Полімеразна ланцюгова реакція, її сутність та сфери застосування. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та її застосування Метод полімеразної ланцюгової реакції пцр

Нещодавно був розроблений надійний, високочутливий і швидкий метод діагностики різних інфекційних захворювань людини. Такий спосіб має назву "аналіз ПЛР". Що це таке, в чому його сутність, які він може виявити мікроорганізми та як правильно його здавати, ми розповімо у нашій статті.

Історія відкриття

Також методи ПЛР використовуються у діагностиці онкозахворювань.

Переваги методу

Діагностика ПЛР має низку переваг:

Висока чутливість. Навіть за наявності лише кількох молекул ДНК мікроорганізму аналіз ПЛР визначає наявність інфекції. Допоможе метод при хронічних та латентно протікаючих захворюваннях. Часто в таких випадках мікроорганізм є некультивованим іншими способами.
Для дослідження підходить будь-який матеріал, наприклад слина, кров, статеві виділення, волосся, клітини епітелію. Найбільш поширеним є аналіз крові та урогенітального мазка на ПЛР.
Не потрібно тривалого вирощування культур. Автоматизований процес проведення діагностики дозволяє отримати результати дослідження через 4-5 годин.
Метод є майже стовідсотково достовірним. Зафіксовано лише поодинокі випадки хибнонегативного результату.
Можливість визначити кілька видів збудників із однієї проби матеріалу. Це не лише прискорює процес діагностики захворювання, а й суттєво знижує матеріальні витрати. Часто лікар призначає комплексний аналіз ПЛР. Ціна обстеження, що складається із визначення шести збудників, становить близько 1500 рублів.

Щоб результати були достовірними при проведенні дослідження ПЛР, здати аналіз потрібно, дотримуючись рекомендацій щодо попередньої підготовки до діагностики:

Перед здаванням слини слід утриматися від їди та ліків за 4 години до забору матеріалу. Безпосередньо перед процедурою прополощіть рот кип'яченою водою.
Вищезгаданими правилами потрібно керуватися і при взятті зразка з внутрішньої поверхні щоки. Після полоскання рекомендують провести легкий масаж шкіри виділення секрету залози.
Сечу зазвичай збирають у домашніх умовах. Для цього потрібно провести ретельний туалет полових органів. У стерильний пластиковий контейнер потрібно зібрати 50-60 мл сечі. Для забезпечення чистоти матеріалу рекомендується жінкам вставити тампон у піхву, а чоловікам максимально відтягнути складку. Не можна здавати матеріал у період менструальних виділень.
Для здачі сперми необхідно утриматися від статевого акту протягом 3 днів до забору матеріалу. Також лікарі радять відмовитися від відвідування сауни та вживання гарячої ванни, вживання алкоголю та гострої їжі. За 3 години до аналізу необхідно утриматися від сечовипускання.
Для здачі, наприклад, якщо проводиться аналіз на хламідії ПЛР, як жінкам, так і чоловікам рекомендується статевий спокій протягом 3 днів. За два тижні до аналізу не можна приймати антибактеріальні препарати. За тиждень потрібно припинити використання інтимних гелів, мазей, вагінальних свічок, спринцювання. За 3 години до дослідження необхідно утриматися від сечовипускання. Під час менструацій забір матеріалу не проводиться лише через 3 дні після припинення кров'яних виділень можна взяти урогенітальний мазок.

ПЛР під час вагітності

У період очікування малюка багато інфекційних захворювань, що передаються статевим шляхом, є вкрай небезпечними для нормального розвитку плода. ЗПСШ можуть спровокувати внутрішньоутробну затримку розвитку, викидень або передчасні пологи, уроджені вади дитини. Тому дуже важливо пройти на ранніх термінах вагітності обстеження методом ПЛР. Здати аналіз необхідно при постановці на облік – до 12 тижнів.

Забір матеріалу походить з каналу шийки матки за допомогою спеціальної щіточки. Процедура безболісна і не становить небезпеки для малюка. Зазвичай під час вагітності проводять аналіз на хламідії ПЛР-методом, а також на уреаплазмоз, мікоплазмоз, цитомегаловірус, герпес, папіломавірус. Такий комплекс обстеження називають ПЛР-6.

ПЛР для діагностики ВІЛ

У зв'язку з тим, що метод дуже чутливий до змін в організмі та умов проведення діагностики, багато факторів можуть вплинути на результат. Тому аналіз ПЛР на ВІЛ-інфекцію не є достовірним методом, його ефективність – 96-98 %. В інших 2-4% випадків тест дає хибнопозитивні результати.

Але в деяких ситуаціях без ПЛР-діагностики ВІЛ не обійтись. Зазвичай її проводять людям із хибнонегативним результатом ІФА. Такі показники свідчать, що в людини ще виробилися антитіла до вірусу та його неможливо виявити без багаторазового збільшення кількості. Саме цього можна досягти, провівши аналіз крові ПЛР-методом.

Також потрібна така діагностика дітям першого року життя, народженим від ВІЛ-позитивної матері. Метод є єдиним способом достовірного визначення статусу дитини.

ПЛР для діагностики гепатитів

Метод полімеразної ланцюгової реакції дозволяє виявити ДНК вірусу гепатитів А, В, С задовго до утворення антитіл до інфекції або появи симптомів хвороби. Особливо ефективним є аналіз ПЛР на гепатит С, оскільки у 85% випадків таке захворювання протікає безсимптомно і без своєчасного лікування переходить у хронічну стадію.

Своєчасне виявлення збудника допоможе уникнути ускладнень та тривалого лікування.

Комплексне обстеження ПЛР

Комплексний аналіз ПЛР: обстеження методом полімезарної ланцюгової реакції, яке включає визначення одночасно декількох видів інфекцій: мікоплазми геніталіум, мікоплазми хомініс, гарднерелли вагіналіс, кандиди, трихомонади, цитомегаловірусу, герпесу 1-го і 2-го типів. Ціна такої діагностики коливається від 2000 до 3500 руб. залежно від клініки, використовуваних матеріалів та обладнання, а також від виду аналізу: якісного чи кількісного. Який необхідний у вашому випадку – вирішить лікар. В одних випадках досить просто визначити наявність збудника, в інших, наприклад при ВІЛ-інфекції, важливу роль відіграє кількісний титр. При діагностиці всіх перерахованих вище збудників обстеження називають «аналіз ПЛР-12».

Розшифровка результатів аналізу

Розшифровка аналізу ПЛР не становить складності. Є лише 2 шкали показника – «позитивний результат» та «негативний результат». При виявленні збудника лікарі можуть з 99% впевненістю підтвердити наявність захворювання і приступити до лікування пацієнта. При кількісному методі визначення інфекції у відповідній графі буде вказано числовий показник виявлених бактерій. Тільки лікар може визначити ступінь захворювання та призначити необхідне лікування.

У деяких випадках, наприклад, при визначенні ВІЛ-інфекції методом ПЛР, при негативному результаті виникає необхідність проведення додаткових обстежень для підтвердження отриманих показників.

Де здати аналіз?

Де здати ПЛР-аналіз: у державній поліклініці чи у приватній лабораторії? На жаль, у муніципальних медичних закладах апаратура та методи нерідко застарілі. Тому краще віддати перевагу приватним лабораторіям із сучасним обладнанням та висококваліфікованими кадрами. Крім того, у приватній клініці ви отримаєте результати значно швидше.

У Москві багато приватних лабораторій пропонують проведення аналізу ПЛР на різні інфекції. Наприклад, у таких клініках, як «Віта», «Комплексна клініка», «Щаслива родина», «Уро-Про» проводять аналіз ПЛР. Ціна обстеження становить від 200 руб. визначення одного збудника.

Можна зробити висновок, що діагностика інфекційних захворювань методом ПЛР у більшості випадків є швидким та достовірним способом виявлення збудника в організмі на ранніх термінах інфікування. Але все ж таки в певних випадках варто вибрати інші способи діагностики. Визначити необхідність проведення такого дослідження може лише фахівець. Розшифровка аналізу ПЛР також потребує професійного підходу. Дотримуйтесь рекомендацій лікаря та не здавайте самостійно аналізи, в яких немає потреби.

Часто використовується як експрес-метод для індикації та ідентифікації вірусів.

Вперше цей метод розробив К. Мюлліс (США) у 1983 р. Завдяки високій чутливості, специфічності та простоті виконання його широко застосовують у генетиці, судовій медицині, діагностиці та інших областях.

Суть методу – ампліфікація, тобто збільшення числа копій строго певних фрагментів молекули ДНК in vitro. У цьому методі діють матричний механізм та принцип комплементарності. Дві одинарні полінуклеотидні ланцюги (нуклеїнової кислоти) здатні зв'язуватися водневими зв'язками в одну двоспіральну, якщо послідовності нуклеотидів однієї точно відповідають послідовності нуклеотидів іншої так, що їх азотисті основи можуть утворювати пари аденін-тимін та гуанін-цитозин.

ПЛР заснована на ампліфікації ДНК за допомогою термостабільної ДНК-полімерази, що здійснює синтез взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з двох праймерів. Праймер – це фрагмент ДНК, що складається з 20-30 нуклеотидів. Ці праймери (затравки) комплементарні протилежним ланцюгам ДНК. При синтезі ДНК праймери вбудовуються в ланцюг новосинтезуючих молекул ДНК.

Зазвичай ПЛР ставлять у 25-40 циклів. Кожен цикл включає три етапи: перший - денатурація за 92-95 °С. При цьому два ланцюги ДНК розходяться; другий - відпал або приєднання праймерів при 50-65 °С; третій - елонгація, або полімеризація при 68-72 °З, при цьому ДНК-полімераза здійснює комплементарне добудовування ланцюгів ДНК-матриці за допомогою чотирьох видів нуклеотидів. В результаті одного циклу відбувається подвоєння шуканого генетичного матеріалу. Ланцюги ДНК, що утворилися в першому циклі, служать матрицями для другого циклу і т. д. Після першого циклу ампліфікується тільки фрагмент між двома праймерами. Таким чином, йде подвоєння числа копій ділянки, що ампліфікується, що дозволяє за 25-40 циклів насинтезувати мільйони (2 n) фрагментів ДНК - кількість, достатню для індикації їх різними методами (методом гібридизаційних зондів, що містять певну мітку, електрофорезом і т. д.). . Найчастіше для цього використовують метод електрофорезу в агарозному гелі з фарбуванням бромистим етидієм.

У ПЛР із ділянок ДНК збудника використовують праймери, які мають унікальну послідовність нуклеотидів, характерних лише для певного збудника.

Методика постановки ПЛР зводиться до наступного: із досліджуваного матеріалу виділяють ДНК-матрицю; в пробірці з'єднують виділену ДНК з ампліфікаційною сумішшю, в яку входять ДНК-полімераза, всі 4 види нуклеотидів, 2 види праймерів, MgCl, буфер, деіонізована вода та мінеральна олія. Потім пробірки поміщають в ампліфікатор і проводять ампліфікацію в автоматичному режимі за заданою програмою, що відповідає виду збудника. Результати реєструють частіше методом електрофорезу в 1-2%-ному агарозному гелі в присутності бромистого етидія, який з'єднується з фрагментами ДНК і виявляється у вигляді смуг, що світяться при опроміненні гелю УФ-променями на трансілюмінаторі. Усі процедури ПЛР займають 1-2 робочі дні.

З метою підвищення специфічності та чутливості ПЛР застосовують різні варіанти: гніздову ПЛР; ПЛР з гарячим стартом з використанням парафінового прошарку або блокади активних центрів полімерази моноклональними антитілами. Крім того, деякі фірми випускають ліофілізовані набори реагентів для проведення ампліфікації ДНК, які дозволяють прискорити процес проведення ПЛР та зменшити можливість появи хибнопозитивних результатів.

В даний час впроваджується нова технологія ПЛР-ПЛР у реальному часі (Real-Time PCR). Її принципова особливість - моніторинг та кількісний аналіз накопичення продуктів полімеразної ланцюгової реакції та автоматична реєстрація та інтерпретація отриманих результатів. Цей метод не вимагає стадії електрофорезу, що дозволяє знизити вимоги лабораторії, що пред'являються до ПЛР. ПЛР в реальному часі використовують флуоресцентно-мічені олігонуклеотидні зонди для детекції ДНК у процесі її ампліфікації. ПЛР у реальному часі дозволяє провести повний аналіз проби протягом 20-60 хв та теоретично способу детективувати навіть одну молекулу ДНК або РНК у пробі.

Система детекції продукту полімеразної ланцюгової реакції «real-time» (моніторингова ПЛР) дозволяє цикл за циклом стежити за накопиченням ампліфікованої ДНК. Система включає і олігонуклеотидний зонд, який здатний приєднуватися (гібридизуватися) до внутрішнього сегменту ДНК-мішені. На 5'-кінці зонд позначений флуоресцентним барвником-репортером (reporter dye), а на 3'-кінці - блокатором (quencher dye). У міру накопичення продукту ПЛР зонд гібридизується до нього, проте світіння не відбувається через близькість між репортером та блокатором. В результаті копіювання послідовності полімеразу досягає 5'-кінця зонда. 5'-3'-екзонуклеазна активність полімерази від'єднує флуоресцентну мітку з 3'-кінця проби, тим самим звільняючи флуоресцентний репортер від його зв'язку з блокатором сигналу, що і призводить до збільшення флуоресценції. Рівень флуоресценції таким чином пропорційний кількості специфічного продукту реакції. Важливо, що результати ПЛР реєструються за наявності флуоресценції у закритих пробірках і, таким чином, вирішується ще одна з основних проблем цього методу – проблема контамінації ампліконами.

Переваги ПЛР: швидкість аналізу; високі чутливість та специфічність; мінімальна кількість досліджуваного матеріалу; простота у виконанні та можливість повної автоматизації.

Зважаючи на те, що чутливість ПЛР може досягати до детекції однієї копії ДНК-матриці, існує високий ступінь небезпеки отримання хибнопозитивних результатів. Тому генно-діагностичною лабораторією при постановці ПЛР необхідно неухильно виконувати спеціальні вимоги до планування та режиму роботи.

ПЛР є одним із доповнюючих методів, що існують у вірусологічній діагностиці. Ця реакція дуже важлива для діагностики вірусних інфекцій, коли вірусні антигени або вірусспецифічні антитіла не можуть бути виявлені і коли присутність вірусної нуклеїнової кислоти може бути єдиним свідченням зараження, особливо при латентно протікають і змішаних інфекціях.

Якщо ви знайшли помилку, будь ласка, виділіть фрагмент тексту та натисніть Ctrl+Enter.

Отримав Нобелівську премію.

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати реакційну суміш ДНК-полимеразу , оскільки вона инактивировалась при високій температурі, необхідної для поділу ланцюгів спіралі ДНК. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу та ферменту. У 1986 році метод полімеразної ланцюгової реакції був суттєво покращений. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази з термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити та автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій. Thermus aquaticusі названа Taq-полімеразою. Недолік цієї полімерази полягає в тому, що ймовірність внесення помилкового нуклеотиду у неї досить висока, тому що цей фермент відсутні механізми виправлення помилок (3"→5" екзонуклеазна активність). Полімерази Pfuі Pwo, виділені з архей , мають такий механізм, їх використання значно зменшує число мутацій в ДНК, але швидкість їх роботи (процесивність) нижче, ніж у Taq. Зараз застосовують суміші Taqі Pfu, щоб досягти одночасно високої швидкості полімеризації та високої точності копіювання.

У момент винаходу методу Кері Мулліс працював хіміком-синтетиком (він синтезував олігонуклеотиди, які застосовувалися тоді для виявлення точкових мутацій методом гібридизації з геномною ДНК) у компанії Цетус (Cetus Corporation), яка і запатентувала метод ПЛР. У 1992 році Цетус продала права на метод та патент на використання Taq-полімерази компанії Хофман-Ла Рош за 300 млн доларів Однак виявилося, що Taq-полімераза була охарактеризована радянськими біохіміками А. Калєдіним, А. Слюсаренко та С. Городецким у 1980 році, а також за 4 роки до цієї радянської публікації, тобто в 1976 році, американськими біохіміками Alice Chien, David B. Edgar та John M. Trela. У зв'язку з цим компанія Промега (Promega) намагалася у судовому порядку змусити Рош відмовитися від виняткових прав на цей фермент. Американський патент на метод ПЛР закінчився у березні 2005 р.

Проведення ПЛР

Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах ( in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня у досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК у живих організмах (реплікації), за допомогою ПЛР ампліфікуються відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp). За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок та за певних умов довжина ПЛР-фрагменту може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше за довжину хромосомної ДНК еукаріотичної клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд пар основ.

Компоненти реакції

Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні такі компоненти:

ДНК-матрицямістить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати .
Два праймери, комплементарні протилежним кінцям різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК
Термостабільна ДНК-полімераза- фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів. Thermus aquaticus(Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus(Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полімераза) та інші.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфати(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Іони Mg 2+ необхідні для роботи полімерази.
Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, бичачий сироватковий альбумін.

Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококипляче масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з кришкою, що підігрівається, цього робити не потрібно.

Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату, побічного продукту приєднання нуклеотидтрифосфатів до зростаючого ланцюга ДНК, до ортофосфату. Пірофосфат може інгібувати ПЛР-реакцію.

Праймери

Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею та праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18-30 основ. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюжкової матриці і обмежує початок і кінець ділянки, що ампліфікується.

Після гібридизації матриці з праймером (відпал) останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюга матриці (див. ).

Найважливіша характеристика праймерів – температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця.

T m - температура, за якої половина ДНК-матриць утворює комплекс з олігонуклеотидним праймером. Усереднена формула підрахунку T m для короткого олігонуклеотиду (і для довгих фрагментів ДНК), з урахуванням концентрації іонів K + і DMSO :

де L – кількість нуклеотидів у праймері, K+ – молярна концентрація іонів калію, G+C – сума всіх гуанінів та цитозинів.

У разі неправильного вибору довжини та нуклеотидного складу праймера або температури відпалу можливе утворення частково комплементарних комплексів з іншими ділянками матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення обмежена оптимумом температури дії полімерази, активність якої знижується при температурах вище 80 °C.

При виборі праймерів бажано дотримуватись наступних критеріїв:

Ампліфікатор

Мал. 1: Ампліфікатор для проведення ПЛР

ПЛР проводять в ампліфікаторі - приладі, який забезпечує періодичне охолодження та нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 °C. Сучасні ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, у тому числі з можливістю «гарячого старту», Touchdown ПЛР (див. нижче) та подальшого зберігання ампліфікованих молекул при 4 °C. Для ПЛР у реальному часі випускають прилади, що обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою та відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх у автоматизовані системи.

Хід реакції

Фотографія гелю, що містить маркерну ДНК (перший та останній слоти) та продукти ПЛР

Зазвичай під час проведення ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен із яких складається з трьох стадій (рис. 2).

Денатурація

Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, оскільки руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попередній прогрів реакційної суміші протягом 2-3 хв для повної денатурації матриці та праймерів. Такий прийом називається гарячим стартомвін дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.

Відпал

Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з матрицею одноланцюгової. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається рівною температурі плавлення праймерів. Неправильний вибір температури відпалу призводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при підвищеній температурі), або до зв'язування в неправильному місці та появи неспецифічних продуктів (при заниженій температурі). Час стадії відпалу - 30 сік, одночасно, за цей час полімераза вже встигає синтезувати кілька сотень нуклеотидів. Тому рекомендується підбирати праймери з температурою плавлення вище 60 °C і проводити відпал і елонгацію одночасно при 60-72 °C.

Елонгація

ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як затравку. Це – стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3"-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається вздовж матриці, синтезуючи новий ланцюг у напрямку від 5" до 3" кінця. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72 ° C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, що ампліфікується.Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар підстав. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв.

Мал. 2: Схематичне зображення першого циклу ПЛР (1) Денатурація за 94-96 °C. (2) Відпал при 68 °C (наприклад). (3) Елонгація при 72 °C (P=полімераза). (4) Закінчено перший цикл. Два ДНК-ланцюги, що виходять, служать матрицею для наступного циклу, тому кількість матричної ДНК в ході кожного циклу подвоюється

Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2 n - 2n де n - число циклів реакції . Насправді ефективність кожного циклу може бути меншою за 100 %, тому насправді P ~ (1+E) n , де P - кількість продукту, Е - середня ефективність циклу.

Число «довгих» копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому продукти реакції домінує специфічний фрагмент.

Зростання необхідного продукту в геометричній прогресії обмежене кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, утворенням побічних продуктів. На останніх циклах реакції зростання уповільнюється, це називають ефектом плато.

Різновиди ПЛР

Вкладена ПЛР(Nested PCR (англ.)) - Застосовується для зменшення кількості побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів та проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.
Інвертована ПЛР(Inverse PCR (англ.)) - використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка всередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізань ДНК рестриктаз з подальшим з'єднанням фрагментів (лігування). В результаті відомі фрагменти виявляються на обох кінцях невідомої ділянки, після чого можна проводити ПЛР як завжди.
ПЛР із зворотною транскрипцією(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - Використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайною ПЛР проводять на матриці мРНК синтез одноланцюгової молекули ДНК за допомогою ревертази і отримують одноланцюжкову кДНК, яка використовується як матриця для ПЛР. Цим методом часто визначають, де коли експресуються дані гени.
Асиметрична ПЛР(англ. Asymmetric PCR) - проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно один із ланцюгів вихідної ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування та гібридизаційного аналізу. ПЛР проводиться як завжди, за винятком того, що один із праймерів береться у великій надлишку. Модифікацій цього є англ. L inear- A fter- T he- E xponential-PCR (LATE-PCR), в якому використовуються праймери з різною концентрацією і праймер з низькою концентрацією підбирається з високою (температурою плавлення), ніж праймер з високою концентрацією. ПЛР проводять при високій температурі відпалу, тим самим вдається підтримати ефективність реакції протягом усіх циклів.
Кількісна ПЛР(Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) або ПЛР у реальному часі- використовується для безпосереднього спостереження вимірюванням кількості конкретного ПЛР продукту в кожному циклі реакції. У цьому методі використовують флуоресцентно-мічені праймери або ДНК-зонди для точного вимірювання кількості продукту реакції з його накопиченням; або використовується флуоресцентний інтеркалюючий барвник Sybr Green I, який зв'язується з дволанцюжковою ДНК. Sybr Green Iзабезпечує простий та економічний варіант для детекції та кількісного визначення ПЛР-продуктів у ході ПЛР у режимі реального часу без необхідності використання специфічних флуоресцентних зондів чи праймерів. У ході ампліфікації барвник SYBR Green Iвбудовується в малу борозенку ДНК ПЛР продуктів і випромінює сильніший у порівнянні з незв'язаним барвником флуоресцентний сигнал при опроміненні синім лазером. SYBR Green Iсумісний із усіма відомими на сьогоднішній день приладами для проведення ПЛР у режимі реального часу. Максимум поглинання для SYBR Green Iзнаходиться за довжини хвилі 494 нм. Крім головного, у спектрі барвника є два невеликі додаткові максимуми поглинання - при 290 нм і 380 нм. Максимум випромінювання для SYBR Green Iзнаходиться при довжині хвилі 521 нм (зелений).
Ступінчаста ПЛР(Touchdown PCR (англ.)) – за допомогою цього підходу зменшують вплив неспецифічного зв'язування праймерів. Перші цикли проводять при температурі вище оптимальної температури відпалу, потім кожні кілька циклів температуру відпалу поступово знижують до оптимальної. Це робиться для того, щоб праймер гібридизувався з комплементарним ланцюгом всією своєю довжиною; тоді як при оптимальній температурі відпалу праймер частково гібридизується з комплементарним ланцюгом. Часткова гібридизація праймера геномної ДНК призводить до неспецифічної ампліфікації, якщо ділянок зв'язування для праймера досить багато. У більшості випадків перші десять ПЛР циклів можна проводити при температурі відпалу в 72-75°С, а потім відразу знизити до оптимальної, наприклад до 60-65°С.
Метод молекулярних колоній(ПЛР у гелі, англ. Colony - PCR Colony) - акриламідний гель полімеризують з усіма компонентами ПЛР на поверхні та проводять ПЛР. У точках, що містять аналізовану ДНК, відбувається ампліфікація з утворенням молекулярних колоній.
ПЛР із швидкою ампліфікацією кінців кДНК(англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR ).
ПЛР довгих фрагментів(англ. Long-range PCR) - модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10 тисяч і більше підстав). Використовують суміш двох полімераз, одна з яких - Taq-полімераза з високою процесивністю (тобто, здатна за один прохід синтезувати довгу ланцюг ДНК), а друга - ДНК полімеразу з 3"-5" екзонуклеазною активністю, зазвичай це Pfu полімеразу. Друга полімераза необхідна для того, щоб коригувати помилки, внесені першою, оскільки Taq-полімераза зупиняє синтез ДНК, якщо був доданий не комплементарний нуклеотид. Цей не комплементарний нуклеотид видаляє полімераза Pfu. Суміш полімераз береться відносно 50:1 або навіть менше 100:1, де Taq-полімераза береться в 25-100 разів більше по відношенню до полімерази Pfu.
RAPD(англ. Random Amplification of Polymorphic DNA ), ПЛР з випадковою ампліфікацією поліморфної ДНК - використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі за генетичною послідовністю організми, наприклад різні сорти культурних рослин, породи собак або близькі споріднені мікроорганізми. У цьому методі зазвичай використовують один праймер невеликого розміру (близько 10 п.н.). Цей праймер буде частково комплементований до випадкових ділянок ДНК досліджуваних організмів. Підбираючи умови (довжину праймера, його склад, температуру та ін.), вдається домогтися задовільного відмінності картини ПЛР для двох організмів.
Груп-специфічна ПЛР(англ. group-specific PCR) - ПЛР для споріднених послідовностей всередині одного або між різними видами , використовуючи консервативні праймери до цих послідовностей. Наприклад, підбір універсальних праймерів до рибосомальних 18Sі 26Sгенам для ампліфікації видоспецифічного міжгенного спейсера: послідовність генів 18Sі 26Sконсервативна між видами, тому ПЛР між цими генами проходитиме всім досліджуваних видів. Протилежний цьому методу є - унікальна ПЛР(англ. unique PCR), в якому завдання полягає у підборі праймерів для ампліфікації лише конкретної послідовності серед споріднених послідовностей.
ПЛР з використанням гарячого старту(англ. Hot-start PCR) - модифікація ПЛР з використанням ДНК-полімерази, в якій полімеразна активність блокується при кімнатній температурі антитілами або антитіла, що імітують, невеликими молекулами типу Affibody , тобто в момент постановки реакції до першої денатурації в ПЛР. Зазвичай, перша денатурація проводиться при 95 °C протягом 10 хвилин.
Віртуальна ПЛР(англ. in silico PCR, цифрова ПЛР, електронна ПЛР, е-ПЛР) - математичний метод комп'ютерного аналізу теоретичної полімеразної ланцюгової реакції з використанням списку послідовностей праймерів (або ДНК-зондів) для передбачення потенційної ампліфікації ДНК досліджуваного генома, хромосоми, будь-якої іншої ділянки ДНК.

Якщо нуклеотидна послідовність матриці відома частково або невідома зовсім, можна використовувати вироджені праймери, Послідовність яких містить вироджені позиції, в яких можуть розташовуватися будь-які підстави. Наприклад, послідовність праймера може бути такою: …ATH…де Н - А, Т або С.

Застосування ПЛР

ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів та в наукових експериментах.

Криміналістика

ПЛР використовують для порівняння так званих «генетичних відбитків пальців». Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину – кров, слина, сперма, волосся тощо. Його порівнюють із генетичним матеріалом підозрюваного. Досить малої кількості ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, ампліфікують за допомогою ПЛР. Фрагменти поділяють за допомогою електрофорезу ДНК. Отриману картину розташування смуг ДНК і називають генетичним відбитком пальців(англ. genetic fingerprint).

Встановлення батьківства

Мал. 3: Результати електрофорезу ДНК-фрагментів, ампліфікованих за допомогою ПЛР (1) Батько. (2) Дитина. (3) Мати. Дитина успадкувала деякі особливості генетичного відбитка обох батьків, що дало новий, унікальний відбиток.

Хоча «генетичні відбитки пальців» унікальні (за винятком випадку однояйцевих близнюків), родинні зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши кілька таких відбитків (рис. 3). Той самий метод можна застосувати, трохи модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

Медична діагностика

ПЛР дає можливість суттєво прискорити та полегшити діагностику спадкових та вірусних захворювань. Потрібний ген ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів, потім секвенируют для визначення мутацій . Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні чи місяці до того, як виявляться симптоми захворювання.

Персоналізована медицина

Іноді ліки виявляються токсичними чи алергенними для деяких пацієнтів. Причини цього - частково в індивідуальних відмінностях у сприйнятливості та метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються генетичному рівні. Наприклад, в одного пацієнта певний цитохром (білок печінки, що відповідає за метаболізм чужорідних речовин) може бути активнішим, у іншого - меншим. Для того, щоб визначити, який різновид цитохрому має даний пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попереднім генотипуванням (англ. prospective genotyping).

Клонування генів

Клонування генів (не плутати з клонуванням організмів) - це процес виділення генів і в результаті генноінженерних маніпуляцій отримання великої кількості продукту даного гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється в вектор- фрагмент ДНК, що переносить чужорідний ген у той самий чи інший, зручний для вирощування, організм. Як вектори використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів у чужорідний організм зазвичай використовують із отримання продукту цього гена - РНК чи, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін.

Мал. 4: Клонування гена з використанням плазміди
(1) Хромосомна ДНК організму A. (2) ПЛР. (3) Безліч копій гена організму А. (4) Вставка гена в плазміду. (5) Плазміда з геном організму А. (6) Введення плазміди в організм В. (7) Збільшення кількості копій гена організму А в організмі Ст.

Секвенування ДНК

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом дидезоксинуклеотидів ПЛР є невід'ємною частиною, оскільки саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентною або радіоактивною міткою. Приєднання дидезоксинуклеотиду до ланцюга, що синтезується, призводить до обриву синтезу, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після поділу в гелі.

Мутагенез

В даний час ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу (внесення змін до нуклеотидної послідовності ДНК). Використання ПЛР дозволило спростити та прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її більш надійною та відтворюваною.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – метод високої точності в області діагностування спадкових патологій, інфекцій, вірусних хвороб у будь-якій стадії (гострої чи хронічної), а також – на ранньому етапі – до очевидних проявів хвороби шляхом ідентифікації збудників, на основі їх ДНК, РНК , що є генетичним матеріалом, у пробах, які отримують від пацієнта І сьогодні ми поговоримо про суть, етапи діагностики та принципи методів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також про її вартість.

Що таке полімеразна ланцюгова реакція

Основа аналізу - ампліфікація (подвоєння) - створення безлічі копій з короткої ділянки ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти), що представляє генетичний комплекс людини. Для дослідження потрібна дуже мала кількість фізіологічної речовини (мокрота, калові маси, зіскрібок епітелію, сік простати, кров, сперма, навколоплідні води, слиз, тканина плаценти, сеча, слина, рідина плевральна, цереброспінальна). При цьому, наприклад, сечостатевому тракті хворого можливе виявлення навіть одиничного шкідливого мікроба.

Методику ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) розробив американський вчений К. Мюллісом, який у 1993 отримав Нобелівську премію.

Активно використовується:

у ранньому діагностуванні інфекцій, генетичних, ;
у судово-медичній експертизі за наявності для дослідження вкрай малої кількості ДНК;
у ветеринарній медицині, фармацевтиці, біології, молекулярній генетиці;
для ідентифікації особи за ДНК, підтвердження батьківства;
у палеонтології, антропології, екології (при відстеженні якості продуктів, факторів довкілля).

Про те, що таке полімеразна ланцюгова реакція, розповість у подробицях дане відео:

Кому її призначають

Полімеразна ланцюгова реакція в діагностиці інфекційних захворювань - одна з найбільш надійних методик особливої точності та достовірності. Наприклад, достовірність проведеного аналізу ПЛР на хламідії та багато інших патогенів наближається до 100% (абсолютна). Найчастіше процедуру полімеразної ланцюгової реакції призначають пацієнтам, у яких при діагностуванні виникають складнощі з ідентифікацією конкретного збудника.

Лабораторний тест ПЛР застосовують:

для виявлення хвороботворних організмів, що викликають інфікування сечовивідних та статевих органів, що важко ідентифікуються при використанні посівів або методів імунології;
для повторного діагностування ВІЛ на початковій стадії у разі позитивного, але спричиняючого сумніву результату первинного аналізу (наприклад, у новонароджених від інфікованих СНІДом батьків);
для встановлення онкологічного захворювання на ранньому етапі (вивчення мутацій онкогенів) та індивідуальної корекції схеми лікування у конкретного пацієнта;
з метою раннього виявлення та потенційного лікування спадкових патологій.

Так, майбутні батьки здають аналіз, щоб дізнатися, чи є вони носіями генетичної патології, у дітей ПЛР визначає ймовірність схильності до хвороби, що передається у спадок.

для виявлення патологій плода на ранньому терміні виношування (окремі клітини ембріона, що росте, досліджують на наявність можливих мутацій);
у пацієнтів перед трансплантацією органів – для «тканинного типування» (визначення сумісності тканин);
для виявлення небезпечних патогенних організмів у донорській крові;
у новонароджених малюків – виявлення прихованих інфекцій;
для оцінки результатів антивірусного та антимікробного лікування.

Навіщо проходити таку процедуру

Оскільки ПЛР – високоефективний спосіб діагностики, що дає майже 100% результат, процедуру використовують:

для підтвердження чи виключення остаточного діагнозу;
швидкої оцінки ефективності терапії.

У багатьох випадках ПЛР - єдино можливий тест для виявлення захворювання, що розвивається, якщо інші бактеріологічні, імунологічні та вірусологічні методики діагностування виявляються марними.

Віруси виявляються за допомогою процедури ПЛР відразу після інфікування та до появи ознак хвороби. Раннє виявлення вірусу дає змогу оперативно призначити лікування.
Так зване "вірусне навантаження" (або - кількість вірусів в організмі) також визначається при аналізі ДНК кількісним методом.
Конкретні хвороботворні організми (наприклад, туберкульозну паличку Коха) складно та надто довго культивувати. Аналіз ПЛР дозволяє швидко виявити мінімальну кількість патогенів (живих та мертвих) у зразках, зручних для дослідження.

Детальний аналіз ДНК патогену використовується:

щоб визначити його чутливість до конкретних видів антибіотиків, що дозволяє негайно розпочати лікування;
щоб контролювати поширення епідемій серед свійських, диких тварин;
щоб виявити та відстежувати нові заразні види мікробів та підтипи патогенів, які спровокували попередні епідемії.

Види діагностики

Стандартний метод

Аналіз полімеразно-ланцюгової реакції проводиться на основі багаторазової ампліфікації (подвоєння) конкретного фрагмента ДНК та РНК при використанні спеціальних ферментів-праймерів. В результаті ланцюжка копіювання виходить кількість матеріалу, достатню для дослідження.

У ході процедури копіюється лише фрагмент, що шукається (відповідний заданим конкретним умовам) і у разі, якщо він дійсно присутній в пробі.

Про те, як проходить ПЛР, розповідає це докладне відео з корисними схемами:

Інші методи

ПЛР, що проводиться в режимі реального часу. У цьому виді дослідження процес виявлення заданого фрагмента ДНК запускається після проходження кожного циклу, а не після здійснення всього ланцюжка 30 - 40 циклів. Цей вид дослідження дозволяє отримати інформацію про кількість патогену (вірусу чи мікроба) в організмі, тобто здійснювати кількісний аналіз.
ВІД-ПЛР (режим зворотної транскрипції). Цей аналіз використовують для того, щоб знайти РНК з одним ланцюжком для виявлення вірусів, генетичною базою яких є саме РНК (наприклад, вірус гепатиту С, імунодефіциту). При такому дослідженні використовується спеціальний фермент - зворотна транскриптаза і певний праймер і основі РНК будується одноланцюгова ДНК. Потім із цього ланцюжка відновлюють другий ланцюг ДНК і виконується стандартна процедура.

Показання для проведення

Процедура ПЛР застосовується у клініці інфекційних хвороб, неонатології, акушерстві, педіатрії, урології, гінекології, венерології, неврології, нефрології, офтальмології.

Показання до призначення аналізу:

з'ясування ризику розвитку генетичних відхилень у дитини за ймовірності спадкових патологій;
діагностування обох батьків при плануванні вагітності або тяжкому стані матері при вагітності;
проблеми із зачаттям, виявлення причин безпліддя;
підозра на статеві інфекції у гострій стадії та при симптоматиці переходу їх у хронічну;
виявлення причин запальних процесів неясного походження;
незахищені випадкові та постійні статеві контакти;
визначення чутливості патогенного мікроорганізму до конкретних антибіотиків;
пацієнтам із підозрою на приховану інфекцію для виявлення патогенів до розвитку явної симптоматики (доклінічне діагностування);
хворим на підтвердження одужання після хвороби (ретроспективна діагностика);:

Також використовується діагностика при необхідності точного виявлення наступних збудників:

віруси гепатиту (A B C G), імунодефіциту людини, цитомегаловірус;
вібріон холерний;
вірус простого герпесу; герпетиформні види;
ретро – адено – та риновіруси;
віруси краснухи, Епштейна-Барр, варіцелла (Зостер – вірус);
парво - та пікорновіруси;
бактерія Helicobacter pylori;
легіонели, патогенні типи палички кишкової;
стафілокок золотистий;
збудник;
клостридії, дифтерійна та гемофільна паличка;

Використовується для визначення інфекцій:

інфекційний мононуклеоз;
бореліоз, листериоз, кліщовий енцефаліт;
кандидоз, що викликається грибками Candida;
статеві інфекції – трихомоніаз, уреаплазмоз, бліда трепонема, гарднереллез, гонорея, мікоплазмоз, хламідіоз;
туберкульоз.

Протипоказання щодо

Оскільки процедура проводиться не з пацієнтом, без будь-якого впливу на організм, а з біологічним матеріалом, взятим для дослідження, то жодних протипоказань для ПЛР немає через відсутність потенційної небезпеки.

Однак забір біоматеріалу з шийного каналу матки не проводять після процедури кольпоскопії. Здача мазків, зіскрібків на аналіз дозволена лише через 4 – 6 днів після закінчення менструації та повного припинення виділень.

Чи безпечний метод

Жодний негативний вплив на пацієнта при ізольованому дослідженні його біоматеріалу в лабораторних умовах неможливий.

Підготовка до процедури (здавання біологічних речовин на аналіз)

Як зразок для аналізу ПЛР, при якому виявляють ДНК чужорідного патогену, є будь-яка біологічна рідина, тканина, виділення організму. Забір досліджуваної речовини проводять у вигляді взяття крові з вени, зіскрібка з гортані, порожнини носа, сечівника, плевральної порожнини, шийки матки.

Перед діагностичною процедурою лікар пояснює пацієнту, забір якого матеріалу буде взято:

При обстеженні на статеві інфекції проводиться забір виділень із статевих органів, сеча, мазок з уретри.
При аналізі на герпетичні інфекції, цитомегаловірус, мононуклеоз – беруть на аналіз сечу, мазок із зіва, гепатит, токсоплазмоз - кров із вени.
З метою діагностування різних видів проводиться забір спинномозкової рідини.
У пульмонології зразки для аналізу - мокротиння та плевральна рідина.
Коли проводять дослідження можливих внутрішньоутробних інфекцій при виношуванні плода для аналізу використовують навколоплідні води та клітини плаценти.

Достовірність та точність аналізу залежить від стерильності умов під час взяття матеріалу. Оскільки дослідження ПЛР має високу чутливість, будь-яке забруднення досліджуваної речовини здатне спотворювати результат.

Грамотна підготовка до здачі біоматеріалу не становить пацієнтів жодних труднощів. Є певні рекомендації:

при аналізі на статеві інфекції:
- виключити інтимні контакти за 72 години до здавання матеріалу;
- припинити використання будь-яких вагінальних засобів за 3 доби;
- з вечора попереднього дня не проводити гігієну області, що досліджується;
- виключити сечовипускання за 3 – 4 години під час взяття проби з уретри;
припинити прийом антибіотиків за місяць до здавання аналізів на інфекції;
кров здають вранці до їди та пиття;
збирання першої ранкової порції сечі проводиться в стерильний контейнер після ретельного інтимного туалету.

Про те, як проводиться діагностика за методикою полімеразної ланцюгової реакції, читайте нижче.

Як проходить процедура

При виконанні дослідження ПЛР щоразу в реакторі (ампліфікатор або термоциклер) повторюються певні цикли:

Перший крок – денатурація. Слину, кров, біоптат, гінекологічні проби, мокротиння, в яких підозрюється присутність ДНК (або РНК) патогену, поміщають в ампліфікатор, де відбувається нагрівання матеріалу та розщеплення ДНК на два окремі ланцюжки.
Другий крок – відпал або невелике охолодження матеріалуі додавання щодо нього праймерів, здатних розпізнавати необхідні ділянки у молекулі ДНК і зв'язуватися із нею.
Третій крок – елонгація- відбувається після приєднання 2 праймерів до кожного з ланцюжків ДНК. В ході процесу фрагмент ДНК патогену добудовується, і формується копія.

Ці цикли повторюються на кшталт «ланцюгової реакції», щоразу призводячи до подвоєння копій специфічного фрагмента ДНК (наприклад, відрізка, де запрограмований певний вірус). За кілька годин утворюється безліч копій фрагмента ДНК, і виявляється їхня присутність у зразку. Після цього проводять аналіз та порівняння результатів з даними бази різних видів патогенів, щоб визначити вид інфекції.

Про розшифровку результатів та висновок виходячи з ПЛР-реакції читайте нижче.

Розшифровка результатів

Остаточний результат дослідження видається через 1 – 2 доби після здавання біологічного матеріалу. Нерідко – вже першу добу після аналізу.

Якісний аналіз

Негативнийрезультат означає, що в речовині, зданій на дослідження, слідів збудників інфекції не виявлено.
Позитивнийрезультат означає виявлення патогенних вірусів або бактерій у біологічному зразку з дуже високим ступенем точності на момент здачі матеріалу.

Якщо результат позитивний, але ознак активізації інфекції не виявлено – такий стан організму називають безсимптомним здоровим носієм. Найчастіше спостерігається під час взяття біоматеріалу з певного місця (цервікальний канал, уретра, порожнина рота) при вірусних захворюваннях. Лікування в цьому випадку не потрібне, але обов'язкове постійне лікарське спостереження, оскільки існує ймовірність:

поширення вірусу від носіїв та зараження здорових людей;
активізації процесу та перехід захворювання на хронічну форму.

Однак – якщо позитивним є аналіз крові, це вказує на те, що інфекція вразила організм, і це вже не стан носійства, а патологія, яка потребує негайної специфічної терапії.

Кількісний аналіз

Кількісний результат визначає фахівець для певного виду інфекції. На його підставі можна оцінити рівень розвитку, стадію хвороби, що дає можливість оперативно призначити правильне лікування.

Середня вартість

Ціни на проведення полімеразної ланцюгової реакції визначають: вид дослідження, складність ідентифікації збудника, складність забору біологічного матеріалу, вид аналізу (якісний чи кількісний), рівень цін у лабораторії.

З іншого боку, для дослідження ПЛР можна визначити відразу кілька патогенів при заборі одного виду матеріалу для аналізу. Це дозволяє заощадити на інших лабораторних аналізах.

Орієнтовно, вартість аналізу ПЛР у рублях:

гонокок, гарднерелла, трихомонада вагіналіс – від 180
хламідія трахоматис - від 190
папіломавірус – від 380 до 500
біоценоз урогенітального тракту у жінок (кількісна та якісна оцінка мікрофлори) – від 800.

Ще більше корисної інформації щодо дослідження ПЛР міститься у відеосюжеті нижче:

Генетика бактерій Інформація для другого заняття.

Полімеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція - метод, що дозволяє провести багаторазове збільшення (ампліфікацію) кількості певних молекул ДНК в зразку, що аналізується (у тому числі в біологічному матеріалі або чистій культурі).

Головні переваги ПЛР як діагностичного методу в мікробіології - дуже висока чутливість, що дозволяє виявлення вкрай малих концентрацій збудників у зразках, а також регульована специфічність, що дозволяє виявляти або ідентифікувати збудників на родовому, видовому або субвидовому рівні. Основний недолік ПЛР випливає з його вкрай високої чутливості - образи дуже легко забруднити ДНК з позитивного контролю, іншого зразка або продукту ПЛР, що призведе до хибно-позитивної реакції. Це накладає жорсткі обмеження на умови, в яких проводиться змішування ПЛР та робота з готовими продуктами ПЛР.

Проведення ПЛР.Готується реакційна суміш, що містить такі компоненти:

Виділену ДНК з досліджуваного зразка,

Буферний розчин

Іони Mg2+ (необхідні для роботи ферменту),

Два праймери - одноланцюгові короткі молекули ДНК (довжина найчастіше від 18 до 24 нуклеотидів), комплементарні кінцям різних ланцюгів послідовності ДНК, що виявляється.

Суміш дезоксинуклеотидтрифосфатів.

Термостійку ДНК-полімеразу (найчастіше використовується Taq-полімераза - полімераза, виділена з Thermus aquaticus).

Потім дана реакційна суміш міститься в ампліфікатор, який фактично є програмованим термостатом. В ампліфікаторі проводиться 30-40 циклів зміни температури. Кожен із цих циклів складається з трьох етапів (див. рис. 1):

Денатурація (температура 94 про З) – розриваються водневі ланцюги, і ланцюжка ДНК розходяться.

Відпал праймерів (температура зазвичай близько 50-60 про З) – до кінців ланцюгів ДНК приєднуються праймери. Взагалі, при зниженні температури енергетично вигідніше возз'єднання вихідних ланцюгів ДНК з досліджуваного зразка (ренатурація), проте концентрація праймерів в реакційній суміші на багато порядків більше концентрації ДНК зі зразка (принаймні, на початкових циклах ПЛР), тому реакція відпалу праймерів протікає швидше ДНК. Температура відпалу вибирається залежно від температури плавлення (денатурації) праймерів.

Елонгація (температура зазвичай 72 про С) – ДНК-полімераза добудовує праймери матриці довгих ланцюгів ДНК. Температура відповідає оптимальній температурі роботи використовуваної ДНК-полімерази.

Детекція результатів відрізняється у різних варіантах постановки ПЛР та описана у розділі «Різновиди ПЛР».

Динаміка ПЛР

На ранніх циклах ПЛР кількість дволанцюгових молекул ДНК, розмір яких визначається відстанню між місцями посадки праймерів, подвоюється з кожним циклом. Також утворюється мала кількість довших молекул ДНК, яких можна знехтувати (див. рис 2).

Таким чином, на ранніх циклах кількість продукту ПЛР описується формулою m*2 n , де m – вихідна кількість шуканої ДНК у пробі, n – число циклів. Потім реакція виходить на плато. Це відбувається через накопичення продукту реакції, зниження концентрації праймерів і дезоксинуклеотидтрифосфатів, а також підвищення концентрації пірофосфату (див. Рис 3).

Різновиди ПЛР

Конвенційна ПЛР

У даному варіанті постановки ПЛР реакція йде заздалегідь обране число циклів (30-40), після чого аналізується, чи накопичення дволанцюгових молекул ДНК відбулося в реакційній суміші.

Даний варіант постановки ПЛР при використанні як спосіб діагностики є якісним методом. Позитивна реакція свідчить про наявність хоча б слідових кількостей молекул ДНК, що шукаються в зразку. Негативна реакція свідчить про їхню відсутність. Кількісна оцінка вмісту вихідних молекул ДНК у зразку неможлива через вихід реакції на плато.

Основним методом виявлення наявності продукту є електрофорез у агарозному або поліакриламідному гелі. Продукти ПЛР поділяються в гелі під дією електричного поля відповідно до їх молекулярної маси. У гель додається інтеркалюючий барвник (флуоресцентний у пов'язаному з дволанцюжковою ДНК стані - найчастіше бромистий етидій). Таким чином, при опроміненні ультрафіолетом можна буде побачити наявність або відсутність смужки, що відповідає ДНК необхідної молекулярної маси. Під час проведення ПЛР у діагностичних цілях завжди ставляться позитивний і негативний контролі реакції, із якими порівнюються зразки (див. рис. 4).

ПЛР у реальному часі

У даному варіанті постановки ПЛР кількість продукту ПЛР реакційної суміші реєструється постійно в ході протікання реакції. Це дозволяє побудувати криву перебігу реакції (див. рис. 3) і, виходячи з неї, розрахувати кількість шуканих молекул ДНК у зразках.

Один із видів проведення ПЛР у реальному часі – з використанням інтеркалюючого барвника, який додається прямо в реакційну суміш (найчастіше використовується SYBRGreen). Інший вид - з використанням одного з видів флуоресціюючих зондів, що зв'язуються з ділянкою всередині ПЛР-продукту, що дозволяє підвищити специфічність виявлення (див. Рис 5). Детекція флуоресценції відбувається безпосередньо в приладі в ході протікання реакції.

Крім можливості кількісного виявлення, існують інші переваги ПЛР в реальному часі в порівнянні з конвенційною. Даний варіант ПЛР більш простий, швидкий, а також не вимагає відкриття пробірок з продуктами ПЛР, що зменшує ймовірність забруднення інших зразків. Основний недолік – більш висока вартість ампліфікатора із вбудованою можливістю детекції флуоресценції порівняно із звичайним.

Цифрова кількісна ПЛР

Новий, дорогий і поки що малопоширений варіант ПЛР, що дозволяє більш точно визначати кількість ДНК у зразку. У даному варіанті реакційна суміш, що містить флуоресцентний барвник, розбивається на величезну кількість мікроскопічних об'ємів (наприклад, крапельок в емульсії). Після протікання ПЛР аналізується, у якій частці крапель реакція виявилася позитивною і, відповідно, спостерігається флуоресценція. Ця частка буде пропорційна числу шуканих молекул ДНК у зразку.

ПЛР із зворотною транскрипцією

У разі перед тим чи іншим варіантом ПЛР виробляється реакція зворотної транскрипції (РНК в ДНК) з допомогою ферменту ревертази. Таким чином, цей метод дозволяє проводити якісне чи кількісне виявлення молекул РНК. Це може використовуватися для детекції РНК-вірусів або визначення рівня транскрипції (кількості мРНК) того чи іншого гена.

Малюнок 1.Етапи ПЛР. Червоним кольором позначені праймери.

Малюнок 2.Накопичення дволанцюгових молекул ДНК, обмежених праймерами, під час ПЛР.

Малюнок 3.Динаміка реакції ПЛР при різних початкових концентраціях молекул ДНК, що шукаються в пробі. (а) – найбільша концентрація (б) – проміжна концентрація (в) – найменша концентрація

Малюнок 4.Агарозний електрофорез продуктів ПЛР. К+ - позитивний контроль (заздалегідь присутня ДНК, що шукається). 1-7 - досліджувані зразки (з них 1-2 - позитивні, 3-7 - негативні). K-негативний контроль (відомо відсутня шукана ДНК). У багатьох випадках, крім цільового продукту, видно більш легкі неспецифічні продукти реакції (праймер-димери).

Малюнок 5.Способи детекції під час використання ПЛР у часі. (а) – інтеркалюючий барвник – флуоресціює при зв'язуванні з дволанцюжковою ДНК (б) – зонд Taqman – флуоресценція виникає при розщепленні зонда ДНК полімеразою з 5'-3' ендонуклеазною активністю за рахунок поділу флуорофору та гасника. (в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценція виникає при гібридизації зонда з цільовим фрагментом за рахунок просторового віддалення флуорофору та гасника (г) – зонди LightCycler - флуоресценція акцептора виникає при гібридизації зондів перенесення (FRET).