Бактеріальні антигени:
групоспецифічні (зустрічаються у різних видіводного роду чи сімейства)
видоспецифічні (у різних представників одного виду);
типоспецифічні (визначають серологічні варіанти – серовари, антигеновари всередині одного виду).
Залежно від локалізації в бактеріальній клітині розрізняють К-, Н-, О-антигени (позначають буквами латинського алфавіту).
О-АГ – ліпополісахарид клітинної стінки грамнегативних бактерій. Складається з полісахаридного ланцюжка (власне О-Аг) та ліпіду А.
Полісахарид термостабілен (витримує кип'ятіння протягом 1-2 годин), хімічно стійкий (витримує обробку формаліном та етанолом). Чистий О-АГ слабо імуногенний. Виявляє варіабельність структури та по ньому розрізняють багато сероваріантів бактерій одного виду. Наприклад, для кожної групи сальмонел характерна наявність певного О-АГ (полісахариду) – у групи А
Це фактор 2, групи В - фактор 4 і т.д. У R-форм бактерій О-АГ втрачає бічні ланцюги
полісахариду та типоспецифічність.
Ліпід А - містить глюкозамін та жирні кислоти. Він має сильну ад'ювантну, неспецифічну імуностимулюючу активність і токсичність. У цілому нині ЛПС є эндотоксином. Вже у невеликих дозах викликає лихоманку через активацію макрофагів та виділення ними ІЛ1, ФНП та інших цитокінів, дегрануляцію гранулоцитів, агрегацію тромбоцитів. Він може зв'язуватися з будь-якими клітинами організму, але особливо макрофагами. У великих дозах пригнічує фагоцитоз, викликає токсикоз, порушення функції серцево-судинної системи, тромбози, ендотоксичний шок. ЛПС деяких бактерій входить до складу імуностимуляторів (продігіозан,
пірогенал). Пептидоглікани клітинної стінки бактерій мають сильний ад'ювантний ефект на клітини СІ.
Н-АГвходить до складу бактеріальних джгутиків, основа його – білок флагеллін. Термолабілен.
К-АГ– це гетерогенна група поверхневих, капсульних АГ бактерій.
Вони перебувають у капсулі. Містять головним чином кислі полісахариди, до складу яких входять галактуронова, глюкуронова та ідуронова кислоти. Зустрічаються варіації у будові цих антигенів, на підставі чого, наприклад, розрізняють 75 типів (серотипів) пневмококів, 80 типів клебсієл і т.д. Капсульні антигени використовуються для приготування вакцин менінгококів, пневмококів, клебсієл. Однак введення високих доз полісахаридних антигенів може спричинити толерантність.
Антигенами бактерій є також їх токсини, рибосоми та ферменти.
Деякі мікроорганізми містять перехреснореагуючі - антигенні детермінанти, що зустрічаються у мікроорганізмів і людини/тварин.
У бактерій різних видів і людини зустрічаються загальні, подібні за будовою АГ. Ці явища називаються антигенною мімікрією. Часто перехреснореагуючі антигени відображають філогенетичну спільність даних представників, іноді є результатом випадкової схожості конформації та зарядів - молекул АГ.
Наприклад, АГ Форсмана міститься в еритроцитах барача, сальмонел і у морських свинок.
Гемолітичні стрептококи групи А містять перехресно реагують АГ (зокрема, М-протеїн), загальні з АГ ендокарда та клубочків нирок людини. Такі бактеріальні антигени викликають утворення антитіл, що перехресно реагують з клітинами людини, що призводить до розвитку ревматизму та постстрептококового гломерулонефриту.
У збудника сифілісу є фосфоліпіди, подібні до будови з тими, що є в серці тварин і людини. Тому кардіоліпіновий антигенсерця тварин використовується виявлення антитіл до спірохете в хворих людей (реакція Вассермана).
Антигени – це високомолекулярні сполуки. При потраплянні в організм викликають імунну реакцію та взаємодіють із продуктами цієї реакції: антитілами та активованими лімфоцитами.
Класифікація антигенів.
1. За походженням:
1) природні (білки, вуглеводи, нуклеїнові кислоти, бактеріальні екзо- та ендотоксини, антигени клітин тканин та крові);
2) штучні (динітрофенільовані білки та вуглеводи);
3) синтетичні (синтезовані поліамінокислоти, поліпептиди).
2. За хімічною природою:
1) білки (гормони, ферменти та ін);
2) вуглеводи (декстран);
3) нуклеїнові кислоти (ДНК, РНК);
4) кон'юговані антигени (дінітрофенільовані білки);
5) поліпептиди (полімери a-амінокислот, кополімери глутаміну та аланіну);
6) ліпіди (холестерин, лецитин, які можуть виступати в ролі гаптена, але, поєднавшись з білками сироватки крові, вони набувають антигенних властивостей).
3. За генетичним відношенням:
1) аутоантигени (походять із тканин власного організму);
2) ізоантигени (походять від генетично ідентичного донора);
3) алоантигени (походять від неспорідненого донора того ж виду);
4) ксеноантигени (походять від донора іншого виду).
4. За характером імунної відповіді:
1) тимузалежні антигени (імунна відповідь залежить від активної участі Т-лімфоцитів);
2) тимуснезалежні антигени (запускають імунну відповідь та синтез антитіл В-клітинами без Т-лімфоцитів).
Виділяють також:
1) зовнішні антигени; потрапляють до організму ззовні. Це мікроорганізми, трансплантовані клітини та чужорідні частинки, які можуть потрапляти в організм аліментарним, інгаляційним чи парентеральним шляхом;
2) внутрішні антигени; виникають із пошкоджених молекул організму, які розпізнаються як чужі;
3) приховані антигени – певні антигени (наприклад, нервова тканина, білки кришталика та сперматозоїди); анатомічно відокремлені від імунної системи гістогематичними бар'єрами у процесі ембріогенезу; толерантність до цих молекул не виникає; їх попадання в кровотік може призводити до імунної відповіді.
Імунологічна реактивність проти змінених чи прихованих власних антигенів виникає при деяких аутоімунних захворюваннях.
Властивості антигенів:
1) антигенність - здатність викликати утворення антитіл;
2) імуногенність - здатність створювати імунітет;
3) специфічність - антигенні особливості, завдяки наявності яких антигени відрізняються один від одного.
Гаптени – низькомолекулярні речовини, які у звичайних умовах не викликають імунної реакції, але при зв'язуванні з високомолекулярними молекулами набувають імуногенності. До гаптенів відносяться лікарські засобита більшість хімічних речовин. Вони можуть викликати імунну відповідь після зв'язування з білками організму.
Антигени або гаптени, які при повторному попаданні в організм викликають алергічну реакцію, називаються алергенами.
2. Антигени мікроорганізмів
Інфекційні антигени – це антигени бактерій, вірусів, грибів, найпростіших.
Існують такі різновиди бактеріальних антигенів:
1) групоспецифічні (зустрічаються у різних видів одного роду чи сімейства);
2) видоспецифічні (зустрічаються у різних представників одного виду);
3) типоспецифічні (визначають серологічні варіанти – серовари, антигеновари – усередині одного виду).
Залежно від локалізації в бактеріальній клітині розрізняють:
1) Про - АГ - полісахарид; входить до складу клітинної стінки бактерій. Визначає антигенну специфічність ліпополісахариду клітинної стінки; по ньому розрізняють сероваріанти бактерій одного виду. Про - АГ слабко імуногенний. Він термостабільний (витримує кип'ятіння протягом 1-2 годин), хімічно стійкий (витримує обробку формаліном та етанолом);
2) ліпід А – гетеродимер; містить глюкозамін та жирні кислоти. Він має сильну ад'ювантну, неспецифічну імуностимулюючу активність і токсичність;
3) Н - АГ; входить до складу бактеріальних джгутиків, основа його – білок флагеллін. Термолабілен;
4) К – АГ – гетерогенна група поверхневих, капсульних антигенів бактерій. Вони знаходяться в капсулі і пов'язані з поверхневим шаром ліпополісахариду клітинної стінки;
5) токсини, нуклеопротеїни, рибосоми та ферменти бактерій.
Антигени вірусів:
1) суперкапсидні антигени – поверхневі оболонкові;
2) білкові та глікопротеїдні антигени;
3) капсидні – оболонкові;
4) нуклеопротеїдні (серцеві) антигени.
Усі вірусні антигени Т-залежні.
Протективні антигени – це сукупність антигенних детермінантів (епітопів), які викликають найбільш сильну імунну відповідь, що захищає організм від повторного інфікування цим збудником.
Шляхи проникнення інфекційних антигенів в організм:
1) через пошкоджену та іноді непошкоджену шкіру;
2) через слизові оболонки носа, рота, ШКТ, сечостатевих шляхів.
Гетероантигени – загальні для представників різних видів антигенні комплекси або загальні антигенні детермінанти на комплексах, що розрізняються за іншими властивостями. За рахунок гетероантигенів можуть виникати перехресні імунологічні реакції.
У бактерій різних видів і в людини зустрічаються загальні, подібні до будови антигени. Ці явища називаються антигенною мімікрією.
Суперантигени – це особлива група антигенів, які у дуже малих дозах викликають поліклональну активацію та проліферацію великої кількостіТ-лімфоцитів. Суперантигенами є бактеріальні ентеротоксини, стафілококові, холерні токсини, деякі віруси (ротавіруси).
Виділення мікроорганізмів з різних матеріалів та одержання їх культур широко використовується в лабораторній практиці для мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань, у науково-дослідній роботі та в мікробіологічному виробництві вакцин, антибіотиків та інших біологічно активних продуктів мікробної життєдіяльності.
Умови культивування також залежить від властивостей відповідних мікроорганізмів. Більшість патогенних мікробів вирощують на живильних середовищах при температурі 37 ° С протягом 12 діб. Однак деякі з них потребують більш тривалих термінів. Наприклад, бактерії кашлюку - в 2-3 доби, а мікобактерії туберкульозу - в 3-4 тижнях.
Для стимуляції процесів росту та розмноження аеробних мікробів, а також скорочення термінів їх вирощування використовують метод глибинного культивування, який полягає у безперервному аеруванні та перемішуванні живильного середовища. Глибинний метод знайшов широке застосування у біотехнології.
Для культивування анаеробів застосовують спеціальні методи, сутність яких полягає у видаленні повітря або заміни його інертними газами в герметизованих термостатах - анаеростатах. Анаеробів вирощують на живильних середовищах, що містять редукуючі речовини (глюкозу, мурашинокислий натрій та ін), що зменшують окисно-відновний потенціал.
У діагностичній практиці особливе значення мають чисті культури бактерій, які виділяються з матеріалу, що досліджується, взятого у хворого або об'єктів навколишнього середовища. З цією метою використовують штучні живильні середовища, які поділяють на основні, диференціально-діагностичні та елективні найрізноманітніші склади. Вибір живильного середовища виділення чистої культури має важливе значення при бактеріологічної діагностиці.
Найчастіше використовують тверді живильні середовища, попередньо розлиті чашки Петрі. На поверхню середовища петлею поміщають матеріал, що досліджується, і розтирають шпателем, щоб отримати ізольовані колонії, що виросли з однієї клітини. Пересівання ізольованої колонії на скошене агарове середовище в пробірку призводить до отримання чистої культури.
Для ідентифікації, тобто. визначення родової та видової приналежності виділеної культури, найчастіше вивчають фенотипічні ознаки:
а) морфологію бактеріальних клітин у забарвлених мазках, чи нативних препаратах;
б) біохімічні ознаки культури за її здатністю ферментувати вуглеводи (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маніт та ін), утворювати індол, аміак та сірководень, які є продуктами протеолітичної активності бактерій.
Для повнішого аналізу застосовують газово-рідинну хромографію та інші методи.
Поруч із бактеріологічними методами для ідентифікації чистих культур широко використовують імунологічні методи дослідження, спрямовані вивчення антигенної структури виділеної культури. З цією метою використовують серологічні реакції: аглютанації, преципітації імунофлюоресценції, зв'язування комплементу, імуноферментний, радіоімунний методи та ін.
Методи виділення чистої культури
Для того щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відокремити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягти за допомогою методів, які ґрунтуються на двох принципах – механічному і біологічному роз'єднання бактерій.
Методи виділення чистих культур, що базуються на механічному принципі
Метод послідовних розведень , запропонований Л. Пастером, був одним із найперших, який застосовувався для механічного роз'єднання мікроорганізмів. Він полягає у проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить мікробів, у стерильній рідкоїживильному середовищі. Цей прийом досить копіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які потрапляють у пробірки під час розведення.
Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень ). Р. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розлучався у кількох пробірках з розтопленим і трохи охолодженим желатином, вміст якого пізніше виливався на стерильні скляні пластини. Після застуднення середовища воно культивувалося за оптимальної температури. У його товщі утворювалися ізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.
Метод Дрігальського є досконалішим методом, який широко поширений у повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню середовища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять матеріал, що досліджується. За допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середу. Чашку під час посіву тримають відкритою та обережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять їм зайняв матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – у третій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум'ї пальника. На поверхні середовища у першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільне зростання бактерій, у другій – густе зростання, а у третій – зростання у вигляді ізольованих колоній.
Колонії за методом Дрігальського
Метод штрихових посівів сьогодні використовується у мікробіологічних лабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею та наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять зайняв його паралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів за оптимальної температури на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів.
Метод штрихів
Для отримання ізольованих колоній можна використовувати зайняв тампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо перевідкривають чашку Петрі з живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, поступово повертаючи тампон і чашку.
Таким чином, суттєва перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дригальського та штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище перетворюються на чисту культуру.
Методи виділення чистих культур, що базуються на біологічному принципі
Біологічний принцип роз'єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, що враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити такі:
1. За типом дихання. Усі мікроорганізми за типом дихання поділяються на дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholeraeі тому подібне)і анаеробні (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringensта ін.). Якщо матеріал, з якого слід виділити збудники анаеробні, попередньо прогріти, а потім культивувати в анаеробних умовах, то виростуть саме ці бактерії.
2. За спороутворенню . Відомо, що деякі мікроби (бацили та клостридії) здатні до споротворення. Серед них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів довкілля. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії термічного фактора, а потім перенесений інокулятивно в живильне середовище. Через деякий час на ньому виростуть саме бактерії, які здатні до споротворення.
3. Стійкість мікробів до дії кислот та лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідок особливостей їх хімічної будови стійкі до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, мокротиння при туберкульозі попередньо обробляють рівним об'ємом 10% розчину сірчаної кислоти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора гине, а мікобактерії внаслідок їх резистентності до кислот виростають.
Холерний вібріон (Vibrio сholerae) , Навпаки, є галофільною бактерією, тому для створення оптимальних умов зростання його висівають на середовища, які містять луг (1% лужна пептонна вода). Вже через 4-6 годин на поверхні середовища з'являються характерні ознаки зростання у вигляді ніжної блакитної плівки.
4. Рухливість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) мають тенденцію до повзучого зростання і здатні швидко поширюватися по поверхні дещо вологого середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у крапельку конденсаційної рідини, яка утворюється при охолодженні стовпчика скошеного агару. Через 16-18 рік вони поширюються всю поверхню середовища. Якщо взяти матеріал із верхньої частини агару, матимемо чисту культуру збудників.
5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших протимікробних засобів.Внаслідок особливостей метаболізму бактерій вони можуть мати різну чутливість до деяких хімічних факторів. Відомо, що стафілококи, аеробні бацили, які утворюють суперечки, стійкі до дії 7,5-10% натрію хлориду. Ось чому для виділення цих збудників використовують елективні живильні середовища (жовтково-сольовий агар, маніт-сольовий агар), які містять саме цю речовину. Інші бактерії за такої концентрації хлориду натрію практично не ростуть.
6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для гальмування росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, навпаки, додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє зростанню бактеріальної флори, якщо потрібно виділити гриби. Додавання фуразолідону у певних концентраціях до живильного середовища створює селективні умови для зростання коринебактерій та мікрококів.
7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні покриви. Деякі патогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої кількості ферментів агресії здатні проникати через неушкоджену шкіру. Для цього шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають досліджуваний матеріал, який містить збудника і багато сторонньої мікрофлори. Через деякий час тварину забивають, та якщо з крові чи внутрішніх органів виділяють мікробів.
8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворювань. Окремі тварини виявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів.
Наприклад, за будь-якого способу введення Streptococcus pneumoniaeбілим мишам у них розвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна картина спостерігається під час зараження гвінейських свинок збудниками туберкульозу (Mycobacterium tuberculosis) .
У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями, як штамі чиста культурамікроорганізмів. Під штамом розуміють мікробів одного виду, які виділені з різних джерел, або з одного й того джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – це мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на живильному середовищі.
Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з низки етапів.
В перший день (1 етап дослідження)у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають - зовнішній вигляд, консистенція, колір, запах та інші ознаки, готують мазок, фарбують та досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Потім проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя – методом Дрігальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат за оптимальної температури (37 ° С) на 18-48 годин. Мета етапу – отримати ізольовані колонії мікроорганізмів.
Однак, часом з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.
На другий день (2 етап дослідження)на поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія- це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клони), тому їхній склад досить однорідний. Особливості зростання бактерій на живильних середовищах є виявом їх культуральних властивостей.
Чашки ретельно розглядають та вивчають ізольовані колонії, які виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв та поверхні колоній, їхню консистенцію та інші ознаки. Якщо потрібно, досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній досліджують у прохідному світлі за малого збільшення мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні або волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.
Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога та лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії.
На третій день (3 етап дослідження)вивчають характер зростання чистої культури мікроорганізмів та проводять її ідентифікацію.
Спочатку звертають увагу на особливості зростання мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розміром і тинкторіальних (здатність фарбуватися) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже на вигляд і особливостям їх зростання можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.
Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні.
Ідентифікація бактерій
Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.
З метою встановлення видової приналежності бактерій часто вивчають їхню антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями. Кожен мікроорганізм має у собі різні антигенні субстанції. Зокрема, представники сім'ї ентеробактерій (ешерихії, сальмонелі, шигели) містять оболонковий О-антиген, жгутиковий Н-антиген та капсульний К-антиген. Вони неоднорідні своїм хімічним складом, тому існують у багатьох випадках. Їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення виду бактерій зветься серологічної ідентифікації.
Іноді ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою та спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об'єкти – найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей та щурів.
ДОДАТКИ
(Таблиці та схеми)
Фізіологія бактерій
Схема 1. Фізіологія мікробів.
розмноження
вирощування на живильних середовищах
Таблиця 1. Загальна таблиця фізіології мікробів.
|
Характеристика |
||
|
Процес придбання енергії та речовин. |
||
|
Сукупність біохімічних процесів, у яких звільняється енергія, необхідна життєдіяльності мікробних клітин. |
||
|
Координоване відтворення всіх клітинних компонентів та структур, що веде в кінцевому підсумку до збільшення маси клітини |
||
|
Розмноження |
Збільшення числа клітин у популяції |
|
|
Вирощування на живильних середовищах. |
У лабораторних умовмікроорганізми вирощують на живильних середовищах, які повинні бути стерильними, прозорими, вологими, містити певні поживні речовини (білки, вуглеводи, вітаміни, мікроелементи та ін.), мати певну буферність, мати відповідний рН, окисно-відновний потенціал. |
Таблиця 1.1 Хімічний склад та фізіологічні функції елементів.
|
Елемент складу |
Характеристика та роль у фізіології клітини. |
||
|
Основний компонент бактеріальної клітини становить близько 80 % її маси. Вона знаходиться у вільному або пов'язаному стані із структурними елементами клітини. У суперечках кількість води зменшується до 18.20%. Вода є розчинником для багатьох речовин, а також виконує механічну роль у забезпеченні тургору. При плазмолізі – втраті клітиною води у гіпертонічному розчині – відбувається відшарування протоплазми від клітинної оболонки. Видалення води з клітини, висушування зупиняють процеси метаболізму. Більшість мікроорганізмів добре переносять висушування. За нестачі води мікроорганізми не розмножуються. Висушування у вакуумі із замороженого стану (ліофілізація) припиняє розмноження та сприяє тривалому збереженню мікробних особин. |
|||
|
40 - 80% сухої маси. Визначають найважливіші біологічні властивості бактерій і складаються зазвичай із поєднань 20 амінокислот. До складу бактерій входить діамінопімелінова кислота (ДАП), відсутня в клітинах людини і тварин. Бактерії містять понад 2000 різних білків, що перебувають у структурних компонентах та беруть участь у процесах метаболізму. Більшість білків має ферментативної активністю. Білки бактеріальної клітини зумовлюють антигенність та імуногенність, вірулентність, видову приналежність бактерій. |
|||
|
Елемент складу |
Характеристика та роль у фізіології клітини. |
||
|
Нуклеїнові кислоти |
Виконують функції, аналогічні нуклеїновим кислотам еукаріотичних клітин: молекула ДНК у вигляді хромосоми відповідає за спадковість, рибонуклеїнові кислоти (інформаційна, або матрична, транспортна та рибосомна) беруть участь у біосинтезі білка. |
||
|
Вуглеводи |
Представлені простими речовинами (моно- та дисахариди) та комплексними сполуками. Полісахариди часто входять до складу капсул. Деякі внутрішньоклітинні полісахариди (крохмаль, глікоген та ін) є запасними поживними речовинами. |
||
|
Входять до складу цитоплазматичної мембрани та її похідних, а також клітинної стінки бактерій, наприклад, зовнішньої мембрани, де, крім біомолекулярного шару ліпідів, є ЛПС. Ліпіди можуть виконувати у цитоплазмі роль запасних поживних речовин. Ліпіди бактерій представлені фосфоліпідами, жирними кислотами та гліцеридами. Найбільше ліпідів (до 40%) містять мікобактерії туберкульозу. |
|||
|
Мінеральні речовини |
Виявляють у золі після спалювання клітин. У великій кількості виявляються фосфор, калій, натрій, сірка, залізо, кальцій, магній, а також мікроелементи (цинк, мідь, кобальт, барій, марганець та ін.). , активують ферменти, входять до складу ферментів, вітамінів та структурних компонентів мікробної клітини. |
||
Таблиця 1.2. Азотисті основи.
Таблиця 1.2.1 Ферменти
|
Характеристика |
|||
|
Визначення |
Специфічні та ефективні білкові каталізатори, присутні у всіх живих клітинах. |
||
|
Ферменти знижують енергію активації, забезпечуючи перебіг таких хімічних реакцій, які без них могли б проходити тільки за високої температури, надлишкового тиску та інших нефізіологічних умов, неприйнятних для живої клітини. |
|||
|
Ферменти збільшують швидкість реакції приблизно на 10 порядків, що скорочує напівперіод будь-якої реакції з 300 до однієї секунди. |
|||
|
Ферменти «дізнаються» субстрат за просторовим розташуванням його молекули та розподілом зарядів у ній. За зв'язування із субстратом відповідає певна ділянка молекули ферментативного білка – його каталітичний центр. При цьому утворюється проміжний фермент-субстратний комплекс, який потім розпадається з утворенням продукту реакції та вільного ферменту. |
|||
|
Різновиди |
Регуляторні (алостеричні) ферменти сприймають різні метаболічні сигнали та відповідно до них змінюють свою каталітичну активність. |
Ефективні ферменти - ферменти, що каталізують деякі реакції (докладніше табл. 1.2.2.) |
|
|
Функціональна активність |
Функціональна активність ферментів та швидкість ферментативних реакцій залежать від умов, в яких знаходиться даний мікроорганізм і насамперед від температури середовища та його pH. Для багатьох патогенних мікроорганізмівоптимальними є температура 37°З pH 7,2-7,4. |
||
КЛАСИ ФЕРМЕНТІВ:
мікроорганізми синтезують різні ферменти, що належать до всіх шести відомих класів.
Таблиця 1.2.2. Класи ефекторних ферментів
|
Клас ферменту |
Каталізує: |
|
|
Оксидоредуктази |
Перенесення електронів |
|
|
Трансферази |
Перенесення різних хімічних груп |
|
|
Гідролази |
Перенесення функціональних груп на молекулу води |
|
|
Приєднання груп з подвійних зв'язків та зворотні реакції |
||
|
Ізомерази |
Перенесення груп усередині молекули з утворенням ізомерних форм |
|
|
Утворення зв'язків С-С, C-S, С-О, C-N за рахунок реакцій конденсації, пов'язаних з розпадом аденозинтрифосфату (АТФ) |
Таблиця 1.2.3. Типи ферментів за утворенням у бактеріальній клітині
|
Характеристика |
Примітки |
||
|
Ідуцибельні (адаптивні) ферменти «індукція субстратом» |
Ферменти, концентрація яких у клітині різко зростає у відповідь появу серед субстрату-індуктора. Синтезуються бактеріальною клітиною лише за наявності у середовищі субстрату даного ферменту | ||
|
Репресибельні ферменти |
Синтез цих ферментів пригнічується внаслідок надмірного накопичення продукту реакції, що каталізується цим ферментом. |
Прикладом репресії ферментів може бути синтез триптофану, який утворюється з антранілової кислоти за участю антранілатсинтетази. |
|
|
Конститутивні ферменти |
Ферменти, що синтезуються незалежно від умов середовища |
Ферменти гліколізу |
|
|
Мультиферментні комплекси |
Внутрішньоклітинні ферменти, об'єднані структурно та функціонально |
Ферменти дихального ланцюга, локалізовані на цитоплазматичній мембрані. |
Таблиця 1.2.4. Специфічні ферменти
|
Ферменти |
Ідентифікація бактерій |
|
|
Супероксид дисмутаза та каталаза |
Всі аероби або факультативні анаероби мають супероксид дисмутазою і каталазою - ферментами, що захищають клітину від токсичних продуктів кисневого метаболізму. Майже всі облігатні анаероби не синтезують ці ферменти. Лише одна група аеробних бактерій- молочнокислі бактерії каталазонегативні. |
|
|
Пероксидаза |
Молочнокислі бактерії акумулюють пероксидазу - фермент, що каталізує окислення органічних сполук під дією Н202 (відновлюється до води). |
|
|
Аргініндигідролаза |
Діагностична ознака, що дозволяє розрізнити сапрофітичні види Pseudomonas від фітопатогенних. |
|
|
Серед п'яти основних груп сімейства Enterobacteriaceae лише дві - Escherichiae та Erwiniae- не синтезують уреазу. |
Таблиця 1.2.5. Застосування ферментів бактерій у промисловій мікробіології.
|
Ферменти |
Застосування |
|
|
Амілаза, целюлаза, протеаза, ліпаза |
Для поліпшення травлення застосовують готові препарати ферментів, що полегшують відповідно гідроліз крохмалю, целюлози, білка та ліпідів. |
|
|
Інвертаза дріжджів |
При виготовленні солодощів для попередження кристалізації сахарози |
|
|
Пектиназа |
Використовують для освітлення фруктових соків |
|
|
Колагеназа клостридій та стрептоконаза стрептококів |
Гідролізують білки, сприяють загоєнню ран та опіків. |
|
|
Літичні ферменти бактерій |
Секретуються в навколишнє середовище, діють на клітинні стінки патогенних мікроорганізмів і служать ефективним засобом у боротьбі з останніми, навіть якщо вони мають множинну стійкість до антибіотиків. |
|
|
Рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, полімерази, ДНК-лігази та інші ферменти, спрямовано модифікуючі нуклеїнові кислоти |
Використовують як інструментарій у біоорганічній хімії, генній інженерії та генотерапії. |
Таблиця 1.2.6. Класифікація ферментів з локалізації.
|
Локалізація | |||
|
Ендоферменти |
У цитоплазмі У цитоплазматичній мембрані У периплазматичному просторі |
Функціонують лише усередині клітини. Вони каталізують реакції біосинтезу та енергетичного обміну. |
|
|
Екзоферменти |
Виділяються у довкілля. |
Виділяються клітиною в середу і каталізують реакції гідролізу складних органічних сполук більш прості, доступні для асиміляції мікробною клітиною. До них відносяться гідролітичні ферменти, які грають виключно важливу роль у харчуванні мікроорганізмів. |
Таблиця 1.2.7. Ферменти патогенних мікробів (ферменти агресії)
|
Ферменти | |||
|
Лецитовітелаза Лецитіназа |
Руйнує клітинні мембрани |
Посів досліджуваного матеріалу на живильне середовище ЖСА Результат: зона помутніння довкола колоній на ЖСА. |
|
|
Гемолізин |
Руйнує еритроцити |
Посів досліджуваного матеріалу на живильне середовище кров'яний агар. Результат: повна зона гемолізу довкола колоній на кров'яному агарі. |
|
|
Коагулаза-позитивні культури |
Викликає згортання плазми крові |
Посів досліджуваного матеріалу на стерильну плазму крові. Результат: згортання плазми |
|
|
Коагулаза-негативні культури |
Вироблення маніту |
Посів на живильне середовище маніт в анаеробних умовах. Результат: Поява пофарбованих колоній (у колір індикатора) |
|
|
Ферменти |
Утворення деяких ферментів у лабораторних умовах |
||
|
Гіалуронідаза |
Гідролізує гіалуронову кислоту – основний компонент сполучної тканини |
Посів досліджуваного матеріалу на живильне середовище, що містить гіалуронову кислоту. Результат: у пробірках, де міститься гіалуронідаза, не відбувається утворення згустку. |
|
|
Нейрамінідаза |
Відщеплює від різних глікопротеїдів, гліколіпідів, полісахаридів сіалову (нейрамінову) кислоту, підвищуючи проникність різних тканин. |
Виявлення: реакція визначення антитіл до нейрамінідази (РІНА) та інші (імунодіфузні, імуноензимні та радіоімунні методи). |
Таблиця 1.2.8. Класифікація ферментів з біохімічних властивостей.
|
Ферменти |
Виявлення |
||
|
Сахаролітичні |
Розщеплення цукрів |
Диференціально – діагностичні середовища такі, як середовища Гісса, середовище Олькеницького, середовище Ендо, середовище Левіна, середовище Плоскірєва. |
|
|
Протеолітичні |
Розщеплення білків |
Мікроби засівають уколом у стовпчик желатину та після 3-5 діб інкубування при кімнатній температурі відзначають характер розрідження желатину. Протеолітичну активність визначають також за утворенням продуктів розкладання білка: індолу, сірководню, аміаку. Для їх визначення мікроорганізми засівають у м'ясо-пептонний бульйон. |
|
|
Ферменти, що виявляються по кінцевих продуктах |
Освіта лугів Освіта кислот Освіта сірководню Освіта аміаку та ін. |
Для відмінності одних видів бактерій від інших на підставі їхньої ферментативної активності застосовуються диференційно-діагностичні середовища |
Схема 1.2.8. Ферментний склад.
ФЕРМЕНТНИЙ СКЛАД БУДЬ-ЯКОГО МІКРООРГАНІЗМУ:
Визначається його геномом
Є стабільною ознакою
Широко застосовується для їхньої ідентифікації
Визначення сахаролітичних, протеолітичних та інших властивостей.
Таблиця 1.3. Пігменти
|
Пігменти |
Синтез мікроорганізмом |
|
|
Жиророзчинні каротиноїдні пігменти червоного, оранжевого або жовтого кольорів |
Утворюють сарцини, мікобактерії туберкульозу, деякі актиноміцети. Ці пігменти оберігають їх від дії УФ-променів. |
|
|
Пігменти чорного або коричневого кольору – меланіни |
Синтезуються облігатними анаеробами Bacteroides niger та ін. не розчиняються у воді і навіть сильних кислотах |
|
|
Пірроловий пігмент яскраво-червоного кольору – продігіозин |
Утворюється деякими сераціями |
|
|
Водорозчинний фенозиновий пігмент – піоціанін. |
Продукуються синьогнійними бактеріями (Pseudomonas aeruginosa). При цьому живильне середовище з нейтральним або лужним pH забарвлюється у синьо-зелений колір. |
Таблиця 1.4. Мікроорганізми, що світяться і ароматоутворюють
|
Умова та характеристика |
||
|
Свічення (люмінесценція) |
Бактерії викликають світіння тих субстратів, наприклад луски риб, вищих грибів, дерев, що гниють, харчових продуктів, на поверхні яких розмножуються. Більшість бактерій, що світяться, відносяться до галофільних видів, здатних розмножуватися при підвищених концентраціях солей. Вони мешкають у морях та океанах і рідко – у прісних водоймах. Усі бактерії, що світяться, є аеробами. Механізм світіння пов'язаний із звільненням енергії у процесі біологічного окислення субстрату. |
|
|
Ароматоутворення |
Деякі мікроорганізми виробляють леткі ароматичні речовини, наприклад оцтово-етиловий та оцтово-аміловий ефіри, які надають аромату вину, пиву, молочнокислим та іншим харчовим продуктам, внаслідок чого застосовуються в їх виробництві. |
Таблиця 2.1.1.
|
Визначення |
|||
|
Метаболізм |
Біохімічні процеси, що протікають у клітині, об'єднані одним словом – метаболізм (грец. metabole – перетворення). Цей термін рівнозначний поняттю «обмін речовин та енергії». Розрізняють дві сторони метаболізму: анаболізм та катаболізм. |
||
|
Анаболізм – сукупність біохімічних реакцій, що здійснюють синтез компонентів клітини, тобто та сторона обміну речовин, яку називають конструктивним обміном |
Катаболізм - сукупність реакцій, які забезпечують клітину енергією, необхідної, зокрема, й у реакцій конструктивного обміну. Тому катаболізм визначають як енергетичний обмін клітини. |
||
|
Амфіболізм |
Проміжний обмін речовин, що перетворює низькомолекулярні фрагменти поживних речовин на ряд органічних кислот та фосфорних ефірів, називають |
||
Схема 2.1.1. Метаболізм
МЕТАБОЛІЗМ –
сукупність двох протилежних, але взаємодіючих процесів: катаболізму та анаболізму
Анаболізм= асиміляція = пластичний метаболізм = конструктивний метаболізм
Катаболізм= Дисиміляція = енергетичний метаболізм = розпад = забезпечення клітини енергією
Синтез (компонентів клітини)
Ферментативні катаболічні реакції, внаслідок яких відбувається виділення енергіїяка акумулювалася в молекулах АТФ.
Біосинтез мономерів:
амінокислот нуклеотидів моносахаридів жирних кислот
Біосинтез полімерів:
білків нуклеїнових кислот полісахаридів ліпідів
В результаті ферментативних анаболічних реакція, енергія, виділена в процесі катаболізму, витрачається на синтез макромолекул органічних сполук, з яких потім монтуються біополімери – складові мікробної клітини.
Енергія витрачається на синтез компонентів клітини
Таблиця 2.1.3. Обмін речовин та перетворення енергії клітини.
|
Обмін речовин |
Характеристика |
Примітки |
|
|
Обмін речовин забезпечує властиве живому організму як системі динамічну рівновагу, при якому взаємно врівноважуються синтез та руйнування, розмноження та загибель. |
Обмін речовин – головна ознака життя |
||
|
Пластичний обмін Синтез білків, жирів, вуглеводів. |
Це сукупність реакцій біологічного синтезу. |
З речовин, що надходять у клітину ззовні, утворюються молекули, подібні до сполук клітини, тобто відбувається асиміляція. |
|
|
Енергетичний обмін |
Процес протилежний до синтезу. Це сукупність реакцій розщеплення. |
При розщепленні високомолекулярних сполук виділяється енергія, необхідна реакції біосинтезу, тобто відбувається дисиміляція. При розщепленні глюкози енергія виділяється поетапно за участю низки ферментів. |
Таблиця 2.1.2. Відмінність у метаболізмі для ідентифікації.
Таблиця 2.2 Анаболізм (конструктивний метаболізм)
Схема 2.2.2. Біосинтез амінокислот у прокаріотів.
Схема 2.2.1. Біосинтез вуглеводів у мікроорганізмів.
Малюнок 2.2.3. Біосинтез ліпідів
Таблиця 2.2.4. Етапи енергетичного обміну – катаболізм.
|
Етапи |
Характеристика |
Примітка |
|
|
Підготовчий |
Молекули дисахаридів та полісахаридів, білків розпадаються на дрібні молекули – глюкозу, гліцерин та жирні кислоти, амінокислоти. Великі молекули нуклеїнових кислот на нуклеотиди. |
На цьому етапі виділяється невелика кількість енергії, що розсіюється у вигляді теплоти. |
|
|
Безкисневий чи неповний чи анаеробний чи бродіння чи дисиміляція. |
Речовини, що утворюються на цьому етапі, за участю ферментів піддаються подальшому розщепленню. Наприклад: глюкоза розпадається на дві молекули молочної кислоти та дві молекули АТФ. |
У реакціях розщеплення глюкози бере участь АТФ та H 3 PO 4 . У ході безкисневого розщеплення глюкози у вигляді хімічного зв'язку в молекулі АТФ зберігається 40% енергії, решта розсіюється як теплоти. У всіх випадках розпаду однієї молекули глюкози утворюється дві молекули АТФ. |
|
|
Стадія аеробного дихання чи кисневого розщеплення. |
При доступі кисню до клітини речовини, що утворилися під час попереднього етапу, окислюються (розщеплюються) до кінцевих продуктів. CO 2 іH 2 O. |
Сумарне рівняння аеробного дихання:
|
Схема 2.2.4. Бродіння.
Бродильний метаболізм -характеризується утворенням АТФ у вигляді фосфорилювання субстратів.
Перша (окислення) = розщеплення
Друга (відновлення)
Включає перетворення глюкози на піровиноградну кислоту.
Включає утилізацію водню відновлення піровиноградної кислоти.
Шляхи утворення піровиноградної кислоти з вуглеводів
Схема 2.2.5. Пировиноградна кислота.
Гліколітичний шлях (шлях Ембдена-Мейєргофа-Парнаса)
Шлях Ентнера-Дудорова
Пентозо-фосфатний шлях
Таблиця 2.2.5. Бродіння.
|
Тип бродіння |
Представники |
Кінцевий продукт |
Примітки |
|
|
Молочнокисле |
|
Утворюють із пірувату молочну кислоту. |
У одних випадках (гомоферментне бродіння) утворюється лише молочна кислота, інших також побічні продукти. |
|
|
Мурашинокисле |
Enterobacteriaceae |
Мурашина кислота – один із кінцевих продуктів. (поряд з нею – побічні) |
Деякі види ентеробактерій розщеплюють мурашину кислоту до H 2 і CO 2/ |
|
|
Олійнокисле |
Масляна кислота та побічні продукти |
Деякі види клостридій поряд з масляною та іншими кислотами утворюють бутанол, ацетон та ін. (Тоді його називають ацетоно-бутилове бродіння). |
||
|
Пропіоновокисле |
Propionobacterium |
Утворюють з пірувату пропіонову кислоту |
Багато бактерій при зброджуванні вуглеводів поряд з іншими продуктами утворюють етиловий спирт. При цьому він не є основним продуктом. |
Таблиця 2.3.1. Білоксинтезуюча система, іонний обмін.
|
Назва елемента |
Характеристика |
|
|
Рибосомні субодиниці 30S та 50S |
У разі бактеріальних рибосом 70S субчастиця 50S містить рРНК 23S (довжина ~3000 нуклеотидів) та субчастиця 30S містить рРНК 16S (довжина ~1500 нуклеотидів); велика рибосомна субчастка крім "довгої" рРНК містить також одну або дві "коротких" рРНК (5S рРНК бактеріальних рибосомних субчастинок 50S або 5S і 5.8S рРНК великих рибосомних субчастинок еукаріотів). (Докладніше – див. рис. 2.3.1.) |
|
|
Матрична РНК (мРНК) | ||
|
Повний комплект двадцяти аміноацил-тРНК, для утворення яких потрібні відповідні амінокислоти, аміноацил-тРНК-синтетази, тРНК та АТФ |
Це заряджена енергією і пов'язана з тРНК амінокислота, готова для підвезення до рибосоми і включення в поліпептид, що синтезується на ній. |
|
|
Транспортна РНК (тРНК) |
Рибонуклеїнова кислота, функцією якої є транспортування амінокислот до місця синтезу білка. |
|
|
Білкові фактори ініціації |
(у прокаріотів - IF-1, IF-2, IF-3) Отримали свою назву тому, що вони беруть участь в організації активного комплексу (708-комплексу) з субодиниць 30S і 50S, мРНК та ініціаторної аміноацил-тРНК (у прокаріотів - формілметіоніл -тРНК), який «запускає» (ініціює) роботу рибосом – трансляцію мРНК. |
|
|
Білкові фактори елонгації |
(у прокаріотів - EF-Tu, EF-Ts, EF-G) Беруть участь у подовженні (елонгації) поліпептидного ланцюга (пептидила), що синтезується. Білкові фактори термінації або звільнення (англ. – release factors – RF) забезпечують кодон-специфічне відділення поліпептиду від рибосоми та закінчення синтезу білка. |
|
|
Назва елемента |
Характеристика |
|
|
Білкові фактори термінації |
(у прокаріотів - RF-1, RF-2, RF-3) |
|
|
Деякі інші білкові фактори (асоціації, дисоціації субодиниць, вивільнення та ін.). |
Білкові фактори трансляції, необхідні для функціонування системи |
|
|
Гуанозінтріфосфат (ГТФ) |
Для здійснення трансляції потрібна участь ГТФ. Потреба білоксинтезуючої системи ГТФ дуже специфічна: він може бути замінений жодним з інших трифосфатів. На біосинтез білка клітина витрачає енергії більше, ніж синтез будь-якого іншого біополімеру. Утворення кожного нового пептидного зв'язку вимагає розщеплення чотирьох високоенергетичних зв'язків (АТФ і ГТФ): двох для того, щоб навантажити амінокислотою молекулу тРНК, і ще двох у ході елонгації - одну при зв'язуванні аа-тРНК та іншу при транслокації. |
|
|
Неорганічні катіони у певній концентрації. |
Для підтримки рН системи у фізіологічних межах. Іони амонію використовуються деякими бактеріями для синтезу амінокислот, іони калію – для зв'язування тРНК із рибосомами. Іони заліза, магнію виконують роль кофактора у ряді ферментативних процесів |
Малюнок 2.3.1. Схематичне зображення структур прокаріотичних та еукаріотичних рибосом.
Таблиця 2.3.2. Особливості іонного обміну бактерій.
|
Особливість |
Характеризується: |
||
|
Високий осмотичний тиск |
Завдяки значній внутрішньоклітинній концентрації іонів калію у бактеріях підтримується високий осмотичний тиск. |
||
|
Споживання заліза |
Для ряду патогенних та умовно-патогенних бактерій (ешерихії, шигели та ін.) споживання заліза в організмі господаря утруднене через його нерозчинність при нейтральних і слаболужних значеннях pH |
Сидерофори –спеціальні речовини, які, зв'язуючи залізо, роблять його розчинним та транспортабельним. |
|
|
Асиміляція |
Бактерії активно асимілюють із середовища аніони SO2/ та Р034+ для синтезу сполук, що містять ці елементи (сірковмісні амінокислоти, фосфоліпіди та ін.). |
||
|
Для зростання та розмноження бактерій необхідні мінеральні сполуки - іони NH4+, К+, Mg2+ та ін. (Докладніше, дивись табл. 2.3.1.) |
|||
Таблиця 2.3.3. Іонний обмін
|
Назва мінеральних сполук |
Функція |
|
|
NH 4+ (іони амонію) |
Використовуються деякими бактеріями для синтезу амінокислот |
|
|
K+ (іони калію) |
Використовуються для зв'язування т-РНК із рибосомами. Підтримують високий осмотичний тиск |
|
|
Fe 2+ (іони заліза) |
Виконують роль кофакторів у ряді ферментативних процесів Входять до складу цитохромів та інших гемопротеїдів |
|
|
Mg 2+ (іони магнію) |
||
|
SO 4 2 - (сульфат-аніон) |
Необхідні для синтезу сполук, що містять ці елементи (сірковмісні амінокислоти, фосфоліпіди та ін.) |
|
|
PO 4 3- (фосфат-аніон) |
Схема 2.4.1. Енергетичний метаболізм.
Для синтезу бактерії потребують…
Поживних речовин
Таблиця 2.4.1. Енергетичний метаболізм (біологічне окиснення).
|
Процес |
Необхідно: |
|
|
Синтез структурних компонентів мікробної клітини та підтримання процесів життєдіяльності |
Достатня кількість енергії. Ця потреба задовольняється з допомогою біологічного окислення, у результаті синтезуються молекули АТФ. |
|
|
Енергія (АТФ) |
Залізобактерії отримують енергію, що виділяється при безпосередньому окисленні ними заліза (Fe2+ Fe3+), яка використовується для фіксації С02, бактерії, що метаболізують сірку, забезпечують себе енергією за рахунок окислення сірковмісних сполук. Однак переважна більшість прокаріотів отримує енергію шляхом дегідрогування. Отримання енергії відбувається також у процесі дихання (докладну таблицю дивись у відповідному розділі). |
Схема 2.4. Біологічне окиснення у прокаріотів.
Розпад полімерів на мономери
Вуглеводи
гліцерин та жирні кислоти
амінокислоти
моносахариди
Розщеплення у безкисневих умовах
Освіта проміжних продуктів
Окислення в кисневих умовах до кінцевих продуктів
Таблиця 2.4.2. Енергетичний метаболізм.
|
Концепція |
Характеристика |
|
|
Сутність енергетичного метаболізму |
Забезпечення енергією клітин, яка потрібна на прояви життя. |
|
|
Молекула АТФ синтезується внаслідок перенесення електрона від його первинного донора до кінцевого акцептора. |
||
|
Дихання – біологічне окиснення (розщеплення). Залежно від того, що є кінцевим акцептором електронів розрізняють дихання: Аеробне - при аеробному диханні кінцевим акцептором електронів служить молекулярний кисень O2. Анаеробне - кінцевим акцептором електронів служать неорганічні сполуки: NO 3 - ,SO 3 - ,SO 4 2- |
||
|
Мобілізація енергії |
Енергія мобілізуються в реакціях окиснення та відновлення. |
|
|
Реакція окислення |
Здатність речовини віддавати електрони (окислятися) |
|
|
Реакція відновлення |
Здатність речовини приєднувати електрони. |
|
|
Окисно-відновний потенціал |
Здатність речовини віддавати (окислюватись) або приймати (відновлюватись) електрони. (кількісний вираз) |
Схема 2.5. Синтез.
вуглеводів
Таблиця 2.5.1. Синтез
Таблиця 2.5.1. Синтез
|
Біосинтез |
З чого |
Примітки |
|
|
Біосинтез вуглеводів |
Автотрофи синтезують глюкозу з CO2. Гетеротрофи синтезують глюкозу з вуглецевмісних сполук. |
Цикл Кальвіна (див. схему 2.2.1) |
|
|
Біосинтез амінокислот |
Більшість прокаріотів здатні синтезувати всі амінокислоти з: Пірувата α-кетоглутората фуморату |
Джерело енергії – АТФ. Піруват утворюється в гліколітичному циклі. Ауксотрофні мікроорганізми споживають готові в організмі господаря. |
|
|
Біосинтез ліпідів |
Ліпіди синтезуються з більш простих сполук – продуктів метаболізму білків та вуглеводів |
Важливу роль грають ацетилпереносящие білки. Ауксотрофні мікроорганізми - споживають готові в організмі господаря або з живильних середовищ. |
Таблиця 2.5.2. Основні етапи біосинтезу білка.
|
Етапи |
Характеристика |
Примітки |
|
|
Транскрипція |
Процес синтезу РНК на генах Це процес переписування інформації з ДНК гена на мРНК ген. |
Здійснюється за допомогою ДНК – залежної РНК – полімерази. Перенесення інформації про структуру білка до рибосом відбувається за допомогою мРНК. |
|
|
Трансляція (передача) |
Процес власного біосинтезу білка. Процес розшифрування генетичного коду в мРНК та здійснення його у вигляді поліпептидного ланцюга. |
Оскільки кожен кодон містить три нуклеотиди, той самий генетичний текст можна прочитати трьома. різними способами(починаючи з першого, другого та третього нуклеотидів), тобто у трьох різних рамках зчитування. |
Примітка до таблиці: Первинна структура кожного білка – послідовність розташування у ньому амінокислот.
Схема 2.5.2. Ланцюги перенесення електронів від первинного донора водню (електронів) до кінцевого акцептора O 2 .
Органічна речовина
(первинний донор електронів)
Флавопротеїн (-0,20)
Хінон (- 0, 07)
Цитохром (+0,01)
Цитохром C(+0,22)
Цитохром A(+0,34)
кінцевий акцептор
Таблиця 3.1. Класифікація організмів за типами харчування.
|
Елемент-органоген |
Типи харчування |
Характеристика |
|
|
Вуглець (С) |
Автотрофи |
Самі синтезують всі вуглецевмісні компоненти клітини з CO 2 . |
|
|
Гетеротрофи |
Не можуть задовольняти свої потреби за рахунок CO 2 використовують готові органічні сполуки. |
||
|
Сапрофіти |
Джерело харчування – мертві органічні субстрати. |
||
|
Джерело живлення – живі тканини тварин та рослин. |
|||
|
Прототрофи |
Задовольняють свої потреби за допомогою атмосферного та мінерального азоту |
||
|
Ауксотрофи |
Потребують готових органічних азотистих сполук. |
||
|
Водень (H) |
Основним джерелом є H 2 O |
||
|
Кисень (O) |
|||
Таблиця 3.1.2. Перетворення енергії
Таблиця 3.1.3. Способи вуглецевого харчування
|
Джерело енергії |
Донор електронів |
Спосіб вуглецевого живлення |
|
|
Енергія сонячного світла |
Неорганічні сполуки |
Фотолітогетеротрофи |
|
|
Органічні сполуки |
Фотоорганогетеротрофи |
||
|
Окисно-відновні реакції |
Неорганічні сполуки |
Хемолітогетеротрофи |
|
|
Органічні сполуки |
Хемоорганогетеротрофи |
Таблиця 3.2. Механізми харчування:
|
Механізм |
Умови |
Градієнт концентрації |
Витрати енергії |
Субстратна специфічність |
|
|
Пасивна дифузія |
Концентрація поживних речовин у середовищі перевищує концентрацію у клітині. |
За градієнтом концентрації | |||
|
Полегшена дифузія |
Беруть участь білки пермеази. |
За градієнтом концентрації | |||
|
Активний транспорт |
Беруть участь білки пермеази. | ||||
|
Транслокація хімічних груп |
У процесі перенесення відбувається хімічна модифікація поживних речовин. |
Проти градієнта концентрації |
Таблиця 3.3. Транспорт поживних речовин із бактеріальної клітини.
|
Назва |
Характеристика |
|
|
Фосфотрансферазна реакція |
Відбувається при фосфорилюванні молекули, що переноситься. |
|
|
Контрансляційна секреція |
У цьому випадку синтезовані молекули повинні мати особливу послідовність амінокислот, що лідирує, щоб прикріпитися до мембрани і сформувати канал, через який молекули білка зможуть вийти в навколишнє середовище. Таким чином виходять із клітини відповідних бактерій токсини правця, дифтерії та інші молекули |
|
|
Ниркування мембрани |
Молекули, що утворюються в клітині, оточуються мембранною бульбашкою, яка відшнуровується в навколишнє середовище. |
Таблиця 4. Зростання.
|
Концепція |
Визначення поняття. |
|
|
Необоротне збільшення кількості живої речовини, найчастіше обумовлене розподілом клітин. Якщо багатоклітинних організмів зазвичай спостерігається збільшення розмірів тіла, то багатоклітинних збільшується кількість клітин. Але й у бактерій слід виділяти збільшення кількості клітин та збільшення клітинної маси. |
||
|
Чинники, що впливають на зростання бактерій invitro. |
Культуральні середовища: Mycobacterium leprae не здатні in vitro до Температура (зростають в інтервалі): Мезофільні бактерії (20-40 о С) Термофільні бактерії (50-60 о С) Психофільні (0-10 про С) |
|
|
Оцінка зростання бактерій |
Кількісну оцінку росту зазвичай проводять у рідких середовищах, де бактерії, що ростуть, утворюють гомогенну суспензію. Збільшення кількості клітин встановлюють, визначаючи концентрацію бактерій в 1 мл, або визначають збільшення клітинної маси у вагових одиницях, віднесених до одиниці об'єму. |
Чинники зростання
Амінокислоти
Вітаміни
Азотисті основи
Таблиця 4.1. Чинники зростання
|
Чинники зростання |
Характеристика |
Функція |
||
|
Амінокислоти |
|
Багато мікроорганізмів, особливо бактерії, потребують тих чи інших амінокислот (однієї або декількох), оскільки вони не можуть їх самостійно синтезувати. Такі мікроорганізми називаються ауксотрофними за тими амінокислотами або інших сполук, які вони не здатні синтезувати. |
||
|
Пуринові основи та їх похідні |
Нуклеотиди: |
Є чинниками зростання бактерій. Нуклеотиди потребують деякі види мікоплазм. Потрібні для побудови нуклеїнових кислот. |
||
|
Піримидинові основи та їх похідні |
Нуклеотиди |
|||
|
Чинники зростання |
Характеристика |
Функція |
||
|
Нейтральні ліпіди |
Входять до складу мембранних ліпідів |
|||
|
Фосфоліпіди |
||||
|
Жирні кислоти |
Є компонентами фосфоліпідів. |
|||
|
Гліколіпіди |
У мікоплазм входять до складу цитоплазматичної мембрани |
|||
|
Вітаміни (в основному групи B) |
Тіамін (B1) |
Золотистий стафілокок, пневмокок, бруцели. |
||
|
Нікотинова кислота (B3) |
Усі види паличкоподібних бактерій |
|||
|
Фолієва кислота (B9) |
Біфідобактерії та пропіоновокислі |
|||
|
Пантотенова кислота (B5) |
Деякі види стрептококів, бацили правця |
|||
|
Біотин (B7) |
Дріжджі та азотфіксуючі бактерії Rhizobium |
|||
|
Геми – компоненти цитохромів |
Гемофільні бактерії, мікобактерії туберкульозу |
|||
Таблиця 5. Дихання.
|
Назва |
Характеристика |
|
|
Біологічне окиснення (ферментативні реакції) |
||
|
Заснування |
Дихання засноване на окисно-відновних реакціях, що йдуть з утворенням АТФ – універсального акумулятора хімічної енергії. |
|
|
Процеси |
При диханні відбуваються процеси: Окислення – віддача донорами водню чи електронів. Відновлення – приєднання водню чи електронів до акцептора. |
|
|
Аеробне дихання |
Кінцевим акцептором водню чи електронів служить молекулярний кисень. |
|
|
Анаеробне дихання |
Акцептором водню чи електронів є неорганічна сполука – NO 3 - ,SO 4 2- ,SO 3 2- . |
|
|
Бродіння |
Акцептором водню чи електронів є органічні сполуки. |
Таблиця 5.1. Класифікація за типом дихання.
|
Бактерії |
Характеристика |
Примітки |
|
|
Суворі анаероби |
Енергетичний обмін відбувається без участі вільного кисню. Синтез АТФ при споживанні глюкози в анаеробних умовах (гліколіз) відбувається за рахунок фосфорилювання субстрату. Кисень для анаеробів не є кінцевим акцептором електронів. Більш того, молекулярний кисень має на них токсичну дію. |
у строгих анаеробів відсутня фермент каталаза, тому що накопичується в присутності кисню надає на них бактерицидну дію; у строгих анаеробів відсутня система регуляції окисно-відновного потенціалу (редокс-потенціалу). |
|
|
Суворі аероби |
Здатні отримувати енергію тільки шляхом дихання і тому обов'язково потребують молекулярного кисню. Організми, які одержують енергію і утворюють АТФ за допомогою лише окисного фосфорилювання субстрату, де окислювачем може бути тільки молекулярний кисень. Зростання більшості аеробних бактерій припиняється при концентрації кисню 40-50% і вище. |
До строгих аероб відносять, наприклад, представників роду Pseudomonas |
|
|
Бактерії |
Характеристика |
Примітки |
|
|
Факультативні анаероби |
Зростають як у присутності, так і у відсутності молекулярного кисню Аеробні організми містять найчастіше три цитохроми, факультативні анаероби - один або два, облігатні анаероби не містять цитохромів. |
До факультативних анаеробів відносять ентеробактерії і багато дріжджі, здатні перемикатися з дихання в присутності 02 на бродіння без 02. |
|
|
Мікроаерофіли |
Мікроорганізм, що вимагає, на відміну від строгих анаеробів, для свого зростання присутності кисню в атмосфері або поживному середовищі, але в знижених концентраціях у порівнянні з вмістом кисню у звичайному повітрі або в нормальних тканинах організму господаря (на відміну від аеробів вміст кисню в атмосфері або живильному середовищі). Багато мікроаерофілів також є капнофілами, тобто їм потрібна підвищена концентрація вуглекислого газу. |
У лабораторії такі організми легко культивуються у «свічковій банці». «Свічкова банка» це ємність, в яку перед запечатуванням повітронепроникною кришкою вносять свічку, що горить. Полум'я свічки горітиме доти, доки не згасне від нестачі кисню, внаслідок чого в банку утворюється атмосфера, насичена діоксидом вуглецю, зі зниженим вмістом кисню. |
Таблиця 6. Характеристика розмноження.
Схема 6. Залежність тривалості генерації різних чинників.
Тривалість генерації
Вид бактерії
Населення
Температура
Склад живильного середовища
Таблиця 6.1. Фази розмноження бактерій
|
Фаза |
Характеристика |
|
|
Початкова стаціонарна фаза |
Триває 1-2 години. Протягом цієї фази кількість бактеріальних клітин не збільшується. |
|
|
Лаг-фаза (фаза затримки розмноження) |
Характеризується початком інтенсивного зростання клітин, але швидкість їхнього розподілу залишається невисокою. |
|
|
Лог-фаза (логарифмічна) |
Відрізняється максимальною швидкістю розмноження клітин та збільшенням чисельності бактеріальної популяції у геометричній прогресії. |
|
|
Фаза негативного прискорення |
Характеризується меншою активністю бактеріальних клітин та подовженням періоду генерації. Це відбувається внаслідок виснаження живильного середовища, накопичення в ньому продуктів метаболізму та дефіциту кисню. |
|
|
Стаціонарна фаза |
Характеризується рівновагою між кількістю загиблих, що знову утворюються і перебувають у стані спокою клітин. |
|
|
Фаза загибелі |
Відбувається постійною швидкістю і змінюється УП-УШ фазами зменшення швидкості відмирання клітин. |
Схема 7. Вимоги до живильних середовищ.
Вимоги
В'язкість
Вологість
Стерильність
Поживність 
Прозорість
Ізотонічність
Таблиця 7. Розмноження бактерій на живильних середовищах.
|
Живильне середовище |
Характеристика |
||
|
Щільні живильні середовища |
На щільних живильних середовищах бактерії утворюють колонії - скупчення клітин. |
||
|
S– тип(smooth – гладкий та блискучий) Круглі, з рівним краєм, гладкі, опуклі. |
R– тип(rough - шорсткий, нерівний) Неправильної форми з порізаними краями, шорсткі, вм'яті. |
||
|
Рідкі живильні середовища |
Придонне зростання (осад) Поверхневе зростання (плівка) Дифузне зростання (рівномірне помутніння) |
||
Таблиця 7.1. Класифікація живильних середовищ.
|
Класифікація |
Види |
Приклади |
|
|
За складом |
МПА – м'ясо-пептонний агар МПБ – м'ясо-пептонний бульйон ПВ – пептонна вода |
||
|
Кров'яний агар ЖСА – жовтково-сольовий агар Середовища Гісса |
|||
|
За призначенням |
Основні | ||
|
Елективні |
Лужний агар Лужна пептонна вода |
||
|
Диференційно-діагностичні |
|
||
|
Спеціальні |
Вільсона-Блера Кітта-Тароцці Тіоглікольовий бульйон Молоко за Тукаєвим |
||
|
За консистенцією |
Кров'яний агар Лужний агар |
||
|
Напіврідкі |
Напіврідкий агар |
||
|
За походженням |
Натуральні | ||
|
Напівсинтетичні | |||
|
Синтетичні |
|
Таблиця 7.2. Принципи виділення чистої культури клітин.
|
Механічний принцип |
Біологічний принцип |
|
1. Фракційні розведення Л. Пастера 2. Пластинчастих розведень Р. Коха 3. Поверхневих посівів Дригальського 4. Поверхневих штрихів |
Беруть до уваги: а – тип дихання (метод Фортнера); б – рухливість (метод Шукевича); в - кислотостійкість; г - спороутворення; д – температурний оптимум; е - вибіркову чутливість лабораторних тварин до бактерій |
Таблиця 7.2.1. Етапи виділення чистої культури клітин.
|
Етап |
Характеристика |
|
|
1 етап дослідження |
Забирають патологічний матеріал. Його вивчають - зовнішній вигляд, консистенція, колір, запах та інші ознаки, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. |
|
|
2 етап дослідження |
На поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія- це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клони), тому їхній склад досить однорідний. Особливості зростання бактерій на живильних середовищах є виявом їх культуральних властивостей. |
|
|
3 етап дослідження |
Вивчають характер зростання чистої культури мікроорганізмів та проводять її ідентифікацію. |
Таблиця 7.3. Ідентифікація бактерій
|
Назва |
Характеристика |
|
|
Біохімічна ідентифікація |
Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями |
|
|
Серологічна ідентифікація |
З метою встановлення видової приналежності бактерій часто вивчають їхню антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями. |
|
|
Ідентифікація за біологічними властивостями |
Іноді ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою та спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі |
|
|
Культуральна ідентифікація |
Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками |
|
|
Морфологічна ідентифікація |
Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками |
Який із процесів не відноситься до фізіології бактерій?
Розмноження
Які речовини становлять 40-80% сухої маси бактеріальної клітини?
Вуглеводи
Нуклеїнові кислоти
Які класи ферментів синтезують мікроорганізми?
Оксиредуктази
Усі класи
Трансферази
Ферменти, концентрація яких у клітині різко зростає у відповідь на появу серед субстрату-індуктора?
Ідуцибельні
Конституційні
Репресибельні
Мультиферментні комплекси
Фермент патогенності, що виділяється золотистим стафілококом?
Нейрамінідаза
Гіалуронідаза
Лецитіназа
Фібринолізин
Протеолітичні ферменти виконують функцію?
Розщеплення білків
Розщеплення жирів
Розщеплення вуглеводів
Освіта лугів
Бродіння ентеробактерій?
Молочнокисле
Мурашинокисле
Пропіоновокисле
Олійнокисле
Які мінеральні сполуки використовують для зв'язування т-РНК з рибосомами?
Біологічне окиснення це…?
Розмноження
Загибель клітин
Які речовини самі синтезують всі вуглецеві компоненти клітини з CO 2 .
Прототрофи
Гетеротрофи
Автотрофи
Сапрофіти
Поживні середовища розрізняються:
За складом
За консистенцією
За призначенням
По всьому з перерахованого вище
Фаза розмноження, яка характеризується рівновагою між кількістю загиблих, що знову утворюються і перебувають у стані спокою клітин?
Фаза негативного прискорення
Стаціонарна фаза
Тривалість генерації залежить від?
віку
Населення
Усього вищепереліченого
З метою встановлення видової приналежності бактерій часто вивчають їхню антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію, яку?
Біологічну
Морфологічну
Серологічну
Біохімічну
Метод поверхневих посівів Дрігальського відносять до...?
Механічним принципам виділення чистої культури
Біологічним принципам виділення чистої культури
Список літератури
1. Борисов Л. Б. Медична мікробіологія, вірусологія, імунологія: підручник для мед. вишів. - М.: ТОВ «Медичне інформаційне агентство», 2005.
2. Поздєєв О. К. Медична мікробіологія: підручник для мед. вишів. - М: ГЕОТАР-МЕД, 2005.
3. Коротяєв А. І., Бабічов С. А. Медична мікробіологія, імунологія та вірусологія / підручник для мед. вишів. - Спб.: СпецЛіт, 2000.
4. Воробйов А. А., Биков А. С., Пашков Є. П., Рибакова А. М. Мікробіологія: підручник. - М.: Медицина, 2003.
5. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник / за ред. В. В. Звєрєва, М. Н. Бойченко. - М.: Геотар-Медіа, 2014.
6. Керівництво до практичних занять з медичної мікробіології, вірусології та імунології / за ред. В. В. Теца. - М.: Медицина, 2002.
Вступ 6
Склад бактерій з погляду їхньої фізіології. 7
Метаболізм 14
Харчування (транспорт поживних речовин) 25
Дихання 31
Розмноження 34
Мікробні спільноти 37
ДОДАТКИ 49
Список литературы 105
Антигенна структура мікроорганізмів дуже різноманітна. У мікроорганізмів розрізняють загальні, чи групові, і специфічні, чи типові, антигени.
Групові антигени є загальними для двох або більше видів мікробів, що входять в один рід, а іноді відносяться до різних родів. Так, загальні групові антигени є в окремих типів роду сальмонел; збудники черевного тифу мають загальні групові антигени зі збудниками паратифу А та паратифу В (0-1,12).
Специфічні антигени є тільки в даного виду мікроба або навіть у певного типу (варіанту) або підтипу всередині виду. Визначення специфічних антигенівдозволяє диференціювати мікроби всередині роду, виду, підвиду та навіть типу (підтипу). Так, усередині роду сальмонел по комбінації антигенів диференційовано понад 2000 типів сальмонел, а у підвиду шигел Флекснера – 5 серотипів (сероваріантів).
По локалізації антигенів у мікробній клітині розрізняють соматичні антигени, пов'язані з тілом мікробної клітини, капсульні - поверхневі, або оболонкові антигени та джгутикові антигени, що знаходяться у джгутиках.
Соматичні, О-антигени(Від нім. Ohne Hauch - без дихання), пов'язані з тілом мікробної клітини. У грамнегативних бактерій О-антиген - складний комплекс ліпідополісахаридно-білкової природи. Він є високо токсичним і є ендотоксином цих бактерій. У збудників кокових інфекцій, холерних вібріонів, збудників бруцельозу, туберкульозу та деяких анаеробів з тіла мікробних клітин виділено полісахаридні антигени, які зумовлюють типову специфічність бактерій. Як антигени вони можуть бути активними в чистому вигляді та в комплексі з ліпідами.
Жгутикові, Н-антигени(Від ньому. Hauch - дихання), мають білкову природу і знаходяться в джгутиках рухливих мікробів. Джгутикові антигени швидко руйнуються при нагріванні та під дією фенолу. Вони добре зберігаються у присутності формаліну. Цю властивість використовують при виготовленні вбитих діагностів кумів для реакції аглютинації, коли необхідно зберегти джгутики.
Капсульні, К - антигени- розташовані на поверхні мікробної клітини і називаються ще поверхневими, або оболонковими. Найбільш детально вони вивчені у мікробів сімейства кишкових, у яких розрізняють Vi-, М-, В-, L-і А-антигени. Важливе значення має Vi-антиген. Вперше він був виявлений у штамах бактерій черевного тифу, що мають високу вірулентність, і отримав назву антигену вірулентності. При імунізації людини комплексом О- та Vi-антигенів спостерігається високий рівень захисту проти черевного тифу. Vi-антиген руйнується при 60°З менш токсичний, ніж О-антиген. Він виявлений і в інших кишкових мікробів, наприклад, у кишкової палички.
Протективний(від лат. protectio - заступництво, захист), або захисний, антиген утворюється сибірковими мікробами в організмі тварин і виявляється в різних ексудатах при захворюванні на сибірку. Протективний антиген є частиною екзотоксину, що виділяється мікробом сибірки, і здатний викликати вироблення імунітету. У відповідь на введення цього антигену утворюються комплементзв'язуючі антитіла. Протективний антиген можна отримати при вирощуванні сибіркового мікроба на складному синтетичному середовищі. З протективного антигену виготовлена високоефективна хімічна вакцина проти сибірки. Захисні протективні антигени виявлені також у збудників чуми, бруцельозу, туляремії, кашлюку.
Повноцінні антигенивикликають в організмі синтез антитіл або сенсибілізацію лімфоцитів та вступають з ними в реакцію як in vivo, так і in vitro. Для повноцінних антигенів характерна сувора специфічність, т. е. викликають у організмі вироблення лише специфічних антитіл, вступають у реакцію лише з цим антигеном. До таких антигенів відносять білки тваринного, рослинного та бактеріального походження.
Неповноцінні антигени (гаптени) являють собою складні вуглеводи, ліпіди та інші речовини, не здатні викликати утворення антитіл, але які вступають з ними у специфічну реакцію. Гаптени набувають властивості повноцінних антигенів лише за умови введення в організм у комплексі з білком.
Типовими представниками гаптенів є ліпіди, полісахариди, нуклеїнові кислоти, а також прості речовини: фарби, аміни, йод, бром та ін.
Вакцинація як метод профілактики інфекційних хвороб. Історія розвитку вакцинації. Вакцини Вимоги до вакцин. Чинники, що визначають можливість створення вакцин.
Вакцини – це біологічно активні препарати, що запобігають розвитку інфекційних захворювань та інших проявів імунопатології. Принцип застосування вакцин полягає у випереджальному створенні імунітету і, як наслідок, стійкості до розвитку захворювання. Вакцинацією називають заходи, створені задля штучну імунізацію населення шляхом запровадження вакцин підвищення стійкості до захворювання. Мета вакцинації полягає у створенні імунологічної пам'яті проти конкретного патогену.
Розрізняють пасивну та активну імунізацію. Введення імуноглобулінів, отриманих з інших організмів, - пасивна імунізація. Вона застосовується як у терапевтичних, так і профілактичних цілях. Введення вакцин – це активна імунізація. Основна відмінність активної імунізації від пасивної – формування імунологічної пам'яті.
Імунологічна пам'ять забезпечує прискорене та більше ефективне видаленнячужорідних агентів за їх повторній появів організмі. Основою імунологічної пам'яті є T-і B-клітини пам'яті.
Перша вакцина отримала свою назву від слова vaccinia(коров'яча віспа) - вірусна хворобавеликого рогатої худоби. Англійський лікар Едвард Дженнер вперше застосував на хлопчику Джеймсі Фіппсе вакцину проти натуральної віспи, отриману з бульбашок на руці хворого на корову віспу, в 1796 р. Лише майже через 100 років (1876-1881) Луї Пастер сформулював головний принципвакцинації – застосування ослаблених препаратів мікроорганізмів для формування імунітету проти вірулентних штамів.
Деякі з живих вакцин було створено радянськими вченими, наприклад, П. Ф. Здродовський створив вакцину проти висипного тифу у 1957-59 роках. Вакцину проти грипу створила група вчених: А. А. Смородинцев, В. Д. Соловйов, В. М. Жданов у 1960 році. П. А. Вершилова у 1947-51 роках створила живу вакцинувідбруцельозу.
Вакцина повинна відповідати таким вимогам:
● активувати клітини, що беруть участь у процесингу та презентації антигену;
● містити епітопи для T- та T-клітин, що забезпечують клітинну та гуморальну відповідь;
● легко піддаватися процесингу з подальшою ефективною презентацією антигенами гістосумісності;
● індукувати утворення ефекторних T-клітин, антитілопродукуючих клітин та відповідних клітин пам'яті;
● запобігати розвитку захворювання протягом тривалого часу;
● бути нешкідливою, тобто не викликати серйозного захворювання та побічних ефектів.
Ефективність вакцинації – це фактично відсоток щеплених, які відреагували на вакцинацію формуванням специфічного імунітету. Таким чином, якщо ефективність певної вакцини становить 95%, то це означає, що з 100 щеплених 95 надійно захищені, а 5 все-таки схильні до ризику захворювання. Ефективність вакцинації визначається трьома групами факторів. Фактори, що залежать від вакцинного препарату: властивості самої вакцини, що визначають її імуногенність (жива, інактивована, корпускулярна, субодинична кількість імуногену і ад'ювантів і т.д.); якість вакцинного препарату, тобто. імуногенність не втрачена у зв'язку із закінченням терміну придатності вакцини або у зв'язку з тим, що її неправильно зберігали або транспортували. Фактори, що залежать від вакцинованого: генетичні фактори, що визначають принципову можливість (або неможливість) вироблення специфічного імунітету; вік, бо імунна відповідь найтіснішим чином визначається ступенем зрілості системи імунітету; стан здоров'я «взагалі» (зростання, розвиток та вади розвитку, харчування, гострі чи хронічні хвороби та ін.); фоновий стан імунної системи - насамперед наявність уроджених чи набутих імунодефіцитів.
Федеральне агентство з освіти
Бійський технологічний інститут (філія)
державної освітньої установи
з курсів «Загальна біологія та мікробіологія», «Мікробіологія» для студентів спеціальностей 240901 «Біотехнологія»,
260204 «Технологія бродильних виробництв та виноробство»
всіх форм навчання
УДК 579.118:579.22
Кам'янська, мікроорганізмів: методичні рекомендації до лабораторних робіт з курсів «Загальна біологія
та мікробіологія», «Мікробіологія» для студентів спеціальностей 240901 «Біотехнологія», 260204 «Технологія бродильних виробництв та виноробство» всіх форм навчання / ,
.
Алт. держ. техн. ун-т, БТІ . - Бійськ:
Вид-во Алт. держ. техн. ун-ту, 2007. - 36 с.
У цих методичних рекомендаціях розглядаються основні поняття, правила та принципи класифікації та ідентифікації мікроорганізмів. Наводиться лабораторна робота з вивчення різних властивостей бактерій, необхідні опису бактеріального штаму та ідентифікації його рівня роду.
Розглянуто та схвалено
на засіданні кафедри
"Біотехнологія".
Протокол №88 від 01.01.2001 р.
Рецензент:
д. б.н., професор, БПГУ ім.
© БТІ АлтДТУ, 2007
1 ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ І ПРАВИЛА НАЙМЕННЯ
МІКРООРГАНІЗМІВ
Описано кілька тисяч видів мікроорганізмів, проте вважають, що це не менше 1 % від реальних. Вивчення різноманітності мікроорганізмів є предметом систематики. Основним її завданням є створення природної системи, Що відбиває філогенетичні взаємини мікроорганізмів До останнього часу систематика мікроорганізмів базувалася переважно на фенотипічних ознаках: морфологічних, фізіологічних, біохімічних та ін, тому існуючі системи класифікації мають значною мірою штучний характер. Однак вони дозволяють порівняно легко ідентифікувати деякі виділені штами мікроорганізмів.
Систематика включає такі розділи, як класифікація, номенклатура і іден тифікація . Класифікація визначає порядок приміщення індивідуумів, що мають заданий ступінь однорідності, у певні групи (таксони). Номенклатура є зведенням правил найменування таксонів. Ідентифікація означає визначення приналежності досліджуваного організму до того чи іншого таксону.
Термін «таксономія» часто використовують як синонім систематики, проте іноді під ним розуміють розділ систематики, що включає теорію класифікації, вчення про систему таксономічних категорій, межі та підпорядкування таксонів. Основною таксономічною категорією в мікробіології, як і в інших біологічних науках, є вигляд- Сукупність особин, що характеризуються рядом загальних морфологічних, фізіолого-біохімічних, молекулярно-генетичних ознак.
Під терміном «штам» розуміють чисту культуру мікроорганізму, виділену з певного місця проживання (води, ґрунту, організму тварини і т. д.). Різні штами одного виду мікроорганізмів можуть відрізнятися за деякими ознаками, наприклад, чутливість до антибіотиків, здатність синтезувати деякі продукти метаболізму і т. д., але ці відмінності менше, ніж видові. Поняття «штам» у мікробіології та генетиці дещо різняться: у мікробіології це поняття є ширшим. Види мікроорганізмів поєднують у таксономічні категорії вищого порядку: пологи, сімейства, порядки, класи, відділи, царства. Ці категорії називають обов'язковими. Передбачені також необов'язкові категорії: підклас, підпорядок, підродина, триба, підтриба, підрід, підвид. Однак у систематиці необов'язкові категорії використовуються досить рідко.
Номенклатура мікроорганізмів підпорядковується міжнародним правилам. Так, є Міжнародний кодекс номенклатури бактерій. Для дріжджових грибів основним керівництвом є The Yeasts. A Taxonomic Study», для міцеліальних грибів та водоростей – Міжнародний кодекс ботанічної номенклатури.
Для найменування об'єктів у мікробіології, як у зоології та ботаніці, використовують бінарну чи біномінальну (від лат. bis- Двічі) систему номенклатури, відповідно до якої кожен вид має назву, що складається з двох латинських слів. Перше слово означає рід, а друге визначає конкретний вид цього й називається видовим епітетом. Родова назва завжди пишеться з великої літери, а видова – з малої навіть у тому випадку, якщо видовий епітет присвоєний на честь вченого, наприклад Clostridium pasteurianum. У тексті, особливо з латинською графікою, все словосполучення виділяють курсивом. При повторній згадці назви мікроорганізму родову назву можна скоротити до однієї або кількох початкових букв, наприклад З.pasteurianum. Якщо в тексті зустрічаються назви двох мікроорганізмів, які починаються з однієї й тієї ж літери (наприклад, Clostridium pasteurianumі Citrobacterfreundii), то скорочення мають бути різними (С. pasteurianumі Ct. freundii). Якщо мікроорганізм ідентифікований лише до народження, замість видового епітету пишуть слово sp. (species– вид), наприклад Pseudomonas sp. У цьому випадку при повторній згадці про назву мікроорганізму в тексті родову назву слід завжди писати повністю.
Для найменування підвиду використовують словосполучення, що складається з назви роду, а також видового та підвидового епітетів. Для розмежування цих епітетів між ними пишуть літерне поєднання, що є скороченим словом subspecies – «subsp.» або (рідше) "ss.". Наприклад, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Для кожного штаму вказують також абревіатуру назви колекції культур мікроорганізмів, в якій він зберігається, та номер, під яким він там значиться. Наприклад, Clostridium butyricumАТСС 19398 означає, що штам зберігається в американській колекції типових культур (American Type Culture Collection, АТСС) під номером 19398. Список колекцій мікроорганізмів, що користуються світовою популярністю, наводиться в Керівництві Берджі з систематики бактерій (Bergey1 Manual 1989), у каталогах культур мікроорганізмів та інших довідкових виданнях.
Опис будь-якого нового виду мікроорганізмів базується на типовому штамі, який зберігається в одній з колекцій мікроорганізмів і на підставі сукупності властивостей якого даний вид
характеризується в оригінальній статті чи визначнику. Типовий штам є номенклатурним типом виду, оскільки за ним закріплено видову назву. Якщо будь-які штами, спочатку включені в той же вид, надалі будуть визнані заслуговують виділення в особливі види, вони повинні отримати нові назви, а старе видове назва зберігається за типовим і спорідненим йому штамами. При цьому номер перейменованого штаму зберігається тим самим. Автентичними називають штами, що повністю збігаються за своїми властивостями.
Для роду номенклатурним типом є спеціально позначений типовий вид, що має набір найбільш характерних для представників даного таксона ознак. Наприклад, у роді Bacillusтиповим видом є Ст.subtilis.
У деяких визначниках та каталогах вказують старі назви перейменованих мікроорганізмів, а також наводять прізвища авторів, які першими виділили цей мікроорганізм, та рік публікації, в якій вперше описаний цей організм. Наприклад, один із видів дріжджів вказується в каталозі Всеросійської колекції мікроорганізмів (ВКМ) як Candida magnoliae(Lodder та Kreger van Rij, 1952) Meyer та Yarrow 1978, BKM Y-1685. Це означає, що він вперше був описаний Lodder і Kreger van Rij у публікації 1952, тоді цей вид був названий Torulopsis magnoliae. У 1978 р. Torulopsis magnoliaeбув перейменований такими дослідниками, як Meyer і Yarrow, Candida magnoliaeта зберігається нині у ВКМ під номером ВКМ Y-1685. Літера Y перед номером штаму означає "The Yeasts" - дріжджі.
Крім поняття «штам» у мікробіології застосовують терміни «варіант», «тип», «форма». Вони зазвичай використовуються для позначення штамів мікроорганізмів, що відрізняються за деякими ознаками типового штаму. Штам, який відрізняється від типового за морфологічними особливостями, називають морфовар(морфотип), фізіолого-біохімічним особливостям – біовар(біотип, фізіологічний тип), наскільки можна синтезувати певні хімічні сполуки – хемовар(хемоформа, хемотип), умов культивування – культивар,на кшталт відповіді використання бактеріофага – фаговар(фаготип, лізотип), антигенних характеристик – серовар(серотип)
і т.п.
У роботах з генетики мікроорганізмів часто використовують термін «клон»,під яким мають на увазі популяцію генетично споріднених клітин, отриману нестатевим шляхом із однієї батьківської клітини. У молекулярній біології клоном називають множинні
копії ідентичних послідовностей ДНК, отримані при їх вбудовуванні в вектори, що клонують (наприклад, плазміди). Під терміном "генетично модифіковані", або "рекомбінантні", штами розуміють штами мікроорганізмів, отримані в результаті генноінженерних маніпуляцій. Часто нові штами мікроорганізмів одержують за допомогою мутагенів.
Кожен новий штам мікроорганізмів, виділений із природних або техногенних джерел, повинен бути охарактеризований для отримання повного набору даних про властивості мікроорганізму
у чистій культурі. Ці дані можуть бути використані, наприклад, для складання паспорта цінних у промисловому відношенні штамів, а також їх ідентифікації.
Мета ідентифікації
– встановити таксономічне положення досліджуваного штаму на підставі порівняння його властивостей із вивченими та прийнятими (офіційно зареєстрованими) видами. Тому результатом ідентифікації зазвичай є ототожнення досліджуваного мікроорганізму з будь-яким видом чи віднесення
до певного роду. Якщо досліджуваний штам або група штамів відрізняються своїми властивостями від представників відомих таксонів, то вони можуть бути виділені в новий таксон. Для цього дають опис нового таксона, що включає, наприклад, у випадку бактерій, наступне: перелік штамів, що входять в таксон; характеристику кожного штаму; перелік властивостей, що розглядаються як суттєві
у таксоні; перелік властивостей, які кваліфікують таксон для представництва у найближчому вищому таксоні; список діагностичних характеристик, що диференціюють пропонований таксон від близьких таксонів; окремий опис типового (для виду) штаму; фотографію мікроорганізму.
Щоб знову пропонований таксон міг бути офіційно прийнятий, його опис має бути опублікований відповідно до певних правил. Наприклад, дійсне або узаконене опублікування таксону бактерій передбачає розміщення статті з його описом у Міжнародному журналі з систематики та еволюційної мікробіології "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology" (IJSEM). Якщо публікація з'являється в іншому авторитетному науковому журналі (ефективне опублікування), відбиток статті з цього журналу надсилається до IJSEM. З 1980 р. в IJSEM регулярно публікуються звані списки узаконених найменувань бактерій. У них перераховуються всі найменування бактерій, які були опубліковані в IJSEM (дійсне або узаконене опублікування) або ефективно опубліковані насамперед у будь-яких
інших авторитетних журналах. Після внесення найменування бактерій до списку узаконених IJSEM найменувань це найменування визнається дійсним, незалежно від того, було воно раніше опубліковане в IJSEM чи іншому журналі. Дата появи публікації найменування даного таксону в IJSEM або списку узаконених найменувань IJSEM є для таксона пріоритетною.
Культура типового штаму нового виду мікроорганізмів передається на зберігання до однієї з колекцій мікроорганізмів світового значення. У разі втрати типового штаму можлива його заміна на так званий неотиповий штам. При цьому має бути підтверджено, що властивості нового штаму добре збігаються з описом загубленого. Щоб показати, що таксон пропонується вперше, після назви нового сімейства додається скорочена комбінація fam. nov.», нового роду – «gen. nov.», а нового виду – «sp. nov.». Наприклад,
у 2000 р. із співавторами було запропоновано нове сімейство бактерій – Oscillochloridaceae,
fam. nov. Вираз «species insertac sedis» означає, що йдеться про вид, який тимчасово не має певного таксономічного статусу, оскільки не ясно, в якому таксоні вищого порядку – рід чи сімейство – слід помістити даний вид через брак необхідних для цього експериментальних.
даних.
2 ОПИС І ІДЕНТИФІКАЦІЯ
МІКРООРГАНІЗМІВ
Як зазначалося, принципи класифікації та ідентифікації різних груп прокаріотів і еукаріотних мікроорганізмів мають суттєві відмінності. Ідентифікація грибів до класів, порядків
та сімейств заснована на характерних рисахбудови та способи освіти, насамперед, статевих структур. Крім того, використовується характеристика безстатевих спороношень, будова та ступінь розвитку міцелію (зародковий, добре розвинений, септований або несептований), культуральні (колонія) та фізіологічні ознаки. Диференціація пологів усередині сімейств та ідентифікація видів проводяться із застосуванням морфологічних ознак, отриманих
з використанням електронної мікроскопії, а також фізіологічних та культуральних особливостей. Єдиного визначника для ідентифікації всіх грибів немає, тому спочатку визначають клас чи порядок ідентифікованого гриба і далі користуються відповідним визначником цього класу чи порядку.
Ідентифікація дріжджових грибів, які належать до широко використовуваних об'єктів різних мікробіологічних досліджень, заснована на культуральних (макроморфологічних), цитологічних, фізіолого-біохімічних особливостях, характеристиці життєвих циклів і статевого процесу, специфічних ознаках, Пов'язаних з екологією, і проводиться з використанням спеціальних визначників для дріжджів.
В основі систематики мікроскопічних форм водоростей лежить будова їх клітин та склад пігментів. Визначення систематичного становища найпростіших проводиться з використанням морфологічних особливостейта життєвих циклів. Таким чином, ідентифікація еукаріотів базується головним чином на особливостях їх морфології та циклів розвитку.
Ідентифікація прокаріотів, які морфологічно менш різноманітні, ніж еукаріоти, заснована на використанні широкого спектру фенотипічних, а в багатьох випадках генотипичних ознак. Вона більшою мірою, ніж ідентифікація еукаріотів, ґрунтується на функціональних ознаках, оскільки більшість бактерій можна ідентифікувати не за їх зовнішнім виглядом, а лише з'ясувавши, які процеси вони здатні здійснювати.
При описі та ідентифікації бактерій вивчають їх культуральні властивості, морфологію, організацію клітини, фізіолого-біохімічні особливості, хімічний складклітин, зміст
гуаніну та цитозину (ГЦ) у ДНК, послідовність нуклеотидів у гені, що кодує синтез 16S рРНК та інші фено- та генотипічні ознаки. При цьому необхідно дотримуватись наступних правил: працювати з чистими культурами, застосовувати стандартні методи дослідження, а також використовувати для інокуляції клітини, що знаходяться в активному фізіологічному стані.
2.1 Культуральні характеристики
До культуральних, або макроморфологічних властивостей відносяться характерні особливостізростання мікроорганізмів на щільних та рідких поживних середовищах.
2.1.1 Зростання на щільних живильних середовищах
На поверхні щільних живильних середовищ, залежно від посіву, мікроорганізми можуть рости у вигляді колонії, штриха або суцільного газону. Колонієюназивають ізольоване скупчення клітин одного виду, що виросло здебільшого з однієї клітини. Залежно від того, де розвивалися клітини (на поверхні щільного живильного середовища, у товщі її або на дні судини), розрізняють поверхневі, глибинніі донніколонії.
Освіта поверхніснихколоній – найістотніша особливість зростання багатьох мікроорганізмів на щільному субстраті. Такі колонії відрізняються великою різноманітністю. При їх описі враховують наступні ознаки:
профіль– плоский, опуклий, кратероподібний, конусоподібний тощо (рис. 1);
форму- Округла, амебоподібна, неправильна, ризоидная і т. д. (рисунок 2);
розмір (діаметр)- Вимірюють в міліметрах; якщо розміри колонії не перевищують 1 мм, їх називають точковими;
поверхня- Гладка, шорстка, борозенчаста, складчаста, зморшкувата, з концентричними колами або радіально смугастий;
блискі прозорість– колонія блискуча, матова, тьмяна, борошниста, прозора;
колір- безбарвна (брудно-білі колонії відносять до безбарвних) або пігментована - біла, жовта, золотиста, оранже-
вія, бузкова, червона, чорна і т. д.; особливо відзначають виділення в
субстрат пігменту; при описі колоній актиноміцетів відзначають пігментацію повітряного та субстратного міцелію, а також виділення пігментів у середу;
край- рівний, хвилястий, зубчастий, бахромчастий і т. д. (рисунок 3);
структуру– однорідна, дрібно- або крупнозерниста, струменева тощо (рисунок 4); край і структуру колонії визначають за допомогою лупи або за малого збільшення мікроскопа. І тому чашку Петрі поміщають на столик мікроскопа кришкою вниз;
консистенціювизначають, торкаючись поверхні колонії петлею. Колонія може легко зніматися з агару, бути щільною, м'якою або вростаючою в агар, слизовою (прилипає до петлі), тягучою, мати вигляд плівки (знімається повністю), бути крихкою (легко ламається при дотику петлею).
1 - вигнутий; 2 - Кратероподібний; 3 - горбистий;
4 - Вростаючий у субстрат; 5 - Плоский; 6 – опуклий;
7 – краплеподібний; 8 - конусоподібний
Малюнок 1 – Профіль колонії
Глибинні колонії,навпаки, досить однакові. Найчастіше вони на вигляд схожі на більш-менш сплющені чечевички,
у проекції мають форму овалів із загостреними кінцями. Лише
у небагатьох бактерій глибинні колонії нагадують пучки вати
з ниткоподібними виростами у живильне середовище. Утворення глибинних колоній часто супроводжується розривом щільного середовища, якщо мікроорганізми виділяють вуглекислоту чи інші гази.
Донні колоніїрізних мікроорганізмів зазвичай мають вигляд тонких прозорих плівок, що стелиться по дну.
Розміри та багато інших особливостей колонії можуть змінюватися з віком та залежать від складу середовища. Тому при їх описі вказують вік культури, склад середовища та температуру культивування.
1
- Кругла; 2
- Кругла з фестончастим краєм; 3
- Кругла з валиком по краю; 4, 5
- Ризоїдні; 6
- З ризоидним краєм; 7 – амебоподібна;
8
- Ниткоподібна; 9
- Складчаста; 10
- Неправильна;
11 - Концентрична; 12 - Складна
Малюнок 2 – Форма колонії
/ - Гладкий; 2 - хвилястий; 3 - Зубчастий; 4 – лопатевий; 5 - Неправильний; 6 - війчастий; 7 - Нитчастий; 8 - ворсинчастий; 9 – гіллястий
Малюнок 3 – Край колонії
1 - Однорідна; 2 - дрібнозерниста; 3 - крупнозерниста;
4 - Струмчаста; 5 - волокниста
Малюнок 4 – Структура колонії
При описі зростання мікроорганізмів по штрихувідзначають такі особливості: мізерний, помірний або рясний, суцільний
з рівним або хвилястим краєм, чітко подібний, що нагадує ланцюжки ізольованих колоній, дифузний, перистий, деревоподібний, або ризоїдний (рисунок 5). Характеризують оптичні властивості нальоту, його колір, поверхню та консистенцію.
Для опису колоній і зростання штрихом багато мікроорганізмів часто вирощують на м'ясопептонному агарі. Застосовують також м'ясопептонну желатину. Для кращого розгляду глибинних колоній середовища з агаром або желатиною рекомендується висвітлювати.
1 - Суцільний з рівним краєм; 2 - Суцільний з хвилястим краєм; 3 - Чіткоподібний; 4 – дифузний; 5 - Перистий; 6 - ризоїдний
Рисунок 5 – Зростання бактерій по штриху
2.1.2. Зростання в рідких живильних середовищах
Зростання мікроорганізмів у рідких живильних середовищах більш одноманітне і супроводжується помутнінням середовища, утворенням плівки або осаду. Характеризуючи зростання мікроорганізмів у рідкому середовищі, зазначають ступінь помутніння(слабка, помірна чи сильна), особливості плівки(тонка, щільна або пухка, гладка або складчаста),
а при утворенні осаду вказують убогий він або рясний, щільний, пухкий, слизовий або пластівцевий.
Нерідко зростання мікроорганізмів супроводжується появою запаху, пігментацією середовища, виділенням газу. Останнє виявляють за утворенням піни, бульбашок, а також за допомогою «поплавців» – маленьких, запаяних з одного кінця трубочок. Поплавець поміщають
у пробірку запаяним кінцем вгору перед стерилізацією середовища проживання і стежать, щоб він повністю заповнений середовищем. У разі виділення газу він накопичується в поплавці у вигляді бульбашки.
Для опису характеру зростання мікроорганізмів у рідких середовищах їх вирощують на м'ясопептонному бульйоні (МПБ) або на іншому середовищі, що забезпечує гарне зростання.
2.2 Морфологічна характеристика
Морфологічна характеристика та організація клітин бактерій включає такі ознаки, як форма та розміри клітин, їх рухливість, наявність джгутиків і тип джгутикування, здатність до спороутворення. Корисним може виявитися також виявлення у клітинах
характерних мембранних систем (хлоросом, карбоксисом, фікобілісом, газових вакуолей і т. д.), властивих окремим групам бакте-
рій, а також включень (параспоральних тілець, гранул волютину,
полі-β-гідроксибутирату, полісахаридів і т. д.). Першорядне значення для систематики бактерій надається фарбуванню клітин за Грамом
та будову їх клітинних стінок.
2.3 Фізіолого-біохімічні властивості
Вивчення фізіолого-біохімічних властивостей включає, перш за все, встановлення способу харчування досліджуваної бактерії (фото/хемо-, авто/гетеротрофія) та типу енергетичного метаболізму (здатність до бродіння, аеробного або анаеробного дихання або фотосинтезу). Важливо визначити такі ознаки, як відношення бактерії до молекулярного кисню, температури, рН середовища, солоності, освітленості та інших факторів середовища. У цю групуознак
входить також перелік субстратів, що утилізуються як джерела вуглецю, азоту та сірки, потреба у вітамінах та інших факторах росту, утворення характерних продуктів метаболізму, наявність деяких ферментів. І тому використовують спеціальні тести.
Багато тестів, які застосовуються виявлення перелічених ознак (їх іноді називають рутинними тестами), важливі для діагностики і широко використовуються в медичній мікробіології. Їхня постановка вимагає значних витрат часу, великої кількості складних середовищ та реактивів, дотримання стандартних умов проведення, акуратності виконання. Для прискорення та полегшення процесу ідентифікації деяких мікроорганізмів, що мають головним чином медичне значення, розроблені різні тест-системи, наприклад системи Oxi/Ferm Tube, Mycotube та Enterotube II фірми Hoffmann-La Roche (Швейцарія) та ін. Так, система Enterotube II, призначена для ідентифікації ентеробактерій, є пластиковою камерою з 12 осередками, що містять пофарбовані діагностичні середовища. Засівання всіх середовищ проводиться поступально-обертальними рухами через камеру голки з посівним матеріалом. Інкубацію проводять протягом 24 годин при температурі 37 ºС. Про позитивний чи негативний результат тесту судять щодо зміни кольору середовища, розриву агару (тест на газоутворення) або після введення спеціальних реактивів (тест на утворення індолу, реакція Фогес-Проскау-ера). Кожну ознаку позначають певною цифрою, тому отримані дані можна ввести до комп'ютера з відповідною програмою та отримати відповідь про таксономічне становище досліджуваного штаму.
Визначення складу клітин бактерій також має значення їх систематики (хемосистематика). Хемотаксономічні методи можуть бути важливими, зокрема, для тих груп бактерій, у яких морфологічні та фізіологічні характеристикишироко варіюються та недостатні для проведення їх задовільної ідентифікації. До складу клітинних стінок різних прокаріотіввходить кілька класів унікальних гетерополімерів: муреїн (або псевдомуреїн), ліпополісахариди, міколові та тейхоєві кислоти. Склад клітинної стінки визначає серологічні властивості бактерій. Це є основою імунохімічних методів їх ідентифікації.
Як хемотаксономічний маркер іноді використовують також ліпідний і жирнокислотний склад клітин бактерій. Інтенсивне вивчення жирних кислот стало можливим із розвитком методу газохроматографічного аналізу. Відмінності у складі ліпідів використовують із ідентифікації бактерій лише на рівні роду і навіть виду. Цей метод, однак, має певні обмеження, оскільки вміст жирних кислот у клітинах може залежати від умов культивування та віку культури.
У систематиці деяких бактерій враховується склад хінонів
та інших переносників електронів, а також пігментів.
Важлива інформація про взаємну спорідненість бактерій може бути отримана щодо клітинних білків – продуктів трансляції генів. З вивчення мембранних, рибосомних, сумарних клітинних білків, і навіть окремих ферментів сформувалося новий напрямок – білкова таксономія. Спектри рибосомних білків відносяться до найбільш стабільних і використовуються для ідентифікації бактерій на рівні сімейства або порядку. Спектри мембранних білків можуть відображати родові, видові та навіть внутрішньовидові відмінності. Проте характеристики хімічних сполукКлітини не можуть використовуватися для ідентифікації бактерій ізольовано від інших даних, що описують фенотип, оскільки немає критерію оцінки значущості фенотипічних ознак.
Іноді для ідентифікації бактерій або інших мікроорганізмів, наприклад, дріжджів, використовують метод нумеричної (або адансонівської) таксономії. В її основі лежать ідеї французького ботаніка М. Адансона (M. Adanson), який запропонував різні фенотипічні ознаки, що піддаються обліку, вважати рівноцінними, що дозволяє кількісно висловити таксономічні дистанції між організмами у вигляді відношення числа позитивних ознак до загального вивчених. Подібність між двома досліджуваними організмами визначається шляхом кількісної оцінки можливо більшого числа (зазвичай не менше ста) фенотипічних ознак, які підбираються так, щоб їх варіанти були альтернативними і могли позначатися знаками "мінус" та "плюс". Ступінь подібності встановлюється на підставі кількості збігаються ознак і виражається у вигляді коефіцієнта відповідності S:
де a + d- Сума ознак, за якими штами А і В збігаються;
а– обидва штами з позитивними ознаками;
d- Обидва з негативними;
b- Сума ознак, за якими штам А позитивний, В негативний;
з- Сума ознак, за якими штам А від'ємний, штам В позитивний.
Значення коефіцієнта відповідності може змінюватися від 0 до 1. Коефіцієнт 1 означає повну ідентичність, 0 повна відмінність. Оцінки комбінацій ознак провадяться за допомогою комп'ютера. Отримані результати подають у вигляді матриці подібності та/або у вигляді дендрограми. Нумерична таксономія може застосовуватися в оцінці подібності між таксонами мікроорганізмів лише невисокого рангу (пологи, види). Вона не дозволяє робити безпосередні висновки щодо генетичної спорідненості мікроорганізмів, проте певною мірою відображає їх філогенетичні властивості. Так, встановлено, що фенотипічні ознаки бактерій, що піддаються вивченню нині, відбивають від 5 до 20 % властивостей їхнього генотипу.
2.4 Вивчення генотипу
Вивчення генотипу мікроорганізмів стало можливим у результаті успішного розвитку молекулярної біології та призвело до виникнення геносистематики. Дослідження генотипу, засноване на аналізі нуклеїнових кислот, у принципі дає змогу побудувати згодом природну (філогенетичну) систему мікроорганізмів. Філогенетичні взаємини бактерій оцінюють визначенням молярного змісту гуаніну та цитозину (ГЦ) у ДНК, методами ДНК–ДНК та ДНК–рРНК-гібридизації, за допомогою ДНК-зондів, а також вивченням послідовності нуклеотидів в 5S,
J6
Sі
23
S рРНК.
2.4.1 Визначення молярного вмісту ГЦ
Визначення молярного вмісту ГЦ від загальної кількостіоснов ДНК у прокаріотів, як уже вказувалося, коливається від 25 до 75%. Кожен вид бактерій має ДНК із характерним середнім вмістом ГЦ. Однак оскільки генетичний код вироджений, а генетичне кодування засноване не тільки на вмісті нуклеотидних основ в одиницях кодування (триплетах), але і на взаємному розташуванні, однаковий середній вміст ГЦ в ДНК двох видів бактерій може супроводжуватися їх значним генотипічним
поділом. Якщо два організми дуже близькі за нуклеотидним складом, то це може бути свідченням їхньої еволюційної спорідненості тільки за умови, що вони мають велику кількість загальних фенотипічних ознак або генетичну подібність, підтверджену іншими методами. У той самий час розбіжність (понад 10…15 %) в нуклеотидному складі ДНК двох штамів бактерій із загальними фенотиповими властивостями показує, що вони ставляться, по крайнього заходу, до різних видів.
2.4.2 Метод ДНК –ДНК-гібридизації
Даний метод є важливішим для оцінки генетичної спорідненості бактерій. При ретельному проведенні експериментів можна отримати цінну інформацію про ступінь їхньої генетичної гомології. Усередині одного виду бактерій ступінь генетичної гомології штамів сягає від 70 до 100%. Однак якщо в результаті еволюційної дивергенції послідовності нуклеотидних основ геномів двох бактерій різняться більшою мірою, то специфічна реасоціація ДНК-ДНК стає такою слабкою, що не піддається виміру. У такому разі гібридизація ДНК-рРНК дозволяє значно збільшити коло організмів, у яких можна визначити ступінь генетичної гомології завдяки тому, що на відносно невеликій ділянці бактеріального геному, що кодує рибосомні РНК, вихідна послідовність основ зберігається значно повніше, ніж на інших ділянках хромосоми. Через війну шляхом ДНК–рРНК-гибридизации нерідко виявляють досить високу гомологію геномів бактерій, які реасоціація ДНК–ДНК не виявляє помітної гомології.
2.4.3 Метод ДНК-зондів (генних зондів)
Метод ДНК-зондів є різновидом методу молекулярної гібридизації ДНК-ДНК. Реакція гібридизації ведеться в цьому випадку не між двома препаратами тотальної ДНК, а між фрагментом нуклеотидної послідовності ДНК (зондом), що включає ген (генетичний маркер), відповідальний за якусь певну функцію (наприклад, стійкість до якогось антибіотика), та ДНК бактерії, що вивчається. Найпоширенішим способом створення генних зондів є виділення специфічних фрагментів шляхом молекулярного клонування. Для цього спочатку створюють банк генів бактерії, що вивчається, розщепленням її ДНК ендонуклеазами.
рестрикції, а потім відбирають потрібний клон із суми фрагментів ДНК методом електрофорезу з подальшою перевіркою генетичних властивостей цих фрагментів методом трансформації. Далі вибраний фрагмент ДНК лігують до складу відповідної плазміди (вектора),
а цю комбіновану плазміду вводять у зручний для роботи штам бактерій (наприклад, Escherichia coli).
З біомаси бактерії, що несе ДНК-зонд, виділяють плазмідну ДНК і мітять її, наприклад, радіоізотопною міткою. Потім здійснюють гібридизацію ДНК-зонда.
з ДНК бактерії. Гібридні ділянки, що утворилися, виявляють методом авторадіографії. За відносною частотою гібридизації генетичного маркера з хромосомою тієї чи іншої бактерії роблять
висновок про генетичну спорідненість цих бактерій з досліджуваним штамом.
2.4.4 Метод аналізу нуклеотидних послідовностей
в рибосомальних РНК
Для ідентифікації бактерій та створення філогенетичної системи їх класифікації найбільш широке поширення та значення отримав метод аналізу нуклеотидних послідовностей у рибосомальних РНК. Молекули 5S, 16S та 23S рРНК містять ділянки з найвищим ступенем генетичної стабільності. Вважають, що вони перебувають поза механізмом дії природного відборута еволюціонують тільки в результаті спонтанних мутацій, що відбуваються із постійною швидкістю. Накопичення мутацій залежить тільки від часу, тому інформація про нуклеотидну послідовність цих молекул вважається найбільш об'єктивною для визначення філогенетичної спорідненості організмів на рівні від підвиду до царства. У разі аналізу
5S рРНК зазвичай визначають повну послідовність нуклеотидів, яка у цій молекулі у прокаріотів становить 120 нуклеотидів. При дослідженні 16S та 23S рРНК, що містять 1500 та 2500 нуклеотидів відповідно, часто проводять аналіз олігонуклеотидів, отриманих з цих молекул за допомогою специфічних ендонуклеаз рестрикції. Найбільшого поширення набуло вивчення послідовності нуклеотидів в 16S рРНК. Вивчення структури 16S рРНК представників різних мікроорганізмів призвело до виявлення серед прокаріотів групи архей. Значення коефіцієнта подібності SAB,
що відокремлюють I6S рРНК бактерій та архей, лежать у межах 0,1, у той час як значення SAB,
рівне 1,0, відповідає повній гомології нуклеотидних послідовностей, а 0,02 – рівню випадкового збігу.
Все частіше для ідентифікації бактерій пропонують дендрограми, що показують взаємовідносини між бактеріальними пологами, видами або штамами на підставі вивчення послідовності нуклеотидів (або олігонуклеотидів) у рРНК, а також ДНК-ДНК
та ДНК-рРНК гібридизації. Проте ідентифікація бактерій до пологів виходячи з лише генетичних методів без попереднього вивчення їх фенотипічних характеристик часто взагалі неможлива. Тому найкращим підходом у роботі з систематики бактерій вважається вивчення як генотипічних, і фенотипических властивостей. У разі невідповідності між філогенетичними та фенотиповими даними пріоритет тимчасово віддають останнім.
Особливою проблемою є ідентифікація таких бактерій та архей, особливо морських видів, які не здатні рости на відомих лабораторних поживних середовищах і для яких не можна було отримати чисту культуру. Донедавна ця проблема видавалася нерозв'язною. Однак близько 15 років тому були розроблені методи, що дозволили екстрагувати, клонувати, секвенувати
і порівнювати рибосомні РНК безпосередньо з навколишнього середовища. Це дозволило точно порахувати та ідентифікувати мікроорганізми, що населяють даний біотоп без їх виділення у чисту культуру. Ідентифікований таким чином «некультивований» в лабораторії мікроорганізм може бути описаний, але з приєднанням слова «candidatus» (кандидат). Слово «candidatus» супроводжуватиме новий вигляд доти, доки вченими не буде знайдено умов культивування цього організму в лабораторії і не буде отримано його чисту культуру, що дозволить вивчити всі його властивості та опублікувати як узаконене.
Ідентифікацію бактерій проводять зазвичай за допомогою «Визначника бактерій Берджі» (Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology). Перше видання цього посібника було здійснено в 1923 р. під керівництвом відомого американського бактеріолога Д. Берджі (D. H. Bergey, 1860-19). досі воно регулярно перевидається за участю провідних вчених-мікробіологів світу.В останньому, дев'ятому виданні визнач, всі бактерії розділені на 35 груп за фенотиповими ознаками, що легко визначаються.
у назві груп. Таксономічне положення бактерій усередині груп визначається за допомогою таблиць та ключів, складених на основі невеликої кількості фенотипічних ознак. Диференціювальні таблиці для диференціації видів бактерій деяких пологів, наприклад роду Bacillus,
не наводяться, а читач посилається до «Керівництва Берджі щодо систематики бактерій».
У чотиритомному «Посібнику Берджі з систематики бактерій» (Bergey"s Manual of Systematic Bacteriology, 1984-1989) міститься більше повна інформаціяпро таксономічне становище бактерій. Для кожної групи бактерій дається опис пологів, що входять до нього.
та видів, у тому числі з незрозумілим таксономічним статусом. Крім докладного фенотипного опису, що включає морфологію, організацію та хімічний склад клітин, антигенні властивості, вид колоній, особливості життєвого циклу та екології, у характеристиці пологів наводяться також відомості про вміст ГЦ у ДНК, результати гібридизації ДНК-ДНК та ДНК-рРНК. Ключі та таблиці дозволяють ідентифікувати бактерії не тільки до роду, а й до вигляду.
В даний час вийшло у світ друге видання чотиритомного «Посібника Берджі з систематики бактерій» (Bergcy"s Manual of Systematic Bacteriology). У 2002 р. вийшов перший том. Крім цього є ряд статей і книг, в яких пропонуються оригінальні ключі для ідентифікації окремих групбактерій, наприклад, бацил, псевдомонад, актиноміцети, ентеробактерії.
В даний час накопичилося багато нових даних, у тому числі отриманих в результаті аналізу нуклеотидних послідовностей рибосомальних РНК, про вивчені раніше і знову виділені види бактерій. На підставі цих відомостей видовий склад деяких груп бактерій, наприклад роду Bacillus, буде переглянуто: частина видів залишиться у складі роду Bacillus, а деякі утворюють нові пологи або будуть віднесені до інших бактерій, що вже існують. Слід зазначити також, що для опису нових штамів бактерій вивчають, як правило, більше ознак, ніж необхідно для їх ідентифікації, оскільки ключі та таблиці включають не всі ознаки бактерій, що ідентифікуються, а тільки ті, які відрізняються у різних видів (таблиця 1).
Таблиця 1 - Мінімальний перелік даних, необхідних для
описи нових штамів бактерій (за H. Truper, K. Schleifer, 1992)
Властивості | Основні ознаки | Додаткові ознаки |
Морфологія клітин | Форма; розмір; рухливість; всередині - та позаклітинні структури; взаємне розташування клітин; клітинне диференціювання; тип клітинного поділу; ультраструктура клітини | Колір; характер джгутикування; суперечки; капсули; чохли; вирости; життєвий цикл; гетероцисти; ультраструктура джгутиків, оболонки та клітинної стінки |
Продовження таблиці 1
Характер зростання | Особливості зростання на щільних та рідких поживних середовищах; морфологія колоній | Колір колоній, суспензії |
Кислотостійкість; забарвлення суперечка, джгутиків |
||
Склад клітини | склад ДНК; запасні речовини | Гомологія нуклеїнових кислот; клітинні пігменти; склад клітинної стінки; типові ферменти |
Фізіологія | Ставлення до температури; до рН середовища; тип метаболізму (фототроф, хемотроф, літотроф, органотроф); ставлення до молекулярного кисню; акцептори електронів; джерела вуглецю; джерела азоту; джерела сірки | Потреба у солях чи осмотичних факторах; потреба у чинниках зростання; типові продукти метаболізму (кислоти, пігменти, антибіотики, токсини); стійкість до антибіотиків |
Екологія | Умови проживання | Патогенність; коло господарів; освіту антигенів; серологія; сприйнятливість до фагів; симбіоз |
3 ЛАБОРАТОРНА РОБОТА «ІДЕНТИФІКАЦІЯ
МІКРООРГАНІЗМІВ»
Мета роботи: знайомство з основними засадами визначення мікроорганізмів. У процесі виконання лабораторної роботи кожен студент вивчає властивості бактерій, необхідні опису бактеріального штаму та ідентифікації його рівня роду.
Завдання
1. Визначити чистоту бактерії, що ідентифікується, і вивчити морфологію її клітин.
2. Описати культуральні характеристики.
3. Вивчити цитологічні властивості бактерій, що ідентифікуються.
4. Вивчити фізіолого-біохімічні властивості ідентифікованих бактерій.
5. Визначити чутливість бактерій до антибіотиків.
6. Заповнити таблицю та підбити підсумки.
3.1 Визначення чистоти бактерії, що ідентифікується.
та вивчення морфології її клітин
Для проведення роботи з ідентифікації мікроорганізмів кожен студент отримує одну культуру бактерій (на скошеному агаризованому середовищі у пробірці), яку потім перевіряє на чистоту. Це здійснюють декількома способами: візуально, висівом на живильні середовища та мікроскопією.
Характер зростанняотриманої бактерії переглядають штрихом на поверхні скошеного агаризованого середовища. Якщо зростання по штриху неоднорідне, то культура забруднена. Потім культуру відсівають у пробірку на скошене середовище (м'ясопептонний агар) для використання
у подальшій роботі, а також роблять розсівання на поверхню твердого середовища в чашці Петрі методом виснажливого штриха для перевірки на чистоту (по однорідності колоній, що виросли). Засіяні пробірки та чашки поміщають у термостат при температурі 30 ºС на час від 2 до 3 діб. Залишок вихідної культури бактерії в пробірці використовують для перевірки на чистоту методом мікроскопії (за морфологічною однорідністю популяції), а також вивчення форми, взаємного розташування, рухливості клітин та їх розмірів. Мікроскопують культуру з використанням препаратів «роздавлена крапля» та препарату фіксованих, забарвлених фуксином клітин. Результати вносять у таблицю, складену формою таблиці 2.
Таблиця 2 – Властивості ідентифікованої бактерії
Властивості | Ознаки | Результати |
Культуральні властивості | ||
Розмір, мм | ||
Поверхня | ||
Структура | ||
Консистенція | ||
Морфологія клітин та | Форма та розташування клітин | |
Рухливість | ||
Наявність ендоспор | ||
Забарвлення за Грамом | ||
Забарвлення на кислотостійкість | ||
Фізіолого-біохімічні властивості | Ставлення до молекулярного кисню | |
Зростання на середовищі з глюкозою | ||
Зростання на середовищі з желатиною | ||
Зростання на середовищі з молоком | ||
Зростання на середовищі з крохмалем | ||
Тест на каталазу | ||
Чутливість до антибіотиків |
3.2 Культуральні властивості
На наступному занятті переглядають чашку Петрі, засіяну суспензією бактерії, що ідентифікується. Критерієм чистоти культури є однорідність колоній, що виросли. Описують культуральні властивості бактеріальних колоній відповідно до розділу.
брухт 2.1 та результати вносять до таблиці 2.
3.3 Вивчення цитологічних властивостей бактерій, що ідентифікуються.
3.3.1 Наявність ендоспор
Невелика кількість клітин з твердого середовища поміщають петлею на предметне скло в краплю водопровідної води та роблять мазок. Мазок висушують на повітрі, фіксують у полум'ї пальника і наносять на нього 5% розчин хромової кислоти. Через 5...10 хв її змивають водою. Препарат накривають смужкою фільтрувального паперу та рясно змочують папір карболовим фуксином Цилю. Підігрівають препарат над полум'ям до появи пари (не до кипіння), потім відводять його убік і додають нову порцію барвника. Цю процедуру проводять протягом 7 хв. Важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихав. Після охолодження її знімають, препарат промивають водою і ретельно промокають фільтрувальною папером.
Якщо всі операції зроблено правильно, забарвлення виходить контрастним, і яскраво-червоні суперечки чітко виділяються на блакитному тлі цитоплазми.
3.3.2 Забарвлення за Грамом
3.3.2.1 На знежиреному предметному склі в краплі води роблять тонкий мазок, щоб клітини рівномірно розподілялися по поверхні скла та не утворювали скупчень.
3.3.2.2 Препарат висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника та забарвлюють протягом 1...2 хв карболовим генціановим або кристалічним фіолетовим.
3.3.2.3 Потім барвник зливають і мазки обробляють 1...2 хв. розчином Люголя до почорніння.
3.3.2.4 Зливають розчин Люголя, препарат знебарвлюють протягом 0,5...1,0 хв 96%-ним етиловим спиртомта швидко промивають водою.
3.3.2.5 Додатково фарбують протягом 1...2 хв водним фуксином.
3.3.2.6 Барвник зливають, промивають водою і висушують.
3.3.2.7 Мікроскопують з імерсійною системою.
При правильному фарбуванні грампозитивні бактерії мають синьо-фіолетовий, грамнегативний. – рожево-червоний колір.
Для отримання достовірних результатів необхідно готувати мазки для фарбування за Грамом з молодих, активно зростаючих (зазвичай однодобових) культур, оскільки клітини із старих культур іноді дають нестійку реакцію за Грамом. Грамнегативні бактерії можуть виглядати як грампозитивні, якщо бактеріальна плівка (мазок) занадто товста та знебарвлення спиртом не проведено до кінця. Грампозитивні бактерії можуть бути грамнегативними, якщо мазок перезнебарвлений спиртом.
3.3.3 Забарвлення на кислотостійкість
На знежиреному предметному склі в краплі води готують мазок досліджуваної бактерії. Препарат висушують на повітрі та фіксують над полум'ям пальника. На мазок поміщають фільтрувальну бамагу, заливають препарат карболовим фуксином Циля і 2-3 рази підігрівають його до появи пари, тримаючи предметне скло за допомогою пінцету високо над полум'ям пальника. За появою парів спостерігають, дивлячись на мазок збоку, і при появі відразу відставляють
препарат убік. Дають препарату охолонути, знімають фільтрувальний папір, зливають барвник і мазок промивають водою. Потім
клітини знебарвлюють 5%-ним розчином кислоти. Для цього предметне скло занурюють 2-3. рази на склянку із сірчаною кислотою,
не затримуючи його у ній. Препарат знову ретельно промивають водою і дофарбовують від 3 до 5 хв метиленовим синім (за Леффлером). Фарбу зливають, промивають водою, висушують і розглядають з імерсійною системою. При правильному фарбуванні клітини кислотостійких бактерій мають червоний колір, а некислотостійких – синій.
3.3.4 Визначення рухливості
Роблять посів досліджуваної культури в стовпчик 0,2...0,5% напіврідкого агару методом уколу. Для того щоб особливості зростання виявилися найбільш чітко, прокол роблять у безпосередній близькості від стінки пробірки. Посів ставлять у термостат на 24 години. Зроблений таким чином посів дає можливість виявити та відокремити рухливі мікроорганізми від нерухомих.
Нерухомі форми бактерій ростуть по лінії уколу, утворюючи невеликі вирости циліндричної чи конічної форми. Навколишнє середовище залишається зовсім прозорим. Рухливі мікроби при такому посіві викликають виражене помутніння, що поширюється більш менш рівномірно по всій товщі середовища.
3.4 Вивчення фізіолого-біохімічних властивостей
ідентифікованих бактерій
3.4.1 Ставлення до молекулярного кисню
По відношенню до молекулярного кисню мікроорганізми ділять на чотири групи: облігатні аероби, мікроаерофіли, факультативні аероби (анаероби) та облігатні аероби. Щоб судити
про приналежність мікроорганізмів до тієї чи іншої групи, мікробну суспензію висівають у пробірки з розплавленою і остудженою до температури 45 ºС агаризованим живильним середовищем. Посів можна проводити і уколом. Суворі аеробиростуть на поверхні середовища та у верхньому шарі, мікроаерофіли- На деякій відстані від поверхні. Факультативні анаеробизазвичай розвиваються по всій товщі середовища. Суворі анаеробиростуть лише у глибині середовища, біля самого дна пробірки (рисунок 6).
|
1 - аероби; 2 - Мікроаерофіли; 3 - Факультативні анаероби;
4 – анаероби
Рисунок 6 – Зростання мікроорганізмів при посіві уколом ( а) і при посіві в розплавлене щільне середовище ( б)
3.4.2 Зростання на середовищі з глюкозою та пептоном
Культуру вносять стерильною петлею у рідке середовище, що містить: 5,0 г/л пептону, 1,0 г/л К2НР04, 10,0 г/л глюкози, 2 мл бромтимолового синього (1,6%-ного спиртового розчину), дистильовану воду, розлиту в пробірки (8-10 мл) з поплавцями. Тривалість культивування 7 діб у термостаті за температури 30 °С. Зростання мікроорганізмів або його відсутність визначають за помутнінням середовища, утворення плівки або осаду. Зміна кольору індикатора (бромтимолового синього) вказує на утворення кислих (жовте забарвлення середовища) або лужних (синє забарвлення середовища) продуктів метаболізму. Про утворення газу свідчить накопичення їх у поплавці. Результати спостережень порівнюють із стерильним середовищем.
3.4.3 Зростання на середовищі з желатиною
Активність у мікроорганізмів позаклітинних протеолітичних ферментів визначають, використовуючи як субстрат желатину, казеїн або інші білки. Середовище з желатиною складається з м'ясопептонного бульйону (МПБ) та 10…15 % желатини (МПЗ). Посів проводять уколом.
Бактеріологічною голкою стерильно відбирають клітини мікроорганізмів з одвірка і вводять голку в товщу стовпчика МПЗ до дна пробірки.
Тривалість культивування від 7 до 10 діб за кімнатної температури. Розрідження желатин відзначають візуально. Якщо желатину розріджується, вказують інтенсивність і форму розрідження – пошарове, лійкоподібне, мішковидне, кратероподібне, реповидне, міхурове.
3.4.4 Зростання на середовищі з молоком
Висівши на «молочний агар» у чашки Петрі виробляють визначення здатності бактерій розкладати казеїн молока. Середовище складається з рівних частин стерильного знежиреного молока і стерильного 3% водного агар-агару. Бактерії висівають петлею, проводячи штрих по діаметру чашки або центру сектора, на які розділена чашка. Тривалість культивування бактерій у термостаті при температурі 30 ° С становить 7 діб. Гідроліз казеїну виявляють по зоні просвітлення середовища навколо колоній або культури мікроорганізмів, що виросла по штриху. Особливо чітко зона видно після обробки середовища з бактеріями, що виросли, розчином 5%-ї трихлороцтової кислоти. Зону гідролізу казеїну вимірюють у міліметрах від краю штриха або колонії до межі світлої зони. Чим більший діаметр світлої зони, тим вища казеїнолітична активність бактерій.
3.4.5 Зростання на середовищі з крохмалем
Висівши на агаризоване середовище з крохмалем (у чашки Петрі), що містить (г/л): пептон – 10,0; КН2Р04 – 5,0; розчинний крохмаль – 2,0; агар – 15,0; рН 6,8 – 7,0, виробляють визначення освіти мікроорганізмами амілази. Бактерії висівають петлею, проводячи штрих по діаметру чашки або центру сектора, на які розділена чашка. Тривалість культивування бактерій 7 діб у термостаті за температури 30 °С. Гідроліз крохмалю виявляють після обробки середовища з бактеріями, що виросли, розчином Люголя. Для цього на поверхню середовища наливають від 3 до 5 мл Люголю розчину. Середовище, що містить крохмаль, забарвлюється в синій колір, а зона гідролізу залишається безбарвною або набуває червоно-бурого забарвлення, якщо крохмаль гідролізувався до декстринів. Зону гідролізу крохмалю вимірюють від краю штриха (колонії) до межі світлої зони (мм). Чим більший діаметр світлої зони, тим вища активність амілази.
3.4.6 Тест на каталазу
Частину культури, що виросла, суспензують за допомогою бактеріологічної петлі в краплі 3%-ного перекису водню на предметному склі. Про наявність каталази свідчить утворення бульбашок газу, що спостерігається через 1-5 хв після внесення бактерій неозброєним оком або під мікроскопом при малому збільшенні. Можна нанести кілька крапель перекису водню безпосередньо на колонію або культуру, що виросла на скошеному агарі, і спостерігати виділення молекулярного кисню.
3.4.7 Визначення чутливості бактерій
до антибіотиків
Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків зручно визначати за допомогою готових паперових дисків, просочених певними антибіотиками. Досліджувані мікроорганізми вирощують на відповідному щільному поживному середовищі. Готують у стерильній водопровідній воді густу суспензію мікроорганізму, що вивчається шляхом змиву клітин водою з поверхні твердого живильного середовища. Працюючи біля полум'я пальника, вносять 1 мл отриманої суспензії.
в пробірку з 20 мл розплавленого та остудженого до температури 50 ºС агаризованого середовища, наприклад, з м'ясопептонним агаром (МПА). Якщо мікроорганізми вирощували в рідкому поживному середовищі, то агар вносять відповідний обсяг культури. Вміст пробірки швидко і ретельно перемішують та переливають у стерильну чашку Петрі.
Коли середовище застигне, на її поверхню поміщають папір.
диски на рівній відстані один від одного і на відстані
1,5-2,0 см від краю чашки. Чашки Петрі витримують 2 години при кімнатній температурі для кращої дифузії антибіотиків в товщу агаризованого середовища, а потім, не перевертаючи, поміщають термостат на 24 год при температурі 30 ºС. Через добу відзначають утворення зон пригнічення зростання мікроорганізмів, що досліджуються, навколо дисків. Якщо досліджувана бактерія чутлива до певних антибіотиків, навколо дисків виявляються зони відсутності зростання культури. Діаметр зони придушення зростання вимірюють міліметровою лінійкою та записують результати до таблиці 3. Зона понад 30 мм свідчить
про високу чутливість мікроорганізмів до антибіотика, а менше 12 мм – про слабку чутливість.
Коли у розпорядженні експериментатора є розчини
антибіотичних речовин або культуральні рідини, що містять
антибіотик, використовують метод із застосуванням лунок у товщі агару.
У цьому випадку в застиглому агаризованому середовищі, засіяному випробуваним мікроорганізмом, стерильним пробковим свердлом (діаметр від 6 до 8 мм) роблять лунки на відстані 1,5...2,0 см від краю чашки.
У лунки вносять розчини антибіотиків чи культуральну рідину. Цей метод дозволяє виявити здатність до утворення антибіотичних речовин мікроорганізмами, вирощеними в рідкому середовищі.
Таблиця 3 – Дія антибіотиків на зростання бактерій
Антибіотик | Діаметр зон придушення росту, мм |
Диск із пеніциліном | |
Диск із левоміцетином |
4 КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ
1. Дайте визначення наступних термінів:
- Штам; автентичний штам; типовий штам;
– колонія;
– культуральні властивості;
- Таксономія;
- Класифікація;
- Номенклатура;
- Плазміда;
- Фаготипування.
2. Які розділи включає систематика мікроорганізмів? Дайте їхню характеристику.
3. Чому існуючі системи класифікації мікроорганізмів носять штучний характер?
5. За якими ознаками різняться різні штами одного виду мікроорганізму?
6. Які таксономічні категорії мікроорганізмів належать до обов'язкових, а які до необов'язкових?
7. Перерахуйте основні правила номенклатури мікроорганізмів.
8. У чому основна мета ідентифікації мікроорганізмів?
9. Чим відрізняються принципи класифікації та ідентифікації різних груп прокаріотів та еукаріотів?
10. Які властивості вивчають при описі та ідентифікації бактерій?
11. Які ознаки враховують при описі поверхневих, глибинних та донних колоній мікроорганізмів?
12. Які особливості відзначають при описі зростання мікроорганів - нізмів по штриху?
13. Що відзначають, характеризуючи зростання мікроорганізмів у рідкому поживному середовищі?
14. Які ознаки включає морфологічна характеристика та організація клітин бактерій?
15. Які фізіолого-біохімічні властивості вивчають під час ідентифікації бактерій?
16. У яких випадках необхідно використовувати хемотаксономічні методи?
17. Наведіть приклади речовин, що використовуються як хемо-таксономічні маркери?
18. У чому особливості білкової таксономії?
19. Охарактеризуйте метод нумеричної таксономії, які обмеження має?
20. Якими методами оцінюють філогенетичні взаємини бактерій?
21. У чому суть методу ДНК-зондів та його відмінність від методу
ДНК-ДНК-гібридизації?
22. Які особливості методу аналізу нуклеотидних послідовностей у рибосомальних РНК?
23. Які ознаки покладено основою класифікації бактерій у «Визначнику бактерій Берджи»?
24. Які властивості та ознаки вивчають при описі нових штамів бактерій?
25. Якими способами визначають чистоту бактерії, що ідентифікується?
26. Які основні правила виконання методики фарбування за Грамом?
27. На які групи ділять мікроорганізми стосовно молекулярного кисню?
28. Що використовують як субстрат щодо активності позаклітинних протолітичних ферментів у мікроорганізмів?
29. Які методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків ви знаєте, дайте їх характеристику.
30. Яким методом визначають утворення мікроорганізмами амілази?
31. Яким чином вироблений посів дає змогу виявити та відокремити рухливі мікроорганізми від нерухомих?
5 РЕЦЕПТИ КРАСНИКІВ І ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ
5.1 Фуксин основний карболовий (фуксин Ціля)
- 5%-ний водний розчин свіжоперегнаного фенолу - 100 мл;
- Насичений спиртовий розчин фуксину основного - 10 мл;
Приготовлену суміш через 48 годин відфільтровують.
5.2 Метиленовий синій (за Леффлером)
– насичений спиртовий розчин метиленового синього – 30 мл;
– вода дистильована – 100 мл;
- 1%-ний водний розчин КОН - 1 мл.
5.3 М'ясопептонний бульйон (МПБ)
500 г м'ясного фаршу без жиру та сухожиль заливають 1 л водопровідної водиі екстрагують при кімнатній температурі 12 год або термостаті при температурі 37 ºС – 2год, а при температурі 50 ºС – одну годину. Потім м'ясо віджимають через марлю і отриманий настій кип'ятять 30 хв. При цьому згортаються білки. Охолоджену масу фільтрують через ватний фільтр і доливають водою до початкового обсягу. Далі до 1 л м'ясного бульйону додають від 5 до 10 г пептону та 5 г кухонної солі. Середовище нагрівають до розчинення пептону, постійно помішуючи. МПБ стерилізують при тиску 2 атм 20 хвилин.
5.4 М'ясопептонний агар (МПА)
До 1 л МПБ додають 20 г агару. Середовище нагрівають до розчинення агару, потім встановлюють слаболужну реакцію середовища
20% розчином NaCO64" height="52" bgcolor="white" style="vertical-align:top;background: white">
Loading...