Acțiunea citokinelor asupra celulelor se realizează prin. Citokine. Imunitate antivirală mecanisme moleculare și celulare, modele de dezvoltare și imunopatho

Până de curând, cancerul în stadiul 4 era de fapt o condamnare la moarte pentru pacient. Metodele tradiționale de tratament au fost de puțin ajutor; toată terapia s-a limitat la ameliorarea simptomelor. Cu toate acestea, în urmă cu câteva decenii, au început să dezvolte activ imuno-oncologia și, în special, terapia cu citokine - o metodă de tratament cu medicamente pe bază de proteine corporale, care, conform recenziilor, este foarte eficientă. Clinica de oncoimunologie și terapia cu citokine din Moscova este considerată una dintre cele mai bune din lume pentru indicatorii săi pozitivi.

Ce este terapia cu citokine

Această metodă de tratament s-a dezvoltat pe baza imuno-oncologiei - o secțiune de oncologie care studiază funcționarea sistemului imunitar în cancer. Metoda se bazează pe tratamentul cancerului și al altor boli cu medicamente pe bază de proteine (citokine) ale corpului uman. În anumite condiții, pot distruge diferiți agenți patogeni: celule străine, viruși, antigeni, endotoxine etc. Cum funcționează citokinele:

activarea răspunsului imunologic al organismului la atacul agenților patogeni;
controlul activității sistemului imunitar, celulelor ucigașe (elemente care luptă direct împotriva bolii);
provocarea reînnoirii masei celulare la una sănătoasă;
normalizarea sistemelor corpului.

Acțiune pozitivă

Adăugarea de lucru cu citokine în tratamentul complex al oncologiei ajută la obținerea unei terapii pozitive absolute la 10-30% dintre pacienți, iar succesul parțial ajunge la 90%. Se poate părea că acest lucru nu este suficient, dar pentru tumorile canceroase severe din ultimele etape, aceasta este o realizare imensă. Mai mult, tehnica poate și trebuie combinată cu metode tradiționale (medicamente, chimioterapie).

Terapia cu citokine funcționează eficient și precis împotriva tumorilor, metastazelor și, în același timp, nu are un efect toxic asupra organismului. Separat, merită remarcat o creștere pozitivă a calității chimioterapiei. Tehnica și-a dovedit deja eficacitatea în studiile clinice (în Federația Rusă, peste 50 de patologii de diferite tipuri sunt permise să fie tratate cu această tehnică). Pe lângă bolile oncologice, terapia cu citokine luptă cu succes împotriva altor patologii:

oncologie până la etapa 4;
hepatita virală B, C;
melanom;
Sarcomul lui Kaposi pe fondul HIV;
SIDA și HIV;
SARS, gripă, infecții bacteriene intestinale și cu rotavirus;
tuberculoză;
zona zoster;
schizofrenie;
scleroză multiplă.

Oncoimunologie și citokine terapie

Practic toate tumorile maligne cu evoluție severă apar pe fondul imunității suprimate. Oncoimmunologii (specialiști în imuno-oncologie) dezvoltă, pe fondul studiilor clinice, noi metode și medicamente pentru tratamentul cancerului, pe baza acțiunilor sistemului imunitar. Metoda terapiei cu citokine se bazează pe utilizarea citokinelor, proteine speciale, iar tehnica în sine a apărut în anii 80 ai secolului XX. Principala problemă a fost toxicitatea ridicată a medicamentelor. Medicamentele moderne bazate pe citokine au o toxicitate de 100 de ori mai mică.

Funcțiile citokinelor în organism

Există o cantitate imensă de citokine în corpul uman, toate îndeplinind funcții diferite. Terapia cu citokine utilizează această diversitate pentru a trata o gamă largă de boli și pentru a activa procesele interne ale corpului. S-a dovedit că, de fapt, sistemele umane pot combate orice problemă. Principalul lucru este să porniți procesele necesare. Funcțiile citokinelor în organism:

control asupra duratei și calității răspunsului imun;
citokinele antiinflamatorii controlează inflamația;
stimularea dezvoltării reacțiilor autoimune (citokine antiinflamatoare și proinflamatorii);
participarea la mecanica alergiei;
reducerea tumorii sau distrugerea acesteia;
stimularea sau suprimarea creșterii celulare;
încetinirea dezvoltării oncologiei;
coordonarea sistemului imunitar, endocrin și nervos;
prevenirea reapariției tumorii;
menținerea homeostaziei (constanță sănătoasă) a corpului.

Numărul de proteine citokine studiate a depășit deja 200 de nume. Interacțiunea citokinelor este un complex complex cu funcții diferite. Inițial, acestea sunt împărțite în funcție de tipul de activitate. O clasificare simplificată presupune o divizare în funcție de efectele biologice: regulatori inflamatori (citokine antiinflamatorii și proinflamatorii), reglarea imunității celulare și diviziunea imună umorală. O sistematizare mai precisă descompune proteinele în funcție de natura lor de acțiune. Tipuri de citokine:

regulatorii activității imune (interleukinele și funcțiile lor biologice asigură interacțiunea corectă a imunității cu alte sisteme ale corpului);
regulatori antivirali - interferoni;
TNF (factori de necroză tumorală) - efecte reglatoare sau toxice asupra celulelor;
chemokine - controlul mișcării tuturor tipurilor de leucocite, a altor celule;
factori de creștere - controlul creșterii celulare;
factori de stimulare a coloniei - stimularea dezvoltării celulelor hematopoietice.

Citokinele ca medicamente

Ingaron este un agent terapeutic cu citokine pentru îmbunătățirea efectului chimioterapiei, protejând în același timp organismul de efectele toxice. În plus, reduce posibila apariție a metastazelor și tumorilor. Medicamentul Ingaron provoacă dezvoltarea imunității, care după chimioterapie nu va permite dezvoltarea bolilor infecțioase, va reduce nevoia de medicamente antibacteriene. Instrumentul are o toxicitate minimă în comparație cu omologii occidentali.

Medicamentul Refnot are ca scop limitarea dezvoltării neoplasmelor datorate citokinei TNF din compoziție. Agentul are, de asemenea, o toxicitate calitativ redusă, care permite administrarea sa subcutanată sau intravenoasă, stimulează distrugerea tumorilor maligne fără a afecta țesuturile însoțitoare. Pentru a determina dinamica tratamentului, sunt necesare 1-2 cursuri. Pentru a obține efectul maxim, ambele medicamente sunt utilizate în combinație pentru a activa citokinele necesare în oncologie.

Efecte secundare

Tratamentul cu citokine poate provoca efecte negative în funcție de morfologia bolii, de starea generală a pacientului și de combinația de medicamente. În cea mai mare parte, efectele secundare nu reprezintă un pericol pentru pacient, ci indică o reacție a tumorii la medicament. Când apar reacții secundare, cursul terapiei este suspendat sau regimul de tratament este ajustat. Posibile manifestări negative ale corpului:

o creștere a temperaturii corpului cu 2-3 grade 4-6 ore după introducerea citokinelor;
durere și roșeață la locul injectării;
otrăvirea corpului cu produse de dezintegrare tumorală (în cazul unei formațiuni mari).

Pentru cine nu este potrivită metoda terapiei cu citokine

Medicamentele pe bază de citokine nu au practic contraindicații și pot fi utilizate pentru orice pacient. Cu toate acestea, ca și în cazul altor medicamente, există un număr de pacienți cărora nu li se recomandă utilizarea acestei metode de tratament. Nu utilizați terapia cu citokine pentru femeile gravide, în timpul alăptării, în prezența bolilor autoimune, o alergie personală rară a organismului la medicamente.

Costul terapiei cu citokine

Utilizarea eficientă a medicamentelor cu citokine se realizează în centre specializate (de exemplu, Centrul de Oncoimunologie și Terapie cu Citokine din Moscova este cea mai bună clinică în opinia pacienților salvați). Costul acestui tip de tratament variază foarte mult în funcție de tipul de medicament utilizat și de boala specifică. Prețuri aproximative pentru unele medicamente citokinice din Moscova.

Acest capitol va lua în considerare o abordare integrată a evaluării sistemului de citokine utilizând metodele moderne de cercetare descrise anterior.

În primul rând, prezentăm conceptele de bază ale sistemului de citokine.

Citokinele sunt considerate în prezent ca molecule proteină-peptidă produse de diferite celule ale corpului și care efectuează interacțiuni intercelulare și intersistemice. Citokinele sunt regulatori universali ai ciclului de viață al celulelor, controlează procesele de diferențiere, proliferare, activare funcțională și apoptoză a acestora din urmă.

Citokinele produse de celulele sistemului imunitar se numesc imunocitokine; sunt o clasă de mediatori peptidici solubili ai sistemului imunitar necesari dezvoltării, funcționării și interacțiunii cu alte sisteme ale corpului (Kovalchuk L.V. și colab., 1999).

Ca molecule reglatoare, citokinele joacă un rol important în reacțiile imunității înnăscute și adaptative, asigură interconectarea acestora, controlează hematopoieza, inflamația, vindecarea rănilor, formarea de noi vase de sânge (angiogeneza) și multe alte procese vitale.

În prezent, există mai multe clasificări diferite ale citokinelor, luând în considerare structura, activitatea funcțională, originea, tipul receptorilor citokinelor. În mod tradițional, în conformitate cu efectele biologice, este obișnuit să se distingă următoarele grupuri de citokine.

1. Interleukini(IL-1-IL-33) sunt proteine reglatoare secretoare ale sistemului imunitar care asigură interacțiuni mediator în sistemul imunitar și conexiunea acestuia cu alte sisteme ale corpului. Interleukinele sunt clasificate în funcție de activitatea lor funcțională în citokine pro și antiinflamatoare, factori de creștere a limfocitelor, citokine reglatoare etc.

3. Factori de necroză tumorală (TNF)- citokine cu acțiuni citotoxice și reglatoare: TNFa și limfotoxine (LT).

4. Factori de creștere a celulelor hematopoietice- factor de creștere a celulelor stem (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoietină, trobopoietină, factor de stimulare a coloniilor granulocite-macrofage - GM-CSF, granulocite CSF - G-CSF, macrofage -

ny KSF - M-KSF).

5. Chimiochine- С, CC, СХС (IL-8), СХ3С - regulatori ai chimiotaxiei diferitelor tipuri de celule.

6. Factori de creștere a celulelor nelimfoide- regulatori de creștere, diferențiere și activitate funcțională a celulelor aparținând diferitelor țesuturi (factor de creștere a fibroblastelor - FGF, factor de creștere a celulelor endoteliale, factor de creștere epidermică - EGF al epidermei) și factori de creștere transformatori (TGFβ, TGFα).

Printre alții, în ultimii ani, a fost studiat în mod activ un factor care inhibă migrația macrofagelor (factorul de inhibare a migrației - MIF), care este considerat un neurohormon cu citokină și activitate enzimatică (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV și colab. ,

Citokinele diferă prin structură, activitate biologică și alte proprietăți. Cu toate acestea, împreună cu diferențele, citokinele au proprietăți generale, caracteristic acestei clase de molecule de bioreglare.

1. Citokinele sunt, de regulă, polipeptide glicozilate cu greutate moleculară medie (mai mică de 30 kD).

2. Citokinele sunt produse de celulele sistemului imunitar și de alte celule (de exemplu, endoteliu, fibroblaste etc.) ca răspuns la un stimul activant (structuri moleculare asociate patogenilor, antigeni, citokine etc.) și participă la reacții de imunitate înnăscută și adaptativă, reglând puterea și durata acestora. Unele citokine sunt sintetizate constitutiv.

3. Secreția citokinelor este un proces pe termen scurt. Citokinele nu sunt stocate ca molecule preformate, ci ale lor

sinteza începe întotdeauna cu transcrierea genelor. Celulele produc citokine în concentrații mici (picograme pe mililitru).

4. În majoritatea cazurilor, citokinele sunt produse și acționează asupra celulelor țintă din imediata apropiere (acțiune pe termen scurt). Situl principal al acțiunii citokinelor este sinapsa intercelulară.

5. Redundanţă sistemul de citokine se manifestă prin faptul că fiecare tip de celulă este capabilă să producă mai multe citokine, iar fiecare citokină poate fi secretată de celule diferite.

6. Toate citokinele se caracterizează prin pleiotropie, sau polifuncționalitatea acțiunii. Astfel, manifestarea semnelor de inflamație se datorează influenței IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Duplicarea funcțiilor asigură fiabilitatea sistemului de citokine.

7. Acțiunea citokinelor asupra celulelor țintă este mediată de receptori de membrană foarte specifici cu afinitate ridicată, care sunt glicoproteine transmembranare, constând de obicei din mai multe subunități. Partea extracelulară a receptorilor este responsabilă de legarea citokinelor. Există receptori care elimină excesul de citokine în focarul patologic. Aceștia sunt așa-numiții receptori capcană. Receptorii solubili sunt domeniul extracelular al receptorului de membrană, separat de o enzimă. Receptorii solubili sunt capabili să neutralizeze citokinele, participă la transportul lor către focarul inflamației și la excreția lor din corp.

8. Citokine lucrează pe principiul unei rețele. Pot acționa concertat. Multe dintre funcțiile atribuite inițial unei singure citokine par a fi mediate de acțiunea concertată a mai multor citokine. (sinergie acțiuni). Exemple de interacțiuni sinergice ale citokinelor sunt stimularea răspunsurilor inflamatorii (IL-1, IL-6 și TNF-a), precum și sinteza IgE

(IL-4, IL-5 și IL-13).

Unele citokine induc sinteza altor citokine (cascadă). Acțiunea în cascadă a citokinelor este necesară pentru dezvoltarea răspunsurilor inflamatorii și imune. Capacitatea unor citokine de a spori sau de a slăbi producția altora determină importante mecanisme de reglare pozitive și negative.

Efectul antagonist al citokinelor este cunoscut, de exemplu, producția de IL-6 ca răspuns la o creștere a concentrației de TNFα poate fi

un mecanism de reglare negativ pentru controlul producției acestui mediator în timpul inflamației.

Reglarea citokinelor a funcțiilor celulelor țintă se realizează utilizând mecanisme autocrine, paracrine sau endocrine. Unele citokine (IL-1, IL-6, TNF-α etc.) pot participa la implementarea tuturor acestor mecanisme.

Răspunsul celulei la influența unei citokine depinde de mai mulți factori:

Din tipul de celule și activitatea funcțională inițială a acestora;

Din concentrația locală a citokinei;

Din prezența altor molecule mediator.

Astfel, celulele producătoare, citokinele și receptorii lor specifici de pe celulele țintă formează o singură rețea de mediatori. Setul de peptide reglatoare, nu citokine individuale, determină răspunsul celular final. În prezent, sistemul de citokine este considerat un sistem universal de reglare la nivelul întregului organism, care asigură dezvoltarea reacțiilor de protecție (de exemplu, în timpul infecției).

În ultimii ani, ideea unui sistem de citokine care combină:

1) celule producătoare;

2) citokine solubile și antagoniștii acestora;

3) celulele țintă și receptorii lor (Fig. 7.1).

Încălcările diferitelor componente ale sistemului citokinelor duc la dezvoltarea a numeroase procese patologice și, prin urmare, identificarea defectelor în acest sistem de reglementare este importantă pentru diagnosticul corect și numirea unei terapii adecvate.

Să luăm în considerare mai întâi principalele componente ale sistemului de citokine.

Celule producătoare de citokine

I. Grupul principal de celule producătoare de citokine în răspunsul imun adaptiv sunt limfocitele. Celulele în repaus nu secretă citokine. Odată cu recunoașterea antigenului și cu participarea interacțiunilor receptorilor (CD28-CD80 / 86 pentru limfocitele T și CD40-CD40L pentru limfocitele B), are loc activarea celulelor, ducând la transcrierea genelor citokinelor, traducerea și secreția peptidelor glicozilate în celulele intercelulare. spaţiu.

Orez. 7.1. Sistemul de citokine

Ajutorii CD4 T sunt reprezentați de subpopulații: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, care diferă în spectrul citokinelor secretate ca răspuns la diverși antigeni.

Th0 produc o gamă largă de citokine la concentrații foarte scăzute.

Direcția de diferențiere Th0 determină dezvoltarea a două forme ale răspunsului imun cu predominanță a mecanismelor umorale sau celulare.

Natura antigenului, concentrația acestuia, localizarea în celulă, tipul de celule care prezintă antigen și un anumit set de citokine reglează direcția diferențierii Th0.

După captarea și procesarea antigenului, celulele dendritice prezintă peptide antigenice celulelor Th0 și produc citokine care reglează direcția diferențierii lor în celule efectoare. Rolul citokinelor individuale în acest proces este prezentat în Fig. 7.2. IL-12 induce sinteza IFNγ de către limfocitele T și] HGC. IFNu oferă diferențierea Th1, care începe să secrete citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, limfotoxine), care reglează dezvoltarea reacțiilor la agenții patogeni intracelulari

(hipersensibilitate de tip întârziat (TRS) și diferite tipuri de citotoxicitate celulară).

IL-4 asigură diferențierea Th0 în Th2. Th2 activat produce citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 etc.), care determină proliferarea limfocitelor B, diferențierea lor în celule plasmatice și dezvoltarea răspunsurilor anticorpilor, în principal la agenți patogeni extracelulari.

IFNu reglează negativ funcția celulelor Th2 și, dimpotrivă, IL-4, IL-10 secretate de Th2 inhibă funcția Th1 (Fig. 7.3). Mecanismul molecular al acestei reglementări este asociat cu factori de transcripție. Expresia T-bet și STAT4, determinată de IFNy, direcționează diferențierea celulelor T de-a lungul căii Th1 și suprimă dezvoltarea Th2. IL-4 induce expresia GATA-3 și STAT6, care, respectiv, asigură conversia THO naiv în celule Th2 (Fig. 7.2).

În ultimii ani, a fost descrisă o subpopulație specială de celule T helper (Th17), producătoare de IL-17. Membrii familiei IL-17 pot fi exprimați prin celule de memorie activate (CD4CD45RO), celule y5T, celule NKT, neutrofile, monocite sub influența IL-23, IL-6, TGFβ produse de macrofage și celule dendritice. Principalul factor de diferențiere la om este ROR-C, la șoareci - ROR-γ l A fost arătat rolul cardinal al IL-17 în dezvoltarea inflamației cronice și a patologiei autoimune (vezi Fig. 7.2).

În plus, limfocitele T din timus se pot diferenția în celule reglatoare naturale (Treg) care exprimă markeri de suprafață CD4 + CD25 + și factorul de transcripție FOXP3. Aceste celule sunt capabile să suprime răspunsul imun mediat de celulele Th1 și Th2 prin contact intercelular direct și sinteza TGFβ și IL-10.

Schemele de diferențiere ale clonelor Th0 și citokinelor secretate de acestea sunt prezentate în Fig. 7.2 și 7.3 (vezi și inserția de culoare).

Celulele T-citotoxice (CD8 +), celulele ucigașe naturale sunt producători slabi de citokine precum interferoni, TNF-a și limfotoxine.

Activarea excesivă a uneia dintre subpopulațiile Th poate determina dezvoltarea uneia dintre variantele răspunsului imun. Dezechilibrul cronic al activării Th poate duce la formarea afecțiunilor imunopatologice asociate cu manifestarea

alergii, patologie autoimună, procese inflamatorii cronice etc.

Orez. 7.2. Diferite subpopulații de limfocite T producătoare de citokine

II. În sistemul imunitar înnăscut, principalii producători de citokine sunt celulele mieloide. Cu ajutorul receptorilor Toll-like (TLR), aceștia recunosc structuri moleculare similare ale diferiților agenți patogeni, așa-numitele modele moleculare asociate cu agenții patogeni (RAMP), de exemplu, lipopolizaharida (LPS) a bacteriilor gram-negative, acizii lipoteicoici, peptidoglicanii microorganismelor gram-pozitive, flagelină, ADN bogat în repetări G etc. Ca rezultat

Această interacțiune cu TLR declanșează o cascadă de transducție a semnalului intracelular care duce la exprimarea genelor a două grupuri principale de citokine: proinflamatoare și IFN tip 1 (Fig. 7.4, vezi și inserția de culoare). În principal, aceste citokine (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokine etc.) induc dezvoltarea inflamației și sunt implicate în protejarea organismului împotriva infecțiilor bacteriene și virale.

Orez. 7.3. Spectrul de citokine secretate de celulele TH1 și TH2

III. Celulele care nu aparțin sistemului imunitar (celule ale țesutului conjunctiv, epiteliului, endoteliului) secretă constitutiv factori de creștere autocrină (FGF, EGF, TGFR etc.). și citokine care susțin proliferarea celulelor hematopoietice.

Citokinele și antagoniștii acestora sunt descrise în detaliu într-o serie de monografii (Kovalchuk L.V. și colab., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Orez. 7.4. Inducția mediată de TLR a producției de citokine de către celulele imune înnăscute

Supraexprimarea citokinelor este nesigură pentru organism și poate duce la dezvoltarea unui răspuns inflamator excesiv, un răspuns de fază acută. Diverși inhibitori sunt implicați în reglarea producției de citokine proinflamatorii. Astfel, au fost descrise o serie de substanțe care leagă in mod specific citokina IL-1 și împiedică manifestarea acțiunii sale biologice (a2-macroglobulină, componenta C3 a complementului, uromodulina). Inhibitorii specifici ai IL-1 includ receptori solubili pentru momeală, anticorpi și un antagonist al receptorului IL-1 (IL-1RA). Odată cu dezvoltarea inflamației, există o creștere a expresiei genei IL-1RA. Dar chiar și în mod normal, acest antagonist este prezent în sânge în concentrații mari (până la 1 ng / ml sau mai mult), blocând acțiunea IL-1 endogen.

Celulele țintă

Acțiunea citokinelor asupra celulelor țintă este mediată prin receptori specifici care leagă citokinele cu afinitate foarte mare, iar citokinele individuale pot utiliza

subunități de receptor comune. Fiecare citokină se leagă de receptorul său specific.

Receptorii citokinelor sunt proteine transmembranare și sunt împărțiți în 5 tipuri principale. Cel mai frecvent este așa-numitul receptor de tip hematopoietină, care are două domenii extracelulare, dintre care unul conține o secvență comună de reziduuri de aminoacizi a două repetări de triptofan și serină, separate prin orice aminoacid (motiv WSXWS). Al doilea tip de receptor poate avea două domenii extracelulare cu un număr mare de cisteine conservate. Aceștia sunt receptori ai familiei IL-10 și IFN. Al treilea tip este reprezentat de receptori de citokine aparținând grupului TNF. Al patrulea tip de receptor de citokine aparține superfamiliei receptorilor de imunoglobulină, care au domenii extracelulare care sunt similare din punct de vedere structural cu domeniile moleculelor de imunoglobulină. Al cincilea tip de receptor care leagă moleculele din familia chemokinelor este reprezentat de proteinele transmembranare care traversează membrana celulară în 7 locuri. Receptorii citokinelor pot exista într-o formă solubilă, păstrând capacitatea de a lega liganzi (Ketlinsky S.A. și colab., 2008).

Citokinele pot influența proliferarea, diferențierea, activitatea funcțională și apoptoza celulelor țintă (vezi Fig. 7.1). Manifestarea activității biologice a citokinelor în celulele țintă depinde de participarea diferitelor sisteme intracelulare la transmiterea semnalului de la receptor, care este asociată cu caracteristicile celulelor țintă. Semnalul apoptozei este realizat, printre altele, cu ajutorul unei regiuni specifice din familia receptorilor TNF, așa-numitul domeniu „moarte” (Fig. 7.5, vezi inserția de culoare). Semnalele diferențiale și de activare sunt transmise prin proteinele Jak-STAT intracelulare - traductoare de semnal și activatori de transcripție (Fig. 7.6, vezi inserția de culoare). Proteinele G sunt implicate în semnalizarea de la chemokine, ceea ce duce la creșterea migrației și a aderenței celulare.

O analiză cuprinzătoare a sistemului de citokine include următoarele.

I. Evaluarea celulelor producătoare.

1. Determinarea expresiei:

Receptorii care recunosc un agent patogen sau antigen TCR, TLR) la nivelul genelor și moleculelor de proteine (PCR, citometrie în flux);

Molecule adaptoare care conduc un semnal care declanșează transcrierea genelor citokinei (PCR etc.);

Orez. 7.5. Transmiterea semnalului de la receptorul TNF

Orez. 7.6. Jak-STAT - cale de semnalizare de la receptorii citokinelor de tip 1

Genele citokinelor (PCR); molecule de proteine ale citokinelor (evaluarea funcției de sintetizare a citokinelor celulelor mononucleare umane).

2. Cuantificarea subpopulațiilor de celule care conțin anumite citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda de colorare intracelulară a citokinelor); determinarea numărului de celule care secretă anumite citokine (metoda ELISPOT, vezi Cap. 4).

II. Evaluarea citokinelor și a antagoniștilor acestora în mediul biologic al corpului.

1. Testarea activității biologice a citokinelor.

2. Cuantificarea citokinelor folosind ELISA.

3. Colorarea imunohistochimică a citokinelor din țesuturi.

4. Determinarea raportului dintre citokine opuse (pro- și antiinflamatoare), citokine și antagoniști ai receptorilor de citokine.

III. Evaluarea celulelor țintă.

1. Determinarea expresiei receptorilor citokinici la nivelul genelor și moleculelor proteice (PCR, metoda citometriei în flux).

2. Determinarea moleculelor de semnalizare în conținutul intracelular.

3. Determinarea activității funcționale a celulelor țintă.

În prezent, au fost dezvoltate numeroase metode de evaluare a sistemului de citokine, care oferă informații diverse. Printre acestea se disting:

1) metode biologice moleculare;

2) metode pentru determinarea cantitativă a citokinelor folosind imunoanaliza;

3) testarea activității biologice a citokinelor;

4) colorarea intracelulară a citokinelor;

5) Metoda ELISPOT, care permite detectarea citokinelor în jurul unei singure celule producătoare de citokine;

6) imunofluorescență.

Iată o scurtă descriere a acestor metode.

Prin utilizarea metode biologice moleculare este posibil să se studieze expresia genelor citokinelor, a receptorilor acestora, a moleculelor de semnalizare, pentru a studia polimorfismul acestor gene. În ultimii ani, au fost efectuate un număr mare de studii care au relevat asocieri între variantele de alele ale genelor moleculelor sistemului citokinelor și predispoziția

la o serie de boli. Studiul variantelor alelice ale genelor citokinelor poate furniza informații despre producția programată genetic a unei anumite citokine. Cea mai sensibilă este reacția în lanț a polimerazei în timp real - RT-PCR (vezi Capitolul 6). Metoda de hibridizare in situ permite clarificarea țesutului și localizarea celulară a expresiei genelor citokinei.

Determinarea cantitativă a citokinelor în fluidele biologice și în culturile de celule mononucleare din sânge periferic prin ELISA poate fi caracterizată după cum urmează. Deoarece citokinele sunt mediatori locali, este mai potrivit să se măsoare nivelurile acestora în țesuturile corespunzătoare după extragerea proteinelor tisulare sau în fluidele naturale, de exemplu, în lacrimi, spălare din cavități, urină, lichid amniotic, lichid cefalorahidian etc. Nivelurile de citokine din ser sau alte fluide corporale reflectă starea actuală a sistemului imunitar, adică sinteza citokinelor de către celulele corpului in vivo.

Determinarea nivelurilor de producție de citokine de către celulele mononucleare din sângele periferic (MNC) arată starea funcțională a celulelor. Producția spontană de citokine MNC în cultură indică faptul că celulele sunt deja activate in vivo. Sinteza citokinelor induse (de diferiți stimulenți, mitogeni) reflectă capacitatea potențială de rezervă a celulelor de a răspunde la un stimul antigenic (în special, la acțiunea medicamentelor). Producția redusă de citokine indusă poate servi drept unul dintre semnele unei stări de imunodeficiență. Citokinele nu sunt specifice pentru un anumit antigen. Prin urmare, diagnosticul specific al bolilor infecțioase, autoimune și alergice prin determinarea nivelului anumitor citokine este imposibil. În același timp, evaluarea nivelurilor de citokine permite obținerea de date cu privire la severitatea procesului inflamator, tranziția acestuia la nivel sistemic și prognostic, activitatea funcțională a celulelor sistemului imunitar, raportul dintre celulele Th1 și Th2, care este foarte important în diagnosticul diferențial al unui număr de procese infecțioase și imunopatologice.

În mediul biologic, citokinele pot fi cuantificate folosind o varietate de metode de imunotest, folosind anticorpi policlonali și monoclonali (vezi capitolul 4). ELISA vă permite să aflați care sunt concentrațiile exacte de citokine din bio-

fluide corporale logice. Testul imunosorbent enzimatic al citokinelor are o serie de avantaje față de alte metode (sensibilitate ridicată, specificitate, independență față de prezența antagoniștilor, posibilitatea unei contabilități automate precise, standardizare contabilă). Totuși, această metodă are și limitările sale: ELISA nu caracterizează activitatea biologică a citokinelor, poate da rezultate false datorită epitopilor care reacționează încrucișat.

Testarea biologică efectuate pe baza cunoașterii proprietăților de bază ale citokinelor, a acțiunii lor asupra celulelor țintă. Studiul efectelor biologice ale citokinelor a permis dezvoltarea a patru tipuri de testare a citokinelor:

1) prin inducerea proliferării celulelor țintă;

2) prin efect citotoxic;

3) prin inducerea diferențierii progenitorilor măduvei osoase;

4) pentru acțiunea antivirală.

IL-1 este determinat de efectul stimulator asupra proliferării timocitelor murine activate de mitogen in vitro; IL-2 - prin capacitatea de a stimula activitatea proliferativă a limfoblastelor; TNFα și limfotoxinele sunt testate pentru acțiunea citotoxică asupra fibroblastelor de șoarece (L929). Factorii de stimulare a coloniei sunt evaluați pentru capacitatea lor de a susține creșterea progenitorilor măduvei osoase sub formă de colonii în agar. Activitatea antivirală a IFN este detectată prin inhibarea acțiunii citopatice a virusurilor în cultura fibroblastelor diploide umane și a liniei tumorale a fibroblastelor șoarecilor L-929.

Au fost create linii celulare a căror creștere depinde de prezența anumitor citokine. Masa 7.1 este o listă a liniilor celulare utilizate pentru testarea citokinelor. În funcție de capacitatea de a induce proliferarea celulelor țintă sensibile, se efectuează biotestarea IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 etc. Cu toate acestea, aceste metode de testare nu sunt suficient de sensibile și informative. Moleculele inhibitoare și antagoniste pot masca activitatea biologică a citokinelor. Mai multe citokine prezintă activitate biologică generală. Cu toate acestea, aceste metode sunt ideale pentru testarea activității specifice a citokinelor recombinate.

Tabelul 7.1. Linii celulare utilizate pentru testarea activității biologice a citokinelor

Sfârșitul mesei. 7.1

Laboratorul 7-1

Determinarea activității biologice a IL-1 prin efectul comitogen asupra proliferării timocitelor de șoarece

Metoda de testare biologică a IL-1 se bazează pe capacitatea unei citokine de a stimula proliferarea timocitelor murine.

IL-1 poate fi determinat în cultura monocitelor stimulate cu LPS, precum și în orice fluid biologic al corpului. Este necesar să fiți atenți la o serie de detalii.

1. Timocitele șoarecilor C3H / HeJ stimulate la proliferare de către mitogeni (concanavalină A - ConA și fitohemaglutinină - PHA) sunt utilizate pentru testare. Timocitele C3H / HeJ nu au fost alese întâmplător: șoarecii din această linie consangvinizată nu răspund la LPS, care poate fi prezent în materialul de testare și poate produce producerea de IL-1.

2. Timocitele răspund la IL-2 și mitogeni, prin urmare, prezența IL-2 și a mitogenilor ar trebui determinată și în preparatele testate pentru IL-1.

Procedura de operare

1. Obțineți o suspensie de timocite la o concentrație de 12 × 106 / ml de mediu RPMI 1640 conținând 10% ser de embrioni de vaci și 2-mercaptoetanol (5 × 10 -5 M).

2. Pregătiți o serie de diluții succesive duble de probe experimentale (fluide biologice corporale) și probe de control. Fluide biologice care conțin IL-1 sau probe obținute prin incubarea celulelor mononucleare fără LPS și preparat standard de laborator care conține IL-1 sunt utilizate ca martori. În plăci cu fund rotund cu 96 de godeuri, 50 μl sunt transferați din fiecare diluare în 6 godeuri.

3. În trei godeuri din fiecare diluare se adaugă 50 μl de PHA purificat (Wellcome) dizolvat în mediu complet la o concentrație de 3 μg / ml, iar în celelalte 3 godeuri - 50 μl de mediu.

4. Adăugați 50 μl de suspensie de timocit în fiecare godeu și incubați timp de 48 de ore la 37 ° C.

6. Înainte de sfârșitul cultivării, 50 g de soluție (1 μCi / ml) de ["3 H] -timidină se adaugă în godeuri și se incubează încă 20 de ore.

7. Pentru a determina nivelul de radioactivitate, celulele de cultură sunt transferate pe hârtie de filtru folosind un secerător automat de celule, filtrele sunt uscate și includerea etichetei este determinată de un contor de scintilație lichidă.

8. Rezultatele sunt exprimate ca factor de stimulare.

unde m cp este numărul mediu de impulsuri în 3 găuri.

Dacă timocitele răspund la stimulare cu IL-1 standard, atunci indicele de stimulare al probei de testare care depășește 3 indică în mod fiabil activitatea IL-1.

Bioanaliza este singura metodă de evaluare a funcției citokinelor, dar această metodă trebuie completată de diferite tipuri de control adecvat pentru specificitate folosind anticorpi monoclonali. Adăugarea anumitor anticorpi monoclonali la citokină în cultură blochează activitatea biologică a citokinei, ceea ce dovedește că citokina detectată servește ca semnal pentru proliferarea liniei celulare.

Utilizarea bioanalizei pentru detectarea interferonului. Principiul evaluării activității biologice a IFN se bazează pe efectul său antiviral, care este determinat de gradul de inhibare a înmulțirii virusului testat în cultura celulară.

Celulele sensibile la acțiunea IFN pot fi utilizate în această lucrare: în primul rând celule fibroblaste tripsinizate ale embrionilor de pui și umani, celule transplantate de fibroblaste diploide umane și cultură de celule de șoarece (L929).

Atunci când se evaluează efectul antiviral al IFN, este recomandabil să se utilizeze viruși cu un ciclu scurt de reproducere, sensibilitate ridicată la acțiunea IFN: virusul encefalomielitei de șoarece, stomatita veziculară a șoarecelui etc.

Laboratorul 7-2

Determinarea activității interferonului

1. O suspensie de fibroblaste diploide ale unui făt uman pe un mediu cu 10% ser de embrioni bovini (concentrație celulară - 15-20 × 10 6 / ml) este turnată în plăci sterile cu 96 de godeuri cu fund plat, 100 μl per godeu și plasat într-un incubator cu CO2 la o temperatură de 37 ° C.

2. După formarea unui monostrat complet, mediul de creștere este îndepărtat din godeuri și se adaugă 100 pl din mediul de sprijin în fiecare godeu.

3. Titrarea activității IFN în probele testate se efectuează prin metoda diluțiilor de două ori pe un monostrat de fibroblaste.

Concomitent cu probele, virusul encefalomielitei de șoarece (VEM) este introdus în godeuri la o doză care provoacă leziuni celulare de 100% la 48 de ore după infecție.

4. Pentru control folosiți puțuri cu celule intacte (netratate) infectate cu virusul.

În fiecare studiu, probele de referință IFN cu activitate cunoscută sunt utilizate ca medicamente de referință.

5. Plăcile cu probe diluate sunt incubate timp de 24 de ore la 37 ° C într-o atmosferă cu 5% CO 2.

6. Nivelul activității IFN este determinat de reciprocitatea diluției maxime a probei testate, care inhibă efectul citopatic al virusului cu 50% și se exprimă în unități de activitate pe ml.

7. Pentru a determina tipul de IFN, se adaugă la sistem antiser împotriva IFNα, IFNβ sau IFNγ. Antiserul anulează acțiunea citokinei corespunzătoare, ceea ce face posibilă identificarea tipului de IFN.

Determinarea activității biologice a migrației factorului inhibitor.În prezent, s-au format idei complet noi despre natura și proprietățile MITULUI, care a fost descoperit în anii 60 ai secolului trecut ca mediator al imunității celulare și a rămas mulți ani fără atenția cuvenită (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; David JR, 1966). Abia în ultimii 10-15 ani a devenit clar: MITUL este unul dintre cei mai importanți mediatori biologici din organism, cu o gamă largă de funcții biologice ale citokinei, hormonului și enzimei. Acțiunea MIF asupra celulelor țintă este realizată prin receptorul CD74 sau prin calea non-clasică a endocitozei.

MITUL este considerat un important mediator al inflamației, activând funcția macrofagelor (producerea de citokine, fagocitoză, citotoxicitate etc.), precum și un hormon imunoregulator endogen care modulează activitatea glucocorticoidă.

Se acumulează tot mai multe informații despre rolul MIF în patogeneza multor boli inflamatorii, inclusiv sepsis, artrită reumatoidă (RA), glomerulonefrită etc. În RA, concentrația MIF în fluidul articulațiilor afectate este semnificativ crescută, care se corelează cu severitatea bolii. Sub influența MITULUI, crește producția de citokine pro-inflamatorii de către macrofage și celule sinoviale.

Sunt cunoscute diverse metode pentru testarea activității MIF, atunci când celulele migratoare (celule țintă pentru MIF) sunt plasate într-un capilar de sticlă (test capilar), într-o picătură de agaroză sau într-un puț de agaroză.

Prezentăm o metodă de screening relativ simplă bazată pe formarea microculturilor celulare (leucocite sau macrofage) standard în suprafață și numărul de celule de la baza puțurilor unei plăci cu fund plat de 96 de godeuri, urmată de cultivarea lor într-un mediu nutritiv și determinarea schimbării zonei acestor microculturi sub acțiunea MIF (Suslov A.P., 1989).

Laboratorul 7-3

Definiția activității MYTH

Determinarea activității biologice a MIF se realizează folosind un dispozitiv pentru formarea microculturilor celulare (Fig. 7.7) - MIGROSKRIN (Institutul de Cercetare pentru Epidemiologie și Microbiologie numit după NF Gamaleya RAMS).

1. În godeurile unei plăci cu 96 de godeuri (Flow, UK sau similar) se adaugă 100 μl dintr-o probă diluată în mediu de cultură, în care se determină activitatea MIT (fiecare diluție în 4 paralele, probe experimentale). Mediul de cultură conține RPMI 1640, 2 mM L-glutamină, 5% ser fetal bovin, 40 μg / ml gentamicină.

2. În godeurile de control se adaugă mediu de cultură (în 4 paralele), 100 μl.

3. Pregătiți o suspensie celulară de macrofage peritoneale, pentru care 2 șoareci hibrizi (CBAxC57B1 / 6) F1 sunt injectați intraperitoneal cu 10 ml soluție Hanks cu heparină (10 U / ml), masați ușor abdomenul timp de 2-3 minute. Apoi, animalul este sacrificat prin decapitare, peretele abdominal este străpuns cu atenție în zona inghinală și exsudatul este aspirat printr-un ac cu o seringă. Celulele exsudatului peritoneal sunt spălate de două ori cu soluție Hanks, centrifugate timp de 10-15 minute la 200 g. Apoi se prepară o suspensie celulară cu o concentrație de 10 ± 1 milion / ml de mediu RPMI 1640. Numărarea se efectuează într-o cameră Goryaev.

4. Asamblați sistemul MIGROSKRIN, care este un suport pentru fixarea direcționată și standard a vârfurilor cu culturi celulare într-o poziție strict verticală la o înălțime dată deasupra centrului unui puț al unei plăci de cultură cu 96 de godeuri și include, de asemenea, 92 de vârfuri pentru o pipetă automată de la Costar, SUA (Fig. 7.7).

Introduceți picioarele trepiedului în sondele de colț ale plăcii. Suspensia de celulă este preluată cu o pipetă automată în vârfuri - câte 5 μl fiecare, clătită din celulele în exces printr-o singură scufundare în mediu și introdusă vertical în prizele rack-ului sistemului. Raftul umplut cu vârfuri se menține la temperatura camerei timp de 1 oră pe o suprafață strict orizontală. În acest timp, celulele suspensiei se așează la fundul puțurilor, unde se formează microculturi celulare standard.

5. Raftul pentru vârfuri este îndepărtat cu grijă de pe placă. O placă cu o microcultură de celule este plasată într-o poziție strict orizontală într-un incubator de CO 2, unde este cultivată timp de 20 de ore. În timpul cultivării, celulele migrează de-a lungul fundului puțului.

6. Contabilitatea cantitativă a rezultatelor după incubare se efectuează pe o lupă binoculară, evaluând vizual dimensiunea coloniei pe scara din interiorul ocularului. Microculturile sunt circulare. Cercetătorii determină apoi diametrul mediu al coloniilor din măsurătorile coloniilor din 4 godeuri de testare sau de control. Eroarea de măsurare este de ± 1 mm.

Indicele de migrație (MI) este calculat prin formula:

Eșantionul are activitate MIT dacă valorile MI sunt egale

Pentru o unitate convențională (U) de activitate MIT, se ia reciprocitatea, egală cu valoarea celei mai mari diluții a eșantionului (eșantionului), la care indicele de migrare este de 0,6 ± 0,2.

Activitatea biologică a FEOα este evaluat prin efectul său citotoxic asupra liniei fibroblastelor transformate L-929. TNFa recombinant a fost utilizat ca un control pozitiv, iar celulele dintr-un mediu de cultură au fost utilizate ca un control negativ.

Calculați indicele citotoxic (CI):

Unde A- numărul de celule vii din control; b- numărul de celule vii din experiment.

Orez. 7.7. Schema MIGROSKRIN - Dispozitive pentru cuantificarea migrării culturilor celulare

Celulele sunt colorate cu un colorant (albastru de metilen), care este încorporat numai în celulele moarte.

Valoarea diluării reciproce a eșantionului necesară pentru a obține 50% citotoxicitate celulară este luată ca o unitate convențională a activității TNF. Activitatea specifică a unei probe este raportul de activitate în unități arbitrare pe ml la concentrația de proteine conținută în probă.

Colorarea citokinelor intracelulare. O modificare a raportului dintre celulele care produc diferite citokine poate reflecta patogeneza bolii și poate servi drept criteriu pentru prognosticul bolii și pentru evaluarea terapiei.

Prin metoda colorării intracelulare, se determină expresia unei citokine la nivelul unei celule. Citometria de flux vă permite să numărați numărul de celule care exprimă o anumită citokină.

Să enumerăm pașii principali în determinarea citokinelor intracelulare.

Celulele nestimulate produc cantități mici de citokine, care, de regulă, nu sunt depuse; prin urmare, un pas important în evaluarea citokinelor intracelulare este stimularea limfocitelor și blocarea eliberării acestor produse din celule.

Cel mai frecvent utilizat inductor al citokinelor este activatorul proteinei kinazei C forbol-12-miristatul-13-acetat (PMA) în combinație cu ionomicina ionoforului de calciu (IN). Utilizarea unei astfel de combinații determină sinteza unei game largi de citokine: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Dezavantajul utilizării PMA-IN este problema detectării moleculelor CD4 pe suprafața limfocitelor după o astfel de activare. De asemenea, producția de citokine de către limfocitele T este indusă de mitogeni (PHA). Celulele B și monocitele stimulează

Celulele mononucleare sunt incubate în prezența inductorilor producției de citokine și a unui blocant al transportului lor intracelular, brefeldin A sau monensin timp de 2-6 ore.

Celulele sunt apoi resuspendate în soluție salină tamponată. Pentru fixare, se adaugă 2% formaldehidă, incubată timp de 10-15 minute la temperatura camerei.

Apoi celulele sunt tratate cu saponină, ceea ce crește permeabilitatea membranei celulare și colorate cu anticorpi monoclonali specifici citokinelor detectate. Colorarea prealabilă a markerilor de suprafață (CD4, CD8) mărește cantitatea de informații obținute despre celulă și vă permite să determinați mai exact identitatea populației sale.

Există unele limitări în aplicarea metodelor descrise mai sus. Deci, cu ajutorul lor, este imposibil să se analizeze sinteza citokinelor de către o singură celulă, este imposibil să se determine numărul de celule producătoare de citokine într-o subpopulație, este imposibil să se determine dacă celulele producătoare de citokine exprimă markeri unici, dacă citokine diferite sunt sintetizate de celule diferite sau de aceleași. Răspunsul la aceste întrebări este obținut folosind alte metode de cercetare. Pentru a determina frecvența celulelor producătoare de citokine într-o populație, se utilizează metoda de limitare a diluțiilor și o variantă a testului imunosorbent legat de enzimă ELISPOT (vezi capitolul 4).

Metoda de hibridizare in situ. Metoda include:

2) fixarea cu paraformaldehidă;

3) detectarea ARNm utilizând ADNc marcat. În unele cazuri, mARN-ul citokinei este determinat pe secțiuni utilizând radioizotop PCR.

Imunofluorescența. Metoda include:

1) înghețarea organului și pregătirea secțiunilor de criostat;

2) fixare;

3) prelucrarea secțiunilor cu anticorpi anti-citokine marcate cu fluoresceină;

4) observarea vizuală a fluorescenței.

Aceste tehnici (hibridizare in situși imunofluorescența) sunt rapide și nu depind de concentrațiile de prag ale produsului secretat. Cu toate acestea, ele nu cuantifică cantitatea de citokină secretată și pot fi complexe din punct de vedere tehnic. Este necesară o varietate de monitorizare atentă a reacțiilor nespecifice.

Folosind metodele prezentate pentru evaluarea citokinelor, au fost identificate procesele patologice asociate cu tulburări ale sistemului citokinelor la diferite niveluri.

Astfel, evaluarea sistemului citokinelor este extrem de importantă pentru caracterizarea stării sistemului imunitar al organismului. Studiul diferitelor niveluri ale sistemului citokinelor oferă informații despre activitatea funcțională a diferitelor tipuri de celule imunocompetente, despre gravitatea procesului inflamator, despre tranziția sa la nivel sistemic și despre prognosticul bolii.

Întrebări și sarcini

1. Enumerați proprietățile generale ale citokinelor.

2. Dați clasificarea citokinelor.

3. Enumerați principalele componente ale sistemului de citokine.

4. Enumerați celulele producătoare de citokine.

5. Descrieți familiile receptorilor de citokine.

6. Care sunt mecanismele funcționării rețelei de citokine?

7. Spuneți-ne despre producția de citokine în sistemul imunitar înnăscut.

8. Care sunt principalele abordări pentru o evaluare cuprinzătoare a sistemului de citokine?

9. Care sunt metodele de testare a citokinelor din fluidele corporale?

10. Care sunt defectele sistemului citokinelor în diferite patologii?

11. Care sunt principalele metode de testare biologică a IL-1, IFN, MIF, TNFa în fluidele biologice?

12. Descrieți procesul de determinare a conținutului intracelular al citokinelor.

13. Descrieți procesul de determinare a citokinelor secretate de o singură celulă.

14. Descrieți secvența metodelor utilizate pentru a detecta un defect la nivelul receptorului citokinei.

15. Descrieți secvența metodelor utilizate pentru a detecta un defect la nivelul celulelor producătoare de citokine.

16. Ce informații se pot obține examinând producția de citokine în cultura celulelor mononucleare, în serul sanguin?

Citokinele proinflamatorii sunt sintetizate, secretate și acționează prin receptorii lor asupra celulelor țintă într-un stadiu incipient de inflamație, participând la declanșarea unui răspuns imun specific, precum și în faza sa efectivă. Mai jos oferim o scurtă descriere a principalelor citokine proinflamatorii.

IL-1 - un compus secretat în timpul stimulării antigenice de către monocite, macrofage, celule Langerhans, celule dendritice, keratinocite, astrocite cerebrale și microglie, endoteliale, epiteliale, celule mezoteliale, fibroblaste, limfocite NK, neutrofile, limfocite B, aproximativ celule C et al. 10% din bazofile și mastocite produc și IL-1. Aceste fapte indică faptul că IL-1 poate fi secretat direct în sânge, lichid tisular și limfă. Toate celulele în care se formează această citokină sunt incapabile de sinteza spontană a IL-1 și răspund cu producția și secreția sa ca răspuns la acțiunea agenților infecțioși și inflamatori, a toxinelor microbiene, a diferitelor citokine, a fragmentelor de complement activ, a unor factori activi de coagulare a sângelui. , si altii. În expresia figurativă a lui A. Bellau, IL-1 este o familie de molecule pentru toate ocaziile. IL-1 este împărțit în 2 fracții - a și b, care sunt produse de gene diferite, dar au proprietăți biologice similare. Ambele forme sunt formate din moleculele precursoare corespunzătoare cu aceeași greutate moleculară - 31 kDa. Ca rezultat al transformărilor biochimice, se formează în cele din urmă polipeptide biologic active cu un singur lanț cu o greutate moleculară de 17,5 kDa. Aproape toată IL-1a rămâne în interiorul celulei sau se leagă de membrană. Spre deosebire de IL-1a, IL-1b este secretată activ de celule și este principala formă secretorie de IL-1 la om. În același timp, ambele interleukine au același spectru de activitate biologică și concurează pentru legarea la același receptor. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere faptul că IL-1a este în principal un mediator al reacțiilor locale de apărare, în timp ce IL-1b acționează atât la nivel local, cât și la nivel sistemic. Experimentele cu IL-1 recombinant au arătat că această citokină are cel puțin 50 de funcții diferite, iar țintele sunt celule ale aproape tuturor organelor și țesuturilor. Influența IL-1 este îndreptată în principal către Th1, deși este capabilă să stimuleze limfocitele Th2 și B. În măduva osoasă, sub influența sa, crește numărul de celule hematopoietice aflate în stadiul mitozei. IL-1 poate acționa asupra neutrofilelor, sporind activitatea lor locomotorie și favorizând astfel fagocitoza. Această citokină este implicată în reglarea funcțiilor endoteliului și a sistemului de coagulare a sângelui, inducând activitate procoagulantă, sinteza citokinelor proinflamatorii și expresia pe suprafața endoteliului a moleculelor adezive care asigură laminarea și atașarea neutrofilelor și limfocitelor, în urma căreia leucopenia și neutropenia se dezvoltă în patul vascular. Acționând asupra celulelor hepatice, stimulează formarea proteinelor de fază acută. S-a constatat că IL-1 este principalul mediator al dezvoltării inflamației locale și a răspunsului la faza acută la nivelul corpului. În plus, accelerează creșterea vaselor de sânge după deteriorare. Sub influența IL-1 în sânge, concentrația de fier și zinc scade și excreția de sodiu crește. În cele din urmă, sa constatat recent că IL-1 este capabil să crească cantitatea de oxid nitric în circulație. Acesta din urmă este cunoscut că joacă un rol extrem de important în reglarea tensiunii arteriale, promovează dezagregarea trombocitelor și îmbunătățește fibrinoliza. Trebuie remarcat faptul că, sub influența IL-1, se îmbunătățește formarea rozetelor de neutrofile și limfocite cu trombocite, care joacă un rol important în punerea în aplicare a rezistenței nespecifice, a imunității și a hemostazei (Yu.A. Vitkovsky). Toate acestea sugerează că IL-1 stimulează dezvoltarea unui întreg complex de reacții de protecție ale corpului care vizează limitarea răspândirii infecției, eliminarea microorganismelor invadatoare și restabilirea integrității țesuturilor deteriorate. IL-1 afectează condrocitele, osteoclastele, fibroblastele și celulele b pancreatice. Sub influența sa, crește secreția de insulină, ACTH și cortizol. Adăugarea de IL-1b sau TNFa la cultura primară a celulelor hipofizare scade secreția hormonului stimulator al tiroidei.

IL-1 este produs în sistemul nervos central, unde poate acționa ca un emițător. Sub influența IL-1, apare somnul, însoțit de prezența unui ritm (somn cu undă lentă). De asemenea, promovează sinteza și secreția factorului de creștere a nervilor de către astrocite. S-a demonstrat că conținutul de IL-1 crește odată cu munca musculară. Sub influența IL-1, producția de IL-1 în sine, precum și de IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 și TNFa, este îmbunătățită. Acesta din urmă, în plus, induce sinteza IL-1, IL-6 și IL-8.

Multe efecte pro-inflamatorii ale IL-1 sunt efectuate în combinație cu TNFa și IL-6: inducerea febrei, anorexie, influență asupra hematopoiezei, participarea la protecția antiinfecțioasă nespecifică, secreția proteinelor de fază acută și altele (AS Simbirtsev) .

IL-6- un monomer cu o greutate moleculară de 19-34 kDa. Este produs de monocite stimulate, macrofage, endoteliocite, Th2, fibroblaste, hepatocite, celule Sertoli, celule ale sistemului nervos, tirocite, celule ale insulelor Langerhans etc. Împreună cu IL-4 și IL-10, oferă creșterea și diferențierea limfocitelor B, facilitând tranziția acestora din urmă în anticorpi. În plus, acesta, ca și IL-1, stimulează hepatocitele, ducând la formarea proteinelor de fază acută. IL-6 acționează asupra celulelor progenitoare hematopoietice și, în special, stimulează megacariocitopoieza. Acest compus are activitate antivirală. Există citokine aparținând familiei IL-6 - oncostatin M (OnM), un factor care inhibă leucemia, factorul neurotrop ciliar, cardiotropina-1. Influența lor nu afectează sistemul imunitar. Familia IL-6 are efect asupra celulelor stem embrionare, provoacă hipertrofie miocardică, sinteză CWA, menținerea proliferării celulelor mielomului și a progenitorilor hematopoietici, diferențierea macrofagelor, osteoclastelor, celulelor nervoase, trombocitopoieza crescută etc.

Trebuie remarcat faptul că șoarecii cu inactivare (knockout) țintită a genei care codifică o componentă comună a receptorului pentru familia citokinelor IL-6 dezvoltă numeroase anomalii în diferite sisteme ale corpului care sunt incompatibile cu viața. Împreună cu perturbarea cardiogenezei la embrionii unor astfel de șoareci, există o scădere bruscă a numărului de celule progenitoare din diferite rânduri hematopoietice, precum și o scădere bruscă a dimensiunii timusului. Aceste fapte indică importanța extremă a IL-6 în reglarea funcțiilor fiziologice (A.A. Yarilin).

Există o relație foarte complexă de reglare reciprocă între citokinele proinflamatorii, care acționează ca sinergici. Astfel, IL-6 inhibă producția de IL-1 și TNFa, deși ambele citokine sunt inductori ai sintezei IL-6. În plus, IL-6, acționând asupra sistemului hipotalamo-hipofizar, duce la o creștere a producției de cortizol, care inhibă expresia genei IL-6, precum și a genelor altor citokine pro-inflamatorii.

Familia IL-6 include, de asemenea oncostatin M (OnM), posedând un spectru extrem de larg de acțiune. Greutatea sa moleculară este de 28 kDa. S-a constatat că OnM este capabil să inhibe creșterea unui număr de tumori. Stimulează formarea IL-6, un activator de plasminogen, peptide intestinale vasoactive și CWA. Din cele de mai sus rezultă că OnM ar trebui să joace un rol important în reglarea răspunsului imun, a coagulării sângelui și a fibrinolizei.

IL-8 aparține așa-numitei familii de chemokine care stimulează chemotaxia și chemokineza și numără până la 60 de substanțe individuale cu proprietăți structurale și biologice proprii. IL-8 matur există sub mai multe forme, diferind prin lungimea lanțului polipeptidic. Formarea unei forme sau a altei depinde de proteaze specifice care acționează asupra capătului N-terminal al moleculei precursoare neglicozilate. În funcție de celulele care sintetizează IL-8, acesta conține un număr diferit de aminoacizi. Cea mai mare activitate biologică o are forma IL-8, constând din 72 de aminoacizi (A.S. Simbirtsev).

IL-8 este eliberat de leucocite polimorfonucleare, monocite, macrofage, megacariocite, neutrofile, limfocite T (Tx), fibroblaste, condrocite, keratinocite, celule endoteliale și epiteliale, hepatocite și microglia.

Producția de IL-8 se realizează ca răspuns la acțiunea compușilor biologic activi, inclusiv citokinele pro-inflamatorii, precum și a IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, diverși mitogeni, lipopolizaharide, lectine , și produse de dezintegrare virală, în timp ce citokinele antiinflamatorii (IL-4, IL-10) reduc producția de IL-8. Activarea și eliberarea sa are loc și sub influența trombinei, un activator al plasminogenului, streptokinazei și tripsinei, ceea ce indică o relație strânsă între funcția acestei citokine și sistemul hemostatic.

Sinteza IL-8 se efectuează pe acțiunea unei varietăți de stimuli endogeni sau exogeni care apar în centrul inflamației în timpul dezvoltării unei reacții de apărare locală la introducerea unui agent patogen. În acest sens, producția de IL-8 are multe asemănări cu alte citokine pro-inflamatorii. În același timp, sinteza IL-8 este suprimată de hormoni steroizi, IL-4, IL-10, Ifa și Ifg.

IL-8 stimulează chemotaxia și chimiochineza neutrofilelor, bazofilelor, limfocitelor T (într-o măsură mai mică) și a cheratinocitelor, provocând degranularea acestor celule. Cu injecția intravasculară de IL-8, există o granulocitopenie rapidă și ascuțită, urmată de o creștere a nivelului de neutrofile din sângele periferic. În acest caz, neutrofilele migrează către ficat, splină, plămâni, dar nu către țesuturile deteriorate. Mai mult, experimentul a arătat că administrarea intravenoasă de IL-8 blochează migrația neutrofilelor în zonele intradermice de inflamație.

În neutrofilele nestimulate, IL-8 determină eliberarea unei proteine asociate cu vitamina B 12 din granule specifice și gelatinază din veziculele secretoare. Degranularea granulelor azrofile în neutrofile are loc numai după stimularea lor cu citocalasin-B. În același timp, se eliberează elastază, mieloperoxidază, b-glucoronidază și alte elastaze și apare expresia moleculelor adezive pe membrana leucocitelor, asigurând interacțiunea neutrofilului cu endoteliul. Trebuie remarcat faptul că IL-8 nu este capabil să declanșeze o explozie respiratorie, dar poate spori efectul altor chimiochine asupra acestui proces.

IL-8 este capabil să stimuleze angiogeneza prin activarea proceselor proliferative în endoteliocite și celulele musculare netede, care joacă un rol important în repararea țesuturilor. În plus, poate inhiba sinteza IgE indusă de IL-4.

Aparent, IL-8 joacă un rol important în imunitatea locală a membranelor mucoase. La persoanele sănătoase, se găsește în secrețiile glandelor sudoripare, lacrimale, sudoripare, în colostru. S-a constatat că celulele musculare netede din traheea umană sunt capabile să producă cantități neglijabile de IL-8. Sub influența bradikininei, producția de IL-8 crește de 50 de ori. Blocanții sintezei proteinelor inhibă sinteza IL-8. Există toate motivele pentru a crede că IL-8 local oferă cursul reacțiilor de protecție atunci când este expus florei patogene în tractul respirator superior.

IL-12 descoperit în urmă cu mai bine de zece ani, dar proprietățile sale au fost studiate abia în ultimii ani. Este produs de macrofage, monocite, neutrofile, celule dendritice și limfocite B activate. Într-o măsură mult mai mică, IL-12 este capabilă să secrete keratinocite, celule Langerhans și limfocite B în repaus. În plus, este produs de celule microgliale și astrocite, ceea ce necesită cooperarea lor. IL-12 este un heterodimer format din două lanțuri polipeptidice legate covalent: greu (45 kDa) și ușor (35 kDa). Activitatea biologică este inerentă numai dimerului; fiecare dintre lanțurile individuale nu posedă proprietăți similare.

Cu toate acestea, NK, limfocitele T (CD4 + și CD8 +) și, într-o măsură mai mică, limfocitele B rămân principalele celule țintă pentru IL-12. Se poate considera că servește ca o legătură între macrofage și monocite, contribuind la o creștere a activității celulelor Th1 și citotoxice. Astfel, această citokină aduce o contribuție semnificativă la asigurarea protecției antivirale și antitumorale. Inductorii sintezei IL-12 sunt componente microbiene și citokine pro-inflamatorii.

IL-12 aparține citokinelor care leagă heparina, ceea ce sugerează participarea sa la procesul de hemostază.

În ultimii ani, s-a demonstrat că IL-12 este o citokină cheie pentru îmbunătățirea răspunsului imun mediate de celule și protecție antiinfecțioasă eficientă împotriva virușilor, bacteriilor, ciupercilor și protozoarelor. Efectele protectoare ale IL-12 în infecții sunt mediate de mecanisme dependente de Ifg, producție sporită de oxid nitric și infiltrare de celule T. Cu toate acestea, efectul său principal este de a sintetiza Ifg. Acesta din urmă, în timp ce se acumulează în organism, promovează sinteza IL-12 de către macrofage. Cea mai importantă funcție a IL-12 este direcția diferențierii Tx0 către Tx1. În acest proces, IL-12 este un sinergist pentru Ifg. Între timp, după diferențiere, Th1 încetează să mai aibă nevoie de IL-12 ca moleculă co-stimulatoare. Natura răspunsului imun depinde în mare măsură de IL-12: dacă se va dezvolta în funcție de imunitatea celulară sau umorală.

Una dintre cele mai importante funcții ale IL-12 este o creștere bruscă a diferențierii limfocitelor B în celule producătoare de anticorpi. Această citokină este utilizată pentru a trata pacienții cu alergii și astm bronșic.

IL-12 are un efect inhibitor asupra producției de IL-4 de către limfocitele T de memorie, mediate prin APC. La rândul său, IL-4 suprimă producția și secreția de IL-12.

Sinergii IL-12 sunt IL-2 și IL-7, deși ambele citokine acționează adesea asupra celulelor țintă diferite. Antagonistul fiziologic și inhibitorul IL-12 este IL-10, o citokină antiinflamatoare tipică care inhibă funcția Th1.

IL-16- este secretat de limfocitele T, stimulate în principal de CD4 +, CD8 +, eozinofile și celulele epiteliale bronșice. Creșterea secreției de IL-16 a fost găsită atunci când celulele T au fost tratate cu histamină. Prin natura chimică, este un homotetramer cu o greutate moleculară de 56000-80000 D. Este o citokină imunomodulatoare și pro-inflamatorie, deoarece este un factor chemotactic pentru monocite și eozinofile, precum și pentru limfocitele T (CD4 +), sporindu-le aderența.

Trebuie remarcat faptul că pretratarea CD4 + cu IL-16 recombinant suprima activitatea promotorului HIV-1 cu aproximativ 60%. Pe baza faptelor de mai sus, a fost prezentată o ipoteză, conform căreia efectul IL-16 asupra replicării HIV-1 este observat la nivelul expresiei virale.

IL-17 format din macrofage. În prezent, IL-17 recombinant a fost obținut și proprietățile sale au fost studiate. S-a dovedit că sub influența IL-17, macrofagele umane sintetizează și secretă intens citokine pro-inflamatorii - IL-1b și TNFa, care este direct proporțională cu doza de citokină studiată. Efectul maxim se observă la aproximativ 9 ore după începerea incubării macrofagelor cu IL-17 recombinant. În plus, IL-17 stimulează sinteza și secreția IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, antagonist RIL-1 și stromalizină. Citokinele antiinflamatorii - IL-4 și IL-10 - abolesc complet eliberarea indusă de IL-17 de IL-1b, în timp ce GTFb 2 și IL-13 blochează doar parțial acest efect. IL-10 suprimă eliberarea indusă de TNFa, în timp ce IL-4, IL-13 și GTFb 2 suprimă secreția acestei citokine într-o măsură mai mică. Faptele prezentate sugerează cu tărie că IL-17 ar trebui să joace un rol important în inițierea și menținerea procesului inflamator.

IL-18în ceea ce privește efectele biologice, este un dublant funcțional și un sinergist al IL-12. Principalii producători de IL-18 sunt macrofage și monocite. Structura sa este extrem de similară cu IL-1. IL-18 este sintetizat sub forma unei molecule precursoare inactive, care necesită participarea unei enzime de conversie a IL-1b pentru ao transforma într-o formă activă.

Sub influența IL-18, crește rezistența antimicrobiană a corpului. În infecția bacteriană, IL-18, împreună cu IL-12 sau Ifa / b, reglează producția de Ifg de către celulele Tx și NK și îmbunătățește expresia ligandului Fas pe limfocitele NK și T. Recent, s-a constatat că IL-18 este un activator CTL. Sub influența sa, crește activitatea celulelor CD8 + în raport cu celulele tumorilor maligne.

La fel ca IL-12, IL-18 promovează diferențierea preferențială a Th0 în Th1. În plus, IL-18 conduce la formarea GM-CSF și, prin urmare, îmbunătățește leucopoieza și inhibă formarea de osteoclaste.

IL-23 constă din 2 subunități (p19 și p40), care fac parte din IL-12. Separat, fiecare dintre subunitățile enumerate nu are activitate biologică, cu toate acestea, împreună, la fel ca IL-12, sporesc activitatea proliferativă a limfoblastelor T și a secreției Ifg. IL-23 este mai puțin puternic decât IL-12.

TNF este o polipeptidă cu o greutate moleculară de aproximativ 17 kDa (este formată din 157 aminoacizi) și este împărțită în 2 fracții - a și b. Ambele fracții au aproximativ aceleași proprietăți biologice și acționează asupra acelorași receptori celulari. TNFa este secretat de monocite și macrofage, Th1, celule musculare endoteliale și netede, keratinocite, limfocite NK, neutrofile, astrocite, osteoblaste etc. Într-o măsură mai mică, TNFa este produs de unele celule tumorale. Principalul inductor al sintezei TNFa este lipopolizaharida bacteriană, precum și alte componente de origine bacteriană. În plus, sinteza și secreția TNFa sunt stimulate de citokine: IL-1, IL-2, Ifa și b, GM-CSF, etc. Virusul Epstein-Barr, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb etc.

Principala manifestare a activității biologice a TNFa este efectul asupra unor celule tumorale. În acest caz, TNFa duce la dezvoltarea necrozei hemoragice și a trombozei vaselor de sânge furnizoare. În același timp, sub influența TNFa, crește citotoxicitatea naturală a monocitelor, macrofagelor și celulelor NK. Regresia celulelor tumorale are loc mai ales intens cu acțiunea combinată a TNFa și Ifg.

Sub influența TNFa, este inhibată sinteza lipoprotein kinazei, una dintre principalele enzime care reglează lipogeneza.

TNFa, ca mediator al citotoxicității, este capabil să inhibe proliferarea celulară, diferențierea și activitatea funcțională a multor celule.

TNFa este direct implicat în răspunsul imun. Acesta joacă un rol extrem de important în primele momente ale declanșării reacției inflamatorii, deoarece activează endoteliul și promovează expresia moleculelor adezive, ceea ce duce la aderența granulocitelor la suprafața interioară a vasului. Sub influența TNFa, are loc migrarea transendotelială a leucocitelor către focarul inflamator. Această citokină activează granulocitele, monocitele și limfocitele și induce producția altor citokine pro-inflamatorii - IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, care sunt sinergici TNFa.

Format local, TNFa în centrul inflamației sau al procesului infecțios crește brusc activitatea fagocitară a monocitelor și neutrofilelor și, îmbunătățind procesele de peroxidare, contribuie la dezvoltarea fagocitozei complete. Împreună cu IL-2, TNFa crește semnificativ producția de Ifg de către limfocitele T.

TNFa este, de asemenea, implicat în procesele de distrugere și reparare, deoarece provoacă creșterea fibroblastelor și stimulează angiogeneza.

În ultimii ani, s-a stabilit că TNF este un important regulator al hematopoiezei. Direct sau împreună cu alte citokine, TNF afectează toate tipurile de celule hematopoietice.

Sub influența sa, funcția sistemului hipotalamus-hipofiză-suprarenală este îmbunătățită, precum și unele glande endocrine - glanda tiroidă, testiculele, ovarele, pancreasul și altele (A.F. Vozianov).

Interferoni sunt formate din aproape orice celule ale corpului uman, dar în principal producția lor este realizată de celule din sânge și măduva osoasă. Sinteza interferonilor are loc sub influența stimulării antigenice, deși o concentrație foarte mică a acestor compuși poate fi găsită în mod normal în măduva osoasă, bronhii, diferite organe ale tractului gastro-intestinal, piele și altele. Nivelul de sinteză a interferonului este întotdeauna mai mare în celulele care nu se împart decât în celulele care se divid rapid.

Introducere.

1. Caracteristicile generale și clasificarea citokinelor.

1.1 Mecanisme de acțiune.

1.2 Proprietățile citokinelor.

1.3 Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului.

2. Studii speciale de citokine.

2.1 Rolul citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii.

2.2 Rolul oxidului nitric și citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute.

3. Metode de determinare a citokinelor

3.1 Determinarea activității biologice a citokinelor

3.2 Cuantificarea citokinelor folosind anticorpi

3.3 Determinarea citokinelor prin imunoanaliză enzimatică.

3.3.1 Factorul de necroză tumorală-alfa.

3.3.2 Interferon gamma.

3.3.3 Interleukina-4

3.3.4 Interleukina-8

3.3.5 Antagonist al receptorului interleukinei-1.

3.3.6 Alfa-interferon.

3.3.7 Anticorpi împotriva alfa-IFN.

4. Medicamente imunotrope pe bază de citokine.

Lista literaturii folosite.

Concluzie.

Introducere.

A trecut puțin timp de la descrierea primelor citokine. Cu toate acestea, cercetările lor au condus la izolarea unei secțiuni extinse de cunoștințe - citokinologia, care este o parte integrantă a diferitelor domenii ale cunoașterii și, în primul rând, imunologia, care a dat un impuls puternic studiului acestor mediatori. Citokineologia pătrunde în toate disciplinele clinice, de la etiologia și patogeneza bolilor până la prevenirea și tratamentul diferitelor afecțiuni patologice. În consecință, cercetătorii științifici și clinicienii trebuie să navigheze în diversitatea moleculelor de reglare și să înțeleagă clar rolul fiecăreia dintre citokine în procesele studiate. Toate celulele sistemului imunitar au anumite funcții și funcționează într-o interacțiune clar coordonată, care este asigurată de substanțe biologice active speciale - citokine - regulatori ai reacțiilor imune. Citokinele sunt proteine specifice cu ajutorul cărora diverse celule ale sistemului imunitar pot face schimb de informații între ele și pot coordona acțiuni. Setul și cantitatea de citokine care acționează asupra receptorilor de suprafață celulară - „mediul citokinelor” - reprezintă o matrice de semnale care interacționează și se schimbă frecvent. Aceste semnale sunt complexe datorită varietății largi de receptori de citokine și datorită faptului că fiecare dintre citokine poate activa sau suprima mai multe procese, inclusiv sinteza proprie și sinteza altor citokine, precum și formarea și apariția receptorilor de citokine pe suprafața celulei. Scopul muncii noastre este de a studia citakinele, funcțiile și proprietățile acestora, precum și posibila lor aplicare în medicină. Citokinele sunt proteine mici (greutate moleculară de la 8 la 80 kDa) care acționează autocrin (adică asupra celulei care le produce) sau paracrine (asupra celulelor situate în apropiere). Formarea și eliberarea acestor molecule extrem de active este de scurtă durată și este bine reglementată.

Revizuire de literatura.

Caracteristicile generale și clasificarea citokinelor.

Citokinele sunt un grup de mediatori polipeptidici ai interacțiunii intercelulare, care sunt implicați în principal în formarea și reglarea reacțiilor de apărare ale corpului în timpul introducerii agenților patogeni și a perturbării integrității țesuturilor, precum și în reglarea unui număr de funcții fiziologice normale. Citokinele pot fi izolate într-un nou sistem de reglare independent, care există împreună cu sistemele nervoase și endocrine pentru menținerea homeostaziei, iar toate cele trei sisteme sunt strâns interconectate și interdependente. În ultimele două decenii, genele majorității citokinelor au fost clonate și s-au obținut analogi recombinați care repetă complet proprietățile biologice ale moleculelor naturale. Acum sunt cunoscute peste 200 de substanțe individuale aparținând familiei de citokine. Istoria studiului citokinelor a început în anii 40 ai secolului XX. Atunci au fost descrise primele efecte ale cachectinei, un factor prezent în serul sanguin și capabil să provoace cașexie sau scădere în greutate. Ulterior, acest mediator a fost izolat și s-a dovedit a fi identic cu factorul de necroză tumorală (TNF). În acel moment, studiul citokinelor se baza pe principiul detectării oricărui efect biologic, care a servit drept punct de plecare pentru numele mediatorului corespunzător. Deci, în anii 50, interferonul (IFN) a fost numit datorită capacității sale de a interfera sau de a crește rezistența în timpul infecției virale repetate. Interleukina-1 (IL-1) a fost, de asemenea, numită inițial pirogen endogen, spre deosebire de lipopolizaharidele bacteriene, care au fost considerate pirogeni exogeni. Următoarea etapă a studiului citokinelor, datând de la 60-70 de ani, este asociată cu purificarea moleculelor naturale și o caracterizare cuprinzătoare a acțiunii lor biologice. În acest moment, descoperirea factorului de creștere a celulelor T, cunoscut acum sub numele de IL-2, și o serie de alte molecule care stimulează creșterea și activitatea funcțională a limfocitelor T, B-limfocite și a altor tipuri de leucocite. În 1979, termenul „interleukine” a fost propus pentru desemnarea și sistematizarea lor, adică mediatori care comunică între leucocite. Cu toate acestea, foarte curând a devenit clar că efectele biologice ale citokinelor se extind mult dincolo de sistemul imunitar și, prin urmare, termenul propus anterior de "citokine", care a supraviețuit până în prezent, a devenit mai acceptabil. O schimbare revoluționară în studiul citokinelor a avut loc la începutul anilor 1980, după clonarea genelor interferonului de șoarece și uman și a producției de molecule recombinante care au repetat complet proprietățile biologice ale citokinelor naturale. După aceasta, a fost posibilă clonarea genelor altor mediatori din această familie. O etapă importantă în istoria citokinelor a fost utilizarea clinică a interferonilor recombinați și în special a IL-2 recombinantă pentru tratamentul cancerului. Anii 90 au fost marcați de descoperirea structurii subunității receptorilor citokinici și formarea conceptului de „rețea de citokine”, și începutul secolului XXI - descoperirea multor citokine noi prin analiza genetică. Citokinele includ interferoni, factori de stimulare a coloniilor (LCR), chemokine care transformă factorii de creștere; factor de necroză tumorală; interleukini cu numere de serie istorice stabilite și alți mediatori endogeni. Interleukinele cu numere de serie începând de la 1 nu aparțin aceluiași subgrup de citokine legate de funcții comune. La rândul lor, acestea pot fi împărțite în citokine proinflamatorii, factori de creștere și diferențiere a limfocitelor și citokine individuale de reglare. Denumirea de „interleukină” este atribuită unui nou mediator descoperit dacă sunt îndeplinite următoarele criterii elaborate de comitetul de nomenclatură al Uniunii Internaționale a Societăților Imunologice: clonarea moleculară și expresia genei factorului studiat, prezența unui nucleotid unic și secvența de aminoacizi corespunzătoare, producerea de anticorpi monoclonali neutralizanți. În plus, noua moleculă trebuie să fie produsă de celulele sistemului imunitar (limfocite, monocite sau alte tipuri de leucocite), să aibă o funcție biologică importantă în reglarea răspunsului imun, precum și funcții suplimentare, motiv pentru care nu poate să i se dea un nume funcțional. În cele din urmă, proprietățile enumerate ale noii interleukine ar trebui publicate într-un jurnal științific evaluat de colegi. Clasificarea citokinelor poate fi efectuată în funcție de proprietățile lor biochimice și biologice, precum și de tipurile de receptori prin care citokinele își îndeplinesc funcțiile biologice. Clasificarea citokinelor după structură (Tabelul 1) ia în considerare nu numai secvența de aminoacizi, ci mai presus de toate structura terțiară a proteinei, care reflectă mai exact originea evolutivă a moleculelor.

Tabelul 1. Clasificarea citokinelor după structură.

Clonarea genică și analiza structurii receptorilor citokinici au arătat că, la fel ca citokinele în sine, aceste molecule pot fi împărțite în mai multe tipuri în funcție de similaritatea secvențelor de aminoacizi și de particularitățile organizării domeniilor extracelulare (Tabelul 2). Una dintre cele mai mari familii de receptori de citokine se numește familia de receptori de hematopoietină sau familia de receptori de citokine de tip I. O caracteristică structurală a acestui grup de receptori este prezența în moleculă a 4 cisteine și secvența de aminoacizi Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), situată la mică distanță de membrana celulară. Receptorii citokinelor de clasa II interacționează cu interferoni și IL-10. Ambele prime tipuri de receptori au omologie între ele. Următoarele grupuri de receptori mediază interacțiunea cu citokinele din familia factorilor de necroză tumorală și familia IL-1. În prezent, mai mult de 20 de receptori diferiți de chemokine sunt cunoscuți că interacționează cu diferite grade de afinitate cu unul sau mai mulți liganzi din familia chemokinelor. Receptorii chemokinei aparțin superfamiliei receptorilor rodopsinei, au 7 domenii transmembranare și conduc un semnal cu participarea proteinelor G.

Tabelul 2. Clasificarea receptorilor de citokine.

Mulți receptori de citokine sunt compuși din 2-3 subunități codificate de diferite gene și exprimate independent. În acest caz, formarea unui receptor cu afinitate ridicată necesită interacțiunea simultană a tuturor subunităților. Un exemplu de astfel de organizare a receptorilor de citokine este structura complexului receptorilor IL-2. Surprinzător a fost descoperirea faptului că subunitățile individuale ale complexului receptorului IL-2 sunt comune IL-2 și altor citokine. Astfel, lanțul β este simultan o componentă a receptorului pentru IL-15, iar lanțul y servește ca subunitate comună a receptorilor pentru IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 și IL-21. Aceasta înseamnă că toate citokinele menționate anterior, ale căror receptori constau și din 2-3 polipeptide individuale, utilizează lanțul γ ca componentă a receptorilor lor, în plus, o componentă responsabilă pentru transducția semnalului. În toate cazurile, specificitatea interacțiunii pentru fiecare citokină este furnizată de alte subunități care diferă în structură. Dintre receptorii citokinici, există încă 2 subunități de receptor mai frecvente care conduc un semnal după interacțiunea cu diferite citokine. Este o subunitate de receptor comună βc (gp140) pentru receptorii IL-3, IL-5 și GM-CSF, precum și subunitatea receptorului gp130, care este comună membrilor familiei IL-6. Prezența unei subunități comune de semnalizare în receptorii de citokine servește ca una dintre abordările pentru clasificarea lor, deoarece permite găsirea de puncte comune atât în structura liganzilor, cât și în efectele biologice.

Tabelul 3 arată clasificarea combinată structurală și funcțională, în care toate citokinele sunt împărțite în grupuri, ținând seama în primul rând de activitatea lor biologică, precum și de caracteristicile structurale de mai sus ale moleculelor de citokine și ale receptorilor acestora.

Tabelul 3. Clasificarea structurală și funcțională a citokinelor.

Familii de citokine	Subgrupuri și liganzi	Funcții biologice de bază
Interferoni de tip I.	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Activitate antivirală, acțiune antiproliferativă, imunomodulatoare
Factori de creștere a celulelor hematopoietice	Factor de celule stem (kit-ligand, factor de oțel), ligand Flt-3, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Liganzi GP140: IL-3, IL-5, GM-KSF	Stimularea proliferării și diferențierea diferitelor tipuri de celule progenitoare în măduva osoasă, activarea hematopoiezei Eritropoietina, trombopoietina
Superfamilia interleukinei-1 și FRF	Familia FRF: FRF acru, FRF de bază, FRF3 - FRF23 Familia IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, antagonist al receptorilor IL-1, IL-18, IL-33 etc.	Activarea proliferării fibroblastelor și a celulelor epiteliale Acțiune pro-inflamatorie, activarea imunității specifice
Familia factorilor de necroză tumorală	TNF, limfotoxine α și β, ligand Fas etc.	Acțiune pro-inflamatorie, reglarea apoptozei și interacțiunea intercelulară a celulelor imunocompetente
Familia Interleukin-6	Liganzi GP130: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Cardiotropin-1, factor inhibitor al leucemiei, factor neurotrofic ciliar	Efecte pro-inflamatorii și imunoreglatorii
Chimiochine	SS, SHS (IL-8), SH3S, S	Reglarea chimiotaxiei diferitelor tipuri de leucocite
Familia Interleukin-10	IL-10,19,20,22,24,26	Acțiune imunosupresivă
Familia Interleukin-12		Reglarea diferențierii limfocitelor T ajutătoare
Citokine ale clonelor T-helper și funcțiile de reglare ale limfocitelor	T-helpers tip 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-helpers tip 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Liganzi ai lanțului γ al receptorului IL-2: IL-7 TSLP	Activarea imunității celulare Activarea imunității umorale, acțiunea imunomodulatoare Stimularea diferențierii, proliferării și proprietăților funcționale ale diferitelor tipuri de limfocite, celule DC, NK, macrofage etc.
Familia Interleukin 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Activarea sintezei de citokine pro-inflamatorii
Superfamilia factorului de creștere a nervilor, a factorului de creștere a trombocitelor și a factorilor de creștere transformatori	Familia factorilor de creștere a nervilor: NGF, factor neurotrofic al creierului Factori de creștere derivate din trombocite (PDGF), factori de creștere angiogenici (VEGF) Familia TRF: TPPb, activine, inhibine, nodale, proteine morfogene osoase, substanță inhibitoare muleriană	Reglarea inflamației, angiogeneza, funcția neuronală, dezvoltarea embrionară și regenerarea țesuturilor
Familia factorilor de creștere epidermică	ERF, TRFα etc.
Familia de factori de creștere asemănători insulinei	IRF-I, IRF-II	Stimularea proliferării diferitelor tipuri de celule

Primul grup include interferoni de tip I și este cel mai simplu în organizare, deoarece toate moleculele incluse în acesta au o structură similară și, în multe privințe, aceleași funcții asociate cu protecția antivirală. Al doilea grup a inclus factori de creștere și diferențiere a celulelor hematopoietice, stimulând dezvoltarea celulelor progenitoare hematopoietice, începând de la celula stem. Acest grup include citokine care sunt strict specifice pentru liniile individuale de diferențiere a celulelor hematopoietice (eritropoietină, trombopoietină și IL-7, care acționează asupra precursorilor limfocitelor TB), precum și citokine cu un spectru mai larg de activitate biologică, cum ar fi IL-3, IL-11, factori de stimulare a coloniei. În cadrul acestui grup de citokine, liganzii gp140, care au o subunitate de receptor comună, precum și trombopoietina și eritropoietina au fost izolați datorită similarității organizării structurale a moleculelor. Citokinele superfamiliei FGF și IL-1 au un grad ridicat de omologie și o structură similară a proteinelor, ceea ce confirmă originea comună. Cu toate acestea, în ceea ce privește manifestările activității biologice, FGF diferă în multe privințe de agoniștii familiei IL-1. Familia de molecule IL-1 în prezent, pe lângă numele funcționale, are denumirile F1-F11, unde F1 corespunde IL-1α, F2 la IL-1β, F3 antagonistului receptorului IL-1, F4 la IL- 18. Restul membrilor familiei au fost descoperiți ca urmare a analizei genetice și au o omologie destul de mare cu molecule IL-1, cu toate acestea, funcțiile lor biologice nu au fost pe deplin elucidate. Alte grupe de citokine includ familiile IL-6 (liganzi ai subunității receptorului comun gp130), factorul de necroză tumorală și chemokine, care sunt reprezentate de cel mai mare număr de liganzi individuali și sunt enumerate integral în capitolele respective. Familia factorului de necroză tumorală se formează în principal pe baza asemănării în structura liganzilor și a receptorilor acestora, constând din trei subunități identice necovalent legate, care formează molecule biologic active. În același timp, în ceea ce privește proprietățile biologice, această familie include citokine cu activități destul de diferite. De exemplu, TNF este una dintre cele mai izbitoare citokine proinflamatorii, ligandul Fas induce apoptoza celulelor țintă, iar ligandul CD40 oferă un semnal stimulant în timpul interacțiunii intercelulare a limfocitelor T și B. Astfel de diferențe în activitatea biologică a moleculelor similare din punct de vedere structural sunt determinate în primul rând de caracteristicile expresiei și structurii receptorilor lor, de exemplu, prezența sau absența unui domeniu intracelular de „moarte”, care determină apoptoza celulară. Familiile IL-10 și IL-12 din ultimii ani au fost, de asemenea, completate cu noi membri care au primit numere de serie ale interleukinelor. Acesta este urmat de un grup foarte complex de citokine, care sunt mediatori ai activității funcționale a limfocitelor T-helper. Includerea în acest grup se bazează pe două principii de bază: 1) aparținând citokinelor sintetizate de Th1 sau Th2, care determină dezvoltarea reacțiilor imunologice de tip predominant umoral sau celular, 2) prezența unei subunități de receptor comune - lanțul gamma a complexului receptorului IL-2. Dintre liganzii lanțului gamma, IL-4 a fost izolat suplimentar, care are și subunități de receptor comune cu IL-13, care determină în mare măsură activitatea biologică parțial suprapusă a acestor citokine. IL-7, care are o structură comună a receptorilor cu TSLP, a fost izolat în mod similar. Avantajele clasificării de mai sus sunt asociate cu luarea în considerare simultană a proprietăților biologice și biochimice ale citokinelor. Fezabilitatea acestei abordări este confirmată în prezent de descoperirea de noi citokine prin analiza genetică a genomului și căutarea unor gene similare din punct de vedere structural. Datorită acestei metode, familia interferonilor de tip I, IL-1, IL-10, IL-12, s-a extins semnificativ, a apărut o nouă familie de citokine analogice IL-17, formată deja din 6 membri. Aparent, în viitorul apropiat, apariția de noi citokine va avea loc mult mai încet, deoarece analiza genomului uman este aproape completă. Modificările sunt cel mai probabil posibile datorită clarificării variantelor interacțiunilor ligand-receptor și a proprietăților biologice, care vor permite clasificarea citokinelor să dobândească o formă finală.

Mecanisme de acțiune.

B. Receptorii citokinelor. Citokinele sunt substanțe de semnalizare hidrofilă, a căror acțiune este mediată de receptori specifici din exteriorul membranei plasmatice. Legarea citokinelor de receptor (1) duce printr-un număr de etape intermediare (2-5) la activarea transcripției anumitor gene (6). Receptorii citokinici înșiși nu posedă activitate de tirozin kinază (cu câteva excepții) . După legarea de citokină (1), moleculele receptorului se asociază pentru a forma homodimeri. În plus, pot forma heterodimeri prin asociere cu proteinele de transfer de semnal [STP] sau pot stimula dimerizarea BPS-urilor (2). Receptorii citokinelor de clasa I se pot agrega cu trei tipuri de BPS: proteinele GP130, βc sau γc. Aceste proteine auxiliare în sine nu sunt capabile să lege citokinele, dar efectuează transducția semnalului la tirozin kinaze (3). Același spectru de activitate biologică a multor citokine se explică prin faptul că diferiți complexe de citokine-receptori pot activa același BPS.

Ca exemplu de transducție a semnalului din citokine, diagrama arată cum receptorul IL-6 (IL-6), după legarea la ligand (1), stimulează dimerizarea GP130 (2). Dimerul proteinei de membrană GP130 se leagă și activează tirozin kinaza citoplasmatică a familiei YK (Janus kinaze cu două situsuri active) (3). Janus kinazele fosforilează receptorii citokinici, BPS și diverse proteine citoplasmatice, care efectuează transducția suplimentară a semnalului; de asemenea, fosforilează factorii de transcripție - traductoare de semnal și activatori ai transcripției [PSAT (STAT, din engleză transducers and activators of transcription)]. Aceste proteine aparțin familiei BPS, care au un domeniu SH3 în structura lor care recunoaște reziduurile de fosfotirozină (vezi p. 372). Prin urmare, au proprietatea de a se asocia cu un receptor de citokine fosforilat. Dacă se produce apoi fosforilarea moleculei PSAT (4), factorul se transformă într-o formă activă și formează un dimer (5). După translocare în nucleu, dimerul, ca factor de transcripție, se leagă de promotorul (vezi p. 240) al genei inițiate și induce transcrierea acesteia (6). Unii receptori de citokine pot pierde domeniul de legare a ligandului extracelular datorită proteolizei. (nu este prezentat în diagramă). Domeniul intră în sânge, unde concurează pentru legarea cu o citokină, ceea ce reduce concentrația de citokine din sânge. Împreună, citokinele formează o rețea de reglare (cascadă de citokine) cu efect multifuncțional. Suprapunerea dintre citokine duce la faptul că sinergismul este observat în acțiunea multora dintre ele, iar unele citokine sunt antagoniști. Întreaga cascadă de citokine cu feedback complex poate fi adesea observată în organism.

Proprietățile citokinelor.

Proprietățile generale ale citokinelor, datorită cărora acești mediatori pot fi combinați într-un sistem de reglementare independent.

1. Citokinele sunt polipeptide sau proteine, adesea glicozilate, cele mai multe dintre ele au un MW de 5 până la 50 kDa. Moleculele biologic active ale citokinelor pot consta din una, două, trei sau mai multe subunități identice sau diferite.

2. Citokinele nu au specificitate antigenică a acțiunii biologice. Acestea afectează activitatea funcțională a celulelor implicate în reacțiile imunității înnăscute și dobândite. Cu toate acestea, acționând asupra limfocitelor T și B, citokinele sunt capabile să stimuleze procesele induse de antigen în sistemul imunitar.

3. Pentru genele citokinelor, există trei variante de exprimare: a) expresie specifică etapei în anumite etape ale dezvoltării embrionare, b) expresie constitutivă pentru reglarea unui număr de funcții fiziologice normale, c) tip de expresie inductibil caracteristic majorității citokine. Într-adevăr, majoritatea citokinelor în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun nu sunt sintetizate de celule. Exprimarea genelor citokinelor începe ca răspuns la pătrunderea agenților patogeni în organism, iritația antigenică sau deteriorarea țesuturilor. Structurile moleculare asociate agentului patogen sunt printre cei mai puternici inductori ai sintezei citokinelor proinflamatorii. Pentru a declanșa sinteza citokinelor celulelor T, este necesară activarea celulelor de către un antigen specific cu participarea unui receptor de antigen al celulelor T.

4. Citokinele sunt sintetizate ca răspuns la stimulare pentru o perioadă scurtă de timp. Sinteza este terminată datorită unei varietăți de mecanisme de autoreglare, inclusiv o instabilitate crescută a ARN și datorită existenței feedback-urilor negative mediate de prostaglandine, hormoni corticosteroizi și alți factori.

5. Una și aceeași citokină poate fi produsă de diferite tipuri de celule ale corpului în diferite organe din punct de vedere al originii histogenetice.

6. Citokinele pot fi asociate cu membranele celulelor care le sintetizează, posedând sub formă de membrană un spectru complet de activitate biologică și manifestându-și acțiunea biologică în timpul contactului intercelular.

7. Efectele biologice ale citokinelor sunt mediate prin complexe specifice de receptori celulari care leagă citokinele cu afinitate foarte mare, iar citokinele individuale pot utiliza subunități de receptor comune. Receptorii citokinelor pot exista într-o formă solubilă, păstrând capacitatea de a lega liganzi.

8. Citokinele au acțiune biologică pleiotropă. Aceeași citokină poate acționa asupra multor tipuri de celule, provocând efecte diferite în funcție de tipul de celule țintă (Fig. 1). Acțiunea pleiotropă a citokinelor este asigurată de expresia receptorilor citokinelor asupra tipurilor de celule de diferite origini și funcții și conducerea semnalului utilizând mai mulți mesageri intracelulari și factori de transcripție.

9. Citokinele se caracterizează prin interschimbabilitatea acțiunii biologice. Mai multe citokine diferite pot provoca același efect biologic sau pot avea activități similare. Citokinele induc sau suprimă sinteza lor, a altor citokine și a receptorilor acestora.

10. Ca răspuns la semnalul de activare, celulele sintetizează simultan mai multe citokine care participă la formarea rețelei de citokine. Efectele biologice în țesuturi și la nivelul corpului depind de prezența și concentrația altor citokine cu efecte sinergice, aditive sau opuse.

11. Citokinele pot influența proliferarea, diferențierea și activitatea funcțională a celulelor țintă.

12. Citokinele acționează asupra celulelor în diferite moduri: autocrine - asupra celulei sintetizând și secretând această citokină; paracrină - pe celulele situate în apropierea celulei producătoare, de exemplu, în centrul inflamației sau în organul limfoid; endocrin - la distanță de celulele oricărui organ și țesut după intrarea în circulație. În acest din urmă caz, acțiunea citokinelor seamănă cu cea a hormonilor (Fig. 2).

Orez. 1. Aceeași citokină poate fi produsă de diferite tipuri de celule din organism în diferite organe de origine histogenetică și acționează asupra multor tipuri de celule, provocând efecte diferite în funcție de tipul de celule țintă.

Orez. 2. Trei variante ale manifestării acțiunii biologice a citokinelor.

Aparent, formarea sistemului de reglare a citokinelor a avut loc în mod evolutiv odată cu dezvoltarea organismelor multicelulare și s-a datorat necesității formării mediatorilor de interacțiune intercelulară, care pot include hormoni, neuropeptide, molecule de aderență și altele. În acest sens, citokinele sunt cel mai versatil sistem de reglare, întrucât sunt capabile să prezinte activitate biologică atât la distanță după secreția de către celula producătoare (local și sistemic), cât și în timpul contactului intercelular, fiind biologic active sub formă de membrană. Acesta este modul în care sistemul de citokine diferă de moleculele de aderență, care îndeplinesc funcții mai înguste doar atunci când celulele sunt în contact direct. În același timp, sistemul de citokine diferă de hormoni, care sunt sintetizați în principal de organe specializate și acționează după intrarea în sistemul de circulație.

Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului.

Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului poate fi împărțit în 4 componente principale:

1. Reglarea embriogenezei, stabilirea și dezvoltarea organelor, incl. organele sistemului imunitar.

2. Reglarea anumitor funcții fiziologice normale.

3. Reglarea reacțiilor de apărare ale organismului la nivel local și sistemic.

4. Reglarea proceselor de regenerare a țesuturilor.

Exprimarea genelor citokinelor individuale are loc în anumite stadii ale dezvoltării embrionare. Factorul celulelor stem, factorii de creștere transformatori, citokinele din familia TNF și chemokinele reglează diferențierea și migrația diferitelor celule și stabilirea organelor sistemului imunitar. După aceasta, sinteza unor citokine poate să nu se reia, în timp ce altele continuă să regleze procesele fiziologice normale sau sunt implicate în dezvoltarea reacțiilor de protecție.

În ciuda faptului că majoritatea citokinelor sunt mediatori inductibili tipici și în perioada postnatală nu sunt sintetizate de celule în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun, unele citokine nu intră sub această regulă. Ca urmare a expresiei constitutive a genelor, unele dintre ele sunt sintetizate constant și sunt în circulație în cantități suficient de mari, reglând proliferarea și diferențierea anumitor tipuri de celule de-a lungul vieții. Exemple de acest tip de reglare fiziologică a funcțiilor de către citokine pot fi un nivel constant ridicat de eritropoietină și unele LCR pentru a asigura hematopoieza. Reglarea reacțiilor de apărare ale organismului de către citokine are loc nu numai în cadrul sistemului imunitar, ci și prin organizarea reacțiilor de apărare la nivelul întregului organism prin reglarea aproape a tuturor aspectelor dezvoltării inflamației și a răspunsului imun. Această funcție, cea mai importantă pentru întregul sistem de citokine, este asociată cu două direcții principale ale acțiunii biologice a citokinelor - protecția împotriva agenților infecțioși și refacerea țesuturilor deteriorate. Citokinele reglementează în primul rând dezvoltarea reacțiilor locale de apărare în țesuturi cu participarea diferitelor tipuri de celule sanguine, endoteliu, țesut conjunctiv și epiteliu. Protecția la nivel local se dezvoltă prin formarea unei reacții inflamatorii tipice cu manifestările sale clasice: hiperemie, dezvoltarea edemului, apariția durerii și disfuncționalității. Sinteza citokinelor începe atunci când agenții patogeni intră în țesuturi sau este încălcată integritatea lor, care de obicei se desfășoară în paralel. Producția de citokine este o parte integrantă a răspunsului celular asociat cu recunoașterea de către celule a seriei mielomonocitice a componentelor structurale similare ale diferiților agenți patogeni, numite modele moleculare asociate cu agenții patogeni. Exemple de astfel de structuri patogene sunt lipopolizaharidele bacteriilor gram-negative, peptidoglicanii microorganismelor gram-pozitive, flagelina sau ADN bogat în secvențe CpolyG, care este tipic pentru ADN-ul tuturor tipurilor de bacterii. Leucocitele exprimă receptorii corespunzători de recunoaștere a modelelor, numiți și receptori Toll-like (TLR), și specifici anumitor modele structurale ale microorganismelor. După interacțiunea microorganismelor sau a componentelor acestora cu TLR, se declanșează o cascadă de transducție a semnalului intracelular, ceea ce duce la o creștere a activității funcționale a leucocitelor și la exprimarea genelor citokinei.

Activarea TLR duce la sinteza a două grupuri principale de citokine: citokine proinflamatorii și interferoni de tip I, în principal IFNα / β. și reglarea inflamației, inclusiv toate tipurile de leucocite, celule dendritice, limfocite T și B, celule NK, celule endoteliale și epiteliale, fibroblaste și altele. Aceasta oferă etape consistente în dezvoltarea răspunsului inflamator, care este principalul mecanism pentru punerea în aplicare a imunității înnăscute. În plus, celulele dendritice încep să sintetizeze citokinele din familia IL-12, stimulând diferențierea limfocitelor T ajutătoare, care servește ca un fel de punte către începutul dezvoltării reacțiilor imunitare specifice asociate cu recunoașterea structurilor antigenice specifice. de microorganisme.

Al doilea mecanism nu mai puțin important asociat cu sinteza IFN prevede implementarea protecției antivirale. Interferonii de tip I prezintă 4 proprietăți biologice principale:

1. Acțiune antivirală directă prin blocarea transcrierii.

2. Suprimarea proliferării celulare, necesară pentru a bloca răspândirea virusului.

3. Activarea funcțiilor celulelor NK care au capacitatea de a liza celulele corpului infectate cu virus.

4. Exprimarea îmbunătățită a moleculelor complexe de histocompatibilitate majoră de clasa I necesare pentru creșterea eficienței prezentării antigenelor virale de către celulele infectate la limfocitele T citotoxice. Acest lucru duce la activarea recunoașterii specifice a celulelor infectate cu virus de către limfocitele T - prima etapă a lizei celulelor țintă infectate cu virus.

Ca urmare, pe lângă acțiunea antivirală directă, sunt activate mecanismele atât ale imunității înnăscute (celule NK), cât și ale imunității dobândite (limfocite T). Acesta este un exemplu al modului în care o moleculă mică de citokine cu un MM de 10 ori mai puțin decât MM de molecule de anticorp este capabilă, datorită tipului pleiotrop de acțiune biologică, să activeze mecanisme complet diferite de reacții de apărare care vizează îndeplinirea unui scop - eliminarea virus care a pătruns în organism.

La nivel tisular, citokinele sunt responsabile pentru dezvoltarea inflamației și apoi regenerarea țesuturilor. Odată cu dezvoltarea unei reacții inflamatorii sistemice (răspuns de fază acută), citokinele afectează aproape toate organele și sistemele corpului implicate în reglarea homeostaziei. Acțiunea citokinelor proinflamatorii asupra sistemului nervos central duce la scăderea poftei de mâncare și la modificarea întregului complex de reacții comportamentale. Oprirea temporară a căutării de alimente și reducerea activității sexuale este benefică în ceea ce privește economisirea energiei pentru o sarcină - combaterea agentului patogen invadator. Acest semnal este furnizat de citokine, deoarece intrarea lor în circulație înseamnă cu siguranță că apărarea locală nu a făcut față agentului patogen și este necesară activarea unui răspuns inflamator sistemic. Una dintre primele manifestări ale unei reacții inflamatorii sistemice asociate cu acțiunea citokinelor asupra centrului termoreglator al hipotalamusului este creșterea temperaturii corpului. O creștere a temperaturii este o reacție de protecție eficientă, deoarece la temperaturi ridicate scade capacitatea unui număr de bacterii de a se reproduce, dar, dimpotrivă, crește proliferarea limfocitelor.

În ficat, sub influența citokinelor, crește sinteza proteinelor în fază acută și a componentelor sistemului complementului necesare combaterii agentului patogen, dar în același timp scade sinteza albuminei. Un alt exemplu de acțiune selectivă a citokinelor este modificarea compoziției ionice a plasmei sanguine în timpul dezvoltării unei reacții inflamatorii sistemice. În acest caz, există o scădere a nivelului de ioni de fier, dar o creștere a nivelului de ioni de zinc și este bine cunoscut faptul că privarea unei celule bacteriene de ioni de fier înseamnă reducerea potențialului său proliferativ (acțiunea lactoferinei se bazează pe pe aceasta). Pe de altă parte, o creștere a nivelului de zinc este necesară pentru funcționarea normală a sistemului imunitar, în special, este necesară pentru formarea unui factor seric biologic activ al timusului - unul dintre principalii hormoni timici care asigură diferențierea limfocitelor. Efectul citokinelor asupra sistemului hematopoietic este asociat cu o activare semnificativă a hematopoiezei. Este necesară o creștere a numărului de leucocite pentru a umple pierderea și a crește numărul de celule, în principal granulocite neutrofile, în centrul inflamației purulente. Acțiunea asupra sistemului de coagulare a sângelui are ca scop îmbunătățirea coagulabilității, care este necesară pentru a opri sângerarea și pentru a bloca direct agentul patogen.

Astfel, odată cu dezvoltarea inflamației sistemice, citokinele prezintă o gamă largă de activități biologice și interferează cu activitatea aproape tuturor sistemelor corpului. Cu toate acestea, niciuna dintre schimbările care au loc nu este aleatorie: toate acestea sunt necesare fie pentru activarea directă a reacțiilor de apărare, fie sunt benefice în ceea ce privește comutarea fluxurilor de energie pentru o singură sarcină - pentru a combate agentul patogen invadator. Sub formă de reglare a expresiei genelor individuale, schimbări hormonale și modificări ale reacțiilor comportamentale, citokinele asigură activarea și eficiența maximă a muncii acelor sisteme corporale care sunt necesare la un moment dat pentru dezvoltarea reacțiilor de protecție. La nivelul întregului organism, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea unei singure reacții de apărare. Citokinele servesc ca sistem de organizare care formează și reglează întregul complex al reacțiilor de apărare ale corpului în timpul introducerii agenților patogeni. Aparent, un astfel de sistem de reglare a fost format evolutiv și aduce beneficii necondiționate pentru cel mai optim răspuns de protecție al unui macroorganism. Prin urmare, aparent, este imposibil să se limiteze conceptul de reacții de apărare doar la participarea mecanismelor nespecifice de rezistență și la un răspuns imun specific. Întregul corp și toate sistemele care la prima vedere nu sunt legate de menținerea imunității participă la o singură reacție de protecție.

Studii speciale de citokine.

Importanța citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihailova. Universitatea Medicală de Stat din Rusia, Centrul de Cercetare de Stat pentru Coloproctologie, Moscova și Institutul de Cercetare de Stat pentru Biologici Foarte Puri, Sankt Petersburg, lucrează pentru a studia importanța citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii. Bolile inflamatorii cronice ale tractului gastro-intestinal ocupă în prezent unul dintre locurile principale în patologia sistemului digestiv la copii. O importanță deosebită este acordată bolilor inflamatorii ale colonului (IBD), a căror incidență crește constant în întreaga lume. Un curs lung, cu recidive frecvente și, în unele cazuri, fatale, cu apariția complicațiilor locale și sistemice - toate acestea determină un studiu aprofundat al patogeniei bolii în căutarea unor noi abordări ale tratamentului IBD. În ultimele decenii, incidența colitei ulcerative (UC) a fost de 510 cazuri pe an la 100 mii populație, cu boala Crohn (CD) 16 cazuri pe an la 100 mii populație. Ratele de prevalență în Rusia, în regiunea Moscovei, corespund cu datele europene medii, dar semnificativ mai mici decât în țările scandinave, America, Israel și Anglia. Pentru NUC, prevalența este de 19,3 la 100 de mii, iar incidența este de 1,2 la 100 de mii de persoane pe an. Pentru CD, prevalența este de 3,0 la 100 de mii, iar incidența este de 0,2 la 100 de mii de persoane pe an. Faptul că cea mai mare frecvență este observată în țările foarte dezvoltate se datorează nu numai factorilor sociali și economici, ci și caracteristicilor genetice și imunologice ale pacienților care determină predispoziția la IBD. Acești factori sunt fundamentali în teoria imunopatogenetică a originii IBD. Teoriile virale și / sau bacteriene explică doar debutul acut al bolii, iar cronizarea procesului se datorează atât predispoziției genetice, cât și caracteristicilor răspunsului imun, care sunt, de asemenea, determinate genetic. Trebuie remarcat faptul că IBTC este clasificat în prezent ca o boală cu predispoziție genetică eterogenă complexă. Au fost identificate mai mult de 15 gene candidate supuse din 2 grupuri (imunospecifice și imunoregulatoare), care cauzează predispoziție ereditară. Cel mai probabil, predispoziția este determinată de mai multe gene care determină natura reacțiilor imunologice și inflamatorii. Pe baza rezultatelor a numeroase studii, se poate concluziona că cea mai probabilă localizare a genelor asociate cu dezvoltarea IBT sunt cromozomii 3, 7, 12 și 16. În prezent, se acordă multă atenție studiului caracteristicilor funcției limfocitelor T și B, precum și a citokinelor mediator al inflamației. Rolul interleukinelor (IL), interferonilor (IFN), factorului de necroză tumorală-a (TNF-a), macrofagelor și autoanticorpilor la proteinele membranei mucoase ale intestinului gros și la microflora auto este în curs de studiu. Trăsăturile tulburărilor lor în CD și UC au fost dezvăluite, dar nu este încă clar dacă aceste modificări apar în principal sau în mod secundar. Pentru înțelegerea multor aspecte ale patogenezei, ar fi foarte importante studiile efectuate în stadiul preclinic al IBD, precum și la rudele de gradul I. Printre mediatorii inflamației, un rol special revine citokinelor, care sunt un grup de molecule polipeptidice cu o masă de 5 până la 50 kDa, care participă la formarea și reglarea reacțiilor de apărare ale corpului. La nivelul corpului, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea reacțiilor de apărare. Clasificarea citokinelor este prezentată în tabelul 2. Majoritatea citokinelor nu sunt sintetizate de celule în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun. Exprimarea genelor citokinelor începe ca răspuns la pătrunderea agenților patogeni în organism, iritația antigenică sau deteriorarea țesuturilor. Unul dintre cei mai puternici inductori ai sintezei citokinelor sunt componentele pereților celulari bacterieni: LPS, peptidoglicanii și muramildipeptidele. Producătorii de citokine pro-inflamatorii sunt în principal monocite, macrofage, celule T etc. În funcție de efectul asupra procesului inflamator, citokinele sunt împărțite în două grupe: pro-inflamatorii (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g) și antiinflamator (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukina-1 (IL-1) este un mediator imunoregulator eliberat în timpul reacțiilor inflamatorii, afectării țesuturilor și infecțiilor (citokină pro-inflamatorie). IL-1 joacă un rol important în activarea celulelor T atunci când acestea interacționează cu antigenul. Există 2 tipuri de IL-1: IL-1a și IL-1b, produse din două loci genetice diferite situate pe cromozomul 2 uman. IL-1a rămâne în interiorul celulei sau poate fi sub formă de membrană și apare în cantități mici în spațiul extracelular. Rolul formei de membrană a IL-1a este transmiterea semnalelor de activare de la macrofag la limfocitele T și alte celule în timpul contactului intercelular. IL - 1a este principalul mediator cu rază scurtă de acțiune. IL-1b, spre deosebire de IL-1a, este secretat activ de celule, acționând atât sistemic, cât și local. Astăzi se știe că IL-1 este unul dintre principalii mediatori ai reacțiilor inflamatorii, stimulează proliferarea celulelor T, crește expresia receptorului IL-2 pe celulele T și producția lor de IL-2. IL-2 împreună cu antigenul induce activarea și aderența neutrofilelor, stimulează formarea altor citokine (IL-2, IL-3, IL-6 etc.) de către celulele T activate și fibroblaste, stimulează proliferarea fibroblastelor și celulele endoteliale. Sistemic, IL-1 acționează sinergic cu TNF-a și IL-6. Odată cu creșterea concentrației în sânge, IL-1 afectează celulele hipotalamusului și determină o creștere a temperaturii corpului, febră, somnolență, scăderea poftei de mâncare și stimulează, de asemenea, celulele hepatice să producă proteine de fază acută (CRP, amiloid A, a-2 macroglobulină și fibrinogen). IL4 (cromozomul 5). Inhibă activarea macrofagelor și blochează multe dintre efectele stimulate de IFNg, cum ar fi producerea de IL1, oxid nitric și prostaglandine, joacă un rol important în reacțiile antiinflamatorii și are un efect imunosupresor. IL6 (cromozomul 7), una dintre principalele citokine proinflamatorii, este principalul inductor al etapei finale de diferențiere a celulelor B și a macrofagelor, un puternic stimulator al producției de proteine de fază acută de către celulele hepatice. Una dintre funcțiile principale ale IL6 este de a stimula producția de anticorpi in vivo și in vitro. IL8 (cromozomul 4). Se referă la mediatori chemokine care cauzează migrația direcționată (chemotaxis) a leucocitelor către focarul inflamației. Funcția principală a IL10 este inhibarea producției de citokine de către Thelpers de tip I (TNFb, IFNg) și macrofage activate (TNF-a, IL1, IL12). Se recunoaște acum că tipurile de răspuns imun sunt asociate cu una dintre variantele de activare a limfocitelor cu participarea predominantă a clonelor de ajutoare ale limfocitelor T de primul tip (TH2) sau al doilea tip (TH3). Produsele TH2 și TH3 afectează negativ activarea clonelor opuse. Activarea excesivă a oricărui tip de clone Th poate direcționa răspunsul imun conform uneia dintre opțiunile de dezvoltare. Dezechilibrul cronic în activarea clonelor Th duce la dezvoltarea condițiilor imunopatologice. Modificările citokinelor din IBTD pot fi studiate în diferite moduri cu determinarea nivelului lor în sânge sau in situ. Nivelurile de IL1 sunt crescute în toate bolile inflamatorii intestinale. Diferențele dintre NNC și CD sunt în expresia crescută a IL2. Dacă un nivel scăzut sau normal de IL2 se găsește în NUC, atunci în CD, nivelul său crescut este detectat. Conținutul de IL4 crește în NUC, în timp ce în CD rămâne normal sau chiar scade. Nivelul IL6, care mediază reacțiile de fază acută, este, de asemenea, crescut în toate formele de inflamație. Datele obținute cu privire la profilul citokinelor au făcut posibilă sugerarea faptului că cele două forme principale ale IBD cronice sunt caracterizate prin activarea și exprimarea diferită a citokinelor. Rezultatele studiilor indică faptul că profilul citokinei observat la pacienții cu UC este mai consistent cu profilul TH3, în timp ce profilul TH2 ar trebui considerat mai caracteristic pentru pacienții cu DC. Atractivitatea acestei ipoteze cu privire la rolul profilurilor TH2 și TH3 este, de asemenea, că utilizarea citokinelor poate modifica răspunsul imun într-o direcție sau alta și poate duce la remisie cu restabilirea echilibrului citokinelor. Acest lucru poate fi confirmat, în special, prin utilizarea IL10. Studii suplimentare ar trebui să arate dacă răspunsul citokinelor este un fenomen secundar ca răspuns la stimulare sau, dimpotrivă, expresia citokinelor corespunzătoare determină reactivitatea organismului cu dezvoltarea manifestărilor clinice ulterioare. Studiul nivelului de citokine în IBD la copii nu a fost încă efectuat. Această lucrare este prima parte a unui studiu științific dedicat studiului stării citokinelor în IBD la copii. Scopul acestei lucrări a fost studierea activității umorale a macrofagelor cu determinarea nivelurilor (IL1a, IL8) în sângele copiilor cu NUC și CD, precum și dinamica acestora în timpul terapiei. Din 2000 până în 2002, 34 de copii cu NUC și 19 copii cu CD cu vârsta cuprinsă între 4 și 16 ani au fost examinați în secția de gastroenterologie a Spitalului Clinic pentru Copii din Rusia. Diagnosticul a fost verificat anamnestic, endoscopic și morfologic. Studiul nivelurilor citokinelor proinflamatorii IL1a, IL8 a fost realizat prin metoda testului imunosorbent legat de enzime (ELISA). Pentru a determina concentrația de IL1a, IL8, am folosit sisteme de testare fabricate de OOO Cytokin (St. Petersburg, Rusia). Analiza a fost efectuată în laboratorul de imunofarmacologie al Centrului Științific de Stat al Institutului de Cercetări pentru Biopreparate Extrem de Pure (șeful laboratorului, MD, Prof. AS Simbirtsev). Rezultatele obținute în cursul studiului au relevat o creștere semnificativă a nivelurilor de IL1a, IL8 în perioada de exacerbare, mai pronunțată la copiii cu NUC decât la copiii cu CD. Fără exacerbare, nivelurile citokinelor proinflamatorii scad, dar nu ating normele. În UC, nivelurile de IL-1a, IL-8 au crescut în perioada de exacerbare la 76,2% și la 90% dintre copii și în perioada de remisie - la 69,2%, respectiv 92,3%. În CD, nivelurile de IL-1a, IL-8 sunt crescute în perioada de exacerbare la 73,3% și la 86,6% dintre copii și în perioada de remisie - la 50% și, respectiv, 75%.

În funcție de gravitatea bolii, copiii au primit terapie cu aminosalicilați sau glucocorticoizi. Natura terapiei a influențat semnificativ dinamica nivelului de citokine. În timpul tratamentului cu aminosalicilați, nivelurile de citokine proinflamatorii în grupul de copii cu NUC și CD au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul de control. În același timp, s-au observat rate mai mari la grupul de copii cu UC. În NUC pe fondul terapiei cu aminosalicilat, IL1a, IL8 sunt crescute la 82,4% și respectiv 100% dintre copii, în timp ce în timpul terapiei cu glucocorticoizi la 60% dintre copii pentru ambele citokine. În CD, IL1a, IL8 sunt crescute în timpul tratamentului cu aminosalicilați la toți copiii și în timpul terapiei cu glucocorticoizi la 55,5% și, respectiv, 77,7% dintre copii. Astfel, rezultatele acestui studiu indică o implicare semnificativă a legăturii macrofage a sistemului imunitar în procesul patogenetic la majoritatea copiilor cu UC și CD. Datele obținute în acest studiu nu diferă în mod fundamental de datele obținute în timpul examinării pacienților adulți. Diferențele dintre nivelurile de IL1a și IL8 la pacienții cu UC și CD sunt cantitative, dar nu calitative, ceea ce sugerează o natură nespecifică a acestor modificări datorită cursului unui proces inflamator cronic. Prin urmare, acești indicatori nu au valoare diagnostic. Rezultatele unui studiu dinamic al nivelurilor de IL1a și IL8 confirmă eficiența mai mare a terapiei cu medicamente glucocorticoide în comparație cu terapia cu aminosalicili. Datele prezentate sunt rezultatul primei etape a studiului stării citokinelor la copiii cu IBT. Este necesar un studiu suplimentar al problemei, luând în considerare indicatorii altor citokine pro-inflamatorii și antiinflamatorii.

Rolul oxidului nitric și al citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya studiază această problemă: Departamentul de Anestezie și Reanimatologie, Universitatea de Stat din Vladivostok. Sindromul de leziuni pulmonare acute (sindromul de detresă respiratorie la adult, ARDS) este una dintre cele mai severe forme de insuficiență respiratorie acută care apare la pacienții cu traume severe, sepsis, peritonită, pancreatită, pierderi profunde de sânge, aspirație, după intervenții chirurgicale extinse și în 50 60% din cazuri sunt fatale. Datele de cercetare privind patogeneza ARDS, dezvoltarea criteriilor pentru diagnosticarea precoce și prognosticul sindromului sunt puține, destul de contradictorii, ceea ce nu permite dezvoltarea unui concept coerent de diagnostic și terapeutic. S-a constatat că ARDS se bazează pe deteriorarea endoteliului capilarelor pulmonare și a epiteliului alveolar, încălcarea proprietăților reologice ale sângelui, ducând la edem al țesutului interstițial și alveolar, inflamație, atelectazie, hipertensiune pulmonară. În literatura din ultimii ani, există suficiente informații despre regulatorul universal al metabolismului celular și tisular - oxidul azotic. Interesul pentru oxidul nitric (NO) se datorează în primul rând faptului că este implicat în reglarea multor funcții, inclusiv tonusul vascular, contractilitatea cardiacă, agregarea trombocitelor, neurotransmisia, sinteza ATP și proteine și apărarea imunitară. În plus, în funcție de alegerea țintei moleculare și de caracteristicile interacțiunii cu aceasta, NO are, de asemenea, un efect dăunător. Se crede că mecanismul declanșator al activării celulare este citokinemia dezechilibrată. Citokinele sunt peptide solubile care acționează ca mediatori ai sistemului imunitar și oferă cooperare celulară, imunoreglare pozitivă și negativă. Am încercat să sistematizăm informațiile disponibile în literatura de specialitate cu privire la rolul NO și al citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute. NO este un gaz solubil în apă și grăsimi. Molecula sa este un radical liber instabil, se difuzează ușor în țesut, este absorbită și distrusă atât de repede încât nu poate afecta decât celulele mediului imediat. Molecula de NO are toate proprietățile inerente mesagerilor clasici: se produce rapid, acționează în concentrații foarte scăzute, după încetarea semnalului extern, se transformă rapid în alți compuși, oxidându-se în oxizi de azot anorganici stabili: nitriți și nitrați. Durata de viață a NO în țesut este, conform diferitelor surse, de la 5 la 30 de secunde. Principalele ținte moleculare ale NO sunt enzimele și proteinele care conțin fier: guanilat ciclază solubilă, nitrooxid sintază (NOS) propriu-zisă, hemoglobină, enzime mitocondriale, enzime ale ciclului Krebs, proteine și sinteza ADN-ului. Sinteza NO în organism are loc prin transformări enzimatice ale părții conținând azot a aminoacidului L-arginină sub influența unei enzime specifice NOS și este mediată de interacțiunea ionilor de calciu cu calmodulina. Enzima este inactivată la concentrații scăzute și este activă maxim la 1 μM calciu liber. Au fost identificate două izoforme NOS: constitutive (cNOS) și induse (iNOS), care sunt produse de gene diferite. CNOS dependent de calciu-calmodulină este prezent în mod constant în celulă și promovează eliberarea unor cantități mici de NO ca răspuns la stimularea fizică și a receptorilor. NU, generat sub influența acestei izoforme, acționează ca purtător într-o serie de răspunsuri fiziologice. INOS independent de calciu-calmodulină se formează în diferite tipuri de celule ca răspuns la citokine pro-inflamatorii, endotoxine și oxidanți. Această izoformă NOS este transcrisă de gene specifice de pe cromozomul 17 și promovează sinteza unor cantități mari de NO. Enzima este, de asemenea, clasificată în trei tipuri: NOS-I (neuronal), NOS-II (macrofag), NOS-III (endotelial). Familia de enzime care sintetizează NO se găsește într-o varietate de celule pulmonare: în celulele epiteliale bronșice, în alveolocite, în macrofage alveolare, în mastocite, în celulele endoteliale ale arterelor și venelor bronșice, în miocitele netede ale bronhiilor și vaselor de sânge, în neuroni non-adrenergici non-colinergici. Capacitatea constitutivă a celulelor epiteliale ale bronhiilor și alveolelor oamenilor și mamiferelor de a secreta NO a fost confirmată în numeroase studii. S-a stabilit că părțile superioare ale căilor respiratorii umane, precum și părțile inferioare, sunt implicate în formarea NO. Studiile efectuate la pacienții cu traheostomie au arătat că cantitatea de gaz din aer expirată prin traheostomie este semnificativ mai mică decât în cavitatea nazală și orală. Sinteza NO endogen la pacienții cu ventilație artificială pulmonară suferă semnificativ. Cercetările confirmă faptul că eliberarea NO are loc în momentul bronhodilatării și este controlată de sistemul nervos vag. S-au obținut date despre care formarea NO în epiteliul căilor respiratorii umane crește în bolile inflamatorii ale sistemului respirator. Sinteza gazelor este crescută datorită activării NOS induse sub influența citokinelor, precum și a endotoxinelor și lipopolizaharidelor.

În prezent, sunt cunoscute mai mult de o sută de citokine, care sunt împărțite în mod tradițional în mai multe grupuri.

1. Interleukinele (IL-1 - IL18) - proteine reglatoare secretoare care asigură interacțiuni mediator în sistemul imunitar și conexiunea acestuia cu alte sisteme ale corpului.

2. Interferoni (IFN-alfa, beta, gamma) - citokine antivirale cu efect imunoreglator pronunțat.

3. Factorii de necroză tumorală (TNF alfa, beta) sunt citokine cu efecte citotoxice și reglatoare.

4. Factori de stimulare a coloniei (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - stimulatori ai creșterii și diferențierii celulelor hematopoietice, reglând hematopoieza.

5. Chimiochine (IL-8, IL-16) - chimioatractori pentru leucocite.

6. Factori de creștere - regulatori de creștere, diferențiere și activitate funcțională a celulelor aparținând diferitelor țesuturi (factor de creștere a fibroblastelor, factor de creștere a celulelor endoteliale, factor de creștere epidermică) și factori de creștere transformatori (TGF beta).

Aceste molecule de bioreglare determină tipul și durata răspunsului inflamator și imun, controlează proliferarea celulară, hematopoieza, angiogeneza, vindecarea rănilor și multe alte procese. Toți cercetătorii subliniază că citokinele nu au specificitate pentru antigeni. Experimentele cu macrofage pulmonare cultivate și mastocite au arătat formarea iNOS ca răspuns la interferon gamma, interleukină-1, factor de necroză tumorală și lipopolizaharide. Expresia iNOS și cNOS pentru citokinele proinflamatorii a fost găsită în alveolocitele animale și umane. Adăugarea factorului de creștere epidermică, un regulator al funcției celulelor epiteliale la cultură, a redus activitatea numai a enzimei induse. Se știe că, în funcție de natură, citokinele acționează autocrin - asupra celulelor producătoare în sine, paracrine - asupra altor celule țintă, sau endocrine - asupra diferitelor celule din afara locului de producție. În același timp, pot interacționa între ei în conformitate cu un principiu agonist sau antagonist, schimbând starea funcțională a celulelor țintă și formând o rețea de citokine. Astfel, citokinele nu sunt peptide izolate, ci un sistem integral, ale cărui componente principale sunt celule producătoare, proteina însăși este o citokină, receptorul ei și o celulă țintă. S-a constatat că odată cu dezvoltarea leziunii pulmonare acute, nivelul citokinelor proinflamatorii crește: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Efectul lor este asociat cu vasodilatație, o creștere a permeabilității lor și acumularea de lichid în țesutul pulmonar. În plus, studiile au arătat capacitatea IFN gamma și TNF alfa de a induce expresia moleculelor de aderență - ICAM -1 pe celulele endoteliale umane. Moleculele de adeziune, care aderă la leucocite, trombocite și celule endoteliale, formează neutrofile „rulante” și promovează agregarea particulelor de fibrină. Aceste procese contribuie la încălcarea fluxului sanguin capilar, cresc permeabilitatea capilară și induc edem tisular local. Încetinirea fluxului sanguin capilar este promovată de activarea NO, care determină dilatarea arteriolelor. Migrația suplimentară a leucocitelor către focarul inflamației este controlată de citokine speciale - chemokine, care sunt produse și secretate nu numai de macrofagele activate, ci și de celulele endoteliale, fibroblaste, miocite netede. Funcția lor principală este de a furniza neutrofile focarului inflamator și de a le activa activitatea funcțională. Principala chimiochină pentru neutrofile este Il-8. Inductorii săi cei mai puternici sunt lipopolizaharidele bacteriene, IL-1 și TNFalpha. R. Bahra și colab. cred că fiecare etapă a migrației transendoteliale a neutrofilelor este reglată prin stimularea concentrațiilor de TNF alfa. Odată cu dezvoltarea leziunii pulmonare acute, endoteliocitele vasculare, celulele epiteliale bronșice și macrofagele alveolare sunt activate și sunt implicate în interacțiunile de fază. Ca rezultat, pe de o parte, apar mobilizarea lor și îmbunătățirea proprietăților protectoare și, pe de altă parte, este posibilă deteriorarea celulelor în sine și a țesuturilor înconjurătoare. O serie de studii au arătat că produsul reducerii parțiale a oxigenului, superoxidul, se poate acumula în focarul inflamației, ceea ce inactivează efectul vasoactiv al NO. NO și anionul superoxid reacționează rapid pentru a forma peroxinitrit care dăunează celulei. Această reacție promovează îndepărtarea NO din pereții vasculari și bronșici, precum și de pe suprafața alveolocitelor. Studiile care arată că în mod tradițional considerat un mediator al toxicității NO, peroxinitritul poate avea un efect fiziologic și poate induce relaxarea vasculară printr-o creștere mediată de NO a cGMP în endoteliul vascular este de interes. La rândul său, peroxinitritul este un oxidant puternic capabil să afecteze epiteliul alveolar și surfactantul pulmonar. Provoacă distrugerea proteinelor și lipidelor membranei, dăunează endoteliului, crește agregarea trombocitelor și participă la endotoxemie. Formarea sa crescută a fost observată în sindromul de leziuni pulmonare acute. Cercetătorii consideră că NO produs ca urmare a activării enzimei induse este destinat protecției nespecifice a organismului împotriva unei game largi de agenți patogeni, inhibă agregarea trombocitelor și îmbunătățește circulația sanguină locală. S-a constatat că o cantitate excesivă de NO suprimă activitatea cNOS din celule datorită interacțiunii cu superoxid și, eventual, ca urmare a desensibilizării guanilat ciclazei, ducând la o scădere a cGMP în celulă și la o creștere a calciului intracelular. . Brett și colab. și Kooy și colab., analizând importanța mecanismelor nitrooxidergice în patogeneza ARDS, au sugerat că iNOS, peroxinitritul și nitrotirozina, principalul produs al efectului peroxinitritului asupra proteinelor, pot juca un rol cheie în dezvoltarea sindromului. Cuthbertson și colab. cred că baza leziunii pulmonare acute este efectul NO și al peroxinitritului asupra elastazei și interleukinei-8. Kobayashi și colab. de asemenea, a înregistrat o creștere a conținutului de iNOS, interleukină-1, interleukină-6, interleukină-8 în lichidul bronhoalveolar la pacienții cu sindrom de leziuni pulmonare acute. Meldrum și colab. a arătat o scădere a producției de citokine inflamatorii de către macrofagele pulmonare în ARDS sub influența substratului producției locale de NO - L-arginină. S-a constatat că în geneza sindromului de leziuni pulmonare acute, un rol semnificativ îl joacă afectarea permeabilității vasculare cauzată de acțiunea citokinelor - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, anticorpi monoclonali împotriva limfocitelor CD3 pe celulele endoteliale vasculare ale plămânii și imunocitele. O creștere rapidă și puternică a permeabilității vaselor pulmonare duce la migrarea neutrofilelor în țesutul pulmonar și la eliberarea de către acestea a mediatorilor citotoxici, ceea ce conduce la dezvoltarea alterării pulmonare patologice. În timpul dezvoltării leziunilor pulmonare acute, TNF alfa crește aderența neutrofilelor la peretele vascular, îmbunătățește migrația acestora în țesuturi, promovează modificări structurale și metabolice ale endoteliocitelor, perturbă permeabilitatea membranelor celulare, activează formarea altor citokine și eicosanoide, și provoacă apoptoză și necroză a celulelor epiteliale pulmonare. Datele obținute indică faptul că apoptoza macrofagelor indusă de introducerea LPS este în mare parte asociată cu IFN gamma și este redusă prin acțiunea IL-4, IL-10, TGF beta. Cu toate acestea, Kobayashi și colab. date obținute care indică faptul că IFN gamma poate fi implicat în repararea epiteliului mucoasei tractului respirator. Studiile Hagimoto conțin informații despre faptul că celulele epiteliale ale bronhiilor și alveolelor ca răspuns la TNF alfa sau ligand Fas eliberează IL-8, IL-12. Acest proces este asociat cu activarea factorului nuclear Carr-B de către ligandul Fas.

Se crede că IL-8 este una dintre cele mai importante citokine din fiziopatologia leziunii pulmonare acute. Miller și colab. în studiul lichidului bronho-alveolar la pacienții cu ARDS pe fondul sesisului, s-a constatat o creștere semnificativă a nivelului de IL-8, comparativ cu pacienții cu edem pulmonar cardiogen. S-a sugerat că sursa primară a Il-8 sunt plămânii, iar acest criteriu poate fi utilizat în diagnosticul diferențial al sindromului. Grau și colab. cred că celulele endoteliale ale capilarelor pulmonare sunt o sursă importantă de citokine - IL-6, IL-8 în dezvoltarea leziunii pulmonare acute. Goodman și colab. Atunci când se studiază dinamica nivelului de citokine din lichidul spălării bronho-alveolare la pacienții cu SDRA, o creștere semnificativă a IL-1beta, IL-8, peptida chemotactică monocitară-1, activator neutrofil celular epitelial, peptida inflamatorie macrofagă -1 s-a găsit alfa. În același timp, autorii consideră că o creștere a conținutului de IL-1 beta poate servi drept marker al unui rezultat nefavorabil al sindromului. Bauer și colab. s-a arătat că controlul asupra conținutului de IL-8 în fluidul bronhoalveolar la pacienții cu SDRA poate fi utilizat pentru monitorizare, o scădere a nivelului de IL-8 indică un curs nefavorabil al procesului. O serie de studii conțin, de asemenea, informații că nivelul producției de citokine de către endoteliul vascular al plămânilor afectează dezvoltarea leziunii pulmonare acute și controlul căruia poate fi utilizat în practica clinică pentru diagnosticarea precoce. Posibilele consecințe negative ale creșterii nivelului de citokine proinflamatorii la pacienții cu SDRA sunt evidențiate de studiile lui Martin și colab., Warner și colab. Macrofagele alveolare activate de citokine și endotoxinele bacteriene cresc sinteza NO. Crește și nivelul producției de NO de către celulele epiteliale bronșice și alveolare, neutrofile, mastocite, celule endoteliale și miocitele netede ale vaselor pulmonare, probabil prin activarea factorului nuclear Carr-B. Autorii cred că oxidul nitric produs ca urmare a activării NOS indus este destinat în primul rând apărării nespecifice a organismului. Eliberat din macrofage, NO pătrunde rapid în bacterii și ciuperci, unde inhibă trei grupuri vitale de enzime: transportul electronilor H, ciclul Krebs și sinteza ADN-ului. NU este implicat în apărarea organismului în ultimele etape ale răspunsului imun și este considerat figurativ ca „sabia pedepsitoare” a sistemului imunitar. Cu toate acestea, acumularea în celulă în cantități inadecvate de mari, NU are, de asemenea, un efect dăunător. Astfel, odată cu dezvoltarea sindromului leziunii pulmonare acute, citokinele și NO declanșează un lanț secvențial de reacții exprimate în microcirculație afectată, hipoxie tisulară, edem alveolar și interstițial și afectarea funcției metabolice a plămânilor. Prin urmare, se poate afirma că studiul mecanismelor fiziologice și fiziopatologice ale acțiunii citokinelor și NO este un domeniu promițător pentru cercetare și va permite în viitor nu numai extinderea înțelegerii patogeniei ARDS, ci și determinarea markeri diagnostici și prognostici ai sindromului, pentru a dezvolta opțiuni pentru terapia pe bază de patogenetic care vizează reducerea letalității.

Metode de determinare a citokinelor.

Revizuirea este dedicată principalelor metode pentru studiul citokinelor utilizate în prezent. Posibilitățile și scopul metodelor sunt descrise pe scurt. Sunt prezentate avantajele și dezavantajele diferitelor abordări ale analizei expresiei genelor citokinelor la nivelul acizilor nucleici și la nivelul producției de proteine. (Citokine și inflamație. 2005. T. 4, nr. 1. S. 22-27.)

Citokinele sunt proteine reglatoare care formează o rețea universală de mediatori, caracteristică atât sistemului imunitar, cât și celulelor altor organe și țesuturi. Toate evenimentele celulare au loc sub controlul acestei clase de proteine reglatoare: proliferarea, diferențierea, apoptoza și activitatea funcțională specializată a celulelor. Efectele fiecărei citokine asupra celulelor se caracterizează prin pleiotropie, spectrul efectelor diferiților mediatori se suprapune și, în general, starea funcțională finală a celulei depinde de influența mai multor citokine care acționează sinergic. Astfel, sistemul de citokine este o rețea universală, polimorfă de reglare a mediatorilor, concepută pentru a controla procesele de proliferare, diferențiere, apoptoză și activitate funcțională a elementelor celulare din sistemele hematopoietice, imune și alte sisteme homeostatice ale corpului. Metodele de determinare a citokinelor au cunoscut o evoluție foarte rapidă de-a lungul a 20 de ani de studiu intens și reprezintă astăzi o întreagă zonă de cunoștințe științifice. Cercetătorii în citokineologie la începutul activității lor se confruntă cu problema alegerii unei metode. Și aici cercetătorul trebuie să știe exact ce informații trebuie să obțină pentru a atinge obiectivul stabilit. În prezent, au fost dezvoltate sute de metode diferite de evaluare a sistemului citokinelor, care furnizează diverse informații despre acest sistem. Evaluarea citokinelor în diferite medii biologice se poate baza pe activitatea biologică specifică. Ele pot fi cuantificate folosind o varietate de metode de imunoanaliză folosind anticorpi poli și monoclonali. În plus față de studierea formelor secretoare ale citokinelor, este posibil să se studieze conținutul și producția intracelulară a acestora în țesuturi prin citometrie în flux, Western blot și imunohistochimie in situ. Informații foarte importante pot fi obținute prin studierea expresiei mRNA citokinei, a stabilității mARN, a prezenței izoformelor mRNA citokinei, a secvențelor naturale de nucleotide antisens. Studiul variantelor alelice ale genelor citokinelor poate furniza informații importante despre producția programată genetic, mare sau scăzută, a unuia sau a altui mediator. Fiecare metodă are propriile sale dezavantaje și avantaje, propria rezoluție și precizie de determinare. Necunoașterea și neînțelegerea cercetătorului cu privire la aceste nuanțe îl pot duce la concluzii false.

Determinarea activității biologice a citokinelor.

Istoria descoperirii și primii pași în studiul citokinelor au fost strâns legate de cultivarea celulelor imunocompetente și a liniilor celulare. Apoi s-au arătat efectele reglatoare (activitatea biologică) a unui număr de factori solubili de natură proteică asupra activității proliferative a limfocitelor, asupra sintezei imunoglobulinelor, asupra dezvoltării răspunsurilor imune în modelele in vitro. Una dintre primele metode de determinare a activității biologice a mediatorilor este determinarea factorului de migrare a limfocitelor umane și a factorului de inhibare a acestuia. Deoarece efectele biologice ale citokinelor au fost studiate, au apărut diverse metode de evaluare a activității lor biologice. Astfel, IL-1 a fost determinată prin evaluarea proliferării timocitelor murine in vitro, IL-2 - prin capacitatea de a stimula activitatea proliferativă a limfoblastelor, IL-3 - prin creșterea coloniilor hematopoietice in vitro, IL-4 - prin efectul comitogen, prin expresia crescută a proteinelor Ia, prin inducerea formării IgG1 și IgE etc. Lista acestor metode poate fi continuată, este actualizată constant pe măsură ce sunt descoperite noi activități biologice ale factorilor solubili. Principalul lor dezavantaj sunt metodele nestandardizate, imposibilitatea unificării lor. Dezvoltarea ulterioară a metodelor pentru determinarea activității biologice a citokinelor a dus la crearea unui număr mare de linii celulare sensibile la una sau alta citokină sau linii multisensibile. Majoritatea acestor celule sensibile la citokine pot fi găsite acum pe listele comerciale de linii celulare. De exemplu, pentru testarea IL-1a și b, se utilizează linia celulară D10S, pentru IL-2 și IL-15 - linia celulară CTLL-2, pentru IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL-13, GM-CSF - linia celulară TF-1, pentru IL-6 - linia celulară B9, pentru IL-7 - linia celulară 2E8, pentru TNFa și TNFb - linia celulară L929, pentru IFNg - linia celulară WiDr, pentru IL-18 - linia de linie celulară KG-1. Cu toate acestea, această abordare a studiului proteinelor imunoactive, împreună cu avantaje bine cunoscute, cum ar fi măsurarea activității biologice reale a proteinelor mature și active, reproductibilitate ridicată în condiții standardizate, are dezavantajele sale. Acestea includ, în primul rând, sensibilitatea liniilor celulare nu la o citokină, ci la mai multe citokine înrudite, ale căror efecte biologice se suprapun. În plus, nu poate fi exclusă posibilitatea inducerii producției de alte citokine de către celulele țintă, care poate distorsiona parametrul testat (de regulă, proliferarea, citotoxicitatea, chimiotaxia). Nu cunoaștem încă toate citokinele și nu toate efectele acestora, prin urmare, nu evaluăm citokina în sine, ci activitatea biologică specifică totală. Astfel, evaluarea activității biologice ca activitate totală a diferiților mediatori (lipsa de specificitate) este unul dintre dezavantajele acestei metode. În plus, folosind linii sensibile la citokine, este imposibil să se identifice moleculele inactivate și proteinele asociate. Aceasta înseamnă că astfel de metode nu reflectă producția efectivă pentru un număr de citokine. Un alt dezavantaj important al utilizării liniilor celulare este necesitatea unui laborator pentru cultura celulară. În plus, toate procedurile pentru creșterea celulelor, incubarea acestora cu proteinele și mediile studiate sunt consumatoare de timp. De asemenea, trebuie remarcat faptul că utilizarea pe termen lung a liniilor celulare necesită reînnoire sau recertificare, deoarece, ca urmare a cultivării, acestea pot muta și modifica, ceea ce poate duce la o schimbare a sensibilității lor la mediatori și la o scădere a preciziei determinarea activității biologice. Cu toate acestea, această metodă este ideală pentru testarea activității biologice specifice mediatorilor recombinați.

Cuantificarea citokinelor folosind anticorpi.

Citokinele produse de imunocompetente și alte tipuri de celule sunt eliberate în spațiul extracelular pentru interacțiuni de semnalizare paracrină și autocrină. Prin concentrația acestor proteine în serul sanguin sau într-un mediu condiționat, se poate judeca natura procesului patologic și excesul sau lipsa anumitor funcții celulare la pacient. Metodele de determinare a citokinelor folosind anticorpi specifici sunt astăzi cele mai comune sisteme de detectare a acestor proteine. Aceste metode au trecut printr-o serie întreagă de modificări folosind diferite etichete (radioizotop, fluorescent, electrochiluminiscent, enzimă etc.). Dacă metodele radioizotopice au o serie de dezavantaje asociate cu utilizarea unei etichete radioactive și posibilitatea limitată a timpului de utilizare a reactivilor marcați (timpul de înjumătățire), atunci metodele imunosorbente legate de enzime au găsit cea mai răspândită utilizare. Ele se bazează pe vizualizarea produselor insolubile ale unei reacții enzimatice, absorbind lumina cu o lungime de undă cunoscută, în cantități echivalente cu concentrația analitului. Pentru a lega substanțele care trebuie măsurate, se folosesc anticorpi aplicați pe o bază solidă de polimer, iar pentru vizualizare se folosesc anticorpi conjugați cu enzime, de obicei fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean. Avantajele metodei sunt evidente: precizie ridicată a determinării în condiții de depozitare standardizate pentru reactivi și proceduri, analiză cantitativă și reproductibilitate. Dezavantajele includ o gamă limitată de concentrații determinate, ca urmare a căreia toate concentrațiile care depășesc un anumit prag sunt considerate egale cu acesta. Trebuie remarcat faptul că timpul necesar pentru finalizarea metodei variază în funcție de recomandările producătorului. Cu toate acestea, în orice caz, vorbim despre câteva ore necesare pentru incubații și spălări cu reactivi. În plus, se determină formele latente și legate de citokine, care în concentrația lor pot depăși semnificativ formele libere, responsabile în principal de activitatea biologică a mediatorului. Prin urmare, este de dorit să se utilizeze această metodă împreună cu metodele de evaluare a activității biologice a mediatorului. O altă modificare a metodei de imunotest, care a găsit o aplicare largă, este metoda electrochiluminiscenței (ECL) pentru determinarea proteinelor cu anticorpi etichetați cu ruteniu și biotină. Această metodă are următoarele avantaje față de imunoanalizele radioizotopice și enzimatice: ușurință în implementare, timp scurt de execuție a metodei, fără proceduri de spălare, volum mic de probă, o gamă largă de concentrații determinate de citokine în ser și într-un mediu condiționat, sensibilitate ridicată a metoda și reproductibilitatea acesteia. Metoda luată în considerare este acceptabilă pentru utilizare atât în cercetarea științifică, cât și în cea clinică. Următoarea metodă de evaluare a citokinelor în mediul biologic este dezvoltată pe baza tehnologiei fluorimetriei în flux. Vă permite să evaluați simultan până la sute de proteine dintr-o probă. În prezent, au fost create kituri comerciale pentru determinarea a până la 17 citokine. Cu toate acestea, avantajele acestei metode determină și dezavantajele acesteia. În primul rând, aceasta este laboriozitatea selecției condițiilor optime pentru determinarea mai multor proteine și, în al doilea rând, producția de citokine este în cascadă cu vârfuri de producție în momente diferite. Prin urmare, determinarea unui număr mare de proteine în același timp nu este întotdeauna informativă. Cerința generală pentru metodele de imunoanaliză folosind așa-numitul. „sandwich”, este o selecție atentă a unei perechi de anticorpi, permițând determinarea formei libere sau legate a proteinei analizate, care impune limitări acestei metode și care trebuie întotdeauna luată în considerare la interpretarea datelor obținute. Aceste metode determină producția totală de citokine de către diferite celule, în același timp, este posibil să se judece producția specifică de antigen a citokinelor de către celulele imunocompetente numai ipotetic. În prezent, a fost dezvoltat sistemul ELISpot (Enzime-Liked ImmunoSpot), care elimină în mare măsură aceste dezavantaje. Metoda face posibilă evaluarea semi-cantitativă a producției de citokine la nivelul celulelor individuale. Rezoluția ridicată a acestei metode permite evaluarea producției de citokine stimulate de antigen, ceea ce este foarte important pentru evaluarea unui răspuns imun specific. Următoarea metodă, utilizată pe scară largă în scopuri științifice, este determinarea intracelulară a citokinelor prin citometrie în flux. Avantajele sale sunt evidente. Putem caracteriza fenotipic populația de celule producătoare de citokine și / sau determina spectrul de citokine produse de celule individuale, cu posibilitatea unei caracterizări cantitative relative a acestei producții. În același timp, metoda descrisă este destul de complicată și necesită echipamente costisitoare. Următoarea serie de metode, care sunt utilizate în principal în scopuri științifice, sunt metode imunohistochimice care utilizează anticorpi monoclonali marcați. Avantajele sunt evidente - determinarea producției de citokine direct în țesuturi (in situ), unde au loc diferite reacții imunologice. Cu toate acestea, metodele luate în considerare sunt foarte laborioase și nu oferă date cantitative exacte.

Determinarea citokinelor prin imunoanaliză enzimatică.

Vector-Best CJSC sub conducerea T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov lucrează activ la determinarea citokinelor. Citokinele sunt un grup de mediatori polipeptidici, adesea glicozilați, cu greutăți moleculare cuprinse între 8 și 80 kDa. Citokinele sunt implicate în formarea și reglarea reacțiilor de apărare și a homeostaziei organismului. Acestea sunt implicate în toate legăturile răspunsului imun umoral și celular, inclusiv diferențierea celulelor progenitoare imunocompetente, prezentarea antigenului, activarea și proliferarea celulară, expresia moleculelor de aderență și răspunsul de fază acută. Unele dintre ele sunt capabile să prezinte multe efecte biologice asupra diferitelor celule țintă. Acțiunea citokinelor asupra celulelor se realizează în următoarele moduri: autocrină - asupra unei celule care sintetizează și secretă această citokină; paracrină - pe celulele situate în apropierea celulei producătoare, de exemplu, în centrul inflamației sau în organul limfoid; endocrin-de la distanță - pe celulele oricăror organe și țesuturi după ce citokina intră în circulația sângelui. Formarea și eliberarea citokinelor este de obicei de scurtă durată și bine reglată. Citokinele acționează asupra celulei prin legarea la receptori specifici de pe membrana citoplasmatică, provocând astfel o cascadă de reacții care duc la inducerea, îmbunătățirea sau suprimarea activității unui număr de gene reglementate de acestea. Citokinele se caracterizează printr-o natură complexă a funcționării în rețea, în care producerea uneia dintre ele afectează formarea sau manifestarea activității unui număr de altele. Citokinele sunt mediatori locali, prin urmare, se recomandă măsurarea nivelurilor acestora în țesuturile corespunzătoare după extragerea proteinelor tisulare din biopsiile organelor corespunzătoare sau din fluidele naturale: urină, lichid lacrimal, lichid gingival de buzunar, spălare bronhoalveolară, secreții vaginale, ejaculare , spălări din cavități, măduva spinării sau lichide sinoviale etc. Informații suplimentare despre starea sistemului imunitar al organismului pot fi obținute prin studierea capacității celulelor sanguine de a produce citokine in vitro. Nivelurile de citokine plasmatice reflectă starea actuală a sistemului imunitar și dezvoltarea răspunsurilor de apărare in vivo. Producția spontană de citokine de către o cultură de celule mononucleare din sângele periferic face posibilă evaluarea stării celulelor corespunzătoare. Producția spontană crescută de citokine indică faptul că celulele sunt deja activate de antigen in vivo. Producția indusă de citokine face posibilă evaluarea capacității potențiale a celulelor corespunzătoare de a răspunde la stimularea antigenică. Inducerea redusă a citokinelor in vitro, de exemplu, poate servi ca unul dintre semnele unei stări de imunodeficiență. Prin urmare, ambele opțiuni pentru studierea nivelurilor de citokine atât în sângele circulant, cât și în timpul producerii lor de către culturi celulare sunt importante din punct de vedere al caracterizării imunoreactivității întregului organism și a funcției legăturilor individuale ale sistemului imunitar. Până de curând, în Rusia, câteva grupuri de cercetători erau implicați în studiul citokinelor, deoarece metodele de cercetare biologică consumă foarte mult timp, iar kiturile imunochimice importate sunt foarte scumpe. Odată cu apariția truselor imunosorbente domestice legate de enzime, medicii practicanți arată un interes tot mai mare în studierea profilului citokinelor. În acest moment, semnificația diagnostic a evaluării nivelului de citokine este de a constata chiar faptul că crește sau scade concentrația acestora la un anumit pacient cu o boală specifică. Mai mult, pentru a evalua severitatea și a prezice evoluția bolii, este recomandabil să se determine concentrația citokinelor anti- și pro-inflamatorii în dinamica dezvoltării patologiei. De exemplu, conținutul de citokine din sângele periferic este determinat de momentul exacerbării, reflectă dinamica procesului patologic în ulcerul peptic și alte boli ale tractului gastro-intestinal. În primele etape ale exacerbării, prevalează o creștere a conținutului de interleukină-1beta (IL-1beta), interleukină-8 (IL-8), apoi concentrația interleukinei-6 (IL-6), gamma-interferon (gamma -INF), factorul de necroză tumorală crește -alfa (alfa-TNF). Concentrația de interleukină-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF a atins maximul la înălțimea bolii, în timp ce conținutul markerilor fazei acute în această perioadă s-a apropiat de valorile normale. La vârful exacerbării, nivelul de alfa-TNF a depășit semnificativ conținutul de interleukină-4 (IL-4) atât în serul sanguin, cât și direct în țesutul afectat al zonei peri-ulcer, după care a început treptat scădea. Pe măsură ce fenomenele de fază acută s-au diminuat și procesele de reparații s-au intensificat, concentrația IL-4 a crescut. Prin schimbarea profilului citokinelor, se poate judeca eficacitatea și fezabilitatea chimioterapiei. La efectuarea terapiei cu citokine, de exemplu, în timpul terapiei cu alfa-interferon (alfa-IFN), este necesar să se controleze atât nivelul conținutului său în sângele circulant, cât și producția de anticorpi împotriva alfa-IFN. Se știe că atunci când se produce o cantitate mare din acești anticorpi, terapia cu interferon nu numai că încetează să fie eficientă, dar poate duce și la boli autoimune. Recent, au fost dezvoltate și introduse în practică noi medicamente, care într-un fel sau altul modifică statutul de citokine al organismului. De exemplu, pentru tratamentul artritei reumatoide, se propune un medicament pe baza anticorpilor împotriva alfa-TNF, conceput pentru a elimina alfa-TNF, care este implicat în distrugerea țesutului conjunctiv. Cu toate acestea, conform datelor noastre și din literatura de specialitate, nu toți pacienții cu poliartrită reumatoidă cronică au un nivel crescut de TNF-alfa, prin urmare, pentru acest grup de pacienți, o scădere a nivelului de TNF-alfa poate agrava și mai mult dezechilibrul sistemul imunitar. Astfel, terapia corectă cu citokine presupune controlul stării citokinelor organismului în timpul tratamentului. Rolul protector al citokinelor proinflamatorii se manifestă local, în centrul inflamației, dar producția lor sistemică nu duce la dezvoltarea imunității antiinfecțioase și nu împiedică dezvoltarea șocului bacterian-toxic, care este cauza mortalității timpurii la pacienții chirurgicali cu complicații purulente-septice. Baza patogeniei infecțiilor chirurgicale este declanșarea cascadei de citokine, care include, pe de o parte, citokine pro-inflamatorii și, pe de altă parte, antiinflamatoare. Echilibrul dintre aceste două grupuri opuse determină în mare măsură natura cursului și rezultatul bolilor purulente-septice. Cu toate acestea, determinarea concentrației în sânge pentru o citokină din aceste grupuri (de exemplu, TNF alfa sau IL-4) nu va reflecta în mod adecvat starea întregului echilibru de citokine. Prin urmare, este necesară o evaluare într-o etapă a nivelului mai multor mediatori (cel puțin 2-3 din subgrupurile opuse). În prezent, CJSC „Vector-Best” a dezvoltat și a produs serial kituri de reactivi pentru determinarea cantitativă a: factorului de necroză tumorală-alfa (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interferon gamma (sensibilitate - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukină-4 (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); interleukina-8 (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); antagonist al receptorilor interleukinei-1 (IL-1RA) (sensibilitate - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); interferon alfa (sensibilitate - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); anticorpi autoimuni la alfa-interferon (sensibilitate - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Toate trusele sunt concepute pentru a determina concentrația acestor citokine în fluidele biologice umane, în supernatante de cultură atunci când se studiază capacitatea culturilor de celule umane de a produce citokine in vitro. Principiul analizei este o variantă „sandwich” a unei faze solide în trei etape (timp de incubație - 4 h) sau în două etape (timp de incubare - 3,5 h) test imunosorbent enzimatic legat pe plăci. Testul necesită 100 pl de fluid biologic sau supernatant de cultură per godeu. Contabilitatea rezultatelor - spectrofotometric la o lungime de undă de 450 nm. În toate trusele, cromogenul este tetrametilbenzidina. Termenul de valabilitate al kiturilor noastre a fost prelungit la 18 luni de la data emiterii și la 1 lună de la începutul utilizării. Analiza datelor din literatura de specialitate a arătat că conținutul de citokine din plasma sanguină a persoanelor sănătoase depinde atât de trusele utilizate pentru a le determina, cât și de regiunea în care trăiesc acești oameni. Prin urmare, pentru a afla valorile concentrațiilor normale de citokine la rezidenții din regiunea noastră, am analizat probe aleatorii de plasmă (de la 80 la 400 de probe) de donatori de sânge practic sănătoși, reprezentanți ai diferitelor grupuri sociale cu vârsta cuprinsă între 18 și 60 de ani fără manifestări clinice ale patologiei somatice brute și absența anticorpilor HBsAg. împotriva virusurilor HIV, hepatitei B și C.

Factor de necroză tumorală-alfa.

TNF-alfa este o citokină proinflamatorie pleiotropă formată din două lanțuri b alungite cu o greutate moleculară de 17 kDa și care îndeplinesc funcții de reglare și efectoare în răspunsul imun și inflamație. Principalii producători de alfa-TNF sunt monocitele și macrofagele. Această citokină este secretată și de limfocitele și granulocitele din sânge, de celulele naturale ucigașe și de liniile de celule limfocitare T. Principalii inductori ai alfa-TNF sunt virușii, microorganismele și produsele metabolismului lor, inclusiv lipopolizaharida bacteriană. În plus, unele citokine, cum ar fi IL-1, IL-2, factorul de stimulare a coloniilor granulocite-macrofage, alfa și beta-INF, pot juca, de asemenea, rolul de inductori. Principalele direcții ale activității biologice a alfa-TNF: prezintă citotoxicitate selectivă în raport cu unele celule tumorale; activează granulocite, macrofage, celule endoteliale, hepatocite (producerea de proteine de fază acută), osteoclaste și condrocite (resorbția țesutului osos și cartilajal), sinteza altor citokine pro-inflamatorii; stimulează proliferarea și diferențierea: neutrofile, fibroblaste, celule endoteliale (angiogeneză), celule hematopoietice, limfocite T și B; îmbunătățește fluxul de neutrofile din măduva osoasă în sânge; are activitate antitumorală și antivirală in vivo și in vitro; participă nu numai la reacțiile de apărare, ci și la procesele de distrugere și reparare care însoțesc inflamația; servește ca unul dintre mediatorii distrugerii țesuturilor, care este comună în inflamațiile cronice prelungite.

Orez. 1. Distribuția nivelului de alfa-TNF

în plasma donatorilor sănătoși.

Un nivel crescut de alfa-TNF se observă în serul sanguin în timpul stării post-traumatice, cu disfuncții pulmonare, încălcări ale cursului normal al sarcinii, cancer, astm bronșic. Nivelul alfa-TNF este de 5-10 ori mai mare decât norma se observă cu o exacerbare a formei cronice a hepatitei virale C. În perioada de exacerbare a bolilor tractului gastro-intestinal, concentrația de alfa-TNF în ser depășește norma de 10 ori în medie, iar la unii pacienți - 75–80 de ori. Concentrații mari de alfa-TNF se găsesc în lichidul cefalorahidian la pacienții cu scleroză multiplă și meningită cerebrospinală și la pacienții cu poliartrită reumatoidă - în lichidul sinovial. Acest lucru sugerează implicarea TNF alfa în patogeneza unui număr de boli autoimune. Frecvența detectării alfa-TNF în serul sanguin, chiar și cu inflamație severă, nu depășește 50%, cu producție indusă și spontană - până la 100%. Gama de concentrații de alfa-TNF a fost 0-6 pg / ml, media - 1,5 pg / ml (Fig. 1).

Interferon gamma.

Orez. 2. Distribuția nivelului IFN-gamma

în plasma donatorilor sănătoși.

Interleukina-4

IL-4 este o glicoproteină cu o greutate moleculară de 18-20 kDa, un inhibitor natural al inflamației. Împreună cu IFN-gamma, IL-4 este o citokină cheie produsă de celulele T (în principal limfocite TH-2). Suportă echilibrul TH-1 / TH-2. Principalele direcții ale activității biologice a IL-4: ameliorează eozinofilia, acumularea de mastocite, secreția de IgG4, răspuns imun umoral mediat de TH-2; posedă activitate antitumorală locală, stimulând populația de limfocite T citotoxice și infiltrarea tumorii de către eozinofile; inhibă eliberarea citokinelor inflamatorii (alfa-TNF, IL-1, IL-8) și a prostaglandinelor din monocitele activate, producerea de citokine de către limfocitele TH-1 (IL-2, gamma-INF etc.).

Orez. 3. Distribuția nivelului de IL-4 în plasmă

donatori sănătoși.

Un nivel crescut de IL-4 atât în ser, cât și în limfocitele stimulate poate fi observat în bolile alergice (în special în momentul exacerbării), cum ar fi astmul bronșic, rinita alergică, febra fânului, dermatita atopică, în bolile tractului gastro-intestinal. Nivelul IL-4 este, de asemenea, semnificativ crescut la pacienții cu hepatită cronică C (CHC). În perioadele de exacerbare a CHC, cantitatea sa crește de aproape 3 ori comparativ cu norma, iar în timpul remisiei CHC, nivelul IL-4 scade, în special pe fondul tratamentului cu IL-2 recombinant. Gama de concentrații de IL-4 a fost de 0-162 pg / ml, media a fost de 6,9 pg / ml, intervalul normal a fost de 0-20 pg / ml (Fig. 3).

Interleukina-8

IL-8 aparține chemokinelor, este o proteină cu o greutate moleculară de 8 kDa. IL-8 este produs de fagocite mononucleare, leucocite polimorfonucleare, celule endoteliale și alte tipuri de celule ca răspuns la diferiți stimuli, inclusiv bacterii și viruși și produsele lor metabolice, inclusiv citokinele proinflamatorii (de exemplu, IL-1, alfa-TNF). Rolul principal al interleukinei-8 este de a spori chemotaxia leucocitelor. Acesta joacă un rol important atât în inflamația acută, cât și în cea cronică. Un nivel crescut de IL-8 este observat la pacienții cu infecții bacteriene, boli pulmonare cronice și boli ale tractului gastro-intestinal. Nivelurile plasmatice ale IL-8 sunt crescute la pacienții cu sepsis, iar concentrațiile mari sunt asociate cu creșterea mortalității. Rezultatele măsurării conținutului de IL-8 pot fi utilizate pentru a monitoriza cursul tratamentului și a prezice rezultatul bolii. Astfel, un conținut crescut de IL-8 a fost găsit în lichidul lacrimal la toți pacienții cu un curs favorabil de ulcere corneene. La toți pacienții cu un curs complicat de ulcer corneean, concentrația de IL-8 a fost de 8 ori mai mare decât la pacienții cu un curs favorabil al bolii. Astfel, conținutul de citokine proinflamatorii (în special IL-8) în lichidul lacrimal din ulcerele corneene poate fi utilizat ca criteriu de prognostic pentru evoluția acestei boli.

Orez. 4. Distribuirea nivelului IL-8 în

plasma donatorilor sănătoși (Novosibirsk).

Conform datelor noastre și publicate, la persoanele sănătoase, IL-8 este detectată extrem de rar în serul sanguin; producția spontană de IL-8 de către celulele mononucleare din sânge este observată la 62%, iar producția indusă la 100% din donatorii sănătoși. Gama de concentrații de IL-8 a fost de 0-34 pg / ml, media a fost de 2 pg / ml, intervalul normal a fost de 0-10 pg / ml (Fig. 4).

Orez. 5. Distribuția nivelului de IL-8 în plasmă

donatori sănătoși (Rubtsovsk).

Antagonist al receptorului interleukinei-1.

IL-1RA aparține citokinelor, este o oligopeptidă cu o greutate moleculară de 18-22 kDa. IL-1RA este un inhibitor endogen al IL-1, produs de macrofage, monocite, neutrofile, fibroblaste și celule epiteliale. IL-1RA inhibă activitatea biologică a interleukinelor IL-1alpha și IL-1beta, concurând cu acestea pentru legarea de receptorul celular.

Orez. 6. Distribuția nivelului IL-1RA

în plasma donatorilor sănătoși

Producția de IL-1RA este stimulată de multe citokine, produse virale și proteine de fază acută. IL-1RA poate fi exprimat activ în focare inflamatorii într-o varietate de boli cronice: artrita cronică reumatoidă și juvenilă, lupus eritematos sistemic, leziuni cerebrale ischemice, boli inflamatorii intestinale, astm bronșic, pielonefrita, psoriazis și altele. În sepsis, se observă cea mai mare creștere a IL-1RA - până la 55 ng / ml în unele cazuri și s-a constatat că concentrațiile crescute de IL-1RA se corelează cu un prognostic favorabil. Nivelurile ridicate de IL-1RA sunt observate la femeile cu obezitate ridicată, iar acest nivel scade semnificativ în decurs de 6 luni după liposucție. Gama de concentrații de IL-1RA a fost 0-3070 pg / ml, media a fost de 316 pg / ml. Intervalul normal este de 50-1000 pg / ml (Fig. 6).

Alfa interferon.

Alfa-IFN este o proteină monomerică neglicozilată cu o greutate moleculară de 18 kDa, care este sintetizată în principal de leucocite (limfocite B, monocite). Această citokină poate fi, de asemenea, produsă de practic orice tip de celulă ca răspuns la o excitație adecvată, iar infecțiile virale intracelulare pot fi stimulatori puternici ai sintezei IFN-alfa. Inductorii alfa-IFN includ: viruși și produsele lor, printre care locul principal este ocupat de ARN-uri cu dublă catenă produse în timpul replicării virale, precum și bacterii, micoplasme și protozoare, citokine și factori de creștere (cum ar fi IL-1, IL- 2, alfa -FNO, factori de stimulare a coloniei etc.). Reacția inițială de apărare a răspunsului imun antibacterian nespecific al organismului include inducerea IFN alfa și beta. În acest caz, este produs de celule care prezintă antigen (macrofage) care au invadat bacteriile. Interferonii (inclusiv alfa-IFN) joacă un rol important în legătura nespecifică a răspunsului imun antiviral. Ele sporesc rezistența antivirală prin inducerea în celule a sintezei enzimelor care suprimă formarea acizilor nucleici și a proteinelor virusurilor. În plus, au un efect imunomodulator, sporesc expresia antigenelor din complexul principal de histocompatibilitate din celule. O modificare a conținutului de alfa-IFN a fost detectată în hepatită și ciroză hepatică de etiologie virală. În momentul exacerbării infecțiilor virale, concentrația acestei citokine crește semnificativ la majoritatea pacienților, iar în perioada de convalescență scade la un nivel normal. S-a demonstrat o relație între nivelul seric al alfa-INF și severitatea și durata infecției gripale.

Orez. 7. Distribuția nivelului alfa-IFN

în plasma donatorilor sănătoși.

O creștere a concentrației de alfa-IFN este observată în serul majorității pacienților care suferă de boli autoimune, cum ar fi poliartrita, poliartrita reumatoidă, spondiloza, artrita psoriazică, polimialgia reumatică și sclerodermia, lupusul eritematos sistemic și vasculita sistemică. Un nivel ridicat al acestui interferon este, de asemenea, observat la unii pacienți în timpul unei exacerbări a ulcerului peptic și a colelitiazei. Gama de concentrații de alfa-INF a fost 0-93 pg / ml, media a fost de 20 pg / ml. Intervalul normal este de până la 45 pg / ml (Fig. 7).

Anticorpi împotriva alfa-IFN.

Anticorpii împotriva alfa-IFN pot fi detectați în serul pacienților cu lupus eritematos somatic. Inducerea spontană a anticorpilor împotriva alfa-IFN este observată și în serul pacienților cu diferite forme de cancer. În unele cazuri, anticorpi împotriva alfa-IFN au fost găsiți în serurile pacienților infectați cu HIV, precum și în lichidul cefalorahidian și serurile pacienților cu meningită în timpul fazei acute, în serurile pacienților cu poliartrită cronică.

Orez. 8. Distribuția nivelului de anticorpi față de alfa-IFN

în plasma donatorilor sănătoși.

Alfa-IFN este unul dintre medicamentele terapeutice antivirale și antitumorale eficiente, dar utilizarea sa pe termen lung poate duce la producerea de anticorpi specifici împotriva alfa-IFN. Acest lucru reduce eficacitatea tratamentului și, în unele cazuri, provoacă diverse efecte secundare: de la gripă la dezvoltarea bolilor autoimune. Având în vedere acest lucru, în timpul terapiei cu INF, este important să se controleze nivelul anticorpilor împotriva alfa-INF în corpul pacientului. Formarea lor depinde de tipul de medicament utilizat în terapie, de durata tratamentului și de tipul de boală. Gama de concentrații de anticorpi împotriva alfa-IFN a fost de 0-126 ng / ml, media a fost de 6,2 ng / ml. Intervalul normal este de până la 15 ng / ml (Fig. 8). Evaluarea nivelului de citokine folosind kituri de reactivi disponibile comercial la CJSC „Vector-Best” permite o nouă abordare a studiului stării sistemului imunitar al organismului în practica clinică.

Medicamente imunotrope pe bază de citokine.

Muncă interesantă S. Simbirtseva, Institutul de Cercetare de Stat pentru Biologici Foarte Puri, Ministerul Sănătății din Rusia, Sankt Petersburg. Citokinele pot fi izolate într-un nou sistem independent de reglare a funcțiilor principale ale corpului, care există împreună cu reglarea nervoasă și endocrină. și este în primul rând asociat cu menținerea homeostaziei în timpul introducerii agenților patogeni și a încălcării integrității țesuturilor. Această nouă clasă de molecule de reglare a fost creată de natură pe parcursul a milioane de ani de evoluție și are un potențial nelimitat de utilizare ca medicamente. În cadrul sistemului imunitar, citokinele mediază relația dintre răspunsurile nespecifice de apărare și imunitatea specifică, acționând în ambele direcții. La nivelul corpului, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea reacțiilor de apărare. Forța motrice a studiului intensiv al citokinelor a fost întotdeauna perspectiva promițătoare a utilizării lor clinice pentru tratamentul bolilor răspândite, inclusiv a cancerului, a bolilor infecțioase și a imunodeficienței. Mai multe medicamente de citokine sunt înregistrate în Rusia, inclusiv interferoni, factori de stimulare a coloniilor, interleukine și antagoniștii acestora, factor de necroză tumorală. Toate preparatele de citokine pot fi împărțite în preparate naturale și recombinate. Preparatele naturale sunt preparate cu diferite grade de purificare, obținute din mediul de cultură al celulelor eucariote stimulate, în principal celule umane. Principalele dezavantaje sunt gradul scăzut de purificare, imposibilitatea standardizării datorită numărului mare de componente și utilizarea componentelor sanguine în producție. Aparent, viitorul terapiei cu citokine este asociat cu medicamente modificate genetic obținute folosind cele mai recente progrese în biotehnologie. În ultimele două decenii, genele majorității citokinelor au fost clonate și s-au obținut analogi recombinați care repetă complet proprietățile biologice ale moleculelor naturale. În practica clinică, există trei domenii principale de utilizare a citokinelor:

1) terapia cu citokine pentru a activa reacțiile de apărare ale organismului, imunomodulare sau pentru a completa lipsa de citokine endogene,

2) terapia imunosupresoare anti-citokine care vizează blocarea acțiunii biologice a citokinelor și a receptorilor acestora,

3) terapia genică a citokinelor cu scopul de a spori imunitatea antitumorală sau de a corecta defectele genetice ale sistemului citokinelor.

Un număr de citokine pot fi utilizate clinic pentru uz sistemic și local. Administrarea sistemică este justificată în cazurile în care este necesar să se asigure acțiunea citokinelor în mai multe organe pentru o activare mai eficientă a imunității sau pentru a activa celulele țintă situate în diferite părți ale corpului. În alte cazuri, aplicația topică are o serie de avantaje, deoarece vă permite să obțineți o concentrație locală ridicată a principiului activ, să țineți organul-țintă și să evitați manifestările sistemice nedorite. În prezent, citokinele sunt considerate unul dintre cele mai promițătoare medicamente pentru utilizare în practica clinică.

Concluzie.

Astfel, în prezent nu există nicio îndoială că citokinele sunt cei mai importanți factori în imunopatogenie. Studiul nivelului de citokine permite obținerea de informații despre activitatea funcțională a diferitelor tipuri de celule imunocompetente, raportul proceselor de activare a ajutoarelor T de tipurile I și II, care este foarte important în diagnosticul diferențial al unui număr a proceselor infecțioase și imunopatologice. Citokinele sunt proteine specifice prin care celulele sistemului imunitar pot schimba informații și interacționa între ele. Astăzi, au fost descoperite peste o sută de citokine diferite, care sunt împărțite în mod convențional în pro-inflamatorii (provocând inflamații) și antiinflamatorii (prevenind dezvoltarea inflamației). Deci, diferitele funcții biologice ale citokinelor sunt împărțite în trei grupe: ele controlează dezvoltarea și homeostazia sistemului imunitar, controlează creșterea și diferențierea celulelor sanguine (sistemul hematopoietic) și participă la reacții de protecție nespecifice ale corpului, influențând inflamația inflamatorie procesele, coagularea sângelui, tensiunea arterială.

Lista literaturii folosite.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihailova. / Universitatea medicală de stat rusă, Centrul științific de stat de coloproctologie, Moscova și Institutul de cercetare de stat pentru biopreparări extrem de pure, Sankt Petersburg.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Jurnalul "Citokine și inflamație", 2005, nr. 1 T. 4, nr. 1. P.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov, materiale de lucru ale SA "Vector-Best".

A.S.Simbirtsev, Institutul de Cercetare de Stat pentru Biologici Foarte Puri, Ministerul Sănătății din Rusia, Sankt Petersburg.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Institutul de Cercetări de Stat pentru Biopreparări extrem de pure, Sankt Petersburg.

T.A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Dry-warm. Departamentul de Anestezie și Reanimatologie, Universitatea de Stat din Vladivostok.

În lucrările utilizate materialele de pe site-ul http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

anumiți agenți patogeni ai bolilor infecțioase. Deci, norsulfazolul ...

Imunitate antivirală mecanisme moleculare și celulare, modele de dezvoltare și imunopatho
Rezumat >> Medicină, sănătate
... „site” se referă la un anumit site un anumit polipeptidă (antigen) cu care ... etapele sale timpurii. Citokineși chimiochine. Alte citokine, pe lângă interferoni, ... produși de ei pe unitate de timp citokine determină intensitatea proliferării și ...
Studiul cauzelor dezvoltării fibrozei măduvei osoase în bolile mieloproliferative prin analiza efectului factorilor plachetari asupra celulelor stem mezenchimale
Teme >> Medicină, sănătate
Diverse concentrări; - cantitativ definiție proteinele din sistemele experimentale ... duc la acțiune prelungită citokină, care îmbunătățește procesul de fibroză ... trombocite. De asemenea, a crescut conținutul citokină a fost găsit în urină ...
Patogenia tuberculozei la om
Rezumat >> Medicină, sănătate
Dar alimentar este, de asemenea, posibil. Un anumit joacă un rol în infecția aerogenă ... joacă, secretată de macrofage și monocite citokină- factor de necroză tumorală (TNF). ... ioni, fiecare celulă posedă anumit un sistem care asigură transportul substanțelor ...

Citokinele sunt factori umorali cheie ai inflamației necesari pentru implementarea funcțiilor de protecție a imunității înnăscute. Trei grupuri de citokine sunt implicate în dezvoltarea inflamației - citokine inflamatorii sau proinflamatorii, chemokine, factori de stimulare a coloniilor, precum și factori corelați funcțional IL-12 și IFNy. Citokinele joacă, de asemenea, un rol important în suprimarea și controlul răspunsului inflamator. Citokinele antiinflamatorii includ factorul de creștere transformant β (TGFp), IL-10; deseori rolul factorului antiinflamator este jucat de IL-4.
Există 3 reprezentanți principali ai grupului de citokine pro-inflamatorii - TNFa, IL-1 și IL-6; relativ recent, IL-17 și IL-18 au fost adăugate la acestea. Aceste citokine sunt produse în principal de monocite și macrofage activate, predominant la locul inflamației. Citokinele proinflamatorii pot fi produse și de neutrofile, celule dendritice, limfocite B-, NK- și T activate. În centrul penetrării agentului patogen, citokinele sunt primele care sintetizează câteva macrofage inflamatorii locale. Apoi, în procesul de emigrare a leucocitelor din sânge, numărul de celule producătoare crește și spectrul lor se extinde. În special, celulele epiteliale, endoteliale, sinoviale, gliale și fibroblaste stimulate de produsele microorganismelor și factorii de inflamație sunt legate de sinteza citokinelor proinflamatorii. Genele citokinelor sunt clasificate ca inductibile. Inductorii naturali ai expresiei lor sunt agenții patogeni și produsele lor, acționând prin TLR și alți receptori patogeni. Inductorul clasic este LPS bacterian. În același timp, unele citokine proinflamatorii (IL-1, TNFa) sunt ele însele capabile să inducă sinteza citokinelor proinflamatorii.
Citokinele proinflamatorii sunt sintetizate și secretate destul de repede, deși cinetica sintezei diferitelor citokine din acest grup nu este aceeași. În cazuri tipice (opțiune rapidă), expresia mARN-ului lor este notată la 15-30 minute după inducție, apariția unui produs proteic în citoplasmă - după 30-60 minute, conținutul său în mediul extracelular atinge un maxim în 3- 4 ore. Sinteza citokinelor de către o celulă specifică continuă destul de scurt timp - de obicei puțin mai mult de o zi. Nu tot materialul sintetizat este secretat. O anumită cantitate de citokine este exprimată pe suprafața celulei sau conținută în granule citoplasmatice. Eliberarea granulelor poate provoca aceleași semnale de activare ca și producerea de citokine. Aceasta asigură un flux rapid (în decurs de 20 de minute) de citokine în focarul leziunii.
Citokinele proinflamatorii îndeplinesc multe funcții. Rolul lor principal este „organizarea” răspunsului inflamator (Fig. 2.55). Unul dintre cele mai importante și timpurii efecte ale citokinelor proinflamatorii este creșterea expresiei moleculelor de aderență pe celulele endoteliale, precum și asupra leucocitelor în sine, ceea ce duce la migrarea leucocitelor din sânge către focarul de inflamație (vezi secțiunea 2.3.3. ). În plus, citokinele induc o creștere a metabolismului oxigenului celulelor, exprimarea lor a receptorilor pentru citokine și alți factori de inflamație, stimularea producției de citokine, peptide bactericide etc. Citokinele proinflamatorii au un efect predominant local. Ingerarea de citokine proinflamatorii secretate excesiv în circulație contribuie la manifestarea efectelor sistemice ale inflamației și stimulează, de asemenea, producerea de citokine de către celulele aflate la distanță de focarul inflamației. La nivel sistemic, citokinele proinflamatorii stimulează producția de proteine de fază acută, determină o creștere a temperaturii corpului și acționează asupra

Orez. 2,55. Semnalizarea intracelulară declanșată de citokinele pro-inflamatorii și mecanismele de activare a genelor pro-inflamatorii

sistemele endocrine și nervoase și, în doze mari, conduc la dezvoltarea efectelor patologice (carnea la șoc, similară cu cea septică).
IL-1 este denumirea colectivă pentru o familie de proteine de peste 11 molecule. Funcția majorității dintre ele este necunoscută, cu toate acestea 5 molecule - IL-1a (conform clasificării moderne - IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) și IL-33 (IL-1F11) sunt citokine active.
IL-1a și IL-1P sunt denumite în mod tradițional IL-1 deoarece interacționează cu același receptor și efectele lor nu se pot distinge. Genele acestor citokine sunt localizate în brațul lung al cromozomului 2 uman. Omologia dintre ele la nivelul nucleotidelor este de 45%, la nivelul aminoacizilor - 26%. Ambele molecule au o structură pliată în p: conțin 6 perechi de straturi p antiparalele și au o formă de trifoi. Celulele sintetizează o moleculă precursor cu o greutate moleculară de aproximativ 30 kDa, lipsită de peptide semnal, ceea ce indică un mod neobișnuit de procesare a moleculei IL-1. Greutatea moleculară a proteinelor mature este de aproximativ 18 kDa.
IL-1a există în trei forme - intracelular (o moleculă solubilă este prezentă în citosol și îndeplinește funcții de reglare), membrană (molecula este livrată la suprafața celulei printr-un mecanism similar reciclării receptorilor și este ancorată în membrană) și secreție (molecula este secretată în forma sa originală, dar suferă procesare - clivare prin proteaze extracelulare cu formarea unei citokine active cu greutatea de 18 kDa). Varianta principală a moleculei IL-1a la om este varianta cu membrană. În această formă, efectul citokinei este mai pronunțat, dar se manifestă doar local.
Prelucrarea IL-1P are loc în interiorul celulei cu participarea unei enzime specializate, IL-1 convertaza (caspaza 1), situată în lizozomi.
Această enzimă este activată ca parte a inflammosomului - o structură temporară supramoleculară care include, pe lângă caspaza 1 inactivă, receptori intracelulari ai familiei NLR (vezi secțiunea 2.2.3) - NOD1, NOD2, IPAF etc., care determină dezvoltarea a unui semnal de activare. Acest lucru are ca rezultat formarea factorului de transcripție NF-kB și inducerea genelor pro-inflamatorii, precum și activarea inflammosomului și a caspazei 1 conținute în acesta. Enzima activă clivează molecula precursor IL-1P și citokina matură rezultată cu o greutate moleculară de 18 kDa este secretată de celulă.
IL-1a, IL-1P și antagonistul receptorilor de IL-1 împart receptori comuni care sunt exprimați spontan pe multe tipuri de celule. Când celulele sunt activate, numărul receptorilor de membrană pentru IL-1 crește pe ele. Principalul, IL-1RI, conține 3 domenii asemănătoare imunoglobulinei în partea extracelulară. Partea sa intracelulară reprezintă domeniul TIR, care este similar din punct de vedere structural cu domeniile TLR analoage și declanșează aceleași căi de semnalizare (vezi secțiunea 2.2.1). Numărul acestor receptori este mic (200-300 pe celulă), dar au o afinitate mare pentru IL-1 (Kd este de 10-11 M). Un alt receptor, IL-1RII, nu are o componentă de semnalizare în partea citoplasmatică, nu transmite un semnal și servește ca receptor de momeală. Transducția semnalului de la IL-1RI implică aceiași factori ca și pentru TLR (de exemplu, MyD88, IRAK și TRAF6), ceea ce duce la rezultate similare - formarea factorilor de transcripție NF-kB și AP-1, care determină expresia la fel un set de gene (vezi Fig. 2.12). Aceste gene sunt responsabile pentru sinteza citokinelor proinflamatorii, chemokinelor, moleculelor de aderență, enzimelor care asigură acțiunea bactericidă a fagocitelor și a altor gene ale căror produse sunt implicate în dezvoltarea răspunsului inflamator. IL-1 în sine aparține produselor, a căror secreție este indusă de IL-1, adică în acest caz, se declanșează o buclă de feedback pozitiv.
Orice celule din corp pot fi potențial ținte ale IL-1. În cea mai mare măsură, acțiunea sa afectează celulele endoteliale, toate tipurile de leucocite, celulele cartilajului și țesutului osos, celulele sinoviale și epiteliale, multe tipuri de celule nervoase. Sub influența IL-1, este indusă expresia a peste 100 de gene; cu participarea sa se realizează peste 50 de reacții biologice diferite. Principalele efecte ale IL-1 sunt emigrarea leucocitelor și activarea activității lor fagocitare și bactericide. Acestea afectează, de asemenea, sistemul de coagulare și tonusul vascular, determinând caracteristicile hemodinamicii în centrul inflamației. IL-1 are un efect multifacetic asupra celulelor nu numai a imunității înnăscute, ci și a adaptării, stimulând de obicei manifestările ambelor.
IL-1 are multe efecte sistemice. Stimulează producția de proteine de fază acută de către hepatocite, atunci când acționează asupra centrului de termoreglare a hipotalamusului, provoacă dezvoltarea febrei, participă la dezvoltarea manifestărilor sistemice ale procesului inflamator (de exemplu, stare de rău, scăderea poftei de mâncare, somnolență, adinamie), care este asociată cu acțiunea IL-1 asupra sistemului nervos central. Prin îmbunătățirea expresiei receptorilor pentru factorii de stimulare a coloniilor, IL-1 îmbunătățește hematopoieza, care este asociată cu efectul său radioprotector. IL-1 stimulează eliberarea leucocitelor din măduva osoasă, în primul rând neutrofile, inclusiv cele imature, ceea ce duce la apariția leucocitozei în timpul inflamației și la o deplasare a formulei leucocitelor spre stânga (acumularea de forme celulare imature). Efectele IL-1 afectează funcțiile autonome și chiar și activitatea nervoasă mai mare (modificări ale răspunsurilor comportamentale etc.). Condrocitele și osteocitele pot fi, de asemenea, ținte ale IL-1, care este asociată cu capacitatea IL-1 de a provoca distrugerea cartilajului și a oaselor atunci când acestea sunt implicate în procesul inflamator și, invers, hiperplazia țesuturilor patologice (panus în reumatoidă artrită). Efectul dăunător al IL-1 se manifestă și în șocul septic, afectarea articulațiilor în artrita reumatoidă și o serie de alte procese patologice.
Duplicarea efectelor IL-1 ale produselor bacteriene este asociată cu necesitatea reproducerii multiple a efectului activator al agenților patogeni fără diseminarea acestora. Microorganismele stimulează numai celulele din imediata apropiere a locului de intrare, în primul rând macrofagele locale. Apoi, același efect este reprodus de multe ori de moleculele IL-1p. Îndeplinirea acestei funcții de către IL-1 este facilitată de exprimarea receptorilor lor de către aproape toate celulele corpului la activare (apare în primul rând în centrul inflamației).
Antagonistul receptorului IL-1 (IL-1RA) este omolog cu IL-1a și IL-1P (omologia este de 26% și respectiv 19%). Interacționează cu receptorii IL-1, dar nu poate transmite un semnal către celulă. Ca urmare, IL-1RA acționează ca un antagonist specific al IL-1. IL-1RA este secretată de aceleași celule ca și IL-1, acest proces nu necesită participarea caspazei 1. Producția de IL-1RA este indusă de aceiași factori ca sinteza IL-1, dar o parte din aceasta este produsă spontan de macrofage și hepatocite. Ca urmare, acest factor este prezent în mod constant în serul sanguin. Acest lucru este probabil necesar pentru a preveni consecințele negative ale acțiunii sistemice a IL-1, care este produsă în cantități semnificative în inflamația acută. IL-1RA recombinant este testat în prezent ca medicament în tratamentul bolilor inflamatorii cronice (poliartrită reumatoidă etc.)
IL-18 este o citokină pro-inflamatorie legată de IL-f: este sintetizată și ca precursor convertit de caspaza 1; interacționează cu un receptor, a cărui parte citoplasmatică conține domeniul TIR și transmite un semnal care duce la activarea NF-kB. Ca urmare, apare activarea tuturor genelor pro-inflamatorii, dar este mai puțin pronunțată decât cu acțiunea IL-1. O proprietate separată a IL-18 este inducerea (în special în combinație cu IL-12) a sintezei IFNy de către celule. În absența IL-12, IL-18 induce sinteza antagonistului IFNy, IL-4 și promovează dezvoltarea reacțiilor alergice. Acțiunea IL-18 este limitată de antagonistul solubil care îl leagă în faza lichidă.
IL-33 este structural foarte asemănător cu IL-18. Prelucrarea IL-33 are loc și cu participarea caspazei 1. Cu toate acestea, această citokină diferă de ceilalți membri ai familiei IL-1 în funcțiile pe care le îndeplinește. Particularitatea acțiunii IL-33 se datorează în mare măsură faptului că receptorul său este exprimat selectiv pe celulele Ig2. În acest sens, IL-33 promovează secreția de ^ 2-citokine IL-4, IL-5, IL-13 și dezvoltarea proceselor alergice. Nu are un efect pro-inflamator semnificativ.
Factorul de necroză tumorală a (TNFa sau TNFa) este un membru al unei alte familii de proteine semnificative imunologic. Este o citokină pro-inflamatorie cu un spectru larg de activitate. TNFa are o structură b-fold. Este sintetizat ca o moleculă de membrană activă funcțional pro-TNFa cu o greutate moleculară de 27 kDa, care este o proteină transmembranară de tip II (adică, partea sa N-terminală este direcționată în celulă). Ca rezultat al proteolizei, se formează un monomer solubil cu o greutate moleculară de 17 kDa în domeniul extracelular. Monomerii TNFa formează spontan un trimer de 52 kDa reprezentând forma principală a acestei citokine. Trimerul are o formă în formă de clopot și subunitățile sunt conectate prin capetele lor C, fiecare conținând 3 site-uri de legare cu receptorul, în timp ce capetele N nu sunt conectate între ele și nu participă la interacțiunea cu receptorii (și , prin urmare, în îndeplinirea funcțiilor lor de către citokină). La valorile pH-ului acid, TNFa dobândește o structură helicoidală, ceea ce determină o schimbare a unora dintre funcțiile sale, în special citotoxicitatea crescută. TNF este un membru prototip al familiei numeroase de molecule din superfamilia TNF (Tabelul 2.31). Include limfotoxinele a și b (doar prima există într-o formă solubilă), precum și multe molecule de membrană implicate în interacțiunile intercelulare (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), care vor fi menționate mai jos în diverse contexte. Conform nomenclaturii moderne, numele membrilor superfamiliei constă dintr-o abreviere TNFSF și un număr de serie (pentru TNFa - TNFSF2, pentru limfotoxina a - TNFSF1).
Tabelul 2.31. Reprezentanții principali ai familiilor factorului de necroză tumorală și ai receptorilor săi

Factor (ligand)	Chro mosom	Greutate moleculară, kDa	Receptor
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimer - 52; formă glicozilată - 25,6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Limfotoxina (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Limfotoxina B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
TRAIL (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
APRILIE (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
LUMINĂ (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Principalii producători de TNFa, precum IL-1, sunt monocitele și macrofagele. De asemenea, este secretat de neutrofile, celulele endoteliale și epiteliale, eozinofile, mastocitele, limfocitele B și T atunci când sunt implicate în procesul inflamator. TNFa este detectat în fluxul sanguin mai devreme decât alte citokine proinflamatorii - deja la 20-30 de minute după inducerea inflamației, care este asociată cu „descărcarea” formei de membrană a moleculei de către celule și, eventual, și cu eliberarea de TNFa în conținutul granulelor.
Există 2 tipuri de receptori TNF, obișnuiți pentru TNFa și limfotoxina a - TNFRI (din receptorul factorului de necroză tumorală I) și TNFRII cu greutăți moleculare de 55 și respectiv 75 kDa. TNFRI este prezent pe aproape toate celulele corpului, cu excepția eritrocitelor, iar TNFRII este prezent în principal pe celulele sistemului imunitar. TNFR formează o familie numeroasă care include molecule implicate în interacțiunea celulară și inducerea morții celulare - apoptoză. Afinitatea TNFa pentru TNFRI este mai mică decât pentru TNFRII (aproximativ 5x10-10 M și, respectiv, 55x10-11 M.) Când se leagă trimerul TNFa, are loc trimerizarea receptorilor săi, necesară pentru transmiterea semnalului.
Caracteristicile transmiterii semnalului de la acești receptori sunt în mare parte determinate de structura părții lor intracelulare. Partea citoplasmatică a TNFRI este reprezentată de așa-numitul domeniu al morții, din care sunt recepționate semnale care duc la activarea mecanismului de apoptoză; TNFRII nu are un domeniu al morții. Semnalizarea de la TNFRI are loc cu participarea proteinelor adaptoare TRADD (domeniu de deces asociat TNFR) și FADD (domeniu de deces asociat cu Fas), care conțin și domenii de deces. În plus față de calea care duce la dezvoltarea apoptozei (prin activarea caspazei 8 sau sinteza ceramidei), se disting mai multe căi de semnalizare, care sunt activate cu participarea factorilor TRAF2 / 5 și RIP-1. Primul dintre acești factori transmite un semnal de-a lungul căii care duce la activarea factorului NF-kB, adică prin calea clasică de inducere a genelor pro-inflamatorii (vezi Fig. 2.55). Calea de semnalizare activată de factorul RIP-1 duce la activarea cascadei MAP cu produsul final, factorul de transcripție AP-1. Acest factor include gene care asigură activarea celulelor și previn dezvoltarea apoptozei. Astfel, soarta celulară este determinată de echilibrul mecanismelor pro- și anti-apoptotice declanșate atunci când TNFa se leagă de TNFRI.
Implementarea funcțiilor TNFa este în principal asociată cu acțiunea prin TNFRI - oprirea genei corespunzătoare duce la dezvoltarea imunodeficienței severe, în timp ce consecințele inactivării genei TNFRII sunt nesemnificative. La vârful răspunsului inflamator, receptorii TNFa pot fi „aruncați” din membrană și eliberați în spațiul intercelular, unde se leagă TNFa, exercitând un efect antiinflamator. În acest sens, formele solubile de TNFR sunt utilizate în tratamentul bolilor inflamatorii cronice. Sa dovedit că medicamentul pe bază de TNFRII solubil sa dovedit a fi cel mai eficient din punct de vedere clinic.
La fel ca IL-1, TNFa îmbunătățește expresia moleculelor de aderență, sinteza citokinelor și chemokinelor proinflamatorii, proteinelor de fază acută, enzimelor celulelor fagocitare etc. Împreună cu IL-1, TNFa este implicat în formarea tuturor localităților majore, precum și a unor manifestări sistemice ale inflamației. Activează celulele endoteliale, stimulează angiogeneza, îmbunătățește migrația și activează leucocitele. TNFa afectează activarea și proliferarea limfocitelor într-o măsură mai mare decât IL-1. În combinație cu IFNy, TNFa induce activitatea de NO sintază în fagocite, ceea ce sporește semnificativ potențialul lor bactericid. TNFa stimulează proliferarea fibroblastelor, favorizând vindecarea rănilor. Odată cu producția locală crescută de TNFa, predomină procesele de afectare a țesuturilor, manifestate prin dezvoltarea necrozei hemoragice. În plus, TNFa inhibă activitatea lipoproteinei lipazei, care slăbește lipogeneza și duce la dezvoltarea cașexiei (una dintre denumirile originale pentru TNFa este cachexina). O eliberare crescută de TNFa și acumularea acestuia în circulație, de exemplu, sub acțiunea unor doze mari de superantigene bacteriene, determină dezvoltarea unei patologii severe - șoc septic. Astfel, acțiunea TNFa, care vizează îndeplinirea unei funcții de protecție și menținerea homeostaziei, poate fi însoțită de efecte toxice severe (locale și sistemice), care sunt adesea cauza decesului.
IL-6 este o citokină pro-inflamatorie cu spectru larg. De asemenea, servește ca factor prototipic în familia citokinelor, care include, pe lângă IL-6 în sine, oncostatina M (OSM), factorul inhibitor al leucemiei (LIF), factorul neurotrofic ciliar (CNTF), cardiotropina-1 (CT-1) ) și IL-11 și IL-31. Greutatea moleculară a IL-6 este de 21 kDa. IL-6 este produs de monocite și macrofage, celule endoteliale, epiteliale, gliale, musculare netede, fibroblaste, limfocite T de tip Th2, precum și multe celule tumorale. Producția de IL-6 de către celulele mieloide este indusă atunci când TLR-ul lor interacționează cu microorganismele și produsele lor, precum și sub influența IL-1 și TNFa. În același timp, în decurs de 2 ore, conținutul de IL-6 în plasma sanguină crește de 1000 de ori.
Receptorii pentru toți factorii din familia IL-6 conțin o componentă comună - lanțul gp130, care este prezent în aproape toate celulele corpului. A doua componentă a receptorului este individuală pentru fiecare citokină. Lanțul specific al receptorului IL-6 (gp80) este responsabil pentru legarea acestei citokine, în timp ce gp130 este implicat în transducția semnalului, deoarece este asociat cu tirozin kinazele Jak1 și Jak2. Când IL-6 interacționează cu receptorul, se declanșează următoarea secvență de evenimente: monomerul IL-6 interacționează cu lanțul gp80, apare dimerizarea complexelor (2 molecule de citokine - 2 lanțuri gp80), după care se atașează 2 lanțuri gp130 complexul, care duce la fosforilarea Jak-kinazei. Acestea din urmă fosforilează factorii STAT1 și STAT3, care dimerizează, se deplasează în nucleu și leagă promotorii genelor țintă. Lanțul gp80 este ușor spălat de pe celulă; în formă liberă, interacționează cu citokina, inactivând-o, adică acționează ca un inhibitor specific al IL-6.
IL-6 este implicat în inducerea aproape întregului complex de manifestări locale de inflamație. Afectează migrația fagocitelor, crescând producția de chimiochine CC care atrag monocite și limfocite și slăbește producția de chimiochine CX care atrag neutrofile. Efectele proinflamatorii ale IL-6 sunt mai slabe decât cele ale IL-1 și TNFa, spre deosebire de care nu crește, ci inhibă producția de citokine proinflamatorii (IL-1, TNFa și IL-6) și chemokine de către celulele implicate. în procesul inflamator. Astfel, IL-6 combină proprietățile citokinelor pro și antiinflamatoare și este implicată nu numai în dezvoltare, ci și în limitarea răspunsului inflamator.
IL-6 este principalul factor care induce expresia genelor proteinelor de fază acută în hepatocite. IL-6 influențează diferite etape ale hematopoiezei, inclusiv proliferarea și diferențierea celulelor stem. Acesta servește ca factor de creștere pentru celulele plasmatice imature, îmbunătățind semnificativ răspunsul imun umoral. IL-6 afectează, de asemenea, limfocitele T, crescând activitatea celulelor T citotoxice.
IL-17 și citokine înrudite. Un grup de citokine, inclusiv speciile IL-17, a atras atenția pe scară largă în legătură cu descoperirea unui tip special de ajutoare T - Th17, care este implicat în dezvoltarea unor forme dăunătoare de reacții inflamatorii, în special în procese autoimune (a se vedea secțiunea 3.4.3.2). Rolul acestor citokine în răspunsurile răspunsului imun adaptiv va fi discutat mai jos. Aici oferim doar o descriere generală a citokinelor și luăm în considerare pe scurt rolul acestora în reacțiile imunității înnăscute.
Familia IL-17 include 6 proteine, desemnate prin literele de la A la F. Proprietățile citokinelor pro-inflamatorii ale acestora sunt IL-17A și IL-17F. Sunt homodimeri legați de disulfură; greutatea lor moleculară este de 17,5 kDa. Aceste citokine sunt produse de Th17 menționate, precum și de celulele T CD8 +, eozinofile și neutrofile. IL-23 stimulează dezvoltarea celulelor TH7 și producerea de IL-17.
Receptorii pentru IL-17 sunt exprimați de mai multe celule - epiteliale, fibroblaste, celule ale sistemului imunitar, în special neutrofile. Rezultatul principal al interacțiunii IL-17 cu receptorul este, la fel ca și cu acțiunea altor citokine proinflamatorii, în inducerea factorului NF-kB și exprimarea a numeroase gene de inflamație dependente de NF-KB.
Unul dintre efectele biologice importante ale IL-17 (împreună cu IL-23) este menținerea homeostaziei neutrofilelor. Aceste citokine sporesc producția de neutrofile prin stimularea producției de G-CSF. În același timp, o creștere sau o scădere a producției de IL-17 și IL-23 este reglementată de numărul de neutrofile din țesuturile periferice: o scădere a numărului acestor celule ca urmare a apoptozei duce la o creștere a producerea de citokine.
Efectul proinflamator al IL-17 se realizează în principal printr-o creștere a producției altor citokine (IL-8, IL-6, y-CSF, un număr de chemokine) și prin exprimarea moleculelor de aderență. La șoareci transgenici pentru IL-17 sau IL-23, se dezvoltă inflamație cronică sistemică de natură interstițială, cu infiltrare de neutrofile, eozinofile, macrofage și limfocite ale diferitelor organe. Aceste citokine sunt recunoscute ca fiind un rol principal în dezvoltarea bolilor autoimune cronice.
Familia IL-12
IL-12 a fost identificat pentru capacitatea sa de a activa celulele NK, de a induce proliferarea limfocitelor T și de a induce sinteza IFNy. IL-12 ocupă un loc special printre citokinele produse de celulele sistemului imunitar înnăscut, deoarece acesta (la fel ca principalii săi producători, celulele dendritice) servește ca o legătură între imunitatea înnăscută și adaptativă. Pe de altă parte, IL-12 face parte din tandemul IL-12-IFNy, care joacă un rol cheie în apărarea imună împotriva agenților patogeni intracelulari.
IL-12 este un dimer compus din subunitățile p40 și p35. Greutatea sa moleculară totală este de 75 kDa. Activitatea funcțională a IL-12 este asociată cu subunitatea sa p40. IL-12 "la scară completă" este secretată de monocite activate, macrofage, celule dendritice mieloide, neutrofile și celule epiteliale ale țesuturilor barieră (produc atât subunități de citokine Ig-12p35, cât și IL-12p40). Majoritatea celulelor corpului sintetizează doar subunitatea funcțională inactivă ^ -12p35. Cantitatea de heterodimer IL-12 secretată de celulă este limitată de subunitatea p35. IL-12p40 este sintetizat în exces și se poate dimeriza pentru a forma un homodimer care acționează ca antagonist IL-12, precum și ca chimioatractor. Inductorii de producție IL-12 sunt în principal agenți patogeni recunoscuți de TLR și de alți receptori de recunoaștere a modelelor. Producția de IL-12 este sporită de IL-1, IFNy, precum și de interacțiunile intercelulare mediate de CD40-CD154 și alte perechi de molecule ale familiilor - TNFR.
Receptorul IL-12 este cel mai puternic exprimat pe celulele NK, celulele TH activate și limfocitele T citotoxice și, într-o măsură mai mică, pe celulele dendritice. Expresia receptorului IL-12 de către celulele T activate este îmbunătățită sub influența IL-12, IFNy, IFNa, TNFa și la costimulare prin receptorul CD28. Receptorul pentru IL-12 este un dimer format din subunitățile IL-12RP1 (100 kDa) și IL-12RP2 (130 kDa, CD212), cu care este asociată o proteină de 85 kDa. Atât lanțurile Pj cât și p2 sunt implicate în legarea IL-12, în timp ce subunitatea IL-12RP2 este implicată predominant în transducția semnalului. Domeniul intracelular al lanțului Pj este asociat cu kinaza JAK2, domeniul intracelular al lanțului P2 este asociat cu kinaza Tyk2. Kinazele fosforilează factorii de transcripție STAT1, STAT3, STAT4 și STAT5.
Funcția principală a IL-12, datorită capacității sale de a stimula limfocitele citotoxice (NK și T) și de a induce diferențierea celulelor Thl (a se vedea secțiunea 3.4.3.1), este de a declanșa mecanisme de apărare celulară împotriva agenților patogeni intracelulari. IL-12 acționează asupra celulelor NK și NKT deja în stadiile incipiente ale proceselor imune, sporind proliferarea și activitatea citotoxică a celulelor NK, iar mai târziu asupra limfocitelor T citotoxice și sinteza IFNy de către toate aceste celule. Ceva mai târziu, IL-12 induce diferențierea celulelor Thl, care produc și IFNy. Condiția pentru inducerea celulelor Thl este expresia preliminară a subunității receptorului IL-12RP2 de către celulele T CD4 + activate. După aceea, celulele dobândesc capacitatea de a lega IL-12, ceea ce duce la activarea factorului STAT4, care reglează expresia genelor caracteristice celulelor Thl (pentru exprimarea genei IFNG, acțiunea factorului de transcripție T -pariul este mai important). În același timp, IL-12 suprimă diferențierea celulelor ^ 2 și slăbește producția de celule
Seria B de anticorpi din clasele IgE și IgA. Acționând asupra APC-urilor dendritice și a altor, IL-12 induce expresia moleculelor costimulatoare (CD80 / 86 etc.), precum și a produselor APC MHC-II. Astfel, IL-12 joacă un rol de legătură între imunitatea înnăscută și adaptivă și îmbunătățește mecanismele imune responsabile de protecția împotriva agenților patogeni și tumorilor intracelulare.
Familia IL-12 include IL-23, IL-27 și IL-35. Aceste citokine sunt heterodimeri: IL-23 este format din două subunități - I-23p19 și IL-12p40 (identice cu subunitatea corespunzătoare a IL-12), IL-27 - de subunitățile Ebi3 și IL-27p28, IL-35 - de subunitățile Ebi3 și IL-12p35. Aceste citokine sunt produse în principal de celule dendritice. Producția de citokine din familia IL-12 este declanșată de PAMP și citokine prezente pe agenți patogeni, în special GM-CSF.
Recepția IL-23 este realizată de două structuri diferite: subunitatea IL-12p40 este recunoscută de lanțul p al receptorului pentru IL-12, iar subunitatea R-23p19 este recunoscută de un receptor special, IL-23R. STAT4 joacă rolul principal în transmiterea semnalului de la IL-23. Receptorul pentru IL-27 activează moleculele WSX-1 (un omolog al subunității p2 a IL-12R) și gp130 (un lanț polipeptidic care face parte din receptorii pentru citokinele din familia IL-6).
La fel ca IL-12, IL-23 și IL-27 acționează predominant asupra celulelor T CD4 +, promovând diferențierea lor de-a lungul căii Th1. Caracteristicile IL-23 - un efect predominant asupra celulelor T de memorie, precum și capacitatea de a sprijini dezvoltarea asistenților T de tip Th17. IL-27 diferă de celelalte două citokine ale familiei prin capacitatea sa de a induce proliferarea celulelor T CD4 + activate, dar și în repaus. Recent, s-a arătat că IL-27 și IL-35 pot acționa ca factori de reglare (supresori), deoarece subunitatea lor Ebi3 este ținta factorului cheie al celulelor T de reglementare FOXP3.
Factorii de stimulare a coloniei (LCR) (Tabelul 2.32) sau hematopoietinele sunt reprezentați de trei citokine - GM-CSF, G-CSF și M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) este aproape funcțional de ele. Acești factori sunt numiți factori de stimulare a coloniilor, deoarece au fost identificați mai întâi prin capacitatea lor de a susține creșterea in vitro a coloniilor de celule hematopoietice din compoziția corespunzătoare. IL-3 are cel mai larg spectru de acțiune, deoarece susține dezvoltarea oricărei colonii de celule hematopoietice, cu excepția celulelor limfoide. GM-CSF susține dezvoltarea atât a coloniilor mixte de granulocite-monocite, cât și a coloniilor de granulocite și monocite / macrofage. G-CSF și M-CSF sunt specializate în menținerea creșterii și diferențierii coloniilor lor respective. Acești factori nu numai că asigură supraviețuirea și proliferarea celulelor hematopoietice de acest tip, dar sunt, de asemenea, capabili să activeze celule diferențiate deja mature (M-CSF - macrofage, G-CSF - neutrofile). M-CSF este implicat în diferențierea monocitelor în macrofage și inhibă diferențierea monocitelor în celule dendritice. G-CSF, pe lângă faptul că acționează asupra ramurii granulocitice a hematopoiezei, determină mobilizarea celulelor stem hematopoietice din măduva osoasă în fluxul sanguin.
Tabelul 2.32. Caracterizarea factorilor de stimulare a coloniilor

Nume nie	Chromo somn	Greutate moleculară, kDa	Celulele producători	Celulele ţintă	Reţetă tori
GM-CSF	5q	22	Macrofage, celule T, celule NK, celule stromale, celule epiteliale	Macrofage, neutrofile, eozinofile, celule T, celule dendritice, celule hematopoietice	GM- CSFR a / R
G-CSF	17q	18-22		Neutrofile, eozinofile, celulele T, celulele hematopoietice	G-CSFR (1 lanț)
M-CSF	5q	45/70 (dimer)	Macrofage, celule stromale, celule epiteliale	Macrofage, hematopoietic celule	c-Fms
Factorul celulei stem	12q	32	Stromal celule	Celule hematopoietice, celule B, mastocite	c-Kit
Flt-3- ligand	19q	26,4	Stromal celule	Celule hematopoietice, mastocite	Flt-3

G-CSF, GM-CSF și IL-3 sunt caracterizate structural ca hematopoietine care conțin 4 domenii a-elicoidale. Receptorii lor conțin 2 lanțuri polipeptidice, aparțin familiei receptorilor de hematopoietină. M-CSF este diferit de alte CSF-uri. Este o moleculă dimerică și există atât în forme solubile, cât și în forme legate de membrană. Receptorul său are domenii extracelulare de tip Ig și un domeniu intracelular cu activitate de tirozin kinază (numele acestei proto-oncogene kinaze - c-Fms - este uneori transferată către întregul receptor). Când M-CSF se leagă de receptori, apare dimerizarea și activarea kinazei acestora.
Factorii de stimulare a coloniei sunt produși de celulele endoteliale și fibroblaste, precum și de monocite / macrofage. GM-CSF și IL-3 sunt, de asemenea, sintetizate de către limfocitele T. Sub influența produselor bacteriene (prin receptori de recunoaștere a modelelor) și a citokinelor proinflamatorii, sinteza și secreția factorilor de stimulare a coloniilor crește semnificativ, ceea ce duce la o creștere a mielopoiezei. Granulocitopoieza este stimulată în special puternic, care este însoțită de o emigrare accelerată a celulelor, inclusiv a celor imature, la periferie. Acest lucru creează o imagine a leucocitozei neutrofile cu o schimbare a formulei spre dreapta, care este foarte caracteristică inflamației. Preparatele pe bază de GM- și G-CSF sunt utilizate în practica clinică pentru a stimula granulocitopoieza slăbită de efectele citotoxice (radiații, chimioterapie pentru tratamentul bolilor tumorale etc.). G-CSF este utilizat pentru mobilizarea celulelor stem hematopoietice, urmat de utilizarea leucomasei induse pentru a restabili hematopoieza afectată.
Factorul celulelor stem (SCF - factorul celulelor stem, ligandul c-kit) este secretat de celulele stromale ale măduvei osoase (fibroblaste, celule endoteliale), precum și de diferite tipuri de celule în timpul dezvoltării embrionare. SCF există ca moleculă transmembranară și solubilă (aceasta din urmă se formează ca rezultat al clivajului proteolitic al părții extracelulare). SCF este detectat în plasma sanguină. Molecula sa are două legături disulfurice. Receptorul SCF, c-Kk, are activitate de tirozin kinază și este similar din punct de vedere structural cu Flt-3 și c-Fms (receptorul M-CSF). Când SCF se leagă, receptorii sunt dimerizați și fosforilați. Transmiterea semnalului are loc cu participarea PI3K și a cascadei MAP.
Mutațiile genei SCF și ale receptorului acesteia au fost mult timp descrise (mutații din oțel); la șoareci, acestea se manifestă printr-o schimbare a culorii hainei și o încălcare a hematopoiezei. Mutațiile care perturbă sinteza formei de membrană a factorului provoacă defecte grave în dezvoltarea embrionului. Împreună cu alți factori, SCF este implicat în menținerea viabilității celulelor stem hematopoietice, asigură proliferarea lor și susține etapele incipiente ale hematopoiezei. SCF este important în special pentru dezvoltarea eritropoiezei și mastocitelor și servește, de asemenea, ca factor de creștere pentru timocite în stadiile DN1 și DN2.
În ceea ce privește structura și activitatea biologică, factorul Flt-3L- (ligand 3 al tirozinkinazei asemănător Fms) posedă proprietăți similare cu SCF, în combinație cu alți factori care susțin stadiile incipiente ale mielopoiezei și dezvoltarea limfocitelor B. SCF joacă rolul unui factor de creștere pentru mieloblastele leucemice.
Chimiochinele, care sunt un factor umoral important în inflamație și imunitatea înnăscută, sunt discutate mai sus în descrierea chimiotaxiei leucocitelor (vezi secțiunea 2.3.2).

Ce este terapia cu citokine

Acțiune pozitivă

Oncoimunologie și citokine terapie

Funcțiile citokinelor în organism

Citokinele ca medicamente

Efecte secundare

Pentru cine nu este potrivită metoda terapiei cu citokine

Costul terapiei cu citokine

Imunitate antivirală mecanisme moleculare și celulare, modele de dezvoltare și imunopatho

Studiul cauzelor dezvoltării fibrozei măduvei osoase în bolile mieloproliferative prin analiza efectului factorilor plachetari asupra celulelor stem mezenchimale

Patogenia tuberculozei la om