Polymerasekjedereaksjon, dens essens og bruksområder. Polymerase kjedereaksjon (PCR) og dens anvendelse Polymerase kjedereaksjon PCR metode

For ikke lenge siden ble det utviklet en pålitelig, svært sensitiv og rask metode for å diagnostisere ulike infeksjonssykdommer hos mennesker. Denne metoden kalles "PCR-analyse". Hva det er, hva dets essens er, hvilke mikroorganismer det kan identifisere og hvordan du tar det riktig, vil vi fortelle deg i artikkelen vår.

Oppdagelseshistorie

PCR-metoder brukes også ved diagnostisering av kreft.

Fordeler med metoden

PCR-diagnostikk har en rekke fordeler:

Høy følsomhet. Selv om bare noen få mikroorganisme-DNA-molekyler er tilstede, bestemmer PCR-analyse tilstedeværelsen av infeksjon. Metoden vil hjelpe mot kroniske og latente sykdommer. Ofte i slike tilfeller er ikke mikroorganismen ellers dyrkbar.
Ethvert materiale er egnet for forskning, for eksempel spytt, blod, kjønnssekresjoner, hår, epitelceller. Den vanligste er PCR-testen av blod og urogenital utstryk.
Det er ikke nødvendig med langvarig dyrking av avlinger. Den automatiserte diagnoseprosessen lar deg få forskningsresultater etter 4-5 timer.
Metoden er nesten hundre prosent pålitelig. Bare isolerte tilfeller av falske negative resultater er registrert.
Evnen til å identifisere flere typer patogener fra en prøve av materiale. Dette øker ikke bare prosessen med å diagnostisere sykdommen, men reduserer også materialkostnadene betydelig. Ofte foreskriver legen en kompleks PCR-test. Kostnaden for en undersøkelse som består av å identifisere seks patogener er omtrent 1500 rubler.

For at resultatene skal være pålitelige når du utfører en PCR-studie, må du ta testen, etter anbefalingene for foreløpig forberedelse til diagnose:

Før du donerer spytt, bør du avstå fra å spise og ta medisiner 4 timer før du samler inn materialet. Umiddelbart før prosedyren, skyll munnen med kokt vann.
Reglene ovenfor bør også følges når du tar en prøve fra den indre overflaten av kinnet. Etter skylling anbefales det å utføre en lett massasje av huden for å frigjøre sekresjonen av kjertelen.
Urin samles vanligvis opp hjemme. For å gjøre dette, må du rengjøre kjønnsorganene grundig. 50-60 ml urin skal samles i en steril plastbeholder. For å sikre renheten til materialet anbefales det for kvinner å sette inn en tampong i skjeden, og for menn å trekke tilbake hudfolden så mye som mulig. Du kan ikke donere materiale under menstruasjonen.
For å donere sæd, må du avstå fra seksuell omgang i 3 dager før du samler inn materialet. Leger anbefaler også å unngå å besøke badstuen og ta et varmt bad, drikke alkohol og krydret mat. Du bør avstå fra å tisse 3 timer før testen.
For eksempel, hvis en PCR-test for klamydia utføres, anbefales både kvinner og menn å ha seksuell hvile i 3 dager. 2 uker før testen bør du ikke ta antibakterielle legemidler. I en uke må du slutte å bruke intime geler, salver, vaginale stikkpiller og douching. 3 timer før testen bør du avstå fra å tisse. Under menstruasjon samles ikke materiale, kun 3 dager etter at blødningen har stoppet, kan en urogenital utstryk tas.

PCR under graviditet

Mens du venter på en baby, er mange seksuelt overførbare infeksjonssykdommer ekstremt farlige for den normale utviklingen av fosteret. Kjønnssykdommer kan forårsake intrauterin vekstretardasjon, spontanabort eller for tidlig fødsel, og medfødte defekter hos barnet. Derfor er det ekstremt viktig å gjennomgå PCR-testing i de tidlige stadiene av svangerskapet. Prøven skal tas ved registrering – inntil 12 uker.

Materialet samles opp fra livmorhalskanalen ved hjelp av en spesiell børste. Prosedyren er smertefri og utgjør ingen fare for babyen. Vanligvis, under graviditet, utføres en analyse for klamydia ved bruk av PCR-metoden, samt for ureaplasmose, mykoplasmose, cytomegalovirus, herpes og papillomavirus. Dette settet med undersøkelser kalles PCR-6.

PCR for HIV-diagnose

På grunn av at metoden er svært følsom for endringer i kroppen og diagnostiske forhold, kan mange faktorer påvirke resultatet. Derfor er ikke PCR-analyse for HIV-infeksjon en pålitelig metode; dens effektivitet er 96-98%. I de resterende 2-4 % av tilfellene gir testen falske positive resultater.

Men i noen situasjoner kan du ikke klare deg uten PCR-diagnostikk av HIV. Det utføres vanligvis på personer med et falskt negativt ELISA-resultat. Slike indikatorer indikerer at en person ennå ikke har utviklet antistoffer mot viruset, og de kan ikke oppdages uten en flere økning i antallet. Det er nettopp dette som kan oppnås ved å utføre en blodprøve med PCR-metoden.

Slik diagnostikk er også nødvendig for barn i det første leveåret født fra en HIV-positiv mor. Metoden er den eneste måten å pålitelig bestemme statusen til et barn.

PCR for diagnostisering av hepatitt

Polymerasekjedereaksjonsmetoden lar deg oppdage DNAet til hepatitt A, B, C-virus lenge før dannelsen av antistoffer mot infeksjonen eller utseendet av symptomer på sykdommen. PCR-testen for hepatitt C er spesielt effektiv, siden denne sykdommen i 85% av tilfellene er asymptomatisk og uten rettidig behandling blir kronisk.

Rettidig påvisning av patogenet vil bidra til å unngå komplikasjoner og langsiktig behandling.

Omfattende PCR-undersøkelse

Omfattende PCR-analyse: undersøkelse ved bruk av den polymesiske kjedereaksjonsmetoden, som inkluderer samtidig bestemmelse av flere typer infeksjoner: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, cytomegalovirus, herpes type 1 og 2, gonoré, papillomavirus. Prisen på slik diagnostikk varierer fra 2000 til 3500 rubler. avhengig av klinikken, materialene og utstyret som brukes, samt type analyse: kvalitativ eller kvantitativ. Legen vil avgjøre hvilken som er nødvendig i ditt tilfelle. I noen tilfeller er det nok å bare bestemme tilstedeværelsen av patogenet; i andre, for eksempel med HIV-infeksjon, spiller en kvantitativ titer en viktig rolle. Når du diagnostiserer alle de ovennevnte patogenene, kalles undersøkelsen "PCR-12-analyse."

Avkoding av analyseresultatene

Å tyde PCR-analysen er ikke vanskelig. Det er bare 2 indikatorskalaer - "positivt resultat" og "negativt resultat". Hvis et patogen oppdages, kan leger bekrefte tilstedeværelsen av sykdommen med 99% sikkerhet og begynne å behandle pasienten. Med den kvantitative metoden for å bestemme infeksjon, vil den numeriske indikatoren for de påviste bakteriene bli indikert i den tilsvarende kolonnen. Bare en lege kan bestemme omfanget av sykdommen og foreskrive nødvendig behandling.

I noen tilfeller, for eksempel ved bestemmelse av HIV-infeksjon ved bruk av PCR-metoden, hvis resultatet er negativt, blir det nødvendig å gjennomføre ytterligere undersøkelser for å bekrefte de oppnådde indikatorene.

Hvor kan jeg bli testet?

Hvor skal man ta en PCR-test: i en offentlig klinikk eller i et privat laboratorium? Dessverre er utstyr og metoder i kommunale medisinske institusjoner ofte utdaterte. Derfor er det bedre å gi preferanse til private laboratorier med moderne utstyr og høyt kvalifisert personell. I tillegg vil du i en privat klinikk få resultater mye raskere.

I Moskva tilbyr mange private laboratorier PCR-testing for ulike infeksjoner. For eksempel, i slike klinikker som "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro", utføres PCR-analyse. Prisen på undersøkelsen er fra 200 rubler. for å identifisere ett patogen.

Det kan konkluderes med at diagnostisering av infeksjonssykdommer ved hjelp av PCR-metoden i de fleste tilfeller er en rask og pålitelig måte å oppdage patogenet i kroppen i de tidlige stadiene av infeksjonen. Men likevel, i visse tilfeller er det verdt å velge andre diagnostiske metoder. Bare en spesialist kan bestemme behovet for en slik studie. Å tyde PCR-analysen krever også en profesjonell tilnærming. Følg legens anbefalinger og ikke ta unødvendige tester selv.

Ofte brukt som en rask metode for indikasjon og identifikasjon av virus.

Denne metoden ble først utviklet av K. Mullis (USA) i 1983. På grunn av sin høye sensitivitet, spesifisitet og enkle implementering, er den mye brukt innen genetikk, rettsmedisin, diagnostikk og andre felt.

Essensen av metoden er amplifikasjon, det vil si å øke antall kopier av strengt definerte fragmenter av et DNA-molekyl in vitro. Denne metoden bruker en matrisemekanisme og komplementaritetsprinsippet. To enkle polynukleotidkjeder (nukleinsyrer) er i stand til å kobles med hydrogenbindinger til én dobbelttrådet kjede hvis nukleotidsekvensene til den ene nøyaktig samsvarer med nukleotidsekvensen til den andre slik at deres nitrogenholdige baser kan danne adenin-tymin og guanin-cytosin par.

PCR er basert på DNA-amplifisering ved bruk av en termostabil DNA-polymerase, som syntetiserer gjensidig komplementære DNA-tråder, med utgangspunkt i to primere. En primer er et DNA-fragment som består av 20-30 nukleotider. Disse primerne er komplementære til de motsatte DNA-trådene. Under DNA-syntese settes primere inn i kjeden av nylig syntetiserte DNA-molekyler.

Vanligvis utføres PCR i 25-40 sykluser. Hver syklus inkluderer tre stadier: den første er denaturering ved 92-95 °C. I dette tilfellet divergerer de to DNA-trådene; den andre er annealing, eller tilsetning av primere ved 50-65 ° C; den tredje er forlengelse, eller polymerisering ved 68-72 ° C, mens DNA-polymerase utfører komplementær komplettering av DNA-templatekjedene ved bruk av fire typer nukleotider. Som et resultat av én syklus dobles ønsket genetisk materiale. DNA-kjedene som dannes i den første syklusen tjener som maler for den andre syklusen, osv. Etter den første syklusen blir bare fragmentet mellom de to primerne amplifisert. Dermed dobles antallet kopier av den amplifiserte regionen, noe som gjør det mulig å syntetisere millioner (2 n) DNA-fragmenter i 25-40 sykluser - en mengde som er tilstrekkelig for deres indikasjon ved forskjellige metoder (metoden for hybridiseringsprober som inneholder en viss merke, elektroforese, etc.). Oftere brukes agarosegelelektroforese med etidiumbromidfarging til dette formålet.

I PCR fra DNA-seksjoner av et patogen, brukes primere som har en unik sekvens av nukleotider som kun er karakteristisk for et bestemt patogen.

Prosedyren for å utføre PCR koker ned til følgende: en DNA-matrise isoleres fra materialet som studeres; i et reagensrør kombineres det isolerte DNA med en amplifikasjonsblanding, som inkluderer DNA-polymerase, alle 4 typer nukleotider, 2 typer primere, MgCl, buffer, avionisert vann og mineralolje. Deretter plasseres rørene i en syklus, og amplifikasjon utføres automatisk i henhold til et gitt program som tilsvarer typen patogen. Resultatene registreres oftere ved elektroforese i en 1-2 % agarosegel i nærvær av etidiumbromid, som kombineres med DNA-fragmenter og avsløres i form av lysende bånd når gelen bestråles med UV-stråler på en transilluminator. Alle PCR-prosedyrer tar 1-2 virkedager.

For å øke spesifisiteten og sensitiviteten til PCR, brukes ulike alternativer: nestet PCR; PCR med en "varm start" ved bruk av et parafinlag eller blokkering av de aktive sentrene til polymerasen med monoklonale antistoffer. I tillegg produserer noen selskaper lyofiliserte reagenssett for DNA-amplifisering, som fremskynder PCR-prosessen og reduserer muligheten for falske positive resultater.

En ny teknologi, Real-Time PCR, introduseres for tiden. Dens grunnleggende funksjon er overvåking og kvantitativ analyse av akkumulering av pog automatisk registrering og tolkning av de oppnådde resultatene. Denne metoden krever ikke et elektroforesetrinn, noe som reduserer laboratoriekravene til PCR. Sanntids-PCR bruker fluorescensmerkede oligonukleotidprober for å oppdage DNA når det amplifiseres. Sanntids-PCR tillater fullstendig analyse av en prøve i løpet av 20-60 minutter og er teoretisk sett en måte å oppdage selv ett DNA- eller RNA-molekyl i en prøve.

Produktdeteksjonssystemet i sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR-overvåking) lar deg overvåke akkumuleringen av amplifisert DNA syklus for syklus. Systemet inkluderer også en oligonukleotidprobe som er i stand til å feste (hybridisere) til det indre segmentet av mål-DNA. Proben er merket i 5′-enden med et fluorescerende reporterfargestoff, og i 3′-enden med et blokkeringsfargestoff (quencher-fargestoff). Når PCR-produktet akkumuleres, hybridiserer proben til det, men det oppstår ingen luminescens på grunn av nærheten mellom reporteren og blokkeren. Som et resultat av kopiering av sekvensen når polymerasen 5'-enden av proben. 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til polymerasen løsner den fluorescerende taggen fra 3'-enden av proben, og frigjør derved den fluorescerende reporteren fra dens forbindelse med signalblokkeren, noe som fører til en økning i fluorescens. Nivået av fluorescens er dermed proporsjonalt med mengden av det spesifikke reaksjonsproduktet. Det er viktig at PCR-resultater registreres ved tilstedeværelse av fluorescens i lukkede rør, og dermed er et annet av hovedproblemene med denne metoden løst - problemet med kontaminering med amplikoner.

Fordeler med PCR: analysehastighet; høy sensitivitet og spesifisitet; minimumsmengde testmateriale; enkel utførelse og mulighet for full automatisering.

På grunn av det faktum at sensitiviteten til PCR kan nå opp til påvisning av én kopi av DNA-malen, er det en høy grad av fare for å oppnå falske positive resultater. Derfor, når du utfører PCR-testing, må et genetisk diagnostisk laboratorium strengt overholde spesielle krav til layout og driftsmodus.

PCR er en av de komplementære metodene som finnes i virologisk diagnostikk. Denne reaksjonen er svært viktig for diagnostisering av virusinfeksjoner når virale antigener eller virusspesifikke antistoffer ikke kan påvises og når tilstedeværelsen av viral nukleinsyre kan være det eneste beviset på infeksjon, spesielt ved latente og blandede infeksjoner.

Hvis du finner en feil, merk en tekst og klikk Ctrl+Enter.

Fikk Nobelprisen.

Ved begynnelsen av metoden, etter hver oppvarming-avkjølingssyklus, måtte DNA-polymerase tilsettes reaksjonsblandingen, siden den ble inaktivert ved den høye temperaturen som kreves for å skille trådene til DNA-helixen. Reaksjonsprosedyren var relativt ineffektiv og krevde mye tid og enzym. I 1986 ble polymerasekjedereaksjonsmetoden betydelig forbedret. Det er foreslått å bruke DNA-polymeraser fra termofile bakterier. Disse enzymene viste seg å være termostabile og var i stand til å motstå mange reaksjonssykluser. Bruken av dem gjorde det mulig å forenkle og automatisere PCR. En av de første termostabile DNA-polymerasene ble isolert fra bakterier Thermus aquaticus og navngitt Taq-polymerase. Ulempen med denne polymerasen er at sannsynligheten for å introdusere et feil nukleotid er ganske høy, siden dette enzymet ikke har feilkorreksjonsmekanismer (3"→5" eksonukleaseaktivitet). Polymeraser Pfu Og Pwo, isolert fra archaea, har en slik mekanisme; bruken av dem reduserer antallet mutasjoner i DNA betydelig, men hastigheten på arbeidet deres (prosessiviteten) er lavere enn for Taq. I dag brukes blandinger Taq Og Pfu for å oppnå både høy polymerisasjonshastighet og høy kopieringsnøyaktighet.

På tidspunktet for oppfinnelsen av metoden jobbet Kary Mullis som syntetisk kjemiker (han syntetiserte oligonukleotider, som deretter ble brukt til å oppdage punktmutasjoner ved hybridisering med genomisk DNA) ved Cetus Corporation, som patenterte PCR-metoden. I 1992 solgte Cetus rettighetene til metoden og patentet til bruk Taq-polymeraseselskapet Hofmann-La Roche for 300 millioner dollar. Det viste seg imidlertid at Taq-polymerase ble karakterisert av de sovjetiske biokjemikerne A. Kaledin, A. Slyusarenko og S. Gorodetsky i 1980, og også 4 år før denne sovjetiske publikasjonen, det vil si i 1976, av de amerikanske biokjemikerne Alice Chien, David B. Edgar og John M. Trela. I denne forbindelse prøvde Promega-selskapet å tvinge Roche til å gi fra seg eksklusive rettigheter til dette enzymet i retten. Det amerikanske patentet for PCR-metoden utløp i mars 2005.

Utføre PCR

Metoden er basert på gjentatt selektiv kopiering av en bestemt del av DNA ved bruk av enzymer under kunstige forhold ( in vitro). I dette tilfellet kopieres bare delen som tilfredsstiller de spesifiserte betingelsene, og bare hvis den er til stede i utvalget som studeres. I motsetning til DNA-amplifisering i levende organismer (replikasjon), blir relativt korte seksjoner av DNA amplifisert ved bruk av PCR. I en konvensjonell PCR-prosess er lengden på de kopierte DNA-seksjonene ikke mer enn 3000 basepar (3 kbp). Ved å bruke en blanding av forskjellige polymeraser, ved bruk av tilsetningsstoffer og under visse forhold, kan lengden på et PCR-fragment nå 20-40 tusen nukleotidpar. Dette er fortsatt betydelig mindre enn lengden på kromosomalt DNA til en eukaryot celle. For eksempel består det menneskelige genomet av omtrent 3 milliarder basepar.

Reaksjonskomponenter

For å utføre PCR i det enkleste tilfellet, kreves følgende komponenter:

DNA-matrise, som inneholder delen av DNA som må amplifiseres.
To primere, komplementær til de motsatte endene av forskjellige tråder av det ønskede DNA-fragmentet.
Termisk stabil DNA-polymerase- et enzym som katalyserer polymerisasjonsreaksjonen til DNA. Polymerase for bruk i PCR må forbli aktiv ved høye temperaturer i lang tid, så enzymer isolert fra termofile brukes - Thermus aquaticus(Taq polymerase), Pyrococcus furiosus(Pfu polymerase), Pyrococcus woesei(Pwo polymerase) og andre.
Deoksyribonukleosidtrifosfater(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ ioner nødvendig for driften av polymerasen.
Bufferløsning, som gir de nødvendige reaksjonsbetingelser - pH, ionestyrke til løsningen. Inneholder salter, bovint serumalbumin.

For å unngå fordampning av reaksjonsblandingen, tilsett høytkokende olje, slik som vaselin, i reagensrøret. Hvis du bruker en termisk syklus med oppvarmet lokk, er dette ikke nødvendig.

Tilsetning av pyrofosfatase kan øke utbyttet av PCR-reaksjonen. Dette enzymet katalyserer hydrolysen av pyrofosfat, et biprodukt av tilsetning av nukleotidtrifosfater til den voksende DNA-strengen, til ortofosfat. Pyrofosfat kan hemme PCR-reaksjonen.

Primere

Spesifisiteten til PCR er basert på dannelsen av komplementære komplekser mellom malen og primerne, korte syntetiske oligonukleotider 18-30 baser lange. Hver primer er komplementær til en av trådene til den dobbelttrådete malen og begrenser begynnelsen og slutten av den amplifiserte regionen.

Etter hybridisering av malen med primeren (annealing), tjener sistnevnte som en primer for DNA-polymerase under syntesen av den komplementære malstrengen (se).

Den viktigste egenskapen til primere er smeltetemperaturen (Tm) til primer-matrise-komplekset.

Tm er temperaturen der halvparten av DNA-templatene danner et kompleks med oligonukleotidprimeren. Gjennomsnittlig formel for å beregne Tm for et kort oligonukleotid (og for lange DNA-fragmenter), tatt i betraktning konsentrasjonen av K + og DMSO-ioner:

hvor L er antall nukleotider i primeren, K + er den molare konsentrasjonen av kaliumioner, G + C er summen av alle guaniner og cytosiner.

Hvis lengden og nukleotidsammensetningen til primeren eller annealingstemperaturen er feil valgt, er dannelsen av delvis komplementære komplekser med andre regioner av mal-DNA mulig, noe som kan føre til utseendet av uspesifikke produkter. Den øvre grensen for smeltetemperaturen er begrenset av den optimale virkningstemperaturen til polymerasen, hvis aktivitet avtar ved temperaturer over 80 °C.

Når du velger primere, er det tilrådelig å følge følgende kriterier:

Forsterker

Ris. 1: Cycler for PCR

PCR utføres i en termisk syklus - en enhet som gir periodisk kjøling og oppvarming av reagensrør, vanligvis med en nøyaktighet på minst 0,1 °C. Moderne syklere lar deg stille inn komplekse programmer, inkludert muligheten til "varmstart", Touchdown PCR (se nedenfor) og påfølgende lagring av amplifiserte molekyler ved 4 °C. For sanntids PCR produseres enheter utstyrt med en fluorescerende detektor. Det finnes også enheter med et automatisk lokk og et rom for mikroplater, som gjør at de kan integreres i automatiserte systemer.

Fremdrift av reaksjonen

Fotografi av en gel som inneholder markør-DNA (første og siste spor) og PCR-produkter

Vanligvis utfører PCR 20-35 sykluser, som hver består av tre trinn (fig. 2).

Denaturering

Den dobbelttrådete DNA-malen varmes opp til 94-96 °C (eller til 98 °C hvis en spesielt termostabil polymerase brukes) i 0,5-2 minutter for å skille DNA-trådene. Dette stadiet kalles denaturering, siden hydrogenbindingene mellom de to DNA-trådene blir ødelagt. Noen ganger, før den første syklusen (før tilsetning av polymerasen), forvarmes reaksjonsblandingen i 2-3 minutter for å fullstendig denaturere matrisen og primerne. Denne teknikken kalles varm start, lar den deg redusere mengden av uspesifikke reaksjonsprodukter.

Gløding

Når strengene har skilt seg, senkes temperaturen for å la primerne binde seg til den enkelttrådede malen. Dette stadiet kalles gløding. Utglødningstemperaturen avhenger av sammensetningen av primerne og velges vanligvis lik smeltetemperaturen til primerne. Et feil valg av annealingstemperatur fører enten til dårlig binding av primere til malen (ved for høy temperatur) eller til binding på feil sted og utseende av uspesifikke produkter (ved for lav temperatur). Tiden for annealingsstadiet er 30 sekunder, samtidig klarer polymerasen i løpet av denne tiden å syntetisere flere hundre nukleotider. Derfor anbefales det å velge primere med et smeltepunkt over 60 °C og utføre annealing og forlengelse samtidig ved 60-72 °C.

Forlengelse

DNA-polymerase replikerer malstrengen ved å bruke en primer som primer. Dette er scenen forlengelse. Polymerasen begynner å syntetisere den andre tråden fra 3"-enden av primeren som har bundet seg til malen, og beveger seg langs malen, og syntetiserer en ny tråd i retningen fra 5" til 3"-enden. Forlengelsestemperaturen avhenger av polymerase. De vanligste polymerasene Taq og Pfu er mest aktive ved 72 ° C. Forlengelsestiden avhenger både av typen DNA-polymerase og lengden på det amplifiserte fragmentet. Typisk er forlengelsestiden satt til ett minutt per tusen basepar Etter at alle sykluser er fullført, utføres ofte et ekstra trinn endelig forlengelse, for å fullføre alle enkelttrådede fragmenter. Dette stadiet varer i 7-10 minutter.

Ris. 2: Skjematisk fremstilling av den første PCR-syklusen. (1) Denaturering ved 94-96 °C. (2) Gløding ved 68 °C (for eksempel). (3) Forlengelse ved 72°C (P=polymerase). (4) Første syklus fullført. De to resulterende DNA-trådene fungerer som en mal for neste syklus, så mengden av mal-DNA dobles i løpet av hver syklus

Mengden spesifikt reaksjonsprodukt (begrenset av primere) øker teoretisk proporsjonalt med 2n - 2n, hvor n er antall reaksjonssykluser. Faktisk kan effektiviteten til hver syklus være mindre enn 100 %, så i virkeligheten P ~ (1+E) n, hvor P er mengden produkt, er E den gjennomsnittlige effektiviteten til syklusen.

Antallet "lange" DNA-kopier øker også, men lineært, så et spesifikt fragment dominerer i reaksjonsproduktene.

Veksten av det nødvendige produktet er eksponentielt begrenset av antall reagenser, tilstedeværelsen av inhibitorer og dannelsen av biprodukter. I løpet av de siste syklusene av reaksjonen avtar veksten, dette kalles "platåeffekten".

Typer PCR

Nestet PCR(Nested PCR (engelsk)) - brukes til å redusere antall reaksjonsbiprodukter. To par primere brukes og to sekvensielle reaksjoner utføres. Det andre primerparet forsterker en DNA-region i produktet av den første reaksjonen.
Invertert PCR(Invers PCR (engelsk)) - brukes hvis bare en liten region innenfor ønsket sekvens er kjent. Denne metoden er spesielt nyttig når det gjelder å bestemme nabosekvenser etter at DNA er satt inn i genomet. For å utføre invertert PCR, utføres en serie DNA-kutt med restriksjonsenzymer, etterfulgt av sammenføyning av fragmenter (ligering). Som et resultat havner kjente fragmenter i begge ender av den ukjente regionen, hvoretter PCR kan utføres som vanlig.
Revers transkripsjon PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (engelsk)) - brukes til å amplifisere, isolere eller identifisere en kjent sekvens fra et RNA-bibliotek. Før konvensjonell PCR syntetiseres et enkelttrådet DNA-molekyl på en mRNA-template ved bruk av reversease, og det oppnås et enkelttrådet cDNA, som brukes som en mal for PCR. Denne metoden bestemmer ofte hvor og når disse genene kommer til uttrykk.
Asymmetrisk PCR(Engelsk) Asymmetrisk PCR) - utføres når det er nødvendig å amplifisere hovedsakelig en av strengene til det opprinnelige DNA. Brukt i noen sekvenserings- og hybridiseringsanalyseteknikker. PCR utføres som vanlig, bortsett fra at en av primerne tas i stort overskudd. Modifikasjoner av denne metoden er engelsk. L i øret- EN etter- T han- E xponential-PCR (LATE-PCR), hvor primere med forskjellige konsentrasjoner brukes, og lavkonsentrasjonsprimeren velges til å ha et høyere (smeltepunkt) enn høykonsentrasjonsprimeren. PCR utføres ved høy glødetemperatur, og opprettholder dermed effektiviteten av reaksjonen gjennom alle sykluser.
Kvantitativ PCR(Kvantitativ PCR, Q-PCR (engelsk)) eller Sanntids PCR- brukes til direkte å overvåke måling av mengden av et spesifikt PCR-produkt i hver reaksjonssyklus. Denne metoden bruker fluorescensmerkede primere eller DNA-prober for nøyaktig å måle mengden av reaksjonsproduktet når det akkumuleres; eller et fluorescerende interkalerende fargestoff brukes Sybr Green I, som binder seg til dobbelttrådet DNA. Sybr Green I gir et enkelt og kostnadseffektivt alternativ for deteksjon og kvantifisering av PCR-produkter under sanntids PCR uten behov for spesifikke fluorescerende prober eller primere. Under forsterkning, fargestoffet SYBR Grønn I er innebygd i det mindre sporet i DNAet til PCR-produkter og sender ut et sterkere fluorescerende signal når det bestråles med en blå laser sammenlignet med ubundet fargestoff. SYBR Grønn I kompatibel med alle kjente enheter for sanntids PCR. Maksimal absorpsjon for SYBR Grønn I ligger ved en bølgelengde på 494 nm. I tillegg til den viktigste inneholder fargestoffets spektrum to små ekstra absorpsjonsmaksima - ved 290 nm og 380 nm. Maksimalt utslipp for SYBR Grønn I ligger ved en bølgelengde på 521 nm (grønn).
Trinnvis PCR(Touchdown PCR (engelsk)) - ved å bruke denne tilnærmingen reduseres påvirkningen av uspesifikk primerbinding. De første syklusene utføres ved en temperatur over den optimale glødetemperaturen, deretter med noen få sykluser reduseres glødetemperaturen gradvis til den optimale. Dette gjøres slik at primeren hybridiserer med den komplementære tråden langs hele dens lengde; mens ved den optimale annealingstemperaturen hybridiserer primeren delvis med den komplementære tråden. Delvis hybridisering av primeren på genomisk DNA fører til uspesifikk amplifikasjon dersom det er mange bindingsseter for primeren. I de fleste tilfeller kan de første ti PCR-syklusene utføres ved en glødetemperatur på 72-75°C, og deretter umiddelbart reduseres til den optimale temperaturen, for eksempel til 60-65°C.
Molekylær kolonimetode(PCR i gel, engelsk. Koloni - PCR-koloni) - akrylamidgel polymeriseres med alle PCR-komponenter på overflaten og PCR utføres. På punkter som inneholder det analyserte DNA, skjer amplifikasjon med dannelse av molekylære kolonier.
PCR med rask amplifikasjon av cDNA-ender(Engelsk) Rask amplifikasjon av cDNA-ender, RACE-PCR ).
Langt fragment PCR(Engelsk) Langdistanse PCR) - en modifikasjon av PCR for amplifikasjon av utvidede seksjoner av DNA (10 tusen baser eller mer). En blanding av to polymeraser brukes, hvorav den ene er Taq-polymerase med høy prosessivitet (det vil si i stand til å syntetisere en lang kjede av DNA i en passasje), og den andre er DNA-polymerase med 3"-5" eksonukleaseaktivitet, vanligvis Pfu polymerase. Den andre polymerasen er nødvendig for å korrigere feil introdusert av den første, siden Taq-polymerase stopper DNA-syntese hvis et ikke-komplementært nukleotid er tilsatt. Dette ikke-komplementære nukleotidet fjernes av Pfu-polymerase. Blandingen av polymeraser tas i forholdet 50:1 eller til og med mindre enn 100:1, hvor Taq-polymerase tas 25-100 ganger mer i forhold til Pfu-polymerase.
RAPD(Engelsk) Tilfeldig amplifikasjon av polymorft DNA ), PCR med tilfeldig amplifikasjon av polymorft DNA - brukes når det er nødvendig å skille mellom organismer som er nærliggende i genetisk rekkefølge, for eksempel ulike varianter av kulturplanter, hunderaser eller nært beslektede mikroorganismer. Denne metoden bruker vanligvis en liten primer (ca. 10 bp). Denne primeren vil være delvis komplementær til tilfeldige deler av DNAet til organismene som studeres. Ved å velge betingelser (primerlengde, dens sammensetning, temperatur osv.), er det mulig å oppnå en tilfredsstillende forskjell i PCR-mønsteret for to organismer.
Gruppespesifikk PCR(Engelsk) gruppespesifikk PCR) - PCR for beslektede sekvenser innenfor samme eller mellom forskjellige arter, ved bruk av konserverte primere for disse sekvensene. For eksempel valg av universelle primere for ribosomal 18S Og 26S gener for artsspesifikk intergen spacer-amplifikasjon: gensekvens 18S Og 26S er bevart mellom arter, så PCR mellom disse genene vil fungere for alle arter som er testet. Det motsatte av denne metoden er - unik PCR(Engelsk) unik PCR), der oppgaven er å velge primere for kun å amplifisere en spesifikk sekvens blant beslektede sekvenser.
PCR ved hjelp av varmstart(Engelsk) Hot-start PCR) - en modifikasjon av PCR ved bruk av DNA-polymerase, der polymeraseaktiviteten blokkeres ved romtemperatur av antistoffer eller små molekyler som simulerer antistoffer som Affibody, det vil si på tidspunktet for oppsett av reaksjonen før den første denatureringen i PCR. Vanligvis utføres den første denatureringen ved 95 °C i 10 minutter.
Virtuell PCR(eng. in silico PCR, digital PCR, elektronisk PCR, e-PCR) - en matematisk metode for datamaskinanalyse av en teoretisk polymerasekjedereaksjon ved bruk av en liste over primersekvenser (eller DNA-prober) for å forutsi potensiell DNA-amplifisering av genomet , kromosom, sirkulært DNA eller et annet stykke DNA.

Hvis nukleotidsekvensen til malen er delvis kjent eller ukjent i det hele tatt, kan du bruke degenererte primere, hvis sekvens inneholder degenererte posisjoner hvor alle baser kan lokaliseres. For eksempel kan primersekvensen være: ...ATH..., hvor N er A, T eller C.

Anvendelse av PCR

PCR brukes på mange områder for testing og vitenskapelige eksperimenter.

Forensics

PCR brukes til å sammenligne såkalte "genetiske fingeravtrykk." Det kreves en prøve av genetisk materiale fra åstedet - blod, spytt, sæd, hår osv. Dette sammenlignes med arvestoffet til den mistenkte. En veldig liten mengde DNA er nok, teoretisk sett én kopi. DNAet brytes ned til fragmenter og forsterkes deretter ved hjelp av PCR. Fragmentene separeres ved hjelp av DNA-elektroforese. Det resulterende bildet av arrangementet av DNA-bånd kalles genetisk fingeravtrykk(Engelsk) genetisk fingeravtrykk).

Etablering av farskap

Ris. 3: Resultater av elektroforese av DNA-fragmenter amplifisert ved PCR. (1) Far. (2) Barn. (3) Mor. Barnet arvet noen trekk ved det genetiske avtrykket til begge foreldrene, noe som ga et nytt, unikt avtrykk.

Selv om genetiske fingeravtrykk er unike (unntatt når det gjelder eneggede tvillinger), kan familieforhold fortsatt etableres ved å lage flere fingeravtrykk (figur 3). Den samme metoden kan brukes, litt modifisert, for å etablere evolusjonær slektskap mellom organismer.

Medisinsk diagnostikk

PCR gjør det mulig å fremskynde og lette diagnostiseringen av arvelige og virussykdommer betydelig. Genet av interesse blir amplifisert ved PCR ved bruk av passende primere og deretter sekvensert for å identifisere mutasjoner. Virusinfeksjoner kan oppdages umiddelbart etter infeksjon, uker eller måneder før symptomene oppstår.

Personlig medisin

Noen ganger viser medisiner seg å være giftige eller allergifremkallende for noen pasienter. Årsakene til dette skyldes delvis individuelle forskjeller i mottakelighet og metabolisme av legemidler og deres derivater. Disse forskjellene bestemmes på genetisk nivå. For eksempel, hos en pasient kan et visst cytokrom (et leverprotein som er ansvarlig for metabolisering av fremmede stoffer) være mer aktivt, i en annen - mindre. For å finne ut hvilken type cytokrom en gitt pasient har, foreslås det å gjennomføre en PCR-analyse før legemidlet tas i bruk. Denne analysen kalles foreløpig genotyping. prospektiv genotyping).

Genkloning

Genkloning (ikke å forveksle med kloning av organismer) er prosessen med å isolere gener og, som et resultat av genmanipulasjonsmanipulasjoner, oppnå en stor mengde av produktet av et gitt gen. PCR brukes til å forsterke et gen, som deretter settes inn i vektor- et DNA-fragment som overfører et fremmed gen til den samme eller en annen organisme som er praktisk for dyrking. For eksempel brukes plasmider eller viralt DNA som vektorer. Innsetting av gener i en fremmed organisme brukes vanligvis til å produsere produktet av det genet - RNA eller, oftest, et protein. På denne måten oppnås mange proteiner i industrielle mengder til bruk i landbruk, medisin m.m.

Ris. 4: Genkloning ved bruk av et plasmid.
(1) Kromosomalt DNA fra organisme A. (2) PCR. (3) Mange kopier av genet til organisme A. (4) Innsetting av genet i et plasmid. (5) Plasmid med genet til organisme A. (6) Innføring av plasmidet i organisme B. (7) Multiplikasjon av antall kopier av genet til organisme A i organisme B.

DNA-sekvensering

I sekvenseringsmetoden som bruker dideoksynukleotider merket med en fluorescerende markør eller radioaktiv isotop, er PCR en integrert del, siden det er under polymerisering at derivater av nukleotider merket med en fluorescerende eller radioaktiv markør settes inn i DNA-kjeden. Tilsetningen av et dideoksynukleotid til den syntetiserte kjeden avslutter syntesen, slik at posisjonen til spesifikke nukleotider kan bestemmes etter separasjon i gelen.

Mutagenese

For tiden har PCR blitt hovedmetoden for å utføre mutagenese (endre nukleotidsekvensen til DNA). Bruken av PCR har gjort det mulig å forenkle og fremskynde mutageneseprosedyren, samt gjøre den mer pålitelig og reproduserbar.

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en høypresisjonsmetode innen diagnostisering av arvelige patologier, infeksjoner, virussykdommer på ethvert stadium (akutt eller kronisk), samt - på et tidlig stadium - før åpenbare manifestasjoner av sykdommen ved å identifisere patogener basert på deres DNA, RNA , som er genetisk materiale, i prøver hentet fra pasienten. Og i dag vil vi snakke om essensen, diagnostiske stadier og prinsipper for polymerasekjedereaksjon (PCR) metoder, så vel som kostnadene.

Hva er polymerasekjedereaksjon

Grunnlaget for analysen er amplifikasjon (dobling) - opprettelsen av mange kopier fra en kort del av DNA (deoksyribonukleinsyre), som representerer det menneskelige genetiske kompleks. Studien krever en svært liten mengde fysiologisk substans (sputum, avføring, epitelavskrapninger, prostatajuice, blod, sæd, fostervann, slim, morkakevev, urin, spytt, pleuravæske, cerebrospinalvæske). I dette tilfellet, for eksempel, kan til og med en enkelt skadelig mikrobe oppdages i pasientens kjønnsorganer.

PCR-teknikken (polymerase chain reaction) ble utviklet av den amerikanske vitenskapsmannen K. Mullis, som mottok Nobelprisen i 1993.

Brukes aktivt:

i tidlig diagnose av infeksjoner, genetisk;
i rettsmedisinsk undersøkelse når det er en ekstremt liten mengde DNA tilgjengelig for undersøkelse;
innen veterinærmedisin, farmasøytiske produkter, biologi, molekylær genetikk;
for identifikasjon av en person ved DNA, bekreftelse av farskap;
i paleontologi, antropologi, økologi (ved overvåking av kvaliteten på produkter, miljøfaktorer).

Denne videoen vil fortelle deg i detalj hva en polymerasekjedereaksjon er:

Hvem er det foreskrevet til?

Polymerasekjedereaksjon i diagnostisering av infeksjonssykdommer er en av de mest pålitelige metodene for spesiell nøyaktighet og pålitelighet. For eksempel er påliteligheten til PCR-analysen for klamydia og mange andre patogener nær 100 % (absolutt). Oftest er poforeskrevet til pasienter som har problemer med å identifisere et spesifikt patogen under diagnosen.

Laboratorie PCR-test brukes:

å oppdage patogener som forårsaker infeksjoner i urin- og kjønnsorganer som er vanskelig å identifisere ved bruk av kultur eller immunologiske metoder;
for re-diagnostisering av HIV i det innledende stadiet i tilfelle et positivt, men tvilsomt resultat av den første testen (for eksempel hos nyfødte fra AIDS-infiserte foreldre);
å identifisere kreft på et tidlig stadium (studie av onkogenmutasjoner) og individuelt justere behandlingsregimet for en bestemt pasient;
for tidlig oppdagelse og potensiell behandling av arvelige patologier.

Derfor tar fremtidige foreldre en test for å finne ut om de er bærere av en genetisk patologi; hos barn bestemmer PCR sannsynligheten for eksponering for en sykdom som overføres ved arv.

å oppdage føtale patologier i de tidlige stadiene av svangerskapet (individuelle celler i det voksende embryoet undersøkes for tilstedeværelse av mulige mutasjoner);
hos pasienter før organtransplantasjon - for "vevstyping" (bestemmelse av vevskompatibilitet);
å identifisere farlige patogene organismer i donert blod;
hos nyfødte - for å identifisere skjulte infeksjoner;
å evaluere resultatene av antiviral og antimikrobiell behandling.

Hvorfor gjennomgå en slik prosedyre?

Siden PCR er en svært effektiv diagnostisk metode, som gir nesten 100 % resultater, brukes prosedyren:

å bekrefte eller ekskludere den endelige diagnosen;
rask vurdering av effektiviteten av behandlingen.

I mange tilfeller er PCR den eneste mulige testen for å oppdage en utviklende sykdom dersom andre bakteriologiske, immunologiske og virologiske diagnostiske metoder er ubrukelige.

Virus oppdages ved hjelp av en PCR-prosedyre umiddelbart etter infeksjon og før tegn på sykdom viser seg. Tidlig påvisning av viruset gir rask behandling.
Den såkalte "virale belastningen" (eller antall virus i kroppen) bestemmes også ved DNA-analyse ved bruk av en kvantitativ metode.
Spesifikke patogener (f.eks. Kochs tuberkulosebasill) er vanskelige og tar for lang tid å dyrke. PCR-testing muliggjør rask påvisning av minimale patogener (levende og døde) i prøver som er praktiske for testing.

Detaljert patogen DNA-analyse brukes:

å bestemme dens følsomhet for spesifikke typer antibiotika, som tillater umiddelbar behandling;
å kontrollere spredningen av epidemier blant husdyr og ville dyr;
å identifisere og spore nye smittsomme mikrobielle arter og patogenundertyper som har gitt næring til tidligere epidemier.

Typer diagnostikk

Standard metode

Polymerasekjedereaksjonsanalyse utføres på grunnlag av multippel amplifikasjon (dobling) av et spesifikt fragment av DNA og RNA ved bruk av spesielle primerenzymer. Som følge av kopieringskjeden oppnås tilstrekkelig mengde materiale til forskning.

Under prosedyren kopieres bare det ønskede fragmentet (tilsvarer de spesifiserte spesifikke forholdene) og hvis det faktisk er tilstede i prøven.

Denne detaljerte videoen med nyttige diagrammer forklarer hvordan PCR fungerer:

Andre metoder

Sanntids PCR. I denne typen forskning starter prosessen med å identifisere et gitt DNA-fragment etter hver syklus, og ikke etter å ha fullført hele kjeden på 30 - 40 sykluser. Denne typen forskning lar deg få informasjon om mengden av et patogen (virus eller mikrobe) i kroppen, det vil si utføre en kvantitativ analyse.
RT-PCR (omvendt transkripsjonsmodus). Denne testen brukes til å se etter enkelttrådet RNA for å oppdage virus hvis genetiske base er RNA (for eksempel hepatitt C-virus, immunsviktvirus). I denne studien brukes et spesielt enzym - revers transkriptase og en spesifikk primer, og enkelttrådet DNA bygges på basis av RNA. Deretter gjenvinnes den andre DNA-strengen fra denne strengen og standardprosedyren utføres.

Indikasjoner for testing

PCR-prosedyren brukes i klinikken for infeksjonssykdommer, neonatologi, obstetrikk, pediatri, urologi, gynekologi, venerologi, nevrologi, nefrologi og oftalmologi.

Indikasjoner for testing:

bestemme risikoen for å utvikle genetiske abnormiteter hos et barn med sannsynlighet for arvelige patologier;
diagnostisere begge foreldrene når de planlegger en graviditet eller den alvorlige tilstanden til moren under en pågående graviditet;
vanskeligheter med unnfangelse, identifisere årsakene til infertilitet;
mistanke om seksuelt overførbare infeksjoner i det akutte stadiet og med symptomer på deres overgang til kronisk;
påvisning av årsaker til inflammatoriske prosesser av ukjent opprinnelse;
ubeskyttede tilfeldige og regelmessige seksuelle kontakter;
bestemme følsomheten til en patogen mikroorganisme for spesifikke antibiotika;
pasienter med mistenkt latent infeksjon for å oppdage patogener før utvikling av åpenbare symptomer (preklinisk diagnose);
pasienter for å bekrefte bedring etter sykdom (retrospektiv diagnose);:

Diagnostikk brukes også hvis det er nødvendig å nøyaktig identifisere følgende patogener:

hepatittvirus (ABC G), human immunsvikt, cytomegalovirus;
Vibrio cholerae;
herpes simplex-virus, herpetiforme arter;
retro - adeno - og rhinovirus;
rubella, Epstein-Barr, varicella (Zoster) virus;
parvo- og picornovirus;
bakterie Helicobacter pylori;
Legionella, patogene typer Escherichia coli;
Staphylococcus aureus;
patogen;
clostridia, difteri og hemophilus influenzae;

Det brukes også til å bestemme infeksjoner:

Infeksiøs mononukleose;
borreliose, listeriose, flått-encefalitt;
candidiasis forårsaket av Candida-sopp;
seksuelt overførbare infeksjoner - trichomoniasis, ureaplasmose, treponema pallidum, gardnerellose, gonoré, mykoplasmose, klamydia;
tuberkulose.

Kontraindikasjoner for

Siden prosedyren ikke utføres med pasienten, uten påvirkning på kroppen, men med biologisk materiale tatt for forskning, er det ingen kontraindikasjoner for PCR på grunn av fravær av potensiell fare.

Imidlertid samles ikke biomateriale opp fra livmorhalskanalen etter kolposkopi. Innlevering av utstryk og skrap for analyse er kun tillatt 4–6 dager etter slutten av menstruasjonen og fullstendig opphør av utflod.

Er metoden trygg?

Ingen negativ innvirkning på pasienten under en isolert studie av biomaterialet hans i laboratoriet er mulig.

Forberedelse til prosedyren (innlevering av biologiske stoffer for analyse)

Eventuelle biologiske væsker, vev eller kroppssekreter fungerer som en prøve for PCR-analyse, som oppdager DNA til et fremmed patogen. Teststoffet tas i form av å ta blod fra en vene, skraping fra strupehodet, nesehulen, urinrøret, pleurahulen, livmorhalsen.

Før den diagnostiske prosedyren forklarer legen til pasienten hvilket materiale som vil bli samlet inn:

Når man undersøker for seksuelt overførbare infeksjoner, samles sekret fra kjønnsorganene, urin og et utstryk fra urinrøret.
Når man analyserer for herpetiske infeksjoner, tas cytomegalovirus, mononukleose, urin og en halsprøve for analyse; for hepatitt, toksoplasmose tas blod fra en vene.
For å diagnostisere ulike typer samles cerebrospinalvæske.
I pulmonologi er prøver for analyse sputum og pleuravæske.
Når man gjennomfører en studie av mulige intrauterine infeksjoner under graviditet, brukes fostervann og placentaceller for analyse.

Påliteligheten og nøyaktigheten til analysen avhenger av steriliteten til forholdene når materialet tas. Siden PCR-testing er svært sensitiv, kan enhver forurensning av teststoffet forvrenge resultatet.

Kompetent forberedelse for levering av biomateriale byr ikke på noen vanskeligheter for pasientene. Det er visse anbefalinger:

når man analyserer for seksuelt overførbare infeksjoner:
- ekskluder intime kontakter 72 timer før du sender inn materialet;
- slutte å bruke vaginale produkter 3 dager før;
- fra kvelden dagen før, ikke utfør hygiene på området som undersøkes;
- utelukk vannlating 3–4 timer før du tar en prøve fra urinrøret;
slutte å ta antibiotika en måned før testing for infeksjoner;
blod doneres om morgenen før du spiser og drikker;
Den første morgenurinprøven samles i en steril beholder etter et grundig intimtoalett.

Les nedenfor om hvordan diagnostikk utføres ved bruk av polymerasekjedereaksjonsmetoden.

Hvordan fungerer prosedyren?

Når du utfører en PCR-studie, gjentas visse sykluser om og om igjen i en reaktor (forsterker eller termisk syklus):

Det første trinnet er denaturering. Spytt, blod, biopsimateriale, gynekologiske prøver, sputum, hvor det er mistanke om tilstedeværelse av DNA (eller RNA) av et patogen, plasseres i en forsterker, hvor materialet varmes opp og DNAet deles i to separate kjeder.
Det andre trinnet er gløding eller svak avkjøling av materialet og legge til primere til det som kan gjenkjenne de ønskede områdene i DNA-molekylet og binde seg til dem.
Det tredje trinnet er forlengelse– oppstår etter at 2 primere er festet til hver av DNA-trådene. Under prosessen fullføres DNA-fragmentet av patogenet, og kopien dannes.

Disse syklusene gjentas som en "kjedereaksjon", hver gang som fører til dobling av kopier av et spesifikt DNA-fragment (for eksempel segmentet der et spesifikt virus er programmert). I løpet av få timer dannes mange kopier av DNA-fragmentet, og deres tilstedeværelse i prøven oppdages. Etter dette blir resultatene analysert og sammenlignet med data fra en database over ulike typer patogener for å bestemme type infeksjon.

Les nedenfor om avkoding av resultatene og konklusjonen basert på PCR-reaksjonen.

Dekoding av resultatene

Det endelige resultatet av studien utstedes 1 – 2 dager etter innlevering av biologisk materiale. Ofte - allerede den første dagen etter analysen.

Kvalitativ analyse

Negativ resultatet betyr at det ikke ble funnet spor av smittestoffer i stoffet som ble sendt inn for testing.
Positivt resultatet betyr påvisning av patogene virus eller bakterier i en biologisk prøve med en meget høy grad av nøyaktighet på tidspunktet for innsending av materialet.

Hvis resultatet er positivt, men ingen tegn på økt infeksjon oppdages, kalles denne tilstanden til kroppen asymptomatisk "sunn vogn." Oftest observert når man tar biomateriale fra et bestemt sted (cervikal kanal, urinrør, munnhule) i virussykdommer. I dette tilfellet er behandling ikke nødvendig, men konstant medisinsk tilsyn er nødvendig, siden det er en mulighet for:

spredning av viruset fra bærere og infeksjon av friske mennesker;
aktivering av prosessen og overgang av sykdommen til en kronisk form.

Men hvis blodprøven er positiv, indikerer dette at infeksjonen har rammet kroppen, og dette er ikke lenger en bærertilstand, men en patologi som krever umiddelbar spesifikk terapi.

Kvantitativ analyse

Det kvantitative resultatet bestemmes av en spesialist spesielt for en bestemt type infeksjon. Basert på det er det mulig å vurdere graden av utvikling og stadium av sykdommen, noe som gjør det mulig å raskt foreskrive riktig behandling.

gjennomsnittlig kostnad

Prisene for polymerasekjedereaksjon bestemmes av: type forskning, vanskeligheten med å identifisere patogenet, vanskeligheten med å samle biologisk materiale, type analyse (kvalitativ eller kvantitativ) og prisnivået i laboratoriet.

På den annen side, når man studerer PCR, er det mulig å identifisere flere patogener samtidig når man samler inn én type materiale for analyse. Dette lar deg spare på andre laboratorietester.

Omtrentlig kostnad for PCR-analyse i rubler:

gonokokker, gardnerella, trichomonas vaginalis – fra 180
chlamydia trachomatis - fra 190
papillomavirus - fra 380 til 500
biocenose av urogenitalkanalen hos kvinner (kvantitativ og kvalitativ vurdering av mikroflora) - fra 800.

Enda mer nyttig informasjon om PCR-testing finnes i videoen nedenfor:

Genetikk av bakterier. Informasjon til andre leksjon.

Polymerase kjedereaksjon

Polymerasekjedereaksjon er en metode som tillater en multippel økning (amplifikasjon) i mengden av visse DNA-molekyler i den analyserte prøven (inkludert i biologisk materiale eller ren kultur).

Hovedfordelene med PCR som en diagnostisk metode i mikrobiologi er svært høy sensitivitet, som tillater påvisning av ekstremt lave konsentrasjoner av patogener i prøver, samt justerbar spesifisitet, som tillater påvisning eller identifisering av patogener på slekts-, art- eller underartnivå. Den største ulempen med PCR kommer fra den ekstremt høye sensitiviteten – det er veldig lett for prøver å bli kontaminert med DNA fra en positiv kontroll, en annen prøve eller et PCR-produkt, noe som resulterer i en falsk positiv reaksjon. Dette setter strenge restriksjoner på forholdene for PCR-blanding og arbeid med ferdige PCR-produkter.

Utføre PCR. En reaksjonsblanding fremstilles som inneholder følgende komponenter:

Isolert DNA fra testprøven,

Bufferløsning,

Mg2+ ioner (nødvendig for at enzymet skal fungere),

To primere er enkelttrådede korte DNA-molekyler (oftest 18 til 24 nukleotider i lengde), komplementære til endene av forskjellige tråder av DNA-sekvensen som påvises.

En blanding av deoksynukleotidtrifosfater.

Varmebestandig DNA-polymerase (Taq-polymerase brukes oftest - en polymerase isolert fra Thermus aquaticus).

Denne reaksjonsblandingen plasseres deretter i en termisk syklus, som i hovedsak er en programmerbar termostat. Den termiske sykluseren utfører 30-40 sykluser med temperaturendringer. Hver av disse syklusene består av tre stadier (se fig. 1):

Denaturering (temperatur 94 o C) - hydrogenkjeder brytes og DNA-tråder divergerer.

Annealing av primere (temperaturen er vanligvis rundt 50-60 o C) - primere festes til endene av DNA-kjedene. Generelt, når temperaturen synker, er det energimessig mer gunstig å gjenforene de originale DNA-kjedene fra testprøven (renaturering), men konsentrasjonen av primere i reaksjonsblandingen er mange størrelsesordener større enn konsentrasjonen av DNA fra prøve (i det minste i de innledende PCR-syklusene), slik at primer-annealingsreaksjonen fortsetter raskere enn renaturerings-DNA. Utglødningstemperaturen velges avhengig av smeltetemperaturen (denaturerings-) til primerne.

Forlengelse (temperaturen er vanligvis 72 o C) - DNA-polymerase fullfører primerne langs malen til lange DNA-kjeder. Temperaturen tilsvarer den optimale driftstemperaturen til DNA-polymerasen som brukes.

Deteksjon av resultater er forskjellig i forskjellige versjoner av PCR og er beskrevet i delen "Typer PCR".

PCR-dynamikk

I tidlige PCR-sykluser dobles antallet dobbelttrådete DNA-molekyler, hvis størrelse bestemmes av avstanden mellom primer-landingsstedene, med hver syklus. Det dannes også en liten mengde lengre DNA-molekyler, som kan neglisjeres (se fig. 2).

Således, i tidlige sykluser, er mengden av PCR-produkt beskrevet av formelen m*2n, hvor m er startmengden av ønsket DNA i prøven, n er antall sykluser. Så når reaksjonen et platå. Dette skjer på grunn av akkumulering av reaksjonsproduktet, en reduksjon i konsentrasjonen av primere og deoksynukleotidtrifosfater, og også på grunn av en økning i konsentrasjonen av pyrofosfat (se figur 3).

Typer PCR

Konvensjonell PCR

I denne versjonen av PCR-oppsettet fortsetter reaksjonen i et forhåndsvalgt antall sykluser (30-40), hvoretter det analyseres om opphopning av dobbelttrådede DNA-molekyler har skjedd i reaksjonsblandingen.

Dette alternativet for å utføre PCR, når det brukes som en diagnostisk metode, er en kvalitativ metode. En positiv reaksjon indikerer tilstedeværelsen av minst spormengder av de ønskede DNA-molekylene i prøven. En negativ reaksjon indikerer deres fravær. Kvantitativ vurdering av innholdet av de originale DNA-molekylene i prøven er umulig på grunn av at reaksjonen når et platå.

Hovedmetoden for å påvise tilstedeværelsen av et produkt er elektroforese i agarose eller polyakrylamidgel. PCR-produkter separeres i en gel under påvirkning av et elektrisk felt i henhold til deres molekylvekt. Et interkalerende fargestoff (fluorescerende i dobbelttrådet DNA-tilstand - oftest etidiumbromid) tilsettes gelen. Ved bestråling med ultrafiolett lys vil det således være mulig å se tilstedeværelsen eller fraværet av en stripe som tilsvarer DNA med den nødvendige molekylvekten. Ved gjennomføring av PCR for diagnostiske formål brukes alltid positive og negative reaksjonskontroller som prøvene sammenlignes med (se fig. 4).

Sanntids PCR

I denne versjonen av PCR registreres mengden av PCR-produkt i reaksjonsblandingen konstant i løpet av reaksjonen. Dette lar deg konstruere en reaksjonskurve (se fig. 3) og basert på den beregne antall ønskede DNA-molekyler i prøvene.

En type sanntids-PCR er å bruke et interkalerende fargestoff, som tilsettes direkte til reaksjonsblandingen (SYBRGreen brukes oftest). En annen type er å bruke en av typene fluorescerende prober som binder seg til et sted inne i PCR-produktet, noe som gjør det mulig å øke spesifisiteten til deteksjon (se fig. 5) Fluorescensdeteksjon skjer direkte i enheten under reaksjonen.

I tillegg til muligheten for kvantitativ deteksjon, er det andre fordeler med sanntids PCR sammenlignet med konvensjonell PCR. Dette PCR-alternativet er enklere, raskere og krever heller ikke åpning av rør med PCR-produkter, noe som reduserer sannsynligheten for kontaminering av andre prøver. Den største ulempen er den høyere kostnaden for en termisk syklus med innebygd fluorescensdeteksjonsevne sammenlignet med en konvensjonell.

Digital kvantitativ PCR

En ny, dyr og fortsatt sjeldent brukt versjon av PCR som lar deg mer nøyaktig bestemme mengden DNA i en prøve. I denne versjonen er reaksjonsblandingen som inneholder et fluorescerende fargestoff delt inn i et stort antall mikroskopiske volumer (f.eks. dråper i en emulsjon). Etter PCR analyseres det i hvilken brøkdel av dråper reaksjonen var positiv, og følgelig observeres fluorescens. Denne fraksjonen vil være proporsjonal med antall DNA-molekyler som søkes i prøven.

Revers transkripsjon PCR

I dette tilfellet, før en eller annen versjon av PCR, utføres en revers transkripsjonsreaksjon (RNA til DNA) ved å bruke enzymet reversetase. Dermed tillater denne metoden kvalitativ eller kvantitativ påvisning av RNA-molekyler. Dette kan brukes til å oppdage RNA-virus eller bestemme transkripsjonsnivået (mengden av mRNA) til et bestemt gen.

Bilde 1. PCR stadier. Primere er angitt med rødt.

Figur 2. Akkumulering av dobbelttrådede DNA-molekyler begrenset av primere under PCR.

Figur 3. Dynamikk av PCR-reaksjonen ved forskjellige innledende konsentrasjoner av de ønskede DNA-molekylene i prøven. (a) – høyeste konsentrasjon (b) – mellomkonsentrasjon (c) – laveste konsentrasjon

Figur 4. Agaroseelektroforese av PCR-produkter. K+ – positiv kontroll (det er kjent at ønsket DNA er tilstede). 1-7 – testprøver (hvorav 1-2 er positive, 3-7 er negative). K- – negativ kontroll (ønsket DNA er åpenbart fraværende). I mange tilfeller, i tillegg til målproduktet, er lettere uspesifikke reaksjonsprodukter (primer-dimerer) synlige.

Figur 5. Deteksjonsmetoder ved bruk av sanntids PCR. (a) – interkalerende fargestoff – fluorescerer når det er bundet til dobbelttrådet DNA (b) – Taqman-probe – fluorescens oppstår når proben spaltes av DNA-polymerase med 5'-3' endonukleaseaktivitet på grunn av separasjon av fluoroforen og quencheren. (c) – MolecularBeacon-probe – fluorescens oppstår når proben hybridiserer med målfragmentet på grunn av romlig separasjon av fluoroforen og quencheren (d) – LightCycler-prober – akseptorfluorescens oppstår når probene (som inneholder en akseptor og donor) hybridiserer med målfragment på grunn av resonansoverføring av fluorescensenergi (FRET).