Lančana reakcija polimeraze, njegova suština i područje primjene. Lančana reakcija polimeraze (PCR) i njegova upotreba PCR metode lančane reakcije polimeraze

Ne tako davno, razvijen je pouzdan, vrlo osjetljiv i brz način dijagnosticiranja različitih zaraznih bolesti osobe osobe. Ova metoda se naziva "PCR" analiza. Šta je, koja je njegova suština, koju može otkriti mikroorganizme i kako to da prođemo kako treba, reći ćemo nam u našem članku.

Otvaranje povijesti

PCR metode se koriste i u dijagnostici raka.

Prednosti metode

Dijagnoza PCR-a ima niz prednosti:

1. Visoka osetljivost. Čak i ako postoji samo nekoliko molekula DNK mikroorganizma, analiza PCR određuje prisustvo infekcije. Metoda će pomoći u hroničnim i latentnim bolestima. Često u takvim slučajevima mikroorganizam se ne obrađuje na druge načine.
2. Za studiju, bilo koji materijal je prikladan, na primjer, slina, krv, seks, kosu, epitelske epitelijske kose. Najčešće je test krvi i urogenitalni razmaz na PCR-u.

   

3. Nije potrebno dugo uzgoj usjeva. Automatizirani dijagnostički proces omogućava vam da dobijete rezultate studije nakon 4-5 sati.
4. Metoda je gotovo 100% pouzdana. Zabilježeni su samo pojedinačni slučajevi lažnog negativnog rezultata.
5. Sposobnost identifikacije nekoliko vrsta patogena iz jednog materijala. To ne samo ubrzava proces dijagnosticiranja bolesti, već značajno smanjuje materijalne troškove. Često doktor imenuje sveobuhvatnu PCR analizu. Cijena istraživanja koja se sastoji od određivanja šest patogena iznosi oko 1.500 rubalja.

Dakle, rezultati su bili pouzdani prilikom provođenja PCR studije, potrebno je donijeti analizu, poštivanje preporuka za preliminarnu pripremu za dijagnostiku:

1. Prije prolaska sline trebali biste se suzdržati od obroka i lijekova za 4 sata prije materijalne ograde. Neposredno prije postupka isperite kuhanom vodom.
2. Gore navedena pravila trebaju se voditi i kada uzimaju uzorak sa unutarnje površine obraza. Nakon isperenja, preporučuje se izlaganje lagane masaže kože kako bi se istaknuo rub žlijezde.
3. Urin se obično sakuplja kod kuće. Da biste to učinili, morate provesti temeljni toalet genitalnih organa. U sterilnom plastičnom spremniku potrebno je sakupljati 50-60 ml urina. Da bi se osigurala čistoću materijala, preporučuje se umetnuti tampon u vaginu, a mužjak povucite kožu preklopite što je više moguće. Nemoguće je donirati materijal u periodu menstrualnih sekreta.
4. Da biste stavili spermu, morate se suzdržati od seksualnog odnosa u roku od 3 dana prije ograde materijala. Takođe, doktori savetuju da odbiju da posete saunu i usvajanje vruće kade, pijenja alkohola i akutne hrane. 3 sata prije analize, morate se suzdržati od mokrenja.
5. Za dostavu, na primjer, ako se analizira u klamidiji PCR, i žene i muškarci preporučuju seksualnim odmorom u roku od 3 dana. 2 tjedna prije analize nemoguće uzimati antibakterijske droge. Za nedelju dana potrebno je prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne svijeće, umirući. 3 sata prije studije, morate se suzdržati od mokrenja. Tijekom menstruacije, materijalna ograda se ne vrši, tek nakon 3 dana nakon prestanka pražnjenja krvi, možete uzeti urogenitalnu mrlju.

PCR tokom trudnoće

Tokom perioda čekanja, dijete ima mnogo zaraznih bolesti koje su seksualno prenose, izuzetno su opasne za normalan razvoj ploda. STDS može izazvati intrauterin kašnjenje u razvoju, pobačaju ili preranu rođenju, urođene deficit djetinjstva. Stoga je imperativ proći u ranu trudnoću PCR metode. Assist je neophodan prilikom registracije - do 12 tjedana.



Materijalna ograda dolazi od grlića materice pomoću posebne četke. Postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost za bebu. Tipično tokom trudnoće, analize u Chlamydia PCR metodi, kao i na ureaplasmosis, mikoplazmozi, citomegalovirusu, herpes, papilomavirus. Takav kompleks anketa naziva se PCR-6.

PCR za HIV dijagnostiku

Zbog činjenice da je metoda vrlo osjetljiva na promjene u tijelu i uvjetima za provođenje dijagnostike, mnogi faktori mogu utjecati na rezultat. Stoga analiza PCR-a na HIV infekciji nije pouzdana metoda, njegova učinkovitost je 96-98%. U preostalih 2-4% slučajeva test daje lažne pozitivne rezultate.

Ali u nekim situacijama bez PCR dijagnoze, HIV ne može. Obično ga provodi ljudima s lažnim negativnim rezultatom Elise. Takvi pokazatelji sugeriraju da osoba još nije razvila antitijela na virus i nemoguće je otkriti bez višestrukog povećanja količine. To je upravo ono što se može postići provođenjem testa krvi putem PCR metode.

Također je potrebno za dijagnozu prve godine života rođenog iz HIV pozitivne majke. Metoda je jedini način da pouzdano odredite status djeteta.

PCR za dijagnozu hepatitisa

Metoda reakcije lanca polimerase omogućava otkriti DNK hepatitisa virus, B, s puno prije formiranja antitijela do infekcije ili izgledu simptoma bolesti. Posebno je efikasna analiza PCR-a za hepatitis C, jer u 85% slučajeva takva bolest daje asimptomatsko i bez pravovremenog tretmana ide u hroničnu fazu.



Pravovremeno otkrivanje uzročnog agenta pomoći će u izbjegavanju komplikacija i dugoročnog tretmana.

Sveobuhvatno ispitivanje PCR-a

Sveobuhvatna PCR analiza: ispitivanje lančane reakcije polimezara, koji uključuje definiciju istovremeno nekoliko vrsta infekcija: mikoplazmis genitalij, hominis mioplasma, Candida, trihomona, citomegalovirus, herpes 1. i 2. tipa, gonorrea, papilomavirus. Cijena takve dijagnoze kreće se od 2000 do 3.500 rubalja. Ovisno o klinici koju koristi materijali i oprema, kao i na vrsti analize: visokog kvaliteta ili kvantitativnog. Ono što je u vašem slučaju neophodno - doktor će odlučiti. U nekim je slučajevima dovoljno samo da utvrdimo prisustvo patogena, na primjer, na primjer, u HIV infekciji, kvantitativni titer igra važnu ulogu. U dijagnozi svih gore navedenih uzročnika ispitivanje se naziva "analiza PCR-12".

Dešifriranje rezultata analize

Dešifriranje PCR analize ne predstavlja složenost. Postoje samo 2 vage indikatora - "Pozitivan rezultat" i "negativni rezultat". Kada otkrijete kaurotivni agent, ljekari mogu sa 99% povjerenja koji potvrđuju prisustvo bolesti i prelaze na postupanje sa pacijentom. Pomoću kvantitativne metode određivanja infekcije u odgovarajućem grafikonu, bit će naveden numerički pokazatelj otkrivenih bakterija. Samo liječnik može odrediti stupanj bolesti i imenovati potreban tretman.



U nekim slučajevima, na primjer, u određivanju HIV infekcije putem PCR metode, s negativnim rezultatom, postoji potreba za dodatnim anketama za potvrdu dobivenih pokazatelja.

Gdje proći analizu?

Gdje proći PCR analizu: u državnoj klinici ili u privatnoj laboratoriji? Nažalost, u opštinskim medicinskim ustanovama, oprema i metode su često zastarjeli. Stoga je bolje dati preferencije privatnim laboratorijama sa modernom opremom i visoko kvalificiranom osoblju. Pored toga, u privatnoj klinici dobit ćete rezultate mnogo brže.

U Moskvi, mnoge privatne laboratorije predlažu PCR analizu različitim infekcijama. Na primjer, u takvim klinikama, poput "VITA", "Složena klinika", "Srećna porodica", "Uro-Pro", provedite PCR analizu. Cijena ankete je od 200 rubalja. Za određivanje jednog patogena.

Može se zaključiti da je dijagnoza zaraznih bolesti po PCR metodi u većini slučajeva brz i pouzdan način za otkrivanje patogena u tijelu u ranoj infekciji. Ali još uvijek u određenim slučajevima vrijedi odabrati druge načine za dijagnosticiranje. Samo stručnjak može odrediti potrebu za takvom studijom. Dešifriranje PCR analize također zahtijeva profesionalni pristup. Slijedite preporuke ljekara i ne dajte samostalno analize u kojima nema potrebe.

Često se koristi kao izravna metoda za označavanje i identifikaciju virusa.

Prvi put je ova metoda razvila K. Mulis (SAD) u 1983 tona. Zbog velike osjetljivosti, specifičnosti i lakoće izvršenja, široko se koristi u genetici, forenzicijskoj medicini, dijagnozi i drugim oblastima.

Suština metode je pojačanje, I.E., povećanje broja primjeraka strogo definiranih fragmenata molekule in vitro DNK. U ovoj metodi se nalazi matrični mehanizam i princip komplementarnosti. Dva pojedinačna polinukleotidna lanca (nukleinska kiselina) mogu se obvezati na vodikove obveznice u jedan dvostruko, ako nukleotidne sekvence jednog tačno odgovaraju redoslijedu nukleotida, tako da njihove azogenske baze mogu formirati adenine-timinske parove i guanin-citozine parove .

PCR se temelji na pojačanju DNK koristeći termičku stabilnu DNK polimerazu, izvedbe sinteze obostrano komplementarnih DNK sklopova, počevši od dva temeljača. Primer je DNK fragment koji se sastoji od 20-30 nukleotida. Ovi temeljni premazi (sjemenke) su komplementarni suprotnim lancima DNK. Tijekom sinteze DNK, temeljni premazi su ugrađeni u lanac novoosjetljivih DNK molekula.

Obično PCR stavlja u 25-40 ciklusa. Svaki ciklus uključuje tri faze: prva - denaturacija na 92-95 ° C. Istovremeno, dva DNK lanca se dižuju; Drugo - žarenje ili dodavanje prajmera na 50-65 ° C; Treće - izduženje ili polimerizacija na 68-72 ° C, dok DNK polimeraza vrši komplementarni završetak DNK matričnih lanaca koristeći četiri vrste nukleotida. Kao rezultat jednog ciklusa dolazi do udvostručenja željenog genetskog materijala. DNK lanca koji se generira u prvom ciklusu služi kao matrice za drugi ciklus itd. Nakon prvog ciklusa, samo fragment između dva temelja koji se pojačaju. Stoga se sumnja u broj primjeraka pojačanog dijela, koji omogućava 25-40 ciklusa na nazyzine milijune (2 n) DNK fragmente - količinu dovoljne za označavanje različitih metoda (metodom hibridizacijske sonde koje sadrže određenu etiketu , elektroforeza itd.). Češće u tu svrhu koristi se metoda elektroforeze u agaroznoj gelu sa bojenjem sa bromidom Etidija.

U PCR, temeljni premazi koji imaju jedinstven niz nukleotida karakteristični samo za određeni patogen koriste se za PCR iz DNK uzročnika.

Način izvođenja PCR-a spušta se na sljedeće: DNK matrica odvojena je od materijala u studiji; Tube kombinira namjensku DNK sa smjesom pojačala, koja uključuje DNK polimerazu, sve 4 vrste nukleotida, 2 vrste prajmera, mgcl, tampon, deionizirane vode i mineralno ulje. Tada se ispitne cijevi postavljaju u pojačalo i pojačavaju u automatskom režimu u skladu s određenim programom koji odgovaraju izgledu patogena. Rezultati su češće registrirani elektroforezom u prisustvu etidijevog bromida, koji je priključen na fragmente DNK i otkriva se kao svjetlosni bendovi tokom zračenja UV gela na transil licima. Svi PCR postupci uzimaju 1-2 radna dana.

Da bi se povećala specifičnost i osjetljivost PCR-a, koriste se različite opcije: gniježđenje PCR; PCR s vrućim startom počnite koristiti parafinske slojeve ili blokadu aktivnih polimeraznih centara monoklonskim antitijelima. Pored toga, neke firme proizvode liofilizirane supere za reagense za obavljanje DNK pojačanja koje omogućuju ubrzavanje procesa PCR-a i smanjiti mogućnost pojavljivanja lažnih pozitivnih rezultata.

Trenutno se provodi nova PCR PCR tehnologija (PCR u stvarnom vremenu). Njegova temeljna značajka je nadgledanje i kvantitativna analiza akumulacije lančanih reakcija na polimerazu i automatsku registraciju i tumačenje dobivenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva fazu elektroforeze, što omogućava smanjenje laboratorijskih zahtjeva za PCR. PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentne oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK u procesu njegovog pojačanja. PCR u realnom vremenu omogućava vam da izvršite potpunu analizu uzorka za 20-60 minuta, a teoretski metoda je da otkrijete čak i jednu DNK molekulu ili RNA u uzorku.

Sistem za otkrivanje proizvoda u lančanoj reakciji polimeraze "u stvarnom vremenu" (nadgledanje PCR) omogućava ciklus ciklusu za nadgledanje akumulacije pojačanog DNK. Sistem uključuje sondu oligonukleotida, koja je sposobna da se pridruži (hibridiziraju) u unutrašnjem segmentu ciljne DNK. Na 5'-Cym, sonda je označena fluorescentnim bojama (reporter boja), a na 3'-ak-kraju - blokatoru (utapač boje). Kako je PCR proizvod nakuplja hibridizira sondu, ali sjaj se ne događa zbog blizine reportera i blokatora. Kao rezultat kopiranja slijeda polimeraze dostiže 5'-CALD iz sonde. 5'-3-egzonukleinska aktivnost polimeraza isključuje fluorescentnu etiketu sa 3'-end uzorka, čime oslobađa fluorescentni reporter iz veze s blokatorom signala, što dovodi do povećanja fluorescencije. Razina fluorescencije je tako proporcionalna broju specifičnih reakcijskih proizvoda. Važno je da se rezultati PCR-a zabilježe u prisustvu fluorescencije u zatvorenim cijevima i na taj način je jedan od glavnih problema ove metode riješen - problem kontaminacije sa pojačanjima.

Prednosti PCR-a: brzina analize; Velika osetljivost i specifičnost; Minimalna količina materijala u studiju; Jednostavne performanse i puna automatizacija.

Zbog činjenice da osjetljivost PCR može dostići otkrivanje jedne kopije DNK matrice, postoji visok stupanj opasnosti od pribavljanja lažnih pozitivnih rezultata. Stoga, genetski dijagnostička laboratorija pod formulisanjem PCR-a treba stalno obavljati posebne zahtjeve za izgled i radno režimu.

PCR je jedno od komplementarnih metoda koje postoje u Virološkoj dijagnostici. Ova je reakcija vrlo važna za dijagnozu virusnih infekcija, kada se ne može otkriti virusna antigena ili antitijela virusa i kada prisustvo virusne nukleinske kiseline može biti jedini dokaz infekcije, posebno kada su latentne i miješane infekcije.

Ako ste našli grešku, odaberite fragment teksta i kliknite Ctrl + Enter..

Imam Nobelovu nagradu.

Na početku metode korištenja metode nakon svakog ciklusa hlađenja grijanja, bilo je potrebno dodati u reakcijsku smjesu DNK polimeraze, jer je inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje DNK spiralnih krugova. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovito, zahtijevao je puno vremena i enzima. 1986. godine značajno je poboljšana metoda lančane reakcije polimeraze. Predloženo je korištenje DNK polimeraza iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi bili su termostabilni i mogli su izdržati mnoge cikluse reakcije. Njihova upotreba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedan od prvih termostabilnih DNK Polymerza je istaknut iz bakterija ThermUs aquaticus. i imenovan Taq.- Polyimia. Nedostatak ove polimeraze je da je vjerojatnost da je postigla pogrešan nukleotid dovoljno visok, jer ovaj enzim nema mehanizme korekcije grešaka (3 "→ 5" exonuclease aktivnosti). Polimeraza PFU. i Pwo.Izabran od Archeya posjeduju takav mehanizam, njihova upotreba značajno smanjuje broj mutacija u DNK, ali njihova brzina (dokazi) je niža od toga Taq.. Sada primijenite miksere Taq. i PFU.Da biste postigli istovremeno visoku brzinu polimerizacije i visoka preciznost kopiranja.

U trenutku izuma, Metoda Cary Mullis radila je kao sintetički hemičar (sintetizirao oligonukleotide, koji su korišteni za otkrivanje tačaka hibridizacijom sa kompanijom CETUS-a, koja je takođe patentirala PCR metodu. 1992. Zetus je prodao pravo na metodu i patent za upotrebu Taq.- Polimeriman kompanije Hofman-la Rosh za 300 miliona dolara. Međutim, ispostavilo se da Taq.- Polymeraza su karakterizirali sovjetski biohemiistri A. Kaltedin, A. Sklizarenko i S. Rodetsky 1980. godine, kao i 4 godine prije ove sovjetske publikacije, odnosno 1976. godine, američki biohemičari Alice Chien, David B.DGAR i John M. Trela. S tim u vezi, kompanija Promega (Promega) pokušala je prisiliti RoSh da odbije ekskluzivna prava na ovaj enzim. Američki patent za PCR metodu je istekao u martu 2005. godine

PCR

Metoda se temelji na višestrukom izbornom kopiranju određenog dijela DNK uz pomoć enzima u umjetnim uvjetima ( in vitro.). U isto vrijeme kopira se samo mjesto, što zadovoljava navedene uvjete, a samo ako je prisutan u uzorku u studiju. Za razliku od pojačanja DNK u živim organizmima, (replikacija), uz pomoć PCR-a, relativno kratki DNK dionica su pojačani. U uobičajenom PCR procesu, dužina kopiranog DNK dijelova nije više od 3000 baznih parova (3 kbp). Uz pomoć mješavine raznih polimeraza, koristeći aditive i pod određenim uvjetima, dužina fragmenta PCR može dostići 20-40 hiljada parova nukleotida. Još je znatno manje od dužine hromozoma DNK eukariotske ćelije. Na primjer, ljudski genom sastoji se od oko 3 milijarde parova baza.

Komponente reakcije

Za PCR u najjednostavnijem slučaju su potrebne sljedeće komponente:

• DNK matricakoji sadrže DNK dio koji je potreban za pojačavanje.
• Dva temeljna premazakomplementarno suprotnim krajevima različitih krugova željenog fragmenta DNK.
• Termostabilan DNK polimeraza - enzim koji katalizira reakciju DNK polimerizacije. Polimeraza za upotrebu u PCR-u treba održavati aktivnosti na visokoj temperaturi, tako da koriste enzime izolirane iz termofila - ThermUs aquaticus. (Taq polimerase), Pyrokoccus Furiosus (PFU polimerase) Pyrokoccus woesei. (Pwo polimerase) i drugi.
• DeoxyribonuclejTrifhosfat (DATP, DGTP, DCTP, DTTP).
• MG 2+ ioni potrebni za rad polimeraze.
• Pufer rešenjePružanje potrebnih uslova reakcije - pH, jonska sila snage. Sadrži soli, goveni surutke albumin.

Da bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u ulje visokog kuhanja dodaje se u cijev, na primjer, vazelin. Ako se pojačalo koristi s grijanim poklopcem, to nije potrebno učiniti.

Dodavanje pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, bočnog proizvoda pričvršćivanja nukleotidtriphosfata na rastući lanac DNK, na ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Primimeri

Specifičnost PCR-a temelji se na formiranju komplementarnih kompleksa između matrice i temeljača, kratkih sintetičkih oligonukleotida od 18-30 baza. Svaki od prajmera je komplementaran za jedan od lanaca matrice sa dvije lance i ograničava početak i kraj pojačanog područja.

Nakon hibridizacije matrice sa temeljnim premazom (žarenje), potonje služi kao sjeme za DNK polimerazu u sintezi komplementarnog lanca matrice (vidi).

Najvažnija karakteristika temeljnika je talište (t m) kompleksa temeljnog matričnog matrica.

T M je temperatura na kojoj polovina DNK matrica oblikuje kompleks s oligonukleotidnim premazom. Prosječno izračunavanje formula T M za kratki oligonukleotid (i za duge fragmente DNK) uzimajući u obzir koncentraciju K + i DMSO jona:

gdje sam broj nukleotida u temeljnom krugu, k + je molarna koncentracija kalijuma jona, g + c - zbroj svih guanina i citozina.

U slučaju nepravilnog odabira duljine i nukleotidnog sastava temeljnog temeljnog ili žarstva, moguće je oblikovati djelomično komplementarne komplekse s drugim dijelovima matrice DNK, koji mogu dovesti do nespecifičnih proizvoda. Gornja granica taline ograničena je na optimalnu temperaturu polimeraze, od kojih se aktivnost pada na temperaturama iznad 80 ° C.

Prilikom odabira temeljača poželjno se pridržavati sljedećih kriterija:

Pojačalo

Sl. jedan: Pojačalo za PCR

PCR se vrši u pojačalu - instrument koji pruža periodične rashladne i grijaće cijevi, obično s tačnošću od najmanje 0,1 ° C. Moderna pojačala omogućavaju da odredite složene programe, uključujući mogućnost "vrućeg starta", dodirnu PCR (vidi dolje) i naknadno skladištenje pojačanih molekula na 4 ° C. Za PCR u stvarnom vremenu puštaju se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Postoje i instrumenti sa automatskim poklopcem i odjeljkom za mikroplat, što vam omogućava da ih ugradite u automatizirane sisteme.

Tečaj reakcije

Fotografski gel koji sadrži marker DNK (prvi i zadnji slotovi) i PCR proizvodi

Tipično je tokom PCR-a izvedeno 20-35 ciklusa, od kojih se svaka sastoji od tri faze (Sl. 2).

Denaturacija

Dvo-nasuđena DNK matrica zagrevana je na 94-96 ° C (ili do 98 ° C ako se koristi određena termostalna polimeraza) za 0,5-2 minute, tako da su DNK lanci odvojeni. Ova faza se zove denaturacijaBudući da se vodikovine obveznice uništavaju između dva DNK lanca. Ponekad prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), preliminarno zagrijavanje reakcijske smjese vrši se 2-3 minute za potpunu denaturaciju matrice i temeljača. Ovaj prijem se zove vrući početakOmogućuje vam smanjenje broja nespecifičnih reakcijskih proizvoda.

Žarljivost

Kad su krugovi razdvojeni, temperatura se spušta tako da se temeljni premazi mogu obratiti jednočasnu matricu. Ova faza se zove Žarljivost. Temperatura žarenja ovisi o sastavu prajmera i obično se odabere jednak talištem za topljenje prajmera. Pogrešan izbor temperature žarenja vodi ili na loše vezivanje temeljača sa matricom (na precijenjenoj temperaturi) ili za obvezujući na pogrešnu mestu i izgled nespekičnih proizvoda (na niskim temperaturama). Vrijeme zastupljenosti je 30 komada, u isto vrijeme, za to vrijeme, polimerame su već uspjeli sintetizirati nekoliko stotina nukleotida. Stoga se preporučuje odabir temeljača s talištem iznad 60 ° C i za izlaganje žarenja i izduženje u isto vrijeme, na 60-72 ° C.

Izduženje

DNK Polimerase replicira matrični krug koristeći temeljni premaz kao sjeme. Ovo je faza izduženje. Polimeraza započinje sintezu drugog lanca iz 3 "-Kontizer premaza, koji je kontaktirao matricu i pomiče se duž matrice, sintetizirajući novi lanac u smjeru od 5" do 3 ". Temperatura izduženja. Zavisi od polimeraze. Često korištene taq polimerizije i PFU-a su najaktivniji na 72 ° C. Izvodni rok ovisi i iz vrste DNK polimeraze i na dužini pojačanog fragmenta. Tipično vrijeme izduženja jednako je jednako jedna minut za svaka tisuću baznih parova. Nakon završetka svih ciklusa često postoji dodatni korak završno izduženjeDa biste dovršili sve fragmente sa jednim lancem. Ova faza traje 7-10 minuta.

Sl. 2.: Shematski prikaz prvog PCR ciklusa. (1) Denaturacija na 94-96 ° C. (2) žarenje na 68 ° C (na primjer). (3) Izduživanje na 72 ° C (p \u003d polimeraza). (4) Prvi ciklus je završen. Dvojica su dobila DNK lanci služe kao matrica za sljedeći ciklus, pa količina matrice DNK tokom svakog ciklusa parova

Količina specifičnog reakcijskog proizvoda (ograničeni premazionicima) teoretski se povećava srazmjerno 2 N - 2N, gdje je n broj reakcijskih ciklusa. U stvari, efikasnost svakog ciklusa može biti manja od 100%, stoga, u stvarnosti P ~ (1 + E) n, gdje je p količina proizvoda, e je prosječna efikasnost ciklusa.

Broj "dugih" kopija DNK takođe raste, ali linearno, dakle, dominira poseban fragment u reakcijskim proizvodima.

Rast željenog proizvoda u geometrijskom napredovanju ograničen je brojem reagensa, prisutnosti inhibitora, formiranja nusproizvoda. Posljednji ciklusi reakcije rast usporava, naziva se "visoravnim efektom".

PCR sorte

• Ugniježđene PCR (Ugniježđene PCR (eng.)) - Koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Koristite dva para temeljnika i provedite dva uzastopna reakcije. Drugi par temeljka pojačava DNK odjeljak u proizvodu prve reakcije.
• Obrnuti pcr (Inverzijski PCR (engleski)) - koristi se samo ako je samo mali dio poznat unutar željenog slijeda. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Za provedbu obrnutog PCR-a, niz rezanja DNK ograničenja vrši se s naknadnim spojem fragmenata (ligacije). Kao rezultat toga, dobro poznati fragmenti su na oba kraja nepoznatog dijela, nakon čega se PCR može izvesti kao i obično.
• PCR sa obrnutom transkripcijom (Obrnuto transkripciju PCR, RT-PCR (eng.)) - Koristi se za pojačavanje, odabir ili identificiranje poznatog niza iz biblioteke RNA. Prije običnog PCR-a, sinteza jedne nasukane DNK molekule izvedena je na MRNA matrici s reverte i dobivena je jedno-lanac CDNA, koji se koristi kao matrica za PCR. Ova metoda često određuje gdje i kada se izraže podaci gena.
• Asimetrični PCR (Eng. Asimetrični PCR.) - Izvodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanca originalnog DNK. Koristi se u nekim metodama sekvenciranja i analize hibridizacije. PCR se vrši kao i obično, osim što se jedan od prajmera uzima u velikom višku. Izmjene ove metode su engleski. L. inear-SVEDOK JOVANOVIĆ - ODGOVOR: fter-T. on-E. xponential-PCR. (Kasno-PCR), u kojem se temeljini temelji koriste s različitim koncentracijama, a s visokim (taljenjem) temeljnog temeljnog koncentracije (temperatura topljenja) od visokog koncentracije. PCR se vrši pri visokoj temperaturi žarenja, na taj način je moguće održavati efikasnost reakcije u cijelim ciklusima.
• Kvantitativni PCR (Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR realnog vremena - Koristi se za direktno nadgledanje mjerenja količine određenog PCR proizvoda u svakom reakcijskom ciklusu. U ovoj metodi, fluorescentni temeljni premazi ili DNK sonde koriste se za tačno mjerenje količine reakcijskog proizvoda kao što je akumulirano; ili se koristi fluorescentna interkalaciona boja Sybr Zelena I. koji se veže za dvostruko nasukane DNK. Sybr Zelena I. Pruža jednostavnu i ekonomičnu opciju za otkrivanje i kvantitativno određivanje PCR proizvoda tokom PCR-a u stvarnom vremenu bez potrebe za korištenjem specifičnih fluorescentnih sondi ili temeljnog kruga. Tokom pojačalog boje Sybr Zelena I. Ugradite u mali utor DNK PCR proizvoda i pojede jače u odnosu na nepovezanu boju sa fluorescentnim signalom kada je ozračen plavim laserom. Sybr Zelena I. Kompatibilan je sa svim uređajima koji su poznati do danas za PCR u stvarnom vremenu. Maksimalna apsorpcija za Sybr Zelena I. Smješten na talasnoj dužini od 494 nm. Pored glavnog, u spektrom boja na raspolaganju su dva mala dodatna apsorpcija maksima - na 290 Nm i 380 Nm. Maksimalna emisija za Sybr Zelena I. Smješten na talasnoj dužini od 521 nm (zelena).
• Korak PCR (Touchdown PCR (engleski)) - Uz pomoć ovog pristupa, smanjuju učinak obvezujuća nespecifičnog primera. Prvi ciklusi se izvode na temperaturama iznad optimalne temperature žarenja, a zatim svakih nekoliko ciklusa temperatura anele se postepeno smanjuje na optimalno. To se radi kako bi se temeljni premaz hibridizirao sa komplementarnim lancem svih njegove dužine; Dok je s optimalnom temperaturom žarenja, temeljni premaz djelomično hibridiziran s komplementarnim lancem. Djelomična hibridizacija temeljnog premaza na genomskom DNK vodi do određenog pojačanja, ako ima mnogo veza za primer. U većini slučajeva, prvih deset PCR ciklusa može se izvesti na žarištu od 72-75 ° C, a zatim se odmah smanji na optimalno, na primjer i do 60-65 ° C.
• Način molekularnih kolonija (PCR u gelu, eng. Kolonija - PCR kolonija) - Akrilamidni gel je polimeriziran sa svim PCR komponentama na površini i provodi PCR. Na bodovima koji sadrže analizirani DNK, pojačalo je pojačanje sa formiranjem molekularnih kolonija.
• PCR sa brzom pojačanjem krajeva CDNA (Eng. Brza aplifikacija CDNA krajeva, trka-PCR ).
• PCR dugih fragmenata (Eng. PCR dugog dometa) - Modifikacija PCR-a za pojačavanje proširenih DNK sektora (10 tisuća i više razloga). Koristi se mješavina od dvije polimeraze, od kojih je taq polimeraza s visokim dokazom (koji je u stanju sintetizirati DNK dugi lanac u jednom prolazu), a druga - DNK polimeraza sa 3 "-5" exonuclease aktivnosti je obično PFU polimeraza. Druga polimeraza je neophodna da bi se prilagodili pogreške koje su napravili prvi, jer taq polimeraza zaustavlja sintezu DNK ako nije dodata komplementarna nukleotida. Ovaj komplementarni nukleotid uklanja PFU polimerazu. Smjesa polimeraza uzima se u odnosu na 50: 1 ili čak manju od 100: 1, gdje taq polimerase traje 25-100 puta više u odnosu na PFU polimerazu.
• Rabr. (Eng. Nasumično pojačanje polimorfnog DNK ), PCR sa slučajnim pojačavanjem polimorfnog DNK-a koristi se kada je potrebno razlikovati organizme zatvoriti genetskom slijedu, na primjer, razne sorte kultiviranih biljaka, pasmina pasa ili u blizini mikroorganizama. U ovoj se metodi obično koristi jedan temeljni temelj malih dimenzija (oko 10 str.). Ovaj temeljni premaz bit će djelomično komplementarni nasumičnim DNK mjestima proučavanih organizma. Odabir uvjeta (dužina temeljnog premaza, njegov sastav, temperatura itd.) Moguće je postići zadovoljavajuće razlike u PCR slikama za dva organizama.
• Specifičan PCR (Eng. pCR specifičan za grupe) - PCR za povezane nizove unutar jedne ili između različitih vrsta, koristeći konzervativne prajmere na ove sekvence. Na primjer, izbor univerzalnih prajmera do ribosomalnog 18s. i 26S. Geni za pojačavanje međugenskih razvedbe specifičnih za vrste: niz gena 18s. i 26S. Konzervativci između vrsta, tako da će PCR između ovih gena održati za sve proučene vrste. Suprotna metoda je - jedinstveni PCR (Eng. jedinstveni PCR.), u kojem se zadatak sastoji u odabiru prajmera da pojačaju samo određeni slijed među povezanim sekvencima.
• PCR pomoću vrućeg starta (Eng. Hot-Start PCR) - Modifikacija PCR-a pomoću DNK polimeraze, u kojoj se aktivnost polimeraze blokira na sobnoj temperaturi sa antitijevima ili antitijelom koji oponašaju male molekule poput afigovaja, odnosno u vrijeme reakcije na prvu denaturaciju u PCR-u. Obično se prva denaturacija vrši na 95 ° C 10 minuta.
• Virtual PCR (Engleski u Siliko PCR, Digitalni PCR, E-PCR) - matematički način računarske analize teorijske lančane reakcije polimeraze pomoću liste prajdova (ili DNK sonde) za predviđanje potencijalnog pojačanja DNK genoma ispod Studija, kromosom, prsten DNK ili bilo koje druge zaplet DNK.

Ako je nukleotidni niz matrica uopće poznat djelomično ili nepoznat, možete koristiti degenerirani temeljni premazSlijed koji sadrži degenerirane položaje u kojima se bilo koja baza može nalaziti. Na primjer, slijed temeljnog temelja može biti ovako: ... Ath ...gdje n - a, t ili s.

PCR aplikacija

PCR se koristi u mnogim područjima za analize i u naučnim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban nam je uzorak genetskog materijala sa mjesta zločina - krvi, pljuvačke, sperma, kose itd. Usporedi se sa genetskim materijalom osumnjičenog. Sasvim mali broj DNK, teoretski - jedan primjerak. DNK se podijelio u fragmente, a zatim pojačano pomoću PCR-a. Fragmenti su odvojeni DNK elektroforezom. Rezultirajući obrazac DNK bendova i naziva se genetski otisak prsta (Eng. genetski otisak prsta).

Očinsko očuvanje

Sl. 3.: Rezultati elektroforeze fragmenata DNK pojačani PCR. (1) Oče. (2) Beba. (3) Majko. Dijete je naslijedilo neke karakteristike genetskog otiska oba roditelja, koji su dali novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci prstiju jedinstveni (osim slučaja jednokratnih blizanaca), odnosi se i dalje mogu instalirati izradom nekoliko takvih otisaka prstiju (Sl. 3). Ista metoda se može primijeniti, pomalo modificirati, za uspostavljanje evolucijskog srodstva među organizmima.

Medicinska dijagnoza

PCR omogućava značajno ubrzati i olakšati dijagnozu nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen pojačava PCR koristeći odgovarajuće temeljne temeljice, a zatim se nastavi da odrede mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, sedmicama ili mjesecima prije simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Ponekad su lijekovi toksični ili alergijski za neke pacijente. Razlozi za to dijelom su u pojedinačnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te se razlike određuju na genetskom nivou. Na primjer, jedan pacijent ima određeni citohrom (jetreni protein koji je odgovoran za metabolizam vanzemaljskih supstanci) može biti aktivniji, drugi je manji. Da bi se utvrdio koji vrstu citokroma ima ovaj pacijent, predlaže se da provede PCR analizu prije nanošenja lijekova. Ova analiza naziva se preliminarno genotipiranje (ENG. potencijalno genotipiziranje.).

Cloning geni

Kloniranje gena (da se ne bi zbunili kloniranjem organizma) proces je odvajanja gena i kao rezultat genetskih projektiranih manipulacija, proizvodnje velikog broja proizvoda ovog gena. PCR se koristi za pojačavanje gena koji se zatim ubacuje u vektor - Fragment DNK, noseći vanzemaljski gen u istom ili različitoj, pogodno za uzgoj, organizam. Kao vektori, na primjer, koriste se plazmidi ili virusni DNK. Umetanje gena na strani organizam obično se koristi za dobivanje proizvoda ovog gena - RNA ili, najčešće, proteina. Tako se u industrijskim količinama dobivaju mnogi proteini za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Sl. četvoro: Klonirski gen pomoću plazmida.
(1) hromosomski DNK organizma A. (2) PCR. (3) Mnoge kopije gena gena A. (4) umetajući gen u plazmidu. (5) sa genom organizmu A. (6) Uvođenje plazmida u tijelu V. (7) Pomnožavanje broja kopija gena tijela A u tijelu B.

DNK sekvenciranje

U metodi sekvenciranja koristeći fluorescentnu naljepnicu ili radioaktivni izotop dideoksinukleotida integralni je dio, jer je upravo tokom polimerizacije do DNK kruga, derivati \u200b\u200bnukleotida označen sa fluorescentnom ili radioaktivnom etiketom. Prilog dideoksinukleotida do sintetiziranog kruga vodi se do litice sinteze, omogućavajući vam određivanje položaja određenih nukleotida nakon odvajanja u gelu.

Mutagenez

Trenutno je PCR postao glavna metoda mutageneze (izmjena nukleotidne sekvence DNK). Upotreba PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzavanje postupka za provođenje mutageneze, kao i čine pouzdanijem i reproduktivnim.

Lančana reakcija polimeraza (PCR) - visoka metoda preciznosti u polju dijagnosticiranja nasljednih patologija, infekcija, virusnih bolesti u bilo kojoj fazi (akutnom ili hroničnom), kao i u ranoj fazi - do očiglednih manifestacija bolesti identificiranjem patogena , Na osnovu njihove DNK, RNA, koji su genetski materijal, u uzorcima koji se dobivaju od pacijenta. I danas ćemo govoriti o suštini, dijagnostičkim fazama i principima metoda lančane reakcije polimeraze (PCR), kao i njezinu vrijednost.

Što je lančana reakcija polimeraze

Osnova analize je pojačavanje (udvostručavanje) - stvaranje pluralnosti primjeraka iz kratke DNK dio (deoksiribonukleinska kiselina) koja predstavlja ljudski genetski kompleks. Za studiju, vrlo malu količinu fiziološke tvari (ispljuvak, masovna masa, epitelij ostatak, krv, sperma, masna voda, sluz, tkanina za placenu, urin, pljuvačku, pleuralnu tečnost, cerebrospinal). Istovremeno, na primjer, u urogenitalnom putu pacijenta, čak i jedan zlonamjerni mikrob može se otkriti.

Metodologija PCR-a (lančana reakcija polimeraze) razvila je američkog naučnika K. Mulis, 1993. godine dobio je Nobelovu nagradu.

Aktivno se koristi:

• u ranoj dijagnozi infekcija, genetički;
• u forenzičkom ispitu, ako postoji izuzetno mali broj DNK za studiranje;
• u veterinarskoj medicini, farmaceutskoj, biologiji, molekularnom genetiku;
• da biste identificirali identitet DNK, potvrdite očinstvo;
• u paleontologiji, antropologiji, ekologiji (prilikom praćenja kvalitete proizvoda, faktora zaštite okoliša).

O činjenici da će lanac za polimerize detaljno reći ovaj video:

Kome je propisano

Lančana reakcija polimeraze u dijagnozi zaraznih bolesti jedna je od najpouzdanijih tehnika pojedine tačnosti i pouzdanosti. Na primjer, tačnost analize PCR-a na klamidiji i za mnoge druge patogene približava se 100% (apsolutno). Najčešće se postupak lančanog reakcije polimeraze propisuje pacijentima koji imaju poteškoće sa identifikacijom određenog patogena u dijagnosticiranju.

Ispitivanje laboratorija PCR Upotreba:

• otkriti patogene organizme koji uzrokuju infekciju organa urinarnih i genitalija, teško je prepoznati prilikom korištenja usjeva ili metoda imunologije;
• da se više puta dijagnosticira HIV u početnoj fazi u slučaju pozitivnog, ali uzrokuju sumnju u rezultat primarne analize (na primjer, u novorođenčadi od roditelja zaraženih pomagalima);
• uspostaviti onkološku bolest u ranoj fazi (proučavanje mutacija onkogena) i pojedine korekcije režima liječenja u određenom pacijentu;
• da bi se rano otkrio i potencijalni tretman nasljednih patologija.

Stoga su budući roditelji predali analizu kako bi saznali da li su nosioci genetske patologije, kod djece PCR određuje vjerojatnost bolesti koja se prenosi nasljedstvom.

• za otkrivanje patologija fetusa u ranom periodu habanja (pojedine ćelije rastućeg embrija istražuju se za moguće mutacije);
• kod pacijenata prije transplantacije organa - za "kucanje tkanine" (određivanje kompatibilnosti tkiva);
• identificirati opasne patogene organizme u krvi donatora;
• u novorođenčadi, djeca - za identifikaciju skrivenih infekcija;
• za procjenu rezultata antivirusnog i antimikrobnog tretmana.

Zašto prenijeti takav postupak

Budući da je PCR vrlo efikasan način dijagnoze, dajući gotovo 100% rezultat, postupak se koristi:

• za potvrdu ili uklanjanje konačne dijagnoze;
• brza procjena učinkovitosti terapije.

U mnogim slučajevima, PCR je jedini mogući test za otkrivanje bolesti u razvoju, ako su druge bakteriološke, imunološke i vinološke tehnike dijagnoze beskorisne.

• Virusi se otkrivaju pomoću PCR postupka odmah nakon infekcije i prije pojave znakova bolesti. Rano otkrivanje virusa omogućava vam brzo dodijeli liječenje.
• Takozvano "virusno opterećenje" (ili - broj virusa u tijelu) također se određuje za analizu DNK-om kvantitativnom metodom.
• Specifični patogeni organizmi (na primjer, Koch tuberkulozni štapić) je težak i obrađen predugo. PCR analiza omogućava vam brzo identificiranje minimalnog broja patogena (živih i mrtvih) u uzorcima koji su zgodni za istraživanje.

Detaljna analiza DNK patogena koristi se:

• da biste odredili njegovu osjetljivost na određene vrste antibiotika, što vam omogućava da odmah nastavite na liječenje;
• pratiti širenje epidemija među domaćim, divljim životinjama;
• otkriti i pratiti nove zarazne vrste mikroba i podtipova patogena koji su izazvali prethodne epidemije.

Vrste dijagnoze

Standardna metoda

Analiza reakcije lanca polimeraze vrši se na temelju višestrukog pojačanja (udvostručuje) određenog fragmenta DNK i RNA koristeći posebne enzime temeljnog temeljnog primera. Kao rezultat toga, lanac kopiranja pokazuje količinu materijala dovoljne za studiju.

Tokom postupka kopira se samo željeni fragment (koji odgovara određenim specifičnim uvjetima) i u slučaju da je zaista prisutan u uzorku.

O tome kako PCR prolazi, kaže ovaj detaljni video s korisnim shemama:

Ostale metode

• PCR provedeno u realnom vremenu. U ovom obliku istraživanja, postupak otkrivanja određenog fragmenta DNK pokrenut je nakon prelaska svakog ciklusa, a ne nakon cijelog lanca od 30 - 40 ciklusa. Ova vrsta studije omogućava vam dobivanje informacija o broju patogena (virusa ili mikroba) u tijelu, odnosno kvantitativne analize.
• From-pcr (režim obrnutog transkripcije). Ova analiza koristi se za pronalaženje RNA jednim lancem za otkrivanje virusa čija je genetska baza precizno RNA (na primjer, virus hepatitisa C, imunodeficijent). S ovom studijom koristi se posebna enzima - obrnuta transkriptaza i određeni temeljni premaz i jedno-lanac DNK izgrađen je na osnovu RNA. Zatim iz ovog lanca obnavljaju drugi DNK krug i standardni postupak se izvodi.

Indikacije za držanje

PCR postupak se koristi u klinici zarazne bolesti, neonatologiju, akušerstvu, pedijatriji, urologiji, ginekologiji, venerologiji, neurologiji, nefrologiji, oftalmologiji.

Indikacije za dodjelu analize:

• razjašnjavajući rizik od razvoja genetskih nepravilnosti u djetetu u vjerojatnosti nasljednih patologija;
• dijagnoza oba roditelja prilikom planiranja trudnoća ili ozbiljnog stanja majke sa podvrgom trudnoće;
• poteškoće sa začećem, identificiranje razloga neplodnosti;
• sumnja na seksualne infekcije u akutnoj fazi i sa simptomima tranzicije u hroničnu;
• otkrivanje uzroka upalnih procesa nejasnog porijekla;
• nezaštićeni slučajni i trajni spolni kontakti;
• određivanje osjetljivosti patogenog mikroorganizma na specifične antibiotike;
• pacijenti sa sumnjom na skrivenu infekciju za otkrivanje patogena na razvoj eksplicitnih simptoma (preklinički dijagnostici);
• pacijenti za potvrdu oporavka nakon bolesti (retrospektivna dijagnostika);

Također se koristi za dijagnosticiranje ako je potrebno da precizno otkrije sljedeće patogene ::

• virusi hepatitisa (A B C G), ljudska imunodeficijencija, citomegalovirus;
• vibrion kolera;
• virus herpesa, herpetirske vrste;
• retro - Adeno - i Rinovirusi;
• viruse Rubella, Epstein-Barr, Varizella (Zoster - virus);
• parso - i Picovirovirus;
• bakterije Helicobacter pylori;
• legionells, patogene vrste crevnih štapića;
• staphylococcus Golden;
• kauzativni agent;
• clostridia, difterija i hemofilni štap;

Koristi i za određivanje infekcija:

• zarazna mononukleoza;
• borreliois, lemardioza, otkucaji encefalitis;
• kandida gljive uhvaćene;
• seks infekcije - trihomonijaza, ureaplamosis, blijedo treponema, gardnereloza, gonoreja, mikoplazmoza, klamidija;
• tuberkuloza.

Kontraindikacije za držanje

Budući da se postupak ne provodi s pacijentom, bez utjecaja na tijelo, ali s biološkim materijalom uzetim za istraživanje, tada nema kontraindikata za PCR zbog nepostojanja potencijalne opasnosti.

Međutim, ograda biomaterijal iz cervikalnog kanala maternice ne vrši se nakon postupka kolposkopije. Dostava razmaza, struganje za analizu dopušteno je tek nakon 4 - 6 dana nakon završetka menstruacije i potpunog prekida izbora.

Je li metoda sigurna?

Nema negativnog uticaja na pacijenta sa izoliranim studijom svog biomaterijala u laboratorijskim uvjetima nemoguće je.

Priprema za postupak (doniranje bioloških supstanci za analizu)

Kao uzorak za analizu PCR-a, u kojem se otkriva DNK vanzemaljskog patogena, postoji bilo kakvo biološka tekućina, tkiva, alokacije organizma. Ograda proučarene tvari vrši se u obliku krvi koja uzima iz vena, otpada iz grmljana, šupljine nosa, uretre kanala, pleuralne šupljine, grlića.

Prije dijagnostičkog postupka, doktor objašnjava pacijenta, od kojih će se ograda oduzeti materijal:

1. Prilikom ispitivanja seksualnih infekcija napravljen je izbor genitalija, urina, moždani udar iz uretre.
2. Prilikom analize za herpetske infekcije, citomegalovirus, mononukleoza - uzmite analizu urina, razmažite se iz zea, do hepatitisa, toksoplazmoze - krvi iz Beča.
3. Da bi se dijagnosticirala različita vrsta, uzima se cerebrospinalna tekućina.
4. U pulmologiji uzorci za analizu - ispljuva i pleuralne tečnosti.
5. Kada postoji studija o mogućih intrauterinskih infekcija prilikom ulaska u fetus za analizu, korištene su obojene vodene i placente stanice.

Tačnost i tačnost analize ovise o sterilnosti uvjetima prilikom uzimanja materijala. Budući da studija PCR-a ima visoku osjetljivost, svaka kontaminacija studirane tvari može iskriviti rezultat.

Nadležna priprema za isporuku biomaterieta ne predstavlja poteškoće za pacijente. Postoje određene preporuke:

• prilikom analize seks infekcija:
  • eliminirajte intimne kontakte 72 sata prije materijala;
  • prestanite koristiti bilo koji vaginalni alati za 3 dana;
  • od večeri prethodnog dana, ne vodite higijenu pod istraženim područjem;
  • isključite mokrenje 3 do 4 sata prilikom uzimanja uzorka iz uretre;
• prestanite uzimati antibiotike mjesec dana prije testova za infekciju;
• krv je predan ujutro do jela i pića;
• sakupljanje prvog jutarnjeg dijela urina vrši se u sterilnom spremniku nakon pažljivog intimnog toaleta.

O tome kako se provodi dijagnostika pod metodom lančane reakcije polimeraze, čitanje ispod.

Kako je postupak

Prilikom obavljanja PCR studije, određeni ciklusi se ponavljaju na reaktoru (pojačalo ili termičko biciklizam):

1. Prvi korak - denaturacija. Plita, krv, bioptat, ginekološki uzorci, ispljuvak, u kojem se osuzre prisustvo DNK (ili RNA) patogena, postavljaju se u pojačalo, gdje se materijal zagrijava i pojavljuju se dijeljenje DNK u dva odvojena lanca u dva odvojena lanca.
2. Drugi korak - žarenje ili malo hlađenje materijala i dodavanje prajla na njega sposobno prepoznati željena područja u molekuli DNK i kontaktirati ih.
3. Treći korak - Endugacija - Javlja se nakon povezivanja 2 prajmera na svaki od DNK lanca. Tokom procesa, fragment patogena DNK je završen, a formirana je kopija.

Ovi se ciklusi ponavljaju vrstom "lančane reakcije", svaki put što dovodi do udvostručenja kopija specifičnog DNK fragmenta (na primjer, segment u kojem je određeni virus programiran). Već nekoliko sati formiraju se mnoge kopije fragmenta DNK, a otkriva se njihovo prisustvo u uzorku. Nakon toga, analizira i uspoređuju rezultate s bazom podataka o različitim vrstama patogena za određivanje vrste infekcije.

O dekodiranju rezultata i zaključivanja na osnovu PCR reakcije čitanje u nastavku.

Rezultati dekodiranja

Konačni rezultat studije izdaje se za 1 - 2 dana nakon prelaska biološkog materijala. Često - već prvog dana nakon analize.

Kvalitativna analiza

• Negativanrezultat toga znači da u supstanci nazvanom na studiji nisu otkriveni tragovi kauzacionih agenata infekcije.
• Pozitivnorezultat znači otkrivanje patogenih virusa ili bakterija u biološkom uzorku s vrlo visokim stupnjem tačnosti u trenutku isporuke materijala.

Ako je rezultat pozitivan, ali znakovi povećane infekcije nisu identificirani - ovo stanje tijela naziva se asimptomatskim "zdravim prevoznicima". Najčešće se primjećuje pri sklapanju biomaterijala sa određenog mjesta (grlićarski kanal, uretra, oralna šupljina) u virusnim bolestima. Tretman u ovom slučaju nije potreban, ali nužno stalno medicinsko posmatranje, jer postoji šansa:

• širenje virusa iz medija i infekcije zdravih ljudi;
• aktivacija procesa i tranzicija bolesti u hroničnom obliku.

Međutim, ako je test krvi pozitivan, to ukazuje da je infekcija pogodila telo, a to više nije stanje prijevoza, već patologija koja zahtijeva neposrednu specifičnu terapiju.

Kvantitativna analiza

Kvantitativni rezultat definira specijalistu posebno za određenu vrstu infekcije. Na osnovu toga, moguće je procijeniti stupanj razvoja, fazu bolesti, što omogućava brzo imenovanje pravilnog tretmana.

prosječni trošak

Cijene lančane reakcije polimeraze određuju se: Vrsta istraživanja, složenost kaurotivnog agenta, poteškoće u unosu biološkog materijala, vrsta analize (visokokvalitetni ili kvantitativni), nivo cijene u laboratoriji.

S druge strane, u proučavanju PCR-a moguće je odrediti nekoliko patogena odjednom za vrijeme ograde jedne vrste materijala za analizu. To štedi na drugim laboratorijskim analizama.

Otprilike, troškovi analize PCR-a u rubalju:

• gonokokk, Gardnerwell, Trichomonada Vagynis - od 180
• chlamydia Traamatis - od 190
• papillomavirus - od 380 do 500
• biocenoza urogenitalnog trakta kod žena (kvantitativna i kvalitetna procjena mikroflora) - od 800.

Čak i više korisne informacije o PCR studiji nalazi se u snimku u nastavku:

Genetika bakterija. Informacije za druge klase.

Lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimeraze je metoda koja omogućava višestruko povećanje (pojačanja) količine određenih molekula DNK u analiziranom uzorku (uključujući biološku materijalu ili čistu kulturu).

Glavne prednosti PCR-a kao dijagnostičkoj metodi u mikrobiologiji vrlo su visoka osjetljivost koja omogućava otkrivanje izuzetno malih koncentracija patogena u uzorcima i specifičnosti poreza, što omogućava otkrivanje ili identifikaciju patogena na generičkoj, vrstama ili pod- nivo nivoa. Glavni nedostatak PCR-a slijede iz izuzetno visoke osjetljivosti - slike su vrlo lako kontaminirati DNK iz pozitivne kontrole, još jedan uzorak ili PCR proizvod, koji će dovesti do lažne pozitivne reakcije. To nameće oštre ograničenja u uvjetima u kojima se PCR miješa i radi sa gotovim PCR proizvodima.

Provođenje PCR-a.Reakcijska smjesa se priprema sa sljedećim komponentama:

Odabrana DNK iz uzorka u studiji,

Pufer

MG2 + Ioni (neophodno za enzimski rad),

Dva temeljna su jednosodnevna DNK molekula (dužina češće od 18 do 24 nukleotida), komplementarni krajevi različitih krugova otpornog DNK sekvence.

Mješavina deoksinukleotidtriphosfata.

DNA polimeraza otporna na toplinu (Taq polimeraza se najčešće koristi, izolirana od THERMUS. aquaticus.).

Tada se ova reakcijska smjesa postavlja u pojačalo, što je zapravo programibilan termostat. U pojačalu se provodi 30-40 ciklusa promjene temperature. Svaki od ovih ciklusa sastoji se od tri faze (vidi Sl. 1):

Denaturatacija (temperatura 94 ° C) - rafalni vodonični lanci i DNK lanci se razilaze.

Primarni temelji (temperatura je obično oko 50-60 o c) - temeljni premaš pridruženi su krajevima DNK krugova. Općenito, kada se temperatura smanjuje, ujedinjenje originalnih DNK početnih krugova iz proučarenog uzorka (renaiterijski) energično je profitabilnije, ali koncentracija prajmera u reakcijskoj smjesi za mnoge reda veličine više od koncentracije DNK iz Uzorak (barem na početnim PCR ciklusima), stoga reakcija primernog prigušivanja teče brže renaturaration DNK. Ispaljivanje temperature je odabrana ovisno o taliranju temperatura (denaturacije) temeljnih premaza.

Izduživanje (temperatura je obično 72 ° C) - DNK Polimeraza dovršava temeljne temelji prema matrici dugih DNK lanca. Temperatura odgovara optimalnoj temperaturi rabljene DNK polimeraze.

Otkrivanje rezultata različito je u različitim verzijama PCR skupova i opisano je u odjeljku "PCR sorte".

PCR zvučnik

U ranim PCR ciklusima, broj dvosmjernih DNK molekula, od kojih je veličina određena udaljenosti između mjesta temeža, parovi sa svakim ciklusom. Formiran je i mali broj dužeg molekula DNK, koji se može zanemariti (vidi Sl. 2).

Dakle, u ranim ciklusima iznos PCR proizvoda opisan je M * 2 N Formulom, gdje je M početni broj DNK u uzorku, n je broj ciklusa. Tada reakcija ide na visoravan. To je zbog akumulacije reakcijskog proizvoda, smanjujući koncentraciju temeljnih priklada i deoksinukleotidhrijana, kao i povećanjem koncentracije pirofosfata (vidi Sl. 3).

PCR sorte

Konvencija PCR

U ovoj izvrhu, PCR vrši reakciju unaprijed određeni broj ciklusa (30-40), nakon čega se analizira je li akumulacija dvostruke molekula DNK došlo do reakcijske smjese.

Ova varijanta PCR formulacija kada se koristi kao metoda dijagnostike je kvalitativna metoda. Pozitivna reakcija ukazuje na prisustvo barem tragalnih količina željenih molekula DNK u uzorku. Negativna reakcija ukazuje na njihovo odsustvo. Kvantitativna procjena sadržaja originalnih molekula DNK u uzorku je nemoguća zbog reakcije na visoravni.

Glavna metoda otkrivanja prisutnosti proizvoda je elektroforeza u gelu agaroze ili poliakrilamid. PCR proizvodi su podijeljeni u gel pod djelovanjem električnog polja u skladu sa njihovom molekularne težine. Interkalizirajuća boja se dodaje u gel (fluorescentno u stanju povezano sa dvostranim DNK - najčešće brominski etidijum). Dakle, kada će se ozračiti ultraljubičastom, bit će moguće vidjeti prisutnost ili odsutnost pruge koja odgovara DNK potrebnoj molekularnoj težini. Prilikom provođenja PCR-a u dijagnostičke svrhe, uvijek se stavlja pozitivna i negativna kontrola reakcije, s kojom se uzorci uzorci (vidi Sl. 4).

PCR realnog vremena

U ovoj izvrhu, PCR vrši iznos PCR proizvoda u reakcijskoj smjesi stalno se registrira tijekom protoka reakcije. To nam omogućava da izgradimo reakcijsku krivulju (vidi Sl. 3) i na osnovu njega izračunaju broj željenih molekula DNK u uzorcima.

Jedna od vrsta PCR-a u realnom vremenu - koristeći interkaracionarnog, koji se dodaje direktno u reakcijsku smjesu (najčešće se koristi Sybrgeen). Druga vrsta - koristeći jednu od vrsta fluorescentnih sondi, obvezujući na odjeljak unutar PCR proizvoda, što omogućava povećanje specifičnosti otkrivanja (vidi Sl. 5). Fluorescencija protoka događa se direktno u instrumentu tokom protoka reakcije .

Pored mogućnosti kvantitativnog otkrivanja, postoje i druge prednosti PCR-a u realnom vremenu u usporedbi s konvencionalnim. Ova verzija PCR-a je jednostavnija, brza, a također ne zahtijeva otkrivanje cijevi sa PCR proizvodima, što smanjuje vjerojatnost zagađenja drugih uzoraka. Glavni nedostatak je veća vrijednost pojačala s integriranom mogućnošću otkrivanja fluorescencije u odnosu na uobičajenu.

Digitalni kvantitativni PCR

Nova, skupa i do sada mala širenja PCR-a, koja vam omogućava preciznije odrediti količinu DNK u uzorku. U ovoj izvedbi, reakcijska mješavina koja sadrži fluorescentnu boju podijeljena je u ogroman broj mikroskopskih količina (Na primjer, kapljice u emulziji). Nakon analizira PCR protok, u kojem je djela kapljica reakcija bila pozitivna i, u skladu s tim se primjećuje fluorescencija. Ovaj udio će biti proporcionalan broju željenih DNK molekula u uzorku.

PCR sa obrnutom transkripcijom

U ovom slučaju, prije određene varijante PCR, obrnuto prepisivanje (RNA u DNK) vrši se pomoću enzima za preokret. Dakle, ova metoda vam omogućuje provođenje visokokvalitetnog ili kvantitativnog otkrivanja RNA molekula. To se može koristiti za otkrivanje virusa koji sadrže RNA ili određivanje nivoa transkripcije (broj MRNA) gena ili drugog.

Slika 1. Faze PCR-a. Red-boja označeni temeljni premazi.

Slika 2.Akumulacija dvostrukih molekula DNK molekula ograničena prema temeljima za vrijeme PCR-a.

Slika 3.Dinamika RCR reakcije u različitim početnim koncentracijama željenih molekula DNK u uzorku. (a) - Najveća koncentracija (b) - srednja koncentracija (b) - najmanja koncentracija

Slika 4.Agaromnska elektroforeza PCR proizvoda. K + - Pozitivna kontrola (Snoral DNK je prisutan). 1-7 - Studirani uzorci (od kojih su 1-2 pozitivni, 3-7 su negativni). K - negativna kontrola (željena DNK očigledno nedostaje). U mnogim slučajevima, pored ciljanog proizvoda, vidljivi su lakši nesektični reakcijski proizvodi (temelji na temeljcima).

Slika 5.Metode otkrivanja prilikom korištenja PCR-a u stvarnom vremenu. (a) - Interkalizirajuća boja - fluoresciziraju se u dvostrani DNK (b) - Taqman - fluorescentna sonda događa se kada se polimeriza DNK ispipa sa 5'-3 'endonuclease aktivnosti zbog odvajanja fluorofora i istrebljenja. (c) - molekularna mreža - fluorescentna sonda nastaje kada je hibridizacija sonde sa ciljanim fragmentom zbog prostorne udaljenosti fluorofora i iscrpljenosti (g) - LightCycler - fluorescencija za akumulaciju pojavljuje se u hibridizaciji sondi (koji sadrže akumulator) i donator) sa ciljanim fragmentom zbog rezonantnog fluorescentnog energije (FRET).