Вступ.

1. Загальна характеристика та класифікація цитокінів.

1.1.Механізми дії.

1.2Властивості цитокінів.

1.3Роль цитокінів у регуляції фізіологічних функцій організму.

2.Особливі дослідження цитокінів.

2.1 Значення цитокінів у патогенезі запальних захворювань товстої кишки у дітей.

2.2.Роль оксиду азоту та цитокінів у розвитку синдрому гострого пошкодження легень.

3.Методи визначення цитокінів

3.1.Визначення біологічної активності цитокінів

3.2.Кількісне визначення цитокінів за допомогою антитіл

3.3.Визначення цитокінів методом імуноферментного аналізу.

3.3.1Фактор некрозу пухлин-альфа.

3.3.2 Гамма-інтерферон.

3.3.3 Інтерлейкін-4

3.3.4 Інтерлейкін-8

3.3.5 Рецепторний антагоніст інтерлейкіну-1.

3.3.6 Альфа-інтерферон.

3.3.7Антитіла до альфа-ІНФ.

4.Імунотропні препарати на основі цитокінів.

Список використаної литературы.

Висновок.

Вступ.

З моменту опису перших цитокінів минуло небагато часу. Однак їх дослідження призвело до виділення великого розділу знань - цитокінології, що є невід'ємною частиною різних галузей знання і, в першу чергу, імунології, що дала потужний поштовх вивчення цих медіаторів. Цитокінологія пронизує всі клінічні дисципліни, починаючи від етіології та патогенезу захворювань та закінчуючи профілактикою та лікуванням різних патологічних станів. Отже, науковим дослідникам і клініцистам необхідно орієнтуватися в різноманітності регуляторних молекул і мати чітке уявлення про роль кожного з цитокінів у процесах, що вивчаються. Усі клітини імунної системи мають певні функції та працюють у чітко узгодженій взаємодії, яка забезпечується спеціальними біологічно активними речовинами – цитокінами – регуляторами імунних реакцій. Цитокінами назвали специфічні білки, за допомогою яких різноманітні клітини імунної системи можуть обмінюватися одна з одною інформацією та здійснювати координацію дій. Набір та кількості цитокінів, що діють на рецептори клітинної поверхні, - "цитокінове середовище" - являють собою матрицю взаємодіючих і мінливих сигналів. Ці сигнали мають складний характер через велику різноманітність цитокінових рецепторів і через те, що кожен з цитокінів може активувати або пригнічувати кілька процесів, включаючи свій власний синтез та синтез інших цитокінів, а також утворення та появу на поверхні клітин цитокінових рецепторів. Метою нашої роботи є вивчення цитакінів, їх функцій та властивостей, а також можливе застосування їх у медицині. Цитокіни - це невеликі білки (мол. маса від 8 до 80 КДа), що діють аутокринно (тобто на клітину, що їх продукує) або паракринно (на клітини, що розташовані поблизу). Утворення та вивільнення цих високоактивних молекул відбувається короткочасно та жорстко регулюється.

Літературний огляд.

Загальна характеристика та класифікація цитокінів.

Цитокіни є групою поліпептидних медіаторів міжклітинної взаємодії, що беруть участь головним чином у формуванні та регуляції захисних реакцій організму при впровадженні патогенів та порушенні цілісності тканин, а також у регуляції низки нормальних фізіологічних функцій. Цитокіни можуть бути виділені в нову самостійну систему регуляції, що існує поряд з нервовою та ендокринною системами підтримки гомеостазу, причому всі три системи тісно взаємопов'язані і взаємозалежні. За останні два десятиліття клоновані гени більшості цитокінів та отримані рекомбінантні аналоги, що повністю повторюють біологічні властивості природних молекул. Наразі відомо вже понад 200 індивідуальних речовин, що належать до сімейства цитокінів. Історія вивчення цитокінів розпочалася у 40-ті роки ХХ століття. Саме тоді були описані перші ефекти кахектину - фактора, що був у сироватці крові і здатного викликати кахексію або зниження ваги тіла. Надалі даний медіатор вдалося виділити та показати його ідентичність фактору некрозу пухлин (ФНП). У той час вивчення цитокінів проходило за принципом виявлення будь-якого одного біологічного ефекту, який був відправною точкою для назви відповідного медіатора. Так у 50-ті роки назвали інтерферон (ІФН) через здатність інтерферувати або підвищувати опірність при повторній вірусній інфекції. Інтерлейкін-1 (ІЛ-1) також спочатку називався ендогенним пірогеном на противагу бактеріальним ліпополісахаридам, які вважалися екзогенними пірогенами. Наступний етап вивчення цитокінів, що відноситься до 60-70 років, пов'язаний з очищенням природних молекул та всебічною характеристикою їх біологічної дії. До цього часу відноситься відкриття Т-клітинного ростового фактора, відомого тепер як ІЛ-2, і низки інших молекул, що стимулюють зростання і функціональну активність Т-, В-лімфоцитів та інших типів лейкоцитів. У 1979 році для їх позначення та систематизації було запропоновано термін «інтерлейкіни», тобто медіатори, які здійснюють зв'язок між лейкоцитами. Однак дуже скоро з'ясувалося, що біологічні ефекти цитокінів поширюються далеко за межі імунної системи, і тому прийнятнішим був раніше запропонований термін «цитокіни», що зберігся і донині. Революційний поворот у вивченні цитокінів відбувся на початку 80-х років після клонування генів інтерферону миші та людини та отримання рекомбінантних молекул, що повністю повторювали біологічні властивості природних цитокінів. Після цього вдалося клонувати гени та інших медіаторів з цього сімейства. Важливою віхою історія цитокінів стало клінічне застосування рекомбінантних інтерферонів і особливо рекомбінантного ІЛ-2 для лікування раку. 90-ті роки ознаменувалися відкриттям субодиничної будови рецепторів цитокінів та формуванням поняття «цитокінової мережі», а початок XXI століття - відкриттям багатьох нових цитокінів шляхом генетичного аналізу. До цитокінів відносять інтерферони, колонієстимулюючі фактори (КСФ), хемокіни, що трансформують ростові фактори; фактор некрозу пухлин; інтерлейкіни з історично порядковими номерами, що склалися, і деякі інші ендогенні медіатори. Інтерлейкіни, що мають порядкові номери, починаючи з 1, не належать до однієї підгрупи цитокінів, пов'язаних спільністю функцій. Вони у свою чергу можуть бути поділені на прозапальні цитокіни, ростові та диференціювальні фактори лімфоцитів, окремі регуляторні цитокіни. Назва «інтерлейкін» присвоюється знову відкритому медіатору в тому випадку, якщо дотримані наступні критерії, вироблені номенклатурним комітетом Міжнародного союзу імунологічних товариств: молекулярне клонування та експресія гена фактора, що вивчається, наявність унікальної нуклеотидної та відповідної їй амінотілонейной послідовності. Крім того, нова молекула повинна продукуватися клітинами імунної системи (лімфоцитами, моноцитами або іншими типами лейкоцитів), мати важливу біологічну функцію в регуляції імунної відповіді, а також додаткові функції, через що їй не може бути дано функціональну назву. Нарешті, перелічені властивості нового інтерлейкіну мають бути опубліковані в науковому виданні, що рецензується. Класифікація цитокінів може проводитися за їх біохімічними та біологічними властивостями, а також за типами рецепторів, за допомогою яких цітокіни здійснюють свої біологічні функції. Класифікація цитокінів за будовою (Табл. 1) враховує як амінокислотну послідовність, а передусім третинну структуру білка, точніше відбиває еволюційне походження молекул.

Таблиця 1. Класифікація цитокінів за будовою.

Клонування генів та аналіз будови рецепторів цитокінів показали, що так само, як і самі цитокіни ці молекули можуть бути поділені на декілька типів відповідно до подібності амінокислотних послідовностей та особливостей організації позаклітинних доменів (табл. 2). Одне з найбільших родин рецепторів цитокінів називається сімейством гемопоетинових рецепторів або сімейством цитокінових рецепторів I типу. Особливістю будови цієї групи рецепторів є наявність у молекулі 4 цистеїнів та послідовності амінокислот Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), розташованої на невеликій відстані від клітинної мембрани. II клас цитокінових рецепторів взаємодіє з інтерферонами та ІЛ-10. Обидва перші типи рецепторів мають гомологію один з одним. Наступні групи рецепторів забезпечують взаємодію з цитокінами сімейства фактора некрозу пухлин та сімейства ІЛ-1. В даний час відомо більше 20 різних рецепторів хемокінів, що взаємодіють з різним ступенем афінності з одним або декількома лігандами хемокінового сімейства. Рецептори хемокінів належать до суперродини родопсинових рецепторів, мають 7 доменів трансмембранних і проводять сигнал за участю G-білків.

Таблиця 2. Класифікація рецепторів цитокінів.

Багато рецепторів цитокінів складаються з 2-3 субодиниць, що кодуються різними генами та експресуються незалежно. При цьому для формування високоафінного рецептора потрібна одночасна взаємодія всіх субодиниць. Прикладом такої організації рецепторів цитокінів є будова рецепторного комплексу ІЛ-2. Дивним виявилося відкриття того факту, що окремі субодиниці рецепторного комплексу ІЛ-2 є загальними для ІЛ-2 та деяких інших цитокінів. Так, β-ланцюг є одночасно компонентом рецептора для ІЛ-15, а γ-ланцюг служить загальною субодиницею рецепторів для ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-7, ІЛ-9, ІЛ-15 та ІЛ-21. Це означає, що всі згадані цитокіни, рецептори яких також складаються з 2-3 індивідуальних поліпептидів, використовують γ-ланцюг як компонент своїх рецепторів, причому, компонента, відповідального за проведення сигналу. У всіх випадках специфічність взаємодії для кожного цитокіну забезпечується іншими субодиницями, що відрізняються за структурою. Серед рецепторів цитокінів існують ще 2 загальні рецепторні субодиниці, які проводять сигнал після взаємодії з різними цитокінами. Це загальна рецепторна субодиниця βc (gp140) для рецепторів ІЛ-3, ІЛ-5 та ГМ-КСФ, а також рецепторна субодиниця gp130, загальна для членів сімейства ІЛ-6. Присутність загальної сигнальної субодиниці в рецепторах цитокінів служить одним із підходів для їх класифікації, оскільки дозволяє знайти спільність як у будові лігандів, так і в біологічних ефектах.

У таблиці 3 наведено об'єднану структурно-функціональну класифікацію, де всі цитокіни розділені на групи, в першу чергу з урахуванням їх біологічної активності, а також зазначених вище особливостей будови молекул цитокінів та їх рецепторів.

Таблиця 3. Структурно-функціональна класифікація цитокінів.

Сімейства цитокінів	Підгрупи та ліганди	Основні біологічні функції
Інтерферони І типу	ІФН a, b, d, k, w, t, ІЛ-28, ІЛ-29 (ІФН l)	Противірусна активність, антипроліферативна, імуномодулююча дія
Фактори зростання гемопоетичних клітин	Чинник стовбурових клітин (kit-ligand, steel factor), Flt-3 ligand, Г-КСФ, М-КСФ, ІЛ-7, ІЛ-11 Ліганди GP140: ІЛ-3, ІЛ-5, ГМ-КСФ	Стимуляція проліферації та диференціювання різних типів клітин попередників у кістковому мозку, активація кровотворення Ерітропоетин, Тромбопоетин
Суперсімейство інтерлейкіну-1 та ФРФ	Сімейство ФРФ: Кислий ФРФ, основний ФРФ, ФРФ3 - ФРФ23 Сімейство ІЛ-1 (F1-11): ІЛ-1α, ІЛ-1β, Рецепторний антагоніст ІЛ-1, ІЛ-18, ІЛ-33 та ін.	Активація проліферації фібробластів та епітеліальних клітин Прозапальна дія, активація специфічного імунітету
Сімейство фактора некрозу пухлин	ФНП, лімфотоксин α і β, Fas-ліганд та ін.	Прозапальна дія, регуляція апоптозу та міжклітинної взаємодії імунокомпетентних клітин
Сімейство інтерлейкіну-6	Ліганди GP130: ІЛ-6, ІЛ-11, ІЛ-31, Онкостатин-М, Кардіотропін-1, Leukemia inhibitory factor, Ciliary neurotrophic factor	Прозапальна та імунорегуляторна дія
Хемокіни	СС, СГС (ІЛ-8), СХ3С, С	Регуляція хемотаксису різних типів лейкоцитів
Сімейство інтерлейкіну-10	ІЛ-10,19,20,22,24,26	Імуносупресивна дія
Сімейство інтерлейкіну-12		Регуляція диференціювання Т-лімфоцитів хелперів
Цитокіни Т-хелперних клонів та регулюючі функції лімфоцитів	Т-хелпери 1 типу: ІЛ-2, ІЛ-15, ІЛ-21, ІФНg Т-хелпери 2 типу: ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-10, ІЛ-13 Ліганди γ-ланцюга рецептора ІЛ-2: ІЛ-7 ТСЛП	Активація клітинного імунітету Активація гуморального імунітету, імуномодулююча дія Стимуляція диференціювання, проліферації та функціональних властивостей різних типів лімфоцитів, ДК, НК клітин, макрофагів та ін.
Сімейство інтерлейкіну 17	ІЛ-17A, B, C, D, E, F	Активація синтезу прозапальних цитокінів
Суперсімейство фактора росту нервів, тромбоцитарного ростового фактора та трансформуючих ростових факторів.	Сімейство фактора росту нервів: ФРН, мозковий нейротрофічний фактор Фактори зростання з тромбоцитів (PDGF), ангіогенні ростові фактори (VEGF) Сімейство ТРФ: ТРФb, активіни, інгібіни, Nodal, Bone morphogenic proteins, Mullerian inhibitory substance	Регуляція запалення, ангіогенезу, функціонування нейронів, ембріонального розвитку та регенерації тканин
Сімейство епідермального ростового фактора	ЕРФ, ТРФα та ін.
Сімейство інсуліноподібних ростових факторів	ІРФ-I, ІРФ-II	Стимуляція проліферації різних типів клітин

Перша група включає інтерферони I типу і є найпростіший по організації, оскільки всі включені до неї молекули мають подібну будову та багато в чому однакові функції, пов'язані з противірусним захистом. До другої групи увійшли фактори росту та диференціювання гемопоетичних клітин, що стимулюють розвиток кровотворних клітин-попередників, починаючи від стовбурової клітини. У цю групу включені цитокіни, вузько специфічні для окремих ліній диференціювання кровотворних клітин (еритропоетин, тромбопоетин, а також ІЛ-7, що діє на попередники Т-В-лімфоцитів), а також цитокіни з ширшим спектром біологічної активності, такі як ІЛ- , ІЛ-11, колонієстимулюючі фактори. У складі цієї групи цитокінів виділено ліганди gp140, що мають загальну рецепторну субодиницю, а також тромбопоетин та еритропоетин через подібність структурної організації молекул. Цитокіни суперродини ФРФ та ІЛ-1 мають високий ступінь гомології та подібну будову білків, що підтверджує спільність походження. Проте, за проявами біологічної активності ФРФ багато в чому відрізняється від агоністів сімейства ІЛ-1. Сімейство молекул ІЛ-1 в даний час, крім функціональних назв, має позначення F1-F11, де F1 відповідає ІЛ-1α, F2 - ІЛ-1β, F3 - рецепторному антагоністу ІЛ-1, F4 - ІЛ-18. Інші члени сімейства відкриті в результаті генетичного аналізу і мають досить високу гомологію з молекулами ІЛ-1, проте, їх біологічні функції повністю не з'ясовані. Наступні групи цитокінів включають сімейства ІЛ-6 (ліганди загальної рецепторної субодиниці gp130), фактора некрозу пухлин та хемокіни, представлені найбільшою кількістю індивідуальних лігандів та перераховані повністю у відповідних розділах. Сімейство фактора некрозу пухлин сформоване в основному на підставі подібності у будові лігандів та їх рецепторів, що складаються з трьох нековалентно пов'язаних однакових субодиниць, що формують біологічно активні молекули. У той же час, за біологічними властивостями в цю родину включені цитокіни з досить різними активностями. Наприклад, ФНП є одним з найбільш яскравих прозапальних цитокінів, Fas-ліганд викликає апоптоз клітин мішеней, а CD40-ліганд забезпечує стимулюючий сигнал при міжклітинній взаємодії Т-і В-лімфоцитів. Такі відмінності в біологічній активності структурно подібних молекул визначаються насамперед особливостями експресії та будови їх рецепторів, наприклад, наявністю або відсутністю внутрішньоклітинного домену «смерті», що визначає апоптоз клітин. Сімейства ІЛ-10 та ІЛ-12 в останні роки також поповнилися новими членами, які отримали порядкові номери інтерлейкінів. Далі слідує дуже складна група цитокінів, що є медіаторами функціональної активності Т-лімфоцитів хелперів. Включення до цієї групи засноване на двох основних принципах: 1) приналежність до цитокінів, що синтезуються Тх1 або Тх2, що визначає розвиток переважно гуморального або клітинного типу імунологічних реакцій; 2) наявність загальної рецепторної субодиниці – гама ланцюга рецепторного комплексу ІЛ-2. Серед лігандів гама ланцюга додатково виділено ІЛ-4, що має також загальні рецепторні субодиниці з ІЛ-13, що багато в чому визначає біологічну активність цих цитокінів, що частково перекривається. Аналогічно виділено ІЛ-7, що має спільність будови рецепторів з ТСЛП. Переваги наведеної класифікації пов'язані з одночасним обліком біологічних та біохімічних властивостей цитокінів. Доцільність такого підходу нині підтверджується відкриттям нових цитокінів шляхом генетичного аналізу геному та пошуку структурно схожих генів. Завдяки цьому методу істотно розширилося сімейство інтерферонів І типу, ІЛ-1, ІЛ-10, ІЛ-12, з'явилося нове сімейство цитокінів аналогів ІЛ-17, що вже складається з 6 членів. Очевидно, найближчим часом поява нових цитокінів відбуватиметься значно повільніше, оскільки аналіз геному людини практично закінчено. Зміни швидше за все можливі за рахунок уточнення варіантів ліганд-рецепторних взаємодій та біологічних властивостей, які дозволять класифікації цитокінів набути остаточного вигляду.

Механізми дії.

Б. Рецептори цитокінів. Цитокіни – гідрофільні сигнальні речовини, дія яких опосередкована специфічними рецепторами на зовнішній стороні плазматичної мембрани. Зв'язування цитокінів з рецептором (1) призводить через ряд проміжних стадій (2-5) до активації транскрипції певних генів (6). Самі цитокінові рецептори не мають тирозинкіназної активності (за небагатьма винятками). Після зв'язування з цитокіном (1) молекули рецептора асоціюють, утворюючи гомодимери. Крім того, вони можуть утворювати гетеродимери за рахунок асоціації з білками-переносниками сигналу [БПС (STP)] або стимулювати димеризацію самих БПС (2). Цитокінові рецептори класу I можуть агрегувати з трьома типами БПС: білками GP130, βс або γс. Ці допоміжні білки самі не здатні пов'язувати цитокіни, але вони здійснюють передачу сигналу на тирозинкінази (3), однакові спектри біологічної активності багатьох цитокінів пояснюються тим, що різні цитокін-рецепторні комплекси можуть активувати одні й ті ж БПС.

Як приклад передачі сигналу від цитокінів на схемі показано, як рецептор ІЛ-6 (IL-6) після зв'язування з лігандом (1) стимулює димеризацію GP130 (2). Димер мембранного білка GP130 зв'язує та активує цитоплазматичну тирозинкіназу ЯК-родини (Янус-кінази, що мають два активні центри) (3). Янус-кінази фосфорилюють цитокінові рецептори, БПС та різні цитоплазматичні білки, які здійснюють подальшу передачу сигналу; вони також фосфорилируют фактори транскрипції - переносники сигналу та активатори транскрипції [ПСАТ (STAT, від англ. signal transducers and activators of transcription)]. Ці білки відносяться до сімейства БПС, що мають у структурі SH3-домен, що впізнає залишки фосфотирозину (див. с. 372). Тому вони мають властивість асоціювати з фосфорильованим цитокіновим рецептором. Якщо потім відбувається фосфорилювання молекули ПСАТ (4), фактор перетворюється на активну форму і утворює димер (5). Після транслокації в ядро димер як фактор транскрипції зв'язується з промотором (див. с. 240) гена, що ініціюється, і індукує його транскрипцію (6). Деякі цитокінові рецептори можуть за рахунок протеолізу втрачати екстрацелюлярний лігандзв'язуючий домен (на схемі. Домен надходить у кров, де конкурує за зв'язування з цитокіном, що знижує концентрацію цитокіну в крові. У сукупності цитокіни утворюють регуляторну сітку (каскад цитокінів) з багатофункціональною дією. Взаємоперекриття між цитокінами призводять до того, що в дії багатьох з них спостерігається синергізм, а деякі цитокіни є антагоністами. Часто в організмі можна спостерігати весь каскад цитокінів зі складним зворотним зв'язком.

Властивості цитокінів.

Загальні властивості цитокінів, завдяки яким медіатори можуть бути об'єднані в самостійну систему регуляції.

1. Цитокіни є поліпептидами або білками, часто глікозильованими, більшість з них мають ММ від 5 до 50 кДа. Біологічно активні молекули цитокінів можуть складатися з однієї, двох, трьох і більш однакових або різних субодиниць.

2. Цитокіни не мають антигенної специфічності біологічної дії. Вони впливають на функціональну активність клітин, що беруть участь у реакціях вродженого та набутого імунітету. Проте, впливаючи на Т-і В-лімфоцити, цитокіни здатні стимулювати індуковані антигенами процеси в імунній системі.

3. Для генів цитокінів існують три варіанти експресії: а) стадіоспецифічна експресія на певних стадіях ембріонального розвитку; б) конститутивна експресія для регуляції низки нормальних фізіологічних функцій; в) індуцибельний тип експресії, характерний для більшості цитокінів. Дійсно, більшість цитокінів поза запальною реакцією та імунною відповіддю не синтезуються клітинами. Експресія генів цитокінів починається у відповідь на проникнення в організм патогенів, антигенне подразнення або пошкодження тканин. Одними з найсильніших індукторів синтезу прозапальних цитокінів є патоген-асоційовані молекулярні структури. Для запуску синтезу Т-клітинних цитокінів потрібна активація клітин специфічним антигеном за участю Т-клітинного антигенного рецептора.

4. Цитокіни синтезуються у відповідь стимуляцію короткий проміжок часу. Синтез припиняється за рахунок різноманітних механізмів ауторегуляції, включаючи підвищену нестабільність РНК, та за рахунок існування негативних зворотних зв'язків, які опосередковуються простагландинами, кортикостероїдними гормонами та іншими факторами.

5. Один і той же цитокін може продукуватися різними за гістогенетичним походженням типами клітин організму в різних органах.

6. Цитокіни можуть бути асоційованими з мембранами синтезуючих їх клітин, маючи у вигляді мембранної форми повний спектр біологічної активності і проявляючи свою біологічну дію при міжклітинному контакті.

7. Біологічні ефекти цитокінів опосередковуються через специфічні клітинні рецепторні комплекси, що зв'язують цитокіни з дуже високою афінністю, причому окремі цитокіни можуть використовувати загальні субодиниці рецепторів. Рецептори цитокінів можуть існувати у розчинній формі, зберігаючи здатність зв'язувати ліганди.

8. Цитокіни мають плейотропність біологічної дії. Один і той же цитокін може діяти на багато типів клітин, викликаючи різні ефекти в залежності від виду клітин-мішеней (рис. 1). Плейотропність дії цитокінів забезпечується експресією рецепторів цитокінів на різних за походженням та функціями типів клітин та проведенням сигналу з використанням декількох різних внутрішньоклітинних месенджерів та транскрипційних факторів.

9. Для цитокінів характерна взаємозамінність біологічної дії. Декілька різних цитокінів можуть викликати той самий біологічний ефект або мати схожу активність. Цитокіни індукують або пригнічують синтез самих себе, інших цитокінів та їх рецепторів.

10. У відповідь на активаційний сигнал відбувається синтез клітинами одночасно кількох цитокінів, що беруть участь у формуванні цитокінової мережі. Біологічні ефекти в тканинах і на рівні організму залежать від присутності та концентрації інших цитокінів із синергічною, адитивною чи протилежною дією.

11. Цитокіни можуть впливати на проліферацію, диференціювання та функціональну активність клітин-мішеней.

12. Цитокіни діють на клітини різними шляхами: аутокринно – на клітину, що синтезує та секретує даний цитокін; паракринно - на клітини, розташовані поблизу клітини-продуцента, наприклад, в осередку запалення або в лімфоїдному органі; ендокринно – дистантно на клітини будь-яких органів та тканин після потрапляння в циркуляцію. У разі дію цитокінів нагадує дію гормонів (рис. 2).

Мал. 1. Один і той же цитокін може продукуватися різними за гістогенетичним походженням типами клітин організму в різних органах і діяти на багато типів клітин, викликаючи різні ефекти в залежності від виду клітин-мішеней.

Мал. 2. Три варіанти прояву біологічної дії цитокінів.

Очевидно формування системи цитокінової регуляції еволюційно проходило разом із розвитком багатоклітинних організмів і було зумовлено необхідністю утворення посередників міжклітинної взаємодії, яких можуть бути зараховані гормони, нейропептиди, молекули адгезії та інших. Цитокіни в цьому плані є найбільш універсальною системою регуляції, оскільки здатні проявляти біологічну активність як дистантно після секреції клітиною-продуцентом (місцево і системно), так і при міжклітинному контакті, біологічно активними у вигляді мембранної форми. Цим система цитокінів відрізняється від молекул адгезії, виконують вужчі функції лише за безпосередньому контакті клітин. У той же час система цитокінів відрізняється від гормонів, які в основному синтезуються спеціалізованими органами та діють після потрапляння в систему циркуляції.

Роль цитокінів у регуляції фізіологічних функцій організму.

Роль цитокінів у регуляції фізіологічних функцій організму може бути поділена на 4 основні складові:

1. Регуляція ембріогенезу, закладення та розвитку органів, у т.ч. органів імунної системи

2. Регулювання окремих нормальних фізіологічних функцій.

3. Регуляція захисних реакцій організму на місцевому та системному рівні.

4. Регуляція процесів регенерації тканин.

Експресія генів окремих цитокінів відбувається стадіоспецифічно на певних етапах ембріонального розвитку. Фактор стовбурових клітин, що трансформують ростові фактори, цитокіни сімейства ФНП та хемокіни регулюють диференціювання та міграцію різних клітин та закладку органів імунної системи. Після цього синтез деяких цитокінів може не відновлюватися, тоді як інші продовжують регулювати нормальні фізіологічні процеси або беруть участь у розвитку захисних реакцій.

Незважаючи на те, що більшість цитокінів є типовими індуцибельними медіаторами і в постнатальному періоді не синтезуються клітинами поза запальною реакцією та імунною відповіддю, деякі цитокіни не підпадають під це правило. Через війну конститутивної експресії генів частина їх синтезуються постійно й у досить великих кількостях перебувають у циркуляції, регулюючи проліферацію і диференціювання окремих типів клітин протягом усього життя. Прикладами такого типу фізіологічного регулювання функцій цитокінами може бути постійно високий рівень еритропоетину та деяких КСФ для забезпечення гемопоезу. Регуляція захисних реакцій організму цитокінами відбувається у рамках імунної системи, а й шляхом організації захисних реакцій лише на рівні цілісного організму з допомогою регуляції практично всіх сторін розвитку запалення та імунної відповіді. Ця найважливіша для всієї системи цитокінів функція пов'язана з двома основними напрямками біологічної дії цитокінів – захистом від інфекційних агентів та відновленням пошкоджених тканин. Цитокіни в першу чергу регулюють розвиток місцевих захисних реакцій у тканинах за участю різних типів клітин крові, ендотелію, сполучної тканини та епітеліїв. Захист на місцевому рівні розвивається шляхом формування типової запальної реакції з її класичними проявами: гіперемією, розвитком набряку, появою больового синдрому та порушенням функції. Синтез цитокінів починається при проникненні в тканини патогенів або порушенні їхньої цілісності, що зазвичай протікає паралельно. Продукція цитокінів є складовою клітинної відповіді, пов'язаної з розпізнаванням клітинами мієломоноцитарного ряду подібних структурних компонентів різних патогенів, званих патоген-асоційованими молекулярними паттернами. Прикладами подібних структур патогенів є ліпополісахариди грам-негативних бактерій, пептидоглікани грам-позитивних мікроорганізмів, флагеллін або ДНК, багата на CpolyG послідовності, що характерно для ДНК усіх видів бактерій. Лейкоцити експресують відповідні патерн-розпізнавальні рецептори, звані також Toll-like receptors (TLR) та специфічні для певних структурних патернів мікроорганізмів. Після взаємодії мікроорганізмів або їх компонентів TLR запускається внутрішньоклітинний каскад передачі сигналу, що призводить до посилення функціональної активності лейкоцитів і експресії генів цитокінів.

Активація TLR призводить до синтезу двох основних груп цитокінів: прозапальних цитокінів та інтерферонів І типу, головним чином ІФНα/β. розвитку запальної реакції та забезпечують віялове розширення активації різних типів клітин, що беруть участь у підтримці та регуляції запалення, включаючи всі типи лейкоцитів, дендритні клітини, Т і В-лімфоцити, НК клітини, ендотеліальні та епітеліальні клітини, фібробласти та інші. Це забезпечує послідовні етапи розвитку запальної реакції, що є основним механізмом реалізації вродженого імунітету. Крім того починається синтез дендритних клітин цитокінів сімейства ІЛ-12, що стимулюють диференціювання Т-лімфоцитів хелперів, що служить своєрідним містком до початку розвитку реакцій специфічного імунітету, пов'язаних з розпізнаванням специфічних антигенних структур мікроорганізмів.

Другий не менш важливий механізм, пов'язаний із синтезом ІФН, забезпечує реалізацію противірусного захисту. Інтерферони I типу виявляють 4 основні біологічні властивості:

1. Пряма противірусна дія за рахунок блокування транскрипції.

2. Пригнічення проліферації клітин, необхідне блокування поширення вірусу.

3. Активація функцій НК клітин, які мають здатність лізувати інфіковані вірусом клітини організму.

4. Посилення експресії молекул головного комплексу гістосумісності I класу, необхідне підвищення ефективності представлення вірусних антигенів інфікованими клітинами цитотоксичним Т-лимфоцитам. Це призводить до активації специфічного розпізнавання інфікованих вірусом клітин Т-лімфоцитами – першого етапу лізису вірус-інфікованих клітин-мішеней.

В результаті, крім прямої антивірусної дії, активуються механізми як вродженого (НК клітини) так і набутого (Т-лімфоцити) імунітету. Це приклад того, як одна невелика молекула цитокіну з ММ в 10 разів менша за ММ молекул антитіл здатна за рахунок плейотропного типу біологічної дії активувати абсолютно різні механізми захисних реакцій, спрямовані на виконання однієї мети - видалення вірусу, що проник в організм.

На тканинному рівні цитокіни є відповідальними за розвиток запалення, а потім регенерації тканин. При розвитку системної запальної реакції (острофазової відповіді) цитокіни впливають практично на всі органи та системи організму, що беруть участь у регуляції гомеостазу. Дія прозапальних цитокінів на ЦНС призводить до зниження апетиту та зміни всього комплексу поведінкових реакцій. Тимчасове припинення пошуку їжі і зниження сексуальної активності вигідно в плані економії енергії для одного лише завдання - боротьби з патогеном, що впровадився. Цей сигнал забезпечують цитокіни, оскільки їх попадання в циркуляцію безумовно означає, що місцевий захист не впорався з патогеном, і потрібне включення запальної системи реакції. Один із перших проявів системної запальної реакції, пов'язаний з дією цитокінів на терморегуляторний центр гіпоталамуса, полягає в підйомі температури тіла. Підвищення температури є ефективною захисною реакцією, оскільки при підвищеній температурі знижується здатність низки бактерій до розмноження, але, навпаки, зростає проліферація лімфоцитів.

У печінці під впливом цитокінів підвищується синтез острофазових білків і компонентів системи комплементу, необхідні боротьби з патогеном, але водночас знижується синтез альбуміну. Іншим прикладом вибіркової дії цитокінів є зміна іонного складу плазми крові при розвитку системної запальної реакції. При цьому відбувається зниження рівня іонів заліза, але підвищення рівня іонів цинку, адже добре відомо, що позбавити бактеріальну клітину іонів заліза означає - знизити її проліферативний потенціал (на цьому заснована дія лактоферину). З іншого боку, збільшення рівня цинку потрібне для нормальної роботи імунної системи, зокрема, це необхідно для утворення біологічно активного сироваткового фактору тимусу - одного з основних тимічних гормонів, що забезпечують диференціювання лімфоцитів. Вплив цитокінів на кровотворну систему пов'язаний із суттєвою активізацією гемопоезу. Збільшення числа лейкоцитів необхідне поповнення втрат і нарощування кількості клітин, переважно нейтрофильных гранулоцитів, в осередку гнійного запалення. Дія на систему згортання крові спрямована на посилення згортання, необхідне для зупинки кровотечі та для прямого блокування патогену.

Таким чином, при розвитку системного запалення цитокіни виявляють величезний спектр біологічних активностей і втручаються в роботу практично всіх систем організму. Однак жодна з змін не носить випадковий характер: всі вони або потрібні для безпосередньої активації захисних реакцій або вигідні в плані перемикання енергетичних потоків для одного лише завдання - боротьби з патогеном, що впровадився. У вигляді регуляції експресії окремих генів, гормональних зрушень та зміни поведінкових реакцій цитокіни забезпечують включення та максимальну ефективність роботи тих систем організму, які потрібні на даний час для розвитку захисних реакцій. На рівні цілісного організму цитокіни здійснюють зв'язок між імунною, нервовою, ендокринною, кровотворною та іншими системами та служать для їх залучення в організацію та регуляцію єдиної захисної реакції. Цитокіни якраз і служать тією організуючою системою, яка формує та регулює весь комплекс захисних реакцій організму при впровадженні патогенів. Мабуть, така система регуляції сформувалася еволюційно і несе безумовні вигоди для найбільш оптимальної захисної відповіді макроорганізму. Тому, мабуть, не можна обмежити поняття захисних реакцій лише участю неспецифічних механізмів резистентності та специфічної імунної відповіді. В єдиній захисній реакції бере участь весь організм і всі системи, які на перший погляд не відносяться до підтримки імунітету.

Особливі дослідження цитокінів.

Значення цитокінів у патогенезі запальних захворювань товстої кишки в дітей віком.

С.В. Бельмер, А.С. Симбірцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпіна, Н.Є. Щиголєва, Т.Л. Михайлова. Російський державний медичний університет ДНЦ колопроктології, Москва та ДНДІ особливо чистих біопрепаратів, Санкт-Петербург проводять роботу з вивчення значення цитокінів у патогенезі запальних захворювань товстої кишки у дітей. Хронічні запальні захворювання шлунково-кишкового тракту нині займають одне з провідних місць у патології органів травлення у дітей. Особливого значення надається запальним захворюванням товстої кишки (ВЗТК), частота виникнення яких у всьому світі неухильно зростає. Тривалий перебіг із частими, а часом фатальними рецидивами, розвиток місцевих і системних ускладнень – все це спонукає до ретельного вивчення патогенезу захворювання у пошуках нових підходів до лікування ВЗТК. В останні десятиліття захворюваність на неспецифічний виразковий коліт (НЯК) склала 510 випадків на рік на 100 тис. населення, при хворобі Крона (БК) 16 випадків на рік на 100 тис. населення. Показники поширеності у Росії, у Московській області відповідають середньоєвропейським даним, але значно нижчі, ніж у Скандинавських країнах, Америці, Ізраїлі та Англії. Для НЯК поширеність 19,3 на 100 тис., захворюваність 1,2 на 100 тис. чоловік на рік. Для БК поширеність 3,0 на 100 тис., захворюваність 0,2 на 100 тис. чоловік. Те, що найбільша частота відзначено у високорозвинених станах, зумовлено не тільки соціальними та економічними факторами, але також генетичними та імунологічними особливостями хворих, що визначають схильність до ВЗТК. Ці фактори є основними в імунопатогенетичній теорії походження ВЗТК. Вірусна та/або бактеріальна теорії пояснюють лише гострий початок хвороби, а хронізація процесу обумовлена як генетичною схильністю, так і особливостями імунної відповіді, які також генетично детерміновані. Слід зазначити, що ВЗТК нині відносять до хвороб із генетично гетерогенної комплексної схильністю. Виявлено понад 15 ймовірних генів-кандидатів з 2-х груп (імуноспецифічні та імунорегуляторні), що зумовлюють спадкову схильність. З найбільшою ймовірністю схильність детермінується кількома генами, що визначають характер імунологічних та запальних реакцій. На підставі результатів численних досліджень можна зробити висновок про те, що найвірогіднішою локалізацією генів, пов'язаних з розвитком ВЗТК, є хромосоми 3, 7, 12 та 16. В даний час велика увага приділяється вивченню особливостей функції Т та В лімфоцитів, а також цитокіну медіаторам запалення. Активно вивчається роль інтерлейкінів (IL), інтерферонів (IFN), фактора некрозу пухлин-a (TNF-a), макрофагів та аутоантитіл до білків слизової оболонки товстої кишки та до аутомікрофлори. Виявлено особливості їх порушень при БК та НЯК, але, як і раніше, залишається неясно, чи виникають ці зміни первинно чи вдруге. Для розуміння багатьох сторін патогенезу були б дуже важливими дослідження, виконані в доклінічну стадію ВЗТК, а також у родичів першого ступеня спорідненості. Серед медіаторів запалення особлива роль належить цитокінам, які є групою поліпептидних молекул з масою від 5 до 50 кДа, що беруть участь у формуванні та регуляції захисних реакцій організму. На рівні організму цитокіни здійснюють зв'язок між імунною, нервовою, ендокринною, кровотворною та іншими системами та служать для їх залучення до організації та регулювання захисних реакцій. Класифікацію цитокінів наведено в таблиці 2. Більшість цитокінів не синтезується клітинами поза запальною реакцією та імунною відповіддю. Експресія генів цитокінів починається у відповідь на проникнення в організм патогенів, антигенне подразнення або пошкодження тканин. Одним з найбільш сильних індукторів синтезу цитокінів є компоненти клітинних стінок бактерій: ЛПС, пептидоглікани і мурамілдіпептиди. Продуцентами прозапальних цитокінів є в основному моноцити, макрофаги, Т-клітини та ін. ) та протизапальні (IL-4, IL-10, TGF-b). Інтерлейкін-1 (IL-1) – імунорегуляторний медіатор, що виділяється при запальних реакціях, тканинних ураженнях та інфекціях (прозапальний цитокін). IL-1 відіграє важливу роль в активації Т-клітин при їх взаємодії з антигеном. Відомі 2 типи IL-1: IL-1a, і IL-1b, продукти двох різних генних локусів, розташованих на хромосомі 2 людини. IL–1a залишається всередині клітини або може перебувати у мембранній формі, у незначній кількості з'являється у позаклітинному просторі. Роль мембранної форми IL-1a - передача активуючих сигналів від макрофагу Т-лімфоцитів та інших клітин при міжклітинному контакті. IL-1a – основний медіатор короткодистантної дії. IL–1b на відміну IL–1a активно секретується клітинами, діючи як системно, і локально. На сьогоднішній день відомо, що IL-1 є одним з основних медіаторів запальних реакцій, стимулює проліферацію Т-клітин, збільшує на Т-клітинах експресію рецептора IL-2 та вироблення ними IL-2. IL-2 разом з антигеном індукує активацію та адгезію нейтрофілів, стимулює утворення інших цитокінів (IL-2, IL-3, IL-6 та ін) активованими Т-клітинами та фібробластами, стимулює проліферацію фібробластів та ендотеліальних клітин. Системно IL-1 діє синергічно з TNF-a та IL-6. При підвищенні концетрації в крові IL-1 впливає на клітини гіпоталамуса і викликає підвищення температури тіла, лихоманку, сонливість, зниження апетиту, а також стимулює клітини печінки до продукції білків гострої фази (СRP, амілоїду А, a-2 макроглобуліну та фібриногену). IL4 (хромосома 5). Інгібує активацію макрофагів і блокує багато ефектів, стимульованих IFNg, такі як продукція IL1, окису азоту та простагландинів, відіграє важливу роль у протизапальних реакціях, має імуносупресивну дію. IL6 (хромосома 7), один з основних прозапальних цитокінів, є головним індуктором кінцевого етапу диференціювання клітин і макрофагів, потужним стимулятором продукції білків гострої фази клітинами печінки. Одна з основних функцій IL6 – стимуляція продукції антитіл in vivo та in vitro. IL8 (хромосома 4). Належить до хемокінів медіаторів, що викликають спрямовану міграцію (хемотаксис) лейкоцитів у вогнище запалення. Основна функція IL10 – пригнічення вироблення цитокінів Тхелперами першого типу (TNFb, IFNg) та активованими макрофагами (TNF-a, IL1, IL12). В даний час визнано, що типи імунної відповіді пов'язані з одним із варіантів активації лімфоцитів з переважною участю клонів Тлімфоцитів хелперів першого типу (TH2) або другого типу (TH3). Продукти ТH2 та ТH3 негативно впливають на активацію протилежних клонів. Надмірна активація якогось із типів Тhклонів може направити імунну відповідь по одному з варіантів розвитку. Хронічна незбалансованість активації Тhклонів призводить до розвитку імунопатологічних станів. Зміни цитокінів при ВЗТК можуть вивчатися різними способами з визначенням їхнього рівня в крові або in situ. Рівень IL1 підвищується за всіх запальних захворюваннях кишечника. Відмінності між НЯК та БК полягають у підвищенні експресії IL2. Якщо при НЯК виявляється знижений чи нормальний рівень IL2, то за БК виявляється його підвищений рівень. Зміст IL4 збільшується при НЯК, тоді як при БК воно залишається нормальним або навіть знижується. Рівень IL6, що опосередковує острофазові реакції, також підвищується за всіх форм запалення. Отримані дані щодо профілю цитокінів дозволили висловити припущення про те, що дві основні форми хронічних ВЗТК характеризуються різною активацією та експресією цитокінів. Результати досліджень свідчать, що спостерігається у хворих НЯК профіль цитокінів більшою мірою відповідає профілю ТH3, тоді як для хворих з БК більш характерним слід вважати профіль ТH2. Привабливість цієї гіпотези про роль ТH2 і ТH3 профілів полягає ще й у тому, що застосування цитокінів може змінити імунну відповідь у той чи інший бік та призвести до ремісії з відновленням балансу цитокінів. Це може підтверджуватись, зокрема, застосуванням IL10. Подальші дослідження мають показати, чи є цитокіновий відповідь вторинним феноменом у відповідь роздратування чи, навпаки, експресія відповідних цитокінів визначає реактивність організму з недостатнім розвитком наступних клінічних проявів. Вивчення рівня цитокінів при ВЗТК у дітей досі не проводилося. Ця робота є першою частиною наукового дослідження, присвяченого вивченню цитокінового статусу при ВЗТК у дітей. Метою цієї роботи стало вивчення гуморальної активності макрофагів з визначенням рівнів (IL1a, IL8) у крові у дітей з НЯК та БК, а також їх динаміка на тлі терапії. З 2000 по 2002 рік у відділенні гастроентерології Російської дитячої клінічної лікарні було обстежено 34 дитини з НЯК та 19 дітей з БК віком від 4 до 16 років. Діагноз верифікували анамнестично, ендоскопічно та морфологічно. Дослідження рівнів прозапальних цитокінів IL1a, IL8 проводилося методом імуноферментного аналізу (ELISA). Для визначення концентрації IL1a, IL8 використовували тестсистеми виробництва ТОВ "Цитокін" (м. Санкт-Петербург, Росія). Аналіз проводили у лабораторії імунофармакології Державного наукового центру НДІ особливо чистих біопрепаратів (керівник лабораторії д.м.н., проф. А.С. Симбірцев). Результати, отримані під час дослідження, виявили значне підвищення рівнів IL1a, IL8 під час загострення, виражене переважно в дітей із НЯК, ніж в дітей із БК. Поза загостренням рівні прозапальних цитокінів знижуються, проте не досягають норми. При НЯК рівні IL–1a, IL–8 були підвищені у періоді загострення у 76,2% та у 90% дітей, а в період ремісії – у 69,2% та 92,3% відповідно. При БК рівні IL–1a, IL–8 підвищені у періоді загострення у 73,3% та у 86,6% дітей, а в період ремісії – у 50% та у 75% відповідно.

Залежно від тяжкості захворювання діти отримували терапію аміносаліцилатами чи глюкокортикоїдами. Характер терапії значно впливав динаміку рівня цитокінів. На тлі терапії аміносаліцилатами рівні прозапальних цитокінів у групі дітей з НЯК та БК значно перевищували такі у контрольній групі. При цьому вищі показники спостерігалися у групі дітей з НЯК. При НЯК на фоні терапії аміносаліцилатами IL1a, IL8 підвищені у 82,4% та у 100% дітей відповідно, у той час як при терапії глюкокортикоїдами у 60% дітей для обох цитокінів. При БК IL1a, IL8 підвищені на фоні терапії аміносаліцилатами у всіх дітей, а при терапії глюкокортикоїдами у 55,5% та у 77,7% дітей відповідно. Таким чином, результати цього дослідження вказують на значне залучення до патогенетичного процесу макрофагальної ланки імунної системи у більшості дітей з НЯК та БК. Отримані у цьому дослідженні дані принципово немає від даних, отриманих під час обстеження дорослих пацієнтів. Відмінності рівнів IL1a та IL8 у пацієнтів з НЯК та БК мають кількісний, але не якісний характер, що дозволяє припустити неспецифічний характер даних змін, зумовлений перебігом хронічного запального процесу. Отже, дані показники немає діагностичного значення. Результати динамічного вивчення уронів IL1a та IL8 обґрунтовують більш високу ефективність терапії глюкокортикоїдними препаратами порівняно з терапією аміносаліцилами. Подані дані є результатом першого етапу дослідження цитокінового статусу дітей із ВЗТК. Потрібне подальше вивчення проблеми з урахуванням показників інших прозапальних та протизапальних цитокінів.

Роль оксиду азоту та цитокінів у розвитку синдрому гострого пошкодження легень.

Вивченням цієї проблеми займаються Т.А.Шуматова, В.Б.Шуматов, Е.В.Маркелова, Л.Г.Сухотепла: кафедра анестезіології та реаніматології Владивостоцького державного медичного університету. Синдром гострого ушкодження легень (респіраторний дистрес-синдром дорослих, РДСВ) - одна з найбільш тяжких форм гострої дихальної недостатності, що виникає у хворих на фоні тяжкої травми, сепсису, перитоніту, панкреатиту, рясної крововтрати, аспірації, після великих оперативних втручань і в 60% випадків, що призводить до летального результату. Дані досліджень патогенезу РДСВ, розробки критеріїв ранньої діагностики та прогнозу синдрому нечисленні, досить суперечливі, що не дозволяє розробити струнку діагностичну та лікувальну концепцію. Встановлено, що в основі РДСВ лежить пошкодження ендотелію легеневих капілярів та епітелію альвеол, порушення реологічних властивостей крові, що призводять до набряку інтерстиціальної та альвеолярної тканини, явищ запалення, ателектазу, легеневої гіпертензії. У літературі останніх років з'явилося достатньо відомостей про універсальний регулятор клітинного та тканинного метаболізму - оксид азоту. Інтерес до оксиду азоту (NO) обумовлений насамперед тим, що він залучається до регуляції безлічі функцій, включаючи судинний тонус, серцеву скоротливість, агрегацію тромбоцитів, нейротрансмісію, синтез АТФ та білків, імунний захист. Крім того, залежно від вибору молекулярної мішені та особливостей взаємодії з нею, NO має і ушкоджуючий ефект. Вважається, що пусковим механізмом активації клітин є незбалансована цітокінемія. Цитокіни - це розчинні пептиди, що виконують функції медіаторів імунної системи та забезпечують клітинні кооперації, позитивну та негативну імунорегуляцію. Ми спробували систематизувати відомості про роль NO і цитокінів у розвитку синдрому гострого пошкодження легень. NO являє собою розчинний у воді та жирах газ. Його молекула є нестійким вільним радикалом, легко дифундує у тканину, поглинається та руйнується настільки швидко, що здатна впливати лише на клітини найближчого оточення. Молекула NO має всі властивості, властиві класичним месенджерам: швидко продукується, діє в дуже низьких концентраціях, після припинення дії зовнішнього сигналу швидко перетворюється на інші сполуки, окислюючись до стабільних неорганічних оксидів азоту: нітриту і нітрату. Тривалість життя NO у тканині становить, за різними даними, від 5 до 30 секунд. Основними молекулярними мішенями NО є залізовмісні ферменти та білки: розчинна гуанілатциклаза, власне нітрооксидсинтаза (NOS), гемоглобін, мітохондріальні ферменти, ферменти циклу Кребса, синтезу білка та ДНК. Синтез NO в організмі відбувається шляхом ензиматичних перетворень азотовмісної частини амінокислоти L-аргініну під впливом специфічного ферменту NOS та опосередкований взаємодією іонів кальцію з кальмодуліном. Фермент інактивується при низьких концентраціях та максимально активний при 1 мкМ вільного кальцію. Ідентифіковано дві ізоформи NOS: конститутивну (cNOS) та індуковану (iNOS), що є продуктами різних генів. Кальцій-кальмодулінзалежна cNOS постійно присутня в клітині та сприяє виділенню невеликої кількості NO у відповідь на рецепторну та фізичну стимуляцію. NO, що утворюється під впливом цієї ізоформи, діє як переносник у низці фізіологічних відповідей. Кальцій-кальмодуліннезалежна iNOS утворюється в різних типах клітин у відповідь на прозапальні цитокіни, ендотоксини та оксиданти. Ця ізоформа NOS транскрибується специфічними генами 17 хромосоми та сприяє синтезу великої кількості NO. Фермент також класифікують за трьома типами: NOS-I (нейрональний), NOS-II (макрофагальний), NOS-III (ендотеліальний). Сімейство ферментів, що синтезують NO, знайдено в безлічі клітин легень: в епітеліоцитах бронхів, в альвеолоцитах, в альвеолярних макрофагах, в опасистих клітинах, в ендотеліоцитах бронхіальних артерій і вен, в гладких міоцитах бронхів і судин, в неад. Конститутивна здатність епітеліоцитів бронхів та альвеол людини та ссавців секретувати NО була підтверджена у численних дослідженнях. Встановлено, що верхні відділи дихальних шляхів людини, як і нижні відділи, беруть участь у освіті NO. Дослідження, проведені у хворих з трахеостомією, показали, що в повітрі, що видихається через трахеостому, кількість газу значно менша, порівняно з порожниною носа та рота. Значно страждає синтез ендогенного NO у хворих, які перебувають на штучній вентиляції легень. Дослідження підтверджують, що звільнення NO відбувається в момент бронходилятації та контролюється системою блукаючого нерва. Отримано дані, що утворення NO в епітелії дихальних шляхів людини підвищується при запальних захворюваннях органів дихання. Синтез газу збільшується за рахунок активації індукованої NOS під впливом цитокінів, а також ендотоксинів та ліпополісахаридів.

Нині відомо понад сто цитокінів, які традиційно поділяють кілька груп.

1. Інтерлейкіни (IL-1 – IL18) – секреторні регуляторні білки, що забезпечують медіаторні взаємодії в імунній системі та її зв'язок з іншими системами організму.

2. Інтерферони (IFN-альфа, бета, гама) – противірусні цитокіни з вираженою імунорегуляторною дією.

3. Фактори некрозу пухлини (TNF альфа, бета) – цитокіни з цитотоксичною та регуляторною дією.

4. Колонієстимулюючі фактори (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - стимулятори росту та диференціювання гемопоетичних клітин, що регулюють гемопоез.

5. Хемокіни (IL-8, IL-16) – хемоаттрактанти для лейкоцитів.

6. Фактори росту – регулятори росту, диференціювання та функціональної активності клітин різної тканинної приналежності (фактор росту фібробластів, фактор росту ендотеліальних клітин, фактор росту епідермісу) та трансформуючі фактори росту (TGF бета).

Ці біорегуляторні молекули визначають тип і тривалість запальної та імунної відповіді, контролюють проліферацію клітин, гемопоез, ангіогенез, загоєння ран та багато інших процесів. Усі дослідники наголошують, що цитокіни позбавлені специфічності щодо антигенів. Експерименти з культивованими легеневими макрофагами та опасистими клітинами показали утворення iNOS у відповідь на гамма-інтерферон, інтерлейкін-1, фактор некрозу пухлини та ліпополісахариди. Експресія iNOS та cNOS на прозапальні цитокіни була виявлена в альвеолоцитах тварин та людини. Додавання культуру епідермального чинника зростання, регулятора функції епітеліальних клітин, знижувало активність лише індукованого ферменту. Відомо, що залежно від природи, цитокіни діють аутокринно – на самі клітини продуценти, паракринно – на інші клітини – мішені або ендокринно – на різні клітини за межами місця їхньої продукції. При цьому вони можуть взаємодіяти один з одним за агоністичним або антагоністичним принципом, змінюючи функціональний стан клітин-мішеней та формуючи цитокінову мережу. Таким чином, цитокіни є не розрізненими пептидами, а цілісною системою, основними компонентами якої є клітини-продуценти, сам білок - цитокін, рецептор, що його сприймає, і клітина-мішень. Встановлено, що при розвитку гострого ушкодження легень підвищується рівень прозапальних цитокінів: IL-1, 6, 8, 12, TNF альфа, IFN альфа. Їх ефект пов'язаний з розширенням судин, збільшенням їх проникності та накопиченням рідини у тканині легені. Крім того, у дослідженнях показано здатність IFN гамма та TNF альфа індукувати експресію молекул адгезії - ICAM -1 на ендотеліоцитах людини. Молекули адгезії, прилипаючи до лейкоцитів, тромбоцитів і клітин ендотелію, формують "rolling" (крутні) нейтрофіли і сприяють агрегації частинок фібрину. Ці процеси роблять свій внесок у порушення капілярного кровотоку, збільшують проникність капілярів, індукують локальний набряк тканин. Уповільнення капілярного кровотоку сприяє активація NO, що викликає дилятацію артеріол. Подальша міграція лейкоцитів у вогнище запалення контролюється спеціальними цитокінами – хемокінами, які продукуються та секретуються не лише активованими макрофагами, а й ендотеліальними клітинами, фібробластами, гладкими міоцитами. Їх основна функція - постачати нейтрофіли в осередок запалення та активувати їх функціональну активність. Основним хемокіном для нейтрофілів є Il-8. Найбільш сильними його індукторами є бактеріальні ліпополісахариди, IL-1 і TNFальфа. Р. Bahra із співавт. вважають, що кожен крок трансендотеліальної міграції нейтрофілів регулюється стимулюючими концентраціями TNF альфа. При розвитку гострого пошкодження легень ендотеліоцити судин, епітеліоцити бронхів та альвеолярні макрофаги активуються та залучаються до фазових взаємодій. В результаті відбувається, з одного боку, їх мобілізація та посилення захисних властивостей, а, з іншого боку, можливе пошкодження самих клітин та навколишніх тканин. У ряді робіт показано, що в осередку запалення здатний накопичуватися продукт часткового відновлення кисню - супероксид, який інактивує вазоактивну дію NO. NO і супероксидний аніон піддаються швидкому взаємодії з утворенням пероксинітриту, що ушкоджує клітини. Ця реакція сприяє видаленню NO із судинної та бронхіальної стінки, а також з поверхні альвеолоцитів. Цікавість дослідження, що показали, що традиційно розглядається як медіатор NO-токсичності, пероксинітрит може мати фізіологічну дію і викликати судинну релаксацію через NO-опосередковане збільшення цГМФ в судинному ендотелії. У свою чергу, пероксинітрит - це сильнодіючий оксидант, здатний пошкоджувати альвеолярний епітелій та легеневий сурфактант. Він викликає руйнування білків та ліпідів мембран, ушкоджує ендотелій, збільшує агрегацію тромбоцитів, бере участь у процесах ендотоксемії. Його підвищена освіта відзначена при синдромі гострого ушкодження легень. Дослідники вважають, що продукований внаслідок активації індукованого ферменту NO, призначений для неспецифічного захисту організму від широкого спектра патогенних агентів, гальмує агрегацію тромбоцитів та покращує місцевий кровообіг. Встановлено, що надмірна кількість NO пригнічує активність cNOS у клітинах за рахунок взаємодії з супероксидом і, можливо, внаслідок десенситизації гуанілатциклази, що призводить до зниження цГМФ у клітині та підвищення внутрішньоклітинного кальцію. Brett із співавт. та Kooy зі співавт., аналізуючи значення нітрооксидергічних механізмів у патогенезі РДСВ, висловили думку, що ключову роль у розвитку синдрому може грати iNOS, пероксинітрит, а також нітротирозин – основний продукт впливу пероксинітриту на білок. Cuthbertson з співавт. вважають, що в основі гострого пошкодження легень лежить вплив NO та пероксинітриту на еластазу та інтерлейкін-8. Kobayashi з співавт. також зареєстрували збільшення вмісту iNOS, інтерлейкіну-1, інтерлейкіну-6, інтерлейкіну-8 у бронхоальвеолярній рідині у хворих з синдромом гострого пошкодження легень. Meldrum з співавт. показали зменшення вироблення запальних цитокінів легеневими макрофагами при РДСВ під впливом субстрату локальної продукції NO – L-аргініну. Встановлено, що в генезі синдрому гострого пошкодження легень суттєву роль відіграє порушення проникності судин, зумовлене дією цитокінів – TNF альфа, IL-2, GM-CSF, моноклональних антитіл до CD3 лімфоцитів на ендотеліальні клітини судин легень та імуноцити. Швидке та сильне збільшення проникності легеневих судин призводить до міграції нейтрофілів у тканину легень та вивільнення ними цитотоксичних медіаторів, що є провідним у розвитку патологічної альтерації легень. У процесі розвитку гострого пошкодження легень TNF альфа збільшує адгезію нейтрофілів до судинної стінки, посилює їх міграцію в тканині, сприяє структурним та метаболічним змінам ендотеліоцитів, порушує проникність клітинних мембран, активує утворення інших цитокінів та ейкозаноїдів, викликають апозіоз. Отримано дані, що свідчать, що індукований введенням LPS апоптоз макрофагів багато в чому пов'язаний з IFN гамма та знижується під дією IL-4, IL-10, TGF бета. Однак Kobayashi із співавт. отримали дані, що свідчать, що IFN гама може залучатися до процесів репарації епітелію слизової оболонки дихальних шляхів. У дослідженнях Hagimoto містяться відомості про те, що епітеліоцити бронхів та альвеол у відповідь на TNF альфа або Fas-ліганд виділяють IL-8, IL-12. Цей процес пов'язані з активацією ядерного чинника Карра-В Fas-лігандом.

Існує думка, що IL-8 є одним із найважливіших цитокінів у патофізіології гострих легеневих ушкоджень. Miller із співавт. при дослідженні бронхо-альвеолярної рідини у хворих з РДСВ на фоні сепсису встановили значне збільшення рівня IL-8 порівняно з пацієнтами з кардіогенним набряком легень. Висловлено припущення, що первинним джерелом Il-8 є легкі і цей критерій можна використовувати при диференціальній діагностиці синдрому. Grau із співавт. вважають, що ендотеліоцити легеневих капілярів є важливим джерелом цитокінів - IL-6, IL-8 при розвитку гострого пошкодження легень. Goodman з співавт. при вивченні динаміки рівня цитокінів у рідині бронхо-альвеолярного лаважу у хворих на РДСВ встановили значне збільшення IL-1бету, IL-8, моноцитарного хемотаксичного пептиду-1, епітеліального клітинного нейтрофільного активатора, макрофагального запального пептиду -1 аль. При цьому автори вважають, що збільшення вмісту IL-1 бета може бути маркером несприятливого результату синдрому. Bauer із співавт. було показано, що контроль за вмістом у бронхоальвеолярній рідині у хворих на РДСВ IL-8 можна використовувати для моніторингу, зниження рівня IL-8 свідчить про несприятливу течію процесу. У ряді досліджень також містяться відомості, що рівень продукції цитокінів ендотелією судин легень впливає на розвиток гострого легеневого ушкодження та контроль за яким може бути застосований у клінічній практиці для ранньої діагностики. Про можливі негативні наслідки підвищення рівня прозапальних цитокінів у хворих на РДСВ свідчать дослідження Martin з співавт., Warner із співавт.. Активовані цитокінами та бактеріальними ендотоксинами альвеолярні макрофаги посилюють синтез NO. Рівень продукції NO епітеліоцитами бронхів та альвеол, нейтрофілами, гладкими клітинами, ендотеліоцитами та гладкими міоцитами легеневих судин також збільшується, ймовірно, через активацію ядерного фактора Карра-В. Автори вважають, що оксид азоту, що продукується в результаті активації індукованої NOS, призначений, в першу чергу, для неспецифічного захисту організму. Виділяючись із макрофагів, NO швидко проникає у бактерії, гриби, де інгібує три життєво важливі групи ферментів: Н-електрон-транспортні, циклу Кребса та синтезу ДНК. NO залучається на захист організму на останніх етапах імунної відповіді і образно розглядається як караючий меч імунної системи. Однак, накопичуючись у клітині в неадекватно великих кількостях, NO має і ушкоджуючий ефект. Таким чином, при розвитку синдрому гострого пошкодження легень цитокіни та NO запускають послідовний ланцюг реакцій, що виражаються у порушенні мікроциркуляції, виникненні тканинної гіпоксії, альвеолярного та інтерстиціального набряку, ушкодженні метаболічної функції легень. Отже, можна констатувати, що вивчення фізіологічних та патофізіологічних механізмів дії цитокінів та NO є перспективним напрямом для досліджень та дозволить надалі не лише розширити уявлення про патогенез РДСВ, а й визначити діагностичні та прогностичні маркери синдрому, розробити варіанти патогенетично обґрунтованої терапії, летальності.

Методи визначення цитокінів.

Огляд присвячений основним методам дослідження цитокінів, які нині використовуються. Коротко охарактеризовано можливості та призначення методів. Наведено переваги та недоліки різних методик підходів до аналізу експресії генів цитокінів на рівні нуклеїнових кислот та на рівні продукції білка. (Цитокіни та запалення. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Цитокіни - це регуляторні білки, які утворюють універсальну мережу медіаторів, характерну як імунної системи, так клітин інших органів прокуратури та тканин. Під контролем цього класу регуляторних білків протікають усі клітинні події: проліферація, диференціювання, апоптоз, спеціалізована функціональна активність клітин. Ефекти кожного цитокіну на клітини характеризуються плейотропністю, спектр ефектів різних медіаторів перекривається і в основному кінцевий функціональний стан клітини залежить від впливу кількох цитокінів, що діють синергічно. Таким чином, система цитокінів є універсальною, поліморфною регуляторною мережею медіаторів, призначених для контролю процесів проліферації, диференціювання, апоптозу та функціональної активності клітинних елементів у кровотворній, імунній та інших гомеостатичних системах організму. Методи визначення цитокінів за 20 років їхнього інтенсивного вивчення пройшли дуже швидку еволюцію і сьогодні представляють цілу галузь наукового знання. Перед дослідниками у цитокінології на початку роботи стоїть питання щодо вибору методу. І тут дослідник повинен точно знати, яку інформацію йому потрібно отримати задля досягнення поставленої мети. В даний час розроблено сотні різних методів оцінки системи цитокінів, які дають різнопланову інформацію про цю систему. Оцінювати цитокіни у різних біологічних середовищах можна за специфічною біологічною активністю. Можна визначати їх кількісно за допомогою цілого ряду методів імуноаналізу, які використовують полі- та моноклональні антитіла. Крім вивчення секреторних форм цитокінів можна вивчати їх внутрішньоклітинний вміст та продукцію у тканинах методами проточної цитофлюориметрії, вестерн-блотингу та імуногістохімії in situ. Дуже важливу інформацію можна отримати, вивчаючи експресію мРНК цитокінів, стабільність мРНК, наявність ізоформ мРНК цитокінів, природних антисмислових нуклеотидних послідовностей. Вивчення алельних варіантів генів цитокінів може дати важливу інформацію про генетично запрограмовану високу або низьку продукцію того чи іншого медіатора. У кожного методу є свої недоліки та свої переваги, своя роздільна здатність та точність визначення. Незнання та нерозуміння дослідником цих нюансів може привести його до хибних висновків.

Визначення біологічної активності цитокінів.

Історія виявлення та перших кроків у вивченні цитокінів була тісно пов'язана з культивуванням імунокомпетентних клітин та клітинних ліній. Тоді були показані регуляторні ефекти (біологічна активність) ряду розчинних факторів білкової природи на проліферативну активність лімфоцитів, синтез імуноглобулінів, розвиток імунних реакцій в моделях in vitro. Одна з перших методик визначення біологічної активності медіаторів – визначення фактора міграції людських лімфоцитів та фактора її інгібіції. У міру вивчення біологічних ефектів цитокінів з'являлися різні методи оцінки їх біологічної активності. Так, IL-1 визначали за оцінкою проліферації мишачих тимоцитів in vitro, IL-2 - за здатністю стимулювати проліферативну активність лімфобластів, IL-3 - за зростанням гемопоетичних колоній in vitro, IL-4 - за комітогенним ефектом, посилення експресії Ia-білків. , з індукції освіти IgG1 та IgE і т.д. Список цих методів можна продовжувати, він постійно поповнюється принаймні виявлення нових біологічних активностей розчинних факторів. Головний їх недолік - нестандартність методик, неможливість їхньої уніфікації. Подальший розвиток прийомів визначення біологічної активності цитокінів призвело до створення великої кількості клітинних ліній, чутливих до того чи іншого цитокіну, або мультичутливих ліній. Зараз більшість цих цитокінчутливих клітин можна виявити в списках клітинних ліній, що комерційно розповсюджуються. Наприклад, для тестування IL-1a та b використовують клітинну лінію D10S, для IL-2 та IL-15 - клітинну лінію CTLL-2, для IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF - клітинну лінію TF-1, для IL-6 - клітинну лінію B9, для IL-7 - клітинну лінію 2Е8, для TNFa та TNFb - клітинну лінію L929, для IFNg - клітинну лінію WiDr , для IL-1 лінію KG-1. Однак, подібний підхід у вивченні імуноактивних білків, поряд з добре відомими перевагами, такими як вимірювання реальної біологічної активності зрілих та активних білків, високою відтворюваністю за стандартизованих умов, має свої недоліки. До них можна віднести, в першу чергу, чутливість клітинних ліній не одного цитокіну, а до кількох родинних цитокінів, біологічні ефекти яких перекриваються. Крім того, не можна виключити можливість індукції продукції інших цитокінів клітинами-мішенями, які можуть спотворювати параметр, що тестується (як правило, це проліферація, цитотоксичність, хемотаксис). Ми знаємо ще не всі цитокіни та не всі їхні ефекти, тому оцінюємо не сам цитокін, а сумарну специфічну біологічну активність. Таким чином, оцінка біологічної активності як сумарної активності різних медіаторів (недостатня специфічність) є одним із недоліків цього методу. Крім того, використовуючи цитокінчутливі лінії, неможливо виявити неактивовані молекули та зв'язані білки. Отже, подібні методики не відображають реальної продукції для низки цитокінів. Ще один важливий недолік використання клітинних ліній – необхідність лабораторії для культури клітин. Крім того, всі процедури нарощування клітин, інкубування їх з досліджуваними білками та середовищами вимагають великих тимчасових витрат. Також слід зазначити, що клітинні лінії при тривалому їх застосуванні вимагають оновлення або повторної сертифікації, тому що в результаті культивування вони можуть мутувати і модифікуватися, що може призводити до зміни їх чутливості до медіаторів та зниження точності визначення біологічної активності. Проте цей метод ідеальний для тестування специфічної біологічної активності рекомбінантних медіаторів.

Кількісне визначення цитокінів за допомогою антитіл.

Продуковані імунокомпетентними та іншими типами клітин цитокіни виділяються в міжклітинний простір для здійснення паракринних та аутокринних сигнальних взаємодій. За концентрацією цих білків у сироватці крові або в кондиційному середовищі можна судити про характер патологічного процесу та про надлишок або нестачу певних функцій клітин у хворого. Методи визначення цитокінів за допомогою специфічних антитіл є найпоширенішими системами детекції цих білків. Дані методи пройшли через цілу серію модифікацій з використанням різних міток (радіоізотопних, флюоресцентних, електрохемілюмінесцентних, ферментних тощо). Якщо радіоізотопні методи мають ряд недоліків, пов'язаних з використанням радіоактивної мітки та обмеженою за часом можливістю використання мічених реагентів (період напіврозпаду), то імуноферментні методи знайшли широке поширення. Вони засновані на візуалізації нерозчинних продуктів ферментативної реакції, що поглинають світло з відомою довжиною хвилі, в кількостях, еквівалентних концентрації речовини, що визначається. Для зв'язування вимірюваних речовин використовують антитіла, нанесені на тверду полімерну основу, а для візуалізації - антитіла, кон'юговані з ферментами, як правило, лужною фосфатазою або пероксидазою хрону. Переваги методу очевидні: це висока точність визначення за стандартизованих умов зберігання реактивів та виконання процедур, кількісний аналіз, відтворюваність. До недоліків можна віднести обмежений діапазон визначених концентрацій, у результаті всі концентрації, перевищують певний поріг, вважаються рівними йому. Необхідно відзначити, що витрати часу виконання методу варіюють залежно від рекомендацій виробника. Однак у будь-якому випадку йдеться про кілька годин, необхідних для інкубацій та відмивок реагентів. Крім того, визначаються латентні та пов'язані форми цитокінів, які за своєю концентрацією можуть значно перевищувати вільні форми, переважно відповідальні за біологічну активність медіатора. Тому цей метод бажано використовувати разом із методами оцінки біологічної активності медіатора. Інша модифікація методу імуноаналізу, яка знайшла широке застосування - електрохемілюмінесцентний метод (ЕХЛ) визначення білків антитілами, міченими рутенієм та біотином. Цей метод має наступні переваги в порівнянні з радіоізотопними та імуноферментними: простота виконання, невеликий час виконання методики, відсутність процедур відмивань, малий обсяг проби, великий діапазон зумовлених концентрацій цитокінів у сироватці та в кондиційному середовищі, висока чутливість методу та його відтворюваність. Розглянутий метод є прийнятним для використання як у наукових дослідженнях, так і в клінічних. Наступний метод оцінки цитокінів у біологічних середовищах розроблено на основі технології проточної флюориметрії. Він дозволяє одночасно оцінювати у зразку до сотні білків. Нині створено комерційні набори визначення до 17 цитокінів. Проте переваги цього методу визначають і його недоліки. По-перше, це трудомісткість підбору оптимальних умов визначення кількох білків, по-друге, продукція цитокінів носить каскадний характер із піками продукції різний час. Тому визначення великої кількості білків одномоментно який завжди інформативно. Загальною вимогою методів імуноаналізу, які використовують т.зв. "сендвіч", є ретельний підбір пари антитіл, що дозволяє визначати або вільну або пов'язану форму аналізованого білка, що накладає на цей метод обмеження, і що завжди потрібно враховувати при інтерпретації отриманих даних. Цими методами визначається сумарна продукція цитокінів різними клітинами, водночас про антигенспецифічну продукцію цитокінів імунокомпетентними клітинами можна судити лише ймовірно. В даний час розроблено систему ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), яка значною мірою усуває ці недоліки. Метод дозволяє напівкількісно оцінювати продукцію цитокінів лише на рівні окремих клітин. Висока роздільна здатність цього методу дозволяє оцінювати антиген-стимульовану продукцію цитокінів, що дуже важливо для оцінки специфічної імунної відповіді. Наступний метод, що широко використовується в наукових цілях, - це внутрішньоклітинне визначення цитокінів методом проточної цитофлюориметрії. Переваги його очевидні. Ми можемо фенотипно охарактеризувати популяцію клітин-продуцентів цитокіну та/або визначити спектр продукованих цитокінів окремими клітинами, при цьому є можливість відносної кількісної характеристики цієї продукції. Разом з тим описуваний метод досить складний і вимагає дорогого обладнання. Наступна серія методів, яка використовується в основному в наукових цілях – це імуногістохімічні методи з використанням мічених моноклональних антитіл. Переваги очевидні - визначення продукції цитокінів у тканинах (in situ), де відбуваються різні імунологічні реакції. Однак методи, що розглядаються, дуже трудомісткі і не дають точних кількісних даних.

Визначення цитокінів методом імуноферментного аналізу.

ЗАТ "Вектор-Бест" під керівництвом Т.Г. Рябічова, Н.А. Вараксін, Н.В. Тимофєєва, М.Ю. Рукавишників ведуть активну роботу у напрямі визначення цитокінів. Цитокіни є групою поліпептидних медіаторів, часто глікозильованих, з молекулярною масою від 8 до 80 кД. Цитокіни беруть участь у формуванні та регуляції захисних реакцій організму та його гомеостазу. Вони залучені у всі ланки гуморальної та клітинної імунної відповіді, включаючи диференціювання імунокомпетентних клітин-попередників, подання антигену, клітинну активацію та проліферацію, експресію молекул адгезії та острофазової відповіді. Деякі з них здатні виявляти безліч біологічних ефектів по відношенню до різних клітин-мішеней. Дія цитокінів на клітини здійснюється такими шляхами: аутокринно - на клітину, що синтезує та секретує даний цитокін; паракринно - на клітини, розташовані поблизу клітини-продуцента, наприклад, в осередку запалення або в лімфоїдному органі; ендокринно-дистанційно – на клітини будь-яких органів та тканин після попадання цитокіну в циркуляцію крові. Утворення та вивільнення цитокінів зазвичай відбувається короткочасно та жорстко регулюється. Цитокіни впливають на клітину, зв'язуючись зі специфічними рецепторами на цитоплазматичній мембрані, викликаючи цим каскад реакцій, що веде до індукції, посилення або придушення активності ряду генів, що ними регулюються. Для цитокінів характерний складний мережевий характер функціонування, у якому продукція однієї з них впливає освіту чи прояв активності інших. Цитокіни є локальними медіаторами, тому доцільно вимірювати їх рівні у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів з біоптатів відповідних органів або в природних рідинах: сечі, сльозовій рідині, рідині деснових кишень, бронхоальвеолярному ламові, синовіальної рідини та ін. Додаткову інформацію про стан імунної системи організму можна отримати щодо здатності клітин крові до продукції цитокінів in vitro. Рівні вмісту цитокінів у плазмі відбивають поточний стан імунної системи та розвитку захисних реакцій in vivo. Спонтанна продукція цитокінів культурою мононуклеарів периферичної крові дає змогу оцінити стан відповідних клітин. Підвищена спонтанна продукція цитокінів свідчить, що клітини вже активовані антигеном in vivo. Індукована продукція цитокінів дозволяє оцінити потенційну здатність відповідних клітин відповідати антигенну стимуляцію. Знижена індукція цитокінів in vitro, наприклад, може бути однією з ознак імунодефіцитного стану. Тому обидва варіанти вивчення рівнів цитокінів як у циркулюючій крові, так і за їх продукції культурами клітин важливі з точки зору характеристики імунореактивності всього організму та функції окремих ланок імунної системи. Донедавна у Росії вивченням цитокінів займалися нечисленні групи дослідників, оскільки біологічні методи дослідження дуже трудомісткі, а імпортні імунохімічні набори дуже дорогі. З появою доступних вітчизняних імуноферментних наборів дедалі більший інтерес до вивчення цитокінового профілю виявляють лікарі-практики. На даний момент діагностична значущість оцінки рівня цитокінів полягає в констатації самого факту підвищення або зниження їхньої концентрації у даного хворого з конкретним захворюванням. Причому для оцінки тяжкості та прогнозування перебігу захворювання доцільно визначати концентрацію як проти-, так і прозапальних цитокінів у динаміці розвитку патології. Наприклад, вміст цитокінів у периферичній крові визначається термінами загострення, відображає динаміку патологічного процесу при виразковій хворобі та інших захворюваннях шлунково-кишкового тракту. На ранніх термінах загострення переважає збільшення вмісту інтерлейкіну-1бета (ІЛ-1бета), інтерлейкіну-8 (ІЛ-8), потім підвищується концентрація інтерлейкіну-6 (ІЛ-6), гамма-інтерферону (гамма-ІНФ), фактору некрозу пухлин -альфа (альфа-ФНП). Концентрація інтерлейкіну-12 (ІЛ-12), гамма-ІНФ, альфа-ФНП досягала свого максимуму в розпал захворювання, тоді як вміст маркерів гострої фази в цей період наближався до нормальних величин. На піку загострення рівень альфа-ФНВ достовірно перевищував вміст інтерлейкіну-4 (ІЛ-4) як у сироватці крові, так і безпосередньо в ураженій тканині навколовиразкової зони, після чого починав поступово зменшуватися. У міру стихання острофазних явищ посилення процесів репарації зростало збільшення концентрації ІЛ-4. За зміною цитокінового профілю можна судити про ефективність і доцільність хіміотерапії, що проводиться. При проведенні цитокінотерапії, наприклад, при терапії альфа-інтерфероном (альфа-ІНФ), необхідно контролювати як рівень його вмісту в циркулюючій крові, так і напрацювання антитіл до альфа-ІНФ. Відомо, що при напрацюванні великої кількості цих антитіл інтерферонотерапія не тільки перестає бути ефективною, а може призвести до аутоімунних захворювань. Останнім часом розроблені та впроваджуються в практику нові препарати, які так чи інакше змінюють цитокіновий статус організму. Наприклад, для лікування ревматоїдного артриту пропонується препарат на основі антитіл до альфа-ФНП, призначений для виведення альфа-ФНП, що бере участь у деструкції сполучної тканини. Однак, як за нашими даними, так і за літературними, далеко не у всіх хворих на хронічний ревматоїдний артрит рівень альфа-ФНП підвищений, тому для цієї групи хворих зменшення рівня альфа-ФНП може ще більше посилити дисбаланс імунної системи. Таким чином коректна цитокінотерапія передбачає контроль цитокінового статусу організму під час лікування. Захисна роль прозапальних цитокінів проявляється локально, в осередку запалення, проте їхня системна продукція не призводить до розвитку протиінфекційного імунітету і не перешкоджає розвитку бактеріально-токсичного шоку, що є причиною ранньої летальності хірургічних хворих з гнійно-септичними ускладненнями. Основою патогенезу хірургічних інфекцій є запуск цитокінового каскаду, який включає, з одного боку, прозапальні, а з іншого - протизапальні цитокіни. Баланс між цими двома оппозитними групами багато в чому визначає характер перебігу та результат гнійно-септичних захворювань. Однак визначення концентрації в крові по одному цитокіну з цих груп (наприклад, альфа-ФНП або ІЛ-4) не адекватно відображатиме стан всього цитокінового балансу. Тому необхідна одномоментна оцінка рівня кількох медіаторів (щонайменше 2–3 із опозитних підгруп). У ЗАТ «Вектор-Бест» зараз розроблені та серійно виробляються набори реагентів для кількісного визначення: фактора некрозу пухлин-альфа (чутливість – 2 пг/мл, 0–250 пг/мл); гамма-інтерферону (чутливість – 5 пг/мл, 0–2000 пг/мл); інтерлейкіну-4 (чутливість - 2 пг/мл, 0-400 пг/мл); інтерлейкіну-8 (чутливість - 2 пг/мл, 0-250 пг/мл); рецепторного антагоніста інтерлейкіну-1 (ІЛ-1РА) (чутливість - 20 пг/мл, 0-2500 пг/мл); альфа-інтерферону (чутливість – 10 пг/мл, 0–1000 пг/мл); аутоімунних антитіл до альфа-інтерферону (чутливість – 2 нг/мл, 0–500 нг/мл). Усі набори призначені визначення концентрації зазначених цитокінів в біологічних рідинах людини, в культуральних супернатантах щодо здатності культур клітин людини до продукції цитокінів in vitro. Принцип аналізу - «sandwich»-варіант тристадійного твердофазного (час інкубації - 4 год) або двостадійного (час інкубації - 3,5 год) імуноферментного аналізу на планшетах. Для аналізу потрібно 100 мкл біологічної рідини або культурального супернатанту на одну лунку. Облік результатів – спектрофотометрично на довжині хвилі 450 нм. У всіх наборах хромоген – тетраметилбензидин. Термін зберігання наших наборів збільшено до 18 місяців з дня випуску та 1 місяця після початку використання. Аналіз літературних даних показав, що вміст цитокінів у плазмі крові здорових людей залежить як від наборів, які використовуються для їх визначення, так і від регіону, де ці люди проживають. Тому для з'ясування значень нормальних концентрацій цитокінів у жителів нашого регіону було проведено аналіз випадкових вибірок плазми (від 80 до 400 зразків) практично здорових донорів крові, представників різних соціальних груп віком від 18 до 60 років без клінічних проявів грубої соматичної патології та відсутністю HBsAg, антитіл до ВІЛ, вірусів гепатитів B та C.

Чинник некрозу пухлин-альфа.

Альфа-ФНП - це плейотропний прозапальний цитокін, що складається з двох витягнутих b-ланцюгів з молекулярною масою 17 кД і виконує регуляторні та ефекторні функції в імунній відповіді та запаленні. Основні продуценти альфа-ФНП - моноцити та макрофаги. Цей цитокін виділяється також лімфоцитами та гранулоцитами крові, природними кілерами, Т-лімфоцитарними клітинними лініями. Головні індуктори альфа-ФНП - віруси, мікроорганізми та продукти їхнього метаболізму, у тому числі бактеріальний ліпополісахарид. Крім того, роль індукторів можуть виконувати і деякі цитокіни, такі як ІЛ-1, ІЛ-2, гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор, альфа- та бета-ІНФ. Основні напрямки біологічної активності альфа-ФНП: виявляє вибіркову цитотоксичність щодо деяких пухлинних клітин; активує гранулоцити, макрофаги, ендотеліальні клітини, гепатоцити (продукція білків гострої фази), остеокласти та хондроцити (резорбція кісткової та хрящової тканини), синтез інших прозапальних цитокінів; стимулює проліферацію та диференціювання: нейтрофілів, фібробластів, ендотеліальних клітин (ангіогенез), гемопоетичних клітин, Т- та В-лімфоцитів; посилює надходження нейтрофілів із кісткового мозку до крові; має протипухлинну та противірусну активність in vivo та in vitro; бере участь у захисних реакціях, а й у процесах деструкції і репарації, супутніх запаленню; служить одним із медіаторів деструкції тканин, звичайної при тривалому, хронічному запаленні.

Мал. 1. Розподіл рівня альфа-ФНП

у плазмі здорових донорів.

Підвищений рівень альфа-ФНП спостерігається у сироватці крові в період посттравматичного стану, при легеневих дисфункціях, порушення нормального перебігу вагітності, онкологічних захворюваннях, бронхіальній астмі. Рівень альфа-ФНВ у 5–10 разів вищий за норму спостерігається при загостренні хронічної форми вірусного гепатиту С. У період загострення захворювань шлунково-кишкового тракту концентрація альфа-ФНВ у сироватці перевищує норму в середньому у 10 разів, а у окремих хворих – у 75– 80 разів. Високі концентрації альфа-ФНП виявляються у цереброспінальній рідині у хворих на розсіяний склероз та цереброспінальний менінгіт, а у хворих на ревматоїдний артрит – у синовіальній рідині. Це дозволяє припускати участь альфа-ФНВ у патогенезі низки аутоімунних захворювань. Частота виявлення альфа-ФНВ у сироватці крові навіть при тяжкому запаленні не перевищує 50%, при індукованій та спонтанній продукції – до 100%. Діапазон концентрацій альфа-ФНП становив 0-6 пг/мл, середнє - 1,5 пг/мл (рис. 1).

Гамма-інтерферон.

Мал. 2. Розподіл рівня гамма-ІНФ

у плазмі здорових донорів.

Інтерлейкін-4

ІЛ-4 – глікопротеїн з молекулярною масою 18–20 кД, природний інгібітор запалення. Поряд із гамма-ІНФ ІЛ-4 є ключовим цитокіном, що продукується Т-клітинами (в основному ТН-2-лімфоцитами). Він підтримує баланс TH-1/TH-2. Головні напрями біологічної активності ІЛ-4: посилює еозинофілію, накопичення опасистих клітин, секрецію IgG4, опосередковану ТН-2-клітинами гуморальну імунну відповідь; має місцеву протипухлинну активність, стимулюючи популяцію цитотоксичних Т-лімфоцитів та інфільтрацію пухлини еозинофілами; пригнічує звільнення цитокінів запалення (альфа-ФНП, ІЛ-1, ІЛ-8) та простагландинів з активованих моноцитів, продукцію цитокінів ТН-1-лімфоцитами (ІЛ-2, гамма-ІНФ та ін.).

Мал. 3. Розподіл рівня ІЛ-4 у плазмі

здорових донорів.

Підвищений рівень вмісту ІЛ-4 як у сироватці, так і стимульованих лімфоцитах може спостерігатися при алергічних захворюваннях (особливо в момент загострення), таких як бронхіальна астма, алергічний риніт, поліноз, атопічний дерматит, при захворюваннях шлунково-кишкового тракту. Рівень ІЛ-4 також помітно підвищується у хворих на хронічний гепатит С (ХГС). У періоди загострення ХГС його кількість збільшується майже в 3 рази в порівнянні з нормою, а під час ремісії ХГС рівень ІЛ-4 знижується, особливо на тлі лікування рекомбінантним ІЛ-2, що проводиться. Діапазон концентрацій ІЛ-4 становив 0–162 пг/мл, середнє – 6,9 пг/мл, діапазон у нормі – 0–20 пг/мл (рис. 3).

Інтерлейкін-8

ІЛ-8 відноситься до хемокінів, являє собою протеїн з молекулярною масою 8 кД. ІЛ-8 продукується мононуклеарними фагоцитами, поліморфноядерними лейкоцитами, ендотеліальними клітинами та іншими типами клітин у відповідь на різні стимули, включаючи бактерії та віруси та продукти їх метаболізму, у тому числі прозапальні цитокіни (наприклад, ІЛ-1, альфа-ФНП). Основна роль інтерлейкіну-8 - посилення хемотаксису лейкоцитів. Він відіграє важливу роль як за гострого, так і при хронічному запаленні. Підвищений рівень ІЛ-8 спостерігається у пацієнтів із бактеріальними зараженнями, хронічними захворюваннями легень, захворюваннями шлунково-кишкового тракту. Рівень ІЛ-8 у плазмі збільшений у пацієнтів із сепсисом, а його високі концентрації корелюють із підвищеною смертністю. Результати вимірювання вмісту ІЛ-8 можуть бути використані для контролю за перебігом лікування та прогнозування результату захворювання. Так, підвищений вміст ІЛ-8 виявлено у слізній рідині у всіх хворих із сприятливим перебігом виразки рогівки. У всіх хворих з ускладненим перебігом виразки рогівки концентрація ІЛ-8 була у 8 разів вищою, ніж у пацієнтів із сприятливим перебігом захворювання. Таким чином, вміст прозапальних цитокінів (особливо ІЛ-8) у сльозовій рідині при виразці рогівки може використовуватися як прогностичний критерій перебігу даного захворювання.

Мал. 4. Розподіл рівня ІЛ-8

плазмі здорових донорів (м. Новосибірськ)

За нашими та літературними даними, у здорових людей у сироватці крові ІЛ-8 виявляється вкрай рідко; спонтанна продукція ІЛ-8 мононуклеарами крові спостерігається у 62%, а індукована – у 100% здорових донорів. Діапазон концентрацій ІЛ-8 становив 0-34 пг/мл, середнє - 2 пг/мл, діапазон у нормі - 0-10 пг/мл (рис. 4).

Мал. 5. Розподіл рівня ІЛ-8 у плазмі

здорових донорів (м.Рубцовськ).

Рецепторний антагоніст інтерлейкіну-1.

ІЛ-1РА відноситься до цитокінів, являє собою олігопептид з молекулярною масою 18-22 кД. ІЛ-1РА є ендогенним інгібітором ІЛ-1, що продукується макрофагами, моноцитами, нейтрофілами, фібробластами та епітеліальними клітинами. ІЛ-1РА пригнічує біологічну активність інтерлейкінів ІЛ-1альфа та ІЛ-1бету, конкуруючи з ними за зв'язування з клітинним рецептором.

Мал. 6. Розподіл рівня ІЛ-1РА

у плазмі здорових донорів

Продукцію ІЛ-1РА стимулюють багато цитокіни, вірусні продукти та білки гострої фази. ІЛ-1РА може активно експресуватися в запальних вогнищах при безлічі хронічних захворювань: при ревматоїдному та ювенільному хронічних артритах, системному червоному вовчаку, ішемічних ураженнях головного мозку, запальних захворюваннях кишечника, бронхіальній астмі, пієлонефриті, псоріазі та інших. При сепсисі відзначається найбільш високе підвищення ІЛ-1РА – до 55 нг/мл в окремих випадках, причому виявлено, що підвищені концентрації ІЛ-1РА корелюють зі сприятливим прогнозом. Високий рівень ІЛ-1РА спостерігається у жінок, які страждають на високий рівень ожиріння, причому цей рівень помітно знижується протягом 6 місяців після ліпосакції. Діапазон концентрацій ІЛ-1РА становив 0-3070 пг/мл, середнє - 316 пг/мл. Діапазон у нормі – 50–1000 пг/мл (рис. 6).

Альфа-інтерферон.

Альфа-ІНФ є мономерним неглікозильованим білком з молекулярною масою 18 кД, який синтезується переважно лейкоцитами (В-лімфоцитами, моноцитами). Цей цитокін може продукуватися фактично будь-яким типом клітин у відповідь на відповідне збудження, потужними стимуляторами синтезу альфа-ІНФ можуть бути внутрішньоклітинні вірусні інфекції. До індукторів альфа-ІНФ належать: віруси та їх продукти, серед яких провідне місце займають дволанцюгові РНК, що продукуються під час вірусної реплікації, а також бактерії, мікоплазми та протозої, цитокіни та ростові фактори (такі як ІЛ-1, ІЛ-2, альфа -ФНП, колонієстимулюючі фактори та ін). Початкова захисна реакція неспецифічної протибактеріальної імунної відповіді організму включає індукцію альфа- та бета-ІНФ. У цьому випадку він продукується антигенпрезентуючими клітинами (макрофагами), що захопили бактерії. Інтерферони (у тому числі альфа-ІНФ) відіграють важливу роль у неспецифічній ланці противірусної імунної відповіді. Вони посилюють противірусну резистентність, індукуючи у клітинах синтез ферментів, що пригнічують утворення нуклеїнових кислот та білків вірусів. Крім цього вони мають імуномодулюючу дію, посилюють у клітинах експресію антигенів головного комплексу гістосумісності. Зміна вмісту альфа-ІНФ виявлено при гепатитах та цирозах печінки вірусної етіології. У момент загострення вірусних інфекцій концентрація цього цитокіну значно зростає в більшості пацієнтів, а період реконвалесценції падає до рівня. Показано залежність між сироватковим рівнем альфа-ІНФ та ступенем тяжкості та тривалістю грипозної інфекції.

Мал. 7. Розподіл рівня альфа-ІНФ

у плазмі здорових донорів.

Збільшення концентрації альфа-ІНФ відзначають у сироватці більшості пацієнтів, які страждають на аутоімунні захворювання, такі як поліартрит, ревматоїдний артрит, спондилез, псоріатичний артрит, ревматична поліміалгія і склеродермія, системний червоний вовчак і системний васкуліт. Високий рівень цього інтерферону спостерігається також у окремих хворих у період загострення виразкової та жовчнокам'яної хвороби. Діапазон концентрацій альфа-ІНФ становив 0-93 пг/мл, середнє - 20 пг/мл. Діапазон у нормі – до 45 пг/мл (рис. 7).

Антитіла до альфа-інф.

Антитіла до альфа-ІНФ можуть бути виявлені в сироватках хворих на соматичний еритематозний вовчак. Спонтанна індукція антитіл до альфа-ІНФ також спостерігається у сироватках хворих з різними формами ракових пухлин. У деяких випадках антитіла до альфа-ІНФ були знайдені у сироватках ВІЛ-інфікованих, а також у цереброспінальній рідині та сироватках хворих на менінгіт у період гострої фази, у сироватках хворих на поліартрит у хронічній формі.

Мал. 8. Розподіл рівня антитіл до альфа-ІНФ

у плазмі здорових донорів.

Альфа-ІНФ є одним із ефективних противірусних та протипухлинних терапевтичних препаратів, але його тривале застосування може призвести до продукції специфічних антитіл до альфа-ІНФ. Це знижує ефективність лікування, а окремих випадках викликає різні побічні ефекти: від грипоподібних до розвитку аутоімунних захворювань. Зважаючи на це, при ІНФ-терапії важливо контролювати рівень антитіл до альфа-ІНФ в організмі хворого. Їх освіта залежить від типу препарату, що використовується в терапії, тривалості лікування та виду захворювання. Діапазон концентрацій антитіл до альфа-ІНФ становив 0-126 нг/мл, середнє - 6,2 нг/мл. Діапазон у нормі – до 15 нг/мл (рис. 8). Оцінка рівня цитокінів з використанням наборів реагентів, які серійно випускаються у ЗАТ «Вектор-Бест», дозволяє по-новому підійти до вивчення стану імунної системи організму в клінічній практиці.

Імунотропні препарати з урахуванням цитокінів.

Цікава робота. Цитокіни можуть бути виділені в нову самостійну систему регуляції основних функцій організму, існуючу поряд з нервовою та ендокринною регуляцією і пов'язану в першу чергу з підтриманням гомеостазу при введенні патогенів і порушення цілісності тканин. Цей новий клас регуляторних молекул створений природою протягом мільйонів років еволюції і має необмежені можливості для застосування як лікарські препарати. В рамках імунної системи цитокіни здійснюють взаємозв'язок між неспецифічними захисними реакціями та специфічним імунітетом, діючи в обох напрямках. На рівні організму цитокіни здійснюють зв'язок між імунною, нервовою, ендокринною, кровотворною та іншими системами та служать для їх залучення до організації та регулювання захисних реакцій. Рушійною силою інтенсивного вивчення цитокінів завжди була перспективна перспектива їх клінічного використання для лікування широко поширених захворювань, у тому числі раку, інфекційних та імунодефіцитних захворювань. У Росії зареєстровано кілька препаратів цитокінів, включаючи інтерферони, колонієстимулюючі фактори, інтерлейкіни та їх антагоністи, фактор некрозу пухлин. Усі препарати цитокінів можуть бути поділені на природні та рекомбінантні. Природні є препарати різного ступеня очищення, одержувані з культурального середовища стимульованих еукаріотичних клітин, головним чином, клітин людини. Основними недоліками є невисокий ступінь очищення, неможливість стандартизації через велику кількість компонентів, використання у виробництві компонентів крові. Мабуть, майбутнє цитокінової терапії пов'язане з генноінженерними препаратами, які отримують із застосуванням останніх досягнень біотехнології. За останні два десятиліття клоновані гени більшості цитокінів та отримані рекомбінантні аналоги, що повністю повторюють біологічні властивості природних молекул. У клінічній практиці існують три основні напрямки використання цитокінів:

1) цитокінова терапія для активації захисних реакцій організму, імуномодуляції, або заповнення нестачі ендогенних цитокінів,

2) антицитокінова імуносупресивна терапія, спрямована на блокування біологічної дії цитокінів та їх рецепторів,

3) цитокінову генотерапію з метою посилення протипухлинного імунітету або корекції генетичних дефектів у системі цитокінів.

Ряд цитокінів можуть бути використані в клініці для системного та місцевого застосування. Системне введення виправдовує себе у випадках, коли необхідно забезпечити дію цитокінів у кількох органах більш ефективної активації імунітету чи активувати клітини-мішені, розташовані у різних частинах організму. В інших випадках місцеве застосування має цілу низку переваг, оскільки воно дозволяє досягати високої локальної концентрації діючого початку, цілеспрямовано впливати на орган-мішень і уникнути небажаних системних проявів. В даний час цитокіни вважаються одними з найбільш перспективних лікарських засобів для застосування у клінічній практиці.

Висновок.

Таким чином, в даний час не викликає сумніву, що цітокіни є найважливішими факторами імунопатогенезу. Вивчення рівня цитокінів дозволяє отримати інформацію про функціональну активність різних типів імунокомпетентних клітин, співвідношення процесів активації Т-хелперів І та ІІ типів, що дуже важливо при диференціальній діагностиці ряду інфекційних та імунопатологічних процесів. Цитокіни - це специфічні білки, за допомогою яких клітини імунної системи можуть обмінюватися одна з одною інформацією та здійснювати взаємодію. Сьогодні виявлено більше сотні різних цитокінів, які прийнято умовно розділяти на прозапальні (що провокують запалення) та протизапальні (що перешкоджають розвитку запалення). Отже, різноманітні біологічні функції цитокінів поділяються на три групи: вони керують розвитком та гомеостазом імунної системи, здійснюють контроль за зростанням та диференціюванням клітин крові (системою гемопоезу) та беруть участь у неспецифічних захисних реакціях організму, впливаючи на запальні процеси, згортання крові, кров'я тиск.

Список використаної литературы.

С.В. Бельмер, А.С. Симбірцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпіна, Н.Є. Щиголєва, Т.Л. Михайлова. /Російський державний медичний університет ГНЦ колопроктології, Москва та ДНДІ особливо чистих біопрепаратів, Санкт-Петербург.

С.В. Сенніков, О.М. Силков// Журнал "Цитокіни та запалення", 2005, № 1 Т. 4, № 1. С.22-27.

Т.Г. Рябічова, Н.А. Вараксін, Н.В. Тимофєєва, М.Ю. Рукавишників, матеріали роботи ЗАТ «Вектор-Бест».

А. С. Симбірцев, ДНДІ особливо чистих біопрепаратів МОЗ Росії, м. Санкт-Петербург.

Кетлінський С.А., Симбірцев А.С.. ДержНДІ особливо чистих біопрепаратів, Санкт-Петербург.

Т.А.Шуматова, В.Б.Шуматов, Е.В.Маркелова, Л.Г.Сухотепла. Кафедра анестезіології та реаніматології Владивостоцького державного медичного університету.

В роботі використані матеріали із сайту http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

певних збудників інфекційних хвороб Так, норсульфазол...

Противірусний імунітет молекулярно-клітинні механізми, закономірності розвитку та імунопато
Реферат Медицина, здоров'я
... «сайт» позначають конкретну ділянку певногополіпептиду (антигена), з яким... її ранніх етапах. Цитокінита хемокіни. Інші цитокіни, крім інтерферонів, ... продукованих ними в одиницю часу цитокінівдетермінує інтенсивність проліферації та...
Дослідження причин розвитку фіброзу кісткового мозку при мієлопроліферативних захворюваннях шляхом аналізу впливу тромбоцитарних факторів на мезенхімні стовбурові клітини
Домашня робота >> Медицина, здоров'я
Різної концентрації; - кількісне визначеннябілка в експериментальних системах, ... призводять до пролонгованої дії цитокіну, що посилює процес фіброзування... тромбоцитів. Також підвищений зміст цитокінубуло виявлено у сечі...
Патогенез туберкульозу у людини
Реферат Медицина, здоров'я
Але можливе й аліментарне. Певнуроль при аерогенному зараженні грає... грає, що секретується макрофагами та моноцитами цитокін– фактор некрозу пухлин (TNF). ... іонів, кожна клітина має певноюсистемою, що забезпечує транспорт речовин...

). У зв'язку з тим, що активували або модулювали проліферативні властивості клітин цього класу, вони були названі імуноцитокінами. Після того, як стало відомо, що ці сполуки взаємодіють не тільки з клітинами імунної системи, їх назва скоротилася до цитокінів, що включають також колонієстимулюючий фактор (CSF) і багато інших (див.Вазоактивні агенти і запалення).

Цитокіни (cytokines) [грец. kytos- посудина, тут - клітина та kineo- рухаю, спонукаю] - велика та різноманітна група невеликих за розмірами (молекулярна маса від 8 до 80 кДа) медіаторів білкової природи - молекул-посередників («білків зв'язку»), які беруть участь у міжклітинній передачі сигналів переважно в імунній системі. До цитокінів відносять фактор некрозу пухлини, інтерферони, ряд інтерлейкінів та ін. Цитокіни, які синтезуються лімфоцитами та є регуляторами проліферації та диференціювання, зокрема гематопоетичних клітин та клітин імунної системи, називають лімфокінами. Термін «Цитокіни» запропонований С. Коеном із співавт. 1974 р.

Усі клітини імунної системи мають певні функції та працюють у чітко узгодженій взаємодії, яка забезпечується спеціальними біологічно активними речовинами – цитокінами – регуляторами імунних реакцій. Цитокіни – це специфічні білки, за допомогою яких різноманітні клітини імунної системи можуть обмінюватися одна з одною інформацією та здійснювати координацію дій. Набір та кількості цитокінів, що діють на рецептори клітинної поверхні, - "цитокінове середовище" - являють собою матрицю взаємодіючих і мінливих сигналів. Ці сигнали мають складний характер через велику різноманітність цитокінових рецепторів і через те, що кожен з цитокінів може активувати або пригнічувати кілька процесів, включаючи свій власний синтез та синтез інших цитокінів, а також утворення та появу на поверхні клітин цитокінових рецепторів. Для різних тканин характерне своє здорове "цитокінове середовище". Виявлено понад сотню різноманітних цитокінів.

Цитокіни є важливим елементом при взаємодії різних лімфоцитів між собою та з фагоцитами (рис. 4). Саме за допомогою цитокінів Т-хелпери допомагають координувати роботу різноманітних клітин, що задіяні в імунній реакції.

З моменту відкриття у 1970-х роках інтерлейкінів дотепер виявлено понад сто біологічно активних речовин. Різні цитокіни регулюють проліферацію та диференціювання імунокомпетентних клітин. І якщо вплив цитокінів на зазначені процеси вивчено досить добре, то дані щодо дії цитокінів на апоптоз з'явилися порівняно недавно. Їх слід враховувати і за клінічного використання цитокінів.

Міжклітинна сигналізація в імунній системі здійснюється шляхом безпосередньої контактної взаємодії клітин або за допомогою медіаторів міжклітинних взаємодій. При вивченні диференціювання імунокомпетентних і гемопоетичних клітин, а також механізмів міжклітинної взаємодії, що формують імунну відповідь, була відкрита велика і різноманітна група розчинних медіаторів білкової природи - молекул-посередників ("білків зв'язку"), що беруть участь у міжклітинній передачі сигналів - цитоки. Гормони зазвичай виключають із цієї категорії на підставі ендокринного (а не паракринного або аутокринного) характеру їхньої дії. (Див. Цитокіни: механізми проведення гормонального сигналу). Разом з гормонами та нейромедіаторами вони складають основу мови хімічної сигналізації, шляхом якої в багатоклітинному організмі регулюється морфогенез та регенерація тканин. У позитивній та негативній регуляції імунної відповіді їм належить центральна роль. На даний час у людини виявлено та вивчено тією чи іншою мірою, як уже згадувалося вище, більше ста цитокінів, і постійно з'являються повідомлення про відкриття нових. Для деяких отримано генно-інженерні аналоги. Цитокіни діють через активацію рецепторів цитокінів.

Досить часто підрозділ цитокінів на ряд сімейств проводять не за їх функціями, а за характером тривимірної структури, що відображає внутрішньогрупову подібність за конформацією та амінокислотною послідовністю специфічних клітинних цитокінових рецепторів (див. "Рецептори до цитокінів"). Частина їх продукується Т-клетками (див. " Цитокіни, продуковані T-клетками " ). Основна біологічна активність цитокінів - регуляція імунної відповіді всіх етапах її розвитку, у якій грають центральну роль. Загалом вся ця велика група ендогенних регуляторів забезпечує найрізноманітніші процеси, такі як:

Індукція цитотоксичності у макрофагів

Багато важкі захворювання призводять до значного підвищення рівня ІЛ-1 та ФНП альфа. Ці цитокіни сприяють активації фагоцитів, їх міграції у місце запалення, а також вивільненню медіаторів запалення – похідних ліпідів, тобто простагландину Е2, тромбоксанів та фактору активації тромбоцитів. Крім того, вони прямо або опосередковано викликають розширення артеріол, синтез адгезивних глікопротеїдів, активують Т-і В-лімфоцити. ІЛ-1 запускає синтез ІЛ-8, що сприяє хемотаксису моноцитів і нейтрофілів та виходу ферментів з нейтрофілів. У печінці знижується синтез альбуміну та посилюється синтез білків гострої фази запалення, включаючи інгібітори протеаз, компоненти комплементу, фібриноген, церулоплазмін, феритин та гаптоглобін. Рівень С-реактивного білка, який пов'язується з пошкодженими та загиблими клітинами, а також деякими мікроорганізмами, може підвищуватись у 1000 разів. Можливе також значне підвищення концентрації амілоїду A у сироватці та його відкладення у різних органах, що призводить до вторинного амілоїдозу. Найважливішим медіатором гострої фази запалення є ІЛ-6, хоча ІЛ-1 та ФНП альфа теж можуть викликати описані зміни функції печінки. ІЛ-1 та ФНП альфа посилюють вплив один одного на місцеві та загальні прояви запалення, тому поєднання цих двох цитокінів навіть у невеликих дозах здатне викликати поліорганну недостатність та стійку артеріальну гіпотонію. Пригнічення активності будь-якого з них усуває цю взаємодію та помітно покращує стан хворого. ІЛ-1 сильніше активує Т-і В-лімфоцити при 39С, ніж при 37С. ІЛ-1 і ФНВ альфа викликають зниження безжирової маси тіла і втрату апетиту, що призводять до кахексії при тривалій лихоманці. Ці цитокіни потрапляють у кровообіг лише на короткий час, але його виявляється достатньо, щоб запустити продукцію ІЛ-6. ІЛ-6 постійно присутній у крові, тому його концентрація більшою мірою відповідає виразності лихоманки та інших проявів інфекції. Проте ІЛ-6 на відміну від ІЛ-1 та ФНП альфа не вважають летальним цитокіном.

Резюме Цитокіни - це невеликі білки, що діють аутокринно (тобто на клітину, що їх продукує) або паракринно (на клітини поблизу). Утворення та вивільнення цих високоактивних молекул відбувається короткочасно та жорстко регулюється. Цитокіни, які синтезуються лімфоцитами та є регуляторами проліферації та диференціювання, зокрема, гематопоетичних клітин та клітин імунної системи, називають також лімфокінами та

У цьому розділі буде розглянуто комплексний підхід щодо оцінки системи цитокінів з використанням описаних раніше сучасних методів дослідження.

Спочатку ми викладемо основні уявлення про систему цитокінів.

Цитокіни в даний час розглядають як білковопептидні молекули, що продукуються різними клітинами організму і здійснюють міжклітинні та міжсистемні взаємодії. Цитокіни – універсальні регулятори життєвого циклу клітин, вони контролюють процеси диференціювання, проліферації, функціональної активації та апоптозу останніх.

Цитокіни, які продукуються клітинами імунної системи, називають імуноцитокінами; вони є класом розчинних пептидних медіаторів імунної системи, необхідних для її розвитку, функціонування та взаємодії з іншими системами організму (Ковальчук Л.В. та співавт., 1999).

Будучи регуляторними молекулами, цитокіни відіграють важливу роль у здійсненні реакцій вродженого та адаптивного імунітету, забезпечують їх взаємозв'язок, контролюють гемопоез, запалення, загоєння ран, утворення нових кровоносних судин (ангіогенез) та багато інших життєво важливих процесів.

В даний час існує кілька різних класифікацій цитокінів, що враховують їхню будову, функціональну активність, походження, тип цитокінових рецепторів. Традиційно, відповідно до біологічних ефектів, прийнято виділяти такі групи цитокінів.

1. Інтерлейкіни(ІЛ-1-ІЛ-33) - секреторні регуляторні білки імунної системи, що забезпечують медіаторні взаємодії в імунній системі та зв'язок її з іншими системами організму. Інтерлейкіни поділяють за функціональною активністю на про- та протизапальні цитокіни, ростові фактори лімфоцитів, регуляторні цитокіни та ін.

3. Фактори некрозу пухлини (ФНП)- цитокіни з цитотоксичною та регуляторною діями: ФНПа та лімфотоксини (ЛТ).

4. Фактори зростання гемопоетичних клітин- фактор росту стовбурових клітин (Kit - ligand), ІЛ-3, ІЛ-7, ІЛ-11, еритропоетин, тробопоетин, гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор - ГМ-КСФ, гранулоцитарний КСФ - Г-КСФ, макрофагаль-

ний КСФ - М-КСФ).

5. Хемокіни- С, СС, СГС (ІЛ-8), СХ3С – регулятори хемотаксису різних типів клітин.

6. Фактори росту нелімфоїдних клітин- регулятори росту, диференціювання та функціональної активності клітин різної тканинної приналежності (фактор росту фібробластів – ФРФ, фактор росту ендотеліальних клітин, епідермальний фактор росту – ЕФР епідермісу) та трансформуючі фактори росту (ТФРβ, ТФРα).

Серед інших в останні роки активно вивчається фактор, що інгібує міграцію макрофагів (міграцію інгібує фактор - МІФ), який розглядається як нейрогормон з цитокінової та ферментної активністю (Суслов А.П., 2003; Ковальчук Л.В. та співавт.,

Цитокіни різняться за будовою, біологічною активністю та іншими властивостями. Однак поряд з відмінностями цитокіни мають загальними властивостями,характерними для цього класу біорегуляторних молекул.

1. Цитокіни – це, як правило, глікозильовані поліпептиди середньої молекулярної маси (менше 30 кD).

2. Цитокіни виробляються клітинами імунної системи та іншими клітинами (наприклад, ендотелієм, фібробластами та ін.) у відповідь на активуючий стимул (патогенасоційовані молекулярні структури, антигени, цитокіни та ін.) та беруть участь у реакціях вродженого та адаптивного імунітету, регулюючи їх тривалість. Деякі цитокіни синтезуються конститутивно.

3. Секреція цитокінів – короткий за часом процес. Цитокіни не зберігаються як преформовані молекули, а їх

синтез починається завжди з транскрипції генів. Клітини виробляють цитокіни у низькій концентрації (пікограми на мілілітр).

4. У більшості випадків цитокіни продукуються та діють на клітини-мішені, що знаходяться в безпосередній близькості (короткодистантна дія). Основне місце дії цитокінів – міжклітинний синапс.

5. НадмірністьСистема цитокінів проявляється в тому, що кожен тип клітин здатний продукувати кілька цитокінів, а кожен цитокін може секретуватися різними клітинами.

6. Для всіх цитокінів характерна плейотропність,чи поліфункціональність дії. Так, прояв ознак запалення обумовлено впливом ІЛ-1, ФНПα, ІЛ-6, ІЛ-8. Дублювання функцій забезпечує надійність роботи системи цитокінів.

7. Дія цитокінів на клітини-мішені опосередковується високоспецифічними високоафінними мембранними рецепторами, що є трансмембранними глікопротеїнами, які складаються, як правило, більш ніж з однієї субодиниці. Позаклітинна частина рецепторів відповідальна за зв'язування цитокіну. Існують рецептори, що усувають надлишок цитокінів у патологічному осередку. Це так звані рецептори-пастки. Розчинні рецептори є позаклітинним доменом мембранного рецептора, відокремлений за допомогою ферменту. Розчинні рецептори здатні нейтралізувати цитокіни, брати участь у транспорті їх у вогнище запалення та у виведенні з організму.

8. Цитокіни працюють за принципом мережі.Вони можуть діяти узгоджено. Багато функцій, що приписуються спочатку одному цитокіну, як виявилося, обумовлені узгодженою дією декількох цитокінів (синергізмдії). Прикладами синергічної взаємодії цитокінів є стимуляція запальних реакцій (ІЛ-1, ІЛ-6 та ФНП), а також синтезу IgE

(ІЛ-4, ІЛ-5 та ІЛ-13).

Одні цитокіни індукують синтез інших цитокінів (Каскад).Каскадність дії цитокінів необхідна у розвиток запальних та імунних реакцій. Здатність одних цитокінів посилювати чи послаблювати продукцію інших зумовлює важливі позитивні та негативні регуляторні механізми.

Відомо антагоністичну дію цитокінів, наприклад продукція ІЛ-6 у відповідь на збільшення концентрації ФНП може бути

негативним регуляторним механізмом контролю виробітку цього медіатора при запаленні.

Цитокінова регуляція функцій клітин-мішеней здійснюється за допомогою аутокринного, паракринного чи ендокринного механізмів. Деякі цитокіни (ІЛ-1, ІЛ-6, ФНПα та ін) здатні брати участь у реалізації всіх перерахованих механізмів.

Відповідь клітини на вплив цитокіну залежить від кількох факторів:

Від типу клітин та їх вихідної функціональної активності;

від локальної концентрації цитокіну;

Від наявності інших медіаторних молекул.

Таким чином, клітини-продуценти, цитокіни та специфічні для них рецептори на клітинах мішені формують єдину медіаторну мережу. Саме набір регуляторних пептидів, а не індивідуальні цитокіни, визначають остаточну відповідь клітини. Нині система цитокінів сприймається як універсальна система регуляції лише на рівні цілісного організму, що забезпечує розвиток захисних реакцій (наприклад, при інфекції).

В останні роки склалося уявлення про систему цитокінів, яка об'єднує:

1) клітини-продуценти;

2) розчинні цитокіни та їх антагоністи;

3) клітини-мішені та їх рецептори (рис. 7.1).

Порушення різних компонентів системи цитокінів призводять до розвитку численних патологічних процесів, тому виявлення дефектів у цій регуляторній системі має важливе значення для правильної постановки діагнозу і призначення адекватної терапії.

Спочатку розглянемо основні компоненти системи цитокінів.

Клітини-продуценти цитокінів

I. Основну групу клітин-продуцентів цитокінів в адаптивній імунній відповіді становлять лімфоцити. Клітини, що покоїться, не секретують цитокіни. При розпізнаванні антигену та за участю рецепторних взаємодій (CD28-CD80/86 для Т-лімфоцитів і СD40-CD40L для В-лімфоцитів) відбувається активація клітин, що призводить до транскрипції генів цитокінів, трансляції та секреції глікозильованих пептидів.

Мал. 7.1.Система цитокінів

CD4 Т-хелпери представлені субпопуляціями: Тh0, Тh1, Тh2, Тh17, Tfh, які різняться між собою спектром цитокінів, що секретуються у відповідь на різні антигени.

Тh0 виробляють широкий спектр цитокінів у дуже низьких концентраціях.

Напрямок диференціювання Th0визначає розвиток двох форм імунної відповіді з переважанням гуморальних чи клітинних механізмів.

Природа антигену, його концентрація, локалізація у клітині, тип антигенпрезентуючих клітин та певний набір цитокінів регулюють напрямок диференціювання Тh0.

Дендритні клітини після захоплення та процесингу антигену представляють антигенні пептиди Th0 клітинам і виробляють цитокіни, що регулюють напрямок їх диференціювання в ефекторні клітини. Роль індивідуальних цитокінів у цьому відбито на рис. 7.2. ІЛ-12 індукує синтез ІФНγ Т-лімфоцитами та ]ЧГК. ІФН забезпечує диференціювання ТИ1, які починають секретувати цитокіни (ІЛ-2, ІФНу, ІЛ-3, ФНПа, лімфотоксин), що регулюють розвиток реакцій на внутрішньоклітинні патогени

(Гіперчутливість уповільненого типу (ГЗТ) та різні типи клітинної цитотоксичності).

ІЛ-4 забезпечує диференціювання Тh0 Тh2. Активовані Тh2 виробляють цитокіни (ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-13 та ін), що визначають проліферацію В-лімфоцитів, їх подальшу диференціювання в плазматичні клітини, та розвиток реакцій антителогенезу, переважно на позаклітинні патогени.

ІФН негативно регулює функцію Тh2-клітин і, навпаки, ІЛ-4, ІЛ-10, секретовані Тh2, пригнічують функцію Тh1 (рис. 7.3). Молекулярний механізм цієї регуляції пов'язаний із транскрипційними факторами. Експресія Т-bet та STAT4, детермінована ІФНу, спрямовує диференціювання Т-клітин шляхом Тh1 і супресує розвиток Тh2. ІЛ-4 індукує експресію GATA-3 та STAT6, що відповідно забезпечує перетворення наївних ТИ0 у Тh2-клітини (рис. 7.2).

В останні роки описана особлива субпопуляція Т-клітин хелперів (Тh17), які продукують ІЛ-17. Члени сімейства ІЛ-17 можуть експресуватися активованими клітинами пам'яті (CD4CD45RO), у5Т-клітинами, клітинами NKT, нейтрофілами, моноцитами під впливом ІЛ-23, ІЛ-6, ТФРβ, що виробляються макрофагами і дендритними клітинами. Основним диференціювальним фактором у людини є ROR-C, у мишей – ROR-γ lПоказано кардинальну роль ІЛ-17 у розвитку хронічного запалення та аутоімунної патології (див. рис. 7.2).

Крім того, Т-лімфоцити в тимусі можуть диференціюватися в природні клітини-регулятори (Treg), що експресують поверхневі маркери CD4+CD25+ та транскрипційний фактор FOXP3. Ці клітини здатні пригнічувати імунну відповідь, опосередковану Тh1 і Тh2-клітинами, шляхом прямого міжклітинного контакту та синтезу ТФРβ та ІЛ-10.

Схеми диференціювання клонів Тh0 і цитокінів, що ними секретуються, представлені на рис. 7.2 і 7.3 (див. також цв. вклеювання).

Т-цитотоксичні клітини (CD8+), природні кілери - слабкі продуценти цитокінів, таких, як інтерферони, ФНВа та лімфотоксини.

Надмірна активація однієї із субпопуляцій Тh може визначити розвиток одного з варіантів імунної відповіді. Хронічна незбалансованість активації Тh здатна призвести до формування імунопатологічних станів, пов'язаних з вияв-

ми алергії, аутоімунної патології, хронічних запальних процесів та ін.

Мал. 7.2.Різні субпопуляції Т-лімфоцитів, що продукують цитокіни

ІІ. У системі вродженого імунітету основними продуцентами цитокінів є клітини ряду мієлоїдів. За допомогою Toll-подібних рецепторів (TLRs) вони розпізнають подібні молекулярні структури різних патогенів, так звані патогенассоційовані молекулярні паттерни (РАМП), наприклад, ліпополісахарид (ЛПС) повторами, та ін. У результаті

такої взаємодії з TLR запускається внутрішньоклітинний каскад передачі сигналу, що призводить до експресії генів двох основних груп цитокінів: прозапальних та ІФН типу 1 (рис. 7.4, див також кол. вклейку). Головним чином ці цитокіни (ІЛ-1, -6, -8, -12, ФНВа, ГМ-КСФ, ІФН, хемокіни та ін) індукують розвиток запалення та беруть участь у захисті організму від бактеріальних та вірусних інфекцій.

Мал. 7.3.Спектр цитокінів, секретованих ТИ1- та ТИ2-клітинами

ІІІ. Клітини, що не належать до імунної системи (клітини сполучної тканини, епітелію, ендотелію), конститутивно секретують аутокринні фактори росту (ФРФ, ЄФР, ТФРр та ін.). та цитокіни, що підтримують проліферацію гемопоетичних клітин

Цитокіни та їх антагоністидокладно описані в ряді монографій (Ковальчук Л.В. та співавт., 2000; Кетлінський С.А., Симбірцев А.С.,

Мал. 7.4. TLR-опосередкована індукція вироблення цитокінів клітинами вродженого імунітету

Надмірна експресія цитокінів небезпечна для організму і може призвести до надмірної запальної реакції, острофазової відповіді. У регуляції вироблення прозапальних цитокінів беруть участь різні інгібітори. Так, описано ряд речовин, які неспецифічно пов'язують цитокін ІЛ-1 та перешкоджають прояву його біологічної дії (а2-макроглобулін, С3-компонент комплементу, уромодулін). Специфічними інгібіторами ІЛ-1 можуть бути розчинні рецептори-пастки, антитіла та рецепторний антагоніст ІЛ-1 (ІЛ-1RA). При розвитку запалення відбувається посилення експресії гена ІЛ-1RA. Але і в нормі цей антагоніст присутній у крові у високій концентрації (до 1 нг/мл і більше), блокуючи дію ендогенного ІЛ-1.

Клітини-мішені

Дія цитокінів на клітини-мішені опосередковуються через специфічні рецептори, що зв'язують цитокіни з дуже високою афінністю, причому окремі цітокіни можуть використовувати

загальні субодиниці рецепторів. Кожен цитокін зв'язується із своїм специфічним рецептором.

Рецептори цитокінів є трансмембранними білками і діляться на 5 основних типів. Найбільш поширений так званий гемопоетиновий тип рецепторів, що мають два екстраклітинні домени, один з яких містить загальну послідовність амінокислотних залишків двох повторів триптофану та серину, розділених будь-якою амінокислотою (WSXWS-мотив). Другий тип рецепторів може мати два позаклітинних домени з великою кількістю консервативних цистеїнів. Це рецептори сімейства ІЛ-10 та ІФН. Третій тип представлений рецепторами цитокінів, що належать до групи ФНП. Четвертий тип рецепторів цитокінів належить до суперродини імуноглобулінових рецепторів, що мають позаклітинні домени, що нагадують за будовою домени молекул імуноглобулінів. П'ятий тип рецепторів, що зв'язують молекули сімейства хемокінів, представлений трансмембранними білками, що перетинають клітинну мембрану у 7 місцях. Рецептори цитокінів можуть існувати у розчинній формі, зберігаючи здатність пов'язувати ліганди (Кетлінський С.А. та ін., 2008).

Цитокіни здатні впливати на проліферацію, диференціювання, функціональну активність та апоптоз клітин-мішеней (див. рис. 7.1). Прояв біологічної активності цитокінів у клітинах-мішенях залежить від участі різних внутрішньоклітинних систем у передачі сигналу від рецептора, що пов'язано з особливостями клітин-мішеней. Сигнал до апоптозу проводиться зокрема за допомогою специфічної ділянки сімейства рецепторів ФНП, так званого домену «смерті» (рис. 7.5, див. цв. вклеювання). Диференціювальний та активуючий сигнали передаються за допомогою внутрішньоклітинних білків Jak-STAT - сигнальних трансдукторів та активаторів транскрипції (рис. 7.6, див. цв. вклеювання). G-білки беруть участь у передачі сигналу від хемокінів, що призводить до посилення міграції та адгезії клітин.

До комплексного аналізу системи цитокінів входить таке.

I. Оцінка клітин-продуцентів.

1. Визначення експресії:

Рецепторів, що розпізнають патоген або антиген (ТКР, TLR) на рівні генів та молекули білка (ПЛР, метод проточної цитофлуориметрії);

Адаптерних молекул, що проводять сигнал, що запускає транскрипцію цитокінових генів (ПЛР та ін);

Мал. 7.5.Передача сигналу з ФНП-рецептора

Мал. 7.6. Jak-STAT - сигнальний шлях з цитокінових рецепторів типу 1

Генів цитокінів (ПЛР); білкових молекул цитокінів (оцінка цитокінсинтезуючої функції мононуклеарних клітин людини).

2. Кількісне визначення субпопуляцій клітин, що містять ті чи інші цитокіни: Th1, Th2 Th17 (метод внутрішньоклітинного фарбування цитокінів); визначення кількості клітин, що секретують певні цитокіни (метод ELISPOT, див. гл. 4).

ІІ. Оцінка цитокінів та їх антагоністів у біологічних середовищах організму.

1. Тестування біологічної активності цитокінів.

2. Кількісне визначення цитокінів за допомогою ІФА.

3. Імуногістохімічне фарбування цитокінів у тканинах.

4. Визначення співвідношення оппозитних цитокінів (про- та протизапальних), цитокінів та антагоністів рецепторів цитокінів.

ІІІ. Оцінка клітин-мішеней.

1. Визначення експресії рецепторів цитокінів на рівні генів та білкової молекули (ПЛР, метод проточної цитофлуориметрії).

2. Визначення сигнальних молекул у внутрішньоклітинному вмісті.

3. Визначення функціональної активності клітин-мішеней.

На даний час розроблено численні методи оцінки системи цитокінів, що дають різнопланову інформацію. Серед них розрізняють:

1) молекулярно-біологічні методи;

2) методи кількісного визначення цитокінів за допомогою імуноаналізу;

3) тестування біологічної активності цитокінів;

4) внутрішньоклітинне фарбування цитокінів;

5) метод ELISPOT, що дозволяє виявити цитокіни навколо одиничної цитокінпродукуючої клітини;

6) імунофлюоресценцію.

Наводимо коротку характеристику цих методів.

За допомогою молекулярно-біологічних методівможна досліджувати експресію генів цитокінів, їх рецепторів, сигнальних молекул, вивчати поліморфізм зазначених генів. В останні роки виконано велику кількість робіт, що виявили асоціації між варіантами алелей генів молекул системи цитокінів та схильністю

до низки захворювань. Вивчення алельних варіантів генів цитокінів може дати інформацію про генетично запрограмовану продукцію того чи іншого цитокіну. Найбільш чутливою вважається полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі – ПЛР-РВ (див. гл. 6). Метод гібридизації in situдозволяє уточнити тканинну та клітинну локалізацію експресії цитокінових генів.

Кількісне визначення цитокінів у біологічних рідинах та культурах мононуклеарних клітин периферичної крові методом ІФА можна охарактеризувати наступним чином. Оскільки цитокіни є локальними медіаторами, більш доцільно вимірювати їх рівні у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів або в природних рідинах, наприклад, у сльозах, змивах з порожнин, сечі, амніотичної рідини, спинномозкової рідини і т.д. Рівні цитокінів у сироватці чи інших біологічних рідинах відбивають поточний стан імунної системи, тобто. синтез цитокінів клітинами організму in vivo.

Визначення рівнів продукції цитокінів мононуклеарами периферичної крові показує функціональний стан клітин. Спонтанна продукція цитокінів МНК у культурі свідчить, що клітини вже активовані in vivo.Індукований (різними стимуляторами, мітогенами) синтез цитокінів відбиває потенційну, резервну здатність клітин відповідати антигенний стимул (зокрема, на дію лікарських препаратів). Знижена індукована продукція цитокінів може бути однією з ознак імунодефіцитного стану. Цитокіни не специфічні щодо конкретного антигену. Тому специфічна діагностика інфекційних, аутоімунних та алергічних захворювань за допомогою визначення рівня тих чи інших цитокінів неможлива. У той же час оцінка рівнів цитокінів дозволяє отримати дані про тяжкість запального процесу, його перехід на системний рівень і прогноз, функціональну активність клітин імунної системи, про співвідношення Th1- і Th2-клітин, що дуже важливо при диференціальній діагностиці ряду інфекційних та імунопатологічних процесів.

У біологічних середовищах можна визначити цитокіни кількісно за допомогою цілого ряду методів імуноаналізу,використовуючи поліклональні та моноклональні антитіла (див. гл. 4). ІФА дозволяє дізнатися, які точні концентрації цитокінів у біо-

логічні рідини організму. Імуноферментне виявлення цитокінів має низку переваг перед іншими методами (висока чутливість, специфічність, незалежність від присутності антагоністів, можливість точного автоматизованого обліку, стандартизації обліку). Однак і цей метод має свої обмеження: ІФА не характеризує біологічну активність цитокінів, може давати хибні результати за рахунок перехресно реагуючих епітопів.

Біологічне тестуванняпроводять на основі знання основних властивостей цитокінів, їх дії на клітини-мішені. Вивчення біологічних ефектів цитокінів дозволило розробити чотири різновиди тестування цитокінів:

1) щодо індукції проліферації клітин-мішеней;

2) за цитотоксичним ефектом;

3) щодо індукції диференціювання кістково-мозкових попередників;

4) з противірусної дії.

ІЛ-1 визначають за стимулюючим впливом на проліферацію мишачих тимоцитів, активованих мітогеном in vitro;ІЛ-2 – за здатністю стимулювати проліферативну активність лімфобластів; за цитотоксичною дією на мишачі фібробласти (L929) тестують ФНОа та лімфотоксини. Колонієстимулюючі фактори оцінюють за їх здатністю підтримувати зростання кістково-мозкових попередників у вигляді колоній в агарі. Противірусну активність ІФН виявляють за пригнічення цитопатичної дії вірусів у культурі диплоїдних фібробластів людини та пухлинної лінії фібробластів мишей L-929.

Створено клітинні лінії, зростання яких залежить від наявності певних цитокінів. У табл. 7.1 наведено список клітинних ліній, що використовуються для тестування цитокінів. За здатністю індукувати проліферацію чутливих клітин-мішеней проводять біотестування ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-15 та ін. Однак ці методи тестування відрізняються недостатньою чутливістю та інформативністю. Молекули інгібіторів та антагоністів можуть маскувати біологічну активність цитокінів. Деякі цитокіни виявляють загальну біологічну активність. Тим не менш, ці методи ідеальні для тестування специфічної активності рекомбінантних цитокінів.

Таблиця 7.1.Клітинні лінії, що використовуються для тестування біологічної активності цитокінів

Закінчення табл. 7.1

Лабораторна робота 7-1

Визначення біологічної активності ІЛ-1 за комітогенною дією на проліферацію тимоцитів мишей

В основі методу біологічного тестування ІЛ-1 лежить здатність цитокіну стимулювати проліферацію мишачих тимоцитів.

ІЛ-1 може бути визначений у культурі моноцитів, стимульованих ЛПС, а також у будь-якій біологічній рідині організму.Необхідно звернути увагу на низку деталей.

1. Для тестування застосовують тимоцити мишей лінії С3Н/HeJ, стимульовані до проліферації мітогенами (конканавалін А – КонА та фітогемагглютинін – ФГА). Тимоцити С3Н/HeJ обрані не випадково: миші цієї інбредної лінії не відповідають на ЛПС, який може перебувати у складі матеріалу, що тестується, і викликати продукцію ІЛ-1.

2. Тимоцити відповідають на ІЛ-2 та мітогени, тому в препаратах, що тестуються на ІЛ-1, слід визначати також присутність ІЛ-2 та мітогенів.

Порядок роботи

1. Отримують суспензію тимоцитів у концентрації 12×10 6 /мл середовища RРМI 1640, що містить 10% сироватки ембріонів корів та 2-меркаптоетанол (5×10 -5 М).

2. Готують ряд послідовних дворазових розведень дослідних (біологічні рідини організму) та контрольних зразків. Як контрольні використовують біологічні рідини, що містять ІЛ-1 або зразки, отримані при інкубації мононуклеарних клітин без ЛПС, і стандартний лабораторний ІЛ-1-місткий препарат. У 96-лункові круглодонні планшети з кожного розведення переносять по 50 мкл у 6 лунок.

3. У три лунки кожного розведення додають по 50 мкл розчиненого у повному середовищі очищеного ФГА (Wellcome) у концентрації 3 мкг/мл, а в інші 3 лунки - по 50 мкл середовища.

4. Кожну лунку додають по 50 мкл суспензії тимоцитів і інкубують протягом 48 годин при 37 °С.

6. Перед завершенням культивування в лунки вносять по 50 мкл розчину (1 мкКі/мл) [3 Н]-тимидина і інкубують ще 20 год.

7. Для визначення рівня радіоактивності клітини культури переносять на фільтрувальний папір за допомогою автоматичного збирача клітин, фільтри висушують та визначають включення мітки рідинним сцинтиляційним лічильником.

8. Результати виражають як коефіцієнт стимуляції.

де m cp – середня кількість імпульсів у 3 лунках.

Якщо тимоцити відповідають на стимуляцію стандартним ІЛ-1, індекс стимуляції досліджуваного зразка, що перевищує 3, достовірно свідчить про ІЛ-1-активності.

Біоаналіз є єдиним методом для оцінки функціонування цитокіну, але цей метод має бути доповнений різними видами відповідного контролю на специфічність з використанням моноклональних антитіл. Додавання певних моноклональних антитіл до цитокіну в культуру блокує біологічну активність цитокіну, що доводить: сигналом до проліферації клітинної лінії служить цитокін.

Використання біоаналізу виявлення інтерферону.Принцип оцінки біологічної активності ІФН ґрунтується на його противірусній дії, яка визначається за ступенем інгібіції розмноження тест-вірусу в культурі клітин.

У роботі можуть бути використані клітини, чутливі до дії ІФН: первинно трипсинізовані клітини-фібробласти ембріонів курей і людини, клітини диплоїдних фібробластів людини, що перевиваються, і культура мишачих клітин (L929).

Оцінюючи противірусного дії ІФН доцільно використовувати віруси з коротким циклом розмноження, високої чутливістю до дії ІФН: вірус енцефаломієліту мишей, везикулярного стоматиту миші та інших.

Лабораторна робота 7-2

Визначення активності інтерферону

1. Суспензія диплоїдних фібробластів плода людини на середовищі з 10% сироваткою ембріонів корів (концентрація клітин - 15-20×10 6 /мл) розливають у стерильні 96-лункові плоскодонні планшети по 100 мкл в лунку і поміщають в лунку 37 °С.

2. Після формування повного моношару з лунок видаляють ростове середовище і кожну лунку додають по 100 мкл підтримуючого середовища.

3. Титрування активності ІФН у досліджуваних зразках проводять методом дворазових розведень на моношарі фібробластів.

Одночасно із зразками в лунки вносять вірус енцефаломієліту мишей (ВЕМ) у дозі, що викликає 100% ураження клітин через 48 годин після зараження.

4. Для контролю використовують лунки з інтактними (необробленими) клітинами, зараженими вірусом.

У кожному дослідженні референс-препаратів використовують проби референс-ІФН з відомою активністю.

5. Планшети з розведеннями зразка інкубують 24 години при температурі 37 °С в атмосфері з 5% вмістом СО 2 .

6. Рівень активності ІФН визначають величиною, зворотною значенню максимального розведення зразка, що тестується, що затримує цитопатичну дію вірусу на 50%, і виражають її в одиницях активності на 1 мл.

7. Для визначення типу ІФН до системи додають антисироватку проти ІФНα, ІФНβ або ІФНγ. Антисироватка скасовує дію відповідного цитокіну, що дозволяє ідентифікувати тип ІФН.

Визначення біологічної активності міграції інгібуючого фактора.В даний час сформувалися зовсім нові уявлення про природу і властивості МІФ, відкритого в 60-х роках минулого століття як медіатор клітинного імунітету і багато років, що залишався без належної уваги (Bloom B.R., Bennet В., 1966; David J.R., 1966). Лише в останні 10-15 років стало ясно: МІФ є одним з найважливіших біологічних медіаторів в організмі з широким спектром біологічних функцій цитокіну, гормону, ферменту. Дія МІФ на клітини-мішені реалізується через СD74-рецептор або через некласичний шлях ендоцитозу.

МІФ розглядають як важливий медіатор запалення, що активує функцію макрофагів (вироблення цитокінів, фагоцитоз, цитотоксичність та ін), а також як ендогенний імунорегуляторний гормон, що модулює глюкокортикоїдну активність.

Накопичується все більше відомостей про роль МІФ у патогенезі багатьох запальних захворювань, включаючи сепсис, ревматоїдний артрит (РА), гломерулонефрит та ін. Під впливом МІФ зростає вироблення прозапальних цитокінів як макрофагами, і синовіальними клітинами.

Відомі різні методи тестування активності МІФ, коли мігруючі клітини (клітини-мішені для МІФ) поміщають у скляний капіляр (капілярний тест), краплю агарози або в агарозний колодязь.

Ми наводимо порівняно простий скринінговий метод, заснований на формуванні на дні лунок 96-лункового плоскодонного планшета клітинних мікрокультур (лейкоцитів або макрофагів), стандартних за площею і числом клітин, з подальшим їх культивуванням в живильному середовищі та визначенням зміни площі цих мікрокультур при дії Суслов А.П., 1989).

Лабораторна робота 7-3

Визначення МІФ-активності

Визначення біологічної активності МІФ проводять за допомогою пристрою для формування клітинних мікрокультур (Мал. 7.7) - МІГРОСКРІН (НДІ епідеміології та мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї РАМН).

1. У лунки 96-лункового планшета (Flow, Великобританія або аналогічні) додають по 100 мкл розведеної на культуральному середовищі проби, в якій визначають МІФ-активність (кожне розведення в 4 паралелях, досвідчені проби). Культуральне середовище включає RPMI 1640, 2 mM L-глутаміну, 5% сироватки ембріона корови, 40 мкг/мл гентаміцину.

2. До контрольних лунок додають культуральне середовище (у 4 паралелях) по 100 мкл.

3. Готують клітинну суспензію перитонеальних макрофагів, для чого 2 мишам-гібридам (СВАхС57В1/6)F1 внутрішньочеревно вводять по 10 мл розчину Хенкса з гепарином (10 ОД/мл), обережно масажують черевце протягом 2-3. Потім тварину забивають декапітацією, обережно проколюють черевну стінку в області паху і через голку шприцом відсмоктують ексудат. Клітини перитонеального ексудату двічі відмивають розчином Хенкса, центрифугуючи їх 10-15 хв при 200 g. Потім готують суспензію клітин із концентрацією 10±1 млн/мл середовища RPMI 1640. Підрахунок проводять у камері Горяєва.

4. Збирають систему МІГРОСКРІН, що є штативом для спрямованої та стандартної фіксації наконечників з клітинними культурами у строго вертикальному положенні на заданій висоті над центром лунки 96-лункового культурального планшета, а також включає 92 наконечники для автоматичної піпетки фірми «Costar», USA ( 7.7).

Вставляють ніжки штатива в кутові лунки планшета. Клітинну суспензію набирають автоматичною піпеткою в наконечники - по 5 мкл у кожен, обполіскують від надлишку клітин одноразовим опусканням у середу та вставляють вертикально в гнізда штатива системи. Заповнений штатив з наконечниками витримують при кімнатній температурі протягом 1 години на строго горизонтальній поверхні. За цей час відбувається осідання клітин суспензії на дно лунок, де формуються стандартні клітинні мікрокультури.

5. Штатив із наконечниками обережно знімають із планшета. Планшет з мікрокультурою клітин поміщають у строго горизонтальному положенні 2 -інкубатор, де культивують протягом 20 год. В ході культивування клітини мігрують по дну лунки.

6. Кількісний облік результатів після інкубації проводять на бінокулярній лупі, візуально оцінюючи розмір колонії за шкалою всередині окуляра. Мікрокультури мають форму кола. Потім дослідники визначають середнє значення діаметра колоній за результатами вимірювання колоній у 4 дослідних чи контрольних лунках. Похибка виміру дорівнює ±1 мм.

Індекс міграції (ІМ) розраховують за такою формулою:

Проба має МІФ-активність, якщо значення ІМ рівні

За умовну одиницю (ОД) МІФ-активності приймають зворотну величину, рівну значенню найбільшого розведення проби (зразка), у якому індекс міграції дорівнює 0,6±0,2.

Біологічну активність ФЕОα оцінюють за цитотоксичною його дією на лінію трансформованих фібробластів L-929. Як позитивний контроль використовують рекомбінантний ФНОа, а як негативний контроль - клітини в культуральному середовищі.

Обчислюють цитотоксичний індекс (ЦІ):

де a- кількість живих клітин у контролі; b- кількість живих клітин у досвіді.

Мал. 7.7.Схема МІГРОСКРІН - пристрої для кількісної оцінки міграції клітинних культур

Клітини фарбують барвником (метиленовим синім), який включається лише у загиблі клітини.

За умовну одиницю активності ФНП приймають значення зворотного розведення зразка, необхідного для отримання 50% клітинної цитотоксичності. Питома активність зразка - відношення активності в умовних одиницях на 1 мл концентрації білка, що міститься у зразку.

Внутрішньоклітинне фарбування цитокінів.Зміна співвідношення клітин, що продукують різні цитокіни, може відображати патогенез захворювання і служити критерієм прогнозу захворювання та оцінки терапії, що проводиться.

Методом внутрішньоклітинного фарбування визначають експресію цитокіну лише на рівні однієї клітини. Проточна цитофлуориметрія дозволяє підрахувати кількість клітин, що експресують той чи інший цитокін.

Перелічимо основні етапи визначення внутрішньоклітинних цитокінів.

Нестимульовані клітини продукують невеликі кількості цитокінів, які зазвичай не депонуються, тому важливим етапом оцінки внутрішньоклітинних цитокінів є стимуляція лімфоцитів і блокада виходу цих продуктів з клітин.

Як індуктор цитокінів найчастіше використовують активатор протеїнкінази С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) у комбінації з іонофором кальцію іономіцином (ІН). Застосування такого поєднання викликає синтез широкого спектра цитокінів: ІФН, ІЛ-4, ІЛ-2, ФНПα. Недолік використання ФМА-ІН – проблеми виявлення CD4-молекул на поверхні лімфоцитів після такої активації. Також продукцію цитокінів Т-лімфоцитами індукують за допомогою мітогенів (ФДА). В-клітини та моноцити стимулюють

Мононуклеарні клітини інкубують у присутності індукторів продукції цитокінів та блокатора внутрішньоклітинного транспорту брефельдину А або моненсину протягом 2-6 год.

Потім клітини ресуспендують у буферному розчині. Для фіксації додають 2% формальдегід, інкубують 10-15 хв за кімнатної температури.

Потім клітини обробляють сапоніном, який підвищує проникність клітинної мембрани, і фарбують моноклональними антитілами, специфічними до цитокінів, що визначаються. Попереднє фарбування поверхневих маркерів (CD4, CD8) збільшує кількість інформації про клітину і дозволяє більш точно визначити її популяційну приналежність.

Є деякі обмеження щодо застосування описаних вище методів. Так, з їх допомогою неможливо аналізувати синтез цитокінів одиничною клітиною, неможливо визначити кількість цитокінпродукуючих клітин у субпопуляції, неможливо визначити, чи цитокінпродукуючі клітини експресують унікальні маркери, чи синтезуються різні цитокіни різними клітинами або одними і тими ж. Відповідь ці питання отримують, використовуючи інші методи дослідження. Для визначення частоти цитокін-продукуючих клітин у популяції застосовують метод лімітуючих розведень та варіант імуноферментного аналізу ELISPOT (див. гл. 4).

Метод гібридизації in situ.Метод включає:

2) фіксацію параформальдегід;

3) виявлення мРНК за допомогою міченої кДНК. У деяких випадках цитокінову мРНК визначають на зрізах за допомогою радіоізотопної ПЛР.

Імунофлюоресценція.Метод включає:

1) заморожування органу та приготування кріостатних зрізів;

2) фіксацію;

3) обробку зрізів міченими флюоресцеїном антицитокіновими антитілами;

4) вивальне спостереження флюоресценції.

Ці методики (гібридизація in situі імунофлюоресценція) швидкі і не залежать від порогових концентрацій продукту, що секретується. Однак вони не визначають кількість секретованого цитокіну і можуть бути складними технічно. Необхідний різноманітний ретельний контроль на неспецифічні реакції.

За допомогою наведених методів оцінки цитокінів були виявлені патологічні процеси, пов'язані з порушеннями в системі цитокінів на різних рівнях.

Таким чином, оцінка системи цитокінів є надзвичайно важливою для характеристики стану імунної системи організму. Вивчення різних рівнів системи цитокінів дозволяє отримати інформацію про функціональну активність різних типів імунокомпетентних клітин, про тяжкість запального процесу, про його перехід на системний рівень та про прогноз захворювання.

Запитання та завдання

1. Перерахуйте загальні властивості цитокінів.

2. Наведіть класифікацію цитокінів.

3. Перелічіть основні компоненти системи цитокінів.

4. Перерахуйте клітини-продуценти цитокінів.

5. Охарактеризуйте сімейства рецепторів цитокінів.

6. Якими є механізми функціонування мережі цитокінів?

7. Розкажіть про вироблення цитокінів у системі вродженого імунітету.

8. Якими є основні підходи до комплексної оцінки системи цитокінів?

9. Які методи тестування цитокінів у біологічних рідинах організму?

10. Які дефекти у системі цитокінів при різних патологіях?

11. Які основні методи біологічного тестування ІЛ-1, ІФН, МІФ, ФНВа в біологічних рідинах?

12. Опишіть процес визначення внутрішньоклітинного вмісту цитокінів.

13. Опишіть процес визначення цитокінів, що секретуються одиничною клітиною.

14. Опишіть послідовність методів виявлення дефекту, що застосовуються, на рівні рецептора цитокіну.

15. Опишіть послідовність методів, які застосовуються для виявлення дефекту на рівні клітин-продуцентів цитокінів.

16. Яку інформацію можна отримати, досліджуючи вироблення цитокінів у культурі мононуклеарних клітин у сироватці крові?

Вступ

Загальні відомості

Класифікація цитокінів

Рецептори цитокінів

Цитокіни та регуляція імунної відповіді

Висновок

Література

Вступ

Цитокіни – одна з найважливіших елементів імунної системи. Імунній системі необхідна система оповіщення від клітин організму як крик про допомогу. Це, мабуть, найкраще визначення цитокінів. Коли клітина пошкоджена або уражена патогенним організмом, макрофаги та пошкоджені клітини виділяють цитокіни. Сюди входять такі фактори, як інтерлейкін, інтерферон та фактор некрозу пухлини-альфа. Останній також доводить, що руйнування пухлинної тканини контролюється імунною системою. Коли цитокіни виділяються, вони закликають спеціальні імунні клітини, наприклад, лейкоцити і Т-і В-клітини.

Цитокіни також дають сигнал про якусь конкретну мету, яку ці клітини повинні виконати. Цитокіни та антитіла абсолютно різні, оскільки антитіла – це те, що пов'язане з антигенами, вони дозволяють імунній системі ідентифікувати вторгнення чужорідних організмів. Таким чином, можна провести аналогію: цітокіни є головним сигналом тривоги для загарбників, а антитіла – розвідниками. Процес аналізу цитокінів називається визначенням цитокінів.

Загальні відомості

Цитокіни (cytokines) [грец. kytos - судина, тут - клітина і kineo - рухаю, спонукаю] - велика та різноманітна група невеликих за розмірами (молекулярна маса від 8 до 80 кДа) медіаторів білкової природи - молекул-посередників («білків зв'язку»), що беруть участь у міжклітинній передачі сигналів переважно в імунній системі.

До цитокінів відносять фактор некрозу пухлини, інтерферони, ряд інтерлейкінів та ін. Цитокіни, які синтезуються лімфоцитами та є регуляторами проліферації та диференціювання, зокрема гематопоетичних клітин та клітин імунної системи, називають лімфокінами.

Набір та кількості цитокінів, що діють на рецептори клітинної поверхні, - "цитокінове середовище" - являють собою матрицю взаємодіючих і мінливих сигналів. Ці сигнали мають складний характер через велику різноманітність цитокінових рецепторів і через те, що кожен з цитокінів може активувати або пригнічувати кілька процесів, включаючи свій власний синтез та синтез інших цитокінів, а також утворення та появу на поверхні клітин цитокінових рецепторів.

Гормони зазвичай виключають із цієї категорії на підставі ендокринного (а не паракринного або аутокринного) характеру їхньої дії. (Див. Цитокіни: механізми проведення гормонального сигналу). Разом з гормонами та нейромедіаторами вони складають основу мови хімічної сигналізації, шляхом якої в багатоклітинному організмі регулюється морфогенез та регенерація тканин.

У позитивній та негативній регуляції імунної відповіді їм належить центральна роль. На даний час у людини виявлено та вивчено тією чи іншою мірою, як уже згадувалося вище, більше ста цитокінів, і постійно з'являються повідомлення про відкриття нових. Для деяких отримано генно-інженерні аналоги. Цитокіни діють через активацію рецепторів цитокінів.

А. Інтерферони (ІФН):

1. ПриродніІФН (1 покоління):

2. РекомбінатаніІФН (2 покоління):

а) короткої дії:

ІФН a2b: інтрон-А

ІФН β: авонекс та ін.

(Пегільовані ІФН): пегінтерферон

Б. Індуктори інтерферону (інтерфероногени):

1. Синтетичні- Циклоферон, тілорон, дибазол та ін.

2. Природні- Рідостін та ін.

Ст. Інтерлейкіни : рекомбінантний інтерлейкін-2 (ронколейкін, альдеслейкін, пролейкін, ) , рекомбінантний інтерлейкін 1-бета (беталейкін)

р. Колонієстимулюючі фактори (молграмостім та ін.)

Пептидні препарати

Препарати тимічних пептидів .

Пептидні сполуки, що виробляються вилочковою залозою, стимулюють дозрівання Т-лімфоцитів(тимопоетини).

При вихідно знижених показниках препарати типових пептидів підвищують кількість Т-клітин та їх функціональну активність.

Родоначальником тимічних препаратів першого покоління у Росії став Тактівін, що є комплексом пептидів, екстрагованих з тимусу великої рогатої худоби. До препаратів, що містять комплекс тимічних пептидів, належать також Тималін, Тимоптінта інші, а до тих, що містять екстракти тимусу - Тимостимулін та Вілозен.

Препарати пептидів з тимусу великої рогатої худоби. тималін, тимостимулінвводять внутрішньом'язово, а тактивін, тимоптін- під шкіру переважно при недостатності клітинного імунітету:

При Т-імунодефіцитах,

Вірусні інфекції,

Для профілактики інфекцій при променевій терапії та хіміотерапії пухлин.

Клінічна ефективність тимічних препаратів першого покоління не викликає сумніву, але у них є один недолік: вони є нерозділеною сумішшю біологічно активних пептидів, що досить важко піддаються стандартизації.

Прогрес у сфері лікарських засобів тимічного походження йшов лінії створення препаратів II і III поколінь – синтетичних аналогів природних гормонів тимусу чи фрагментів цих гормонів, які мають біологічної активністю.

Сучасний препарат Імунофан –гексапептид, синтетичний аналог активного центру тимопоетину, застосовують при імунодефіцитах, пухлинах. Препарат стимулює утворення ІЛ-2 імунокомпетентними клітинами, підвищує чутливість лімфоїдних клітин до цього лімфокіну, знижує продукцію ФНП (фактору некрозу пухлин), надає регулюючий вплив на вироблення медіаторів імунітету (запалення) та імуноглобулінів.

Препарати пептидів кісткового мозку

Мієлопідодержують із культури клітин кісткового мозку ссавців (телят, свиней). Механізм дії препарату пов'язаний зі стимуляцією проліферації та функціональної активності В- та Т-клітин.

В організмі мішенню цього препарату вважаються В-лімфоцити.При порушенні імуно- або гемопоезу введення мієлопіду веде до посилення загальної мітотичної активності клітин кісткового мозку та напряму їх диференціювання у бік зрілих В-лімфоцитів.

Мієлопід застосовують у комплексній терапії вторинних імунодефіцитних станів з переважним ураженням гуморальної ланки імунітету для профілактики інфекційних ускладнень після хірургічних втручань, травм, перенесеного остеомієліту, при неспецифічних легеневих захворюваннях, хронічних піодерміях. Побічні ефекти препарату - запаморочення, слабкість, нудота, гіперемія та болючість у місці введення.

Всі препарати цієї групи протипоказані вагітним, мієлопід та імунофан протипоказані за наявності резус-конфлікту матері та плода.

Препарати імуноглобулінів

Імуноглобуліни людини

а) Імуноглобуліни для внутрішньом'язового введення

Неспецифічні:імуноглобулін людини нормальний

Специфічні:імуноглобулін проти гепатиту У людини, імуноглобулін людини антистафілококовий, імуноглобулін людини протиправцевий, імуноглобулін людини проти кліщового енцефаліту, імуноглобулін людини проти вірусу сказу та ін.

б)Імуноглобуліни для внутрішньовенного введення

Неспецифічні:імуноглобулін людини нормальний для внутрішньовенного введення (габриглобін, імуновенін, інтраглобін, хумаглобін)

Специфічні:імуноглобулін проти гепатиту В людини (неогепатект), пентаглобін (містить антибактеріальні IgM, IgG, IgA), імуноглобулін проти цитомегаловірусу (цитотект), імуноглобулін людини проти кліщового енцефаліту, антирабічний ІГ та ін.

в)Імуноглобуліни для перорального застосування:імуноглобуліновий комплексний препарат (КІП) для ентерального застосування при гострих кишкових інфекціях; антиротавірусний імуноглобулін для перорального введення

Гетерологічні імуноглобуліни:

імуноглобулін антирабічний із сироватки коня, сироватка протигангренозна полівалентна кінська та ін.

Препарати неспецифічних імуноглобулінів застосовують при первинних та вторинних імунодефіцитах, препарати специфічних імуноглобулінів – при відповідних інфекціях (з лікувальною чи профілактичною метою).

Цитокіни та препарати на їх основі

Регуляція імунної відповіді, що розвинулася, здійснюється цитокінами – складним комплексом ендогенних імунорегуляторних молекул, які є основою для створення великої групи як природних, так і рекомбінантних імуномодулюючих препаратів.

Інтерферони (ІФН):

1. ПриродніІФН (1 покоління):

Альфаферони: людський лейкоцитарний ІФН та ін.

Бетаферони: людський фібробластний ІФН та ін.

2. РекомбінатаніІФН (2 покоління):

а) короткої дії:

ІФН a2а: реаферон, віферон та ін.

ІФН a2b: інтрон-А

ІФН β: авонекс та ін.

б) пролонгованої дії(Пегільовані ІФН): Пегінтерферон (ІФН a2b + Поліетиленгліколь) та ін.

Основна спрямованість дії препаратів ІФН – Т-лімфоцити (природні кілери та цитотоксичні Т-лімфоцити).

Природні інтерферони одержують у культурі клітин лейкоцитів донорської крові (у культурі лімфобластоїдних та інших клітин) під впливом вірусу-індуктора.

Рекомбінантні інтерферони отримують генно-інженерним методом шляхом культивування бактеріальних штамів, що містять у своєму генетичному апараті вбудовану рекомбінантну плазміду гена інтерферону людини.

Інтерферони мають противірусну, протипухлинну та імуномодулюючу дію.

Як противірусні засоби препарати інтерферону найбільш ефективні при лікуванні герпетичних захворювань очей (місцево у вигляді крапель, субкон'юнктивально), простого герпесу з локалізацією на шкірі, слизових оболонках та геніталіях, оперізуючого лишаю (місцево у вигляді мазі на гідрогелевій основі), гострого та вірусного В та С (парентерально, ректально в супозиторіях), при лікуванні та профілактиці грипу та ГРВІ (інтраназально у формі крапель). При ВІЛ-інфекції препарати рекомбінантного інтерферону нормалізують імунологічні параметри, знижують гостроту перебігу захворювання більш ніж у 50% випадків, викликають зменшення рівня віремії та вмісту сироваткових маркерів захворювання. При СНІДі проводять комбіновану терапію з азидотимідіном.

Протипухлинна дія препаратів інтерферону пов'язана з антипроліферативним ефектом та стимуляцією активності природних кілерів. Як протипухлинні засоби застосовуються ІФН-альфа, ІФН-альфа 2а, ІФН-альфа-2b, ІФН-альфа-n1, ІФН-бета.

Як імуномодулятор при розсіяному склерозі застосовується ІФН-бета-lb.

Препарати інтерферонів викликають подібні побічні ефекти. Характерні – грипоподібний синдром; зміни з боку центральної нервової системи: запаморочення, порушення зору, сплутаність свідомості, депресія, безсоння, парестезії, тремор. З боку шлунково-кишкового тракту: втрата апетиту, нудота; з боку серцево-судинної системи можливий прояв симптомів серцевої недостатності; з боку сечовидільної системи – протеїнурія; з боку системи кровотворення - минуща лейкопенія. Також можуть виникнути висипання, свербіж, алопеція, тимчасова імпотенція, носові кровотечі.

Індуктори інтерферону (інтерфероногени):

1. Синтетичні - Циклоферон, тілорон, полудан та ін.

2. Природні - Рідостін та ін.

Індуктори інтерферону – це препарати, що посилюють синтез ендогенного інтерферону. Ці препарати мають низку переваг у порівнянні з рекомбінантними інтерферонами. Вони не мають антигенної активності. Стимульований синтез ендогенного інтерферону не викликає гіперінтерферонемії.

Тилорон(аміксин) відноситься до низькомолекулярних синтетичних сполук, є пероральним індуктором інтерферону. Має широкий спектр противірусної активності щодо ДНК-і РНК-вірусів. Як противірусний та імуномодулюючий засіб застосовується для профілактики та лікування грипу, ГРВІ, гепатиту А, для лікування вірусних гепатитів, герпесу простого (у тому числі урогенітального) та оперізувального, при комплексній терапії хламідійних інфекцій, нейровірусних та інфекційно-алерійних. Препарат добре переноситься. Можливі диспептичні явища, короткочасне озноб, підвищення загального тонусу, що не вимагає відміни препарату.

Напівданявляє собою біосинтетичний полірибонуклеотидний комплекс поліаденілової та поліуридилової кислот (в еквімолярних співвідношеннях). Препарат має виражений інгібуючий вплив на віруси простого герпесу. Застосовується у вигляді очних крапель та ін'єкцій під кон'юнктиву. Препарат призначають дорослим для лікування вірусних захворювань очей: герпетичних та аденовірусних кон'юнктивітів, кератокон'юнктивітів, кератитів та кератоіридоциклітів (кератоувеїтів), іридоциклітів, хоріоретинітів, невритів зорового нерва.

Побічні ефективиникають рідко і виявляються розвитком алергічних реакцій: свербіж та відчуття стороннього тіла в оці.

Циклоферон- Низькомолекулярний індуктор інтерферону. Чинить противірусну, імуномодулюючу та протизапальну дію. Циклоферон ефективний щодо вірусів кліщового енцефаліту, герпесу, цитомегаловірусу, ВІЛ та ін. Має антихламідійну дію. Ефективний при системних захворюваннях сполучної тканини. Встановлено радіозахисну та протизапальну дію препарату.

Арбідолпризначають внутрішньо для профілактики та лікування грипу та інших ГРВІ, а також при герпетичних захворюваннях.

Інтерлейкіни:

рекомбінантний ІЛ-2 (альдеслейкін, пролейкін, ронколейкін ) , рекомбінантний ІЛ-1бета ( беталейкін).

Для цитокінових препаратів природного походження, що містять досить великий набір цитокінів запалення та першої фази імунної відповіді, характерно багатогранний вплив на організм людини. Ці препарати діють на клітини, що беруть участь у запаленні, процесах регенерації та імунній відповіді.

Альдеслейкін- Рекомбінантний аналог ІЛ-2. Чинить імуномодулюючу та протипухлинну дію. Активує клітинний імунітет. Підсилює проліферацію Т-лімфоцитів та ІЛ-2-залежних клітинних популяцій. Підвищує цитотоксичність лімфоцитів та клітин – кілерів, які розпізнають та знищують клітини пухлини. Підсилює продукцію гамма-інтерферону, ФНП, ІЛ-1. Застосовується при раку нирок.

Беталейкін- Рекомбінантний людський ІЛ-1 бета. Стимулює лейкопоез та імунний захист. Вводять під шкіру або внутрішньовенно при гнійних процесах з імунодефіцитом, при лейкопенії внаслідок хіміотерапії, пухлинах.

Ронколейкін- рекомбінантний препарат інтерлейкіну-2 -вводять внутрішньовенно при сепсисі з імунодефіцитом, а також при раку нирки.

Колонієстимулюючі фактори:

Молграмостім(Лейкомакс) – рекомбінантний препарат людського гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора. Стимулює лейкопоез, має імунотропну активність. Підсилює проліферацію та диференціювання попередників, збільшує вміст зрілих клітин у периферичній крові, зростання гранулоцитів, моноцитів, макрофагів. Підвищує функціональну активність зрілих нейтрофілів, посилює фагоцитоз та окисний метаболізм, що забезпечує механізми фагоцитозу, підвищує цитотоксичність щодо злоякісних клітин.

Філграстім(Нейпоген) – рекомбінантний препарат людського гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Філграстим регулює продукцію нейтрофілів та їх надходження у кров із кісткового мозку.

Лінограстим- рекомбінантний препарат людського гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Є високоочищеним протеїном. Є імуномодулятором та стимулятором лейкопоезу.

Синтетичні імуностимулятори: левамізол, ізопринозин поліоксидоній, галавіт.

Левамізол(декарис), похідним імідазолу, застосовують як імуностимулятор, а також як протиглистовий засіб при аскаридозі. Імуностимулюючі властивості левамізолу пов'язують із підвищенням активності макрофагів та Т-лімфоцитів.

Левамізол призначають внутрішньо при рецидивуючих герпетичних інфекціях, хронічному вірусному гепатиті, аутоімунних захворюваннях (ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, хвороба Крона). Препарат застосовують також при пухлинах товстого кишківника після хірургічної, променевої або лікарської терапії пухлин.

Ізопринозин- Препарат, що містить інозин. Стимулює активність макрофагів, продукцію інтерлейкінів, проліферацію Т-лімфоцитів.

Призначають внутрішньо при вірусних інфекціях, хронічних інфекціях дихальних та сечовивідних шляхів, імунодефіцитах.

Поліоксидоній- синтетичне водорозчинне полімерне з'єднання. Препарат має імуностимулюючу та детоксикувальну дію, збільшує імунну резистентність організму щодо локальних та генералізованих інфекцій. Поліоксидоній активує всі фактори природної резистентності: клітини моноцитарно-макрофагальної системи, нейтрофіли та природні кілери, підвищуючи їхню функціональну активність при вихідно знижених показниках.

Галавіт- Похідне фталгідразиду. Особливість цього препарату полягає в наявності не тільки імуномодулюючих, а й виражених протизапальних властивостей.

Препарати інших фармакологічних класів з імуностимулюючою активністю

1. Адаптогени та препарати рослинного походження (фітопрепарати):препарати ехінацеї (імунал), елеутерококу, женьшеню, родіоли рожевої та ін.

2. Вітаміни:кислота аскорбінова (вітамін С), токоферолу ацетат (вітамін Е), ретинолу ацетат (вітамін А) (див. розділ «Вітаміни»).

Препарати ехінацеїмають імуностимулюючі та протизапальні властивості. При вживанні ці препарати підвищують фагоцитарну активність макрофагів та нейтрофілів, стимулюють продукцію інтерлейкіну-1, активність Т-хелперів, диференціювання В-лімфоцитів.

Застосовують препарати ехінацеї при імунодефіцитах та хронічних запальних захворюваннях. Зокрема, імуналпризначають внутрішньо у краплях для профілактики та лікування гострих респіраторних інфекцій, а також спільно з антибактеріальними засобами при інфекціях шкіри, дихальних та сечовивідних шляхів.

Загальні принципи застосування імуностимуляторів у хворих із вторинними імунодефіцитами

Найбільш обґрунтованим застосування імуномостимуляторів є при імунодефіцитах, що виявляються підвищеною інфекційною захворюваністю. Головною мішенню імуностимулюючих препаратів залишаються вторинні імунодефіцити, які проявляються частими рецидивними, що важко піддаються лікуванню інфекційно-запальними захворюваннями всіх локалізацій та будь-якої етіології. В основі кожного хронічного інфекційно-запального процесу лежать зміни в імунній системі, що є однією з причин персистенції цього процесу.

· Імуномодулятори призначають у комплексній терапії одночасно з антибіотиками, протигрибковими, протипротозойними або противірусними засобами.

· При проведенні імунореабілітаційних заходів, зокрема при неповному одужанні після перенесеного гострого інфекційного захворювання, імуномодулятори можна застосовувати у вигляді монотерапії.

· Застосовувати імуномодулятори доцільно на тлі імунологічного моніторингу, який слід здійснювати незалежно від наявності або відсутності вихідних змін імунної системи.

· Імуномодулятори, що діють фагоцитарне ланка імунітету, можна призначати хворим як з виявленими, так і з невиявленими порушеннями імунного статусу, тобто. основою їх застосування є клінічна картина.

Зниження будь-якого параметра імунітету, виявлене при імунодіагностичному дослідженні практично здорової людини, необов'язковоє основою призначення йому імуномодулюючої терапії.

Контрольні питання:

1. Що таке імуностимулятори, які бувають показання до проведення імунотерапії, на які види поділяють імунодефіцитні стани?

2. Класифікація імуномодуляторів щодо переважної вибірковості дії?

3. Імуностимулятори мікробного походження та їх синтетичні аналоги, їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

4. Ендогенні імуностимулятори та їх синтетичні аналоги, їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

5. Препарати тимічних пептидів та пептидів кісткового мозку їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

6. Препарати імуноглобулінів та інтерферони (ІФН), їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

7. Препарати індукторів інтерферону (інтерфероногени), їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

8. Препарати інтерлейкінів та колонієстимулюючих факторів, їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

9. Синтетичні імуностимулятори їх фармакологічні властивості, показання до застосування, протипоказання, побічні ефекти?

10. Препарати інших фармакологічних класів з імуностимулюючою активністю та загальні принципи застосування імуностимуляторів у хворих із вторинними імунодефіцитами?

Противірусний імунітет молекулярно-клітинні механізми, закономірності розвитку та імунопато

Патогенез туберкульозу у людини

Вступ

Загальні відомості