Mwitikio wa mnyororo wa polymerase (PCR)

Kiini cha njia ya PCR. DNA polymerase

Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase ni njia ya majaribio ya biolojia ya molekuli ambayo inaruhusu mtu kufikia ongezeko kubwa la viwango vidogo vya vipande fulani vya asidi ya nucleic katika nyenzo za kibiolojia. Utaratibu huu wa kuongeza idadi ya nakala za DNA unaitwa ukuzaji. Kunakili DNA wakati wa PCR hufanywa na enzyme maalum - polima. DNA polymerase (Kielelezo 3) ni kimeng'enya kinachohusika katika urudufishaji (ukuzaji wa DNA katika viumbe hai) wa DNA. Enzymes za darasa hili huchochea upolimishaji wa deoxyribonucleotidi pamoja na msururu wa nyukleotidi za DNA, ambazo kimeng'enya "husoma" na kutumia kama kiolezo. Aina ya nucleotide mpya imedhamiriwa na kanuni ya ukamilishano na template ambayo inasomwa.

DNA polymerase huongeza nyukleotidi za bure kwenye mwisho wa 3 "wa mnyororo uliokusanyika. Hii inasababisha kupanua kwa mnyororo katika mwelekeo wa 5"-3. Hakuna polimasi za DNA zinazojulikana ambazo zina uwezo wa kuunda mnyororo kutoka mwanzo: zinaweza kuongeza tu nyukleotidi. kwa kikundi kilichopo 3"-hydroxyl. Kwa sababu hii, DNA polymerase inahitaji primer- mlolongo mfupi wa nyukleotidi (kawaida 20-25), inayosaidia sehemu za mwisho za jeni inayosomwa - ambayo angeweza kuongeza nyukleotidi ya kwanza. Primers daima huwa na besi za DNA na RNA, na besi mbili za kwanza daima zikiwa misingi ya RNA. Primers hutengenezwa na enzyme nyingine - primase. Enzyme nyingine helikosi- ni muhimu kwa ajili ya kufuta helix ya DNA mbili ili kuunda muundo wa kamba moja, ambayo inahakikisha replication ya nyuzi zote mbili kwa mujibu wa mfano wa nusu ya kihafidhina wa replication ya DNA.

Baadhi ya polima za DNA pia zina uwezo wa kusahihisha makosa katika uzi mpya wa DNA uliokusanywa. Ikiwa jozi isiyo sahihi ya nyukleotidi hugunduliwa, DNA polymerase inarudi nyuma hatua moja, huondoa nyukleotidi isiyo sahihi kutoka kwa mnyororo, kisha huingiza moja sahihi mahali pake, baada ya hapo kurudia kunaendelea kama kawaida.

Kufanya PCR

Polymerase chain reaction (PCR) ni mbinu ya ukuzaji wa DNA ambayo inaweza kutumika kutenga na kuzidisha mlolongo maalum wa DNA mabilioni ya mara ndani ya saa chache. Uwezo wa kupata idadi kubwa ya nakala za eneo moja lililofafanuliwa madhubuti la jenomu hurahisisha sana utafiti wa sampuli iliyopo ya DNA.

Ili kutekeleza mmenyuko wa mnyororo wa polymerase, masharti kadhaa lazima yatimizwe. Ili kutekeleza PCR katika kesi rahisi zaidi, vifaa vifuatavyo vinahitajika:

Kiolezo cha DNA kilicho na sehemu ya DNA inayohitaji kuimarishwa.

Primers mbili zinazosaidia mwisho wa kipande unachotaka. (Jozi za oligonucleotidi zilizoundwa kiholela, kawaida huanzia 15 hadi 30 bp, sawa na sehemu zinazolingana za DNA inayolengwa. Zina jukumu muhimu katika uundaji wa bidhaa za mmenyuko wa ukuzaji. Vitangulizi vilivyochaguliwa kwa usahihi huhakikisha umaalumu na unyeti wa mfumo wa mtihani.)

Thermostable DNA polymerase. Polymerasi inayotumiwa katika PCR lazima ibaki hai kwa joto la juu kwa muda mrefu, kwa hivyo vimeng'enya vilivyotengwa na thermophiles hutumiwa - Thermus aquaticus (Taq polymerase) na zingine.

Deoxynucleotide triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ioni za Mg 2+ zinazohitajika ili polima ifanye kazi.

Suluhisho la bafa ambalo hutoa hali muhimu ya athari - pH, nguvu ya ionic ya suluhisho. Ina chumvi, serum albumin.

Ili kuzuia uvukizi wa mchanganyiko wa mmenyuko, ongeza mafuta ya moto sana, kama Vaseline, kwenye bomba la majaribio. Ikiwa unatumia kifaa kilicho na kifuniko cha joto, hii haihitajiki.

Kuongezewa kwa pyrophosphatase kunaweza kuongeza mavuno ya mmenyuko wa PCR. Kimeng'enya hiki huchochea hidrolisisi ya pyrofosfati, dondoo ya kuongezwa kwa trifosfati ya nukleotidi kwenye uzi wa DNA unaokua, kwa orthofosfati. Pyrofosfati inaweza kuzuia athari ya PCR.

Ili kuzidisha idadi ya nakala za DNA ya asili, mmenyuko wa mzunguko unahitajika. Kama sheria, kila moja ya mizunguko ya PCR inayorudiwa mara kwa mara ina hatua tatu:

1. Denaturation, au "kuyeyuka" kwa DNA. Kiolezo cha DNA chenye ncha mbili hupashwa joto hadi 94 - 96? C (au hadi 98? C ikiwa polimasi inayoweza joto inatumika) kwa dakika 0.5 - 2 ili nyuzi za DNA zitengane. Hatua hii inaitwa denaturation kwa sababu vifungo vya hidrojeni kati ya nyuzi mbili za DNA zimevunjwa. Wakati mwingine, kabla ya mzunguko wa kwanza (kabla ya kuongeza polymerase), mchanganyiko wa majibu huwashwa moto kwa dakika 2 - 5 ili kupotosha kabisa matrix na primers. Mbinu hii inaitwa moto kuanza, inakuwezesha kupunguza kiasi cha bidhaa zisizo maalum za majibu.

2. Annealing - kuunganisha kwa primers kwa kiolezo DNA. Mara tu minyororo ikitengana, halijoto hupunguzwa polepole ili kuruhusu vianzio kuwasiliana na kiolezo chenye ncha moja. Joto la anneal hutegemea muundo wa primers na kawaida huchaguliwa kwa 50-65 ° C. Muda wa hatua ni sekunde 20 - 60. Uchaguzi usio sahihi wa hali ya joto ya annealing husababisha kuunganishwa vibaya kwa primers kwenye kiolezo (kwa halijoto ya juu sana) au kufunga mahali pasipofaa na kuonekana kwa bidhaa zisizo maalum (kwa joto la chini sana).

3. Usanisi (kurefusha mnyororo). DNA polimasi hunakili uzi wa kiolezo kwa kutumia kitangulizi kama kianzio. Polima huanza usanisi wa uzi wa pili kutoka mwisho wa 3" wa kianzio, ambao umeshikamana na kiolezo na kusogea kando ya kiolezo. Halijoto ya kurefusha urefu hutegemea polima. Polima za Taq na Pfu zinazotumika mara kwa mara hufanya kazi zaidi zikiwa 72. C. Muda wa usanisi unategemea aina ya polimerasi ya DNA na urefu wa kipande kilichokuzwa. Kwa kawaida, muda wa kurefusha huchukuliwa kuwa dakika moja kwa kila jozi elfu za msingi. Baada ya mizunguko yote kukamilika, hatua ya ziada mara nyingi hufanywa. mwinuko wa mwisho, ili kukamilisha vipande vyote vya nyuzi moja. Hatua hii huchukua dakika 7-10.

Baadaye, hatua za denaturation, annealing na elongation hurudiwa mara nyingi (mara 30 au zaidi). Katika kila mzunguko, idadi ya nakala zilizounganishwa za kipande cha DNA huongezeka maradufu.

Athari zote hufanyika katika mirija ya majaribio iliyotumbukizwa kwenye kidhibiti halijoto. Kubadilisha utawala wa joto na kudumisha hufanyika moja kwa moja.

Ili kuelewa hasa jinsi sehemu maalum ya DNA inavyokuzwa wakati wa PCR, unahitaji kufikiria wazi nafasi ya primers zote na mlolongo wao wa ziada katika nyuzi zilizokuzwa katika kila pande zote. Katika raundi ya kwanza, kila moja ya minyororo iliyosasishwa ina urefu mkubwa zaidi kuliko umbali kutoka kwa kikundi cha 3"-hydroxyl cha msingi wake hadi nyukleotidi ya mwisho ya mlolongo unaosaidiana na utangulizi wa pili. Minyororo kama hiyo inaitwa "violezo virefu" ; ni juu yao kwamba usanisi zaidi utafanyika.

Katika raundi ya pili, DNA yenye nyuzi mbili, inayojumuisha nyuzi zinazofanana na mpya (kiolezo cha muda mrefu), hupunguzwa tena na kisha kuunganishwa na primers. Wakati wa usanisi katika duru hii, "templates ndefu" huunganishwa tena, na vile vile nyuzi kadhaa zilizo na primer mwisho mmoja na mlolongo unaosaidia utangulizi wa pili kwa upande mwingine ("templates fupi"). Wakati wa raundi ya tatu, heteroduplexes zote zilizoundwa hapo awali zinabadilishwa wakati huo huo na kuingizwa na primers, na kisha kuigwa. Katika raundi zinazofuata, kuna "matrices fupi" zaidi na zaidi, na kwa raundi ya 30 idadi yao tayari ni mara 10 6 zaidi kuliko idadi ya minyororo ya awali au "matrices ndefu".

Kiasi cha bidhaa mahususi ya majibu (kinachopunguzwa na vianzio) kinaongezeka kinadharia kwa uwiano wa 2n, ambapo n ni idadi ya mizunguko ya majibu. Kwa kweli, ufanisi wa kila mzunguko unaweza kuwa chini ya 100%, kwa hivyo katika hali halisi:

ambapo P ni kiasi cha bidhaa, E ni wastani wa ufanisi wa mzunguko.

Idadi ya nakala za "muda mrefu" za DNA pia huongezeka, lakini kwa mstari, hivyo kipande maalum kinatawala katika bidhaa za majibu. Ukuaji wa bidhaa zinazohitajika ni mdogo kwa kiasi kikubwa na idadi ya vitendanishi, uwepo wa vizuizi, na uundaji wa bidhaa.

PCR ni njia nyeti sana, kwa hivyo, ikiwa sampuli ya jaribio ina kiasi kidogo cha DNA ambacho kimepitishwa kwa bahati mbaya kutoka kwa mchanganyiko mmoja wa majibu hadi mwingine, matokeo chanya ya uwongo yanaweza kupatikana. Hii inafanya kuwa muhimu kudhibiti kwa uangalifu suluhisho zote na vyombo vya glasi vinavyotumiwa kwa PCR.

Kanuni za msingi za uteuzi wa primer.

Wakati wa kuunda mfumo wa mtihani wa PCR, moja ya kazi kuu ni uteuzi sahihi wa primers, ambayo lazima ikidhi vigezo kadhaa:

1. Primers lazima iwe maalum. Uangalifu hasa hulipwa kwa 3" mwisho wa primers, kwa kuwa ni kutoka kwao kwamba Taq polymerase huanza kukamilisha mlolongo wa ziada wa DNA. Ikiwa maalum yao haitoshi, basi kuna uwezekano kwamba michakato isiyofaa itatokea katika tube ya mtihani na mchanganyiko wa majibu, yaani, usanisi wa DNA isiyo maalum (vipande vifupi au virefu) Inaonekana kwenye electrophoresis kwa namna ya bendi nzito au nyepesi za ziada. Hii inaingilia kati na tathmini ya matokeo ya majibu, kwa kuwa ni rahisi kuchanganya maalum bidhaa ya ukuzaji yenye DNA ya kigeni iliyosanisishwa. Baadhi ya vianzio na dNTP hutumika katika usanisi wa DNA isiyo mahususi, ambayo husababisha hasara kubwa ya unyeti.

2. Primers haipaswi kuunda dimers na loops, i.e. nyuzi mbili thabiti hazipaswi kutengenezwa kama matokeo ya viambatisho vinavyojifunga wenyewe au kwa kila mmoja.

Ambayo inakuwezesha kuchunguza kiasi kidogo cha, au tuseme, vipande vyake katika nyenzo za kibiolojia, na kuzizidisha mara nyingi. Kisha hutambuliwa kwa kuibua na electrophoresis ya gel. Mwitikio huo ulianzishwa mnamo 1983 na K. Mullis na umejumuishwa katika orodha ya uvumbuzi bora wa miaka ya hivi karibuni.

Je! ni mifumo gani ya PCR

Mbinu nzima inategemea uwezo wa asidi ya nucleic kuiga kwa kujitegemea, ambayo katika kesi hii inafanywa kwa bandia katika maabara. Uzazi wa DNA hauwezi kuanza katika eneo lolote la molekuli, lakini tu katika maeneo yenye mlolongo fulani wa nucleotide - vipande vya kuanzia. Ili mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi uanze, vianzio (au vichunguzi vya DNA) vinahitajika. Hizi ni vipande vifupi vya mlolongo wa DNA na mlolongo fulani wa nyukleotidi. Ni za ziada (yaani zinalingana) na tovuti za kuanzia

Bila shaka, ili kuunda primers, wanasayansi wanapaswa kuchunguza mlolongo wa nyukleotidi wa yule anayehusika katika mbinu hiyo. Ni uchunguzi huu wa DNA ambao hutoa maalum ya mmenyuko na kuanzishwa kwake. haitafanya kazi ikiwa sampuli haina angalau molekuli moja ya DNA inayotakiwa. Kwa ujumla, primers hapo juu, seti ya nyukleotidi, na polymerase ya DNA isiyo na joto inahitajika kutekeleza majibu. Mwisho ni kimeng'enya ambacho huchochea mwitikio wa usanisi wa molekuli mpya za asidi ya nukleiki kulingana na sampuli. Dutu hizi zote, ikiwa ni pamoja na nyenzo za kibiolojia ambayo DNA inahitaji kugunduliwa, imeunganishwa katika mchanganyiko wa majibu (suluhisho). Imewekwa kwenye thermostat maalum, ambayo hufanya joto la haraka sana na baridi ndani ya muda fulani - mzunguko. Kawaida kuna 30-50 kati yao.

Je, mwitikio huu hutokeaje?

Kiini chake ni kwamba wakati wa mzunguko mmoja, primers huunganishwa kwenye sehemu zinazohitajika za DNA, baada ya hapo ni mara mbili chini ya hatua ya enzyme. Kulingana na nyuzi za DNA zinazosababisha, vipande zaidi na zaidi vinavyofanana vya molekuli vinaunganishwa katika mizunguko inayofuata.

Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase huendelea kwa mlolongo; hatua zifuatazo zinajulikana. Ya kwanza ina sifa ya kuongeza mara mbili kiasi cha bidhaa wakati wa kila mzunguko wa joto na baridi. Katika hatua ya pili, mmenyuko hupungua kama kimeng'enya kinaharibiwa na pia kupoteza shughuli. Kwa kuongeza, hifadhi za nucleotides na primers zimepungua. Katika hatua ya mwisho - uwanda - bidhaa hazikusanyiki tena kwa sababu vitendanishi vimeisha.

Inatumika wapi?

Bila shaka, mmenyuko wa mnyororo wa polymerase hutumiwa sana katika dawa na sayansi. Inatumika kwa ujumla na biolojia maalum, dawa za mifugo, maduka ya dawa na hata ikolojia. Aidha, katika mwisho wao hufanya hivyo ili kufuatilia ubora wa vitu vya chakula na mazingira. Mwitikio wa mnyororo wa polymerase hutumiwa kikamilifu katika mazoezi ya uchunguzi ili kuthibitisha ubaba na kutambua utambulisho wa mtu. Katika dawa ya uchunguzi, na vile vile katika paleontolojia, mbinu hii mara nyingi ndiyo njia pekee ya kutokea, kwani kwa kawaida kiasi kidogo sana cha DNA kinapatikana kwa utafiti. Bila shaka, njia hiyo imepata matumizi makubwa sana katika dawa ya vitendo. Inahitajika katika maeneo kama vile genetics, magonjwa ya kuambukiza na magonjwa ya oncological.

Walakini, wakati huo wazo hili lilibaki bila madai. Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase uligunduliwa tena mnamo 1983 na Kary Mullis. Kusudi lake lilikuwa kuunda njia ambayo ingeruhusu DNA kukuzwa kupitia marudio mengi mfululizo ya molekuli ya asili ya DNA kwa kutumia kimeng'enya cha DNA polymerase. Miaka 7 baada ya kuchapishwa kwa wazo hili, mnamo 1993, Mullis alipokea Tuzo la Nobel kwa hilo.

Mwanzoni mwa kutumia njia, baada ya kila mzunguko wa kupokanzwa-baridi, polymerase ya DNA ilipaswa kuongezwa kwenye mchanganyiko wa mmenyuko, kwa kuwa ilizimwa haraka kwa joto la juu linalohitajika kutenganisha nyuzi za helix ya DNA. Utaratibu haukuwa na ufanisi sana na ulihitaji muda mwingi na enzyme. Mnamo 1986 iliboreshwa sana. Imependekezwa kutumia DNA polymerases kutoka kwa bakteria thermophilic. Enzymes hizi ziligeuka kuwa thermostable na ziliweza kuhimili mizunguko mingi ya athari. Matumizi yao yalifanya iwezekane kurahisisha na kufanya PCR kiotomatiki. Moja ya polimasi za kwanza za DNA zinazoweza joto zilitengwa na bakteria Thermus aquaticus na jina Taq-polymerase. Ubaya wa polimerasi hii ni kwamba uwezekano wa kuanzisha nyukleotidi yenye makosa ni mkubwa sana, kwani kimeng'enya hiki hakina njia za kurekebisha makosa (3"→5" shughuli ya exonuclease). Polymerases Pfu Na Pwo, iliyotengwa na archaea, ina utaratibu kama huo; matumizi yao hupunguza kwa kiasi kikubwa idadi ya mabadiliko katika DNA, lakini kasi ya kazi yao (uchakataji) ni ya chini kuliko ile ya Taq. Siku hizi, mchanganyiko hutumiwa Taq Na Pfu kufikia kasi ya juu ya upolimishaji na usahihi wa juu wa kunakili.

Wakati wa uvumbuzi wa njia hiyo, Mullis alifanya kazi kwa Shirika la Cetus, ambalo lilikuwa na hati miliki ya njia ya PCR. Mnamo 1992, Cetus iliuza haki za mbinu na hataza ya kutumia Taq-kampuni ya polymerase Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) kwa $300 milioni. Hata hivyo, ikawa hivyo Taq-polymerase ilitambuliwa na mwanabiolojia wa Kirusi Alexei Kaledin mwaka wa 1980, na Promega alijaribu kumlazimisha Roche kuacha haki za kipekee kwa kimeng'enya hiki. Hati miliki ya Marekani ya mbinu ya PCR iliisha muda wake Machi 2005.

Kufanya PCR

Njia hiyo inategemea kunakili mara kwa mara kwa kuchagua sehemu fulani ya DNA kwa kutumia vimeng'enya chini ya hali ya bandia ( katika vitro) Katika kesi hii, ni sehemu tu ambayo inakidhi masharti maalum ndiyo inakiliwa, na tu ikiwa iko kwenye sampuli inayojifunza. Tofauti na ukuzaji wa DNA katika viumbe hai (replication), sehemu fupi za DNA hukuzwa kwa kutumia PCR. Katika mchakato wa kawaida wa PCR, urefu wa sehemu za DNA zilizonakiliwa sio zaidi ya jozi za msingi 3000 (3 kbp). Kutumia mchanganyiko wa polima mbalimbali, kwa kutumia viungio na chini ya hali fulani, urefu wa kipande cha PCR kinaweza kufikia jozi 20-40,000 za nucleotide. Hii bado ni chini sana kuliko urefu wa DNA ya kromosomu ya seli ya yukariyoti. Kwa mfano, jenomu la binadamu lina takriban jozi za msingi bilioni 3.

Vipengele vya majibu

Ili kutekeleza PCR katika kesi rahisi zaidi, vifaa vifuatavyo vinahitajika:

Matrix ya DNA, iliyo na sehemu ya DNA inayohitaji kuimarishwa.
Primers mbili, inayosaidiana na ncha tofauti za nyuzi tofauti za kipande cha DNA kinachohitajika.
Imetulia kwa joto DNA polymerase- enzyme ambayo huchochea mmenyuko wa upolimishaji wa DNA. Polymerase kwa matumizi ya PCR lazima ibaki hai kwa joto la juu kwa muda mrefu, kwa hivyo enzymes zilizotengwa na thermophiles hutumiwa - Thermus aquaticus(Taq polymerase), Pyrococcus hasira(Pfu polymerase), Pyrococcus woosei(Pwo polymerase) na wengine.
Deoxynucleoside triphosphates(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ ions muhimu kwa uendeshaji wa polymerase.
Suluhisho la bafa, kutoa hali muhimu ya mmenyuko - pH, nguvu ya ionic ya suluhisho. Ina chumvi, bovin serum albumin.

Ili kuzuia uvukizi wa mchanganyiko wa mmenyuko, ongeza mafuta ya moto sana, kama Vaseline, kwenye bomba la majaribio. Ikiwa unatumia mzunguko wa joto na kifuniko cha joto, hii haihitajiki.

Vitangulizi

Umaalumu wa PCR unategemea uundaji wa tata za ziada kati ya template na primers, oligonucleotides fupi za synthetic 18-30 besi kwa muda mrefu. Kila kitangulizi kinakamilisha moja ya nyuzi za kiolezo chenye ncha mbili na kuweka mipaka ya mwanzo na mwisho wa eneo lililokuzwa.

Baada ya mseto wa kiolezo na kichungi (kuunganisha), mwisho hutumika kama kitangulizi cha polimerasi ya DNA wakati wa usanisi wa uzi wa kiolezo cha ziada (tazama).

Tabia muhimu zaidi ya primers ni joto la kuyeyuka (Tm) la tata ya primer-matrix. T m ni joto ambalo nusu ya templates za DNA huunda tata na primer oligonucleotide. Kiwango cha kuyeyuka kinaweza kuamuliwa takriban na fomula, ambapo n X ni nambari ya nyukleotidi X kwenye primer. Ikiwa urefu na muundo wa nucleotide ya primer au joto la annealing huchaguliwa vibaya, uundaji wa sehemu za ziada za sehemu na mikoa mingine ya template ya DNA inawezekana, ambayo inaweza kusababisha kuonekana kwa bidhaa zisizo maalum. Upeo wa juu wa joto la kuyeyuka ni mdogo na joto la juu la hatua ya polymerase, shughuli ambayo hupungua kwa joto zaidi ya 80 ° C.

Wakati wa kuchagua primers, ni vyema kuzingatia vigezo vifuatavyo:

Kikuza sauti

Mchele. 1: Baiskeli kwa PCR

PCR inafanywa katika mzunguko wa joto - kifaa ambacho hutoa baridi na joto la mara kwa mara la mirija ya majaribio, kwa kawaida na usahihi wa angalau 0.1 °C. Baiskeli za kisasa hukuruhusu kuweka programu ngumu, ikijumuisha uwezo wa "kuanza moto", Touchdown PCR (tazama hapa chini) na uhifadhi unaofuata wa molekuli zilizokuzwa kwa 4 °C. Kwa PCR ya wakati halisi, vifaa vilivyo na detector ya fluorescent vinazalishwa. Pia kuna vifaa vilivyo na kifuniko cha moja kwa moja na compartment kwa microplates, ambayo inaruhusu kuunganishwa katika mifumo ya automatiska.

Maendeleo ya majibu

Picha ya gel iliyo na alama ya DNA (1) na bidhaa za majibu ya PCR (2,3). Nambari zinaonyesha urefu wa vipande vya DNA katika jozi za nyukleotidi

Kwa kawaida, PCR inahusisha mzunguko wa 20-35, ambayo kila mmoja ina hatua tatu (Mchoro 2).

Denaturation

Kiolezo cha DNA chenye nyuzi mbili hupashwa joto hadi 94-96°C (au hadi 98°C ikiwa polimasi inayoweza joto zaidi inatumiwa) kwa dakika 0.5-2 ili kutenganisha nyuzi za DNA. Hatua hii inaitwa denaturation, kwani vifungo vya hidrojeni kati ya nyuzi mbili za DNA huharibiwa. Wakati mwingine, kabla ya mzunguko wa kwanza (kabla ya kuongeza polymerase), mchanganyiko wa majibu ni preheated kwa dakika 2-5. kwa denaturation kamili ya template na primers. Mbinu hii inaitwa moto kuanza, inakuwezesha kupunguza kiasi cha bidhaa zisizo maalum za majibu.

Annealing

Mara tu nyuzi zitakapotengana, halijoto hupunguzwa ili kuruhusu vianzio kushikamana na kiolezo cha mshororo mmoja. Hatua hii inaitwa annealing. Joto la annealing hutegemea utungaji wa primers na kawaida huchaguliwa 4-5 ° C chini ya joto lao la kuyeyuka. Muda wa hatua - dakika 0.5-2. Uchaguzi usio sahihi wa hali ya joto ya annealing husababisha kuunganishwa vibaya kwa primers kwenye kiolezo (kwa halijoto ya juu sana) au kufunga mahali pasipofaa na kuonekana kwa bidhaa zisizo maalum (kwa joto la chini sana).

Kurefusha

Aina za PCR

PCR ya "Nested" (Nested PCR) hutumiwa kupunguza idadi ya bidhaa za athari. Jozi mbili za primers hutumiwa na athari mbili za mfululizo hufanyika. Jozi ya pili ya primers huongeza eneo la DNA ndani ya bidhaa ya mmenyuko wa kwanza.
"Inverted" PCR (Inverse PCR) - inatumika ikiwa eneo ndogo tu ndani ya mlolongo unaotaka linajulikana. Njia hii ni muhimu sana linapokuja suala la kuamua mlolongo wa jirani baada ya DNA kuingizwa kwenye jenomu. Ili kutekeleza PCR iliyoingia, mfululizo wa kupunguzwa kwa DNA na enzymes ya kizuizi hufanyika, ikifuatiwa na kuunganisha kwa vipande (ligation). Kama matokeo, vipande vinavyojulikana huishia kwenye ncha zote mbili za eneo lisilojulikana, baada ya hapo PCR inaweza kufanywa kama kawaida.
Reverse Transcription PCR (RT-PCR) hutumiwa kukuza, kutenga au kutambua mlolongo unaojulikana kutoka kwa maktaba ya RNA. Kabla ya PCR ya kawaida, molekuli ya DNA yenye ncha moja huunganishwa kwenye kiolezo cha mRNA kwa kutumia kinyume na cDNA yenye ncha moja hupatikana, ambayo hutumika kama kiolezo cha PCR. Njia hii mara nyingi huamua wapi na wakati jeni hizi zinaonyeshwa.
PCR isiyo ya kawaida PCR isiyo ya kawaida) - inafanywa wakati ni muhimu kuimarisha moja ya nyuzi za DNA ya awali. Hutumika katika baadhi ya mbinu za uchanganuzi wa mpangilio na uchanganuzi. PCR inafanywa kama kawaida, isipokuwa kwamba moja ya primers inachukuliwa kwa ziada kubwa.
Kiasi cha PCR (Q-PCR) hutumika kupima kwa haraka kiasi cha DNA, cDNA au RNA mahususi katika sampuli.
PCR ya muda halisi - njia hii hutumia vitendanishi vilivyo na lebo ya umeme ili kupima kwa usahihi kiasi cha athari ya bidhaa kadri inavyojikusanya.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - kwa kutumia njia hii, athari ya kumfunga isiyo maalum ya primers juu ya malezi ya bidhaa imepunguzwa. Mzunguko wa kwanza unafanywa kwa joto la juu ya joto la annealing, basi joto hupunguzwa kila mizunguko michache. Kwa halijoto fulani, mfumo utapita kwenye bendi ya umaalum bora wa primer kwa DNA.
Njia ya koloni ya Masi (PCR katika gel, Kiingereza. Polony - Ukoloni wa PCR) - gel ya acrylamide ni polymerized na vipengele vyote vya PCR juu ya uso na PCR hufanyika. Katika pointi zilizo na DNA iliyochambuliwa, amplification hutokea kwa kuundwa kwa makoloni ya molekuli.
PCR na ukuzaji wa haraka wa mwisho wa cDNA Ukuzaji wa haraka wa mwisho wa cDNA, RACE-PCR )
Sehemu ya muda mrefu ya PCR PCR ya muda mrefu) - marekebisho ya PCR kwa upanuzi wa sehemu zilizopanuliwa za DNA (besi elfu 10 au zaidi). Polymerasi mbili hutumiwa, moja ambayo ni Taq polymerase yenye mchakato wa juu (ambayo ni, uwezo wa kuunganisha mlolongo mrefu wa DNA kwa njia moja), na ya pili ni DNA polymerase yenye shughuli 3 "-5" endonuclease. Polymerase ya pili ni muhimu ili kurekebisha makosa yaliyoletwa na ya kwanza.
RAPD PCR Ukuzaji Nasibu wa Polymorphic DNA PCR , PCR yenye ukuzaji wa nasibu wa DNA ya polymorphic - hutumiwa wakati ni muhimu kutofautisha kati ya viumbe vilivyo karibu katika mlolongo wa maumbile, kwa mfano, aina tofauti za mimea iliyopandwa, mifugo ya mbwa au microorganisms zinazohusiana kwa karibu. Njia hii kawaida hutumia primer moja ndogo (20 - 25 bp). Kitangulizi hiki kitasaidia kwa sehemu kwa sehemu za nasibu za DNA ya viumbe vinavyochunguzwa. Kwa kuchagua hali (urefu wa primer, muundo wake, joto, nk), inawezekana kufikia tofauti ya kuridhisha katika muundo wa PCR kwa viumbe viwili.

Ikiwa mlolongo wa nucleotide wa template unajulikana kwa sehemu au haijulikani kabisa, unaweza kutumia primers degenerate, mlolongo ambao una nafasi za kuzorota ambazo besi yoyote inaweza kupatikana. Kwa mfano, mlolongo wa kwanza unaweza kuwa: ...ATH..., ambapo H ni A, T au C.

Utumiaji wa PCR

PCR hutumiwa katika maeneo mengi kwa majaribio na majaribio ya kisayansi.

Uchunguzi wa uchunguzi

PCR hutumiwa kulinganisha kile kinachoitwa "alama za vidole za maumbile." Sampuli ya nyenzo za kijeni kutoka eneo la uhalifu inahitajika - damu, mate, shahawa, nywele, nk. Hii inalinganishwa na nyenzo za maumbile za mtuhumiwa. Kiasi kidogo sana cha DNA kinatosha, kinadharia nakala moja. DNA imegawanywa katika vipande na kisha kukuzwa kwa kutumia PCR. Vipande vinatenganishwa kwa kutumia electrophoresis ya DNA. Picha inayotokana ya mpangilio wa bendi za DNA inaitwa alama za vidole vya maumbile(Kiingereza) alama za vidole vya maumbile).

Kuanzisha ubaba

Mchele. 3: Matokeo ya electrophoresis ya vipande vya DNA vilivyokuzwa na PCR. (1) Baba. (2) Mtoto. (3) Mama. Mtoto alirithi baadhi ya vipengele vya alama ya maumbile ya wazazi wote wawili, na kusababisha alama mpya, ya kipekee.

Ingawa alama za vidole za kijeni ni za kipekee (isipokuwa katika kesi ya mapacha wanaofanana), uhusiano wa kifamilia bado unaweza kuanzishwa kwa kutengeneza alama za vidole kadhaa (Mchoro 3). Njia hiyo hiyo inaweza kutumika, kubadilishwa kidogo, ili kuanzisha uhusiano wa mageuzi kati ya viumbe.

Uchunguzi wa kimatibabu

PCR inafanya uwezekano wa kuharakisha kwa kiasi kikubwa na kuwezesha utambuzi wa magonjwa ya urithi na virusi. Jeni ya kuvutia inakuzwa na PCR kwa kutumia vianzio vinavyofaa na kisha kupangwa ili kutambua mabadiliko. Maambukizi ya virusi yanaweza kugunduliwa mara baada ya kuambukizwa, wiki au miezi kabla ya dalili kuonekana.

Dawa ya kibinafsi

Inajulikana kuwa dawa nyingi hazifanyi kazi kwa wagonjwa wote ambao wamekusudiwa, lakini tu kwa 30-70% ya idadi yao. Aidha, dawa nyingi hugeuka kuwa sumu au allergenic kwa wagonjwa wengine. Sababu za hii ni kwa sehemu kutokana na tofauti za mtu binafsi katika unyeti na kimetaboliki ya madawa ya kulevya na derivatives yao. Tofauti hizi zimedhamiriwa katika kiwango cha maumbile. Kwa mfano, katika mgonjwa mmoja cytochrome fulani (protini ya ini inayohusika na metabolizing vitu vya kigeni) inaweza kuwa hai zaidi, kwa mwingine - chini. Ili kuamua ni aina gani ya cytochrome mgonjwa anayo, inashauriwa kufanya uchambuzi wa PCR kabla ya kutumia dawa. Uchambuzi huu unaitwa genotyping ya awali. genotyping watarajiwa).

Uundaji wa jeni

Uundaji wa jeni (usichanganyike na cloning ya viumbe) ni mchakato wa kutenganisha jeni na, kama matokeo ya udanganyifu wa uhandisi wa maumbile, kupata kiasi kikubwa cha bidhaa ya jeni fulani. PCR hutumiwa kukuza jeni, ambayo huingizwa ndani vekta- kipande cha DNA ambacho huhamisha jeni la kigeni ndani ya kiumbe sawa au kiumbe kingine kinachofaa kwa kilimo. Kwa mfano, plasmidi au DNA ya virusi hutumiwa kama vekta. Uingizaji wa jeni katika kiumbe cha kigeni hutumiwa kuzalisha bidhaa ya jeni hiyo - RNA au, mara nyingi, protini. Kwa njia hii, protini nyingi hupatikana kwa kiasi cha viwanda kwa matumizi ya kilimo, dawa, nk.

Mchele. 4: Uundaji wa jeni kwa kutumia plasmid. .
(1) DNA ya kromosomu ya kiumbe A. (2) PCR. (3) Nakala nyingi za jeni la kiumbe A. (4) Uingizaji wa jeni kwenye plasmid. (5) Plasmidi yenye jeni ya kiumbe hai A. (6) Kuanzishwa kwa plasmidi katika kiumbe hai B. (7) Kuzidisha idadi ya nakala za jeni la kiumbe hai A katika kiumbe hai B.

Mpangilio wa DNA

Katika njia ya kupanga kwa kutumia dideoxynucleotides iliyo na lebo ya fluorescent au isotopu ya mionzi, PCR ni sehemu muhimu, kwa kuwa ni wakati wa upolimishaji ambapo derivatives za nyukleotidi zilizo na lebo ya fluorescent au ya mionzi huingizwa kwenye mnyororo wa DNA. Hii inasimamisha majibu, kuruhusu nafasi za nyukleotidi maalum kuamua baada ya minyororo iliyounganishwa kutenganishwa kwenye gel.

Mutagenesis

Hivi sasa, PCR imekuwa njia kuu ya kufanya mutagenesis. Matumizi ya PCR imefanya iwezekanavyo kurahisisha na kuharakisha utaratibu wa mutagenesis, na pia kuifanya kuwa ya kuaminika zaidi na ya kuzaliana.

1. Polymerase chain reaction (PCR)

2. Kanuni ya njia ya mmenyuko wa mnyororo wa polymerase

2.1 Uwepo wa idadi ya vipengele katika mchanganyiko wa majibu

2.2 Utawala wa joto la mzunguko

2.3 Kanuni za msingi za kuchagua primers

2.4 Athari ya Plateau

3. Hatua za PCR

3.2 Kukuza

3.4.1 Udhibiti mzuri

3.4.2 Udhibiti wa ndani

4.1 Uchambuzi wa ubora

4.1.2 Utambuzi wa molekuli za RNA

3.1 Maandalizi ya sampuli ya kibiolojia

Ili kutenganisha DNA, mbinu mbalimbali hutumiwa kulingana na kazi zilizopo. Kiini chao kiko katika uchimbaji (uchimbaji) wa DNA kutoka kwa maandalizi ya kibiolojia na kuondolewa au neutralization ya uchafu wa kigeni ili kupata maandalizi ya DNA na usafi unaofaa kwa PCR.

Njia ya kupata maandalizi safi ya DNA iliyoelezwa na Marmur inachukuliwa kuwa ya kawaida na tayari imekuwa ya kawaida. Inajumuisha proteolysis ya enzymatic ikifuatiwa na deproteinization na reprecipitation ya DNA na pombe. Njia hii inakuwezesha kupata maandalizi safi ya DNA. Walakini, ni kazi ngumu sana na inahusisha kufanya kazi na vitu vikali na vyenye harufu kali kama phenoli na klorofomu.

Mojawapo ya njia maarufu kwa sasa ni njia ya uchimbaji wa DNA iliyopendekezwa na Boom et al. Njia hii inategemea matumizi ya wakala wa nguvu wa chaotropic, guanidine thiocyanate (GuSCN), kwa lysis ya seli na sorption inayofuata ya DNA kwenye carrier (shanga za kioo, ardhi ya diatomaceous, maziwa ya kioo, nk). Baada ya kuosha, DNA inabaki kwenye sampuli, iliyotiwa kwenye carrier, ambayo huondolewa kwa urahisi kwa kutumia buffer ya elution. Njia hiyo ni rahisi, ya juu ya teknolojia na inafaa kwa ajili ya kuandaa sampuli kwa amplification. Walakini, upotezaji wa DNA unawezekana kwa sababu ya unyonyaji usioweza kurekebishwa kwenye mtoaji, na vile vile wakati wa kuosha kadhaa. Hii ni muhimu hasa wakati wa kufanya kazi na kiasi kidogo cha DNA katika sampuli. Kwa kuongeza, hata kufuatilia kiasi cha GuSCN kunaweza kuzuia PCR. Kwa hiyo, wakati wa kutumia njia hii, uchaguzi sahihi wa sorbent na kuzingatia kwa makini nuances ya teknolojia ni muhimu sana.

Kundi jingine la mbinu za maandalizi ya sampuli ni msingi wa matumizi ya kubadilishana ion ya aina ya Chilex, ambayo, tofauti na kioo, haitumii DNA, lakini badala yake, uchafu unaoingilia majibu. Kama sheria, teknolojia hii inajumuisha hatua mbili: kuchemsha sampuli na uchafu wa uchafu kwenye kibadilishaji cha ion. Njia hiyo inavutia sana kwa sababu ya unyenyekevu wake wa utekelezaji. Katika hali nyingi, inafaa kwa kufanya kazi na nyenzo za kliniki. Kwa bahati mbaya, wakati mwingine kuna sampuli zilizo na uchafu ambazo haziwezi kuondolewa kwa kutumia kubadilishana ioni. Kwa kuongeza, baadhi ya microorganisms haziwezi kuharibiwa na kuchemsha rahisi. Katika kesi hizi, ni muhimu kuanzisha hatua za ziada za usindikaji wa sampuli.

Kwa hivyo, uchaguzi wa njia ya utayarishaji wa sampuli unapaswa kuzingatiwa kwa uelewa wa madhumuni ya uchambuzi uliokusudiwa.

3.2 Kukuza

Ili kutekeleza mmenyuko wa kukuza, ni muhimu kuandaa mchanganyiko wa majibu na kuongeza sampuli ya DNA iliyochambuliwa kwake. Ni muhimu kuzingatia baadhi ya vipengele vya annealing ya primer. Ukweli ni kwamba, kama sheria, sampuli ya kibaolojia iliyochambuliwa ina molekuli mbalimbali za DNA, ambazo primers zinazotumiwa katika majibu zina sehemu, na katika hali nyingine muhimu, homolojia. Kwa kuongeza, primers inaweza anneal kwa kila mmoja, na kutengeneza primer dimers. Zote mbili husababisha matumizi makubwa ya primers kwa usanisi wa bidhaa za athari (zisizo maalum) na, kwa sababu hiyo, hupunguza kwa kiasi kikubwa unyeti wa mfumo. Hii inafanya kuwa vigumu au haiwezekani kusoma matokeo ya majibu wakati wa electrophoresis.

3.3 Tathmini ya matokeo ya majibu

Ili kutathmini kwa usahihi matokeo ya PCR, ni muhimu kuelewa kwamba njia hii sio ya kiasi. Kinadharia, bidhaa za ukuzaji wa molekuli za DNA zinazolengwa zinaweza kugunduliwa kwa kutumia electrophoresis baada ya mizunguko 30-35. Hata hivyo, katika mazoezi, hii inafanywa tu katika hali ambapo majibu hufanyika chini ya hali karibu na bora, ambayo si mara nyingi katika maisha. Kiwango cha usafi wa maandalizi ya DNA ina ushawishi mkubwa hasa juu ya ufanisi wa amplification, i.e. uwepo katika mchanganyiko wa majibu ya vizuizi fulani, ambayo katika hali zingine inaweza kuwa ngumu sana kuiondoa. Wakati mwingine, kwa sababu ya uwepo wao, hata makumi ya maelfu ya molekuli za DNA zinazolengwa haziwezi kukuzwa. Kwa hivyo, mara nyingi hakuna uhusiano wa moja kwa moja kati ya kiasi cha awali cha DNA inayolengwa na kiasi cha mwisho cha bidhaa za ukuzaji.

3.3.1 Njia ya usawa ya electrophoresis

Mbinu mbalimbali hutumiwa kuibua matokeo ya ukuzaji. Njia ya kawaida leo ni electrophoresis, kulingana na mgawanyo wa molekuli za DNA kwa ukubwa. Ili kufanya hivyo, jitayarisha sahani ya gel ya agarose, ambayo ni agarose iliyoimarishwa baada ya kuyeyuka kwenye buffer ya electrophoresis katika mkusanyiko wa 1.5-2.5% na kuongeza ya rangi maalum ya DNA, kwa mfano, ethidium bromidi. Agarose iliyoimarishwa huunda kimiani cha anga. Wakati wa kumwaga kwa kutumia masega, visima maalum huundwa kwenye gel, ambayo bidhaa za ukuzaji huongezwa baadaye. Sahani ya gel imewekwa kwenye vifaa vya usawa vya gel electrophoresis na chanzo cha voltage mara kwa mara kinaunganishwa. DNA yenye chaji hasi huanza kuhamia kwenye gel kutoka minus hadi plus. Katika kesi hii, molekuli fupi za DNA huenda kwa kasi zaidi kuliko ndefu. Kasi ya harakati ya DNA katika gel huathiriwa na mkusanyiko wa agarose, nguvu ya shamba la umeme, joto, muundo wa buffer ya electrophoresis na, kwa kiasi kidogo, muundo wa GC wa DNA. Molekuli zote za ukubwa sawa huenda kwa kasi sawa. Rangi inaingizwa (iliyounganishwa) na vikundi vilivyopangwa kwenye molekuli za DNA. Baada ya kukamilika kwa electrophoresis, ambayo hudumu kutoka dakika 10 hadi saa 1, gel huwekwa kwenye chujio cha transilluminator ambacho hutoa mwanga katika safu ya ultraviolet (254 - 310 nm). Nishati ya urujuanii inayofyonzwa na DNA katika nm 260 huhamishiwa kwenye rangi, na kuifanya iwe fluoresce katika eneo la rangi ya chungwa-nyekundu la wigo unaoonekana (590 nm).

Mwangaza wa bendi za bidhaa za ukuzaji unaweza kutofautiana. Hata hivyo, hii haiwezi kuhusishwa na kiasi cha awali cha DNA inayolengwa katika sampuli.

3.3.2 Mbinu ya wima ya electrophoresis

Njia ya electrophoresis ya wima kimsingi ni sawa na electrophoresis ya usawa. Tofauti yao ni kwamba katika kesi hii, gel za polyacrylamide hutumiwa badala ya agarose. Inafanywa katika chumba maalum kwa electrophoresis ya wima. Electrophoresis ya jeli ya Polyacrylamide ina azimio kubwa zaidi ikilinganishwa na electrophoresis ya agarose na inaruhusu mtu kutofautisha molekuli za DNA za ukubwa tofauti kwa usahihi wa nyukleotidi moja. Maandalizi ya gel ya Polyacrylamide ni ngumu zaidi kuliko gel ya agarose. Aidha, acrylamide ni dutu yenye sumu. Kwa kuwa haja ya kuamua ukubwa wa bidhaa ya amplification kwa usahihi wa nucleotide 1 hutokea mara chache, njia ya electrophoresis ya usawa hutumiwa katika kazi ya kawaida.

3.4 Kufuatilia maendeleo ya mmenyuko wa ukuzaji

3.4.1 Udhibiti mzuri

Maandalizi ya DNA ya microorganism inayotakiwa hutumiwa kama "udhibiti mzuri". Amplikoni zisizo maalum hutofautiana kwa saizi kutoka kwa amplikoni iliyoundwa kama matokeo ya ukuzaji na utayarishaji wa DNA wa kudhibiti. Bidhaa zisizo maalum zinaweza kuwa kubwa au ndogo kwa saizi ikilinganishwa na udhibiti mzuri. Katika hali mbaya zaidi, ukubwa huu unaweza sanjari na kusoma kama chanya katika electrophoresis.

Ili kudhibiti umaalum wa bidhaa ya ukuzaji inayotokana, unaweza kutumia uchunguzi wa mseto (sehemu za DNA ziko ndani ya mfuatano ulioimarishwa), zilizo na lebo za kimeng'enya au isotopu zenye mionzi na kuingiliana na DNA kwa mujibu wa kanuni sawa na vitangulizi. Hii inachanganya sana na kuongeza muda wa uchambuzi, na gharama yake huongezeka sana.

3.4.2 Udhibiti wa ndani

Ni muhimu kufuatilia maendeleo ya amplification katika kila tube na mchanganyiko wa majibu. Kwa kusudi hili, ziada, inayoitwa "udhibiti wa ndani" hutumiwa. Ni maandalizi yoyote ya DNA ambayo ni tofauti na DNA ya microorganism inayotaka. Ikiwa kidhibiti cha ndani kinaongezwa kwenye mchanganyiko wa athari, kitakuwa kilelengwa sawa cha annealing ya kwanza kama DNA ya kromosomu ya wakala anayetaka wa kuambukiza. Ukubwa wa bidhaa ya amplification ya udhibiti wa ndani huchaguliwa ili ni mara 2 au zaidi zaidi kuliko amplicons sumu kutoka amplification ya taka microorganism DNA. Kama matokeo, ikiwa DNA ya udhibiti wa ndani imeongezwa kwenye mchanganyiko wa majibu pamoja na sampuli ya mtihani, basi bila kujali uwepo wa microorganism katika sampuli ya kibaolojia, udhibiti wa ndani utasababisha kuundwa kwa amplicons maalum, lakini kwa muda mrefu zaidi (nzito) kuliko amplicon ya microorganism. Uwepo wa amplicons nzito katika mchanganyiko wa majibu utaonyesha maendeleo ya kawaida ya mmenyuko wa amplification na kutokuwepo kwa inhibitors. Ikiwa amplicons ya ukubwa unaohitajika haijaundwa, lakini pia amplicons ya udhibiti wa ndani haijaundwa, tunaweza kuhitimisha kuwa kuna uchafu usiofaa katika sampuli iliyochambuliwa ambayo inapaswa kuondolewa, lakini si kuhusu kutokuwepo kwa DNA inayotaka.

Kwa bahati mbaya, licha ya kuvutia kwa njia hii, ina dosari kubwa. Ikiwa DNA inayotaka iko katika mchanganyiko wa majibu, basi ufanisi wa amplification yake hupungua kwa kasi kutokana na ushindani na udhibiti wa ndani kwa primers. Hii ni muhimu hasa katika viwango vya chini vya DNA katika sampuli ya jaribio, ambayo inaweza kusababisha matokeo hasi ya uwongo.

Hata hivyo, mradi tatizo la ushindani kwa primers linatatuliwa, njia hii ya ufuatiliaji wa ufanisi wa amplification hakika itakuwa muhimu sana.

4. Mbinu kulingana na mmenyuko wa mnyororo wa polymerase

4.1 Uchambuzi wa ubora

Njia ya classical ya kufanya PCR, kanuni ambazo zimeelezwa hapo juu, zimetengenezwa katika marekebisho fulani yenye lengo la kuondokana na mapungufu ya PCR na kuongeza ufanisi wa majibu.

4.1.1 Mbinu ya kutekeleza PCR kwa kutumia "mwanzo moto"

Ili kupunguza hatari ya uundaji wa bidhaa zisizo maalum za mmenyuko wa amplification, mbinu inayoitwa "Hot-start" hutumiwa. Kiini chake ni kuzuia kuanza kwa mmenyuko hadi hali katika tube ya mtihani itakapopatikana ambayo inahakikisha kupunguzwa maalum kwa primers.

Ukweli ni kwamba, kulingana na utungaji na ukubwa wa GC, primers zina joto fulani la kuyeyuka (Tm). Ikiwa hali ya joto ya mfumo inazidi Tm, primer haiwezi kuambatana na strand ya DNA na denatures. Kwa kuzingatia hali bora, i.e. Kwa joto la anneal karibu na joto la kuyeyuka, primer huunda molekuli iliyopigwa mara mbili tu ikiwa inakamilisha kikamilifu na hivyo kuhakikisha maalum ya mmenyuko.

Kuna chaguzi mbalimbali za kutekeleza "kuanza moto":

Kuongeza Taq polimasi kwenye mchanganyiko wa majibu wakati wa mzunguko wa kwanza baada ya kupasha joto bomba kwa joto la denaturation.

Mgawanyiko wa viungo vya mchanganyiko wa mmenyuko na safu ya parafini kwenye tabaka (katika sehemu ya chini - primers, katika sehemu ya juu - malengo ya Taq polymerase na DNA), ambayo huchanganywa wakati parafini inayeyuka (~ 65-75 0 C).

Matumizi ya kingamwili za monoclonal kwa Taq polymerase. Kimeng'enya kinachofungamana na kingamwili cha monokloni huanza kufanya kazi tu baada ya hatua ya kwanza ya uasiliaji, wakati kingamwili za monokloni zinapotoshwa na kutoa tovuti hai za Taq polymerase.

Katika visa vyote vilivyoorodheshwa hapo juu, hata ikiwa annealing isiyo maalum ilitokea kabla ya kuanza kwa baiskeli ya joto, urefu haufanyiki, na inapokanzwa, muundo wa primer-DNA hubadilishwa, kwa hivyo bidhaa zisizo maalum hazijaundwa. Baadaye, hali ya joto katika bomba la mtihani haingii chini ya joto la kuyeyuka, ambayo inahakikisha uundaji wa bidhaa maalum ya kukuza.

4.1.2 Utambuzi wa molekuli za RNA

Uwezekano wa kutumia RNA kama lengo la PCR huongeza kwa kiasi kikubwa anuwai ya matumizi ya njia hii. Kwa mfano, genomes za virusi nyingi (hepatitis C, virusi vya mafua, picornaviruses, nk) zinawakilishwa na RNA. Aidha, katika mizunguko ya maisha yao hakuna awamu ya kati ya mabadiliko katika DNA. Ili kugundua RNA, lazima kwanza ibadilishwe kuwa fomu ya DNA. Kwa kufanya hivyo, reverse transcriptase hutumiwa, ambayo imetengwa na virusi viwili tofauti: virusi vya myeloblastosis ya ndege na virusi vya Moloney murine leukemia. Matumizi ya enzymes haya yanahusishwa na matatizo fulani. Kwanza kabisa, wao ni thermolabile na kwa hiyo inaweza kutumika kwa joto si zaidi ya 42 ° C. Kwa kuwa katika joto hili molekuli za RNA huunda kwa urahisi miundo ya sekondari, ufanisi wa majibu hupungua kwa kiasi kikubwa na, kwa mujibu wa makadirio mbalimbali, ni takriban 5%. Majaribio yanafanywa ili kukwepa upungufu huu kwa kutumia polimasi inayoweza kudhibiti joto iliyopatikana kutoka kwa vijidudu vya thermophilic Thermus Thermophilus, ambayo inaonyesha shughuli ya transcriptase mbele ya Mn 2+, kama nakala ya kinyume. Ni kimeng'enya pekee kinachojulikana chenye uwezo wa kuonyesha shughuli za polymerase na transcriptase.

Ili kutekeleza mwitikio wa unukuzi wa kinyume, mchanganyiko wa majibu, kama vile PCR, lazima uwe na vianzio kama kianzilishi na mchanganyiko wa dNTP 4 kama nyenzo ya ujenzi.

Baada ya kutekeleza athari ya unukuzi wa kinyume, molekuli za cDNA zinazotokana zinaweza kutumika kama lengo la PCR

5. Shirika la mchakato wa kiteknolojia wa kufanya PCR

Unyeti unaowezekana wa juu wa mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi hufanya usanifu makini wa maabara ya PCR kuwa muhimu kabisa. Hii ni kutokana na tatizo kali zaidi la njia - uchafuzi.

Uchafuzi ni ingizo kutoka kwa mazingira ya nje kwenye mchanganyiko wa athari ya molekuli maalum za DNA ambazo zinaweza kutumika kama shabaha katika mmenyuko wa ukuzaji na kutoa matokeo chanya ya uwongo.

Kuna njia kadhaa za kupambana na jambo hili lisilo la kufurahisha. Mmoja wao ni matumizi ya enzyme N-uracil glycosylase (UG). Njia hii inategemea uwezo wa UG kuunganisha molekuli za DNA na uracil iliyopachikwa. Mmenyuko wa amplification unafanywa kwa kutumia mchanganyiko wa dNTP ambayo dTTP inabadilishwa na uracil, na baada ya baiskeli ya joto, amplicons zote zinazoundwa kwenye tube ya mtihani zitakuwa na uracil. Ikiwa CG imeongezwa kwenye mchanganyiko wa mmenyuko kabla ya ukuzaji, basi amplicons zinazoingia kwenye mchanganyiko wa majibu zitaharibiwa, wakati DNA ya asili itabaki kuwa sawa na itatumika kama lengo la ukuzaji.

Kwa hivyo, njia hii kwa kiasi fulani huondoa chanzo cha uchafuzi na haitoi dhamana dhidi ya matokeo mazuri ya uongo.

Njia nyingine ya kupambana na matokeo ya uchafuzi ni kupunguza kwa kiasi kikubwa idadi ya mzunguko wa majibu (hadi mzunguko wa 25-30). Lakini hata kwa njia hii, hatari ya kupata matokeo chanya ya uwongo ni ya juu, kwani katika kesi hii, kwa kutokuwepo kwa vizuizi, ni rahisi kupata bidhaa ya kukuza kwa sababu ya uchafuzi.

Kwa hivyo, licha ya faida za hatua za uboreshaji zinazolenga kuzima molekuli za DNA zinazosababisha matokeo chanya ya uwongo, dawa kali zaidi ni shirika la maabara lililofikiriwa vizuri.

Hitimisho

Njia ya PCR kwa sasa inatumika sana kama njia ya kugundua magonjwa anuwai ya kuambukiza. PCR hukuruhusu kutambua asili ya maambukizi hata kama sampuli iliyochukuliwa kwa uchambuzi ina molekuli chache za DNA za pathojeni. PCR hutumiwa sana katika utambuzi wa mapema wa maambukizi ya VVU, hepatitis ya virusi, nk. Leo kuna karibu hakuna wakala wa kuambukiza ambayo haiwezi kugunduliwa kwa kutumia PCR.

Sio muda mrefu uliopita, njia ya kuaminika, nyeti sana na ya haraka ya kuchunguza magonjwa mbalimbali ya kuambukiza ya binadamu ilitengenezwa. Njia hii inaitwa "uchambuzi wa PCR". Ni nini, ni nini kiini chake, ni microorganisms gani inaweza kutambua na jinsi ya kuichukua kwa usahihi, tutakuambia katika makala yetu.

Historia ya ugunduzi

Njia za PCR pia hutumiwa katika utambuzi wa saratani.

Faida za mbinu

Utambuzi wa PCR una faida kadhaa:

Unyeti wa juu. Hata ikiwa kuna molekuli chache za DNA za vijidudu, uchambuzi wa PCR huamua uwepo wa maambukizi. Njia hiyo itasaidia na magonjwa ya muda mrefu na ya latent. Mara nyingi katika hali hiyo microorganism si vinginevyo culturable.
Nyenzo yoyote inafaa kwa ajili ya utafiti, kwa mfano mate, damu, usiri wa uzazi, nywele, seli za epithelial. Ya kawaida ni mtihani wa PCR wa damu na smear ya urogenital.
Hakuna kilimo cha muda mrefu cha mazao kinachohitajika. Mchakato wa uchunguzi wa kiotomatiki hukuruhusu kupata matokeo ya utafiti baada ya masaa 4-5.
Njia hiyo ni karibu asilimia mia moja ya kuaminika. Kesi pekee za matokeo mabaya ya uwongo zimerekodiwa.
Uwezo wa kutambua aina kadhaa za pathogens kutoka kwa sampuli moja ya nyenzo. Hii sio tu kuongeza kasi ya mchakato wa kuchunguza ugonjwa huo, lakini pia hupunguza kwa kiasi kikubwa gharama za nyenzo. Mara nyingi, daktari anaelezea mtihani wa PCR tata. Gharama ya uchunguzi unaojumuisha kutambua pathogens sita ni kuhusu rubles 1,500.

Ili matokeo yawe ya kuaminika wakati wa kufanya uchunguzi wa PCR, unahitaji kuchukua mtihani, kufuata mapendekezo ya maandalizi ya awali ya utambuzi:

Kabla ya kutoa mate, unapaswa kukataa kula na kuchukua dawa masaa 4 kabla ya kukusanya nyenzo. Mara moja kabla ya utaratibu, suuza kinywa chako na maji ya kuchemsha.
Sheria zilizo juu zinapaswa pia kufuatiwa wakati wa kuchukua sampuli kutoka kwenye uso wa ndani wa shavu. Baada ya suuza, inashauriwa kufanya massage nyepesi ya ngozi ili kutolewa secretion ya gland.
Mkojo kawaida hukusanywa nyumbani. Ili kufanya hivyo, unahitaji kusafisha kabisa sehemu za siri. 50-60 ml ya mkojo inapaswa kukusanywa kwenye chombo cha plastiki cha kuzaa. Ili kuhakikisha usafi wa nyenzo, inashauriwa kwa wanawake kuingiza tampon ndani ya uke, na kwa wanaume kuvuta nyuma ya ngozi ya ngozi iwezekanavyo. Huwezi kuchangia nyenzo wakati wa hedhi yako.
Ili kutoa manii, lazima ujiepushe na kujamiiana kwa siku 3 kabla ya kukusanya nyenzo. Madaktari pia wanashauri kuepuka kutembelea sauna na kuoga moto, kunywa pombe na vyakula vya spicy. Unapaswa kujiepusha na kukojoa masaa 3 kabla ya mtihani.
Kwa mfano, ikiwa mtihani wa PCR wa chlamydia unafanywa, wanawake na wanaume wanapendekezwa kupumzika kwa ngono kwa siku 3. Wiki 2 kabla ya mtihani haipaswi kuchukua dawa za antibacterial. Kwa wiki, unahitaji kuacha kutumia gel za karibu, marashi, suppositories ya uke na douching. Masaa 3 kabla ya mtihani unapaswa kukataa kukojoa. Wakati wa hedhi, nyenzo hazikusanywi; siku 3 tu baada ya kuacha damu, smear ya urogenital inaweza kuchukuliwa.

PCR wakati wa ujauzito

Wakati wa kungojea mtoto, magonjwa mengi ya kuambukiza ya zinaa ni hatari sana kwa ukuaji wa kawaida wa fetusi. Magonjwa ya zinaa yanaweza kusababisha ucheleweshaji wa ukuaji wa intrauterine, kuharibika kwa mimba au kuzaliwa kabla ya wakati, na kasoro za kuzaliwa za mtoto. Kwa hiyo, ni muhimu sana kupima PCR katika hatua za mwanzo za ujauzito. Jaribio lazima lichukuliwe wakati wa usajili - hadi wiki 12.

Nyenzo hukusanywa kutoka kwa mfereji wa kizazi kwa kutumia brashi maalum. Utaratibu hauna uchungu na hautoi hatari kwa mtoto. Kwa kawaida, wakati wa ujauzito, uchambuzi unafanywa kwa chlamydia kwa kutumia njia ya PCR, pamoja na ureaplasmosis, mycoplasmosis, cytomegalovirus, herpes, na papillomavirus. Seti hii ya mitihani inaitwa PCR-6.

PCR kwa utambuzi wa VVU

Kutokana na ukweli kwamba njia hiyo ni nyeti sana kwa mabadiliko katika mwili na hali ya uchunguzi, mambo mengi yanaweza kuathiri matokeo. Kwa hiyo, uchambuzi wa PCR kwa maambukizi ya VVU sio njia ya kuaminika, ufanisi wake ni 96-98%. Katika 2-4% iliyobaki ya kesi, mtihani hutoa matokeo mazuri ya uongo.

Lakini katika hali zingine, huwezi kufanya bila uchunguzi wa PCR wa VVU. Kawaida hufanywa kwa watu walio na matokeo hasi ya ELISA. Viashiria vile vinaonyesha kuwa mtu bado hajatengeneza antibodies kwa virusi na hawezi kugunduliwa bila ongezeko nyingi la idadi. Hii ndiyo hasa inaweza kupatikana kwa kufanya mtihani wa damu kwa kutumia njia ya PCR.

Uchunguzi huo pia ni muhimu kwa watoto wa mwaka wa kwanza wa maisha waliozaliwa kutoka kwa mama mwenye VVU. Njia hiyo ndiyo njia pekee ya kuamua kwa uhakika hali ya mtoto.

PCR kwa utambuzi wa hepatitis

Njia ya mmenyuko wa mnyororo wa polymerase inakuwezesha kuchunguza DNA ya virusi vya hepatitis A, B, C muda mrefu kabla ya kuundwa kwa antibodies kwa maambukizi au kuonekana kwa dalili za ugonjwa huo. Mtihani wa PCR wa hepatitis C ni mzuri sana, kwani katika 85% ya kesi ugonjwa huu hauna dalili na bila matibabu ya wakati huwa sugu.

Kugundua kwa wakati pathogen itasaidia kuepuka matatizo na matibabu ya muda mrefu.

Uchunguzi wa kina wa PCR

Uchambuzi wa kina wa PCR: uchunguzi kwa kutumia njia ya mmenyuko wa mnyororo wa polymesic, ambayo ni pamoja na uamuzi wa wakati mmoja wa aina kadhaa za maambukizo: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, cytomegalovirus, aina ya 1 na 2, kisonono, papillomavirus. Bei ya uchunguzi kama huo ni kati ya rubles 2000 hadi 3500. kulingana na kliniki, vifaa na vifaa vinavyotumiwa, pamoja na aina ya uchambuzi: ubora au kiasi. Daktari ataamua ni ipi ambayo ni muhimu katika kesi yako. Katika baadhi ya matukio, inatosha tu kuamua kuwepo kwa pathojeni; kwa wengine, kwa mfano, na maambukizi ya VVU, titer ya kiasi ina jukumu muhimu. Wakati wa kugundua vimelea vyote vilivyo hapo juu, uchunguzi unaitwa "uchambuzi wa PCR-12."

Kusimbua matokeo ya uchambuzi

Kuamua uchambuzi wa PCR sio ngumu. Kuna mizani 2 tu ya viashiria - "matokeo chanya" na "matokeo hasi". Ikiwa pathojeni hugunduliwa, madaktari wanaweza kuthibitisha uwepo wa ugonjwa huo kwa ujasiri wa 99% na kuanza kumtibu mgonjwa. Kwa njia ya kiasi cha kuamua maambukizi, kiashiria cha nambari ya bakteria iliyogunduliwa itaonyeshwa kwenye safu inayofanana. Ni daktari tu anayeweza kuamua kiwango cha ugonjwa huo na kuagiza matibabu muhimu.

Katika baadhi ya matukio, kwa mfano, wakati wa kuamua maambukizi ya VVU kwa kutumia njia ya PCR, ikiwa matokeo ni mabaya, inakuwa muhimu kufanya mitihani ya ziada ili kuthibitisha viashiria vilivyopatikana.

Ninaweza kupimwa wapi?

Wapi kuchukua mtihani wa PCR: katika kliniki ya umma au katika maabara ya kibinafsi? Kwa bahati mbaya, katika taasisi za matibabu za manispaa, vifaa na mbinu mara nyingi zimepitwa na wakati. Kwa hiyo, ni bora kutoa upendeleo kwa maabara binafsi na vifaa vya kisasa na wafanyakazi wenye ujuzi. Kwa kuongeza, katika kliniki ya kibinafsi utapata matokeo kwa kasi zaidi.

Huko Moscow, maabara nyingi za kibinafsi hutoa upimaji wa PCR kwa maambukizo anuwai. Kwa mfano, katika kliniki kama vile "Vita", "Kliniki Complex", "Familia yenye Furaha", "Uro-Pro", uchambuzi wa PCR unafanywa. Bei ya uchunguzi ni kutoka rubles 200. kwa kutambua pathojeni moja.

Inaweza kuhitimishwa kuwa uchunguzi wa magonjwa ya kuambukiza kwa kutumia njia ya PCR katika hali nyingi ni njia ya haraka na ya kuaminika ya kuchunguza pathogen katika mwili katika hatua za mwanzo za maambukizi. Lakini bado, katika hali fulani inafaa kuchagua njia zingine za utambuzi. Mtaalam tu ndiye anayeweza kuamua hitaji la utafiti kama huo. Kufafanua uchambuzi wa PCR pia kunahitaji mbinu ya kitaalamu. Fuata mapendekezo ya daktari wako na usichukue vipimo visivyohitajika mwenyewe.