Polimeraz zincir reaksiyonu, özü ve uygulama alanları. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve uygulaması Polimeraz zincir reaksiyonu PCR yöntemi

Kısa bir süre önce, insanlarda görülen çeşitli bulaşıcı hastalıkların teşhisine yönelik güvenilir, son derece hassas ve hızlı bir yöntem geliştirildi. Bu yönteme “PCR analizi” adı verilmektedir. Nedir, özü nedir, hangi mikroorganizmaları tanımlayabildiğini ve nasıl doğru şekilde alınacağını yazımızda anlatacağız.

Keşif tarihi

Kanser tanısında PCR yöntemlerinden de yararlanılıyor.

Yöntemin avantajları

PCR teşhisinin bir takım avantajları vardır:

Yüksek hassasiyet. Sadece birkaç mikroorganizma DNA molekülü mevcut olsa bile PCR analizi enfeksiyonun varlığını belirler. Yöntem kronik ve gizli hastalıklara yardımcı olacaktır. Çoğu zaman bu gibi durumlarda mikroorganizma başka şekilde kültüre edilemez.
Tükürük, kan, genital salgılar, saç, epitel hücreleri gibi herhangi bir materyal araştırma için uygundur. En yaygın olanı kan ve ürogenital yaymanın PCR testidir.
Uzun süreli mahsul ekimine gerek yoktur. Otomatik teşhis süreci, araştırma sonuçlarını 4-5 saat sonra almanızı sağlar.
Yöntem neredeyse yüzde yüz güvenilirdir. Yalnızca izole yanlış negatif sonuç vakaları kaydedilmiştir.
Bir malzeme örneğinden çeşitli patojen türlerini tanımlama yeteneği. Bu sadece hastalığın teşhis sürecini hızlandırmakla kalmaz, aynı zamanda malzeme maliyetlerini de önemli ölçüde azaltır. Çoğu zaman doktor karmaşık bir PCR testi önerir. Altı patojenin tanımlanmasından oluşan bir incelemenin maliyeti yaklaşık 1.500 ruble.

Bir PCR çalışması yaparken sonuçların güvenilir olması için, teşhis için ön hazırlık önerilerini izleyerek testi yapmanız gerekir:

Tükürük bağışlamadan önce, materyali toplamadan 4 saat önce yemek yemekten ve ilaç almaktan kaçınmalısınız. İşlemden hemen önce ağzınızı kaynamış su ile çalkalayın.
Yanağın iç yüzeyinden örnek alınırken de yukarıdaki kurallara uyulmalıdır. Durulamadan sonra bezin salgısını serbest bırakmak için cilde hafif bir masaj yapılması tavsiye edilir.
İdrar genellikle evde toplanır. Bunu yapmak için cinsel organları iyice temizlemeniz gerekir. Steril plastik bir kapta 50-60 ml idrar toplanmalıdır. Malzemenin saflığını sağlamak için kadınların vajinaya tampon yerleştirmesi, erkeklerin ise deri kıvrımını mümkün olduğu kadar geri çekmesi önerilir. Regl döneminiz boyunca malzeme bağışı yapamazsınız.
Sperm bağışlamak için materyali toplamadan önce 3 gün boyunca cinsel ilişkiden uzak durmalısınız. Doktorlar ayrıca saunaya gitmekten, sıcak banyo yapmaktan, alkol ve baharatlı yiyecekler içmekten kaçınmanızı tavsiye ediyor. Testten 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız.
Örneğin klamidya için PCR testi yapılıyorsa hem kadın hem de erkeğin 3 gün cinsel istirahat etmesi önerilir. Testten 2 hafta önce antibakteriyel ilaç almamalısınız. Bir hafta boyunca özel jeller, merhemler, vajinal fitiller ve duş kullanmayı bırakmanız gerekir. Testten 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız. Adet sırasında materyal toplanmaz, kanama durduktan sadece 3 gün sonra ürogenital smear alınabilir.

Hamilelik sırasında PCR

Bir bebeği beklerken cinsel yolla bulaşan birçok bulaşıcı hastalık, fetüsün normal gelişimi için son derece tehlikelidir. Cinsel yolla bulaşan hastalıklar intrauterin büyüme geriliğine, düşük veya erken doğuma ve çocukta konjenital kusurlara neden olabilir. Bu nedenle hamileliğin erken dönemlerinde PCR testi yaptırmak son derece önemlidir. Teste kayıt sırasında girilmelidir - 12 haftaya kadar.

Malzeme özel bir fırça kullanılarak rahim ağzı kanalından toplanır. İşlem ağrısızdır ve bebek için tehlike oluşturmaz. Tipik olarak hamilelik sırasında, PCR yönteminin yanı sıra üreaplazmoz, mikoplazmoz, sitomegalovirüs, herpes ve papillomavirüs kullanılarak klamidya için bir analiz yapılır. Bu inceleme setine PCR-6 adı verilir.

HIV tanısı için PCR

Yöntemin vücuttaki değişikliklere ve tanısal koşullara karşı oldukça duyarlı olması nedeniyle birçok faktör sonucu etkileyebilmektedir. Bu nedenle HIV enfeksiyonu için PCR analizi güvenilir bir yöntem değildir, etkinliği %96-98'dir. Vakaların geri kalan %2-4'ünde test yanlış pozitif sonuçlar verir.

Ancak bazı durumlarda HIV'in PCR teşhisi olmadan yapamazsınız. Genellikle yanlış negatif ELISA sonucu olan kişilere yapılır. Bu tür göstergeler, kişinin henüz virüse karşı antikor geliştirmediğini ve sayıda birden fazla artış olmadan tespit edilemeyeceğini gösteriyor. PCR yöntemi kullanılarak kan testi yapılarak tam olarak bu elde edilebilir.

Bu tür teşhisler, HIV pozitif bir anneden doğan yaşamın ilk yılındaki çocuklar için de gereklidir. Yöntem, bir çocuğun durumunu güvenilir bir şekilde belirlemenin tek yoludur.

Hepatit tanısı için PCR

Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi, enfeksiyona karşı antikor oluşumundan veya hastalık semptomlarının ortaya çıkmasından çok önce hepatit A, B, C virüsünün DNA'sını tespit etmenizi sağlar. Hepatit C için PCR testi özellikle etkilidir, çünkü vakaların% 85'inde bu hastalık asemptomatiktir ve zamanında tedavi olmadan kronikleşir.

Patojenin zamanında tespiti, komplikasyonları ve uzun süreli tedaviyi önlemeye yardımcı olacaktır.

Kapsamlı PCR incelemesi

Kapsamlı PCR analizi: mikoplazma genitalium, mikoplazma hominis, Gardnerella vajinalis, kandida, trikomonas, sitomegalovirüs, herpes tip 1 ve 2, gonore, papillomavirüs gibi çeşitli enfeksiyon türlerinin eşzamanlı olarak belirlenmesini içeren polimesik zincir reaksiyon yöntemini kullanarak inceleme. Bu tür teşhislerin fiyatı 2000 ila 3500 ruble arasında değişmektedir. kliniğe, kullanılan malzeme ve ekipmana ve analiz türüne bağlı olarak: niteliksel veya niceliksel. Sizin durumunuzda hangisinin gerekli olduğuna doktorunuz karar verecektir. Bazı durumlarda patojenin varlığını belirlemek yeterlidir, diğerlerinde ise örneğin HIV enfeksiyonunda kantitatif titre önemli bir rol oynar. Yukarıdaki patojenlerin tümü teşhis edilirken yapılan incelemeye “PCR-12 analizi” denir.

Analiz sonuçlarının kodunun çözülmesi

PCR analizinin şifresini çözmek zor değildir. Yalnızca 2 gösterge ölçeği vardır - “olumlu sonuç” ve “negatif sonuç”. Bir patojen tespit edilirse doktorlar hastalığın varlığını %99 güvenle doğrulayabilir ve hastayı tedavi etmeye başlayabilir. Enfeksiyonu belirlemenin kantitatif yöntemiyle, tespit edilen bakterilerin sayısal göstergesi ilgili sütunda gösterilecektir. Sadece bir doktor hastalığın derecesini belirleyebilir ve gerekli tedaviyi önerebilir.

Bazı durumlarda, örneğin PCR yöntemini kullanarak HIV enfeksiyonunu belirlerken, sonuç negatifse, elde edilen göstergeleri doğrulamak için ek incelemelerin yapılması gerekli hale gelir.

Nerede test yaptırabilirim?

PCR testi nerede yapılır: devlet kliniğinde mi yoksa özel bir laboratuvarda mı? Ne yazık ki, belediyeye ait sağlık kurumlarında ekipman ve yöntemler sıklıkla güncelliğini yitirmektedir. Bu nedenle modern ekipmanlara ve kalifiye personele sahip özel laboratuvarların tercih edilmesi daha doğru olacaktır. Üstelik özel bir klinikte çok daha hızlı sonuç alırsınız.

Moskova'da birçok özel laboratuvar, çeşitli enfeksiyonlar için PCR testi sunmaktadır. Örneğin “Vita”, “Karmaşık Klinik”, “Mutlu Aile”, “Uro-Pro” gibi kliniklerde PCR analizi yapılmaktadır. Sınavın fiyatı 200 ruble. Bir patojeni tanımlamak için.

Çoğu durumda PCR yöntemini kullanarak bulaşıcı hastalıkların teşhisinin, enfeksiyonun erken aşamalarında vücuttaki patojeni tespit etmenin hızlı ve güvenilir bir yolu olduğu sonucuna varılabilir. Ancak yine de bazı durumlarda diğer teşhis yöntemlerini seçmeye değer. Böyle bir çalışmanın gerekliliğini yalnızca bir uzman belirleyebilir. PCR analizinin deşifre edilmesi de profesyonel bir yaklaşım gerektirir. Doktorunuzun tavsiyelerine uyun ve kendinize gereksiz tetkikler yaptırmayın.

Genellikle virüslerin gösterilmesi ve tanımlanması için hızlı bir yöntem olarak kullanılır.

Bu yöntem ilk olarak 1983 yılında K. Mullis (ABD) tarafından geliştirilmiştir. Yüksek duyarlılığı, özgüllüğü ve uygulama kolaylığı nedeniyle genetik, adli tıp, teşhis ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Yöntemin özü amplifikasyondur, yani. bir DNA molekülünün kesin olarak tanımlanmış parçalarının in vitro kopya sayısının arttırılması. Bu yöntem bir matris mekanizmasını ve tamamlayıcılık ilkesini kullanır. İki tek polinükleotid zinciri (nükleik asit), birinin nükleotid dizileri diğerinin nükleotid dizileriyle tam olarak eşleştiğinde, azotlu bazları adenin-timin ve guanin-sitosin oluşturabiliyorsa, hidrojen bağları ile tek sarmallı bir zincire bağlanma kapasitesine sahiptir. çiftler.

PCR, iki primerden başlayarak karşılıklı olarak tamamlayıcı DNA şeritlerini sentezleyen, termostabil bir DNA polimeraz kullanılarak DNA amplifikasyonuna dayanmaktadır. Primer, 20-30 nükleotidden oluşan bir DNA parçasıdır. Bu primerler karşıt DNA ipliklerini tamamlayıcı niteliktedir. DNA sentezi sırasında, yeni sentezlenen DNA moleküllerinin zincirine primerler eklenir.

Genellikle PCR 25-40 döngüde gerçekleştirilir. Her döngü üç aşamadan oluşur: ilki 92-95 °C'de denatürasyondur. Bu durumda iki DNA zinciri birbirinden ayrılır; ikincisi tavlama veya 50-65 ° C'de primerlerin eklenmesi; üçüncüsü 68-72 °C'de uzama veya polimerizasyondur, DNA polimeraz ise dört tip nükleotid kullanarak DNA şablon zincirlerinin tamamlayıcı tamamlanmasını gerçekleştirir. Bir döngü sonucunda istenilen genetik materyal iki katına çıkar. Birinci döngüde oluşturulan DNA zincirleri, ikinci döngü vb. için şablon görevi görür. İlk döngüden sonra yalnızca iki primer arasındaki parça amplifiye edilir. Böylece, amplifiye edilmiş bölgenin kopya sayısı iki katına çıkar, bu da 25-40 döngüde milyonlarca (2 n) DNA fragmanının sentezlenmesini mümkün kılar - çeşitli yöntemlerle gösterilmeleri için yeterli bir miktar (belirli bir miktar içeren hibridizasyon probları yöntemi). etiket, elektroforez vb.) . Daha sıklıkla bu amaç için etidyum bromür boyamalı agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir patojenin DNA kesitlerinden PCR'de, yalnızca belirli bir patojene özgü benzersiz bir nükleotid dizisine sahip primerler kullanılır.

PCR gerçekleştirme prosedürü aşağıdakilere indirgenir: incelenen materyalden bir DNA matrisi izole edilir; bir test tüpünde izole edilmiş DNA, DNA polimeraz, 4 tip nükleotidin tamamı, 2 tip primer, MgCl, tampon, deiyonize su ve mineral yağ içeren bir amplifikasyon karışımı ile birleştirilir. Daha sonra tüpler bir döngüleyiciye yerleştirilir ve amplifikasyon, patojenin türüne karşılık gelen belirli bir programa göre otomatik olarak gerçekleştirilir. Sonuçlar, DNA fragmanları ile birleşen ve jel bir transillüminatör üzerinde UV ışınlarına maruz bırakıldığında parlak bantlar şeklinde ortaya çıkan etidyum bromür varlığında %1-2 agaroz jelinde elektroforez ile daha sık kaydedilir. Tüm PCR işlemleri 1-2 iş günü sürer.

PCR'nin özgüllüğünü ve duyarlılığını arttırmak için çeşitli seçenekler kullanılır: iç içe PCR; Bir parafin tabakası kullanarak veya polimerazın aktif merkezlerini monoklonal antikorlarla bloke ederek "sıcak başlangıç"lı PCR. Ek olarak, bazı şirketler DNA amplifikasyonu için PCR sürecini hızlandıran ve yanlış pozitif sonuç olasılığını azaltan liyofilize reaktif kitleri de üretmektedir.

Yeni bir teknoloji olan Real-Time PCR şu anda tanıtılıyor. Temel özelliği, polimeraz zincir reaksiyon ürünlerinin birikiminin izlenmesi ve kantitatif analizi ve elde edilen sonuçların otomatik olarak kaydedilmesi ve yorumlanmasıdır. Bu yöntem, PCR için laboratuvar gereksinimlerini azaltan bir elektroforez adımı gerektirmez. Gerçek zamanlı PCR, amplifiye olan DNA'yı tespit etmek için floresan etiketli oligonükleotid probları kullanır. Gerçek zamanlı PCR, bir numunenin 20-60 dakika içinde tam analizine olanak tanır ve teorik olarak bir numunedeki tek bir DNA veya RNA molekülünü bile tespit etmenin bir yoludur.

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonundaki (PCR izleme) ürün tespit sistemi, güçlendirilmiş DNA birikimini döngü döngü izlemenize olanak tanır. Sistem ayrıca hedef DNA'nın iç segmentine bağlanabilen (melezleşebilen) bir oligonükleotid probu içerir. Prob, 5' ucunda bir floresan raportör boyayla ve 3' ucunda bir engelleyici boyayla (söndürücü boya) etiketlenir. PCR ürünü biriktikçe prob ona hibritlenir, ancak raporlayıcı ile bloker arasındaki yakınlık nedeniyle herhangi bir lüminesans meydana gelmez. Dizinin kopyalanması sonucunda polimeraz probun 5' ucuna ulaşır. Polimerazın 5'-3' eksonükleaz aktivitesi, floresan etiketi probun 3' ucundan ayırır, böylece floresan raportörünü sinyal blokerle olan bağlantısından kurtarır, bu da floresansta bir artışa yol açar. Dolayısıyla floresans düzeyi spesifik reaksiyon ürününün miktarıyla orantılıdır. Kapalı tüplerde floresansın varlığıyla PCR sonuçlarının kaydedilmesi önemlidir ve böylece bu yöntemin ana sorunlarından bir diğeri olan amplikonlarla kontaminasyon sorunu çözülmüştür.

PCR'nin avantajları: analiz hızı; yüksek hassasiyet ve özgüllük; minimum miktarda test malzemesi; yürütme kolaylığı ve tam otomasyon imkanı.

PCR'nin duyarlılığı DNA şablonunun bir kopyasının tespitine kadar ulaşabildiğinden, yanlış pozitif sonuç alma tehlikesi yüksektir. Bu nedenle, PCR testi yaparken, bir genetik teşhis laboratuvarının düzen ve çalışma modu açısından özel gereksinimlere kesinlikle uyması gerekir.

PCR, virolojik tanıda var olan tamamlayıcı yöntemlerden biridir. Bu reaksiyon, viral antijenlerin veya virüse özgü antikorların tespit edilemediği ve özellikle latent ve karışık enfeksiyonlarda viral nükleik asit varlığının enfeksiyonun tek kanıtı olabildiği durumlarda viral enfeksiyonların tanısı için çok önemlidir.

Bir hata bulursanız lütfen metnin bir kısmını vurgulayın ve tıklayın. Ctrl+Enter.

Nobel Ödülü'nü aldı.

Yöntemin başlangıcında, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra, DNA sarmalının ipliklerini ayırmak için gereken yüksek sıcaklıkta etkisiz hale getirilen DNA polimerazın reaksiyon karışımına eklenmesi gerekiyordu. Reaksiyon prosedürü nispeten verimsizdi ve çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi önemli ölçüde geliştirildi. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazların kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil olduğu ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildiği ortaya çıktı. Bunların kullanımı PCR'nin basitleştirilmesini ve otomatikleştirilmesini mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edildi Termos suculus ve adlandırılmış Tak-polimeraz. Bu polimerazın dezavantajı, bu enzimin hata düzeltme mekanizmalarına (3"→5" ekzonükleaz aktivitesi) sahip olmaması nedeniyle hatalı bir nükleotidin dahil edilme olasılığının oldukça yüksek olmasıdır. Polimerazlar Pfu Ve Pwo Archaea'dan izole edilenler böyle bir mekanizmaya sahiptir; kullanımları DNA'daki mutasyonların sayısını önemli ölçüde azaltır, ancak işlerinin hızı (işlenebilirlik) diğerlerininkinden daha düşüktür. Tak. Günümüzde karışımlar kullanılmaktadır. Tak Ve Pfu Hem yüksek polimerizasyon hızı hem de yüksek kopyalama doğruluğu elde etmek için.

Yöntemin icadı sırasında Kary Mullis, PCR yönteminin patentini alan Cetus Corporation'da sentetik kimyager olarak çalışıyordu (oligonükleotidleri sentezledi ve bunlar daha sonra genomik DNA ile hibridizasyon yoluyla nokta mutasyonları tespit etmek için kullanıldı). 1992 yılında Cetus, yöntemin ve kullanım patentinin haklarını sattı. Tak-polimeraz şirketi Hofmann-La Roche'u 300 milyon dolara satın aldı. Ancak ortaya çıktı ki Tak-polimeraz, 1980'de Sovyet biyokimyacıları A. Kaledin, A. Slyusarenko ve S. Gorodetsky tarafından ve ayrıca bu Sovyet yayınından 4 yıl önce, yani 1976'da Amerikalı biyokimyacılar Alice Chien, David B. Edgar ve John M. Trela. Bu bağlamda Promega şirketi, Roche'u mahkemede bu enzimin münhasır haklarından vazgeçmeye zorlamaya çalıştı. PCR yöntemine ilişkin ABD patentinin süresi Mart 2005'te doldu.

PCR'nin yürütülmesi

Yöntem, yapay koşullar altında enzimler kullanılarak DNA'nın belirli bir bölümünün tekrarlı seçici kopyalanmasına dayanmaktadır ( laboratuvar ortamında). Bu durumda, yalnızca belirtilen koşulları karşılayan bölüm kopyalanır ve bu bölüm yalnızca incelenen örnekte mevcutsa kopyalanır. Canlı organizmalardaki DNA amplifikasyonunun (replikasyon) aksine, DNA'nın nispeten kısa bölümleri PCR kullanılarak amplifiye edilir. Geleneksel bir PCR işleminde kopyalanan DNA bölümlerinin uzunluğu 3000 baz çiftinden (3 kbp) fazla değildir. Çeşitli polimerazların bir karışımı kullanılarak, katkı maddeleri kullanılarak ve belirli koşullar altında bir PCR fragmanının uzunluğu 20-40 bin nükleotit çiftine ulaşabilir. Bu hala ökaryotik bir hücrenin kromozomal DNA'sının uzunluğundan önemli ölçüde daha azdır. Örneğin insan genomu yaklaşık 3 milyar baz çiftinden oluşur.

Reaksiyon bileşenleri

En basit durumda PCR'yi gerçekleştirmek için aşağıdaki bileşenler gereklidir:

DNA matrisi DNA'nın çoğaltılması gereken bölümünü içeren.
İki astarİstenilen DNA fragmanının farklı iplikçiklerinin karşıt uçlarına tamamlayıcıdır.
Termal olarak kararlı DNA polimeraz- DNA'nın polimerizasyon reaksiyonunu katalize eden bir enzim. PCR'de kullanılacak polimerazın yüksek sıcaklıklarda uzun süre aktif kalması gerekir, bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler kullanılır - Termos suculus(Taq polimeraz), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraz), Pyrococcus woesei(Pwo polimeraz) ve diğerleri.
Deoksiribonükleosit trifosfatlar(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.
Tampon çözümü, gerekli reaksiyon koşullarının sağlanması - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, sığır serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için test tüpüne Vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ ekleyin. Isıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici kullanıyorsanız buna gerek yoktur.

Pirofosfatazın eklenmesi PCR reaksiyonunun verimini artırabilir. Bu enzim, büyüyen DNA zincirine nükleotid trifosfatların eklenmesinin bir yan ürünü olan pirofosfatın ortofosfata hidrolizini katalize eder. Pirofosfat PCR reaksiyonunu inhibe edebilir.

Astarlar

PCR'nin özgüllüğü, şablon ve primerler arasında, 18-30 baz uzunluğunda kısa sentetik oligonükleotidler arasında tamamlayıcı komplekslerin oluşumuna dayanır. Her primer, çift sarmallı şablonun şeritlerinden birine tamamlayıcıdır ve çoğaltılmış bölgenin başlangıcını ve sonunu sınırlar.

Şablonun primer ile hibridizasyonundan (tavlama) sonra, ikincisi, tamamlayıcı şablon ipliğinin sentezi sırasında DNA polimeraz için bir primer görevi görür (bkz.).

Primerlerin en önemli özelliği primer-matris kompleksinin erime sıcaklığıdır (Tm).

Tm, DNA şablonlarının yarısının oligonükleotid primer ile kompleks oluşturduğu sıcaklıktır. K + ve DMSO iyonlarının konsantrasyonunu dikkate alarak kısa bir oligonükleotid (ve uzun DNA fragmanları) için T m'yi hesaplamak için ortalama formül:

burada L, primerdeki nükleotidlerin sayısıdır, K +, potasyum iyonlarının molar konsantrasyonudur, G + C, tüm guaninlerin ve sitozinlerin toplamıdır.

Primerin uzunluğu ve nükleotid bileşimi veya tavlama sıcaklığı yanlış seçilirse, şablon DNA'nın diğer bölgeleriyle kısmen tamamlayıcı komplekslerin oluşması mümkündür ve bu da spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Erime sıcaklığının üst sınırı, aktivitesi 80 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda azalan polimerazın optimum etki sıcaklığı ile sınırlıdır.

Astar seçerken aşağıdaki kriterlere uyulması tavsiye edilir:

Amplifikatör

Pirinç. 1: PCR için Döngüleyici

PCR, genellikle en az 0,1 °C doğrulukla test tüplerinin periyodik olarak soğutulmasını ve ısıtılmasını sağlayan bir cihaz olan termal döngüleyicide gerçekleştirilir. Modern döngüleyiciler, "sıcak başlatma" yeteneği, Touchdown PCR (aşağıya bakınız) ve amplifiye moleküllerin daha sonra 4 °C'de saklanması gibi karmaşık programları ayarlamanıza olanak tanır. Gerçek zamanlı PCR için floresan dedektörle donatılmış cihazlar üretilmektedir. Otomatik kapaklı ve mikroplakalar için bölmeli, bunların otomatik sistemlere entegre edilmesini sağlayan cihazlar da vardır.

Reaksiyonun ilerlemesi

İşaretleyici DNA (ilk ve son yuvalar) ve PCR ürünlerini içeren bir jelin fotoğrafı

Tipik olarak PCR, her biri üç aşamadan oluşan 20-35 döngü gerçekleştirir (Şekil 2).

Denatürasyon

Çift sarmallı DNA şablonu, DNA şeritlerini ayırmak için 0,5-2 dakika süreyle 94-96 °C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98 °C'ye) ısıtılır. Bu aşama denir denatürasyonÇünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları yok edilir. Bazen, ilk döngüden önce (polimerazın eklenmesinden önce), matris ve primerlerin tamamen denatüre olması için reaksiyon karışımı 2-3 dakika önceden ısıtılır. Bu tekniğe denir sıcak başlangıç spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmanıza olanak tanır.

Tavlama

İplikler ayrıldıktan sonra, primerlerin tek iplikli şablona bağlanmasını sağlamak için sıcaklık düşürülür. Bu aşama denir tavlama. Tavlama sıcaklığı primerlerin bileşimine bağlıdır ve genellikle primerlerin erime sıcaklığına eşit olarak seçilir. Tavlama sıcaklığının yanlış seçimi ya primerlerin şablona zayıf bağlanmasına (çok yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına (çok düşük sıcaklıkta) yol açar. Tavlama aşamasının süresi 30 saniyedir, aynı zamanda bu süre zarfında polimeraz zaten birkaç yüz nükleotidi sentezlemeyi başarmaktadır. Bu nedenle erime noktası 60 °C'nin üzerinde olan primerlerin seçilmesi ve tavlama ve uzama işleminin eş zamanlı olarak 60-72 °C'de gerçekleştirilmesi önerilir.

Uzama

DNA polimeraz, primer olarak bir primer kullanarak şablon zincirini çoğaltır. Bu sahne uzama. Polimeraz, şablona bağlanan primerin 3" ucundan ikinci ipliği sentezlemeye başlar ve şablon boyunca hareket ederek 5" ila 3" ucu yönünde yeni bir iplik sentezler. Uzama sıcaklığı, polimeraz. Yaygın olarak kullanılan polimerazlar Taq ve Pfu, 72 °C'de en aktiftir. Uzama süresi, hem DNA polimerazın tipine hem de amplifiye edilmiş parçanın uzunluğuna bağlıdır. Tipik olarak, uzama süresi, bin baz çifti başına bir dakikaya ayarlanır. Tüm döngüler tamamlandıktan sonra sıklıkla ek bir adım gerçekleştirilir son uzama, tüm tek sarmallı parçaları tamamlamak için. Bu aşama 7-10 dakika sürer.

Pirinç. 2: İlk PCR döngüsünün şematik gösterimi. (1) 94-96 °C'de denatürasyon. (2) 68 °C'de tavlama (örneğin). (3) 72°C'de uzama (P=polimeraz). (4) İlk döngü tamamlandı. Ortaya çıkan iki DNA zinciri bir sonraki döngü için şablon görevi görür, böylece şablon DNA miktarı her döngü sırasında iki katına çıkar.

Spesifik reaksiyon ürününün miktarı (primerlerle sınırlı) teorik olarak 2n - 2n ile orantılı olarak artar; burada n, reaksiyon döngülerinin sayısıdır. Aslında her çevrimin verimliliği %100'den az olabilir, dolayısıyla gerçekte P ~ (1+E)n, burada P ürün miktarıdır, E ise çevrimin ortalama verimliliğidir.

"Uzun" DNA kopyalarının sayısı da doğrusal olarak artar, böylece reaksiyon ürünlerinde belirli bir parça baskın olur.

Gerekli ürünün büyümesi reaktiflerin sayısı, inhibitörlerin varlığı ve yan ürünlerin oluşumu ile üstel olarak sınırlıdır. Reaksiyonun son döngülerinde büyüme yavaşlar, buna “plato etkisi” denir.

PCR Türleri

İç içe PCR(İç içe PCR (İngilizce)) - reaksiyon yan ürünlerinin sayısını azaltmak için kullanılır. İki çift primer kullanılır ve iki ardışık reaksiyon gerçekleştirilir. İkinci primer çifti, birinci reaksiyonun ürünü içindeki bir DNA bölgesini güçlendirir.
Ters PCR(Ters PCR (İngilizce)) - istenen sekansta yalnızca küçük bir bölge biliniyorsa kullanılır. Bu yöntem, DNA genoma yerleştirildikten sonra komşu dizilerin belirlenmesi söz konusu olduğunda özellikle faydalıdır. Ters PCR gerçekleştirmek için, kısıtlama enzimleriyle bir dizi DNA kesimi gerçekleştirilir, ardından fragmanların birleştirilmesi (ligasyon) yapılır. Sonuç olarak, bilinen fragmanlar bilinmeyen bölgenin her iki ucunda son bulur ve bundan sonra PCR her zamanki gibi gerçekleştirilebilir.
Ters transkripsiyon PCR(Ters Transkripsiyon PCR, RT-PCR (İngilizce)) - bir RNA kütüphanesinden bilinen bir diziyi çoğaltmak, izole etmek veya tanımlamak için kullanılır. Geleneksel PCR'den önce, ters enzim kullanılarak bir mRNA şablonu üzerinde tek sarmallı bir DNA molekülü sentezlenir ve PCR için şablon olarak kullanılan tek sarmallı bir cDNA elde edilir. Bu yöntem genellikle bu genlerin nerede ve ne zaman ifade edildiğini belirler.
Asimetrik PCR(İngilizce) Asimetrik PCR) - ağırlıklı olarak kaynak DNA iplikçiklerinden birinin çoğaltılması gerektiğinde gerçekleştirilir. Bazı sıralama ve hibridizasyon analiz tekniklerinde kullanılır. Primerlerden birinin çok fazla alınması dışında PCR her zamanki gibi gerçekleştirilir. Bu yöntemin modifikasyonları İngilizcedir. L kulakta- A sonra- T O- e ksponansiyel PCR (LATE-PCR), farklı konsantrasyonlarda primerlerin kullanıldığı ve düşük konsantrasyonlu primerin, yüksek konsantrasyonlu primerden daha yüksek bir erime noktasına (erime noktasına) sahip olacak şekilde seçildiği bir yöntemdir. PCR yüksek bir tavlama sıcaklığında gerçekleştirilir, böylece reaksiyonun etkinliği tüm döngüler boyunca korunur.
Kantitatif PCR(Kantitatif PCR, Q-PCR (İngilizce)) veya Gerçek zamanlı PCR- her reaksiyon döngüsünde belirli bir PCR ürününün miktarının ölçümünü doğrudan izlemek için kullanılır. Bu yöntem, biriken reaksiyon ürününün miktarını doğru bir şekilde ölçmek için floresan etiketli primerleri veya DNA problarını kullanır; veya bir floresan interkalasyon boyası kullanılır Sybr Green Içift sarmallı DNA'ya bağlanan. Sybr Green I spesifik floresan problara veya primerlere ihtiyaç duymadan gerçek zamanlı PCR sırasında PCR ürünlerinin tespiti ve miktarının belirlenmesi için basit ve uygun maliyetli bir seçenek sunar. Amplifikasyon sırasında boya SYBR Yeşil I PCR ürünlerinin DNA'sının küçük oluğuna gömülüdür ve bağlanmamış boyaya kıyasla mavi lazerle ışınlandığında daha güçlü bir floresan sinyali yayar. SYBR Yeşil I gerçek zamanlı PCR için şu anda bilinen tüm cihazlarla uyumludur. Maksimum emilim SYBR Yeşil I 494 nm dalga boyunda bulunur. Ana spektruma ek olarak, boyanın spektrumu iki küçük ek emilim maksimumu içerir - 290 nm ve 380 nm'de. Maksimum emisyon SYBR Yeşil I 521 nm (yeşil) dalga boyunda bulunur.
Adım adım PCR(Touchdown PCR (İngilizce)) - bu yaklaşımı kullanarak spesifik olmayan primer bağlanmasının etkisi azaltılır. İlk döngüler optimum tavlama sıcaklığının üzerindeki bir sıcaklıkta gerçekleştirilir, daha sonra her birkaç döngüde tavlama sıcaklığı kademeli olarak optimum sıcaklığa düşürülür. Bu, primerin tüm uzunluğu boyunca tamamlayıcı iplikle hibritleşeceği şekilde yapılır; oysa optimal tavlama sıcaklığında primer, tamamlayıcı iplikle kısmen hibritleşir. Primerin genomik DNA üzerindeki kısmi hibridizasyonu, eğer primer için çok sayıda bağlanma bölgesi varsa, spesifik olmayan amplifikasyona yol açar. Çoğu durumda, ilk on PCR döngüsü 72-75°C'lik bir tavlama sıcaklığında gerçekleştirilebilir ve daha sonra hemen optimum sıcaklığa, örneğin 60-65°C'ye düşürülebilir.
Moleküler koloni yöntemi(Jelde PCR, İngilizce. Koloni - PCR Kolonisi) - Akrilamid jel yüzeydeki tüm PCR bileşenleriyle polimerize edilir ve PCR gerçekleştirilir. Analiz edilen DNA'yı içeren noktalarda moleküler kolonilerin oluşmasıyla amplifikasyon meydana gelir.
cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu ile PCR(İngilizce) CDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu, RACE-PCR ).
Uzun parça PCR(İngilizce) Uzun menzilli PCR) - DNA'nın genişletilmiş bölümlerinin (10 bin baz veya daha fazla) amplifikasyonu için PCR'nin bir modifikasyonu. İki polimerazın bir karışımı kullanılır; bunlardan biri yüksek işlenebilirliğe sahip Taq polimerazdır (yani, tek geçişte uzun bir DNA zincirini sentezleyebilen), ikincisi ise genellikle 3"-5" eksonükleaz aktivitesine sahip DNA polimerazdır. Pfu polimeraz. Taq polimeraz, tamamlayıcı olmayan bir nükleotid eklenmişse DNA sentezini durdurduğundan, birinci polimerazın neden olduğu hataları düzeltmek için ikinci polimeraz gereklidir. Bu tamamlayıcı olmayan nükleotid, Pfu polimeraz ile uzaklaştırılır. Polimeraz karışımı 50:1 veya hatta 100:1'den daha az bir oranda alınır; burada Taq polimeraz, Pfu polimeraza göre 25-100 kat daha fazla alınır.
RAPD(İngilizce) Polimorfik DNA'nın Rastgele Amplifikasyonu ), polimorfik DNA'nın rastgele amplifikasyonu ile PCR - genetik dizide yakın olan organizmaları, örneğin farklı kültür bitkileri çeşitlerini, köpek ırklarını veya yakından ilişkili mikroorganizmaları ayırt etmek gerektiğinde kullanılır. Bu yöntem genellikle küçük bir primer (yaklaşık 10 bp) kullanır. Bu primer, incelenen organizmaların DNA'sının rastgele bölümlerine kısmen tamamlayıcı olacaktır. Koşulları (primer uzunluğu, bileşimi, sıcaklığı vb.) seçerek, iki organizma için PCR modelinde tatmin edici bir fark elde etmek mümkündür.
Gruba özgü PCR(İngilizce) gruba özgü PCR) - Aynı diziler içindeki veya farklı türler arasındaki ilgili diziler için, bu diziler için korunmuş primerler kullanılarak PCR. Örneğin, ribozomal için evrensel primerlerin seçimi 18S Ve 26S Türe özgü genler arası ayırıcı amplifikasyonu için genler: gen dizisi 18S Ve 26S türler arasında korunur, dolayısıyla bu genler arasındaki PCR test edilen tüm türler için işe yarayacaktır. Bu yöntemin tam tersi: benzersiz PCR(İngilizce) benzersiz PCR), burada görev, ilgili diziler arasından yalnızca belirli bir diziyi çoğaltacak primerleri seçmektir.
Sıcak başlatmayı kullanan PCR(İngilizce) Sıcak başlangıçlı PCR) - Polimeraz aktivitesinin oda sıcaklığında Affibody gibi antikorları simüle eden antikorlar veya küçük moleküller tarafından, yani PCR'deki ilk denatürasyondan önce reaksiyonun kurulması sırasında bloke edildiği DNA polimeraz kullanılarak yapılan bir PCR modifikasyonu. Tipik olarak ilk denatürasyon 95°C'de 10 dakika süreyle gerçekleştirilir.
Sanal PCR(eng. in silico PCR, dijital PCR, elektronik PCR, e-PCR) - genomun potansiyel DNA amplifikasyonunu tahmin etmek için primer dizilerinin (veya DNA problarının) bir listesini kullanan teorik bir polimeraz zincir reaksiyonunun bilgisayar analizinin matematiksel bir yöntemi , kromozom, dairesel DNA veya herhangi bir DNA parçası.

Şablonun nükleotid dizisi kısmen biliniyorsa veya hiç bilinmiyorsa, şunu kullanabilirsiniz: dejenere primerler dizisi, herhangi bir bazın yerleştirilebileceği dejenere konumları içerir. Örneğin primer dizisi şu şekilde olabilir: ...ATH..., burada N, A, T veya C'dir.

PCR uygulaması

PCR birçok alanda test ve bilimsel deneyler amacıyla kullanılmaktadır.

Adli

PCR, sözde "genetik parmak izlerini" karşılaştırmak için kullanılır. Suç mahallinden bir genetik materyal örneği gereklidir - kan, tükürük, meni, saç vb. Bu, şüphelinin genetik materyaliyle karşılaştırılır. Çok az miktarda DNA, teorik olarak tek kopya yeterlidir. DNA parçalara ayrılır ve daha sonra PCR kullanılarak çoğaltılır. Parçalar DNA elektroforezi kullanılarak ayrılır. DNA bantlarının düzeninin ortaya çıkan resmine denir genetik parmak izi(İngilizce) genetik parmak izi).

Babalığın kurulması

Pirinç. 3: PCR ile çoğaltılan DNA fragmanlarının elektroforezinin sonuçları. (1) Baba. (2) Çocuk. (3) Anne. Çocuk, her iki ebeveynin genetik damgasının bazı özelliklerini miras aldı ve bu, yeni, benzersiz bir damga verdi.

Genetik parmak izleri benzersiz olmasına rağmen (tek yumurta ikizleri durumu hariç), birkaç parmak izi alınarak aile ilişkileri yine de kurulabilir (Şekil 3). Organizmalar arasında evrimsel akrabalık kurmak için aynı yöntem biraz değiştirilerek uygulanabilir.

Tıbbi teşhis

PCR, kalıtsal ve viral hastalıkların teşhisini önemli ölçüde hızlandırmayı ve kolaylaştırmayı mümkün kılar. İlgili gen, uygun primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra mutasyonları tanımlamak için sekanslanır. Viral enfeksiyonlar enfeksiyondan hemen sonra, semptomların ortaya çıkmasından haftalar veya aylar önce tespit edilebilir.

Kişiselleştirilmiş tıp

Bazen ilaçlar bazı hastalar için toksik veya alerjen olabiliyor. Bunun nedenleri kısmen ilaç ve türevlerinin duyarlılığı ve metabolizmasındaki bireysel farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Bu farklılıklar genetik düzeyde belirlenir. Örneğin, bir hastada belirli bir sitokrom (yabancı maddelerin metabolize edilmesinden sorumlu bir karaciğer proteini) daha aktifken, diğerinde daha az aktif olabilir. Belirli bir hastanın ne tür sitokroma sahip olduğunu belirlemek için ilacı kullanmadan önce bir PCR analizi yapılması önerilmektedir. Bu analize ön genotipleme denir. ileriye dönük genotipleme).

Gen klonlama

Gen klonlaması (organizmaların klonlanmasıyla karıştırılmamalıdır), genlerin izole edilmesi ve genetik mühendisliği manipülasyonları sonucunda belirli bir genin büyük miktarda ürününün elde edilmesi işlemidir. PCR, bir geni çoğaltmak için kullanılır ve bu daha sonra vektör- yabancı bir geni aynı veya ekime uygun başka bir organizmaya aktaran bir DNA parçası. Örneğin vektör olarak plazmitler veya viral DNA kullanılır. Genlerin yabancı bir organizmaya yerleştirilmesi genellikle o genin ürününü (RNA veya çoğunlukla bir protein) üretmek için kullanılır. Bu şekilde tarım, tıp vb. alanlarda kullanılmak üzere endüstriyel miktarlarda birçok protein elde edilir.

Pirinç. 4: Plazmid kullanılarak gen klonlanması.
(1) A organizmasının kromozomal DNA'sı. (2) PCR. (3) A organizmasının geninin birçok kopyası. (4) Genin bir plazmit içerisine yerleştirilmesi. (5) A organizmasının genini içeren plazmit. (6) Plazmidin B organizmasına dahil edilmesi. (7) B organizmasında A organizmasının geninin kopya sayısının çarpılması.

DNA dizilimi

Floresan etiket veya radyoaktif izotop ile etiketlenmiş dideoksinükleotidlerin kullanıldığı sekanslama yönteminde, PCR ayrılmaz bir parçadır, çünkü polimerizasyon sırasında floresan veya radyoaktif etiketle etiketlenmiş nükleotit türevleri DNA zincirine eklenir. Sentezlenen zincire bir dideoksinükleotidin eklenmesi sentezi sonlandırır ve jelde ayrıldıktan sonra spesifik nükleotidlerin konumunun belirlenmesine olanak tanır.

Mutajenez

Şu anda PCR, mutajenezi (DNA'nın nükleotid dizisini değiştirerek) gerçekleştirmenin ana yöntemi haline gelmiştir. PCR kullanımı, mutajenez prosedürünü basitleştirmeyi ve hızlandırmanın yanı sıra onu daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirmeyi mümkün kılmıştır.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kalıtsal patolojilerin, enfeksiyonların, viral hastalıkların herhangi bir aşamada (akut veya kronik) ve ayrıca - erken bir aşamada - hastalığın belirgin belirtilerinden önce teşhis edilmesi alanında yüksek hassasiyetli bir yöntemdir. Hastadan alınan örneklerde genetik materyal olan DNA, RNA'ya dayanarak patojenlerin tespiti yapılmaktadır. Ve bugün polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemlerinin özü, teşhis aşamaları ve ilkeleri ile maliyeti hakkında konuşacağız.

Polimeraz zincir reaksiyonu nedir

Analizin temeli amplifikasyondur (ikiye katlama) - insan genetik kompleksini temsil eden DNA'nın kısa bir bölümünden (deoksiribonükleik asit) birçok kopyanın oluşturulması. Çalışma çok az miktarda fizyolojik madde (balgam, dışkı, epitel kazıntıları, prostat suyu, kan, sperm, amniyotik sıvı, mukus, plasental doku, idrar, tükürük, plevral sıvı, beyin omurilik sıvısı) gerektirir. Bu durumda örneğin hastanın genitoüriner kanalında tek bir zararlı mikrop bile tespit edilebilmektedir.

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) tekniği, 1993 yılında Nobel Ödülü alan Amerikalı bilim adamı K. Mullis tarafından geliştirildi.

Aktif olarak kullanılanlar:

enfeksiyonların erken tanısında genetik;
Adli tıp muayenesinde, inceleme için çok az miktarda DNA mevcut olduğunda;
veterinerlik, eczacılık, biyoloji, moleküler genetik alanlarında;
bir kişinin DNA ile tanımlanması için babalığın doğrulanması;
paleontoloji, antropoloji, ekoloji (ürünlerin kalitesini, çevresel faktörleri izlerken).

Bu video size polimeraz zincir reaksiyonunun ne olduğunu ayrıntılı olarak anlatacaktır:

Kime reçete edilir?

Bulaşıcı hastalıkların tanısında polimeraz zincir reaksiyonu, özellikle doğruluk ve güvenilirlik açısından en güvenilir yöntemlerden biridir. Örneğin, klamidya ve diğer birçok patojen için PCR analizinin güvenilirliği %100'e yakındır (mutlak). Çoğu zaman, tanı sırasında belirli bir patojeni tanımlamakta zorluk çeken hastalara polimeraz zincir reaksiyonu prosedürü reçete edilir.

Laboratuvar PCR testi kullanılır:

kültür veya immünolojik yöntemler kullanılarak tanımlanması zor olan idrar ve genital organ enfeksiyonlarına neden olan patojenleri tespit etmek;
İlk testin olumlu ancak şüpheli bir sonucu olması durumunda (örneğin, AIDS ile enfekte ebeveynlerden gelen yenidoğanlarda), ilk aşamada HIV'in yeniden teşhisi için;
kanseri erken bir aşamada tanımlamak (onkogen mutasyonlarının incelenmesi) ve belirli bir hasta için tedavi rejimini ayrı ayrı ayarlamak;
kalıtsal patolojilerin erken teşhisi ve potansiyel tedavisi amacıyla.

Bu nedenle, gelecekteki ebeveynler genetik bir patolojinin taşıyıcısı olup olmadıklarını öğrenmek için bir teste girerler, çocuklarda PCR kalıtım yoluyla bulaşan bir hastalığa maruz kalma olasılığını belirler.

gebeliğin erken evrelerinde fetal patolojileri tespit etmek (büyüyen embriyonun bireysel hücreleri olası mutasyonların varlığı açısından incelenir);
organ nakli öncesi hastalarda - “doku tiplendirmesi” için (doku uyumluluğunun belirlenmesi);
bağışlanan kandaki tehlikeli patojen organizmaları tanımlamak;
yenidoğanlarda - gizli enfeksiyonları tanımlamak için;
Antiviral ve antimikrobiyal tedavinin sonuçlarını değerlendirmek.

Neden böyle bir prosedür uygulansın?

PCR, neredeyse% 100 sonuç veren oldukça etkili bir teşhis yöntemi olduğundan, prosedür kullanılır:

nihai tanıyı doğrulamak veya hariç tutmak;
Tedavinin etkinliğinin hızlı değerlendirilmesi.

Çoğu durumda, diğer bakteriyolojik, immünolojik ve virolojik tanı yöntemleri işe yaramazsa, gelişen bir hastalığı tespit etmek için PCR tek olası testtir.

Virüsler, enfeksiyondan hemen sonra ve hastalık belirtileri ortaya çıkmadan önce bir PCR prosedürü kullanılarak tespit edilir. Virüsün erken tespiti hızlı tedaviye olanak sağlar.
Sözde "viral yük" (veya vücuttaki virüs sayısı) da kantitatif bir yöntem kullanılarak DNA analizi ile belirlenir.
Spesifik patojenlerin (örneğin, Koch tüberküloz basili) zordur ve kültürlenmesi çok uzun sürer. PCR testi, test için uygun numunelerde minimum patojenlerin (canlı ve ölü) hızla tespit edilmesini sağlar.

Ayrıntılı patojen DNA analizi kullanılır:

acil tedaviye izin veren belirli antibiyotik türlerine duyarlılığını belirlemek;
evcil ve vahşi hayvanlar arasında salgın hastalıkların yayılmasını kontrol etmek;
Önceki salgınları körükleyen yeni bulaşıcı mikrobiyal türlerin ve patojen alt türlerinin belirlenmesi ve izlenmesi.

Teşhis türleri

Standart yöntem

Polimeraz zincir reaksiyonu analizi, özel primer enzimleri kullanılarak belirli bir DNA ve RNA fragmanının çoklu amplifikasyonu (iki katına çıkarılması) temelinde gerçekleştirilir. Kopyalama zinciri sonucunda araştırma için yeterli miktarda materyal elde edilir.

Prosedür sırasında, yalnızca istenen parça (belirtilen spesifik koşullara karşılık gelen) ve numunede gerçekten mevcut olup olmadığı kopyalanır.

Yararlı diyagramlar içeren bu ayrıntılı video, PCR'nin nasıl çalıştığını açıklamaktadır:

Diğer yöntemler

Gerçek zamanlı PCR. Bu tür araştırmalarda, belirli bir DNA parçasını tanımlama süreci, 30-40 döngüden oluşan zincirin tamamını tamamladıktan sonra değil, her döngüden sonra başlar. Bu tür araştırmalar vücuttaki patojenin (virüs veya mikrop) miktarı hakkında bilgi edinmenizi, yani niceliksel bir analiz yapmanızı sağlar.
RT-PCR (ters transkripsiyon modu). Bu test, genetik temeli RNA olan virüsleri (örneğin, hepatit C virüsü, immün yetmezlik virüsü) tespit etmek amacıyla tek sarmallı RNA'yı aramak için kullanılır. Bu çalışmada özel bir enzim kullanılmış - ters transkriptaz ve spesifik bir primer ve RNA temelinde tek iplikli DNA oluşturulmuştur. Daha sonra bu iplikten ikinci DNA ipliği elde edilir ve standart prosedür uygulanır.

Test için endikasyonlar

PCR prosedürü bulaşıcı hastalıklar, neonatoloji, kadın doğum, pediatri, üroloji, jinekoloji, zührevi hastalık, nöroloji, nefroloji ve oftalmoloji kliniğinde kullanılmaktadır.

Test endikasyonları:

kalıtsal patoloji olasılığı olan bir çocukta genetik anormallik gelişme riskinin belirlenmesi;
hamileliği planlarken her iki ebeveyne veya devam eden hamilelik sırasında annenin ciddi durumuna tanı koymak;
kısırlığın nedenlerini belirleme, kavrama ile ilgili zorluklar;
akut aşamada cinsel yolla bulaşan enfeksiyon şüphesi ve kronik geçiş belirtileri;
bilinmeyen kökenli inflamatuar süreçlerin nedenlerinin tespiti;
korunmasız gündelik ve düzenli cinsel temaslar;
patojenik bir mikroorganizmanın spesifik antibiyotiklere duyarlılığının belirlenmesi;
Gizli enfeksiyon şüphesi olan hastalarda, bariz semptomların ortaya çıkmasından önce patojenlerin tespit edilmesi (klinik öncesi tanı);
Hastaların hastalıktan sonra iyileşmesini doğrulamak için (geriye dönük tanı);

Aşağıdaki patojenleri doğru bir şekilde tanımlamak gerekiyorsa teşhis de kullanılır::

hepatit virüsleri (A BCG), insan immün yetmezliği, sitomegalovirüs;
Vibrio kolera;
herpes simpleks virüsü, herpetiform türler;
retro - adeno - ve rinovirüsler;
kızamıkçık, Epstein-Barr, su çiçeği (Zoster) virüsleri;
parvo ve pikornovirüsler;
bakteri Helicobacter pylori;
Legionella, Escherichia coli'nin patojenik türleri;
Staphylococcus aureus;
patojen;
clostridia, difteri ve hemofilus influenzae;

Ayrıca enfeksiyonları belirlemek için de kullanılır:

Enfeksiyöz mononükleoz;
borreliosis, listeriyoz, kene kaynaklı ensefalit;
Candida mantarlarının neden olduğu kandidiyaz;
cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar – trichomoniasis, ureaplasmosis, treponema pallidum, gardnerelloz, gonore, mikoplazmoz, klamidya;
tüberküloz.

Kontrendikasyonlar

İşlem hastayla, vücuda herhangi bir darbe almadan, araştırma için alınan biyolojik materyalle gerçekleştirildiğinden potansiyel bir tehlike bulunmadığından PCR için herhangi bir kontrendikasyon bulunmamaktadır.

Ancak kolposkopi işlemi sonrasında rahim ağzı kanalından biyomateryal toplanmaz. Smear ve kazımaların analiz için sunulmasına adetin bitiminden ve taburculuğun tamamen kesilmesinden sadece 4-6 gün sonra izin verilir.

Yöntem güvenli mi?

Laboratuvarda biyomateryali üzerinde yapılan izole bir çalışma sırasında hasta üzerinde olumsuz bir etki oluşması mümkün değildir.

Prosedüre hazırlık (biyolojik maddelerin analize sunulması)

Herhangi bir biyolojik sıvı, doku veya vücut salgısı, yabancı bir patojenin DNA'sını tespit eden PCR analizi için örnek görevi görür. Test maddesi damardan kan alınması, gırtlak, burun boşluğu, üretra, plevra boşluğu, rahim ağzından kazıma şeklinde alınır.

Teşhis işleminden önce doktor hastaya hangi materyalin toplanacağını açıklar:

Cinsel yolla bulaşan enfeksiyonları incelerken genital organlardan salgılar, idrar ve üretradan smear toplanır.
Herpetik enfeksiyonlar için analiz yapılırken analiz için sitomegalovirüs, mononükleoz, idrar ve boğaz sürüntüsü alınır; hepatit, toksoplazmoz için damardan kan alınır.
Çeşitli tipleri teşhis etmek için beyin omurilik sıvısı toplanır.
Göğüs hastalıkları alanında analiz için örnekler balgam ve plevral sıvıdır.
Hamilelik sırasında olası intrauterin enfeksiyonlara ilişkin bir çalışma yapılırken analiz için amniyotik sıvı ve plasental hücreler kullanılır.

Analizin güvenilirliği ve doğruluğu, malzemeyi alırken koşulların sterilliğine bağlıdır. PCR testi son derece hassas olduğundan test maddesindeki herhangi bir kontaminasyon sonucu bozabilir.

Biyomateryalin teslimi için yetkin hazırlık, hastalar için herhangi bir zorluk yaratmaz. Belirli öneriler var:

Cinsel yolla bulaşan enfeksiyonları analiz ederken:
- materyali göndermeden 72 saat önce yakın temasları hariç tutun;
- 3 gün öncesinden herhangi bir vajinal ürünü kullanmayı bırakın;
- önceki günün akşamından itibaren muayene edilen alanın hijyenini gerçekleştirmeyin;
- üretradan bir örnek almadan 3-4 saat önce idrara çıkmayı hariç tutun;
enfeksiyon testinden bir ay önce antibiyotik almayı bırakın;
kan, sabahları yemek yemeden ve içmeden önce bağışlanır;
İlk sabah idrar örneği, iyice bir özel tuvaletten sonra steril bir kapta toplanır.

Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi kullanılarak teşhisin nasıl gerçekleştirildiği hakkında aşağıyı okuyun.

Prosedür nasıl işliyor?

Bir PCR çalışması gerçekleştirirken, bir reaktörde (amplifikatör veya termal döngüleyici) belirli döngüler tekrar tekrar tekrarlanır:

İlk adım denatürasyondur. Bir patojenin DNA'sının (veya RNA'sının) varlığından şüphelenilen tükürük, kan, biyopsi materyali, jinekolojik örnekler, balgam, materyalin ısıtıldığı ve DNA'nın iki ayrı zincire bölündüğü bir amplifikatöre yerleştirilir.
İkinci adım malzemenin tavlanması veya hafifçe soğutulmasıdır. ve buna DNA molekülünde istenen bölgeleri tanıyabilen ve onlara bağlanabilen primerlerin eklenmesi.
Üçüncü adım uzamadır– DNA iplikçiklerinin her birine 2 primer bağlandıktan sonra meydana gelir. İşlem sırasında patojenin DNA fragmanı tamamlanarak kopyası oluşturulur.

Bu döngüler bir "zincirleme reaksiyon" gibi tekrarlanır ve her seferinde belirli bir DNA parçasının (örneğin belirli bir virüsün programlandığı bölüm) kopyalarının iki katına çıkmasına yol açar. Birkaç saat içinde DNA fragmanının birçok kopyası oluşturulur ve bunların örnekteki varlığı tespit edilir. Bundan sonra sonuçlar analiz edilir ve enfeksiyonun türünü belirlemek için çeşitli patojen türlerinden oluşan bir veri tabanındaki verilerle karşılaştırılır.

Sonuçların kodunun çözülmesi ve PCR reaksiyonuna dayalı sonuç hakkında aşağıyı okuyun.

Sonuçların kodunun çözülmesi

Çalışmanın nihai sonucu, biyolojik materyalin teslim edilmesinden 1-2 gün sonra açıklanır. Çoğu zaman - analizden sonraki ilk günde.

Niteliksel analiz

Olumsuz sonuç, test için gönderilen maddede hiçbir bulaşıcı ajan izine rastlanmadığı anlamına gelir.
Pozitif sonuç, materyalin teslimi sırasında biyolojik bir numunedeki patojenik virüslerin veya bakterilerin çok yüksek bir doğrulukla tespit edilmesi anlamına gelir.

Sonuç pozitifse ancak enfeksiyonun arttığına dair herhangi bir belirti tespit edilmiyorsa vücudun bu durumuna asemptomatik “sağlıklı taşıyıcılık” adı verilir. Viral hastalıklarda en sık biyomateryallerin belirli bir yerden (servikal kanal, üretra, ağız boşluğu) alınması sırasında gözlenir. Bu durumda tedavi gerekli değildir, ancak aşağıdaki olasılıklar mevcut olduğundan sürekli tıbbi gözetim gereklidir:

virüsün taşıyıcılardan yayılması ve sağlıklı kişilerin enfeksiyonu;
sürecin aktivasyonu ve hastalığın kronik bir forma geçişi.

Ancak kan testi pozitifse bu, enfeksiyonun vücuda çarptığını gösterir ve bu artık taşıyıcı bir durum değil, acil özel tedavi gerektiren bir patolojidir.

Kantitatif Analiz

Kantitatif sonuç, özellikle belirli bir enfeksiyon türü için bir uzman tarafından belirlenir. Buna dayanarak, hastalığın gelişim derecesini ve evresini değerlendirmek mümkündür, bu da doğru tedaviyi derhal reçete etmeyi mümkün kılar.

ortalama tutar

Polimeraz zincir reaksiyonunun fiyatları şunlara göre belirlenir: araştırmanın türü, patojeni tanımlamanın zorluğu, biyolojik materyal toplamanın zorluğu, analiz türü (niteliksel veya niceliksel) ve laboratuvardaki fiyat düzeyi.

Öte yandan, PCR çalışırken, analiz için bir tür materyal toplarken aynı anda birden fazla patojeni tanımlamak mümkündür. Bu, diğer laboratuvar testlerinden tasarruf etmenizi sağlar.

Ruble cinsinden PCR analizinin yaklaşık maliyeti:

gonokok, gardnerella, trikomonas vajinalis – 180'den itibaren
klamidya trachomatis - 190'dan itibaren
papilloma virüsü – 380'den 500'e
kadınlarda ürogenital sistemin biyosenozu (mikrofloranın niceliksel ve niteliksel değerlendirmesi) - 800'den.

PCR testiyle ilgili daha da faydalı bilgiler aşağıdaki videoda yer almaktadır:

Bakterilerin genetiği. İkinci ders için bilgiler.

Polimeraz zincirleme reaksiyonu

Polimeraz zincir reaksiyonu, analiz edilen numunedeki (biyolojik materyal veya saf kültür dahil) belirli DNA moleküllerinin miktarında çoklu artışa (amplifikasyon) izin veren bir yöntemdir.

Mikrobiyolojide bir teşhis yöntemi olarak PCR'nin temel avantajları, numunelerdeki son derece düşük patojen konsantrasyonlarının tespitine izin veren çok yüksek hassasiyetin yanı sıra, patojenlerin cins, tür veya alt tür düzeyinde tespit edilmesine veya tanımlanmasına olanak tanıyan ayarlanabilir özgüllüktür. PCR'nin ana dezavantajı son derece yüksek duyarlılığından kaynaklanmaktadır; numunelerin bir pozitif kontrolden, başka bir numuneden veya bir PCR ürününden alınan DNA ile kontamine olması ve bunun sonucunda yanlış pozitif reaksiyona yol açması çok kolaydır. Bu, PCR karışımının ve bitmiş PCR ürünleriyle çalışmanın gerçekleştirildiği koşullar üzerinde ciddi kısıtlamalar getirir.

PCR'nin yürütülmesi. Aşağıdaki bileşenleri içeren bir reaksiyon karışımı hazırlanır:

Test örneğinden izole edilen DNA,

Tampon çözümü,

Mg2+ iyonları (enzimin çalışması için gereklidir),

İki primer, tespit edilen DNA dizisinin farklı iplikçiklerinin uçlarını tamamlayan, tek iplikçikli kısa DNA molekülleridir (çoğunlukla 18 ila 24 nükleotit uzunluğunda).

Deoksinükleotid trifosfatların bir karışımı.

Isıya dayanıklı DNA polimeraz (Taq polimeraz en sık kullanılır - izole edilen bir polimeraz) Termos sucul bitki).

Bu reaksiyon karışımı daha sonra esasen programlanabilir bir termostat olan bir termal döngüleyiciye yerleştirilir. Termal döngüleyici 30-40 sıcaklık değişimi döngüsü gerçekleştirir. Bu döngülerin her biri üç aşamadan oluşur (bkz. Şekil 1):

Denatürasyon (sıcaklık 94 o C) - hidrojen zincirleri kırılır ve DNA şeritleri birbirinden ayrılır.

Primerlerin tavlanması (sıcaklık genellikle 50-60 o C civarındadır) - primerler DNA zincirlerinin uçlarına bağlanır. Genel olarak, sıcaklık düştüğünde, test örneğindeki orijinal DNA zincirlerini yeniden birleştirmek (renatürasyon) enerji açısından daha uygundur, ancak reaksiyon karışımındaki primerlerin konsantrasyonu, test örneğindeki DNA konsantrasyonundan birkaç kat daha fazladır. (en azından ilk PCR döngülerinde), böylece primer tavlama reaksiyonu renatürasyon DNA'sından daha hızlı ilerler. Tavlama sıcaklığı, primerlerin erime (denatürasyon) sıcaklıklarına bağlı olarak seçilir.

Uzama (sıcaklık genellikle 72 o C'dir) - DNA polimeraz, uzun DNA zincirlerinin şablonu boyunca primerleri tamamlar. Sıcaklık, kullanılan DNA polimerazın optimal çalışma sıcaklığına karşılık gelir.

Sonuçların tespiti farklı PCR versiyonlarında farklılık gösterir ve “PCR Türleri” bölümünde açıklanmaktadır.

PCR dinamikleri

Erken PCR döngülerinde, boyutu primer iniş bölgeleri arasındaki mesafeye göre belirlenen çift sarmallı DNA moleküllerinin sayısı, her döngüde iki katına çıkar. İhmal edilebilecek az miktarda daha uzun DNA molekülleri de oluşur (bkz. Şekil 2).

Dolayısıyla erken döngülerde PCR ürününün miktarı m*2n formülüyle tanımlanır; burada m, numunedeki istenen DNA'nın başlangıç miktarıdır, n ise döngü sayısıdır. Daha sonra reaksiyon bir platoya ulaşır. Bu, reaksiyon ürününün birikmesi, primerlerin ve deoksinükleotid trifosfatların konsantrasyonundaki bir azalmaya ve ayrıca pirofosfat konsantrasyonundaki bir artışa bağlı olarak meydana gelir (bkz. Şekil 3).

PCR Türleri

Geleneksel PCR

PCR kurulumunun bu versiyonunda reaksiyon, önceden seçilmiş sayıda döngü (30-40) boyunca ilerler ve ardından reaksiyon karışımında çift sarmallı DNA moleküllerinin birikmesinin meydana gelip gelmediği analiz edilir.

PCR gerçekleştirmeye yönelik bu seçenek, teşhis yöntemi olarak kullanıldığında niteliksel bir yöntemdir. Pozitif bir reaksiyon, numunede istenen DNA moleküllerinin en azından eser miktarda bulunduğunu gösterir. Negatif bir reaksiyon onların yokluğunu gösterir. Reaksiyonun bir platoya ulaşması nedeniyle numunedeki orijinal DNA moleküllerinin içeriğinin niceliksel değerlendirmesi imkansızdır.

Bir ürünün varlığını tespit etmenin ana yöntemi agaroz veya poliakrilamid jelde elektroforezdir. PCR ürünleri, moleküler ağırlıklarına göre bir elektrik alanının etkisi altında bir jel içerisinde ayrılır. Jelin içine bir ara boya (çift sarmallı DNA durumunda floresans veren - çoğunlukla etidyum bromür) eklenir. Böylece ultraviyole ışıkla ışınlandığında, gerekli moleküler ağırlığa sahip DNA'ya karşılık gelen bir şeridin varlığını veya yokluğunu görmek mümkün olacaktır. Teşhis amacıyla PCR yapılırken, numunelerin karşılaştırıldığı pozitif ve negatif reaksiyon kontrolleri her zaman kullanılır (bkz. Şekil 4).

Gerçek zamanlı PCR

PCR'nin bu versiyonunda, reaksiyon karışımındaki PCR ürününün miktarı, reaksiyonun seyri sırasında sürekli olarak kaydedilir. Bu, bir reaksiyon eğrisi oluşturmanıza (bkz. Şekil 3) ve buna dayanarak numunelerde istenen DNA moleküllerinin sayısını hesaplamanıza olanak tanır.

Gerçek zamanlı PCR'nin bir türü, doğrudan reaksiyon karışımına eklenen bir ara boyanın kullanılmasıdır (en sık SYBRGreen kullanılır). Diğer bir tür ise PCR ürünü içindeki bir bölgeye bağlanan floresan prob türlerinden birinin kullanılmasıdır, bu da tespitin özgüllüğünü arttırmayı mümkün kılar (bkz. Şekil 5).Floresan tespiti reaksiyon sırasında doğrudan cihazda gerçekleşir.

Kantitatif tespit olasılığına ek olarak, gerçek zamanlı PCR'nin geleneksel PCR'ye kıyasla başka avantajları da vardır. Bu PCR seçeneği daha basit, daha hızlıdır ve aynı zamanda PCR ürünleri içeren tüplerin açılmasını gerektirmez, bu da diğer numunelerin kontaminasyon olasılığını azaltır. Ana dezavantaj, yerleşik floresans algılama yeteneklerine sahip bir termal döngüleyicinin geleneksel olanla karşılaştırıldığında daha yüksek maliyetidir.

Dijital kantitatif PCR

Bir numunedeki DNA miktarını daha doğru bir şekilde belirlemenizi sağlayan yeni, pahalı ve hala nadiren kullanılan bir PCR versiyonu.Bu versiyonda, floresan boya içeren reaksiyon karışımı çok sayıda mikroskobik hacme bölünür (örneğin, bir emülsiyondaki damlacıklar). PCR sonrasında reaksiyonun damlacıkların hangi kısmında pozitif olduğu analiz edilir ve buna göre floresans gözlenir. Bu fraksiyon örnekte aranan DNA moleküllerinin sayısıyla orantılı olacaktır.

Ters transkripsiyon PCR

Bu durumda, PCR'nin bir veya başka versiyonundan önce, ters transkripsiyon reaksiyonu (RNA'dan DNA'ya), ters enzim kullanılarak gerçekleştirilir. Böylece bu yöntem, RNA moleküllerinin niteliksel veya niceliksel olarak tespit edilmesine olanak sağlar. Bu, RNA virüslerini tespit etmek veya belirli bir genin transkripsiyon seviyesini (mRNA miktarı) belirlemek için kullanılabilir.

Resim 1. PCR aşamaları. Astarlar kırmızıyla gösterilmiştir.

Şekil 2. PCR sırasında primerlerle sınırlanan çift sarmallı DNA moleküllerinin birikmesi.

Figür 3. Numunedeki istenen DNA moleküllerinin farklı başlangıç konsantrasyonlarında PCR reaksiyonunun dinamiği. (a) – en yüksek konsantrasyon (b) – orta konsantrasyon (c) – en düşük konsantrasyon

Şekil 4. PCR ürünlerinin agaroz elektroforezi. K+ – pozitif kontrol (istenen DNA'nın mevcut olduğu bilinmektedir). 1-7 – test numuneleri (1-2'si pozitif, 3-7'si negatif). K- negatif kontrol (istenen DNA'nın bulunmadığı açıktır). Çoğu durumda hedef ürüne ek olarak daha hafif, spesifik olmayan reaksiyon ürünleri (primer-dimerler) görülebilir.

Şekil 5. Gerçek zamanlı PCR kullanarak tespit yöntemleri. (a) – interkalasyon boyası – çift sarmallı DNA'ya bağlandığında floresans verir (b) – Taqman probu – florofor ve söndürücünün ayrılması nedeniyle prob 5'-3' endonükleaz aktivitesine sahip DNA polimeraz tarafından bölündüğünde floresans meydana gelir. (c) – MolecularBeacon probu - floresans, florofor ve söndürücünün uzaysal ayrımı nedeniyle prob hedef fragmanla hibridize olduğunda meydana gelir (d) – LightCycler probları - akseptör floresansı, problar (bir akseptör ve donör içerir) ile hibridize olduğunda meydana gelir. floresans enerjisinin (FRET) rezonans transferinden dolayı hedef fragman.