Polümeraasi ahelreaktsioon, selle olemus ja rakendusala. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja selle kasutamine PCR polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi

Mitte nii kaua aega tagasi, usaldusväärne, väga tundlik ja kiire meetod erinevate inimeste nakkushaiguste diagnoosimiseks töötati välja. Seda meetodit nimetatakse "PCR" analüüsiks. Mis see on, milline on tema olemus, mida ta saab paljastada mikroorganisme ja kuidas seda õigesti edasi anda, me ütleme meile meie artiklis.

Ajalugu avamine

PCR-meetodeid kasutatakse ka vähi diagnoosimisel.

Meetodi eelised

PCR-i diagnoosimisel on mitmeid eeliseid:

1. Kõrge tundlikkus. Isegi kui on olemas ainult mõned mikroorganismi molekulid, määrab PCR analüüs nakkuse olemasolu. Meetod aitab krooniliste ja varjatud haigustega. Sageli on sellistel juhtudel mikroorganismil kasvatatud muul viisil.
2. Uuringu jaoks on iga materjal sobiv, näiteks sülje, vere, sugu, juuksed, juuste epiteeli rakud. Kõige tavalisem on vereanalüüs ja urogenitaalsed määrdumised PCR-is.

   

3. Puuduvad pika põllukultuuride kasvatamine. Automatiseeritud diagnostikaprotsess võimaldab teil saada uuringu tulemusi 4-5 tunni pärast.
4. Meetod on peaaegu 100% usaldusväärne. Salvestatakse ainult üksikud valed negatiivse tulemuse juhtumid.
5. Võime tuvastada mitut tüüpi patogeene ühest materjalist proovist. See mitte ainult kiirendab haiguse diagnoosimise protsessi, vaid vähendab oluliselt materjali kulusid. Sageli määrab arst tervikliku PCR analüüsi. Uuringu hind, mis koosneb kuue patogeenide määramisest, on umbes 1500 rubla.

Nii et tulemused olid PCR-uuringu läbiviimisel usaldusväärsed, on vaja analüüsi läbida diagnostika esialgse ettevalmistuse soovituste järgimise kohta:

1. Enne sülje läbimist peaksite hoiduma sööki ja narkootikumide 4 tunni jooksul enne materjali tara. Vahetult enne protseduuri loputage keedetud veega.
2. Ülaltoodud reegleid tuleks juhtida ja proovides proovi sisepinnast põske. Pärast loputamist on soovitatav viia läbi kerge naha massaaži, et tõsta esile näärme serva.
3. Uriini tavaliselt kodus kogutud. Selleks peate veetma põhjaliku tualeti suguelundite. Steriilses plastikpakendis on vaja koguda 50-60 ml uriini. Materjali puhtuse tagamiseks soovitatakse paigaldada tampooni tupe ja mees tõmbab nahale nii palju kui võimalik. Materjali on võimatu menstruatsiooniperioodi jooksul võimatu annetada.
4. Sperma panna, peate hoiduma seksuaalvahekorrast 3 päeva jooksul enne materjali tara. Samuti soovitavad arstid keelduda sauna külastamisest ja kümblustünni vastuvõtmisest, alkoholi joomist ja ägedat toitu. 3 tundi enne analüüsi, peate urineerimata hoiduma.
5. Näiteks tarnimiseks soovitatakse Chlamydia PCR-is analüüsida nii naisi kui ka mehi 3 päeva jooksul seksuaalse puhata. 2 nädalat enne analüüsi võimatu antibakteriaalsete ravimite vastuvõtmiseks. Nädala jooksul on vaja lõpetada intiimsete geelide, salvide, vaginaalsete küünalde kasutamise, suremas. 3 tundi enne uuringu, peate hoiduma urineerimisest. Menstruatsiooni ajal ei ole materjali tara läbi viidud, alles pärast 3 päeva pärast vere tühjendamise lõpetamist, saate võtta urogenitaalsed määrdused.

PCR raseduse ajal

Ooteperioodi jooksul on poiss palju nakkushaigusi seksuaalselt edastatavate nakkushaigustega, on loote tavalise arengu jaoks äärmiselt ohtlikud. STD-s võivad tekitada arengu-, raseduse katkemise või enneaegsete sündide, kaasasündinud lapsepõlve defektide intrauteraalse viivituse. Seetõttu on hädavajalik läbida PCR meetodi algusesse raseduse alguses. Assist on vajalik registreeritud kuni 12 nädala jooksul.



Materjali tara pärineb emakakaela emakakaelsest spetsiaalse harja abil. Menetlus on valutu ja ei kujuta endast ohtu lapsele. Tavaliselt raseduse ajal analüüsid Chlamydia PCR meetod, samuti ureaplasmoosi, mükoplasmoosi, tsütomegaloviiruse, herpese, papilloomiviiruse. Sellist uuringute kompleksi nimetatakse PCR-6-le.

PCR HIV-diagnostika jaoks

Tulenevalt asjaolust, et meetod on väga tundlik keha muutuste suhtes ja diagnostika läbiviimise tingimused, võivad tulemust mõjutada paljud tegurid. Seetõttu ei ole HIV-nakkuse PCR analüüs usaldusväärne meetod, selle tõhusus on 96-98%. Ülejäänud 2-4% juhtudest annab test valesti positiivseid tulemusi.

Kuid mõnes olukorras ei saa HIV-i PCR-diagnoosi puudumisel. Tavaliselt teostab selle ELISA vale negatiivse tulemusega inimestele. Sellised indikaatorid näitavad, et isik ei ole veel viiruse antikehi arendanud ja see on võimatu ilma paljude arvu suurenemiseta avaldada. Just seda saab saavutada vereanalüüsi läbiviimisega PCR meetodi abil.

Samuti on vaja HIV-positiivsest emast sündinud esimese eluaasta diagnoosimiseks. Meetod on ainus viis lapse staatuse usaldusväärseks määramiseks.

PCR hepatiidi diagnoosimiseks

Polümeraasi ahelreaktsiooni meetod võimaldab tuvastada hepatiidi DNA DNA-d, B, pikka aega enne infektsiooni antikehade moodustumist või haiguse sümptomite ilmumist. Eriti efektiivne on C-hepatiidi PCR analüüs, kuna 85% juhtudest lähtub selline haigus asümptomaatiline ja ilma õigeaegse töötlemiseta jääb ravi krooniliseks etapiks.



Põõsaliku esindaja õigeaegne tuvastamine aitab vältida tüsistusi ja pikaajalist ravi.

PCRi põhjalik uurimine

Põhjalik PCR analüüs: uurimine Polymezar ahela reaktsioonis, mis hõlmab samaaegselt mitmesuguste infektsioonide määratlust: mükoplasmi suguelundite, hominis müoplasma, Gardinerners Vagynis, Candida, Trichomonas, tsütomegaloviirus, herpes 1. ja 2. tüüpi, gonorröa, papilloomiviirus. Sellise diagnoosi hind ulatub alates 2000. aastast kuni 3500 rubla. Sõltuvalt materjalide ja seadmete kliinikutest ning analüüsi tüübist: kvaliteetne või kvantitatiivne. Mis on teie puhul vajalik - arst otsustab. Mõningatel juhtudel piisab lihtsalt määrata patogeeni olemasolu teistes, näiteks HIV-infektsioonis, on kvantitatiivne tiiter oluline roll. Kõigi ülaltoodud põhjuslike ainete diagnoosimisel nimetatakse uurimist "PCR-12 analüüs".

Analüüsi tulemuste dešifreerimine

Deciphering PCR analüüsi ei kujuta endast keerukust. Indikaatori indikaatoris on ainult kaks kaalu - "positiivne tulemus" ja "negatiivne tulemus". Põhjusliku esindaja tuvastamisel võivad arstid 99% usaldusega kinnitada haiguse esinemist ja jätkata patsiendi ravi jätkamist. Kvantitatiivse meetodiga vastavas graafikus infektsiooni määramiseks määratakse tuvastatud bakterite arvuline näitaja. Ainult arst saab kindlaks määrata haiguse aste ja nimetab vajaliku ravi.



Mõningatel juhtudel näiteks HIV-nakkuse määramisel PCR meetodiga negatiivse tulemusega on vaja täiendavaid uuringuid kinnitada saadud näitajate kinnitamiseks.

Kust analüüsi läbida?

Kust PCR analüüsi läbima: riigi kliinikus või eralaboris? Kahjuks on kohaliku omavalitsuse meditsiiniasutustes, seadmed ja meetodid sageli vananenud. Seetõttu on parem eelistada eralaborid kaasaegsete seadmete ja kõrgelt kvalifitseeritud personali. Lisaks saate privaatses kliinikus tulemusi palju kiiremini.

Moskvas paljud eralaborid pakuvad PCR analüüsi erinevate infektsioonide. Näiteks sellistel kliinikus nagu "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro", läbi PCR analüüsi. Uuringu hind on 200 rubla. Ühe patogeeni määramiseks.

Võib järeldada, et nakkushaiguste diagnoosimine PCR meetod enamikul juhtudel on kiire ja usaldusväärne viis tuvastada patogeeni keha varases infektsioonis. Kuid veel teatud juhtudel tasub valida muid viise diagnoosimiseks. Ainult spetsialist võib määrata sellise uuringu vajalikkuse. Deciphering PCR analüüs nõuab ka professionaalset lähenemist. Järgige soovitusi arsti ja ei anna iseseisvalt analüüse, kus puudub vajadus.

Seda kasutatakse sageli ekspresseerimismeetodina viiruste näitamiseks ja tuvastamiseks.

Esimest korda töötas see meetod välja K. Mulis (USA) 1983. aastal tonni. Tänu oma kõrge tundlikkuse, spetsiifilisuse ja täitmise lihtsuse tõttu kasutatakse seda laialdaselt geneetikas, kohtuekspertiisi, diagnoosi ja muid piirkondi.

Meetodi olemus on võimendus, s.t. in vitro DNA molekuli rangelt määratletud fragmentide koopiate arvu suurenemine. Selles meetodis on maatriksmehhanism ja vastastikuse täiendavuse põhimõte. Kaks ühekordse polünukleotiidide keti (nukleiinhape) on võimelised seonduma vesinikuvõlakirjadega üheks kahekordseks, kui ühe nukleotiidjärjestused vastavad täpselt teise nukleotiidide järjestusele, nii et nende lämmastiku alused võivad moodustada adenine-thymiini ja guaniin-tsütosiinipaari .

PCR põhineb DNA amplifikatsioonil, kasutades termilise stabiilse DNA polümeraasi, täites vastastikku komplementaarsete DNA ahelate sünteesit, alustades kahest praimeriga. Primer on DNA fragment, mis koosneb 20-30 nukleotiidist. Need praimerid (seemned) on täiendavad vastupidise DNA ahelaid. DNA sünteesi ajal ehitatakse praimerid äsja tundliku DNA molekulide ahelasse.

Tavaliselt pannakse PCR 25-40 tsüklit. Iga tsükkel sisaldab kolme etappi: esimene denaturatsioon 92-95 ° C juures. Samal ajal erinevad kaks DNA ahelat; Teiseks - anniilimine või praimerite lisamine 50-65 ° C juures; Kolmas - pikenemine või polümerisatsioon 68-72 ° C juures, samas kui DNA polümeraas täidab DNA maatriksi ahelate komplementaarset lõpetamist nelja tüüpi nukleotiide. Ühe tsükli tulemusena tekib soovitud geneetilise materjali kahekordistamine. DNA-ahelaga genereeritud esimeses tsüklis on teise tsükli jaoks maatriksid jne. Pärast esimest tsüklit amplifitseeriti ainult kahe praimeri vaheline fragment. Seega kahtles see amplifitseeritud sektsiooni koopiate arv, mis võimaldab 25-40 tsüklit nasüsinaatide miljoneid (2 N) DNA fragmente - summa, mis on piisav nende näitamiseks erinevate meetodite abil (teatud etiketti sisaldavate hübridisatsioonide meetodi abil , elektroforeesi jne). Selleks sagedamini kasutatakse elektroforeesi meetod agaroosgeelis, millel on värvimisega broomi etidiumiga.

PCR-s kasutatakse PCR-i jaoks PCR-ile ainult teatud patogeeni jaoks ainulaadset nukleotiidide järjestust.

PCR-i läbiviimise meetod ulatub järgmistele: DNA maatriks eraldatakse uuringu all olevast materjalist; Toru ühendab spetsiaalne DNA amplifikatsiooni seguga, mis hõlmab DNA polümeraasi, kõiki 4 tüüpi nukleotiide, 2 tüüpi praimereid, MgCl, puhvrit, deioniseeritud vee ja mineraalõli. Seejärel paigutatakse katseklaasid võimendi ja amplifitseerides automaatrežiimi vastavalt antud programmile, mis vastab patogeeni välimusele. Tulemused on registreeritud sagedamini elektroforeesis 1-2% agaroosgeelis etiidiumbromiidi juuresolekul, mis on ühendatud DNA fragmentidega ja tuvastatakse helendava ribadena UV-geeli kiiritamise ajal Transüül Lichinatoris. Kõik PCR-protseduurid võtavad 1-2 tööpäeva.

PCR spetsiifilisuse ja tundlikkuse suurendamiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: pesitsev PCR; PCR koos kuuma algusega, kasutades aktiivsete polümeraasi keskused parafiinikihi või blokaadi monoklonaalsete antikehade abil. Lisaks toodavad mõned ettevõtted lüofiliseeritud reaktiivi komplekte, et teostada DNA amplifikatsiooni, mis võimaldab teil kiirustada PCRi protsessi ja vähendada võimalust vale-positiivsete tulemuste ilmumise võimaluse vähendamiseks.

Praegu rakendatakse uut PCR PCR-tehnoloogiat (reaalajas PCR). Selle põhifunktsioon on polümeraasi ahelreaktsioonide kogunemise jälgimine ja kvantitatiivne analüüs ja saadud tulemuste automaatne registreerimine ja tõlgendamine. See meetod ei nõua elektroforeesi etappi, mis võimaldab vähendada PCR-i laboratoorseid nõudeid. PCR reaalajas kasutada fluorestsentsmärgisega oligonukleotiidi sondide DNA tuvastamiseks selle amplifikatsiooni protsessis. PCR reaalajas võimaldab teil teostada proovi täieliku analüüsi 20-60 minutit ja teoreetiliselt meetod on tuvastada isegi ühe DNA molekuli või RNA proovis.

Produkti tuvastamise süsteem polümeraasi ahelreaktsiooni "reaalajas" (jälgimine PCR) võimaldab tsükli tsükli jälgida amplifitseeritud DNA akumulatsiooni jälgimiseks. Süsteem hõlmab ennast oligonukleotiidi sondi, mis on võimeline ühendama (hübridiseeruma) sihtmärgi DNA sisemise segmendiga. 5'-otsas on sond tähistatud fluorestsentsvärvi reporteriga (reportervärv) ja 3'-otsas - blokeerija (kustutaja värv). Kuna PCR-produkt koguneb sondi hübridiseerub sellele, kuid hõõgus ei esine reporteri ja blokeerija läheduse tõttu. Polümeraasi järjestuse kopeerimise tulemusena jõuab sondi 5'-otsale. Polümeraasi 5'-3'-3'-eksonukleektiivsus katkestab fluorestsentsmärgise proovi 3'-otsast, vabastades seeläbi fluorestseerunud reporter oma ühendusest signaali blokaatoriga, mis toob kaasa fluorestsentsi suurenemise. Fluorestsentsi tase on seega proportsionaalne konkreetse reaktsiooniprodukti arvuga. Oluline on, et PCR tulemused salvestatakse fluorestsentsi juuresolekul suletud torudes ja seega lahendatakse üks selle meetodi üks peamisi probleeme - saastumise probleem ampliches'iga.

PCR eelised: analüüsi kiirus; Kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus; uuringu minimaalne kogus uuringus; Lihtne jõudlus ja täielik automaatika.

Tulenevalt asjaolust, et PCR tundlikkus jõuab DNA maatriksi ühe koopia avastamisele, on suur oht valede positiivsete tulemuste saamiseks. Seetõttu geneetiliselt diagnostikalaboris PCR-i kujundamisel peab pidevalt täitma erilisi nõudeid paigutuse ja töörežiimi jaoks.

PCR on üks viroloogilise diagnostika kompmentaraalseid meetodeid. See reaktsioon on väga oluline viirusinfektsioonide diagnoosimiseks, kui viiruse antigeenide või viiruse spetsiifilisi antikehi ei saa tuvastada ja kui viiruse nukleiinhappe olemasolu võib olla ainus infektsiooni tõend, eriti varjatud ja segatsekkide puhul.

Kui olete leidnud vea, valige palun teksti fragment ja klõpsake nuppu Ctrl + Enter..

Sain Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise meetodi alguses pärast iga kuumutusjahutuse tsüklit oli vaja lisada DNA polümeraasi reaktsioonisegule, kuna see inaktiveeriti DNA spiraalsete ahelate eraldamiseks vajaliku kõrgel temperatuuril. Reaktsiooniprotseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudis palju aega ja ensüümi. 1986. aastal paranes polümeraasi ahelreaktsiooni meetod oluliselt. Tehti ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraaside kasutamist. Need ensüümid olid termostabiilsed ja suutsid taluda paljusid reaktsioonitsükleid. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Üks esimesi termostabiilset DNA polümerazi rõhutati bakteritest Thermus Aquaticus. ja nimega Taq.- polüimia. Selle polümeraasi puudumine on see, et eksliku nukleotiidi tegemise tõenäosus on piisavalt suur, kuna sellel ensüümi ei ole veaparandusmehhanisme (3 "→ 5" exonuclease aktiivsus). Polümeraas PFU. ja PWO.Valitud Archey valduses on selline mehhanism, nende kasutamine vähendab oluliselt DNA mutatsioonide arvu, kuid nende kiirus (tõestus) on madalam Taq.. Nüüd rakendage segusid Taq. ja PFU.Samal ajal saavutada kõrge polümerisatsiooni määr ja kõrge koopia täpsus.

Leiutise hetkel töötas Cary Mullatis meetod sünteetilise keemikuna (see sünteesitud oligonukleotiide, mida kasutati siis, et tuvastada punktide mutatsioonid genoomse DNA-ga hübridiseerimisega) Cetutus ettevõtte ettevõttes, mis paneb ka PCR meetodit. 1992. aastal müüs Zetus õigus meetodile ja kasutamiseks patendile Taq.- Ettevõtte Polymerament Hofman-La Rosh for $ 300 miljonit. Siiski selgus, et Taq.- PolyMeraza iseloomustas nõukogude biokeemikud A. Kaltedin, A. Slyusarenko ja S. Rodetsas 1980. aastal ning 4 aastat enne seda Nõukogude avaldamist, st 1976. aastal Ameerika biokeemikud Alice Chien, David B.dgari ja John M. Trela. Sellega seoses püüdis Promega (Promega) ettevõte (Promega) sundida Roshit keelduma ainuõigustest selle ensüümi õigustest. American patendi PCR meetod on lõppenud 2005. aasta märtsis

Pcr

Meetod põhineb teatud DNA osa mitmel valimiste kopeerimisel kunstlike tingimustes ensüümide abil (\\ t in vitro.). Samal ajal kopeeritakse ainult sait, mis vastab kindlaksmääratud tingimustele ja ainult siis, kui see esineb uuringus uuringus. Erinevalt DNA amplifikatsioonist elusorganismides (replikatsioon) amplifitseeritakse PCR abil suhteliselt lühikesed DNA sektsioonid. Tavapärases PCR-protsessis ei ole kopeeritud DNA osade pikkus mitte rohkem kui 3000 baaspaari (3 kbp). Erinevate polümeraaside segu abil saab lisaainete ja teatud tingimustel PCR fragmendi pikkus jõuda 20-40 tuhande paari nukleotiidideni. See on endiselt oluliselt väiksem kui eukarüootsete raku kromosomaalse DNA pikkus. Näiteks koosneb inimese genoomi umbes 3 miljardi baaspaarist.

Reaktsioonikomponendid

PCR jaoks kõige lihtsamal juhul on vaja järgmisi komponente:

• DNA maatriksmis sisaldavad DNA osa, mis on vajalik amplifitseerimiseks.
• Kaks praimerittäiendavad soovitud DNA fragmendi erinevate ahelate vastassuunad.
• Termostabiilne DNA polümeraas - Ensüümi, mis katalüüsib DNA polümerisatsioonireaktsiooni. PCR-is kasutamiseks mõeldud polümeraas peaks säilitama aktiivsust kõrgel temperatuuril pikka aega, nii et nad kasutavad termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus Aquaticus. (Taq polümeraas), Pyrococcus furious. (PFU polümeraas) Pyrococcus Woesei. (PWO polümeraas) ja teised.
• Deoksüribonuklangerifosfaat (DATP, DGTP, DCTP, DTTP).
• Polümeraasi toimimiseks vajalikud mg 2+ ioonid.
• PuhverlahusVajalike reaktsioonitingimuste pakkumine - pH, ioonse jõud. Sisaldab sooli, veiste vadakualbumiini.

Reaktsioonisegu aurustumise vältimiseks lisatakse torule kõrge keeva õli, näiteks vaseliini. Kui kuumutatud kaanega manustatakse võimendi, ei ole see vaja teha.

Pürofosfataasi lisamine võib suurendada PCR-reaktsiooni saagis. See ensüüm katalüüsib pürofosfaadi hüdrolüüsi, nukleotiderifaatsi lisaseadme külgprodukti DNA kasvava ahelaga ortofosfaadile. Pürofosfaat võib pärssida PCR-reaktsiooni.

Primelimerid

PCR spetsiifilisus põhineb täiendavate komplementide moodustumisel maatriksi ja praimerite vahel, lühikesed sünteetilised oligonukleotiidid 18-30 alust. Iga praimeri täiendab ühe kaheahelalise maatriksi ahela komplementaarse ja piirab amplifitseeritud ala algust ja lõppu.

Pärast maatriksi hübridiseerimist praimeriga (lõõmutamine) on viimane DNA polümeraasi seemnena maatriksi komplementaarse ahela sünteesi seemnena (vt).

Kõige olulisemad omadused praimerid on sulamispunkt (t m) praimer-maatriksi kompleksi.

T m on temperatuur, mille juures pool DNA maatriksidest moodustab oligonukleotiidi praimeriga kompleksi kompleksi. Keskmistatud arvutusvalemiga T m lühikesigonukleotiidi (ja pika DNA fragmentide puhul), võttes arvesse K + ja DMSO ioonide kontsentratsiooni:

kui L on nukleotiidide arv praimeris, K + on kaaliumi ioonide molaarne kontsentratsioon, G + C - kõigi guiinide ja tsütosiinide summa.

Praimeri pikkuse ja nukleotiidi koostise ebaõige valiku korral on võimalik moodustada osaliselt komplementaarseid komplekse maatriksi DNA teiste osadega, mis võivad põhjustada mittespetsiifilisi tooteid. Sulamispunkti ülemine piir on piiratud polümeraasi optimaalse temperatuuriga, mille aktiivsus langeb temperatuuril üle 80 ° C.

Praktiliste valimisel on soovitav järgida järgmisi kriteeriume:

Võimend

Joonis fig. üks: PCR-i võimend

PCR viiakse läbi võimendi - vahend, mis pakub perioodilisi jahutus- ja kuumutamistorud, tavaliselt täpsusega vähemalt 0,1 ° C. Kaasaegsed võimendid võimaldavad teil täpsustada keerukaid programme, sealhulgas võimalust "kuuma algus", puudutus PCR-i (vt allpool) ja amplifitseeritud molekulide järgneva ladustamise korral 4 ° C juures. PCR jaoks reaalajas vabastatakse fluorestseeruva detektoriga varustatud seadmed. On ka instrumente automaatse kaanega ja kambrina mikroplaadi jaoks, mis võimaldab teil neid automatiseeritud süsteemidesse kinnistada.

Reaktsioonikursus

Photography Gel sisaldab marker DNA (esimene ja viimane teenindusaegade) ja PCR tooteid

Tavaliselt teostatakse PCR-i ajal 20-35 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist (joonis 2).

Denaturatsioon

Kahekihiga DNA maatriks kuumutatakse temperatuurini 94-96 ° C (või kuni 98 ° C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5-2 minutit, nii et DNA ahelad eraldatakse. Seda etappi kutsutakse denaturatsioonKuna vesiniku sidemed hävitatakse kahe DNA ahela vahel. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) viiakse reaktsioonisegu esialgne kuumutus 2-3 minutit maatriksi ja praimerite täielikuks denatureerimiseks. Seda vastuvõtt kutsutakse kuuma algusSee võimaldab teil vähendada mitmeid mittespetsiifiliste reaktsioonitoodete arvu.

Lõõmutamine

Kui ahelad eraldati, temperatuur langetatakse nii, et praimerid saaksid ühendust üheahelalise maatriksiga. Seda etappi kutsutakse lõõmutamine. Lõõgumise temperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt võrdne praimerite sulamistemperatuuriga. Vale valik lõõmutamise temperatuur viib kas maatriksiga praimerite halva seondumisega (ülehinnatud temperatuuril) või seondumiseks vale koha ja mittespetsiifiliste toodete välimusega (madalatel temperatuuridel). Anniluude aeg on 30 tükki, samal ajal, sel ajal on polümeremes juba suutnud sünteesida mitu sada nukleotiidi. Seetõttu on soovitatav valida praimerid sulamistemperatuuriga üle 60 ° C ja viiakse läbi anniilimine ja pikenemine samal ajal 60-72 ° C juures.

Pikenemine

DNA polümeraas kordab maatriksi ahelat praimeriga kui seemnena. See on etapp pikenemine. Polümeraas algab teise ahela sünteesiks praimeri 3 "-kontseerijast, mis võttis ühendust maatriksiga ja liigub mööda maatriksit, sünteesides uut ketti 5" kuni 3-tollise suunas. Lükamise temperatuur. sõltub polümeraasist. Sageli kasutatud Taq polümeratsioone ja PFU-d on kõige aktiivsemad 72 ° C juures. Verimisaeg sõltub nii DNA polümeraasi tüübist kui ka amplifitseeritud fragmendi pikkusest. Tavaliselt kestab pikendamise aeg võrdne ühega minut iga tuhande baaspaaride jaoks. Pärast kõigi tsüklite lõppu on sageli täiendava sammu lõplik pikenemineKõigi üheahelate fragmentide lõpuleviimiseks. See etapp kestab 7-10 minutit.

Joonis fig. 2.: Esimese PCR-tsükli skemaatiline esitus. (1) denaturatsioon temperatuuril 94-96 ° C. (2) lõõmutamine 68 ° C juures (näiteks). (3) pikenemine temperatuuril 72 ° C (p \u003d polümeraas). (4) Esimene tsükkel on lõpetatud. Need kaks saadud DNA ahelat on järgmisel tsükli maatriksiks, nii et maatriksi DNA kogus iga tsükli ajal kahekordistab

Summa spetsiifilise reaktsiooni produkti (piiri praimeritega) teoreetiliselt suureneb proportsionaalselt 2 N-2N, kus n on reaktsioonitsüklite arv. Tegelikult võib iga tsükli tõhusus olla väiksem kui 100%, seega tegelikkuses P ~ (1 + E) N, kus p on toote kogus, on E tsükli keskmine efektiivsus.

DNA "pikkade" koopiate arv kasvab ka, kuid lineaarselt, seetõttu domineerivad reaktsioonisaadustes spetsiifiline fragment.

Soovitud produkti kasvu geomeetrilise progresseerumise tõttu on piiratud reagentide arv, inhibiitorite olemasolu, kõrvalsaaduste moodustumine. Reaktsiooni viimastes tsüklitel aeglustub kasv, seda nimetatakse "platoo mõjuks".

PCR-sordid

• Pesastatud PCR (Pesastatud PCR (ENG.)) - Seda kasutatakse reaktsiooni kõrvalsaaduste arvu vähendamiseks. Kasutage kahte paari praimereid ja viivad läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine praimeripaar võimendab DNA sektsiooni esimese reaktsiooni toote piires.
• Pööratud PCR (Priver PCR (inglise keeles)) - kasutatakse juhul, kui soovitud järjestuse sees on tuntud ainult väike osa. See meetod on eriti kasulik, kui on vaja kindlaks määrata külgnevate järjestuste järel pärast DNA-sisestamist genoomi. Ümberpööratud PCR rakendamiseks viiakse mitmeid lõikamis-DNA piiranguid koos järgneva fragmentide ühendiga (ligeerimine). Selle tulemusena on tuntud fragmendid tundmatu sektsiooni mõlemas otsas, pärast mida PCR-i võib läbi viia tavapäraselt.
• PCR tagurpidi transkriptsiooniga (Pöörd transkriptsioon PCR, RT-PCR (ENG.)) - Kasutatakse RNA raamatukogu teadaoleva järjestuse võimendamiseks, valimiseks või identifitseerimiseks. Enne tavalise PCR-i süntees üheahelalise DNA molekuli viidi läbi MRNA maatriksis restartase ja ühe ahelaga cDNA saadakse, mida kasutatakse maatriks PCR. See meetod määrab sageli kindlaks, kus ja kui geeni andmed on väljendatud.
• Asümmeetriline PCR (ENG. Asümmeetriline PCR.) - See viiakse läbi, kui on vaja võimendada peamiselt originaal DNA ahelaid. Kasutatakse mõnes järjestuses ja hübridisatsioonianalüüsis. PCR viiakse läbi tavapäraselt, välja arvatud see, et üks praimeritest võetakse suures liigses üleliigse. Selle meetodi modifikatsioonid on inglise keeles. L. ebaura-A. fter-T. ta-E. kmiku-PCR. (Hilise PCR), milles praimereid kasutatakse erinevate kontsentratsioonidega ja madala kontsentratsiooniga praimeri valitakse kõrge (sulamistemperatuuriga) kõrge (sulamistemperatuur) kui kõrge kontsentratsiooni praimer. PCR viiakse läbi kõrge anniilimise temperatuuri juures, seeläbi on võimalik säilitada reaktsiooni tõhusust kogu tsüklites.
• Kvantitatiivne PCR (Kvantitatiivne PCR, Q-PCR (inglise keeles)) või PCR reaalajas - Kasutatakse konkreetse PCR-produkti suuruse mõõtmise otseseks jälgimiseks igas reaktsioonitsüklis. Selles meetodis kasutatakse fluorestsents-märgistatud praimereid või DNA sondide reaktsioonisaaduse koguse täpseks mõõtmiseks, kuna see on kogunenud; või fluorestseeruva interkaleerimise värvainet kasutatakse SyBr roheline I. mis seondub kaheahelaga DNA-ga. SyBr roheline I. Pakub lihtsat ja majanduslikku võimalust PCR-toodete tuvastamiseks ja kvantitatiivseks määramiseks reaalajas PCR-i ajal ilma vajaduseta kasutada spetsiifilisi fluorestseeruvaid soendeid või praimereid. Amplifikatsiooni värvide ajal SyBr roheline I. Väiganud väikese DNA PCR toodete soonesse ja sööb tugevamat võrreldes mitteseotud värviga fluorestsentssignaaliga sinise laseriga kiiritatud kujuga. SyBr roheline I. Ühildub kõigi reaalajas PCR-i jaoks teadaolevate seadmetega. Maksimaalne imendumine SyBr roheline I. Asub lainepikkusel 494 nm. Lisaks peamisele, värvaine spektrile on kaks väikest täiendavat imendumist Maxima - 290 nm ja 380 nm juures. Maksimaalne emissioon SyBr roheline I. Asub lainepikkusel 521 nM (roheline).
• Etapp PCR (PCR (inglise keeles)) - selle lähenemisviisi abil vähendab mittespetsiifilise praimeri sidumise mõju. Esimesed tsüklid viiakse läbi temperatuuril üle optimaalse andekatte temperatuuri kõrgemal, seejärel iga paari tsükli järel vähendatakse anni temperatuuri järk-järgult optimaalseks. Seda tehakse selleks, et praimer hübridiseeritakse kõigi selle pikkuse komplementaarse ahelaga; Arvestades optimaalse lõõmutamise temperatuuriga, hübridiseeritakse krunt osaliselt täiendava ahelaga. Genoomse DNA praimeri osaline hübridiseerimine toob kaasa mittespetsiifilise amplifikatsiooni, kui praimeri jaoks on palju siduvaid saite. Enamikul juhtudel võib esimese kümne PCR-tsüklit läbi viia anniilimise temperatuuril 72-75 ° C ja seejärel kohe vähendada optimaalse, näiteks kuni 60-65 ° C.
• Molekulaarsete kolooniate meetod (PCR geelis, ENG. Koloonia - PCR koloonia) - Akrüülamiidi geel polümeriseeritud kõigi PCR-komponentidega pinnale ja viivad läbi PCR-i. Analüüsitud DNA-ga seotud punktides esineb amplifikatsioon molekulaarsete kolooniate moodustumisega.
• PCR CDNA otste kiire amplifikatsiooniga (ENG. CDNA lõpeb kiire apelitamine, rassi-PCR ).
• PCR pikad fragmendid (ENG. Pikaajaline PCR) - PCR muutmine laiendatud DNA osade võimendamiseks (10 tuhat põhjust). Kasutatakse kahe polümeraasi segu, millest üks on kõrge tõendusmaterjali taq polümeraas (see tähendab, et DNA pikad ketid sünteesivad ühes passis) ja teine \u200b\u200bDNA polümeraas 3-tollise eksonukleaasi aktiivsusega tavaliselt PFU polümeraasi. Teine polümeraasi on vajalik selleks, et kohandada esimesi vigu, kuna Taq polümeraas peatab DNA sünteesi, kui ei ole lisatud täiendava nukleotiidi. See mitte-komplementaarne nukleotiid eemaldab PFU polümeraasi. Polümeri segu võetakse 50: 1 või isegi alla 100: 1 puhul, kus Taq polümeraas kestab PFU polümeraasi suhtes 25-100 korda rohkem võrreldes 25-100 korda rohkem.
• Rapd. (ENG. Polümorfse DNA juhuslik amplifikatsioon ), PCR-i polümorfse DNA juhusliku amplifikatsiooniga - kasutatakse juhul, kui on vaja eristada organisme geneetilise järjestuse lähedal, näiteks erinevaid kultiveeritud taimede sorte, koerte tõugusid või lähedaseid mikroorganisme. Selles meetodis kasutatakse tavaliselt ühte väikese suurusega praimerit (umbes 10 lk.). See praimer täiendavad osaliselt uuritud organismide juhuslike DNA-alade poolt. Tingimuste valimine (praimeri pikkus, selle koostis, temperatuur jne) on võimalik saavutada rahuldavaid erinevusi PCR-maalis kahe organismi jaoks.
• Spetsiifiline PCR (ENG. rühmapõhine PCR) - PCR seotud järjestuste sees ühe või erinevate liikide vahel, kasutades konservatiivseid praimereid nende järjestustega. Näiteks valiku universaalsete praimerite ribosoomi 18s ja 26s. Geenide amplifikatsiooni liikide spetsiifilise intergeense spacer: geenide järjestus 18s ja 26s. Konservatiivne liikide vahel, nii et PCR nende geenide vahel toimub kõigi uuritud liikide jaoks. Vastupidine meetod on - unikaalne PCR (ENG. unikaalne PCR), kus ülesanne seisneb praimerite valimisel, et võimendada ainult konkreetset järjestust seotud järjestuste vahel.
• PCR, kasutades kuuma algust (ENG. Hot-Start PCR) - PCR-i modifitseerimine DNA polümeraasi abil, milles polümeraasi aktiivsus blokeeritakse toatemperatuuril antikehade või antikehaga, imiteerivad väikesed molekulid nagu affigudy, mis on reaktsiooni ajal reaktsiooni esimese denatureerimise ajal PCR-is. Tavaliselt viiakse esimene denaturatsioon läbi 95 ° C juures 10 minutit.
• Virtuaalne PCR (Eesti Silico PCR, digitaalne PCR, elektrooniline PCR, E-PCR) - matemaatiline meetod teoreetilise polümeraasi ahelreaktsiooni arvutianalüüsi analüüsina, kasutades praimerite (või DNA sondid) järjestuste loendit genoomi DNA potentsiaalse amplifikatsiooni prognoosimiseks Uuring, kromosoom, rõngas DNA või muu DNA krundi.

Kui maatriksi nukleotiidijärjestus on üldse osaliselt või teadmata, saate kasutada degenereerunud praimeridSelle järjestus sisaldab degenereerunud positsioone, milles iga alus võib asuda. Näiteks võib praimerijärjestus olla selline: ... ath ...kus n - a, t või s.

PCR-rakendus

PCR-i kasutatakse paljudes analüüsides ja teaduslikes katsetes.

Kriminalistika

PCR-i kasutatakse nn geneetiliste sõrmejälgede võrdlemiseks. Me vajame kuriteo stseeni geneetilise materjali proovi - verd, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlustatava geneetilise materjaliga. Üsna väike arv DNA, teoreetiliselt - üks koopia. DNA jaguneb fragmentideks, seejärel võimendatakse PCR-i abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesiga. Saadud DNA bändide muster ja seda nimetatakse geneetiline sõrmejälg (ENG. geneetiline sõrmejälje.).

Isaduste asutamine

Joonis fig. 3.: PCR-i amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. (1) Isa. (2) laps. (3) ema. Laps päritud mõned omadused geneetilise trüki mõlema vanema, mis andis uue, ainulaadse jälje.

Kuigi "geneetilised sõrmejäljed" on unikaalsed (välja arvatud ühekordse kahepoolsete kaksikute juhtum), saab suhteid siiski paigaldada, tehes mitu sellist sõrmejälgi (joonis 3). Sama meetodit saab rakendada, veidi muuta, et luua evolutsiooniline sugulus organismide seas.

Meditsiiniline diagnoos

PCR võimaldab päriliku ja viirushaiguste diagnoosi oluliselt kiirendada ja hõlbustada. Soovitud geeni amplifitseeritakse PCR-i abil sobivate praimerite abil ja seejärel järjestatakse mutatsioonide määramiseks. Viirusinfektsioonide võib tuvastada kohe pärast nakatamist nädalate või kuu jooksul enne haiguse sümptomeid.

Isikupärastatud meditsiin

Mõnikord on ravimid mõnede patsientide jaoks toksilised või allergilised. Selle põhjused on osaliselt individuaalsed erinevused ravimite vastuvõtlikkuse ja ainevahetuse ja nende derivaatide metabolismis. Need erinevused määratakse geneetilisel tasandil. Näiteks ühel patsiendil on konkreetne tsütokroom (maksavalgu, mis vastutab välismaalase ainete metabolismi eest), võivad olla aktiivsemad, teine \u200b\u200bon väiksem. Selleks et määrata kindlaks, millist tüüpi tsütokroom on see patsient, tehakse ettepanek viia enne ravimi rakendamist PCR analüüsi. Seda analüüsi nimetatakse esialgse genotüüpimiseks (ENG. tulevane genotüüpimine.).

Kloonimine geenid

Geenide kloonimine (mitte segadusse organismide kloonimisega) on geeni eraldamise protsess ja geneetiliselt muundatud manipulatsioonide tulemusena suure hulga selle geeni produkti. PCR-i kasutatakse geeni amplifitseerimiseks, mis seejärel sisestatakse vektor - DNA fragment, mis kannab välismaalase geeni samas või erinevas, kasvatamiseks, organismi. Vektoritena kasutatakse näiteks plasmiide \u200b\u200bvõi viiruse DNA-d. Geeni sisestamist välisorganismile kasutatakse tavaliselt selle geeni-RNA saaduse saamiseks või kõige sagedamini valkude saamiseks. Seega saadakse tööstuslikes kogustes palju valke kasutamiseks põllumajanduses, meditsiinis jne.

Joonis fig. neli: Kloonimine geeni plasmiidi abil.
(1) organismi kromosomaalne DNA-d A. (2) PCR. (3) Paljud geeni geeni koopiad A. (4) geeni sisestamine plasmiidis. (5) Plasmiid koos organismi genoomiga A. (6) Plasmiidide kasutuselevõtt kehas V. (7) korrutades keha geeni A koopiate arvu B.

DNA sekveneerimine

Sekveneerimismeetodis, mis kasutab dideoksinukleotiidi PCR-i fluorestsentsmärgist või radioaktiivset isotoobi, on lahutamatu osa, kuna see on täpselt polümerisatsiooni ajal DNA ahelale, derivaatide derivaadid, mis on märgistatud fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega märgistatud nukleotiidide derivaadid. Kinnitus dideoksinukleotiidi sünteesitud ahelale viib sünteesi kaljuni, mis võimaldab teil määrata spetsiifiliste nukleotiidide asendi pärast geeli eraldamist.

Mutagenez

Praegu on PCR muutunud mutageneesi peamiseks meetodiks (DNA nukleotiidjärjestuse muutmine). PCR kasutamine võimaldas lihtsustada ja kiirendada mutageneesi läbiviimise korra ning muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavaks.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) - kõrge täpsuse meetod pärilike patoloogiate diagnoosimise valdkonnas, viirushaiguste diagnoosimise valdkonnas mis tahes etapis (äge või krooniline), samuti varases staadiumis - haiguse ilmselgede ilmingute ilmnemise tõttu patogeenide tuvastamisel , tuginedes nende DNA-ga, RNA, mis on geneetiline materjal, patsiendilt saadud proovides. Ja täna räägime oma olemusest, diagnostilistest etappidest ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodite põhimõtetest ning selle väärtusest.

Mis on polümeraasi ahelreaktsioon

Analüüsi põhjal on amplifikatsioon (kahekordistus) - paljude koopiate loomine lühikese DNA sektsioonist (deoksüribonukleiinhape), mis esindab inimese geneetilist kompleksi. Uuringu jaoks on väga väike hulk füsioloogilist ainet (röga, raie mass, epiteelijäätmed, eesnäärme mahla, vere, sperma, õline vesi, lima, platsenta kangas, uriin, sülg, pleura vedelik, tserebrospinaalid). Samal ajal võib tuvastada näiteks patsiendi urogenitaalteed, isegi ühe pahatahtliku mikroobi saab tuvastada.

PCR metoodika (polümeraasi ahelreaktsiooni) arendas 1993. aastal Ameerika teadlase K. Mulis, sai ta Nobeli preemia.

Aktiivselt kasutatud:

• infektsioonide varajases diagnoosimisel geneetilises osas;
• kohtuekspertiisi uurimisel, kui uurimiseks on äärmiselt väike arv DNA-d;
• veterinaarmeditsiinis, farmaatsia-, bioloogia, molekulaarne geneetika;
• dNA identiteedi tuvastamiseks kinnitage isadus;
• paleontoloogia, antropoloogia, ökoloogia (toodete kvaliteedi jälgimisel, keskkonnategurid).

Selle kohta, et polümeraasi ahelreaktsioon räägib selle video üksikasjalikult:

Kellele see on ette nähtud

Nakkushaiguste diagnoosimisel polümeraasi ahelreaktsiooni on üks kõige usaldusväärsema konkreetse täpsuse ja usaldusväärsuse tehnikaid. Näiteks on PCR-i analüüsi täpsus klamüüdial ja paljude teiste patogeenide puhul 100% -ni (absoluutne). Kõige sagedamini on polümeraasi ahelreaktsiooni protseduur ette nähtud patsientidele, kellel on raskusi konkreetse patogeeni identifitseerimisega diagnoosimisel.

Laboratoorne test PCR kasutamine:

• tuvastada patogeensete organisme, mis põhjustavad uriini ja suguelundite nakatumist, raskelt identifitseeritavaid põllukultuuride kasutamisel või immunoloogiliste meetodite kasutamisel;
• hIV-i korduvalt diagnoosimiseks esialgses etapis positiivse juhtumi puhul, kuid põhjustades peamise analüüsi tulemust (näiteks AIDS-i nakatunud vanemate vastsündinutel vastsündinutel);
• luua sisestamishaigus varajases staadiumis (onkogeenide mutatsioonide uurimine) ja ravimirežiimi individuaalse korrigeerimise konkreetses patsiendil;
• pärilike patoloogiate varajase avastamise ja potentsiaalse ravi jaoks.

Seega tulevased vanemad annavad analüüsi üle, et teada saada, kas nad on geneetilise patoloogia vedajad, lastel PCR määrab pärimise teel edastatud haiguse tõenäosuse.

• loote patoloogiate avastamiseks kulumisperioodil (kasvava embrüo individuaalsed rakud uuritakse võimalike mutatsioonide puhul);
• patsientidel enne elundite siirdamist - "kanga kirjutamise" jaoks (koe ühilduvuse määramine);
• ohtlike patogeensete organismide tuvastamiseks doonoriveres;
• vastsündinutel, lastel - peidetud infektsioonide tuvastamiseks;
• hinnata viirusetõrje ja antimikroobse ravi tulemusi.

Miks sellise menetluse läbima

Kuna PCR on väga tõhus diagnoosimismeetod, andes protseduuri peaaegu 100% tulemuseks:

• lõpliku diagnoosi kinnitamiseks või kõrvaldamiseks;
• ravi tõhususe kiire hindamine.

Paljudel juhtudel on PCR ainus võimalik test arengu haiguse avastamiseks, kui teised bakterioloogilised, immunoloogilised ja viroloogilised diagnoosimismeetodid on kasutud.

• Viirused tuvastatakse PCR-protseduuri abil kohe pärast nakatamist ja enne haiguse tunnuste ilmumist. Viiruse varajane avastamine võimaldab teil kiiresti ravi määrata.
• Nn viiruslik koormus "(või - viiruste arv kehas) määratakse ka DNA analüüsimisel kvantitatiivse meetodi abil.
• Konkreetsed patogeensed organismid (näiteks Koch Tuberculous Wand) on raske ja kasvatatud liiga pikk. PCR analüüs võimaldab teil kiiresti tuvastada patogeenide (elu ja surnud) minimaalse arvu proovides, mis on teadusuuringute jaoks mugavad.

Kasutatakse patogeeni DNA üksikasjalikku analüüsi:

• selle tundlikkuse määramiseks konkreetsete antibiootikumide tüübi suhtes, mis võimaldab teil kohe ravi jätkata;
• jälgida kodumaiste, metsloomade epideemiate levikut;
• avaldada ja jälgida uusi nakkusi tüüpi mikroobide ja alatüüpide patogeenide provotseeritud eelmise epideemiate.

Diagnoosi liigid

Standardmeetod

Polümeraasi-ahela reaktsiooni analüüs viiakse läbi DNA ja RNA konkreetse fragmendi mitme ampression (kahekordistamise) alusel, kasutades spetsiaalseid praimeri ensüüme. Selle tulemusena selgub kopeerimisahel uuringu jaoks piisava materjali kogus.

Menetluse käigus kopeeritakse ainult soovitud fragment (vastavad konkreetsetele tingimustele) ja juhul, kui see on proovis tõesti olemas.

Selle kohta, kuidas PCR läbib, ütleb selle üksikasjaliku video kasulike skeemidega:

Muud meetodid

• PCR tegeleb reaalajas. Sellises uurimisvormil käivitatakse antud DNA fragmendi avastamise protsess pärast iga tsükli möödumist ja mitte kogu 30-40 tsükli ahela järel. Seda tüüpi uuring võimaldab teil saada teavet patogeeni (viiruse või mikroobi) arvu kohta kehas, mis on kvantitatiivne analüüs.
• PCR-ist (pöördtranskriptsiooni režiim). Seda analüüsi kasutatakse rna leidmiseks ühe ahelaga, et tuvastada viirused, mille geneetiline alus on just RNA (näiteks C-hepatiidi viirus, immuunpuudulikkus). Selle uuringuga kasutatakse spetsiaalset ensüümi - pöördtranskriptaasi ja teatud praimeri ja üheahelaga DNA ehitatakse RNA alusel. Siis selle ahela taastamine teise DNA ahela ja standard protseduuri tehakse.

Näidustused hoidmiseks

PCR-protseduuri kasutatakse nakkushaiguste, neonatoloogia, sünnitusabi, lastel, uroloogia, günekoloogia, veneroloogia, neuroloogia, nefroloogia, oftalmoloogia kliinikus.

Näidustused analüüsi määramiseks:

• selgitades laste geneetiliste kõrvalekaldete tekkimise riski pärilike patoloogiate tõenäosus;
• diagnoosi mõlema vanema raseduse ajal või tõsine seisund ema raseduse ajal;
• raskused kontseptsiooniga, viljatuse põhjuste kindlakstegemine;
• seksinfektsioonide kahtlus ägedas etapis ja kroonilise ülemineku sümptomitega;
• ebaselge päritolu põletikuliste protsesside põhjuste tuvastamine;
• kaitsmata juhuslikud ja püsivad seksuaalvahendid;
• patogeense mikroorganismi tundlikkuse määramine konkreetsetele antibiootikumidele;
• peidetud infektsiooni kahtlusega patsiendid patogeenide avastamiseks selgesõnaliste sümptomite väljatöötamisega (prekliiniline diagnostika);
• patsiendid kinnitavad taastumist pärast haigust (tagasiulatuva diagnostika);

Kasutatakse ka diagnoosimiseks vajadusel täpselt tuvastada järgmised patogeenid ::

• hepatiidi viirused (A B C g), inimese immuunpuudulikkus, tsütomegaloviirus;
• vibrion koolera;
• herpeseliikide viirus;
• retro - Adeno - ja Rinoviirused;
• rubella viirused, Epstein-Barr, Varizella (zoster - viirus);
• partor - ja pikoviroviirus;
• bakterite Helicobacter pylori;
• legionellid, patogeensed soolestiku tüübid;
• staphylococcus kuldne;
• põhjustav aine;
• clostridia, difteeria ja hemofiilne kinni;

Kasutatud ja infektsioonide kindlakstegemiseks:

• nakkusliku mononukleoosi;
• borreloos, lemaryioos, palli entsefaliit;
• candida seente püütud;
• sex infektsioonid - Trichomoniaas, ureaplasmoos, kahvatu treponeem, gardnerelloos, gonorröa, mükoplasmoos, klamüüdia;
• tuberkuloos.

Vastunäidustused hoidmiseks

Kuna protseduuri ei teostata patsiendiga ilma keha mõjuta, vaid teadusuuringute bioloogilise materjaliga, siis ei ole PCR-i vastunäidustused võimaliku ohu puudumise tõttu.

Kuid biomaterjali tara emaka kanali emaka kanalist ei teostata pärast Colkopy protseduuri. Käsitlemise määrdumise, kraapides analüüs on lubatud alles pärast 4-6 päeva pärast menstruatsiooni lõppu ja täieliku katkestamise valiku.

Kas meetod on ohutu?

Nr mingit negatiivset mõju patsiendile isoleeritud uuring selle biomaterjalide laboratoorsetes tingimustes on võimatu.

Menetluse ettevalmistamine (bioloogiliste ainete annetamine analüüsiks)

PCR analüüsi proovina, kus avastatakse välismaalase patogeeni DNA, on olemas bioloogiline vedelik, koe, organismi eraldised. Uuritava aine tara viiakse läbi veres veres, mis võetakse veenidest, jäägid kõristidest, nina õõnsusest, ureetrakanalist, pleuraõõndest, emakakaelast.

Enne diagnostilist menetlust selgitab arst patsienti, mille tara materjali võetakse:

1. Seksinfektsioonide uurimisel valmistatakse genitaale, uriini, uriini, kusiti insult.
2. Herpetiliste infektsioonide analüüsimisel, tsütomegaloviirus, mononukleoos - võtta uriini analüüsi, määrida ZEA, hepatiidi, toksoplasmoosi - verd Viinist.
3. Erinevate liikide diagnoosimiseks võetakse tserebrospinaalvedelik.
4. Pulmonoloogias proovid analüüsimiseks - röga ja pleura vedeliku.
5. Kui on olemas uuring võimalikest emakasisene infektsioonid, kui sisenemisel lootele analüüsi, raudvett ja platsenta rakud kasutatakse.

Analüüsi täpsus ja täpsus sõltub materjali võtmisel tingimuste steriilsusest. Kuna PCR-i uuringus on kõrge tundlikkus, võib uuritava aine saastumine moonutada tulemust.

Biomateriaadi osutamise pädev ettevalmistus ei kujuta endast patsientide raskusi. On teatavaid soovitusi:

• seksinfektsioonide analüüsimisel:
  • eemaldage intiimsed kontaktid 72 tundi enne materjali;
  • lõpetage 3 päeva jooksul vaginaalsete tööriistade kasutamine;
  • eelmise päeva õhtust ärge läbige uuritud ala raames hügieeni;
  • välistada urineerimine 3-4 tundi proovide võtmisel kusiti;
• lõpetage antibiootikumide võtmine kuu enne infektsiooni katseid;
• vere antakse hommikul üle kuni söömise ja joomiseni;
• uriini esimese hommikuse osa kogumine toimub steriilses mahutis pärast hoolikat intiimset tualeti.

Selle kohta, kuidas diagnostika meetodi all polümeraasi ahelreaktsiooni viiakse läbi, loe allpool.

Kuidas protseduur on

PCR-uuringu läbiviimisel korratakse teatud tsükleid reaktoris (võimendi või termilise tsüklina):

1. Esimene samm - denaturatsioon. Sülje, vere, bioptat, günekoloogilised proovid, röga, milles esineb DNA (või RNA) patogeeni esinemist, asetatakse võimendi, kus materjal on kuumutatud ja DNA jagamine kaheks eraldi ahelaks tekib.
2. Teine samm - materjali anniilimine või väike jahutus Ja lisades praimereid, mis on võimeline tunnustama DNA molekuli soovitud alasid ja võtke nendega ühendust.
3. Kolmas samm-augustamine - tekib pärast 2 praimerite ühendamist iga DNA ahelaga. Protsessi käigus on patogeeni DNA fragment lõpule viidud ja moodustub koopia.

Neid tsükleid korratakse "ahelreaktsiooni" tüübiga, millest iga kord viib konkreetse DNA fragmendi koopiate kahekordistamise (näiteks segmendi, kus teatud viirus on programmeeritud). Mitu tundi on moodustatud paljude DNA fragmendi koopiaid ja nende esinemine tuvastatakse proovis. Pärast seda analüüsib ja võrrelda tulemusi erinevate patogeenide andmebaasi andmebaasiga, et määrata infektsiooni tüüp.

Umbes dekodeerimise tulemusi ja järeldus põhineb PCR reaktsiooni allpool.

Dekodeerimistulemused

Uuringu lõpptulemus väljastatakse 1-2 päeva jooksul pärast bioloogilise materjali läbimist. Sageli - juba esimesel päeval pärast analüüsi.

Kvalitatiivne analüüs

• Negatiivnetulemuseks tähendab, et uuringus nimetatud aines ei tuvastatud nakkuse põhjuslike ainete jäljed.
• Positiivnetulemuseks on patogeensete viiruste või bakterite avastamine bioloogilises proovis, millel on materjali kohaletoimetamise ajal väga suur täpsus.

Kui tulemus on positiivne, kuid suurenenud infektsiooni märke ei ole tuvastatud - keha seisundit nimetatakse asümptomaatilisteks "tervislike kandjateks". Kõige sagedamini täheldatakse viirushaiguste teatud koha (emakakaela kanalist, kusiti, suuõõnest) biomaterjali võtmist. Sellisel juhul ravi ei ole vaja, kuid tingimata pidev meditsiiniline vaatlus, kuna on olemas võimalus:

• viiruse paljundamine meediast ja tervete inimeste nakatumisest;
• protsessi aktiveerimine ja haiguse üleminek kroonilises vormis.

Kui vereanalüüs on positiivne, näitab see, et nakkus tabas keha ja see ei ole enam veoseisund, vaid patoloogia, mis nõuab kohest konkreetset ravi.

Kvantitatiivne analüüs

Kvantitatiivne tulemus määratleb spetsialist spetsiaalselt teatud tüüpi infektsiooni. Oma põhjal on võimalik hinnata arenguabi, haiguse etapp, mis võimaldab kiiresti määrata nõuetekohase ravi.

keskmine maksumus

Polümeraasi ahela reaktsiooni hinnad määratakse kindlaks: teadusuuringute liik, põhjusliku aine keerukus, bioloogilise materjali tarbimise raskused, analüüsi liik (kvaliteetne või kvantitatiivne), laboratooriumis hinnatase.

Teisest küljest on PCR uuringu uurimisel võimalik määrata mitu patogeeni korraga ühe tüüpi materjali tara ajal analüüsimiseks. See säästab teisi laboratoorseid analüüse.

Umbes, PCR-i analüüsimise kulud rublates:

• gonokokk, Gardnerwell, Trichomonada Vagynis - 180-st
• chlamydia tramatis - alates 190
• papilloomiviirus - 380 kuni 500
• urogenitaali biotsienoos naistel naistel (mikrofloora kvantitatiivne ja kvaliteetne hindamine) - 800-st.

Veelgi kasulikum teave PCR-uuringu kohta sisaldub video allolevas video:

Bakterite geneetika. Teave teise klassi kohta.

Polümeraasi ahelreaktsioon

Polümeraasi ahelreaktsioon on meetod, mis võimaldab analüüsitud proovis teatud DNA molekulide koguse mitmekordset suurenemist (amplifitseerimist) (kaasa arvatud bioloogilises materjalis või puhtal kultuuris).

Peamised eelised PCR diagnostilise meetodina mikrobioloogias on väga kõrge tundlikkus, mis võimaldab avastada äärmiselt väikeste patogeenide kontsentratsioone proovides ja maksu-reguleeritava spetsiifilisusega, mis võimaldab tuvastada või tuvastada patogeenide üld-, liikide või sub- taseme tase. PCR peamine puudus tuleneb selle äärmiselt suurest tundlikkusest - pildid on väga lihtne saastada DNA positiivse kontrolli, teise proovi või PCR-produkti, mis toob kaasa valepositiivse reaktsiooni. See paneb karmid piirangud tingimused, milles PCR segatakse ja töötavad valmis PCR-tooteid.

PCRi läbiviimine.Reaktsioonisegu valmistatakse järgmisi komponente:

Valitud DNA uuringust saadud proovist,

Puhvris

MG2 + ioonid (ensüümi töö jaoks vajalik), \\ t

Kaks praimerit on üheahelalised DNA molekulid (pikkus sagedamini kui 18 kuni 24 nukleotiidi), tuvastatava DNA järjestuse erinevate ahelate komplementaarsed otsad.

Deoksinukleotiptitraatide segu.

Soojusresistentne DNA polümeraasi (Taq polümeraasi kasutatakse kõige sagedamini, eraldati Termis. aquaticus.).

Seejärel asetatakse see reaktsioonisegu võimendi, mis on tegelikult programmeeritav termostaat. Võimendi korral viiakse läbi 30-40 temperatuuri nihke tsüklit. Kõik need tsüklid koosnevad kolmest etapist (vt joonis 1):

Denaturatsioon (temperatuur 94 ° C) - vesinikuahelate purunemise ja DNA ahelate lahknevad.

Lõpetamispraimerid (temperatuur on tavaliselt umbes 50-60 ° C) - praimerid on ühendatud DNA ahelate otsadega. Üldiselt, kui temperatuur väheneb, on uuritud proovi algsete DNA lähterajatiste taasühinemine energiliselt kasumlikum, kuid reaktsioonisegu praimerite kontsentratsioon reaktsioonisegus paljude suurusjärgus rohkem kui DNA kontsentratsioon Proovi (vähemalt esialgse PCR-tsüklitega), mistõttu praimeri anniilimise reaktsioon voolab kiiremini renaatration DNA. Ainestustemperatuur valitakse sõltuvalt sulamistemperatuuridest (denaturatsioon) praimeritest.

Venitus (temperatuur on tavaliselt 72 ° C) - DNA polümeraas lõpetab praimerite vastavalt pikkade DNA-ahelate maatriksile. Temperatuur vastab kasutatud DNA polümeraasi optimaalsele temperatuurini.

Tulemuste avastamine on erinevates PCR komplekti erinevates versioonides ja seda on kirjeldatud sektsioonis "PCR-sordid".

PCR kõlar

Varase PCR-tsüklites, kaheahelalise DNA molekulide arv, mille suurus määratakse kruntide vahelise vahemaaga iga tsükliga kahekordistub. Samuti moodustub väike arv pikemaid DNA molekule, mida saab tähelepanuta jätta (vt joonis 2).

Seega, varajase tsüklites kirjeldatakse PCR-produkti kogust M * 2 N valemiga, kus m on proovi esialgne arv proovis, n on tsüklite arv. Siis reaktsioon läheb platoo. See on tingitud reaktsioonisaakuduse kogunemisest, redutseerides praimerite ja deoksünukleotidrifosfaatide kontsentratsiooni ning suurendades pürofosfaadi kontsentratsiooni (vt joonis fig 3).

PCR-sordid

Konventsioon PCR

Selles teostuses esineb PCR reaktsiooni etteantud arvu tsüklite arv (30-40), mille järel analüüsitakse, kas topelt-ahelaga DNA molekulide kogunemine toimus reaktsioonisegus.

See variant PCR preparaatide kasutamisel diagnostikameetodiks on kvalitatiivne meetod. Positiivne reaktsioon näitab vähemalt mikroproovimolekulide vähemalt jälgi koguste olemasolu. Negatiivne reaktsioon näitab nende puudumist. Kvantitatiivne hindamine sisu algse DNA molekulide proovis on võimatu tõttu reaktsioon platoo.

Produkti olemasolu tuvastamise peamine meetod on agaroos või polüakrüülamiidi geelis elektroforeesi. PCR-produktid jagunevad geelina elektrivälja tegevuse all vastavalt nende molekulmassile. Geelile lisatakse interkaleeriv värv (fluorestseerumine kaheahelalise DNA-ga seotud seisundiga - kõige sagedamini broomi etidium). Seega, kui ultraviolettkihi kiiritatakse, on võimalik näha vajaliku molekulmassi DNA-d vastava riba olemasolu või puudumist. PCR-i diagnostiliste eesmärkide läbiviimisel pannakse reaktsiooni positiivne ja negatiivne kontroll alati, mille võrreldakse proove (vt joonis 4).

PCR reaalajas

Selles teostuses esineb PCR PCR-produkti kogus reaktsioonisegus pidevalt reaktsiooni voolu ajal. See võimaldab meil konstrueerida reaktsioonikõvera (vt joonis 3) ja selle põhjal arvutada soovitud DNA molekulide arv proovides.

Üks tüüpi PCR reaalajas - kasutades interkalaterjali, mis lisatakse otse reaktsioonisegu (Sybrreeni kasutatakse kõige sagedamini). Teine tüüp - kasutades ühte fluorestsentsskulude tüüpe, mis seonduvad PCR-produkti sektsiooniga, mis võimaldab tuvastamise spetsiifilisust suurendada (vt joonis 5). Voolufluorestsents esineb otseselt instrumendis reaktsiooni voolu ajal vahendis. .

Lisaks kvantitatiivse avastamise võimalusele on reaalajas PCR-i sarnased eelised võrreldes tavapärase aja jooksul. See PCR versioon on lihtsam, kiire ja ei nõua ka PCR-toodetega torude avastamist, mis vähendab teiste proovide saastumise tõenäosust. Peamine puudus on võimeline võimendi suurem väärtus fluorestsentsi avastamise integreeritud võimalusega võrreldes tavalisega.

Digitaalne kvantitatiivne PCR

Uus, kallis ja seni väikese leviku versioon PCR, mis võimaldab teil täpsemalt kindlaks määrata DNA kogus proovis. Selles teostuses on fluorestsentsvärvi sisaldav reaktsioonisegu jagatud suure hulga mikroskoopiliste mahtude hulka (Näiteks emulsiooni tilgad). Pärast PCR-voolust analüüsiti, millises osatsillatsüklites oli reaktsioon positiivne ja seetõttu täheldatakse fluorestsentsi. See osa on proportsionaalne proovis soovitud DNA molekulide arvuga.

PCR tagurpidi transkriptsiooniga

Sel juhul enne konkreetse variandi PCR-i, pöördtranskriptsiooni (RNA DNA-s) viiakse läbi Reverterase ensüümi abil. Seega võimaldab see meetod juhtida RNA molekulide kvaliteetset või kvantitatiivset tuvastamist. Seda saab kasutada RNA-ga sisaldavate viiruste avastamiseks või geeni või teise arvu transkriptsiooni taseme määramiseks.

Pilt 1. PCR-i etapid. Punane värviga tähistatud praimerid.

Joonis 2.Topelt-ahelaga DNA molekulide kogunemine piiratud praimerite poolt PCR ajal.

Joonis 3.PCR-reaktsiooni dünaamika soovitud DNA molekulide erinevates esialgses kontsentratsioonis proovis. a) - kõrgeim kontsentratsioon (b) - vahepealne kontsentratsioon (b) - väikseim kontsentratsioon

Joonis 4.PCR-toodete agaromic elektroforees. K + - positiivne kontroll (Snoral DNA on olemas). 1-7 - Uuritud proovid (millest 1-2 on positiivsed, 3-7 on negatiivsed). K - Negatiivne kontroll (soovitud DNA on ilmselgelt puudu). Paljudel juhtudel on lisaks sihttoodetele kergemad mittespetsiifilised reaktsioonisaadused nähtavad (praimeri dimeerid).

Joonis 5.Avastamise meetodid reaalajas PCR kasutamisel. a) - desacatiivsed värvid - fluorestsendid seondumisel kaheahelalise DNA-ga (B) - Taqman - fluorestsentsi sondiga seondumisel tekib siis, kui polümeraasi DNA sond on lõhustamine 5'-3 'endonukleaasi aktiivsusega fluorofoori ja hävitamise tõttu. (C) - molecularbeacon - fluorestsents sond tekib siis, kui sondi hübridiseerimine sihtfragmendiga fluorofoori ja ammendumise (g) ruumilise kauguse tõttu (g) \u200b\u200b- sondid Lightcycler - aktseptori fluorestsents esineb sondide hübridiseerimisel (aktseptorit sisaldavad aktseptorid) ja doonor) koos sihtfragmendiga resonantse fluorestsentsi energiaülekande (fret) tõttu.