Lančana reakcija polimeraze (PCR)

Suština PCR metode. DNK polimeraza

Lančana reakcija polimeraze eksperimentalna je metoda molekularne biologije koja omogućuje značajno povećanje malih koncentracija određenih fragmenata nukleinske kiseline u biološkom materijalu. Ovaj proces povećanja broja kopija DNK naziva se pojačanje... Kopiranje DNK tokom PCR -a vrši se posebnim enzimom - polimeraza. DNA polimeraza (slika 3) je enzim uključen u replikaciju DNK (amplifikaciju DNK u živim organizmima). Enzimi ove klase kataliziraju polimerizaciju deoksiribonukleotida duž nukleotidnog lanca DNA, koji enzim "čita" i koristi kao predložak. Vrsta novog nukleotida određena je principom komplementarnosti sa predloškom iz kojeg se čita.

DNK polimeraza dodaje slobodne nukleotide na 3 "kraj sastavljenog lanca. To dovodi do produženja niti u smjeru 5" -3 ". Nijedna od poznatih DNA polimeraza ne može stvoriti lanac od nule: oni mogu samo dodati nukleotide već postojeća 3 "-hidroksilna grupa. Iz tog razloga je potrebna DNK polimeraza prajmer- kratka sekvenca nukleotida (obično 20-25), komplementarna krajevima gena koji se proučava - u koju je mogla dodati prvi nukleotid. Prajmeri se uvijek sastoje od baza DNK i RNK, dok su prve dvije baze uvijek baze RNK. Prajmere sintetiše drugi enzim - primazoy... Još jedan enzim - helicase-neophodan je za odmotavanje dvostruke spirale DNK sa formiranjem jednolančane strukture, koja osigurava replikaciju oba lanca u skladu sa polukonzerviranim modelom replikacije DNK.

Neke DNK polimeraze također imaju mogućnost ispravljanja grešaka u novosklopljenom lancu DNK. Ako se otkrije pogrešan par nukleotida, DNK polimeraza se kotrlja unatrag, isključuje pogrešan nukleotid iz lanca, zatim ubacuje ispravan nukleotid na svoje mjesto, nakon čega se replikacija nastavlja kao i obično.

Izvođenje PCR -a

Lančana reakcija polimeraze (PCR) je metoda amplifikacije DNK koja vam omogućuje da izolirate i umnožite određeni niz DNK milijarde puta u roku od nekoliko sati. Mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija jedne strogo određene regije genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje dostupnog uzorka DNK.

Za provođenje lančane reakcije polimeraze moraju biti ispunjeni brojni uvjeti. Za izvođenje PCR -a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

Predložak DNK koji sadrži dio DNK koji želite pojačati.

Dva prajmera komplementarna krajevima željenog fragmenta. (Par umjetno sintetiziranih oligonukleotida, obično veličine 15 do 30 bp, identični su odgovarajućim regijama ciljane DNA. Oni igraju ključnu ulogu u stvaranju produkata reakcije amplifikacije. Pravilno odabrani prajmeri pružaju specifičnost i osjetljivost testni sistem.)

Termostabilna DNK polimeraza. Polimeraza koja se koristi u PCR -u mora dugo ostati aktivna na visokim temperaturama, pa se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus (Taq polimeraza) i drugi.

Deoksinukleotidni trifosfati (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Za rad polimeraze potrebni su ioni Mg 2+.

Puferska otopina osigurava potrebne reakcijske uvjete - pH, ionsku jakost otopine. Sadrži soli, albumin u serumu.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog ključanja, na primjer, vazelin. Ako koristite uređaj s grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodavanjem pirofosfataze može se povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusprodukta dodavanja nukleotid trifosfata rastućem lancu DNK u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Za množenje broja kopija izvorne DNK potrebna je ciklična reakcija. Obično se svaki od sekvencijalno ponavljanih ciklusa PCR -a sastoji od tri faze:

1... Denaturacija ili "topljenje" DNK. Dvolančani DNK šablon zagrijava se na 94 - 96 ° C (ili do 98 ° C, ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minute kako bi se omogućilo odvajanje DNK lanaca. Ova faza naziva se denaturacija jer se vodikove veze između dva lanca DNK uništavaju. Ponekad se, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakcijska smjesa zagrijava 2 - 5 minuta kako bi se potpuno denaturirala šablona i prajmeri. Ova tehnika se naziva vrući start, omogućuje vam smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

2. Žarenje - vezivanje prajmera za šablonsku DNK... Kada se lanci raziđu, temperatura se polako snižava tako da se parimeri mogu vezati za jednolančanu matricu. Temperatura žarenja ovisi o sastavu prajmera i obično se bira 50-65 ° S. Vrijeme faze - 20 - 60 sekundi. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi do lošeg vezivanja prajmera za šablon (pri visokim temperaturama) ili do vezivanja na pogrešnom mjestu i pojave nespecifičnih proizvoda (pri niskim temperaturama).

3. Sinteza (izduženje lanca). DNK polimeraza replicira niz šablona koristeći prajmer kao "sjeme". Polimeraza započinje sintezu drugog lanca sa 3 'kraja prajmera, koji se veže za šablon i kreće duž šablona. Temperatura produženja zavisi od polimeraze. Često korištene Taq i Pfu polimeraze su najaktivnije na 72 ° C. Vrijeme sinteze ovisi o vrsti DNK polimeraze i duljini fragmenta koji se pojačava Obično se vrijeme produženja uzima jednaka jedna minuta za svakih hiljadu parova baza. Nakon završetka svih ciklusa, često je dodatni korak izvršeno konačno produženje dovršiti sve jednolančane fragmente. Ova faza traje 7-10 minuta.

Nakon toga se faze denaturacije, žarenja i produženja ponavljaju mnogo puta (30 ili više puta). U svakom ciklusu udvostručuje se broj sintetiziranih kopija fragmenta DNK.

Sve reakcije se provode u epruvetama uronjenim u termostat. Temperaturni režim se automatski mijenja i održava.

Da bi se razumjelo kako točno dolazi do amplifikacije određenog segmenta DNA tijekom PCR -a, potrebno je jasno zamisliti položaj svih početnica i njihovih komplementarnih sekvenci u amplificiranim lancima u svakoj rundi. U prvom krugu, svaki od novo sintetiziranih niti je mnogo duži od udaljenosti od 3'-hidroksilne grupe svog prajmera do krajnjeg nukleotida sekvence koja je komplementarna drugom prajmeru. Takvi se lanci nazivaju "dugački šabloni" će se koristiti za dalju sintezu.

U drugom krugu, dvolančana DNK koja se sastoji od sličnih i novo sintetiziranih (dugi šablon) niti se ponovo denaturira, a zatim žari premazima. Tokom sinteze u ovoj rundi, ponovo se sintetiziraju "dugi predlošci", kao i niz niti sa prajmerom na jednom kraju i sa sekvencom komplementarnom drugom prajmeru na drugom ("kratki predlošci"). Tokom treće runde, svi prethodno formirani heterodupleksi se istovremeno denaturiraju i žare prajmerima, a zatim repliciraju. U sljedećim rundama broj "kratkih matrica" postaje sve veći, a do 30. runde njihov broj već premašuje broj originalnih lanaca ili "dugih matrica" za 10 6 puta.

Količina specifičnog produkta reakcije (ograničena prajmerima) teoretski se povećava proporcionalno 2 n, gdje je n broj ciklusa reakcije. U stvari, efikasnost svakog ciklusa može biti manja od 100%, pa u stvarnosti:

gdje je P količina proizvoda, E prosječna efikasnost ciklusa.

Broj "dugih" kopija DNK također raste, ali linearno, pa specifičan fragment dominira u produktima reakcije. Rast potrebnog proizvoda eksponencijalno je ograničen količinom reagensa, prisutnošću inhibitora i stvaranjem nusprodukata.

PCR je vrlo osjetljiva metoda, pa ako se u testnom uzorku nalazi čak i neznatna količina DNK, koja je slučajno prešla iz jedne reakcijske smjese u drugu, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati. Zbog toga je potrebno pažljivo pratiti sva rješenja i pribor koji se koriste za PCR.

Osnovni principi odabira prajmera.

Prilikom stvaranja PCR testnog sistema, jedan od glavnih zadataka je ispravan odabir prajmera, koji mora zadovoljiti niz kriterija:

1. Osnovni premazi moraju biti specifični. Posebna pažnja se posvećuje 3 'krajevima prajmera, jer se od njih počinje stvarati komplementarna DNK nit Taq-polimeraza. Ako njihova specifičnost nije dovoljna, onda je vjerojatno da će se u epruveti pojaviti neželjeni procesi s reakcijskom smjesom, naime, sintezom nespecifične DNK (kratkih ili dugih fragmenata). Vidljiva je na elektroforezi u obliku teških ili lakih dodatnih traka. To ometa procjenu rezultata reakcije, jer je lako zbuniti specifični produkt amplifikacije sa sintetiziranom stranom DNK do značajnog gubitka osjetljivosti.

2. Osnovni premazi ne smiju stvarati dimere i petlje; ne smiju nastati stabilni dvostruki lanci kao rezultat žarenja prajmera na sebe ili jedni na druge.

Što vam omogućuje da u biološkom materijalu otkrijete male količine preciznije određenih njegovih fragmenata i umnožite ih više puta. Zatim se vizualno identificiraju gel elektroforezom. Reakciju je 1983. razvio K. Mullis i uključena je u listu izvanrednih otkrića posljednjih godina.

Koji su mehanizmi PCR -a

Cijela tehnika temelji se na sposobnosti nukleinskih kiselina da se samostalno repliciraju, što se u ovom slučaju umjetno izvodi u laboratoriji. Reprodukcija DNK ne može započeti ni u jednoj regiji molekule, već samo u regijama s određenim nizom nukleotida - početnim fragmentima. Da bi lančana reakcija polimeraze započela, potrebni su primeri (ili DNK sonde). To su kratki fragmenti DNK lanca sa datom nukleotidnom sekvencom. Oni su komplementarni (tj. Odgovaraju) početnim mjestima

Naravno, kako bi stvorili početnike, naučnici moraju proučiti nukleotidnu sekvencu one koja je uključena u tehniku. Upravo te DNK sonde daju specifičnost reakcije i njezino započinjanje. neće raditi ako uzorak ne sadrži barem jedan molekul željene DNK. Općenito, za reakciju su potrebni gornji početnici, set nukleotida i DNA polimeraza otporna na toplinu. Ovaj drugi je enzim - katalizator za sintezu novih molekula nukleinske kiseline na osnovu uzorka. Sve ove tvari, uključujući biološki materijal u kojem će se otkriti DNK, kombiniraju se u reakcijsku smjesu (otopinu). Smješten je u poseban termostat koji se zagrijava i hladi vrlo brzo u zadanom vremenu - ciklusu. Obično ih ima 30-50.

Kako protiče ova reakcija?

Njegova suština je u tome što se tokom jednog ciklusa prajmeri vezuju za željene dijelove DNK, nakon čega se ona udvostručuje pod djelovanjem enzima. Na temelju rezultirajućih DNK lanaca, u sljedećim ciklusima sintetiziraju se novi i novi identični fragmenti molekule.

Lančana reakcija polimeraze odvija se uzastopno, razlikuju se njezine sljedeće faze. Prvi karakterizira udvostručavanje količine proizvoda tokom svakog ciklusa zagrijavanja i hlađenja. U drugoj fazi, reakcija se usporava, jer je enzim oštećen i također gubi aktivnost. Osim toga, iscrpljuju se rezerve nukleotida i prajmera. U posljednjoj fazi - visoravni - proizvodi se više ne akumuliraju, jer je reagensa ponestalo.

Gdje se koristi

Bez sumnje, lančana reakcija polimeraze naširoko se koristi u medicini i znanosti. Koristi se u općoj i privatnoj biologiji, veterini, farmaciji, pa čak i ekologiji. Štoviše, u potonjem se to radi radi praćenja kvalitete hrane i predmeta u vanjskom okruženju. Lančana reakcija polimeraze aktivno se koristi u forenzičkoj praksi za potvrđivanje očinstva i identifikaciju ličnosti osobe. U sudsko -medicinskim pregledima, kao i u paleontologiji, ova tehnika je često jedini izlaz, jer je obično izuzetno mala količina DNK dostupna za istraživanje. Naravno, metoda je našla vrlo široku primjenu u praktičnoj medicini. Potreban je u područjima kao što su genetika, zarazne i onkološke bolesti.

Međutim, u to vrijeme ova ideja nije ostala tražena. Lančanu reakciju polimeraze ponovno je 1983. godine otkrio Carey Mallis. Njegov cilj je bio stvoriti metodu koja bi omogućila amplifikaciju DNK tokom višestrukih uzastopnih duplikacija izvornog molekula DNK pomoću enzima DNK polimeraze. Sedam godina nakon objavljivanja ove ideje, 1993., Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku korištenja metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja - hlađenja, u reakcijsku smjesu se morala dodavati DNA polimeraza, jer se brzo inaktivirala na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje niti DNK spirale. Postupak je bio vrlo neučinkovit i zahtijevao je puno vremena i enzima. 1986. značajno je poboljšana. Predloženo je korištenje DNK polimeraza iz termofilnih bakterija. Utvrđeno je da su ti enzimi termički stabilni i da mogu izdržati više ciklusa reakcije. Njihova upotreba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR -a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticus i imenovani Taq-polimeraza. Nedostatak ove polimeraze je to što je vjerojatnost uvođenja pogrešnog nukleotida prilično velika, jer ovom enzimu nedostaju mehanizmi za ispravljanje grešaka (3 "→ 5" eksonukleazna aktivnost). Polimeraza Pfu i Pwo izolirani iz arheja posjeduju takav mehanizam, njihova upotreba značajno smanjuje broj mutacija u DNK, ali je brzina njihovog rada (procesnost) manja od one Taq... Sada se koriste mješavine Taq i Pfu kako bi se postigla velika brzina stvrdnjavanja i velika preciznost kopiranja.

U vrijeme pronalaska metode, Mallis je radio za Cetus Corporation, koja je patentirala PCR metodu. Godine 1992. Cetus je prodao prava na metodu i patent za upotrebu Taq-polimeraza iz kompanije Hoffmann-La Roche za 300 miliona dolara. Međutim, ispostavilo se da je tako Taq-polimerazu je okarakterisao ruski biohemičar Aleksej Kaledin 1980. godine, u vezi s čime je kompanija Promega (Promega) pokušala na sudu natjerati Roche da se odrekne isključivih prava na ovaj enzim. Američki patent za PCR metod istekao je u martu 2005.

Izvođenje PCR -a

Metoda se temelji na višestrukom selektivnom kopiranju određene regije DNA pomoću enzima u umjetnim uvjetima ( in vitro). U ovom slučaju kopira se samo odjeljak koji zadovoljava navedene uvjete i samo ako je prisutan u uzorku koji se proučava. Za razliku od amplifikacije DNK u živim organizmima (replikacija), relativno kratki dijelovi DNK se pojačavaju pomoću PCR -a. U uobičajenom procesu PCR -a, dužina kopiranih DNK regija nije veća od 3000 parova baza (3 kbp). Korištenjem mješavine različitih polimeraza, korištenjem aditiva i pod određenim uvjetima, duljina PCR fragmenta može doseći 20-40 tisuća parova baza. To je još uvijek znatno manje od dužine kromosomske DNK eukariotske stanice. Na primjer, ljudski genom se sastoji od približno 3 milijarde parova baza.

Komponente reakcije

Za izvođenje PCR -a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

DNK matriks koji sadrži dio DNK koji želite pojačati.
Dva prajmera komplementaran sa suprotnim krajevima različitih lanaca željenog fragmenta DNK.
Termostabilni DNK polimeraza- enzim koji katalizira reakciju polimerizacije DNA. Polimeraza za upotrebu u PCR -u mora dugo zadržati aktivnost na visokoj temperaturi, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) i drugi.
Deoksinukleozid trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Za rad polimeraze potrebni su ioni Mg 2+.
Puferski rastvor obezbeđujući neophodne uslove reakcije - pH, jonsku snagu rastvora. Sadrži soli, albumin goveđeg seruma.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog ključanja, na primjer, vazelin. To nije potrebno ako se koristi termički ciklus s grijanim poklopcem.

Dodavanjem pirofosfataze može se povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusprodukta dodavanja nukleotid trifosfata u rastući lanac DNK, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Temeljni premazi

Specifičnost PCR-a temelji se na stvaranju komplementarnih kompleksa između šablona i prajmera, kratkih sintetičkih oligonukleotida dužine 18-30 baza. Svaki od početnih slojeva komplementaran je s jednim od nizova dvolančanog predloška i omeđuje početak i kraj pojačane regije.

Nakon hibridizacije šablone s prajmerom (žarenje), ovaj služi kao prajmer za DNK polimerazu u sintezi komplementarnog lanca šablona (vidi).

Najvažnija karakteristika prajmera je temperatura taljenja (T m) kompleksa prajmer-šablon. T m je temperatura pri kojoj polovina DNK šablona tvori kompleks s oligonukleotidnim prajmerom. Tačka topljenja može se ugrubo odrediti formulom, gdje je n X broj X nukleotida u prajmeru. U slučaju pogrešnog odabira dužine i sastava nukleotida prajmera ili temperature žarenja, moguće je stvaranje djelomično komplementarnih kompleksa s drugim regijama DNK šablona, što može dovesti do pojave nespecifičnih produkata. Gornja granica tališta ograničena je optimalnom temperaturom djelovanja polimeraze, čija se aktivnost smanjuje na temperaturama iznad 80 ° C.

Prilikom odabira temeljnih premaza preporučljivo je pridržavati se sljedećih kriterija:

Pojačalo

Pirinač. 1: Pojačalo za PCR

PCR se provodi u pojačalu - uređaju koji omogućuje periodično hlađenje i zagrijavanje cijevi, obično s točnošću od najmanje 0,1 ° C. Moderna pojačala omogućuju vam postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "vrućeg starta", PCR -a na dodir (vidi dolje) i kasnije pohranjivanje pojačanih molekula na 4 ° C. Za PCR u stvarnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Postoje i instrumenti sa automatskim poklopcem i pregradom za mikroploče za integraciju u automatizovane sisteme.

Napredak reakcije

Fotografija gela koji sadrži marker DNK (1) i proizvode PCR reakcije (2,3). Brojevi pokazuju dužinu fragmenata DNK u parovima nukleotida

Obično se pri provođenju PCR-a izvodi 20-35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze (slika 2).

Denaturacija

Dvolančani DNK šablon zagrijava se na 94-96 ° C (ili 98 ° C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5-2 minute kako bi se omogućilo odvajanje DNK lanaca. Ova faza se naziva denaturacija, jer su vodikove veze između dva lanca DNK uništene. Ponekad se, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakcijska smjesa zagrijava 2-5 minuta. za potpunu denaturaciju predloška i prajmera. Ova tehnika se naziva vrući start, omogućuje vam smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

Žarenje

Kad se pramenovi rasprše, temperatura se snižava tako da se prajmeri mogu vezati za predložak s jednom niti. Ova faza se naziva žarenje... Temperatura žarenja ovisi o sastavu prajmera i obično se bira 4-5 ° C ispod njihove tališta. Vrijeme faze - 0,5-2 minute. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi do lošeg vezivanja prajmera za matricu (pri visokim temperaturama) ili do vezivanja na pogrešnom mjestu i pojave nespecifičnih proizvoda (pri niskim temperaturama).

Elongation

Vrste PCR -a

"Ugniježđeni" PCR (ugniježđeni PCR) - koristi se za smanjenje broja nusprodukata reakcije. Koriste se dva para prajmera i provode se dvije uzastopne reakcije. Drugi par prajmera pojačava dio DNA unutar produkta prve reakcije.
"Inverzna" PCR (Inverse PCR (eng.)) - koristi se u slučaju da je poznat samo mali dio željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada trebate odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Da bi se izveo obrnuti PCR, izvodi se niz DNK rezova s restrikcijskim endonukleazama, nakon čega slijedi spajanje fragmenata (ligacija). Kao rezultat toga, poznati fragmenti pojavljuju se na oba kraja nepoznate regije, nakon čega se PCR može izvesti kao i obično.
PCR reverzne transkripcije (RT-PCR) koristi se za amplifikaciju, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNA biblioteke. Prije konvencionalne PCR, jednolančana molekula DNA se sintetizira na šablonu mRNA pomoću reverzne transkriptaze i dobije se jednolančana cDNA, koja se koristi kao šablon za PCR. Ova metoda se često koristi za određivanje gdje i kada su ti geni eksprimirani.
Asimetrična PCR (rus. Asimetrična PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca izvorne DNK. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije. PCR se izvodi kao i obično, osim što se jedan od prajmera uzima u velikom višku.
Kvantitativna PCR (Q-PCR) koristi se za brzo mjerenje količine određene DNK, cDNK ili RNK u uzorku.
Kvantitativna PCR u stvarnom vremenu - Ova metoda koristi fluorescentno označene reagense za precizno mjerenje količine produkta reakcije pri njegovom nakupljanju.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - ovom metodom se smanjuje učinak nespecifičnog vezivanja prajmera na stvaranje proizvoda. Prvi ciklusi se izvode na temperaturi iznad temperature žarenja, zatim se temperatura smanjuje svakih nekoliko ciklusa. Na određenoj temperaturi sistem će proći kroz pojas optimalne specifičnosti prajmera za DNK.
Metoda molekularnih kolonija (PCR gelom) Polony - PCR Colony) - akrilamidni gel se polimerizira sa svim PCR komponentama na površini i provodi se PCR. Na mjestima koja sadrže analiziranu DNK dolazi do amplifikacije stvaranjem molekularnih kolonija.
PCR sa brzom amplifikacijom krajeva cDNA (rus. Brza amplifikacija krajeva cDNA, RACE-PCR )
PCR sa dugim fragmentima (rus. PCR dugog dometa) - modifikacija PCR -a za amplifikaciju proširenih regija DNK (10 hiljada baza i više). Koriste se dvije polimeraze, od kojih je jedna Taq polimeraza s visokom procesivnošću (odnosno sposobna sintetizirati dugi lanac DNA u jednom prolazu), a druga je DNA polimeraza s 3 "-5" endonukleaznom aktivnošću. Druga polimeraza je potrebna za ispravljanje grešaka koje je uvela prva.
RAPD PCR (eng. Slučajna amplifikacija polimorfne DNK PCR , PCR sa nasumičnim pojačavanjem polimorfne DNK - koristi se kada je potrebno razlikovati organizme bliske po genetskom slijedu, na primjer, različite sorte gajenih biljaka, pasmina pasa ili blisko povezane mikroorganizme. Ova metoda obično koristi jedan mali prajmer (20 - 25 bp). Ovaj prajmer će biti djelomično komplementaran sa nasumičnim regijama DNK proučavanih organizama. Odabirom uslova (dužina prajmera, sastav, temperatura itd.) Moguće je postići zadovoljavajuću razliku u PCR uzorku za dva organizma.

Možete upotrijebiti ako je nukleotidna sekvenca predloška djelomično ili uopće nije poznata degenerirani prajmeričiji slijed sadrži degenerirane položaje u kojima se mogu nalaziti bilo koje baze. Na primjer, niz prajmera može biti: ... ATH ..., gdje je H A, T ili C.

PCR aplikacija

PCR se koristi u mnogim poljima za analizu i naučne eksperimente.

Forenzika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban je uzorak genetskog materijala sa mjesta zločina - krv, pljuvačka, sjeme, dlaka itd. Upoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenog. Teoretski je dovoljna vrlo mala količina DNK - jedna kopija. DNK se cijepa na fragmente, zatim amplificira PCR -om. Fragmenti se odvajaju pomoću DNK elektroforeze. Rezultirajuća slika lokacije DNK traka naziva se genetski otisak prsta(eng. genetski otisak prsta).

Utvrđivanje očinstva

Pirinač. 3: Rezultati elektroforeze fragmenata DNK pojačane PCR -om. (1) Otac. (2) Dijete. (3) Majka. Dijete je naslijedilo neke karakteristike genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstven otisak.

Iako su „genetski otisci prstiju“ jedinstveni (osim u slučaju jednojajčanih blizanaca), porodične veze se i dalje mogu uspostaviti tako što se napravi nekoliko takvih otisaka prstiju (slika 3). Ista se metoda može primijeniti, uz male izmjene, za uspostavljanje evolucijskog srodstva među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje značajno ubrzanje i olakšavanje dijagnoze nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen se amplificira pomoću PCR -a koristeći odgovarajuće prajmere, a zatim sekvencira radi otkrivanja mutacija. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije nego što se pojave simptomi bolesti.

Personalizovana medicina

Poznato je da većina lijekova ne djeluje na sve pacijente kojima su namijenjeni, već samo na 30-70% njihovog broja. Osim toga, mnogi lijekovi su otrovni ili alergeni na neke pacijente. Razlozi za to djelomično su u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Ove razlike su određene na genetskom nivou. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom (protein jetre odgovoran za metabolizam stranih tvari) može biti aktivniji, kod drugog manje. Kako bi se utvrdilo kakvim citokromom raspolaže određeni pacijent, predlaže se provođenje PCR analize prije upotrebe lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija (eng. buduće genotipiziranje).

Kloniranje gena

Kloniranje gena (ne miješati se s klonirajućim organizmima) je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskim inženjeringom, dobivanje velike količine proizvoda datog gena. PCR se koristi za amplifikaciju gena, koji se zatim ubacuje u vektor- fragment DNK koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za rast. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNK. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobivanje proizvoda ovog gena - RNK ili, češće, proteina. Tako se mnogi proteini dobivaju u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Pirinač. 4: Kloniranje gena pomoću plazmida. ...
(1) Hromozomska DNK organizma A. (2) PCR. (3) Mnogo kopija gena organizma A. (4) Umetanje gena u plazmid. (5) Plazmid s genom organizma A. (6) Uvođenje plazmida u organizam B. (7) Umnožavanje broja kopija gena organizma A u organizmu B.

DNK sekvenciranje

U metodi sekvenciranja koja koristi fluorescentno označene ili radioaktivne izotope dideoksinukleotide, PCR je sastavni dio, jer se tokom polimerizacije derivati nukleotida označeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom inkorporiraju u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućavajući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon razdvajanja sintetiziranih niti u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda za provođenje mutageneze. Upotreba PCR -a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka provođenja mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i reprodukciju.

1. Lančana reakcija polimeraze (PCR)

2. Princip metode lančane reakcije polimeraze

2.1 Prisutnost niza komponenti u reakcijskoj smjesi

2.2 Ciklični temperaturni uslovi

2.3 Osnovni principi odabira prajmera

2.4 Efekat "platoa"

3. Faze proizvodnje PCR -a

3.2 Pojačavanje

3.4.1 Pozitivne kontrole

3.4.2 Unutrašnje kontrole

4.1 Kvalitativna analiza

4.1.2 Detekcija molekula RNK

3.1 Priprema uzorka biološkog materijala

Za ekstrakciju DNK koriste se različite tehnike, ovisno o zadacima. Njihova suština leži u ekstrakciji (ekstrakciji) DNK iz biološkog proizvoda i uklanjanju ili neutraliziranju nečistoća kako bi se dobio DNK pripravak čistoće pogodne za PCR.

Metoda za dobivanje čistog pripravka DNK, koju je opisao Marmur, smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimsku proteolizu praćenu deproteinizacijom i ponovnom taloženjem DNA alkoholom. Ova metoda vam omogućuje da dobijete čisti DNK pripravak. Međutim, prilično je naporan i uključuje rad s agresivnim i oštrim tvarima poput fenola i kloroforma.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom i sur. Ova metoda se temelji na upotrebi jakog haotropnog sredstva, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu ćelija, i naknadnu sorpciju DNK na nosaču (staklene perle, dijatomejska zemlja, stakleno "mlijeko" itd.). Nakon ispiranja, DNK ostaje u uzorku, adsorbirana na nosaču, s kojeg se može lako ukloniti pomoću elucijskog pufera. Metoda je prikladna, tehnološka i pogodna za pripremu uzorka za pojačavanje. Međutim, mogući su gubici DNK zbog nepovratne sorpcije na nosaču, kao i u procesu brojnih ispiranja. Ovo je posebno važno pri radu s malim količinama DNK u uzorku. Osim toga, čak i tragovi GuSCN -a mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode pravi izbor sorbenta i pažljivo poštivanje tehnoloških nijansi vrlo važno.

Druga skupina metoda pripreme uzoraka temelji se na upotrebi ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji za razliku od stakla ne adsorbiraju DNK, već, naprotiv, nečistoće koje ometaju reakciju. Ova tehnologija u pravilu uključuje dvije faze: vrenje uzorka i sorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvođenja. U većini slučajeva prikladan je za rad s kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s takvim nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki mikroorganizmi se ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzoraka.

Stoga bi izbor metode pripreme uzorka trebalo uzeti u obzir uz razumijevanje ciljeva predviđenih analiza.

3.2 Pojačavanje

Za provođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcijsku smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. U ovom slučaju važno je uzeti u obzir neke od karakteristika pražnjenja prajmerom. Činjenica je da analizirani biološki uzorak u pravilu sadrži različite molekule DNA, na koje početni slojevi korišteni u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, prajmeri se mogu međusobno žariti kako bi nastali dimeri prajmera. Oboje dovodi do značajne potrošnje prajmera za sintezu nusproizvoda (nespecifičnih) produkata reakcije i, kao posljedicu, značajno smanjuje osjetljivost sistema. To otežava ili onemogućava čitanje rezultata reakcije tijekom elektroforeze.

3.3 Procjena rezultata reakcije

Za ispravnu procjenu rezultata PCR -a važno je shvatiti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, produkti amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNA mogu se otkriti elektroforezom nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uvjetima bliskim idealnim, što se u životu ne susreće često. Stupanj čistoće DNA pripravka ima posebno veliki utjecaj na efikasnost amplifikacije, tj. prisutnost određenih inhibitora u reakcijskoj smjesi, kojih se u nekim slučajevima može biti iznimno teško riješiti. Ponekad, zbog njihovog prisustva, nije moguće pojačati čak desetine hiljada ciljnih molekula DNK. Stoga često ne postoji direktna veza između početne količine ciljne DNK i konačne količine produkata amplifikacije.

3.3.1 Metoda horizontalne elektroforeze

Za vizualizaciju rezultata pojačanja koriste se različite metode. Najčešća metoda danas je elektroforeza, zasnovana na razdvajanju molekula DNK po veličini. Da biste to učinili, pripremite ploču agaroznog gela, koja se nakon topljenja zamrzne u puferu za elektroforezu u agarozi u koncentraciji od 1,5-2,5% uz dodatak posebne boje za DNK, na primjer, etidij bromida. Zamrznuta agaroza čini prostornu rešetku. Prilikom punjenja češljevima, u gelu se formiraju posebne jažice u koje se naknadno unose produkti pojačanja. Gel ploča se postavlja u horizontalni aparat za elektroforezu sa gelom i priključuje izvor konstantnog napona. Negativno nabijena DNK počinje se kretati od minus do plus u gelu. U ovom slučaju, kraći molekuli DNK kreću se brže od dugih. Na brzinu kretanja DNK u gelu utječu koncentracija agaroze, jakost električnog polja, temperatura, sastav pufera za elektroforezu i, u manjoj mjeri, GC sastav DNK. Svi molekuli iste veličine kreću se istom brzinom. Boja je ugrađena (interkalirana) u planarne grupe u molekule DNK. Nakon završetka elektroforeze, u trajanju od 10 minuta do 1 sata, gel se stavlja na filter transilluminator -a koji emitira svjetlost u ultraljubičastom području (254 - 310 nm). Ultraljubičasta energija koju apsorbira DNK u području od 260 nm prenosi se u boju, uzrokujući da ona fluorescira u narančastocrvenom području vidljivog spektra (590 nm).

Svjetlina traka pojačavačkih proizvoda može biti različita. Međutim, to se ne može povezati s početnom količinom ciljane DNA u uzorku.

3.3.2 Metoda okomite elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze u osnovi je slična horizontalnoj elektroforezi. Njihova razlika leži u činjenici da se u ovom slučaju umjesto agaroze koriste poliakrilamidni gelovi. Izvodi se u posebnoj komori za vertikalnu elektroforezu. Elektroforeza s poliakrilamidnim gelom ima veću rezoluciju u odnosu na elektroforezu s agarozom i omogućuje razlikovanje molekula DNK različitih veličina s točnošću od jednog nukleotida. Priprema poliakrilamidnog gela nešto je složenija od gela od agaroze. Osim toga, akrilamid je otrovna tvar. Budući da se rijetko javlja potreba za određivanjem veličine produkta amplifikacije s točnošću od 1 nukleotida, metoda horizontalne elektroforeze koristi se u rutinskom radu.

3.4 Kontrola prolaska reakcije pojačanja

3.4.1 Pozitivne kontrole

Pripravak DNK željenog mikroorganizma koristi se kao "pozitivna kontrola". Nespecifični amplikoni se razlikuju po veličini od amplikona nastalih amplifikacijom s kontrolnim pripravkom DNA. Veličina nespecifičnih proizvoda može biti veća ili manja od pozitivne kontrole. U najgorem slučaju, ove se dimenzije mogu podudarati i čitati kao pozitivne u elektroforezi.

Za kontrolu specifičnosti rezultirajućeg produkta amplifikacije, hibridizacijske sonde (regije DNA smještene unutar pojačane sekvence) označene enzimskim oznakama ili radioaktivnim izotopima i u interakciji s DNA mogu se koristiti u skladu s istim principima kao i prajmeri. Ovo značajno komplikuje i produžava analizu, a njeni troškovi se značajno povećavaju.

3.4.2 Unutrašnje kontrole

Potrebno je kontrolirati tok pojačanja u svakoj epruveti reakcijskom smjesom. U tu svrhu koristi se dodatna, takozvana "interna kontrola". To je svaki preparat DNK koji nije sličan DNK ciljnog mikroorganizma. Ako se u reakcijsku smjesu doda interna kontrola, ona će postati ista meta za žarenje prajmera kao i kromosomska DNA željenog uzročnika. Veličina produkta amplifikacije interne kontrole odabrana je tako da bude 2 ili više puta veća od amplikona nastalih amplifikacijom željene DNK mikroorganizma. Kao rezultat toga, ako se interna kontrolna DNK doda u reakcijsku smjesu zajedno s ispitnim uzorkom, tada će, bez obzira na prisutnost mikroorganizma u biološkom uzorku, unutarnja kontrola uzrokovati stvaranje specifičnih amplikona, ali mnogo duže (teške ) od amplikona mikroorganizama. Prisutnost teških amplikona u reakcijskoj smjesi ukazivat će na normalan tijek reakcije amplifikacije i odsutnost inhibitora. Ako nisu formirani amplikoni potrebne veličine, ali nisu formirani ni amplikoni interne kontrole, može se zaključiti da u analiziranom uzorku postoje nepoželjne nečistoće, koje treba ukloniti, ali ne i odsustvo željene DNK .

Nažalost, unatoč atraktivnosti ovog pristupa, on ima značajnu manu. Ako je potrebna DNK u reakcijskoj smjesi, tada se učinkovitost njenog pojačanja naglo smanjuje zbog konkurencije s unutarnjom kontrolom za prajmere. Ovo je posebno važno pri niskim koncentracijama DNK u uzorku za ispitivanje, što može dovesti do lažno negativnih rezultata.

Ipak, ako se riješi problem konkurencije za prajmere, ovaj način kontrole efikasnosti pojačanja zasigurno će biti vrlo koristan.

4. Metode zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze

4.1 Kvalitativna analiza

Klasična metoda izvođenja PCR -a, čiji su principi gore navedeni, našla je svoj razvoj u nekim modifikacijama usmjerenim na prevladavanje ograničenja PCR -a i povećanje učinkovitosti reakcije.

4.1.1 Način postavljanja PCR -a pomoću „vrućeg starta“

Da bi se smanjio rizik od stvaranja nespecifičnih produkata reakcije pojačanja, koristi se pristup „vrućeg starta“, koji u osnovi sprječava početak reakcije prije postizanja uvjeta u epruveti koji osiguravaju specifično žarenje prajmera.

Činjenica je da, ovisno o sastavu i veličini GC -a, prajmeri imaju određenu talište (Tm). Ako temperatura sistema pređe Tm, prajmer nije u stanju prianjati na lanac DNK i denaturira se. Pod optimalnim uslovima, tj. temperatura žarenja blizu temperature taljenja, prajmer formira dvolančani molekul samo pod uvjetom njegove potpune komplementarnosti i na taj način osigurava specifičnost reakcije.

Postoje različite mogućnosti za implementaciju vrućeg starta:

Uvođenje Taq-polimeraze u reakcijsku smjesu tokom prvog ciklusa nakon zagrijavanja cijevi na temperaturu denaturacije.

Odvajanje sastojaka reakcijske smjese parafinskim slojem u slojeve (u donjem dijelu - prajmeri, u gornjem dijelu - Taq -polimeraza i DNK meta), koji se miješaju kada se parafin otopi (~ 65-75 0 C ).

Upotreba monoklonskih antitijela na Taq polimerazu. Enzim vezan monoklonskim antitijelima postaje aktivan tek nakon prve faze denaturacije, kada monoklonska antitijela nepovratno denaturiraju i oslobađaju aktivna mjesta Taq polimeraze.

U svim ovim slučajevima, čak i ako se nespecifično žarenje dogodilo prije početka ciklusa temperature, ne dolazi do produženja, a zagrijavanjem se kompleksi prajmer-DNA denaturiraju, pa se ne stvaraju nespecifični produkti. Nadalje, temperatura u epruveti ne pada ispod temperature taljenja, što osigurava stvaranje specifičnog produkta pojačanja.

4.1.2 Detekcija molekula RNK

Mogućnost korištenja RNK kao mete za PCR značajno proširuje raspon primjene ove metode. Na primjer, genomi mnogih virusa (hepatitis C, virus influence, pikornavirusi itd.) Predstavljeni su RNK. Istovremeno, ne postoji srednja faza transformacije u DNK u njihovim životnim ciklusima. Da bi se otkrila RNK, potrebno ju je prije svega pretvoriti u oblik DNK. Za to se koristi reverzna transkriptaza, koja je izolirana iz dva različita virusa: virusa mijeloblastoze ptica i virusa Moloney mišje leukemije. Upotreba ovih enzima povezana je s nekim poteškoćama. Prije svega, oni su termolabilni i stoga se mogu koristiti na temperaturama koje nisu veće od 42 ° C. Budući da na ovoj temperaturi molekule RNK lako tvore sekundarne strukture, učinkovitost reakcije je primjetno smanjena i, prema različitim procjenama, iznosi približno 5%. Pokušava se zaobići ovaj nedostatak pomoću termostabilne polimeraze dobivene od termofilnog mikroorganizma Thermus Thermophilus, koji ispoljava aktivnost transkriptaze u prisutnosti Mn 2+, kao reverznu transkriptazu. To je jedini poznati enzim sposoban pokazati i polimerazu i transkriptaznu aktivnost.

Za izvođenje reakcije obrnute transkripcije u reakcijskoj smjesi, kao i u PCR -u, prajmeri moraju biti prisutni kao prajmer i mješavina 4 dNTP -a kao građevinski materijal.

Nakon reakcije obrnute transkripcije, rezultirajuće molekule cDNA mogu poslužiti kao meta za PCR.

5. Organizacija tehnološkog procesa postavljanja PCR -a

Potencijalno velika osjetljivost lančane reakcije polimeraze čini posebno temeljnim PCR laboratorijski dizajn ključnim. To je zbog najhitnijeg problema metode - kontaminacije.

Kontaminacija je ulazak specifičnih molekula DNA iz vanjskog okruženja u reakcijsku smjesu koja može poslužiti kao meta u reakciji amplifikacije i dati lažno pozitivne rezultate.

Postoji nekoliko načina za rješavanje ovog neugodnog fenomena. Jedan od njih je upotreba enzima N-uracil-glikozilaze (UG). Ova metoda se temelji na sposobnosti UG -a da cijepa molekule DNK s ugrađenim uracilom. Reakcija amplifikacije se provodi pomoću dNTP smjese, u kojoj se dTTP zamjenjuje uracilom, a nakon termičkog ciklusa svi amplikoni nastali u epruveti sadržavat će uracil. Ako se UG doda u reakcijsku smjesu prije amplifikacije, tada će se amplikoni u reakcijskoj smjesi uništiti, dok će nativna DNK ostati netaknuta i dalje će služiti kao meta za amplifikaciju.

Stoga ova metoda samo donekle uklanja izvor zagađenja i ne jamči protiv lažno pozitivnih rezultata.

Drugi način rješavanja rezultata kontaminacije je značajno smanjenje broja ciklusa reakcije (do 25-30 ciklusa). Ali čak i s ovim pristupom, rizik od dobivanja lažno pozitivnih rezultata je velik, jer je u ovom slučaju, u nedostatku inhibitora, lako doći do produkta pojačanja zbog kontaminacije.

Dakle, unatoč prednostima mjera predpojačanja usmjerenih na inaktivaciju molekula DNK koje uzrokuju lažno pozitivne rezultate, najradikalnije sredstvo je dobro osmišljena organizacija laboratorija.

Zaključak

Najraširenija metoda PCR -a trenutno se prima kao metoda za dijagnosticiranje različitih zaraznih bolesti. PCR vam omogućuje da identificirate etiologiju infekcije, čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNA patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnog hepatitisa itd. Danas gotovo ne postoji infektivni agens koji se ne može otkriti pomoću PCR -a.

Ne tako davno razvijena je pouzdana, visoko osjetljiva i brza metoda za dijagnosticiranje različitih zaraznih bolesti kod ljudi. Ova metoda se naziva "PCR analiza". Što je to, koja je njegova suština, koje mikroorganizme može otkriti i kako je pravilno uzeti, reći ćemo vam u našem članku.

Istorija otkrića

Također, PCR metode se koriste u dijagnostici raka.

Prednosti metode

PCR dijagnostika ima niz prednosti:

Visoka osetljivost. Čak i ako postoji samo nekoliko molekula DNK mikroorganizama, PCR analiza otkriva prisutnost infekcije. Metoda će pomoći kod kroničnih i latentnih bolesti. Često se u takvim slučajevima mikroorganizam ne kultivira drugim sredstvima.
Bilo koji materijal prikladan je za istraživanje, na primjer, pljuvačka, krv, genitalni sekret, kosa, epitelne stanice. Najčešći je test krvi i urogenitalni bris za PCR.
Dugotrajno uzgoj usjeva nije potreban. Automatizirani dijagnostički proces omogućuje vam da dobijete rezultate studije nakon 4-5 sati.
Metoda je gotovo 100% pouzdana. Zabilježeno je samo nekoliko slučajeva lažno negativnog rezultata.
Sposobnost identifikacije nekoliko vrsta patogena iz jednog uzorka materijala. Ovo ne samo da ubrzava proces dijagnosticiranja bolesti, već i značajno smanjuje materijalne troškove. Često liječnik propisuje opsežnu PCR analizu. Cijena pregleda, koji se sastoji od identifikacije šest patogena, iznosi oko 1.500 rubalja.

Kako bi rezultati bili pouzdani pri provođenju PCR studije, potrebno je proći analizu poštujući preporuke za preliminarnu pripremu za dijagnozu:

Prije davanja sline treba se suzdržati od uzimanja hrane i lijekova 4 sata prije uzimanja materijala. Neposredno prije postupka isperite usta kuhanom vodom.
Gore navedena pravila treba se pridržavati prilikom uzimanja uzorka s unutarnje površine obraza. Nakon ispiranja preporučuje se lagana masaža kože kako bi se oslobodio sekret žlijezde.
Urin se obično sakuplja kod kuće. Da biste to učinili, morate provesti temeljit toalet genitalija. Prikupite 50-60 ml urina u sterilnu plastičnu posudu. Kako bi se osigurala čistoća materijala, ženama se preporučuje umetanje tampona u vaginu, a muškarcima da izvuku kožni nabor što je više moguće. Ne možete donirati materijal tokom menstrualnog ciklusa.
Da biste donirali spermu, morate se suzdržati od spolnog odnosa 3 dana prije uzimanja materijala. Također, liječnici savjetuju da odustanu od posjeta sauni i kupanja u toplim kupkama, pijenja alkohola i začinjene hrane. 3 sata prije analize morate se suzdržati od mokrenja.
Na primjer, za isporuku, ako se izvrši analiza PCR -a na klamidiju, ženama i muškarcima preporučuje se seksualni odmor 3 dana. Antibakterijske lijekove ne treba uzimati 2 sedmice prije analize. Nedelju dana morate prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne supozitorije, tuširanje. Tri sata prije ispitivanja trebali biste se suzdržati od mokrenja. Tijekom menstruacije materijal se ne uzima, samo 3 dana nakon prestanka ispuštanja krvi možete uzeti urogenitalni bris.

PCR tokom trudnoće

Dok čekaju bebu, mnoge spolno prenosive infekcije izuzetno su opasne za normalan razvoj fetusa. SPB mogu izazvati intrauterino usporavanje rasta, pobačaj ili prijevremeni porođaj, urođene malformacije djeteta. Stoga je iznimno važno proći PCR pregled u ranim fazama trudnoće. Potrebno je proći analizu prilikom registracije - do 12 sedmica.

Materijal se uzima iz cervikalnog kanala pomoću posebne četke. Postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost za bebu. Obično se tijekom trudnoće vrši analiza na klamidiju PCR metodom, kao i na ureaplazmozu, mikoplazmozu, citomegalovirus, herpes, papiloma virus. Takav kompleks ispitivanja naziva se PCR-6.

PCR za dijagnozu HIV -a

Zbog činjenice da je metoda vrlo osjetljiva na promjene u tijelu i uslove dijagnoze, mnogi faktori mogu utjecati na rezultat. Stoga analiza PCR-a na HIV infekciju nije pouzdana metoda, njena efikasnost je 96-98%. U preostalih 2-4% slučajeva test daje lažno pozitivne rezultate.

No, u nekim je situacijama PCR dijagnostika HIV -a neophodna. Obično se daje ljudima s lažno negativnim ELISA testom. Takvi pokazatelji ukazuju da osoba još nije razvila antitijela na virus i ne mogu se otkriti bez višestrukog povećanja količine. Upravo se to može postići PCR testom krvi.

Takva dijagnostika je također neophodna za djecu prve godine života rođenu od HIV pozitivne majke. Ova metoda je jedini način da se pouzdano utvrdi status djeteta.

PCR za dijagnozu hepatitisa

Metoda polimerazne lančane reakcije omogućuje otkrivanje DNK virusa hepatitisa A, B, C mnogo prije stvaranja antitijela na infekciju ili pojave simptoma bolesti. PCR analiza za hepatitis C je posebno učinkovita, jer je u 85% slučajeva takva bolest asimptomatska i bez pravovremenog liječenja prelazi u kroničnu fazu.

Pravovremeno otkrivanje patogena pomoći će u izbjegavanju komplikacija i dugotrajnom liječenju.

Sveobuhvatni PCR pregled

Sveobuhvatna PCR analiza: pregled polimezarskom lančanom reakcijom, koja uključuje utvrđivanje nekoliko vrsta infekcija istovremeno: mikoplazma genitalija, mikoplazma hominis, gardnerella vaginalis, Candida, Trichomonas, citomegalovirus, herpes 1 i 2 tipa, gonoreja, papiloma virus. Cijena takve dijagnoze kreće se od 2.000 do 3.500 rubalja. ovisno o klinici, korištenim materijalima i opremi, kao i o vrsti analize: kvalitativnoj ili kvantitativnoj. Šta je potrebno u vašem slučaju - odlučit će ljekar. U nekim je slučajevima dovoljno samo utvrditi prisutnost patogena, u drugim, na primjer, s HIV infekcijom, kvantitativni titar igra važnu ulogu. Prilikom dijagnosticiranja svih gore navedenih patogena, pregled se naziva "PCR-12 analiza".

Tumačenje rezultata analize

Dekodiranje PCR analize nije teško. Postoje samo 2 skale indikatora - "pozitivan rezultat" i "negativan rezultat". Kad se otkrije patogen, liječnici mogu sa 99% sigurnošću potvrditi prisutnost bolesti i započeti liječenje pacijenta. Kvantitativnom metodom za utvrđivanje infekcije, numerički pokazatelj otkrivenih bakterija bit će naveden u odgovarajućoj koloni. Samo liječnik može odrediti stupanj bolesti i propisati potrebno liječenje.

U nekim slučajevima, na primjer, pri određivanju HIV infekcije PCR -om, u slučaju negativnog rezultata, postaje potrebno provesti dodatne preglede kako bi se potvrdili dobiveni pokazatelji.

Gdje se testirati?

Gdje uzeti PCR analizu: u državnoj klinici ili u privatnoj laboratoriji? Nažalost, u općinskim medicinskim ustanovama oprema i metode često su zastarjele. Stoga je bolje dati prednost privatnim laboratorijima sa modernom opremom i visoko kvalificiranim osobljem. Osim toga, u privatnoj klinici ćete brže postići rezultate.

U Moskvi mnoge privatne laboratorije nude PCR analizu za različite infekcije. Na primjer, u klinikama kao što su "Vita", "Složena klinika", "Sretna porodica", "Uro-Pro", provodi se PCR analiza. Cijena pregleda je od 200 rubalja. za identifikaciju jednog patogena.

Može se zaključiti da je dijagnostika zaraznih bolesti pomoću PCR -a u većini slučajeva brz i pouzdan način otkrivanja patogena u tijelu u ranim fazama infekcije. No, ipak, u određenim slučajevima vrijedi odabrati druge dijagnostičke metode. Samo stručnjak može utvrditi potrebu za takvom studijom. Dekodiranje PCR analize također zahtijeva profesionalan pristup. Slijedite preporuke ljekara i nemojte sami raditi testove koji nisu potrebni.