Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Суть методу ПЛР. ДНК-полімераза

Полімеразна ланцюгова реакція - експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє досягти значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти в біологічному матеріалі. Такий процес збільшення кількості копій ДНК називається ампліфікацією. Копіювання ДНК при ПЛР здійснюється спеціальним ферментом - полімеразою.ДНК-полимераза(Рис. 3) - фермент, що у реплікації (ампліфікації ДНК у живих організмах) ДНК. Ферменти цього класу каталізують полімеризацію дезоксирибонуклеотидів уздовж ланцюжка нуклеотидів ДНК, яку фермент "читає" і використовує як шаблон. Тип нового нуклеотиду визначається за принципом комплементарності із шаблоном, з якого ведеться зчитування.

ДНК-полімераза додає вільні нуклеотиди до 3"-кінця ланки, що збирається. Це призводить до подовження ланцюжка в напрямку 5"-3". Жодна з відомих ДНК-полімераз не здатна створити ланцюжок "з нуля": вони в змозі лише додавати нуклеотиди до вже існуючої 3"-гідроксильної групи. З цієї причини ДНК-полімераза потребує праймері- короткої послідовності нуклеотидів (частіше 20-25), комплементарної кінцевим ділянкам гена, що вивчається - до якого вона могла б додати перший нуклеотид. Праймери складаються завжди з основ ДНК і РНК, при цьому перші дві основи завжди є РНК-основи. Праймери синтезуються іншим ферментом праймазою. Ще один фермент - геліказа- необхідний для розкручування подвійної спіралі ДНК з формуванням одноланцюгової структури, яка забезпечує реплікацію обох ланцюжків відповідно до напівконсервативної моделі реплікації ДНК.

Деякі ДНК-полімерази володіють також здатністю виправляти помилки в новому ланцюжку ДНК. Якщо відбувається виявлення неправильної пари нуклеотидів, ДНК-полімераза відкочується на один крок назад, виключає неправильний нуклеотид з ланцюжка, потім вставляє на його місце правильний, після чого реплікація триває у звичайному режимі.

Проведення ПЛР

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК, за допомогою якого протягом кількох годин можна виділити та розмножити певну послідовність ДНК у мільярди разів. Можливість отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки геному значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК.

Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідне дотримання низки умов. Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні такі компоненти:

ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати.

Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагмента. (Пара штучно синтезованих олігонуклеотидів, що мають, як правило, розмір від 15 до 30 п. н., ідентичні відповідним ділянкам ДНК-мішені. Вони відіграють ключову роль в утворенні продуктів реакції ампліфікації. Правильно підібрані праймери забезпечують специфічність та чутливість тест-системи).

Термостабільна ДНК-полімераза. Полімераза, що використовується в ПЛР, повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза) та інші.

Дезоксинуклеотидтрифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Іони Mg 2+, необхідні роботи полімерази.

Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, сироватковий альбумін.

Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококипляче масло, наприклад, вазелінове. Якщо ж використовується прилад з кришкою, що підігрівається, цього робити не потрібно.

Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату, побічного продукту приєднання нуклеотидтрифосфатів до зростаючого ланцюга ДНК, до ортофосфату. Пірофосфат може пригнічувати ПЛР-реакцію.

Для збільшення кількості копій вихідної ДНК потрібна циклічність реакції. Як правило, кожен з циклів ПЛР, що послідовно повторюються, складається з трьох етапів:

1. Денатурація, чи "плавлення" ДНК.Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94 - 96?С (або до 98?З, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5 - 2 хвилини, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, оскільки руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попередній прогрів реакційної суміші протягом 2 - 5 хвилин для повної денатурації матриці та праймерів. Такий прийом називається гарячим стартомвін дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.

2. Відпал - зв'язування праймерів з матричною ДНК. Коли ланцюги розійшлися, температуру повільно знижують, щоб парймер могли зв'язатися з одноланцюжковою матрицею. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається 50-65? Час стадії – 20 – 60 секунд. Неправильний вибір температури відпалу призводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при підвищеній температурі), або до зв'язування в неправильному місці та появи неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).

3. Синтез (Елонгація ланцюга).ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як "затравку". Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3"-кінця праймера, який зв'язався з матрицею і рухається вздовж матриці. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 С. Час синтезу залежить від типу ДНК-полімерази і від довжини фрагмента, що ампліфікується.Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар підстав Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 7 – 10 хвилин.

Надалі етапи денатурації, відпалу та елонгації багаторазово повторюються (30 і більше разів). На кожному циклі кількість синтезованих копій фрагмента ДНК подвоюється.

Усі реакції проводять у пробірках, занурених у термостат. Зміна температурного режиму та його підтримка здійснюється автоматично.

Щоб зрозуміти, як саме відбувається ампліфікація певного сегмента ДНК в ході ПЛР, потрібно чітко уявити положення всіх праймерів і комплементарних їм послідовностей в ланцюгах, що ампліфікуються, в кожному раунді. У першому раунді кожен із новосинтезованих ланцюгів має набагато більшу довжину, ніж відстань від 3" -гідроксильної групи її праймера до кінцевого нуклеотиду послідовності, комплементарної другому праймеру. Такі ланцюги називають "довгими матрицями", саме на них буде йти подальший синтез.

У другому раунді дволанцюгову ДНК, що складається з подібного і новосинтезованого (довга матриця) ланцюгів, знову піддають денатурації, а потім відпалюють з праймерами. Під час синтезу в цьому раунді знову синтезуються "довгі матриці", а також кілька ланцюгів з праймером на одному кінці і з послідовністю, комплементарною другому праймеру, на іншому ("короткі матриці"). Під час третього раунду всі гетеродуплекси, що утворилися раніше, одночасно піддаються денатурації та відпалу з праймерами, а потім реплікуються. У наступних раундах "коротких матриць" стає все більше, і до 30-го раунду їх число вже в 10 6 разів перевищує число вихідних ланцюгів або "довгих матриць".

Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2 n де n - число циклів реакції. Насправді ефективність кожного циклу може бути меншою за 100%, тому насправді:

де Р – кількість продукту, Е – середня ефективність циклу.

Число "довгих" копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому в продуктах реакції домінує специфічний фрагмент. Зростання необхідного продукту у геометричній прогресії обмежене кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, утворенням побічних продуктів.

ПЛР - високочутливий метод, тому за наявності в досліджуваному зразку навіть нікчемної кількості ДНК, яка випадково потрапила з однієї реакційної суміші в іншу, можуть бути отримані хибнопозитивні результати. Це змушує ретельно контролювати всі розчини та посуд, які використовуються для ПЛР.

Основні засади підбору праймерів.

При створенні ПЛР-тест-системи одним із основних завдань є правильний підбір праймерів, які повинні відповідати низці критеріїв:

1. Праймери мають бути специфічні. Особливу увагу приділяють 3"-кінцям праймерів, тому що саме з них починає добудовувати комплементарний ланцюг ДНК Taq-полімераза. Якщо їх специфічність недостатня, то, ймовірно, що в пробірці з реакційною сумішшю відбуватимуться небажані процеси, а саме синтез неспецифічної ДНК (коротких або довгих фрагментів.) Вона видна на електрофорезі у вигляді важких або легких додаткових смуг, що заважає оцінці результатів реакції, тому що легко переплутати специфічний продукт ампліфікації із синтезованою сторонньою ДНК. до значної втрати чутливості.

2. Праймери нічого не винні утворювати димери і петлі, тобто. не повинно утворюватися стійких подвійних ланцюгів внаслідок відпалу праймерів самих на себе чи один з одним.

Який дозволяє виявити в біологічному матеріалі малі кількості точніше, певних її фрагментів, та розмножити їх у багато разів. Потім їх ідентифікують візуально шляхом електрофорезу в гелі. Реакція була розроблена у 1983 р. К. Муллісом та включена до списку видатних відкриттів останніх років.

Які механізми ПЛР

Вся методика базується на здібності нуклеїнових кислот до самостійної реплікації, що в даному випадку проводиться штучно за умов лабораторії. Відтворення ДНК може початися не в будь-якій ділянці молекули, а тільки в ділянках з певною послідовністю нуклеотидів - стартових фрагментах. Щоб полімеразна ланцюгова реакція почалася, потрібні праймери (або ДНК-зонди). Це короткі фрагменти ланцюжка ДНК із заданою нуклеотидною послідовністю. Вони комплементарні (тобто відповідні) стартовим ділянкам

Зрозуміло, щоб створити праймери, вчені повинні вивчити послідовність нуклеотидів тієї, що бере участь у методиці. Саме ці ДНК-зонди забезпечують специфічність реакції та її ініціацію. не піде, якщо в зразку не знайдеться хоча б одна молекула ДНК, що шукається. В цілому, для проведення реакції необхідні вищезазначені праймери, набір нуклеотидів, термостійка ДНК-полімераза. Остання є ферментом - каталізатором реакції синтезу нових молекул нуклеїнової кислоти на основі зразка. Всі ці речовини, включаючи біологічний матеріал, у якому необхідно виявити ДНК, поєднуються в реакційну суміш (розчин). Вона міститься в спеціальний термостат, що виконує її дуже швидке нагрівання та охолодження за заданий час - цикл. Зазвичай їх 30-50.

Як проходить ця реакція

Сутність її в тому, що під час одного циклу праймери приєднуються до потрібних ділянок ДНК, після чого йде подвоєння під дією ферменту. На основі ниток ДНК, що вийшли, в наступних циклах синтезуються нові і нові ідентичні фрагменти молекули.

Полімеразно-ланцюгова реакція йде послідовно, виділяють наступні її стадії. Перша характеризується подвоюванням кількості продукту протягом кожного циклу нагрівання та охолодження. На другій стадії відбувається уповільнення реакції, оскільки фермент ушкоджується, а також втрачає активність. Крім цього, виснажуються запаси нуклеотидів та праймерів. На останній стадії плато продукти більше не накопичуються, оскільки реактиви закінчилися.

Де її застосовують

Безсумнівно, найширше застосування полімеразна ланцюгова реакція знаходить у медицині та науці. Її використовують у загальній та приватній біології, ветеринарній медицині, фармації та навіть екології. При цьому в останній це роблять для відстеження якості продуктів харчування та об'єктів зовнішнього середовища. Активно застосовується полімеразна ланцюгова реакція в криміналістичній практиці для підтвердження батьківства та ідентифікації особи людини. У судово-медичній експертизі, так само, як і в палеонтології, часто ця методика є єдиним виходом, тому що зазвичай для дослідження є дуже мала кількість ДНК. Безумовно, дуже широке застосування метод знайшов у практичній медицині. Він необхідний у таких її областях, як генетика, інфекційні та онкологічні захворювання.

Однак на той час ця ідея залишилася незатребуваною. Полімеразна ланцюгова реакція була знову відкрита в 1983 Кері Маллісом. Його метою було створення методу, який би дозволив ампліфікувати ДНК у ході багаторазових послідовних подвоєння вихідної молекули ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Через 7 років після опублікування цієї ідеї, 1993 р., Малліс отримав за неї Нобелівську премію.

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання - охолодження доводилося додавати реакційну суміш ДНК-полимеразу , оскільки вона швидко інактивувалася при високій температурі, необхідної для розділення ланцюгів спіралі ДНК. Процедура була дуже неефективною, вимагала багато часу та ферменту. У 1986 р. вона була суттєво покращена. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази з термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити та автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій. Thermus aquaticusі названа Taq-полімеразою. Недолік цієї полімерази полягає в тому, що ймовірність внесення помилкового нуклеотиду у неї досить висока, тому що цей фермент відсутні механізми виправлення помилок (3"→5" екзонуклеазна активність). Полімерази Pfuі Pwo, виділені з архей , мають такий механізм, їх використання значно зменшує число мутацій в ДНК, але швидкість їх роботи (процесивність) нижче, ніж у Taq. Зараз застосовують суміші Taqі Pfu, щоб досягти одночасно високої швидкості полімеризації та високої точності копіювання.

У момент винаходу методу Малліс працював у компанії Цетус (en:Cetus Corporation), яка і запатентувала метод ПЛР. У 1992 році Цетус продала права на метод та патент на використання Taq-полімерази компанії Хофман-Ла Рош (en:Hoffmann-La Roche) за 300 млн доларів. Однак виявилося, що Taq-Полімераза була охарактеризована російським біохіміком Олексієм Калєдіним в 1980 році, у зв'язку з чим компанія Промега (Promega) намагалася в судовому порядку змусити Рош відмовитися від виняткових прав на цей фермент. Американський патент на метод ПЛР закінчився у березні 2005 р.

Проведення ПЛР

Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах ( in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня у досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК у живих організмах (реплікації), за допомогою ПЛР ампліфікуються відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp). За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок та за певних умов довжина ПЛР-фрагменту може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше за довжину хромосомної ДНК еукаріотичної клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд пар основ.

Компоненти реакції

Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні такі компоненти:

ДНК-матрицямістить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати .
Два праймери, комплементарні протилежним кінцям різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК
Термостабільна ДНК-полімераза- фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів. Thermus aquaticus(Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus(Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полімераза) та інші.
Дезоксинуклеозидтрифосфати(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Іони Mg 2+ необхідні для роботи полімерази.
Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, бичачий сироватковий альбумін.

Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококипляче масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з кришкою, що підігрівається, цього робити не потрібно.

Праймери

Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею та праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18-30 основ. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюжкової матриці і обмежує початок і кінець ділянки, що ампліфікується.

Після гібридизації матриці з праймером (відпал) останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюга матриці (див. ).

Найважливіша характеристика праймерів – температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця. T m це температура, за якої половина ДНК-матриць утворює комплекс з олігонуклеотидним праймером. Температуру плавлення можна визначити за формулою , де n X - кількість нуклеотидів Х в праймері. У разі неправильного вибору довжини та нуклеотидного складу праймера або температури відпалу можливе утворення частково комплементарних комплексів з іншими ділянками матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення обмежена оптимумом температури дії полімерази, активність якої знижується при температурах вище 80 °C.

При виборі праймерів бажано дотримуватись наступних критеріїв:

Ампліфікатор

Мал. 1: Ампліфікатор для проведення ПЛР

ПЛР проводять в ампліфікаторі - приладі, який забезпечує періодичне охолодження та нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 °C. Сучасні ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, у тому числі з можливістю «гарячого старту», Touchdown ПЛР (див. нижче) та подальшого зберігання ампліфікованих молекул при 4 °C. Для ПЛР у реальному часі випускають прилади, що обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою та відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх у автоматизовані системи.

Хід реакції

Фотографія гелю, що містить маркерну ДНК (1) та продукти ПЛР-реакції (2,3). Цифрами показано довжину фрагментів ДНК у парах нуклеотидів

Зазвичай під час проведення ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен із яких складається з трьох стадій (рис. 2).

Денатурація

Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96°C (або до 98°C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, оскільки руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попередній прогрів реакційної суміші протягом 2-5 хв. для повної денатурації матриці та праймерів. Такий прийом називається гарячим стартомвін дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.

Відпал

Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з матрицею одноланцюгової. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5°С нижче за температуру плавлення. Час стадії – 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу призводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при підвищеній температурі), або до зв'язування в неправильному місці та появи неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).

Елонгація

Різновиди ПЛР

«Вкладена» ПЛР (Nested PCR (англ.)) - Застосовується для зменшення числа побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів та проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
«Інвертована» ПЛР (Inverse PCR(англ.) ) - Використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка всередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізань ДНК рестриктаз з подальшим з'єднанням фрагментів (лігування). В результаті відомі фрагменти виявляються на обох кінцях невідомої ділянки, після чого можна проводити ПЛР як завжди.
ПЛР із зворотною транскрипцією (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) – використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайною ПЛР проводять на матриці мРНК синтез одноланцюгової молекули ДНК за допомогою ревертази і отримують одноланцюжкову кДНК, яка використовується як матриця для ПЛР. Цим методом часто визначають, де коли експресуються дані гени.
Асиметрична ПЛР (англ. Asymmetric PCR) - проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно один із ланцюгів вихідної ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування та гібридизаційного аналізу. ПЛР проводиться як завжди, за винятком того, що один із праймерів береться у великій надлишку.
Кількісна ПЛР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) - використовується для швидкого вимірювання кількості певної ДНК, кДНК або РНК у пробі.
Кількісна ПЛР у реальному часі (Quantitative real-time PCR) - у цьому методі використовують флуоресцентно мічені реагенти для точного вимірювання кількості продукту реакції в міру його накопичення.
Touchdown (Stepdown) ПЛР (Touchdown PCR(англ.) ) - За допомогою цього методу зменшують вплив неспецифічного зв'язування праймерів на утворення продукту. Перші цикли проводять при температурі вище температури відпалу, потім кожні кілька циклів знижують температуру. За певної температури система пройде через смугу оптимальної специфічності праймерів до ДНК.
Метод молекулярних колоній (ПЛР у гелі, англ. Polony - PCR Colony) - акриламідний гель полімеризують з усіма компонентами ПЛР на поверхні та проводять ПЛР. У точках, що містять аналізовану ДНК, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
ПЛР із швидкою ампліфікацією кінців кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR )
ПЛР довгих фрагментів (англ. Long-range PCR) - модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10 тисяч підстав та більше). Використовують дві полімерази, одна з яких - Taq-полімераза з високою процесивністю (тобто здатна за один прохід синтезувати довгий ланцюг ДНК), а друга - ДНК полімеразу з 3"-5" ендонуклеазною активністю. Друга полімераза необхідна для того, щоб коригувати помилки, внесені першою.
RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR , ПЛР з випадковою ампліфікацією поліморфної ДНК - використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі за генетичною послідовністю організми, наприклад різні сорти культурних рослин, породи собак або близькі споріднені мікроорганізми. У цьому методі зазвичай використовують один праймер невеликого розміру (20 – 25 п.н.). Цей праймер буде частково комплементований до випадкових ділянок ДНК досліджуваних організмів. Підбираючи умови (довжину праймера, його склад, температуру та ін.), вдається домогтися задовільного відмінності картини ПЛР для двох організмів.

Якщо нуклеотидна послідовність матриці відома частково або невідома зовсім, можна використовувати вироджені праймери, Послідовність яких містить вироджені позиції, в яких можуть розташовуватися будь-які підстави. Наприклад, послідовність праймера може бути такою: …ATH… де Н - А, Т або С.

Застосування ПЛР

ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів та в наукових експериментах.

Криміналістика

ПЛР використовують для порівняння так званих «генетичних відбитків пальців». Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину – кров, слина, сперма, волосся тощо. Його порівнюють із генетичним матеріалом підозрюваного. Досить малої кількості ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, ампліфікують за допомогою ПЛР. Фрагменти поділяють за допомогою ДНК електрофорезу. Отриману картину розташування смуг ДНК і називають генетичним відбитком пальців(англ. genetic fingerprint).

Встановлення батьківства

Мал. 3: Результати електрофорезу ДНК-фрагментів, ампліфікованих за допомогою ПЛР (1) Батько. (2) Дитина. (3) Мати. Дитина успадкувала деякі особливості генетичного відбитка обох батьків, що дало новий, унікальний відбиток.

Хоча «генетичні відбитки пальців» унікальні (за винятком випадку однояйцевих близнюків), родинні зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши кілька таких відбитків (рис. 3). Той самий метод можна застосувати, трохи модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

Медична діагностика

ПЛР дає можливість суттєво прискорити та полегшити діагностику спадкових та вірусних захворювань. Потрібний ген ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів, потім секвенируют для визначення мутацій . Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні чи місяці до того, як виявляться симптоми захворювання.

Персоналізована медицина

Відомо, більшість ліків діють не так на всіх пацієнтів, котрим вони призначені, лише на 30-70 % їх числа. Крім того, багато ліків виявляються токсичними чи алергенними для частини пацієнтів. Причини цього - частково в індивідуальних відмінностях у сприйнятливості та метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються генетичному рівні. Наприклад, в одного пацієнта певний цитохром (білок печінки, що відповідає за метаболізм чужорідних речовин) може бути активнішим, у іншого - меншим. Для того, щоб визначити, який різновид цитохрому має даний пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попереднім генотипуванням (англ. prospective genotyping).

Клонування генів

Клонування генів (не плутати з клонуванням організмів) - це процес виділення генів і в результаті генноінженерних маніпуляцій отримання великої кількості продукту даного гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється в вектор- фрагмент ДНК, що переносить чужорідний ген у той самий чи інший, зручний для вирощування, організм. Як вектори використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів у чужорідний організм зазвичай використовують із отримання продукту цього гена - РНК чи, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін.

Мал. 4: Клонування гена з використанням плазміди .
(1) Хромосомна ДНК організму A. (2) ПЛР. (3) Безліч копій гена організму А. (4) Вставка гена в плазміду. (5) Плазміда з геном організму А. (6) Введення плазміди в організм В. (7) Збільшення кількості копій гена організму А в організмі Ст.

Секвенування ДНК

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом дидезоксинуклеотидів ПЛР є невід'ємною частиною, оскільки саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентною або радіоактивною міткою. Це зупиняє реакцію, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після поділу синтезованих ланцюжків у гелі.

Мутагенез

Нині ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу. Використання ПЛР дозволило спростити та прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її більш надійною та відтворюваною.

1. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

2. Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції

2.1 Наявність у реакційній суміші ряду компонентів

2.2 Циклічний температурний режим

2.3 Основні засади підбору праймерів

2.4 Ефект "плато"

3. Стадії постановки ПЛР

3.2 Ампліфікація

3.4.1 Позитивні контролі

3.4.2 Внутрішні контролі

4.1 Якісний аналіз

4.1.2 Детекція молекул РНК

3.1 Підготовка проби біологічного матеріалу

Для виділення ДНК використовують різні методики в залежності від поставлених завдань. Їх суть полягає в екстракції (вилучення) ДНК з біопрепарату та видаленні або нейтралізації сторонніх домішок для отримання препарату ДНК з чистотою, придатною для постановки ПЛР.

Стандартною і вже класичною вважається методика отримання чистого препарату ДНК, описана Мрамором. Вона включає ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацією і переосадженням ДНК спиртом. Цей метод дозволяє одержати чистий препарат ДНК. Однак він досить трудомісткий і передбачає роботу з такими агресивними речовинами, що мають різкий запах, як фенол і хлороформ.

Одним з найпопулярніших в даний час є метод виділення ДНК, запропонований Boom із співавторами. Цей метод заснований на використанні для лізису клітин сильного хаотропного агента - гуанідину тіоціонату (GuSCN), та подальшої сорбції ДНК на носії (скляні намисто, діатомова земля, скляне "молоко" і т.д.). Після відмивання в пробі залишається ДНК, сорбована на носії, з якого вона легко знімається за допомогою буфера, що елюює. Метод зручний, технологічний та придатний для підготовки зразка до ампліфікації. Однак можливі втрати ДНК внаслідок незворотної сорбції на носії, а також у процесі численних відмивок. Особливо велике значення це має під час роботи з невеликими кількостями ДНК у зразку. Крім того, навіть слідові кількості GuSCN можуть інгібувати ПЛР. Тому при використанні цього методу дуже важливим є правильний вибір сорбенту та ретельне дотримання технологічних нюансів.

Інша група методів пробопідготовки заснована на використанні іонообмінників типу Chilex, які на відміну від скла сорбують не ДНК, а навпаки, домішки, що заважають реакції. Як правило, ця технологія включає дві стадії: кип'ятіння зразка та сорбція домішок на іонообміннику. Метод надзвичайно привабливий простотою виконання. Найчастіше він придатний до роботи з клінічним матеріалом. На жаль, іноді трапляються зразки з такими домішками, які неможливо видалити за допомогою іонообмінників. Крім того, деякі мікроорганізми не піддаються руйнуванню простим кип'ятінням. У таких випадках необхідно запровадження додаткових стадій обробки зразка.

Таким чином, до вибору методу пробопідготовки слід належати до розуміння цілей проведення передбачуваних аналізів.

3.2 Ампліфікація

Для проведення реакції ампліфікації необхідно приготувати реакційну суміш і внести до неї аналізований зразок ДНК. При цьому важливо враховувати деякі особливості відпалу праймерів. Справа в тому, що, як правило, в аналізованому біологічному зразку присутні різноманітні молекули ДНК, до яких праймери, що використовуються в реакції, мають часткову, а в деяких випадках значну, гомологію. Крім того, праймери можуть відпалюватись один з одним, утворюючи праймер-димери. І те, й інше призводить до значної витрати праймерів на синтез побічних (неспецифічних) продуктів реакції та, як наслідок, значно зменшує чутливість системи. Це ускладнює або унеможливлює читання результатів реакції при проведенні електрофорезу.

3.3 Оцінка результатів реакції

Для правильної оцінки результатів ПЛР важливо розуміти, що цей метод не є кількісним. Теоретично продукти ампліфікації одиничних молекул ДНК-мішені можуть бути виявлені за допомогою електрофорезу після 30-35 циклів. Однак на практиці це виконується лише у випадках, коли реакція проходить в умовах, близьких до ідеальних, що в житті трапляється не часто. Особливо великий вплив ефективність ампліфікації надає ступінь чистоти препарату ДНК, тобто. наявність у реакційній суміші тих чи інших інгібіторів, яких позбутися в деяких випадках буває вкрай складно. Іноді через їхню присутність не вдається ампліфікувати навіть десятки тисяч молекул ДНК-мішені. Таким чином, прямий зв'язок між вихідною кількістю ДНК-мішені та кінцевою кількістю продуктів ампліфікації часто відсутній.

3.3.1 Метод горизонтального електрофорезу

Для візуалізації результатів ампліфікації використовують різноманітні методи. Найбільш поширеним на сьогоднішній день є метод електрофорезу, заснований на розподілі молекул ДНК за розміром. Для цього готують пластину агарозного гелю, що є застиглою після розплавлення в електрофорезному буфері агарозу в концентрації 1,5-2,5% з додаванням спеціального барвника ДНК, наприклад, бромистого етидії. Застигла агароза утворює просторові ґрати. При заливанні за допомогою гребінок у гелі формують спеціальні лунки, які в подальшому вносять продукти ампліфікації. Пластину гелю поміщають в апарат для горизонтального гель-електрофорезу та підключають джерело постійної напруги. Негативно заряджена ДНК починає рухатися в гелі від мінусу до плюсу. При цьому короткі молекули ДНК рухаються швидше, ніж довгі. На швидкість руху ДНК у гелі впливає концентрація агарози, напруженість електричного поля, температура, склад електрофорезного буфера і меншою мірою ГЦ-склад ДНК. Усі молекули одного розміру рухаються з однаковою швидкістю. Барвник вбудовується (інтеркалює) площинними групами молекули ДНК. Після закінчення електрофорезу, що триває від 10 до 1 години, гель поміщають на фільтр трансілюмінатора, що випромінює світло в ультрафіолетовому діапазоні (254 - 310 нм). Енергія ультрафіолету, що поглинається ДНК в області 260 нм, передається на барвник, змушуючи його флуоресціювати в оранжево-червоній ділянці видимого спектру (590 нм).

Яскравість смуг продуктів ампліфікації може бути різною. Однак це не можна пов'язувати з початковою кількістю ДНК-мішені у зразку.

3.3.2 Метод вертикального електрофорезу

Метод вертикального електрофорезу схожий з горизонтальним електрофорезом. Їхня відмінність полягає в тому, що в даному випадку замість агарози використовують поліакриламідні гелі. Його проводять у спеціальній камері для вертикального електрофорезу. Електрофорез у поліакриламідному гелі має більшу роздільну здатність порівняно з агарозним електрофорезом і дозволяє розрізняти молекули ДНК різних розмірів з точністю до одного нуклеотиду. Приготування поліакриламідного гелю дещо складніше за агарозний. Крім того, акриламід є токсичною речовиною. Оскільки необхідність визначити розмір ампліфікації продукту з точністю до 1 нуклеотиду виникає рідко, то у звичайній роботі використовують метод горизонтального електрофорезу.

3.4 Контроль за проходженням реакції ампліфікації

3.4.1 Позитивні контролі

Як "позитивний контроль" використовують препарат ДНК шуканого мікроорганізму. Неспецифічні амплікони відрізняються за розміром від ампліконів, що утворюються внаслідок ампліфікації з контрольним препаратом ДНК. Розмір неспецифічних продуктів може бути як більшого, і меншого розміру проти позитивним контролем. У найгіршому разі ці розміри можуть збігатися і читаються в електрофорезі як позитивні.

Для контролю специфічності утвореного продукту ампліфікації можна використовувати гібридизаційні зонди (ділянки ДНК, розташовані всередині послідовності, що ампліфікується), мічені ферментними мітками або радіоактивними ізотопами і взаємодіють з ДНК відповідно до тих же принципів, що і праймери. Це значно ускладнює та подовжує аналіз, а його вартість суттєво збільшується.

3.4.2 Внутрішні контролі

Необхідно контролювати хід ампліфікації у кожній пробірці з реакційною сумішшю. Для цього використовують додатковий, так званий "внутрішній контроль". Він є будь-яким препаратом ДНК, несхожий з ДНК шуканого мікроорганізму. Якщо внутрішній контроль внести в реакційну суміш, він стане такою ж мішенню для відпалу праймерів, як і хромосомальна ДНК шуканого збудника інфекції. Розмір продукту ампліфікації внутрішнього контролю підбирають таким чином, щоб він був у 2 і більше разів більше, ніж амплікони, що утворюються від ампліфікації ДНК мікроорганізму, що шукається. В результаті, якщо внести ДНК внутрішнього контролю в реакційну суміш разом з випробуваним зразком, то незалежно від наявності мікроорганізму в біологічному зразку, внутрішній контроль стане причиною утворення специфічних ампліконів, але значно довших (важких) ніж амплікон мікроорганізму. Наявність важких ампліконів у реакційній суміші буде свідченням нормального проходження реакції ампліфікації та відсутності інгібіторів. Якщо амплікони потрібного розміру не утворилися, але не утворилися також і амплікони внутрішнього контролю, можна зробити висновок про наявність в аналізованому зразку небажаних домішок, яких слід позбутися, але не про відсутність шуканої ДНК.

На жаль, незважаючи на всю привабливість такого підходу, у нього є суттєва вада. Якщо в реакційній суміші знаходиться потрібна ДНК, ефективність її ампліфікації різко знижується через конкуренцію з внутрішнім контролем за праймери. Це особливо важливо при низьких концентраціях ДНК у випробуваному зразку, що може призводити до помилково-негативних результатів.

Тим не менш, за умови вирішення проблеми конкуренції за праймери, цей спосіб контролю ефективності ампліфікації, безумовно, буде дуже корисним.

4. Методи, засновані на полімеразній ланцюговій реакції

4.1 Якісний аналіз

Класичний спосіб постановки ПЛР, принципи якого були викладені вище, знайшов свій розвиток у деяких модифікаціях, спрямованих на подолання обмежень ПЛР та підвищення ефективності проходження реакції.

4.1.1 Спосіб постановки ПЛР з використанням гарячого старту

Щоб зменшити ризик утворення неспецифічних продуктів реакції ампліфікації, використовують підхід, що одержав назву "гарячий старт" ("Hot-start").

Справа в тому, що залежно від ГЦ-складу та розміру, праймери мають певну температуру плавлення (Tm). Якщо температура системи перевищує Тm, праймер не в змозі утримуватися на ланцюзі ДНК та денатурує. За дотримання оптимальних умов, тобто. температури відпалу, близької до температури плавлення, праймер утворює дволанцюгову молекулу тільки за умови його повної комплементарності і, таким чином, забезпечує специфічність реакції.

Існують різні варіанти реалізації "гарячого старту":

Внесення до реакційної суміші Taq-полімерази під час першого циклу після прогрівання пробірки до температури денатурації.

Поділ інгредієнтів реакційної суміші парафіновим прошарком на шари (у нижній частині - праймери, у верхній - Taq-полімераза та ДНК-мішені), які змішуються при розплавленні парафіну (~65-75 0 С).

Використання моноклональних антитіл до Taq-полімерази. Фермент, пов'язаний моноклональними антитілами, стає активним лише після стадії першої денатурації, коли моноклональні антитіла необоротно денатурують і звільняють активні центри Taq-полімерази.

У всіх випадках, навіть якщо неспецифічний відпал стався до початку температурного циклування, елонгації не відбувається, а при нагріванні комплекси праймер-ДНК денатурують, тому неспецифічні продукти не утворюються. Надалі температура в пробірці не опускається нижче за температуру плавлення, що забезпечує утворення специфічного продукту ампліфікації.

4.1.2 Детекція молекул РНК

Можливість використання РНК як мішені для ПЛР суттєво розширює спектр застосування цього методу. Наприклад, геноми багатьох вірусів (гепатит С, вірус інфлюенцы, пікорнавіруси тощо) представлені саме РНК. При цьому в їх життєвих циклах відсутня проміжна фаза перетворення на ДНК. Для детекції РНК необхідно насамперед перевести їх у форму ДНК. Для цього використовують зворотну транскриптазу, яку виділяють із двох різних вірусів: avian myeloblastosis virus та Moloney murine leukemia virus. Використання цих ферментів пов'язані з деякими труднощами. Насамперед, вони термолабільні і тому можуть бути використані при температурі не вище 42° С. Так як при такій температурі молекули РНК легко утворюють вторинні структури, ефективність реакції помітно знижується і за різними оцінками приблизно дорівнює 5%. Робляться спроби обійти цей недолік використовуючи як зворотну транскриптазу термостабільну полімеразу, отриману з термофільного мікроорганізму Thermus Thermophilus, який проявляє транскриптазну активність у присутності Mn 2+ . Це єдиний відомий фермент, здатний проявляти як полімеразну так і транскриптазну активність.

Для проведення реакції зворотної транскрипції в реакційній суміші також як і ПЛР повинні бути праймери в якості затравки і суміш 4-х дНТФ, як будівельний матеріал.

Після реакції зворотної транскрипції отримані молекули кДНК можуть бути мішенню щодо ПЛР

5. Організація технологічного процесу постановки ПЛР

Потенційно висока чутливість полімеразної ланцюгової реакції робить необхідним особливо ретельний пристрій ПЛР-лабораторії. Це з найбільш гострою проблемою методу - контамінацією.

Контамінація - потрапляння із зовнішнього середовища в реакційну суміш специфічних молекул ДНК, здатних служити мішенями в реакції ампліфікації та давати хибнопозитивні результати.

Існує кілька способів боротьби з цим неприємним явищем. Одним із них є використання ферменту N-урацил-глікозилази (УГ). В основі цього методу лежить здатність УГ розщеплювати молекули ДНК із вбудованим урацилом. Реакцію ампліфікації проводять з використанням суміші дНТФ, в якій дТТФ замінений на урацил, і після термоциклювання всі амплікони, що утворюються в пробірці, будуть містити урацил. Якщо до ампліфікації в реакційну суміш додати УГ, то амплікони, що потрапили в реакційну суміш, будуть зруйновані, тоді як нативна ДНК залишиться цілою і буде надалі служити мішенню для ампліфікації.

Таким чином, цей метод лише деякою мірою дозволяє усунути джерело контамінації і не гарантує від хибно-позитивних результатів.

Інший спосіб боротьби з результатами контамінації, значне зменшення кількості циклів реакції (до 25-30 циклів). Але навіть за такого підходу ризик отримання хибнопозитивних результатів великий, тому й у разі за відсутності інгібіторів легко отримати продукт ампліфікації через контамінації.

Таким чином, незважаючи на користь преампліфікаційних заходів, спрямованих на інактивацію молекул ДНК, що є причиною виникнення хибнопозитивних результатів, найбільш радикальним засобом є заздалегідь продумана організація лабораторії.

Висновок

Найбільшого поширення метод ПЛР нині отримав як метод діагностики різних інфекційних захворювань. ПЛР дозволяє виявити етіологію інфекції навіть якщо в пробі, взятій на аналіз, міститься лише кілька молекул ДНК збудника. ПЛР широко використовується у ранній діагностиці ВІЛ-інфекцій, вірусних гепатитів тощо. На сьогоднішній день майже немає інфекційного агента, якого не можна було б виявити за допомогою ПЛР.

Нещодавно був розроблений надійний, високочутливий і швидкий метод діагностики різних інфекційних захворювань людини. Такий спосіб має назву "аналіз ПЛР". Що це таке, в чому його сутність, які він може виявити мікроорганізми та як правильно його здавати, ми розповімо у нашій статті.

Історія відкриття

Також методи ПЛР використовуються у діагностиці онкозахворювань.

Переваги методу

Діагностика ПЛР має низку переваг:

Висока чутливість. Навіть за наявності лише кількох молекул ДНК мікроорганізму аналіз ПЛР визначає наявність інфекції. Допоможе метод при хронічних та латентно протікаючих захворюваннях. Часто в таких випадках мікроорганізм є некультивованим іншими способами.
Для дослідження підходить будь-який матеріал, наприклад слина, кров, статеві виділення, волосся, клітини епітелію. Найбільш поширеним є аналіз крові та урогенітального мазка на ПЛР.
Не потрібно тривалого вирощування культур. Автоматизований процес проведення діагностики дозволяє отримати результати дослідження через 4-5 годин.
Метод є майже стовідсотково достовірним. Зафіксовано лише поодинокі випадки хибнонегативного результату.
Можливість визначити кілька видів збудників із однієї проби матеріалу. Це не лише прискорює процес діагностики захворювання, а й суттєво знижує матеріальні витрати. Часто лікар призначає комплексний аналіз ПЛР. Ціна обстеження, що складається із визначення шести збудників, становить близько 1500 рублів.

Щоб результати були достовірними при проведенні дослідження ПЛР, здати аналіз потрібно, дотримуючись рекомендацій щодо попередньої підготовки до діагностики:

Перед здаванням слини слід утриматися від їди та ліків за 4 години до забору матеріалу. Безпосередньо перед процедурою прополощіть рот кип'яченою водою.
Вищезгаданими правилами потрібно керуватися і при взятті зразка з внутрішньої поверхні щоки. Після полоскання рекомендують провести легкий масаж шкіри виділення секрету залози.
Сечу зазвичай збирають у домашніх умовах. Для цього потрібно провести ретельний туалет полових органів. У стерильний пластиковий контейнер потрібно зібрати 50-60 мл сечі. Для забезпечення чистоти матеріалу рекомендується жінкам вставити тампон у піхву, а чоловікам максимально відтягнути складку. Не можна здавати матеріал у період менструальних виділень.
Для здачі сперми необхідно утриматися від статевого акту протягом 3 днів до забору матеріалу. Також лікарі радять відмовитися від відвідування сауни та вживання гарячої ванни, вживання алкоголю та гострої їжі. За 3 години до аналізу необхідно утриматися від сечовипускання.
Для здачі, наприклад, якщо проводиться аналіз на хламідії ПЛР, як жінкам, так і чоловікам рекомендується статевий спокій протягом 3 днів. За два тижні до аналізу не можна приймати антибактеріальні препарати. За тиждень потрібно припинити використання інтимних гелів, мазей, вагінальних свічок, спринцювання. За 3 години до дослідження необхідно утриматися від сечовипускання. Під час менструацій забір матеріалу не проводиться лише через 3 дні після припинення кров'яних виділень можна взяти урогенітальний мазок.

ПЛР під час вагітності

У період очікування малюка багато інфекційних захворювань, що передаються статевим шляхом, є вкрай небезпечними для нормального розвитку плода. ЗПСШ можуть спровокувати внутрішньоутробну затримку розвитку, викидень або передчасні пологи, уроджені вади дитини. Тому дуже важливо пройти на ранніх термінах вагітності обстеження методом ПЛР. Здати аналіз необхідно при постановці на облік – до 12 тижнів.

Забір матеріалу походить з каналу шийки матки за допомогою спеціальної щіточки. Процедура безболісна і не становить небезпеки для малюка. Зазвичай під час вагітності проводять аналіз на хламідії ПЛР-методом, а також на уреаплазмоз, мікоплазмоз, цитомегаловірус, герпес, папіломавірус. Такий комплекс обстеження називають ПЛР-6.

ПЛР для діагностики ВІЛ

У зв'язку з тим, що метод дуже чутливий до змін в організмі та умов проведення діагностики, багато факторів можуть вплинути на результат. Тому аналіз ПЛР на ВІЛ-інфекцію не є достовірним методом, його ефективність – 96-98 %. В інших 2-4% випадків тест дає хибнопозитивні результати.

Але в деяких ситуаціях без ПЛР-діагностики ВІЛ не обійтись. Зазвичай її проводять людям із хибнонегативним результатом ІФА. Такі показники свідчать, що в людини ще виробилися антитіла до вірусу та його неможливо виявити без багаторазового збільшення кількості. Саме цього можна досягти, провівши аналіз крові ПЛР-методом.

Також потрібна така діагностика дітям першого року життя, народженим від ВІЛ-позитивної матері. Метод є єдиним способом достовірного визначення статусу дитини.

ПЛР для діагностики гепатитів

Метод полімеразної ланцюгової реакції дозволяє виявити ДНК вірусу гепатитів А, В, С задовго до утворення антитіл до інфекції або появи симптомів хвороби. Особливо ефективним є аналіз ПЛР на гепатит С, оскільки у 85% випадків таке захворювання протікає безсимптомно і без своєчасного лікування переходить у хронічну стадію.

Своєчасне виявлення збудника допоможе уникнути ускладнень та тривалого лікування.

Комплексне обстеження ПЛР

Комплексний аналіз ПЛР: обстеження методом полімезарної ланцюгової реакції, яке включає визначення одночасно декількох видів інфекцій: мікоплазми геніталіум, мікоплазми хомініс, гарднерелли вагіналіс, кандиди, трихомонади, цитомегаловірусу, герпесу 1-го і 2-го типів. Ціна такої діагностики коливається від 2000 до 3500 руб. залежно від клініки, використовуваних матеріалів та обладнання, а також від виду аналізу: якісного чи кількісного. Який необхідний у вашому випадку – вирішить лікар. В одних випадках досить просто визначити наявність збудника, в інших, наприклад при ВІЛ-інфекції, важливу роль відіграє кількісний титр. При діагностиці всіх перерахованих вище збудників обстеження називають «аналіз ПЛР-12».

Розшифровка результатів аналізу

Розшифровка аналізу ПЛР не становить складності. Є лише 2 шкали показника – «позитивний результат» та «негативний результат». При виявленні збудника лікарі можуть з 99% впевненістю підтвердити наявність захворювання і приступити до лікування пацієнта. При кількісному методі визначення інфекції у відповідній графі буде вказано числовий показник виявлених бактерій. Тільки лікар може визначити ступінь захворювання та призначити необхідне лікування.

У деяких випадках, наприклад, при визначенні ВІЛ-інфекції методом ПЛР, при негативному результаті виникає необхідність проведення додаткових обстежень для підтвердження отриманих показників.

Де здати аналіз?

Де здати ПЛР-аналіз: у державній поліклініці чи у приватній лабораторії? На жаль, у муніципальних медичних закладах апаратура та методи нерідко застарілі. Тому краще віддати перевагу приватним лабораторіям із сучасним обладнанням та висококваліфікованими кадрами. Крім того, у приватній клініці ви отримаєте результати значно швидше.

У Москві багато приватних лабораторій пропонують проведення аналізу ПЛР на різні інфекції. Наприклад, у таких клініках, як «Віта», «Комплексна клініка», «Щаслива родина», «Уро-Про» проводять аналіз ПЛР. Ціна обстеження становить від 200 руб. визначення одного збудника.

Можна зробити висновок, що діагностика інфекційних захворювань методом ПЛР у більшості випадків є швидким та достовірним способом виявлення збудника в організмі на ранніх термінах інфікування. Але все ж таки в певних випадках варто вибрати інші способи діагностики. Визначити необхідність проведення такого дослідження може лише фахівець. Розшифровка аналізу ПЛР також потребує професійного підходу. Дотримуйтесь рекомендацій лікаря та не здавайте самостійно аналізи, в яких немає потреби.