Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

PCR yönteminin özü. DNA polimeraz

Polimeraz zincir reaksiyonu, biyolojik materyaldeki belirli nükleik asit fragmanlarının küçük konsantrasyonlarında önemli bir artış elde edilmesini sağlayan deneysel bir moleküler biyoloji yöntemidir. DNA'nın kopya sayısını artırmaya yönelik bu işleme denir. amplifikasyon. PCR sırasında DNA kopyalaması özel bir enzim tarafından gerçekleştirilir - polimeraz. DNA polimeraz (Şekil 3), DNA'nın replikasyonunda (canlı organizmalarda DNA'nın amplifikasyonu) rol oynayan bir enzimdir. Bu sınıfın enzimleri, enzimin "okuduğu" ve şablon olarak kullandığı bir DNA nükleotid zinciri boyunca deoksiribonükleotidlerin polimerizasyonunu katalize eder. Yeni bir nükleotidin türü, okunduğu şablonla tamamlayıcılık ilkesine göre belirlenir.

DNA polimeraz, birleştirilmiş zincirin 3" ucuna serbest nükleotidler ekler. Bu, zincirin 5"-3 yönünde uzamasına yol açar. Bilinen DNA polimerazların hiçbiri sıfırdan zincir oluşturma yeteneğine sahip değildir: yalnızca nükleotidler ekleyebilirler halihazırda var olan 3"-hidroksil grubuna. Bu nedenle DNA polimerazın ihtiyacı vardır. astar- incelenen genin terminal bölümlerini tamamlayan kısa bir nükleotid dizisi (genellikle 20-25) ve buna ilk nükleotidi ekleyebilmektedir. Primerler her zaman DNA ve RNA bazlarından oluşur; ilk iki baz her zaman RNA bazlarıdır. Primerler başka bir enzim tarafından sentezlenir. primaz. Başka bir enzim helikaz- DNA çift sarmalının, yarı muhafazakar DNA replikasyon modeline uygun olarak her iki ipliğin replikasyonunu sağlayan tek iplikli bir yapı oluşturmak üzere çözülmesi için gereklidir.

Bazı DNA polimerazlar ayrıca yeni birleştirilen DNA zincirindeki hataları düzeltme yeteneğine de sahiptir. Yanlış bir nükleotid çifti tespit edilirse, DNA polimeraz bir adım geri döner, yanlış nükleotidi zincirden çıkarır, ardından doğru olanı yerine yerleştirir ve ardından replikasyon her zamanki gibi devam eder.

PCR'nin yürütülmesi

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA dizisini birkaç saat içinde milyarlarca kez izole etmek ve çoğaltmak için kullanılabilen bir DNA amplifikasyon yöntemidir. Genomun kesin olarak tanımlanmış bir bölgesinin çok sayıda kopyasını elde etme yeteneği, mevcut bir DNA örneğinin incelenmesini büyük ölçüde basitleştirir.

Bir polimeraz zincir reaksiyonunun gerçekleştirilmesi için bir takım koşulların karşılanması gerekir. En basit durumda PCR'yi gerçekleştirmek için aşağıdaki bileşenler gereklidir:

DNA'nın çoğaltılması gereken kısmını içeren bir DNA şablonu.

İstenilen parçanın uçlarını tamamlayan iki primer. (Hedef DNA'nın karşılık gelen bölümleriyle aynı olan, genellikle boyutları 15 ila 30 bp arasında değişen, yapay olarak sentezlenmiş bir çift oligonükleotid. Amplifikasyon reaksiyon ürünlerinin oluşumunda anahtar rol oynarlar. Doğru seçilmiş primerler, spesifikliği ve duyarlılığı sağlar. Sınav sistemi.)

Termostabil DNA polimeraz. PCR'de kullanılan polimerazın yüksek sıcaklıklarda uzun süre aktif kalması gerekir, bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler kullanılır - Thermus Aquacusus (Taq polimeraz) ve diğerleri.

Deoksinükleotid trifosfatlar (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.

Gerekli reaksiyon koşullarını sağlayan bir tampon çözeltisi - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için test tüpüne Vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ ekleyin. Isıtmalı kapağı olan bir cihaz kullanıyorsanız buna gerek yoktur.

Pirofosfatazın eklenmesi PCR reaksiyonunun verimini artırabilir. Bu enzim, büyüyen DNA zincirine nükleotid trifosfatların eklenmesinin bir yan ürünü olan pirofosfatın ortofosfata hidrolizini katalize eder. Pirofosfat PCR reaksiyonunu inhibe edebilir.

Orijinal DNA'nın kopya sayısını çoğaltmak için döngüsel bir reaksiyon gereklidir. Kural olarak, sırayla tekrarlanan PCR döngülerinin her biri üç aşamadan oluşur:

1. DNA'nın denatürasyonu veya "erimesi".Çift sarmallı DNA şablonu, DNA şeritlerinin ayrılması için 0,5 - 2 dakika süreyle 94 - 96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu aşamaya denatürasyon denir çünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kırılır. Bazen, ilk döngüden önce (polimerazın eklenmesinden önce), matris ve primerlerin tamamen denatüre olması için reaksiyon karışımı 2 - 5 dakika önceden ısıtılır. Bu tekniğe denir sıcak başlangıç spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmanıza olanak tanır.

2. Tavlama - primerlerin şablon DNA'ya bağlanması. Zincirler ayrıldıktan sonra, primerlerin tek sarmallı şablona temas etmesini sağlamak için sıcaklık yavaşça düşürülür. Tavlama sıcaklığı primerlerin bileşimine bağlıdır ve genellikle 50-65°C'de seçilir. Aşama süresi 20 - 60 saniyedir. Tavlama sıcaklığının yanlış seçimi ya primerlerin şablona zayıf bağlanmasına (çok yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına (çok düşük sıcaklıkta) yol açar.

3. Sentez (zincir uzaması). DNA polimeraz, primer olarak bir primer kullanarak şablon zincirini çoğaltır. Polimeraz, şablona bağlanan ve şablon boyunca hareket eden primerin 3" ucundan ikinci ipliğin sentezine başlar. Uzama sıcaklığı polimeraza bağlıdır. Sıklıkla kullanılan Taq ve Pfu polimerazları en çok 72°C'de aktiftir. C. Sentez süresi, DNA polimerazın tipine ve amplifiye edilmiş parçanın uzunluğuna bağlıdır. Tipik olarak, uzama süresi, bin baz çifti başına bir dakika olarak alınır. Tüm döngüler tamamlandıktan sonra, genellikle ek bir aşama gerçekleştirilir. son uzama, tüm tek sarmallı parçaları tamamlamak için. Bu aşama 7 – 10 dakika sürer.

Daha sonra denatürasyon, tavlama ve uzama aşamaları birçok kez (30 veya daha fazla kez) tekrarlanır. Her döngüde, bir DNA fragmanının sentezlenen kopyalarının sayısı iki katına çıkar.

Tüm reaksiyonlar bir termostata batırılmış test tüplerinde gerçekleştirilir. Sıcaklık rejiminin değiştirilmesi ve sürdürülmesi otomatik olarak gerçekleştirilir.

Belirli bir DNA segmentinin PCR sırasında nasıl amplifiye edildiğini tam olarak anlamak için, her turda amplifiye edilmiş şeritlerdeki tüm primerlerin ve bunların tamamlayıcı dizilerinin konumunu açıkça hayal etmeniz gerekir. İlk turda, yeni sentezlenen zincirlerin her biri, primerinin 3"-hidroksil grubundan, ikinci primeri tamamlayıcı dizinin terminal nükleotidine kadar olan mesafeden çok daha büyük bir uzunluğa sahiptir. Bu tür zincirlere "uzun şablonlar" adı verilir. ; daha fazla sentez onların üzerinde gerçekleşecek.

İkinci turda benzer ve yeni sentezlenmiş (uzun şablon) zincirlerden oluşan çift sarmallı DNA tekrar denatüre edilir ve ardından primerlerle tavlanır. Bu turdaki sentez sırasında, "uzun şablonlar" yeniden sentezlenir, ayrıca bir ucunda bir primer ve diğer ucunda ikinci primeri tamamlayıcı bir dizi ("kısa şablonlar") bulunan bir dizi şerit yeniden sentezlenir. Üçüncü turda, daha önce oluşturulan tüm heterodubleksler eş zamanlı olarak denatüre edilir ve primerlerle tavlanır ve ardından çoğaltılır. Sonraki turlarda giderek daha fazla "kısa matris" ortaya çıkıyor ve 30. turda bunların sayısı zaten ilk zincirlerin veya "uzun matrislerin" sayısından 10 6 kat daha fazla.

Spesifik reaksiyon ürününün miktarı (primerlerle sınırlıdır) teorik olarak 2n ile orantılı olarak artar; burada n, reaksiyon döngülerinin sayısıdır. Gerçekte her döngünün verimliliği %100'den az olabilir; dolayısıyla gerçekte:

burada P ürün miktarıdır, E ise ortalama çevrim verimliliğidir.

"Uzun" DNA kopyalarının sayısı da doğrusal olarak artar, böylece reaksiyon ürünlerinde belirli bir parça baskın olur. Gerekli ürünün büyümesi reaktiflerin sayısı, inhibitörlerin varlığı ve yan ürünlerin oluşumu ile üstel olarak sınırlıdır.

PCR son derece hassas bir yöntemdir, bu nedenle test numunesi bir reaksiyon karışımından diğerine kazara geçen önemsiz miktarda DNA bile içeriyorsa, yanlış pozitif sonuçlar elde edilebilir. Bu, PCR için kullanılan tüm çözeltilerin ve cam malzemelerin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesini gerekli kılar.

Primer seçiminin temel prensipleri.

Bir PCR test sistemi oluştururken ana görevlerden biri, bir dizi kriteri karşılaması gereken doğru primer seçimidir:

1. Astarlar spesifik olmalıdır. Primerlerin 3" uçlarına özellikle dikkat edilir, çünkü Taq polimeraz tamamlayıcı DNA zincirini tamamlamaya buradan başlar. Spesifiklikleri yetersizse, o zaman test tüpünde istenmeyen süreçlerin meydana gelmesi muhtemeldir. reaksiyon karışımı, yani spesifik olmayan DNA'nın sentezi (kısa veya uzun parçalar).Elektroforezde ağır veya hafif ek bantlar şeklinde görülebilir.Bu, spesifik olanı karıştırmak kolay olduğundan reaksiyon sonuçlarının değerlendirilmesine müdahale eder. Sentezlenen yabancı DNA ile amplifikasyon ürünü Primerlerin ve dNTP'lerin bir kısmı spesifik olmayan DNA'nın sentezi için harcanır ve bu da önemli hassasiyet kaybına yol açar.

2. Primerler dimerler ve halkalar oluşturmamalıdır; Primerlerin kendilerine veya birbirlerine tavlanması sonucu stabil çift şerit oluşmamalıdır.

Bu, biyolojik materyaldeki küçük miktarlardaki veya daha doğrusu belirli parçalarını tespit etmenize ve bunları birçok kez çoğaltmanıza olanak tanır. Daha sonra jel elektroforezi ile görsel olarak tanımlanırlar. Reaksiyon 1983 yılında K. Mullis tarafından geliştirildi ve son yılların olağanüstü keşifleri listesine dahil edildi.

PCR'nin mekanizmaları nelerdir?

Tüm teknik, nükleik asitlerin bağımsız olarak çoğalma kabiliyetine dayanmaktadır ve bu durumda bu, bir laboratuvarda yapay olarak gerçekleştirilir. DNA çoğalması, molekülün herhangi bir bölgesinde başlamayabilir, ancak yalnızca belirli bir nükleotid dizisinin başlangıç parçalarına sahip olduğu bölgelerde başlayabilir. Polimeraz zincir reaksiyonunun başlayabilmesi için primerlere (veya DNA problarına) ihtiyaç vardır. Bunlar belirli bir nükleotid dizisine sahip bir DNA zincirinin kısa parçalarıdır. Başlangıç bölgelerine tamamlayıcıdırlar (yani karşılık gelirler)

Elbette, primerler oluşturmak için bilim adamlarının tekniğe dahil olanın nükleotid dizisini incelemesi gerekiyor. Reaksiyonun ve başlatılmasının özgüllüğünü sağlayan bu DNA problarıdır. Numune istenen DNA'nın en az bir molekülünü içermiyorsa çalışmayacaktır. Genel olarak reaksiyonun gerçekleştirilmesi için yukarıdaki primerler, bir dizi nükleotid ve ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz gereklidir. İkincisi, numuneye dayalı yeni nükleik asit moleküllerinin sentezi reaksiyonunu katalize eden bir enzimdir. DNA'nın tespit edilmesi gereken biyolojik materyal de dahil olmak üzere tüm bu maddeler bir reaksiyon karışımı (çözelti) halinde birleştirilir. Belirli bir süre (bir döngü) içinde çok hızlı ısıtma ve soğutma gerçekleştiren özel bir termostata yerleştirilir. Genellikle 30-50 tane vardır.

Bu reaksiyon nasıl oluyor?

Özü, bir döngü sırasında primerlerin DNA'nın istenen bölümlerine bağlanması ve ardından bir enzimin etkisi altında ikiye katlanmasıdır. Ortaya çıkan DNA iplikçiklerine dayanarak, sonraki döngülerde molekülün giderek daha fazla özdeş fragmanı sentezlenir.

Polimeraz zincir reaksiyonu sırayla ilerler; aşağıdaki aşamalar ayırt edilir. Birincisi, her ısıtma ve soğutma döngüsü sırasında ürün miktarının iki katına çıkarılmasıyla karakterize edilir. İkinci aşamada enzim hasar gördüğünden ve aktivitesini de kaybettiğinden reaksiyon yavaşlar. Ayrıca nükleotid ve primer rezervleri de tükenmiştir. Son aşamada, yani platoda, reaktifler bittiğinden ürünler artık birikmez.

Nerede kullanılır?

Şüphesiz polimeraz zincir reaksiyonu tıpta ve bilimde yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel ve özel biyoloji, veterinerlik, eczacılık ve hatta ekolojide kullanılmaktadır. Üstelik ikincisinde bunu gıdanın ve çevresel nesnelerin kalitesini izlemek için yapıyorlar. Polimeraz zincir reaksiyonu, adli tıp uygulamalarında babalığı doğrulamak ve bir kişinin kimliğini belirlemek için aktif olarak kullanılmaktadır. Adli tıpta ve paleontolojide bu teknik genellikle tek çıkış yoludur, çünkü araştırma için genellikle son derece küçük miktarda DNA mevcuttur. Tabii ki, yöntem pratik tıpta çok geniş bir uygulama alanı buldu. Genetik, bulaşıcı hastalıklar ve onkolojik hastalıklar gibi alanlarda gereklidir.

Ancak o dönemde bu fikir sahiplenilmeden kaldı. Polimeraz zincir reaksiyonu 1983 yılında Kary Mullis tarafından yeniden keşfedildi. Amacı, DNA polimeraz enzimi kullanılarak orijinal DNA molekülünün art arda birden fazla kopyalanması yoluyla DNA'nın çoğaltılmasına olanak sağlayacak bir yöntem yaratmaktı. Bu fikrin yayınlanmasından 7 yıl sonra, 1993 yılında Mullis bu fikriyle Nobel Ödülü'nü aldı.

Yöntemi kullanmaya başladığımızda, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra, DNA sarmalının şeritlerini ayırmak için gereken yüksek sıcaklıkta hızla etkisiz hale geldiği için reaksiyon karışımına DNA polimerazın eklenmesi gerekiyordu. Prosedür çok verimsizdi ve çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da önemli ölçüde iyileştirildi. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazların kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil olduğu ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildiği ortaya çıktı. Bunların kullanımı PCR'nin basitleştirilmesini ve otomatikleştirilmesini mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edildi Termos suculus ve adlandırılmış Tak-polimeraz. Bu polimerazın dezavantajı, bu enzimin hata düzeltme mekanizmalarına (3"→5" ekzonükleaz aktivitesi) sahip olmaması nedeniyle hatalı bir nükleotidin dahil edilme olasılığının oldukça yüksek olmasıdır. Polimerazlar Pfu Ve Pwo Archaea'dan izole edilenler böyle bir mekanizmaya sahiptir; kullanımları DNA'daki mutasyonların sayısını önemli ölçüde azaltır, ancak işlerinin hızı (işlenebilirlik) diğerlerininkinden daha düşüktür. Tak. Günümüzde karışımlar kullanılmaktadır. Tak Ve Pfu Hem yüksek polimerizasyon hızı hem de yüksek kopyalama doğruluğu elde etmek için.

Yöntemin icadı sırasında Mullis, PCR yönteminin patentini alan Cetus Corporation için çalışıyordu. 1992 yılında Cetus, yöntemin ve kullanım patentinin haklarını sattı. Tak-polimeraz şirketi Hoffmann-La Roche'u (en: Hoffmann-La Roche) 300 milyon dolara satın aldı. Ancak ortaya çıktı ki Tak-polimeraz, 1980 yılında Rus biyokimyacı Alexei Kaledin tarafından karakterize edildi ve Promega, Roche'u bu enzimin münhasır haklarından vazgeçmeye zorlamaya çalıştı. PCR yöntemine ilişkin ABD patentinin süresi Mart 2005'te doldu.

PCR'nin yürütülmesi

Yöntem, yapay koşullar altında enzimler kullanılarak DNA'nın belirli bir bölümünün tekrarlı seçici kopyalanmasına dayanmaktadır ( laboratuvar ortamında). Bu durumda, yalnızca belirtilen koşulları karşılayan bölüm kopyalanır ve bu bölüm yalnızca incelenen örnekte mevcutsa kopyalanır. Canlı organizmalardaki DNA amplifikasyonunun (replikasyon) aksine, DNA'nın nispeten kısa bölümleri PCR kullanılarak amplifiye edilir. Geleneksel bir PCR işleminde kopyalanan DNA bölümlerinin uzunluğu 3000 baz çiftinden (3 kbp) fazla değildir. Çeşitli polimerazların bir karışımı kullanılarak, katkı maddeleri kullanılarak ve belirli koşullar altında bir PCR fragmanının uzunluğu 20-40 bin nükleotit çiftine ulaşabilir. Bu hala ökaryotik bir hücrenin kromozomal DNA'sının uzunluğundan önemli ölçüde daha azdır. Örneğin insan genomu yaklaşık 3 milyar baz çiftinden oluşur.

Reaksiyon bileşenleri

En basit durumda PCR'yi gerçekleştirmek için aşağıdaki bileşenler gereklidir:

DNA matrisi DNA'nın çoğaltılması gereken bölümünü içeren.
İki astarİstenilen DNA fragmanının farklı iplikçiklerinin karşıt uçlarına tamamlayıcıdır.
Termal olarak kararlı DNA polimeraz- DNA'nın polimerizasyon reaksiyonunu katalize eden bir enzim. PCR'de kullanılacak polimerazın yüksek sıcaklıklarda uzun süre aktif kalması gerekir, bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler kullanılır - Termos suculus(Taq polimeraz), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraz), Pyrococcus woesei(Pwo polimeraz) ve diğerleri.
Deoksinükleosit trifosfatlar(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.
Tampon çözümü, gerekli reaksiyon koşullarının sağlanması - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, sığır serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için test tüpüne Vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ ekleyin. Isıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici kullanıyorsanız buna gerek yoktur.

Astarlar

PCR'nin özgüllüğü, şablon ve primerler arasında, 18-30 baz uzunluğunda kısa sentetik oligonükleotidler arasında tamamlayıcı komplekslerin oluşumuna dayanır. Primerlerin her biri, çift sarmallı şablonun şeritlerinden birine tamamlayıcıdır ve çoğaltılmış bölgenin başlangıcını ve sonunu sınırlar.

Şablonun primer ile hibridizasyonundan (tavlama) sonra, ikincisi, tamamlayıcı şablon ipliğinin sentezi sırasında DNA polimeraz için bir primer görevi görür (bkz.).

Primerlerin en önemli özelliği primer-matris kompleksinin erime sıcaklığıdır (Tm). Tm, DNA şablonlarının yarısının oligonükleotid primer ile bir kompleks oluşturduğu sıcaklıktır. Erime sıcaklığı yaklaşık olarak aşağıdaki formülle belirlenebilir; burada nX, primerdeki X nükleotitlerinin sayısıdır. Primerin uzunluğu ve nükleotid bileşimi veya tavlama sıcaklığı yanlış seçilirse, şablon DNA'nın diğer bölgeleriyle kısmen tamamlayıcı komplekslerin oluşması mümkündür ve bu da spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Erime sıcaklığının üst sınırı, aktivitesi 80 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda azalan polimerazın optimum etki sıcaklığı ile sınırlıdır.

Astar seçerken aşağıdaki kriterlere uyulması tavsiye edilir:

Amplifikatör

Pirinç. 1: PCR için Döngüleyici

PCR, genellikle en az 0,1 °C doğrulukla test tüplerinin periyodik olarak soğutulmasını ve ısıtılmasını sağlayan bir cihaz olan termal döngüleyicide gerçekleştirilir. Modern döngüleyiciler, "sıcak başlatma" yeteneği, Touchdown PCR (aşağıya bakınız) ve amplifiye moleküllerin daha sonra 4 °C'de saklanması gibi karmaşık programları ayarlamanıza olanak tanır. Gerçek zamanlı PCR için floresan dedektörle donatılmış cihazlar üretilmektedir. Otomatik kapaklı ve mikroplakalar için bölmeli, bunların otomatik sistemlere entegre edilmesini sağlayan cihazlar da vardır.

Reaksiyonun ilerlemesi

İşaretleyici DNA (1) ve PCR reaksiyon ürünlerini (2,3) içeren bir jelin fotoğrafı. Sayılar, nükleotid çiftlerindeki DNA parçalarının uzunluğunu gösterir

Tipik olarak PCR, her biri üç aşamadan oluşan 20-35 döngü içerir (Şekil 2).

Denatürasyon

Çift sarmallı DNA şablonu, DNA şeritlerini ayırmak için 0,5-2 dakika süreyle 94-96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu aşama denir denatürasyonÇünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları yok edilir. Bazen ilk döngüden önce (polimeraz eklenmeden önce), reaksiyon karışımı 2-5 dakika önceden ısıtılır. şablonun ve primerlerin tamamen denatürasyonu için. Bu tekniğe denir sıcak başlangıç spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmanıza olanak tanır.

Tavlama

İplikler ayrıldıktan sonra, primerlerin tek iplikli şablona bağlanmasını sağlamak için sıcaklık düşürülür. Bu aşama denir tavlama. Tavlama sıcaklığı primerlerin bileşimine bağlıdır ve genellikle erime sıcaklığının 4-5°C altında seçilir. Aşama süresi - 0,5-2 dakika. Tavlama sıcaklığının yanlış seçimi ya primerlerin şablona zayıf bağlanmasına (çok yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına (çok düşük sıcaklıkta) yol açar.

Uzama

PCR Türleri

“Yuvalanmış” PCR (Yuvalanmış PCR), reaksiyon yan ürünlerinin sayısını azaltmak için kullanılır. İki çift primer kullanılır ve iki ardışık reaksiyon gerçekleştirilir. İkinci primer çifti, birinci reaksiyonun ürünü içindeki bir DNA bölgesini güçlendirir.
“Ters” PCR (Ters PCR) - istenen dizide yalnızca küçük bir bölge biliniyorsa kullanılır. Bu yöntem, DNA genoma yerleştirildikten sonra komşu dizilerin belirlenmesi söz konusu olduğunda özellikle faydalıdır. Ters PCR gerçekleştirmek için, kısıtlama enzimleriyle bir dizi DNA kesimi gerçekleştirilir, ardından fragmanların birleştirilmesi (ligasyon) yapılır. Sonuç olarak, bilinen fragmanlar bilinmeyen bölgenin her iki ucunda son bulur ve bundan sonra PCR her zamanki gibi gerçekleştirilebilir.
Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR), bir RNA kütüphanesinden bilinen bir diziyi çoğaltmak, izole etmek veya tanımlamak için kullanılır. Geleneksel PCR'den önce, ters enzim kullanılarak bir mRNA şablonu üzerinde tek sarmallı bir DNA molekülü sentezlenir ve PCR için şablon olarak kullanılan tek sarmallı bir cDNA elde edilir. Bu yöntem genellikle bu genlerin nerede ve ne zaman ifade edildiğini belirler.
Asimetrik PCR Asimetrik PCR) - orijinal DNA'nın iplikçiklerinden birinin ağırlıklı olarak çoğaltılması gerektiğinde gerçekleştirilir. Bazı sıralama ve hibridizasyon analiz tekniklerinde kullanılır. Primerlerden birinin çok fazla alınması dışında PCR her zamanki gibi gerçekleştirilir.
Kantitatif PCR (Q-PCR), bir numunedeki spesifik DNA, cDNA veya RNA miktarını hızlı bir şekilde ölçmek için kullanılır.
Kantitatif gerçek zamanlı PCR - bu yöntem, biriken reaksiyon ürününün miktarını doğru bir şekilde ölçmek için floresan etiketli reaktifler kullanır.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - bu yöntemi kullanarak, primerlerin spesifik olmayan bağlanmasının ürünün oluşumu üzerindeki etkisi azalır. İlk döngüler tavlama sıcaklığının üzerindeki bir sıcaklıkta gerçekleştirilir, daha sonra sıcaklık her birkaç döngüde bir azaltılır. Belirli bir sıcaklıkta sistem, DNA için optimal primer spesifikliği bandından geçecektir.
Moleküler koloni yöntemi (jelde PCR, İngilizce. Poloni - PCR Kolonisi) - Akrilamid jel yüzeydeki tüm PCR bileşenleri ile polimerize edilir ve PCR gerçekleştirilir. Analiz edilen DNA'yı içeren noktalarda moleküler kolonilerin oluşmasıyla amplifikasyon meydana gelir.
cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu ile PCR CDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu, RACE-PCR )
Uzun parça PCR Uzun menzilli PCR) - DNA'nın genişletilmiş bölümlerinin (10 bin baz veya daha fazla) amplifikasyonu için PCR'nin bir modifikasyonu. İki polimeraz kullanılır; bunlardan biri yüksek işlenebilirliğe sahip (yani uzun bir DNA zincirini tek geçişte sentezleyebilen) Taq polimeraz, ikincisi ise 3"-5" endonükleaz aktivitesine sahip DNA polimerazdır. Birincinin getirdiği hataları düzeltmek için ikinci polimeraz gereklidir.
RAPD PCR'si Polimorfik DNA PCR'nin Rastgele Amplifikasyonu Polimorfik DNA'nın rastgele amplifikasyonu ile PCR - genetik dizide yakın olan organizmaları, örneğin farklı kültür bitkilerini, köpek ırklarını veya yakından ilişkili mikroorganizmaları ayırt etmek gerektiğinde kullanılır. Bu yöntemde genellikle küçük bir primer (20 - 25 bp) kullanılır. Bu primer, incelenen organizmaların DNA'sının rastgele bölümlerine kısmen tamamlayıcı olacaktır. Koşulları (primer uzunluğu, bileşimi, sıcaklığı vb.) seçerek, iki organizma için PCR modelinde tatmin edici bir fark elde etmek mümkündür.

Şablonun nükleotid dizisi kısmen biliniyorsa veya hiç bilinmiyorsa, şunu kullanabilirsiniz: dejenere primerler dizisi, herhangi bir bazın yerleştirilebileceği dejenere konumları içerir. Örneğin, primer dizisi şu şekilde olabilir: ...ATH..., burada H, A, T veya C'dir.

PCR uygulaması

PCR birçok alanda test ve bilimsel deneyler amacıyla kullanılmaktadır.

Adli

PCR, sözde "genetik parmak izlerini" karşılaştırmak için kullanılır. Suç mahallinden bir genetik materyal örneği gereklidir - kan, tükürük, meni, saç vb. Bu, şüphelinin genetik materyaliyle karşılaştırılır. Çok az miktarda DNA, teorik olarak tek kopya yeterlidir. DNA parçalara ayrılır ve daha sonra PCR kullanılarak çoğaltılır. Parçalar DNA elektroforezi kullanılarak ayrılır. DNA bantlarının düzeninin ortaya çıkan resmine denir genetik parmak izi(İngilizce) genetik parmak izi).

Babalığın kurulması

Pirinç. 3: PCR ile çoğaltılan DNA fragmanlarının elektroforezinin sonuçları. (1) Baba. (2) Çocuk. (3) Anne. Çocuk, her iki ebeveynin genetik damgasının bazı özelliklerini miras aldı ve bu da yeni, benzersiz bir damgayla sonuçlandı.

Genetik parmak izleri benzersiz olmasına rağmen (tek yumurta ikizleri durumu hariç), birkaç parmak izi alınarak aile ilişkileri yine de kurulabilir (Şekil 3). Organizmalar arasında evrimsel akrabalık kurmak için aynı yöntem biraz değiştirilerek uygulanabilir.

Tıbbi teşhis

PCR, kalıtsal ve viral hastalıkların teşhisini önemli ölçüde hızlandırmayı ve kolaylaştırmayı mümkün kılar. İlgili gen, uygun primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra mutasyonları tanımlamak için sekanslanır. Viral enfeksiyonlar enfeksiyondan hemen sonra, semptomların ortaya çıkmasından haftalar veya aylar önce tespit edilebilir.

Kişiselleştirilmiş tıp

Çoğu ilacın, amaçlandığı tüm hastalar üzerinde etkili olmadığı, ancak sayılarının yalnızca% 30-70'i üzerinde etkili olduğu bilinmektedir. Ayrıca birçok ilacın bazı hastalar için toksik veya alerjen olduğu ortaya çıkıyor. Bunun nedenleri kısmen ilaç ve türevlerinin duyarlılığı ve metabolizmasındaki bireysel farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Bu farklılıklar genetik düzeyde belirlenir. Örneğin, bir hastada belirli bir sitokrom (yabancı maddelerin metabolize edilmesinden sorumlu bir karaciğer proteini) daha aktifken, diğerinde daha az aktif olabilir. Belirli bir hastanın ne tür sitokroma sahip olduğunu belirlemek için ilacı kullanmadan önce bir PCR analizi yapılması önerilmektedir. Bu analize ön genotipleme denir. ileriye dönük genotipleme).

Gen klonlama

Gen klonlaması (organizmaların klonlanmasıyla karıştırılmamalıdır), genlerin izole edilmesi ve genetik mühendisliği manipülasyonları sonucunda belirli bir genin büyük miktarda ürününün elde edilmesi işlemidir. PCR, bir geni çoğaltmak için kullanılır ve bu daha sonra vektör- yabancı bir geni aynı veya ekime uygun başka bir organizmaya aktaran bir DNA parçası. Örneğin vektör olarak plazmitler veya viral DNA kullanılır. Genlerin yabancı bir organizmaya yerleştirilmesi genellikle o genin ürününü (RNA veya çoğunlukla bir protein) üretmek için kullanılır. Bu şekilde tarım, tıp vb. alanlarda kullanılmak üzere endüstriyel miktarlarda birçok protein elde edilir.

Pirinç. 4: Plazmid kullanılarak gen klonlanması. .
(1) A organizmasının kromozomal DNA'sı. (2) PCR. (3) A organizmasının geninin birçok kopyası. (4) Genin bir plazmit içerisine yerleştirilmesi. (5) A organizmasının genini içeren plazmit. (6) Plazmidin B organizmasına dahil edilmesi. (7) B organizmasında A organizmasının geninin kopya sayısının çarpılması.

DNA dizilimi

Floresan etiket veya radyoaktif izotop ile etiketlenmiş dideoksinükleotidlerin kullanıldığı sekanslama yönteminde, PCR ayrılmaz bir parçadır, çünkü polimerizasyon sırasında floresan veya radyoaktif etiketle etiketlenmiş nükleotit türevleri DNA zincirine eklenir. Bu, reaksiyonu durdurarak, sentezlenen zincirler jelde ayrıldıktan sonra spesifik nükleotidlerin konumlarının belirlenmesine olanak tanır.

Mutajenez

Şu anda, PCR mutajenezi gerçekleştirmenin ana yöntemi haline gelmiştir. PCR kullanımı, mutajenez prosedürünü basitleştirmeyi ve hızlandırmanın yanı sıra onu daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirmeyi mümkün kılmıştır.

1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

2. Polimeraz zincir reaksiyonu yönteminin prensibi

2.1 Reaksiyon karışımında çok sayıda bileşenin varlığı

2.2 Döngüsel sıcaklık rejimi

2.3 Primer seçiminde temel prensipler

2.4 Plato etkisi

3. PCR'nin Aşamaları

3.2 Amplifikasyon

3.4.1 Pozitif kontroller

3.4.2 İç kontroller

4.1 Niteliksel analiz

4.1.2 RNA moleküllerinin tespiti

3.1 Biyolojik numunenin hazırlanması

DNA'yı izole etmek için eldeki göreve bağlı olarak çeşitli teknikler kullanılır. Bunların özü, DNA'nın biyolojik bir preparasyondan ekstraksiyonu (ekstraksiyonu) ve PCR için uygun saflıkta bir DNA preparasyonu elde etmek için yabancı safsızlıkların uzaklaştırılması veya nötralizasyonunda yatmaktadır.

Marmur tarafından açıklanan saf bir DNA preparatı elde etme yöntemi standart olarak kabul ediliyor ve halihazırda klasik hale geldi. Enzimatik proteolizi, ardından deproteinizasyonu ve DNA'nın alkolle yeniden çökelmesini içerir. Bu yöntem saf bir DNA preparatı elde etmenizi sağlar. Ancak oldukça emek yoğun bir işlemdir ve fenol, kloroform gibi agresif ve keskin kokulu maddelerle çalışmayı gerektirir.

Şu anda popüler olan yöntemlerden biri Boom ve arkadaşları tarafından önerilen DNA ekstraksiyon yöntemidir. Bu yöntem, güçlü bir kaotropik ajan olan guanidin tiyosiyanatın (GuSCN) hücre lizizi ve ardından DNA'nın bir taşıyıcı (cam boncuklar, diyatomlu toprak, cam süt vb.) üzerinde emilmesi için kullanılmasına dayanmaktadır. Yıkamadan sonra DNA, taşıyıcıya emilmiş olarak numunede kalır ve bir elüsyon tamponu kullanılarak kolayca uzaklaştırılır. Yöntem kullanışlıdır, teknolojik olarak gelişmiştir ve amplifikasyon için bir numune hazırlamak için uygundur. Bununla birlikte, taşıyıcı üzerindeki geri dönüşümsüz soğurma nedeniyle ve ayrıca çok sayıda yıkama sırasında DNA kaybı mümkündür. Bu, özellikle bir örnekte az miktarda DNA ile çalışırken önemlidir. Ek olarak eser miktardaki GuSCN bile PCR'yi inhibe edebilir. Bu nedenle, bu yöntemi kullanırken doğru sorbent seçimi ve teknolojik nüanslara dikkatle uyulması çok önemlidir.

Başka bir numune hazırlama yöntemi grubu, camdan farklı olarak DNA'yı değil, reaksiyona müdahale eden yabancı maddeleri emen Chilex tipi iyon değiştiricilerin kullanımına dayanmaktadır. Kural olarak, bu teknoloji iki aşamayı içerir: numunenin kaynatılması ve safsızlıkların bir iyon değiştiricide emilmesi. Yöntem, uygulama kolaylığı nedeniyle son derece çekicidir. Çoğu durumda klinik materyalle çalışmaya uygundur. Ne yazık ki bazen iyon değiştiriciler kullanılarak giderilemeyen yabancı maddeler içeren numuneler bulunur. Ayrıca bazı mikroorganizmalar basit kaynatmayla yok edilemez. Bu durumlarda numune işlemenin ek aşamalarının eklenmesi gerekir.

Bu nedenle numune hazırlama yönteminin seçimi, amaçlanan analizin amaçlarının anlaşılmasıyla dikkate alınmalıdır.

3.2 Amplifikasyon

Amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için bir reaksiyon karışımı hazırlamak ve analiz edilen DNA örneğini buna eklemek gerekir. Astar tavlamanın bazı özelliklerini dikkate almak önemlidir. Gerçek şu ki, analiz edilen biyolojik numune, kural olarak, reaksiyonda kullanılan primerlerin kısmi ve bazı durumlarda önemli homolojiye sahip olduğu çeşitli DNA molekülleri içerir. Ayrıca primerler birbirlerine tavlanarak primer dimerleri oluşturabilirler. Her ikisi de yan ürünlerin (spesifik olmayan) reaksiyon ürünlerinin sentezi için önemli miktarda primer tüketimine yol açar ve sonuç olarak sistemin hassasiyetini önemli ölçüde azaltır. Bu, elektroforez sırasında reaksiyon sonuçlarının okunmasını zorlaştırır veya imkansız hale getirir.

3.3 Reaksiyon sonuçlarının değerlendirilmesi

PCR sonuçlarını doğru bir şekilde değerlendirmek için bu yöntemin niceliksel olmadığını anlamak önemlidir. Teorik olarak tek hedef DNA moleküllerinin amplifikasyon ürünleri, 30-35 döngüden sonra elektroforez kullanılarak tespit edilebilir. Ancak pratikte bu yalnızca reaksiyonun ideale yakın koşullar altında gerçekleştiği durumlarda yapılır ki bu da hayatta pek sık karşılaşılan bir durum değildir. DNA preparasyonunun saflık derecesi amplifikasyonun verimliliği üzerinde özellikle büyük bir etkiye sahiptir; Bazı durumlarda kurtulmanın son derece zor olabileceği bazı inhibitörlerin reaksiyon karışımındaki varlığı. Bazen onların varlığı nedeniyle onbinlerce hedef DNA molekülü bile çoğaltılamaz. Bu nedenle hedef DNA'nın başlangıç miktarı ile amplifikasyon ürünlerinin nihai miktarı arasında genellikle doğrudan bir ilişki yoktur.

3.3.1 Yatay elektroforez yöntemi

Amplifikasyon sonuçlarını görselleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılır. Günümüzde en yaygın yöntem, DNA moleküllerinin boyutlarına göre ayrılmasına dayanan elektroforezdir. Bunu yapmak için, etidyum bromür gibi özel bir DNA boyasının eklenmesiyle% 1.5-2.5 konsantrasyonda bir elektroforez tamponunda eritildikten sonra agarozun katılaştırıldığı bir agaroz jel plakası hazırlayın. Katılaşmış agaroz uzaysal bir kafes oluşturur. Tarak kullanarak dökerken, jelde daha sonra amplifikasyon ürünlerinin eklendiği özel oyuklar oluşturulur. Jel plaka yatay bir jel elektroforez aparatına yerleştirilir ve sabit bir voltaj kaynağı bağlanır. Negatif yüklü DNA jel içerisinde eksiden artıya doğru hareket etmeye başlar. Bu durumda kısa DNA molekülleri uzun olanlardan daha hızlı hareket eder. Jeldeki DNA hareketinin hızı, agaroz konsantrasyonundan, elektrik alan gücünden, sıcaklıktan, elektroforez tamponunun bileşiminden ve daha az ölçüde DNA'nın GC bileşiminden etkilenir. Aynı büyüklükteki tüm moleküller aynı hızda hareket eder. Boya, düzlemsel gruplar tarafından DNA moleküllerine dahil edilir (araya eklenir). 10 dakika ile 1 saat arasında süren elektroforez tamamlandıktan sonra jel, ultraviyole aralığında (254 - 310 nm) ışık yayan transilluminatör filtre üzerine yerleştirilir. 260 nm'de DNA tarafından absorbe edilen ultraviyole enerji boyaya aktarılarak görünür spektrumun (590 nm) turuncu-kırmızı bölgesinde floresan ışık saçmasına neden olur.

Amplifikasyon ürün bantlarının parlaklığı farklılık gösterebilir. Ancak bu, numunedeki hedef DNA'nın başlangıçtaki miktarıyla ilişkilendirilemez.

3.3.2 Dikey elektroforez yöntemi

Dikey elektroforez yöntemi temel olarak yatay elektroforeze benzer. Aralarındaki fark, bu durumda agaroz yerine poliakrilamid jellerin kullanılmasıdır. Dikey elektroforez için özel bir odada gerçekleştirilir. Poliakrilamid jel elektroforezi, agaroz elektroforeziyle karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlüğe sahiptir ve farklı boyutlardaki DNA moleküllerinin bir nükleotid doğruluğu ile ayırt edilmesine olanak tanır. Poliakrilamid jelin hazırlanması agaroz jelden biraz daha karmaşıktır. Ayrıca akrilamid toksik bir maddedir. Amplifikasyon ürününün boyutunun 1 nükleotid hassasiyetle belirlenmesi ihtiyacı nadiren ortaya çıktığından, rutin çalışmalarda yatay elektroforez yöntemi kullanılır.

3.4 Amplifikasyon reaksiyonunun ilerlemesinin izlenmesi

3.4.1 Pozitif kontroller

İstenilen mikroorganizmanın DNA preparatı "pozitif kontrol" olarak kullanılır. Spesifik olmayan amplikonların boyutu, bir kontrol DNA preparatı ile amplifikasyonun sonucu olarak oluşan amplikonlardan farklıdır. Spesifik olmayan ürünler, pozitif kontrolle karşılaştırıldığında boyut olarak daha büyük veya daha küçük olabilir. En kötü durumda bu boyutlar çakışabilir ve elektroforezde pozitif olarak okunabilir.

Ortaya çıkan amplifikasyon ürününün özgüllüğünü kontrol etmek için, enzim etiketleri veya radyoaktif izotoplarla etiketlenmiş ve primerlerle aynı prensiplere uygun olarak DNA ile etkileşime giren hibridizasyon problarını (amplifiye edilmiş dizi içinde yer alan DNA bölümleri) kullanabilirsiniz. Bu, analizi önemli ölçüde karmaşıklaştırır ve uzatır ve maliyeti önemli ölçüde artar.

3.4.2 İç kontroller

Reaksiyon karışımıyla her tüpte amplifikasyonun ilerleyişinin izlenmesi gereklidir. Bu amaçla ek olarak “iç kontrol” adı verilen bir sistem kullanılır. İstenilen mikroorganizmanın DNA'sına benzemeyen herhangi bir DNA preparatıdır. Reaksiyon karışımına bir dahili kontrol eklenirse bu, istenen bulaşıcı ajanın kromozomal DNA'sı ile primer tavlama için aynı hedef haline gelecektir. Dahili kontrol amplifikasyon ürününün boyutu, arzu edilen mikroorganizma DNA'sının amplifikasyonundan oluşan amplikonlardan 2 veya daha fazla kat daha büyük olacak şekilde seçilir. Sonuç olarak, reaksiyon karışımına test numunesi ile birlikte dahili kontrol DNA'sı eklenirse, biyolojik numunede bir mikroorganizmanın varlığına bakılmaksızın dahili kontrol, spesifik amplikonların oluşumuna neden olur, ancak önemli ölçüde daha uzun (daha ağır) olur. mikroorganizmanın amplikonundan daha fazladır. Reaksiyon karışımında ağır amplikonların varlığı, amplifikasyon reaksiyonunun normal ilerleyişini ve inhibitörlerin yokluğunu gösterecektir. Gerekli boyutta amplikonlar oluşturulmamışsa ve aynı zamanda dahili kontrol amplikonları da oluşturulmamışsa, analiz edilen örnekte ortadan kaldırılması gereken istenmeyen safsızlıkların olduğu, ancak istenen DNA'nın yokluğuyla ilgili olmadığı sonucuna varabiliriz.

Ne yazık ki bu yaklaşımın tüm çekiciliğine rağmen önemli bir kusuru var. Reaksiyon karışımında istenen DNA mevcutsa, primerler için dahili kontrol ile rekabet nedeniyle amplifikasyonunun verimliliği keskin bir şekilde azalır. Bu, özellikle test numunesindeki düşük DNA konsantrasyonlarında önemlidir ve bu da yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.

Bununla birlikte, primerler için rekabet sorununun çözülmesi koşuluyla, amplifikasyon verimliliğinin izlenmesine yönelik bu yöntem kesinlikle çok yararlı olacaktır.

4. Polimeraz zincir reaksiyonuna dayalı yöntemler

4.1 Niteliksel analiz

Yukarıda prensipleri ana hatlarıyla belirtilen klasik PCR gerçekleştirme yöntemi, PCR'nin sınırlamalarını aşmayı ve reaksiyonun etkinliğini arttırmayı amaçlayan bazı modifikasyonlarla geliştirilmiştir.

4.1.1 “Sıcak başlatma” kullanarak PCR gerçekleştirme yöntemi

Spesifik olmayan amplifikasyon reaksiyon ürünlerinin oluşma riskini azaltmak için "Sıcak başlangıç" adı verilen bir yaklaşım kullanılır. Bunun özü, test tüpünde primerlerin spesifik tavlanmasını sağlayan koşullar elde edilene kadar reaksiyonun başlamasını önlemektir.

Gerçek şu ki, GC bileşimine ve boyutuna bağlı olarak primerlerin belirli bir erime sıcaklığı (Tm) vardır. Sistem sıcaklığı Tm'yi aşarsa, primer DNA zincirine yapışamaz ve denatüre olur. Optimum koşullara tabi olarak, yani. Erime sıcaklığına yakın bir tavlama sıcaklığına sahip olan primer, ancak tamamen tamamlayıcı olması durumunda çift sarmallı bir molekül oluşturur ve böylece reaksiyonun spesifikliğini sağlar.

"Sıcak başlangıç" uygulamak için çeşitli seçenekler vardır:

Tüpün denatürasyon sıcaklığına ısıtılmasından sonraki ilk döngü sırasında reaksiyon karışımına Taq polimerazın eklenmesi.

Reaksiyon karışımının bileşenlerinin bir parafin tabakası ile katmanlara (alt kısımda - primerler, üst kısımda - Taq polimeraz ve DNA hedefleri) ayrılması, bunlar parafin eridiğinde (~ 65-75 0 C) karıştırılır.

Taq polimeraza karşı monoklonal antikorların kullanımı. Monoklonal antikorlar tarafından bağlanan enzim, ancak ilk denatürasyon aşamasından sonra, monoklonal antikorlar geri döndürülemez şekilde denatüre edildiğinde ve Taq polimerazın aktif bölgelerini serbest bıraktığında aktif hale gelir.

Yukarıdaki durumların tümünde, sıcaklık döngüsünün başlamasından önce spesifik olmayan tavlama meydana gelse bile uzama meydana gelmez ve ısıtma üzerine primer-DNA kompleksleri denatüre olur, dolayısıyla spesifik olmayan ürünler oluşmaz. Daha sonra test tüpündeki sıcaklık, erime sıcaklığının altına düşmez, bu da spesifik bir amplifikasyon ürününün oluşmasını sağlar.

4.1.2 RNA moleküllerinin tespiti

RNA'nın PCR için hedef olarak kullanılması olasılığı, bu yöntemin uygulama aralığını önemli ölçüde genişletmektedir. Örneğin birçok virüsün (hepatit C, influenza virüsü, pikornavirüsler vb.) genomları RNA ile temsil edilir. Üstelik yaşam döngülerinde DNA'ya dönüşümün ara aşaması yoktur. RNA'nın tespit edilebilmesi için öncelikle DNA formuna dönüştürülmesi gerekir. Bunu yapmak için iki farklı virüsten izole edilen ters transkriptaz kullanılır: kuş miyeloblastoz virüsü ve Moloney murin lösemi virüsü. Bu enzimlerin kullanımı bazı zorluklarla ilişkilidir. Her şeyden önce, bunlar termolabildir ve bu nedenle 42° C'yi aşmayan sıcaklıklarda kullanılabilir. Bu sıcaklıkta RNA molekülleri kolaylıkla ikincil yapılar oluşturduğundan, reaksiyon verimliliği önemli ölçüde azalır ve çeşitli tahminlere göre yaklaşık %5'tir. Ters transkriptaz olarak Mn2+ varlığında transkriptaz aktivitesi sergileyen termofilik mikroorganizma Thermus Thermophilus'tan elde edilen termostabil bir polimeraz kullanılarak bu dezavantajın üstesinden gelmek için girişimlerde bulunulmaktadır. Hem polimeraz hem de transkriptaz aktivitesini gösterebilen bilinen tek enzimdir.

Ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için reaksiyon karışımı, tıpkı PCR'de olduğu gibi, primer olarak primerleri ve yapı malzemesi olarak 4 dNTP'den oluşan bir karışımı içermelidir.

Ters transkripsiyon reaksiyonunun gerçekleştirilmesinden sonra ortaya çıkan cDNA molekülleri, PCR için bir hedef görevi görebilir.

5. PCR gerçekleştirmenin teknolojik sürecinin organizasyonu

Polimeraz zincir reaksiyonunun potansiyel olarak yüksek hassasiyeti, PCR laboratuvarının özellikle dikkatli tasarımını kesinlikle gerekli kılmaktadır. Bunun nedeni, yöntemin en akut sorunu olan kirlenmedir.

Kontaminasyon, amplifikasyon reaksiyonunda hedef görevi görebilecek ve yanlış pozitif sonuçlar verebilecek spesifik DNA moleküllerinin dış ortamdan reaksiyon karışımına girmesidir.

Bu nahoş olayla mücadele etmenin birkaç yolu var. Bunlardan biri N-urasil glikosilaz (UG) enziminin kullanılmasıdır. Bu yöntem, UG'nin gömülü urasil ile DNA moleküllerini parçalama yeteneğine dayanmaktadır. Amplifikasyon reaksiyonu, dTTP'nin urasil ile değiştirildiği bir dNTP karışımı kullanılarak gerçekleştirilir ve termal döngüden sonra test tüpünde oluşan tüm amplikonlar urasil içerecektir. Eğer CG amplifikasyondan önce reaksiyon karışımına eklenirse, reaksiyon karışımına giren amplikonlar yok edilirken, doğal DNA bozulmadan kalacak ve daha sonra amplifikasyon için bir hedef olarak hizmet edecektir.

Dolayısıyla bu yöntem, kontaminasyonun kaynağını yalnızca bir dereceye kadar ortadan kaldırır ve yanlış pozitif sonuçlara karşı garanti vermez.

Kirlenmenin sonuçlarıyla mücadele etmenin bir başka yolu da reaksiyon döngülerinin sayısını (25-30 döngüye kadar) önemli ölçüde azaltmaktır. Ancak bu yaklaşımla bile yanlış pozitif sonuç alma riski yüksektir, çünkü bu durumda inhibitörlerin yokluğunda kontaminasyon nedeniyle amplifikasyon ürünü elde etmek kolaydır.

Bu nedenle, yanlış pozitif sonuçlara neden olan DNA moleküllerini etkisiz hale getirmeyi amaçlayan ön amplifikasyon önlemlerinin yararlarına rağmen, en radikal çözüm, iyi düşünülmüş bir laboratuvar organizasyonudur.

Çözüm

PCR yöntemi şu anda çeşitli bulaşıcı hastalıkların teşhisinde bir yöntem olarak en yaygın şekilde kullanılmaktadır. PCR, analiz için alınan örnek patojenin yalnızca birkaç DNA molekülünü içerse bile enfeksiyonun etiyolojisini tanımlamanıza olanak tanır. PCR, HIV enfeksiyonlarının, viral hepatitlerin vb. erken tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Günümüzde PCR ile tespit edilemeyen enfeksiyon etkeni neredeyse yoktur.

Kısa bir süre önce, insanlarda görülen çeşitli bulaşıcı hastalıkların teşhisine yönelik güvenilir, son derece hassas ve hızlı bir yöntem geliştirildi. Bu yönteme “PCR analizi” adı verilmektedir. Nedir, özü nedir, hangi mikroorganizmaları tanımlayabildiğini ve nasıl doğru şekilde alınacağını yazımızda anlatacağız.

Keşif tarihi

Kanser tanısında PCR yöntemlerinden de yararlanılıyor.

Yöntemin avantajları

PCR teşhisinin bir takım avantajları vardır:

Yüksek hassasiyet. Sadece birkaç mikroorganizma DNA molekülü mevcut olsa bile PCR analizi enfeksiyonun varlığını belirler. Yöntem kronik ve gizli hastalıklara yardımcı olacaktır. Çoğu zaman bu gibi durumlarda mikroorganizma başka şekilde kültüre edilemez.
Tükürük, kan, genital salgılar, saç, epitel hücreleri gibi herhangi bir materyal araştırma için uygundur. En yaygın olanı kan ve ürogenital yaymanın PCR testidir.
Uzun süreli mahsul ekimine gerek yoktur. Otomatik teşhis süreci, araştırma sonuçlarını 4-5 saat sonra almanızı sağlar.
Yöntem neredeyse yüzde yüz güvenilirdir. Yalnızca izole yanlış negatif sonuç vakaları kaydedilmiştir.
Bir malzeme örneğinden çeşitli patojen türlerini tanımlama yeteneği. Bu sadece hastalığın teşhis sürecini hızlandırmakla kalmaz, aynı zamanda malzeme maliyetlerini de önemli ölçüde azaltır. Çoğu zaman doktor karmaşık bir PCR testi önerir. Altı patojenin tanımlanmasından oluşan bir incelemenin maliyeti yaklaşık 1.500 ruble.

Bir PCR çalışması yaparken sonuçların güvenilir olması için, teşhis için ön hazırlık önerilerini izleyerek testi yapmanız gerekir:

Tükürük bağışlamadan önce, materyali toplamadan 4 saat önce yemek yemekten ve ilaç almaktan kaçınmalısınız. İşlemden hemen önce ağzınızı kaynamış su ile çalkalayın.
Yanağın iç yüzeyinden örnek alınırken de yukarıdaki kurallara uyulmalıdır. Durulamadan sonra bezin salgısını serbest bırakmak için cilde hafif bir masaj yapılması tavsiye edilir.
İdrar genellikle evde toplanır. Bunu yapmak için cinsel organları iyice temizlemeniz gerekir. Steril plastik bir kapta 50-60 ml idrar toplanmalıdır. Malzemenin saflığını sağlamak için kadınların vajinaya tampon yerleştirmesi, erkeklerin ise deri kıvrımını mümkün olduğu kadar geri çekmesi önerilir. Regl döneminiz boyunca malzeme bağışı yapamazsınız.
Sperm bağışlamak için materyali toplamadan önce 3 gün boyunca cinsel ilişkiden uzak durmalısınız. Doktorlar ayrıca saunaya gitmekten, sıcak banyo yapmaktan, alkol ve baharatlı yiyecekler içmekten kaçınmanızı tavsiye ediyor. Testten 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız.
Örneğin klamidya için PCR testi yapılıyorsa hem kadın hem de erkeğin 3 gün cinsel istirahat etmesi önerilir. Testten 2 hafta önce antibakteriyel ilaç almamalısınız. Bir hafta boyunca özel jeller, merhemler, vajinal fitiller ve duş kullanmayı bırakmanız gerekir. Testten 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız. Adet sırasında materyal toplanmaz, kanama durduktan sadece 3 gün sonra ürogenital smear alınabilir.

Hamilelik sırasında PCR

Bir bebeği beklerken cinsel yolla bulaşan birçok bulaşıcı hastalık, fetüsün normal gelişimi için son derece tehlikelidir. Cinsel yolla bulaşan hastalıklar intrauterin büyüme geriliğine, düşük veya erken doğuma ve çocukta konjenital kusurlara neden olabilir. Bu nedenle hamileliğin erken dönemlerinde PCR testi yaptırmak son derece önemlidir. Teste kayıt sırasında girilmelidir - 12 haftaya kadar.

Malzeme özel bir fırça kullanılarak rahim ağzı kanalından toplanır. İşlem ağrısızdır ve bebek için tehlike oluşturmaz. Tipik olarak hamilelik sırasında, PCR yönteminin yanı sıra üreaplazmoz, mikoplazmoz, sitomegalovirüs, herpes ve papillomavirüs kullanılarak klamidya için bir analiz yapılır. Bu inceleme setine PCR-6 adı verilir.

HIV tanısı için PCR

Yöntemin vücuttaki değişikliklere ve tanısal koşullara karşı oldukça duyarlı olması nedeniyle birçok faktör sonucu etkileyebilmektedir. Bu nedenle HIV enfeksiyonu için PCR analizi güvenilir bir yöntem değildir, etkinliği %96-98'dir. Vakaların geri kalan %2-4'ünde test yanlış pozitif sonuçlar verir.

Ancak bazı durumlarda HIV'in PCR teşhisi olmadan yapamazsınız. Genellikle yanlış negatif ELISA sonucu olan kişilere yapılır. Bu tür göstergeler, kişinin henüz virüse karşı antikor geliştirmediğini ve sayıda birden fazla artış olmadan tespit edilemeyeceğini gösteriyor. PCR yöntemi kullanılarak kan testi yapılarak tam olarak bu elde edilebilir.

Bu tür teşhisler, HIV pozitif bir anneden doğan yaşamın ilk yılındaki çocuklar için de gereklidir. Yöntem, bir çocuğun durumunu güvenilir bir şekilde belirlemenin tek yoludur.

Hepatit tanısı için PCR

Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi, hepatit A, B, C virüsünün DNA'sını, enfeksiyona karşı antikor oluşumundan veya hastalık semptomlarının ortaya çıkmasından çok önce tespit etmenizi sağlar. Hepatit C için PCR testi özellikle etkilidir, çünkü vakaların% 85'inde bu hastalık asemptomatiktir ve zamanında tedavi olmadan kronikleşir.

Patojenin zamanında tespiti, komplikasyonları ve uzun süreli tedaviyi önlemeye yardımcı olacaktır.

Kapsamlı PCR incelemesi

Kapsamlı PCR analizi: mikoplazma genitalium, mikoplazma hominis, Gardnerella vajinalis, kandida, trikomonas, sitomegalovirüs, herpes tip 1 ve 2, gonore, papillomavirüs gibi çeşitli enfeksiyon türlerinin eşzamanlı tespitini içeren polimesik zincir reaksiyon yöntemini kullanarak inceleme. Bu tür teşhislerin fiyatı 2000 ila 3500 ruble arasında değişmektedir. kliniğe, kullanılan malzeme ve ekipmana ve analiz türüne bağlı olarak: niteliksel veya niceliksel. Sizin durumunuzda hangisinin gerekli olduğuna doktorunuz karar verecektir. Bazı durumlarda patojenin varlığını belirlemek yeterlidir, diğerlerinde ise örneğin HIV enfeksiyonunda kantitatif titre önemli bir rol oynar. Yukarıdaki patojenlerin tümü teşhis edilirken yapılan incelemeye “PCR-12 analizi” denir.

Analiz sonuçlarının kodunun çözülmesi

PCR analizinin şifresini çözmek zor değildir. Yalnızca 2 gösterge ölçeği vardır - “olumlu sonuç” ve “negatif sonuç”. Bir patojen tespit edilirse doktorlar hastalığın varlığını %99 güvenle doğrulayabilir ve hastayı tedavi etmeye başlayabilir. Enfeksiyonu belirlemenin kantitatif yöntemiyle, tespit edilen bakterilerin sayısal göstergesi ilgili sütunda gösterilecektir. Sadece bir doktor hastalığın derecesini belirleyebilir ve gerekli tedaviyi önerebilir.

Bazı durumlarda, örneğin PCR yöntemini kullanarak HIV enfeksiyonunu belirlerken, sonuç negatifse, elde edilen göstergeleri doğrulamak için ek incelemelerin yapılması gerekli hale gelir.

Nerede test yaptırabilirim?

PCR testi nerede yapılır: devlet kliniğinde mi yoksa özel bir laboratuvarda mı? Ne yazık ki, belediyeye ait sağlık kurumlarında ekipman ve yöntemler sıklıkla güncelliğini yitirmektedir. Bu nedenle modern ekipmanlara ve kalifiye personele sahip özel laboratuvarların tercih edilmesi daha doğru olacaktır. Üstelik özel bir klinikte çok daha hızlı sonuç alırsınız.

Moskova'da birçok özel laboratuvar, çeşitli enfeksiyonlar için PCR testi sunmaktadır. Örneğin “Vita”, “Karmaşık Klinik”, “Mutlu Aile”, “Uro-Pro” gibi kliniklerde PCR analizi yapılmaktadır. Sınavın fiyatı 200 ruble. Bir patojeni tanımlamak için.

Çoğu durumda PCR yöntemini kullanarak bulaşıcı hastalıkların teşhisinin, enfeksiyonun erken aşamalarında vücuttaki patojeni tespit etmenin hızlı ve güvenilir bir yolu olduğu sonucuna varılabilir. Ancak yine de bazı durumlarda diğer teşhis yöntemlerini seçmeye değer. Böyle bir çalışmanın gerekliliğini yalnızca bir uzman belirleyebilir. PCR analizinin deşifre edilmesi de profesyonel bir yaklaşım gerektirir. Doktorunuzun tavsiyelerine uyun ve kendinize gereksiz tetkikler yaptırmayın.