
Korn og kornprodukter	Ikke obligatorisk
Planteprodukter	Ikke obligatorisk
Kjøtt-grønnsaks- og fiske-grønnsaksprodukter	Ekstraksjon med 10 ganger mengden dietyleter 3-4 ganger; en blanding av etanol-kloroform (1:2) 10 ganger mengden veid 2 ganger
Egg, eggprodukter	Ekstraksjon med en blanding av etanol-kloroform (1:2), 10 ganger mengden veid 2 ganger

For å bestemme aminosyrene som utgjør proteiner, brukes sur (HC1), alkalisk (Ba(OH)2) og enzymatisk hydrolyse. Når rent protein, fritt for urenheter, hydrolyseres, frigjøres 20 forskjellige aminosyrer.

Aminosyrer, komponenter av proteiner er
a-aminosyrer. Alle tilhører L-serien, og størrelsen og tegnet på optisk rotasjon avhenger av arten av aminosyreradikaler og pH-verdien til løsningen. D-aminosyrer finnes ikke i humane proteiner, men de finnes i celleveggen til bakterier, som en del av noen antibiotika (aktinomyciner).

Aminosyrer skiller seg fra hverandre i den kjemiske naturen til R-radikalet, som ikke deltar i dannelsen av en peptidbinding.

Moderne rasjonell klassifisering av aminosyrer er basert på polariteten til radikaler:

Ikke-polar (hydrofob)

Polar (hydrofil)

Negativt ladet

Finnes i noen proteiner aminosyrederivater. Bindevevsproteinet kollagen inneholder hydroksyprolin og oksylysin. Dijodtyrosin er grunnlaget for strukturen til skjoldbruskhormoner.

Aminosyrer har en felles egenskap - amfoterisk(fra det greske amphoteros - tosidig). I pH-området 4,0-9,0 eksisterer nesten alle aminosyrer i form av bipolare ioner (zwitterioner). Betydning isoelektrisk punkt av en aminosyre (IEP, pI) beregnet med formelen:

For monoaminodikarboksylsyrer beregnes pI som halvparten av summen av pK-verdiene (tabell 1) av a- og w-karboksylgrupper, for diaminomonokarboksylsyrer - som halvparten av summen av pK-verdiene til a- og w- aminogrupper.

Det er ikke-essensielle aminosyrer (kan syntetiseres i menneskekroppen), og essensielle aminosyrer, som ikke dannes i kroppen og må tilføres mat.

Essensielle aminosyrer: valin, leucin, isoleucin, lysin, metionin, treonin, tryptofan, fenylalanin.

Utskiftbare aminosyrer: glycin, alanin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, prolin, serin.

Betinget utskiftbar(kan syntetiseres i kroppen fra andre aminosyrer): arginin (fra citrullin), tyrosin (fra fenylalanin), cystein (fra serin), histidin (med deltakelse av glutamin).

For å oppdage og kvantifisere aminosyrer i biologiske objekter, brukes en reaksjon med ninhydrin.

Tabell 1. Aminosyredissosiasjonskonstanter

Aminosyre	pK 1	pK 2	pK 3
Alanya	2,34	9,69
Arginin	2,18	9,09	13,2
Asparagin	2,02	8,80
Asparaginsyre	1,88	3,65	9,60
Valii	2,32	9,62
Histidin	1,78	5,97	8,97
Glycin	2,34	9,60
Glutamin	2,17	9,13
Glutaminsyre	2,19	4,25	9,67
Isoleucin	2,26	9,62
Leucin	2,36	9,60
Lysin	2,20	8,90	10,28
Metionin	2,28	9,21
Proline	1,99	10,60
Serie	2,21	9,15
Tyrosin	2,20	9,11	10,07
Treonin	2,15	9,12
Tryptofan	2,38	9,39
Fenylalanin	1,83	9,13
Cystein	1,71	8,33	10,78