تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

جوهر طريقة PCR. بوليميريز الحمض النووي

تفاعل البلمرة المتسلسل هو طريقة تجريبية للبيولوجيا الجزيئية تسمح بزيادة كبيرة في التركيزات الصغيرة لبعض أجزاء الحمض النووي في المواد البيولوجية. تسمى هذه العملية لزيادة عدد نسخ الحمض النووي تضخيم... يتم إجراء نسخ الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة إنزيم خاص - بوليميراز.بوليميراز الحمض النووي (الشكل 3) هو إنزيم يشارك في تكرار الحمض النووي (تضخيم الحمض النووي في الكائنات الحية). تحفز إنزيمات هذه الفئة بلمرة ديوكسي ريبونوكليوتيدات على طول سلسلة نيوكليوتيدات الحمض النووي ، والتي "يقرأها" الإنزيم ويستخدمها كقالب. يتم تحديد نوع النيوكليوتيدات الجديدة من خلال مبدأ التكامل مع القالب الذي يُقرأ منه.

يضيف بوليميراز الدنا نيوكليوتيدات مجانية إلى الطرف 3 بوصات من الخيط المُجمَّع. وهذا يؤدي إلى استطالة الخيط في اتجاه 5 "-3". لا يمكن لأي من بوليمرات الدنا المعروفة أن تخلق خيطًا من الصفر: يمكنها فقط إضافة النيوكليوتيدات مجموعة 3 "هيدروكسيل موجودة بالفعل. لهذا السبب ، يحتاج DNA polymerase التمهيدي- تسلسل قصير من النيوكليوتيدات (عادة 20-25) ، مكمل لنهايات الجين قيد الدراسة - والتي يمكن أن تضيف إليها أول نيوكليوتيدات. تتكون البادئات دائمًا من قواعد DNA و RNA ، بينما تكون القاعدتان الأوليان دائمًا قواعد RNA. يتم تصنيع مواد التمهيدي بواسطة إنزيم آخر - بريمازوي... إنزيم آخر - هيليكس- ضروري لفك الحلزون المزدوج للحمض النووي بتكوين هيكل أحادي السلسلة ، مما يضمن تكرار كلا الخيطين وفقًا لنموذج تكرار الحمض النووي شبه المحفوظ.

تمتلك بعض بوليميرات الدنا أيضًا القدرة على تصحيح الأخطاء في خيط الدنا المُجمَّع حديثًا. إذا تم الكشف عن زوج غير صحيح من النيوكليوتيدات ، فإن بوليميريز الحمض النووي يتراجع خطوة واحدة ، ويستبعد النيوكليوتيدات غير الصحيحة من السلسلة ، ثم يُدخل النيوكليوتيد الصحيح في مكانه ، وبعد ذلك يستمر النسخ المتماثل كالمعتاد.

PCR

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو طريقة تضخيم الحمض النووي التي تسمح لك بعزل ومضاعفة تسلسل DNA معين بلايين المرات في غضون ساعات قليلة. إن إمكانية الحصول على عدد كبير من نسخ منطقة محددة بدقة من الجينوم يبسط إلى حد كبير دراسة عينة الحمض النووي المتاحة.

لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، يجب استيفاء عدد من الشروط. لتنفيذ PCR في أبسط الحالات ، تكون المكونات التالية مطلوبة:

قالب الحمض النووي الذي يحتوي على جزء من الحمض النووي الذي تريد تضخيمه.

اثنان من البادئات مكملان لنهايات الجزء المطلوب. (زوج من قليل النوكليوتيدات المُصنَّع صناعياً ، عادة ما يكون حجمه من 15 إلى 30 نقطة أساس ، مطابق للمناطق المقابلة من الحمض النووي الهدف. ويلعبان دورًا رئيسيًا في تكوين منتجات تفاعل التضخيم. توفر البادئات المختارة بشكل صحيح خصوصية وحساسية نظام اختبار.)

بوليميراز الحمض النووي بالحرارة. يجب أن يظل البوليميراز المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل نشطًا في درجات حرارة عالية لفترة طويلة ، لذلك يتم استخدام الإنزيمات المعزولة من الحرارة - Thermus aquaticus (Taq polymerase) وغيرها.

ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dATP ، dGTP ، dCTP ، dTTP).

Mg 2+ أيونات المطلوبة حتى يعمل البوليميراز.

يوفر محلول عازلة ظروف التفاعل اللازمة - درجة الحموضة ، القوة الأيونية للمحلول. يحتوي على أملاح ، مصل الألبومين.

لتجنب تبخر خليط التفاعل ، يضاف زيت عالي الغليان ، على سبيل المثال ، الفازلين ، إلى أنبوب الاختبار. إذا كنت تستخدم جهازًا بغطاء ساخن ، فهذا ليس ضروريًا.

يمكن أن تؤدي إضافة بيروفوسفاتيز إلى زيادة محصول تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يحفز هذا الإنزيم التحلل المائي للبيروفوسفات ، وهو منتج ثانوي لإضافة النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات إلى سلسلة الحمض النووي المتنامية ، إلى الأورثوفوسفات. يمكن أن يثبط بيروفوسفات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

لمضاعفة عدد نسخ الحمض النووي الأصلي ، يلزم إجراء تفاعل دوري. عادةً ما تتكون كل دورة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة من ثلاث مراحل:

1... تمسخ أو "ذوبان" الحمض النووي.يتم تسخين قالب DNA مزدوج الشريطة إلى 94-96 درجة مئوية (أو حتى 98 درجة مئوية ، إذا تم استخدام بوليميراز قابل للحرارة بشكل خاص) لمدة 0.5 - 2 دقيقة للسماح بفصل خيوط الحمض النووي. تسمى هذه المرحلة تمسخ ، حيث يتم تدمير الروابط الهيدروجينية بين خيوط الحمض النووي. في بعض الأحيان ، قبل الدورة الأولى (قبل إضافة البوليميراز) ، يتم تسخين خليط التفاعل مسبقًا لمدة 2-5 دقائق لإفساد القالب والبادئات تمامًا. هذه التقنية تسمى بداية ساخنة، فإنه يسمح بتقليل كمية منتجات التفاعل غير المحددة.

2. التلدين - ربط المواد الأولية بقالب الحمض النووي... عندما تتباعد السلاسل ، يتم خفض درجة الحرارة ببطء بحيث يمكن للباريمر الارتباط بالمصفوفة أحادية الجديلة. تعتمد درجة حرارة التلدين على تركيبة البادئات وعادة ما يتم اختيارها 50-65 درجة مئوية. وقت المرحلة - 20-60 ثانية. يؤدي الاختيار الخاطئ لدرجة حرارة التلدين إما إلى ارتباط ضعيف للبادئات بالمصفوفة (عند درجة حرارة مرتفعة) ، أو إلى الارتباط في المكان الخطأ وظهور منتجات غير محددة (عند درجة حرارة أقل من الواقع).

3. نتيجة الجمع بين الطريحة والنقيضة (استطالة السلسلة).يقوم بوليميراز الدنا بتكرار خيط القالب باستخدام مادة أولية على أنها "بذرة". يبدأ البوليميراز في تخليق الشريط الثاني من الطرف 3 'من التمهيدي ، والذي يرتبط بالقالب ويتحرك على طول القالب. وتعتمد درجة حرارة الاستطالة على البوليميراز. تكون بوليميراز Taq و Pfu الأكثر نشاطًا عند 72 درجة ج- يعتمد وقت التوليف على نوع بوليميريز الحمض النووي وطول الجزء المراد تضخيمه عادةً ، يتم أخذ وقت الاستطالة مساوياً لدقيقة واحدة لكل ألف زوج قاعدي.بعد نهاية كل الدورات ، غالبًا ما تكون الخطوة الإضافية تم تنفيذها استطالة نهائيةلإكمال جميع الأجزاء التي تقطعت بهم السبل. تستمر هذه المرحلة من 7 إلى 10 دقائق.

بعد ذلك ، تتكرر مراحل التمسخ والصلب والاستطالة عدة مرات (30 مرة أو أكثر). في كل دورة ، يتضاعف عدد النسخ المركبة من جزء الحمض النووي.

يتم إجراء جميع التفاعلات في أنابيب اختبار مغمورة في منظم حرارة. يتم تغيير نظام درجة الحرارة وصيانته تلقائيًا.

لفهم كيفية حدوث تضخيم جزء معين من الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، من الضروري أن نتخيل بوضوح موضع جميع البادئات وتسلسلاتها التكميلية في الخيوط المضخمة في كل جولة. في الجولة الأولى ، يكون كل من الخيوط المصنعة حديثًا أطول بكثير من المسافة من مجموعة 3'-hydroxyl من مادة التمهيدي إلى النيوكليوتيد النهائي للتسلسل التكميلي للطلاء التمهيدي الثاني. تسمى هذه الخيوط "القوالب الطويلة" ، سيتم استخدامها لمزيد من التوليف.

في الجولة الثانية ، يتم تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يتكون من خيوط متشابهة ومُصنَّعة حديثًا (قالب طويل) مرة أخرى ثم يتم تلدينها باستخدام مواد أولية. خلال عملية التركيب في هذه الجولة ، يتم تصنيع "القوالب الطويلة" مرة أخرى ، بالإضافة إلى عدد من الخيوط مع مادة أولية في أحد طرفيها وبتسلسل مكمل للبادئ الثاني في الطرف الآخر ("القوالب القصيرة"). خلال الجولة الثالثة ، يتم تغيير طبيعة جميع التكوينات غير المتجانسة التي تم تكوينها مسبقًا وتصلبها باستخدام مواد أولية ، ثم يتم تكرارها. في الجولات اللاحقة ، يصبح عدد "المصفوفات القصيرة" أكثر فأكثر ، وبحلول الجولة الثلاثين يتجاوز عددها بالفعل عدد السلاسل الأصلية أو "المصفوفات الطويلة" بمقدار 10 6 مرات.

تزداد كمية منتج تفاعل معين (مقيَّد بالبادئات) نظريًا بما يتناسب مع 2 ن ، حيث n هو عدد دورات التفاعل. في الواقع قد تكون كفاءة كل دورة أقل من 100٪ ، لذلك في الواقع:

حيث P هي كمية المنتج ، E هي متوسط ​​كفاءة الدورة.

عدد نسخ الحمض النووي "الطويلة" ينمو أيضًا ، ولكن بشكل خطي ؛ لذلك ، يهيمن جزء معين في نواتج التفاعل. إن نمو المنتج المطلوب مقيد بشكل كبير بكمية الكواشف ووجود المثبطات وتشكيل المنتجات الثانوية.

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل طريقة حساسة للغاية ، لذلك ، إذا كان هناك حتى كمية ضئيلة من الحمض النووي في عينة الاختبار ، والتي تنتقل عن طريق الخطأ من خليط تفاعل إلى آخر ، فيمكن الحصول على نتائج إيجابية خاطئة. هذا يجعل من الضروري مراقبة جميع الحلول والأواني المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل بعناية.

المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي.

عند إنشاء نظام اختبار PCR ، تتمثل إحدى المهام الرئيسية في الاختيار الصحيح للبادئات ، والتي يجب أن تفي بعدد من المعايير:

1. يجب أن تكون البرايمرات محددة. يتم إيلاء اهتمام خاص للنهايات الثلاثة للبادئات ، لأنها تبدأ في تكوين خيوط الدنا التكميلية Taq-polymerase. إذا كانت خصوصيتها غير كافية ، فمن المحتمل أن تحدث عمليات غير مرغوب فيها في أنبوب الاختبار مع خليط التفاعل ، أي تخليق الحمض النووي غير النوعي (شظايا قصيرة أو طويلة). يكون مرئيًا على الرحلان الكهربائي في شكل نطاقات إضافية ثقيلة أو خفيفة. وهذا يتداخل مع تقييم نتائج التفاعل ، لأنه من السهل الخلط منتج تضخيم محدد مع دنا دخيل مركب إلى فقدان كبير للحساسية.

2. لا ينبغي أن تشكل مواد التمهيدي ثنايات وحلقات ؛ لا ينبغي تشكيل سلاسل مزدوجة مستقرة نتيجة لصلب الاشعال لنفسها أو لبعضها البعض.

مما يسمح لك باكتشاف الكميات الصغيرة في المادة البيولوجية ، وبشكل أكثر دقة ، من شظايا معينة منها ، ومضاعفتها عدة مرات. ثم يتم التعرف عليها بصريًا بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. تم تطوير التفاعل في عام 1983 بواسطة K.Mullis وهو مدرج في قائمة الاكتشافات البارزة في السنوات الأخيرة.

ما هي آليات تفاعل البوليميراز المتسلسل

تعتمد التقنية بأكملها على قدرة الأحماض النووية على التكاثر بشكل مستقل ، والذي يتم في هذه الحالة بشكل مصطنع في المختبر. لا يمكن أن يبدأ تكاثر الحمض النووي في أي منطقة من الجزيء ، ولكن فقط في المناطق التي بها تسلسل معين من النيوكليوتيدات - شظايا البداية. من أجل بدء تفاعل البلمرة المتسلسل ، هناك حاجة إلى مواد أولية (أو مجسات DNA). هذه أجزاء قصيرة من سلسلة DNA ذات تسلسل نيوكليوتيد معين. إنها مكملة (أي مقابلة) لمواقع البداية

بالطبع ، من أجل إنشاء مواد أولية ، يجب على العلماء دراسة تسلسل النوكليوتيدات لتلك المستخدمة في هذه التقنية. إن تحقيقات الحمض النووي هذه هي التي توفر خصوصية التفاعل وبدءه. لن تعمل إذا كانت العينة لا تحتوي على الأقل على جزيء واحد من الحمض النووي المطلوب. بشكل عام ، يتطلب التفاعل المواد الأولية المذكورة أعلاه ، ومجموعة من النيوكليوتيدات ، وبوليميراز DNA المقاوم للحرارة. هذا الأخير هو إنزيم - محفز لتخليق جزيئات الحمض النووي الجديدة بناءً على عينة. يتم دمج كل هذه المواد ، بما في ذلك المواد البيولوجية التي سيتم اكتشاف الحمض النووي فيها ، في خليط تفاعل (محلول). يتم وضعه في منظم حرارة خاص يسخن ويبرد بسرعة كبيرة في وقت معين - دورة. عادة ما يكون هناك 30-50 منهم.

كيف يذهب رد الفعل هذا؟

جوهرها هو أنه خلال دورة واحدة ، يتم ربط الاشعال بالأقسام المرغوبة من الحمض النووي ، وبعد ذلك يتم تكرارها تحت تأثير إنزيم. على أساس خيوط الحمض النووي الناتجة ، يتم تصنيع أجزاء متطابقة جديدة وجديدة من الجزيء في دورات لاحقة.

يستمر تفاعل البلمرة المتسلسل بالتتابع ، وتتميز المراحل التالية. الأول يتميز بمضاعفة كمية المنتج خلال كل دورة تسخين وتبريد. في المرحلة الثانية ، يتباطأ التفاعل ، حيث يتلف الإنزيم ويفقد النشاط أيضًا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استنفاد احتياطيات النيوكليوتيدات والبادئات. في المرحلة الأخيرة - مرحلة الاستقرار - لم تعد المنتجات تتراكم ، حيث نفدت الكواشف.

أين يتم استخدامه

مما لا شك فيه أن أوسع تطبيق لتفاعل البوليميراز المتسلسل يكون في الطب والعلوم. يتم استخدامه في علم الأحياء العام والخاص والطب البيطري والصيدلة وحتى علم البيئة. علاوة على ذلك ، في الأخير ، يتم ذلك لتتبع جودة الطعام والأشياء في البيئة الخارجية. يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل بنشاط في ممارسة الطب الشرعي لتأكيد الأبوة وتحديد شخصية الشخص. في الفحص الطبي الشرعي ، وكذلك في علم الحفريات ، غالبًا ما تكون هذه التقنية هي السبيل الوحيد للخروج ، حيث تتوفر عادةً كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي للبحث. بالطبع ، وجدت هذه الطريقة تطبيقًا واسعًا جدًا في الطب العملي. هناك حاجة في مجالات مثل علم الوراثة والأمراض المعدية والأورام.

ومع ذلك ، في ذلك الوقت ظلت هذه الفكرة مجهولة. تم اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل في 1983 بواسطة كاري ماليس. كان هدفه هو إنشاء طريقة تسمح بتضخيم الحمض النووي في سياق تكرار مضاعفات متتابعة لجزيء الحمض النووي الأصلي باستخدام إنزيم بوليميريز الحمض النووي. بعد 7 سنوات من نشر هذه الفكرة ، في عام 1993 ، حصل موليس على جائزة نوبل.

في بداية استخدام الطريقة ، بعد كل دورة تسخين - تبريد ، كان من الضروري إضافة بوليميريز DNA إلى خليط التفاعل ، حيث تم تعطيله بسرعة عند درجة الحرارة العالية المطلوبة لفصل خيوط حلزون DNA. كان الإجراء غير فعال للغاية وتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. في عام 1986 تم تحسينه بشكل ملحوظ. تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. تم العثور على هذه الإنزيمات لتكون مستقرة حرارياً وكانت قادرة على تحمل دورات تفاعل متعددة. جعل استخدامها من الممكن تبسيط وأتمتة PCR. تم عزل واحدة من أولى بلمرات الحمض النووي المقاومة للحرارة من البكتيريا ثيرموس أكواتيكوسواسمه طق- بوليميراز. عيب هذا البوليميراز هو أن احتمال إدخال نيوكليوتيد خاطئ فيه مرتفع للغاية ، لأن هذا الإنزيم يفتقر إلى آليات تصحيح الخطأ (3 "→ 5" نشاط نوكلياز خارجي). بوليميراز Pfuو Pwoمعزولة عن العتائق تمتلك مثل هذه الآلية ، فإن استخدامها يقلل بشكل كبير من عدد الطفرات في الحمض النووي ، لكن سرعة عملهم (المعالجة) أقل من سرعة طق... تستخدم الآن الخلطات طقو Pfuلتحقيق كل من سرعة البلمرة العالية ودقة النسخ العالية.

في وقت اختراع الطريقة ، عمل ماليس لصالح شركة Cetus ، التي حصلت على براءة اختراع طريقة PCR. في عام 1992 ، باع Cetus حقوق الطريقة وبراءة الاختراع للاستخدام طق- بوليميراز من شركة هوفمان لاروش بمبلغ 300 مليون دولار. ومع ذلك ، اتضح أن طق- تم تمييز البوليميراز من قبل عالم الكيمياء الحيوية الروسي أليكسي كالدين في عام 1980 ، حيث حاولت شركة Promega (Promega) إجبار شركة Roche في المحكمة على التنازل عن حقوقها الحصرية لهذا الإنزيم. انتهت صلاحية براءة الاختراع الأمريكية لطريقة PCR في مارس 2005.

PCR

تعتمد الطريقة على النسخ الانتقائي المتعدد لمنطقة DNA معينة باستخدام الإنزيمات في ظل ظروف اصطناعية ( في المختبر). في هذه الحالة ، يتم نسخ القسم الذي يفي بالشروط المحددة فقط ، وفقط إذا كان موجودًا في العينة قيد الدراسة. على عكس تضخيم الحمض النووي في الكائنات الحية (النسخ المتماثل) ، يتم تضخيم مقاطع قصيرة نسبيًا من الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. في عملية PCR التقليدية ، لا يزيد طول مناطق الحمض النووي المنسوخة عن 3000 زوج قاعدي (3 كيلو بايت). باستخدام مزيج من البوليمرات المختلفة ، باستخدام المواد المضافة وتحت ظروف معينة ، يمكن أن يصل طول جزء PCR إلى 20-40 ألف زوج قاعدي. لا يزال هذا أقل بكثير من طول الحمض النووي الصبغي للخلية حقيقية النواة. على سبيل المثال ، يتكون الجينوم البشري من حوالي 3 مليارات زوج قاعدي.

مكونات التفاعل

لتنفيذ PCR في أبسط الحالات ، تكون المكونات التالية مطلوبة:

• مصفوفة الحمض النوويتحتوي على جزء من الحمض النووي الذي تريد تضخيمه.
• اثنين من الاشعالمكمل للنهايات المتقابلة من خيوط مختلفة من جزء الحمض النووي المطلوب.
• ثابت حراريا بوليميريز الحمض النووي- إنزيم يحفز تفاعل بلمرة الحمض النووي. يجب أن يحتفظ البوليميراز المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنشاط عند درجة حرارة عالية لفترة طويلة ، لذلك يتم استخدام الإنزيمات المعزولة من الحرارة - ثيرموس أكواتيكوس(طق بوليميراز) ، Pyrococcus furiosus(Pfu بوليميريز) ، Pyrococcus woesei(Pwo-polymerase) وغيرها.
• ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات(dATP ، dGTP ، dCTP ، dTTP).
• Mg 2+ أيونات المطلوبة حتى يعمل البوليميراز.
• محلول منظمتوفير ظروف التفاعل اللازمة - درجة الحموضة ، القوة الأيونية للمحلول. يحتوي على أملاح وألبومين مصل بقري.

لتجنب تبخر خليط التفاعل ، يضاف زيت عالي الغليان ، على سبيل المثال ، الفازلين ، إلى أنبوب الاختبار. هذا غير مطلوب في حالة استخدام جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن.

يمكن أن تؤدي إضافة بيروفوسفاتيز إلى زيادة محصول تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يحفز هذا الإنزيم التحلل المائي للبيروفوسفات ، وهو منتج ثانوي لإضافة النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات إلى سلسلة الحمض النووي المتنامية ، إلى الأورثوفوسفات. يمكن أن يثبط بيروفوسفات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الاشعال

تعتمد خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل على تكوين مجمعات تكميلية بين القالب والبادئات ، وقواعد قليلة النوكليوتيدات الاصطناعية القصيرة 18-30 في الطول. كل من البادئات مكمل لأحد خيوط القالب المزدوج الشريطة ويحدد بداية ونهاية المنطقة المضخمة.

بعد تهجين القالب مع التمهيدي (التلدين) ، يعمل الأخير كطريقة تمهيدي لبوليميراز الحمض النووي في تخليق الشريط التكميلي للقالب (انظر).

أهم ما يميز البادئات هو درجة حرارة الانصهار (T · m) لمركب قالب التمهيدي. T m هي درجة الحرارة التي يتشكل عندها نصف قوالب الحمض النووي معقدًا باستخدام مادة قليلة النوكليوتيد التمهيدي. يمكن تحديد نقطة الانصهار تقريبًا بواسطة الصيغة ، حيث n X هو عدد النيوكليوتيدات X في التمهيدي. في حالة الاختيار غير الصحيح لطول وتكوين النيوكليوتيدات في التمهيدي أو درجة حرارة التلدين ، يمكن تكوين مجمعات مكملة جزئيًا مع مناطق أخرى من قالب DNA ، مما قد يؤدي إلى ظهور منتجات غير محددة. يقتصر الحد الأعلى لنقطة الانصهار على درجة الحرارة المثلى لعمل البوليميراز ، الذي ينخفض ​​نشاطه عند درجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية.

عند اختيار البرايمر ، يُنصح بالالتزام بالمعايير التالية:

المضخم

أرز. 1: مكبر للصوت ل PCR

يتم تنفيذ PCR في مكبر للصوت - جهاز يوفر التبريد والتسخين الدوريين للأنابيب ، عادةً بدقة لا تقل عن 0.1 درجة مئوية. تسمح لك مكبرات الصوت الحديثة بتعيين برامج معقدة ، بما في ذلك إمكانية "البدء السريع" ، Touchdown PCR (انظر أدناه) والتخزين اللاحق للجزيئات المضخمة عند 4 درجات مئوية. بالنسبة إلى PCR في الوقت الفعلي ، يتم إنتاج أجهزة مزودة بكاشف الفلورسنت. هناك أيضًا أدوات مزودة بغطاء أوتوماتيكي وحجرة صفيحة دقيقة للاندماج في الأنظمة الآلية.

تقدم رد الفعل

صورة جل يحتوي على علامة DNA (1) ومنتجات تفاعل PCR (2،3). توضح الأرقام طول شظايا الحمض النووي في أزواج النيوكليوتيدات

عادة ، عند تنفيذ PCR ، يتم تنفيذ 20-35 دورة ، كل منها تتكون من ثلاث مراحل (الشكل 2).

تمسخ

يتم تسخين قالب DNA مزدوج الشريطة إلى 94-96 درجة مئوية (أو 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليميريز خاص بالحرارة) لمدة 0.5-2 دقيقة للسماح بفصل خيوط الحمض النووي. هذه المرحلة تسمى تمسخ، حيث يتم تدمير الروابط الهيدروجينية بين شريطين من الحمض النووي. في بعض الأحيان ، قبل الدورة الأولى (قبل إضافة البوليميراز) ، يتم تسخين خليط التفاعل مسبقًا لمدة 2-5 دقائق. للتمسخ الكامل للقالب والبرايمر. هذه التقنية تسمى بداية ساخنة، فإنه يسمح بتقليل كمية منتجات التفاعل غير المحددة.

التلدين

عندما تتشتت الخيوط ، تنخفض درجة الحرارة بحيث يمكن ربط الاشعال بالقالب المفرد الذي تقطعت به السبل. هذه المرحلة تسمى التلدين... تعتمد درجة حرارة التلدين على تكوين البادئات وعادة ما يتم اختيارها 4-5 درجات مئوية تحت درجة انصهارها. وقت المرحلة - 0.5-2 دقيقة. يؤدي الاختيار الخاطئ لدرجة حرارة التلدين إما إلى ضعف ارتباط البادئات بالقالب (عند درجات حرارة عالية) ، أو إلى الارتباط في المكان الخطأ وظهور منتجات غير محددة (عند درجات حرارة منخفضة).

استطالة

أصناف PCR

• تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (Nested PCR) - يستخدم لتقليل عدد المنتجات الثانوية للتفاعل. يتم استخدام زوجين من البادئات ويتم إجراء تفاعلين متتاليين. يقوم زوج ثان من البادئات بتضخيم امتداد الحمض النووي داخل ناتج التفاعل الأول.
• PCR "معكوس" (Inverse PCR (eng.)) - يستخدم في حالة معرفة جزء صغير فقط من التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما تحتاج إلى تحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم. لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل المقلوب ، يتم إجراء سلسلة من قطع الحمض النووي باستخدام إنزيمات تقييدية ، متبوعة بضم الأجزاء (الربط). نتيجة لذلك ، تظهر الأجزاء المعروفة على طرفي المنطقة غير المعروفة ، وبعد ذلك يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كالمعتاد.
• يستخدم النسخ العكسي PCR (RT-PCR) لتضخيم أو عزل أو تحديد تسلسل معروف من مكتبة RNA. قبل PCR التقليدي ، يتم تصنيع جزيء DNA أحادي الخيط على قالب mRNA باستخدام النسخ العكسي ويتم الحصول على cDNA أحادي الجديلة ، والذي يستخدم كقالب لـ PCR. غالبًا ما تُستخدم هذه الطريقة لتحديد مكان وزمن التعبير عن هذه الجينات.
• تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل (روس. PCR غير متماثل) - يتم إجراؤه عندما يكون من الضروري تضخيم أحد خيوط الحمض النووي الأصلي بشكل أساسي. تستخدم في بعض تقنيات تحليل التسلسل والتهجين. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كالمعتاد ، باستثناء أن أحد البادئات يؤخذ بكمية كبيرة.
• يستخدم PCR الكمي (Q-PCR) لقياس كمية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي في العينة بسرعة.
• PCR في الوقت الحقيقي الكمي - تستخدم هذه الطريقة الكواشف ذات العلامات الفلورية لقياس كمية منتج التفاعل بدقة أثناء تراكمه.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - بهذه الطريقة ، يتم تقليل تأثير الارتباط التمهيدي غير المحدد على تكوين المنتج. يتم تنفيذ الدورات الأولى عند درجة حرارة أعلى من درجة حرارة التلدين ، ثم تنخفض درجة الحرارة كل عدة دورات. عند درجة حرارة معينة ، سيمر النظام عبر نطاق الخصوصية المثلى للبادئات الخاصة بالحمض النووي.
• طريقة المستعمرة الجزيئية (جل PCR) بولوني - مستعمرة PCR) - يتم بلمرة هلام الأكريلاميد مع جميع مكونات PCR على السطح ويتم تنفيذ PCR. عند النقاط التي تحتوي على الحمض النووي الذي تم تحليله ، يحدث التضخيم مع تكوين المستعمرات الجزيئية.
• PCR مع التضخيم السريع لنهايات (كدنا) (روس. ينتهي التضخيم السريع لـ (كدنا) ، RACE-PCR )
• جزء طويل PCR (روس. بعيد المدى PCR) - تعديل PCR لتضخيم مناطق DNA الممتدة (10 آلاف قاعدة وأكثر). يتم استخدام نوعين من البوليميراز ، أحدهما هو بوليميراز Taq مع معالجة عالية (أي قادر على تصنيع سلسلة DNA طويلة في مسار واحد) ، والثاني هو DNA polymerase مع نشاط نوكلياز داخلي 3 "-5". هناك حاجة إلى البوليميراز الثاني لتصحيح الأخطاء التي أدخلتها الأولى.
• RAPD PCR (هندسة. التضخيم العشوائي لـ DNA PCR متعدد الأشكال ، PCR مع التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال - يستخدم عندما يكون من الضروري تمييز الكائنات الحية القريبة في التسلسل الجيني ، على سبيل المثال ، أنواع مختلفة من النباتات المزروعة أو سلالات الكلاب أو الكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة الوثيقة. تستخدم هذه الطريقة عادةً أساسًا صغيرًا واحدًا (20-25 زوجًا أساسيًا). سيكون هذا التمهيدي مكملًا جزئيًا لمناطق DNA العشوائية للكائنات المدروسة. من خلال اختيار الشروط (طول التمهيدي ، التركيب ، درجة الحرارة ، إلخ) ، من الممكن تحقيق اختلاف مرضٍ في نمط تفاعل البوليميراز المتسلسل لكائنين.

إذا كان تسلسل النوكليوتيدات للقالب معروفًا جزئيًا أو غير معروف على الإطلاق ، فيمكنك استخدامه الاشعال المنحلة، تسلسل يحتوي على مواقف متدهورة يمكن أن توجد فيها أي قواعد. على سبيل المثال ، قد يكون تسلسل التمهيدي: ... ATH ... ، حيث H هي A ، T ، أو C.

تطبيق PCR

يستخدم PCR في العديد من المجالات للتحليل والتجارب العلمية.

التحاليل الجنائية

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمقارنة ما يسمى "بصمات الأصابع الجينية". مطلوب عينة من المادة الجينية من مسرح الجريمة - دم ، لعاب ، سائل منوي ، شعر ، إلخ. تتم مقارنتها مع المادة الوراثية للمتهم. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي تكفي نظريًا - نسخة واحدة. ينقسم الحمض النووي إلى أجزاء ، ثم يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء باستخدام الرحلان الكهربائي للحمض النووي. تسمى الصورة الناتجة لموقع نطاقات الحمض النووي البصمة الجينية(م. البصمة الجينية).

إثبات الأبوة

أرز. 3: نتائج الرحلان الكهربائي لشظايا الحمض النووي التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. (1) الأب. (2) طفل. (3) الأم. ورث الطفل بعض خصائص البصمة الجينية لكلا الوالدين ، مما أعطى بصمة جديدة وفريدة من نوعها.

على الرغم من أن "البصمات الجينية" فريدة من نوعها (باستثناء حالة التوائم المتماثلة) ، إلا أنه لا يزال من الممكن إثبات الروابط الأسرية من خلال عمل العديد من هذه البصمات (الشكل 3). يمكن تطبيق نفس الطريقة ، مع تعديل طفيف ، لتأسيس القرابة التطورية بين الكائنات الحية.

التشخيصات الطبية

يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تسريع تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية وتسهيله بشكل كبير. يتم تضخيم الجين المطلوب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المناسبة ثم تسلسلها لاكتشاف الطفرات. يمكن الكشف عن الالتهابات الفيروسية مباشرة بعد الإصابة ، قبل أسابيع أو أشهر من ظهور أعراض المرض.

طب شخصي

من المعروف أن معظم الأدوية لا تصلح لجميع المرضى الذين تستهدفهم ، ولكن فقط 30-70٪ من عددهم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأدوية تكون سامة أو مسببة للحساسية لبعض المرضى. تعود أسباب ذلك جزئيًا إلى الفروق الفردية في القابلية للتأثر بالأدوية ومشتقاتها واستقلابها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الجيني. على سبيل المثال ، في مريض واحد ، قد يكون السيتوكروم (بروتين الكبد المسؤول عن استقلاب المواد الغريبة) أكثر نشاطًا ، في حالة أخرى أقل. من أجل تحديد نوع السيتوكروم الذي يمتلكه مريض معين ، تم اقتراح إجراء تحليل PCR قبل استخدام الدواء. يسمى هذا التحليل التنميط الجيني الأولي (eng. التنميط الجيني المرتقب).

استنساخ الجينات

الاستنساخ الجيني (يجب عدم الخلط بينه وبين استنساخ الكائنات الحية) هو عملية عزل الجينات ، ونتيجة للتلاعب بالهندسة الوراثية ، الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين الذي يتم إدخاله بعد ذلك المتجه- جزء من الحمض النووي ينقل جينًا غريبًا إلى كائن حي أو كائن آخر ، ملائم للنمو. كما يتم استخدام ناقلات ، على سبيل المثال ، البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي. عادة ما يتم استخدام إدخال الجينات في كائن غريب للحصول على منتج هذا الجين - RNA أو في كثير من الأحيان بروتين. وبالتالي ، يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في الزراعة والطب وما إلى ذلك.

أرز. 4: استنساخ الجين باستخدام البلازميد. ...
(1) الحمض النووي الصبغي للكائن الحي أ. (2) PCR. (3) نسخ عديدة من جين الكائن الحي أ. (4) إدخال الجين في البلازميد. (5) البلازميد مع جين الكائن الحي أ. (6) إدخال البلازميد في الكائن ب. (7) مضاعفة عدد نسخ جين الكائن A في الكائن B.

تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام نظير ديديوكسينيوكليوتيدات مشع أو مشع ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل جزءًا لا يتجزأ ، لأنه أثناء البلمرة يتم دمج مشتقات النيوكليوتيدات الموصوفة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في حبلا DNA. هذا يوقف التفاعل ، مما يسمح بتحديد موضع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل الخيوط المركبة في الهلام.

الطفرات

حاليًا ، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الطريقة الرئيسية لإجراء الطفرات. أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط وتسريع إجراءات إجراء الطفرات ، فضلاً عن جعلها أكثر موثوقية وقابلية للتكاثر.

1. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

2. مبدأ طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل

2.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل

2.2 ظروف درجة الحرارة الدورية

2.3 المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي

2.4 تأثير "الهضبة"

3. مراحل إنتاج PCR

3.2 التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

3.4.2 الضوابط الداخلية

4.1 التحليل النوعي

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي

3.1 تحضير عينة من المواد البيولوجية

لاستخراج الحمض النووي ، يتم استخدام تقنيات مختلفة ، اعتمادًا على المهام. يكمن جوهرها في استخراج (استخراج) الحمض النووي من منتج بيولوجي وإزالة الشوائب أو تحييدها للحصول على تحضير DNA بنقاء مناسب لـ PCR.

تعتبر طريقة الحصول على تحضير DNA النقي الذي وصفه Marmur قياسية وأصبحت كلاسيكية بالفعل. ويشمل التحلل البروتيني الأنزيمي يليه نزع البروتين وإعادة ترسيب الحمض النووي بالكحول. تسمح لك هذه الطريقة بالحصول على تحضير DNA نقي. ومع ذلك ، فهو شاق للغاية وينطوي على العمل مع مواد عدوانية ونفاذة مثل الفينول والكلوروفورم.

إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل تشوتروبي قوي ، غوانيدين ثيوسيانات (GuSCN) ، لتحلل الخلايا ، وامتصاص الحمض النووي اللاحق على الناقل (خرز زجاجي ، تراب دياتومي ، زجاج "حليب" ، إلخ). بعد الغسيل ، يبقى الحمض النووي في العينة ، ويتم امتصاصه على حامل ، ويمكن إزالته بسهولة باستخدام محلول شطف. الطريقة مريحة وتكنولوجية ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك ، فقد يكون فقدان الحمض النووي ممكنًا بسبب الامتصاص الذي لا رجعة فيه على الناقل ، وكذلك أثناء عمليات الغسل العديدة. هذا مهم بشكل خاص عند العمل بكميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك ، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، عند استخدام هذه الطريقة ، يكون الاختيار الصحيح للمواد الماصة والمراعاة الدقيقة للفروق التكنولوجية أمرًا مهمًا للغاية.

تعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينة على استخدام المبادلات الأيونية من نوع Chilex ، والتي ، على عكس الزجاج ، لا تمتص الحمض النووي ، ولكن على العكس من ذلك ، الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة ، تشتمل هذه التقنية على مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في المبادل الأيوني. الطريقة جذابة للغاية لبساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات ، يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ ، توجد أحيانًا عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. في هذه الحالات ، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.

وبالتالي ، ينبغي النظر في اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أهداف التحليلات المقصودة.

3.2 التضخيم

لإجراء تفاعل التضخيم ، من الضروري تحضير خليط تفاعل وإضافة عينة الحمض النووي التي تم تحليلها إليه. في هذه الحالة ، من المهم مراعاة بعض ميزات التلدين التمهيدي. الحقيقة هي أنه ، كقاعدة عامة ، تحتوي العينة البيولوجية التي تم تحليلها على مجموعة متنوعة من جزيئات الحمض النووي ، والتي تحتوي البادئات المستخدمة في التفاعل على تماثل جزئي ، وفي بعض الحالات مهم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تصلب البرايمر مع بعضها البعض لتشكيل ثنائيات التمهيدي. كلاهما يؤدي إلى استهلاك كبير من المواد الأولية لتركيب منتجات تفاعل المنتج الثانوي (غير المحدد) ، ونتيجة لذلك ، يقلل بشكل كبير من حساسية النظام. هذا يجعل من الصعب أو المستحيل قراءة نتائج التفاعل أثناء الرحلان الكهربي.

3.3 تقييم نتائج التفاعل

لإجراء تقييم صحيح لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية ، يمكن الكشف عن منتجات التضخيم لجزيئات الحمض النووي الفردية المستهدفة عن طريق الرحلان الكهربائي بعد 30-35 دورة. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها رد الفعل في ظروف قريبة من المثالية ، والتي لا تحدث غالبًا في الحياة. درجة نقاء تحضير الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم ، أي وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل والتي يصعب التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان ، بسبب وجودها ، لا يمكن تضخيم حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة. وبالتالي ، لا توجد غالبًا علاقة مباشرة بين المقدار الأولي من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.

3.3.1 طريقة التفريد الأفقي

يتم استخدام طرق مختلفة لتصور نتائج التضخيم. الطريقة الأكثر شيوعًا اليوم هي الرحلان الكهربائي ، استنادًا إلى فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم. للقيام بذلك ، قم بإعداد طبق من هلام الاغاروز ، والذي يتم تجميده بعد الذوبان في محلول رحلان كهربائي agarose بتركيز 1.5-2.5٪ مع إضافة صبغة DNA خاصة ، على سبيل المثال ، بروميد الإيثيديوم. يشكل الاغاروز المجمد شبكة مكانية. عند ملء الأمشاط ، يتم تشكيل آبار خاصة في الجل ، والتي يتم إدخال منتجات التضخيم إليها لاحقًا. يتم وضع لوحة الهلام في جهاز أفقي للهلام الكهربائي ويتم توصيل مصدر جهد ثابت. يبدأ الحمض النووي سالب الشحنة في الانتقال من سالب إلى موجب في الهلام. في هذه الحالة ، تتحرك جزيئات الحمض النووي الأقصر بشكل أسرع من الجزيئات الطويلة. تتأثر سرعة حركة الحمض النووي في الهلام بتركيز الاغاروز ، وقوة المجال الكهربائي ، ودرجة الحرارة ، وتكوين محلول الرحلان الكهربائي ، وبدرجة أقل ، بتكوين GC للحمض النووي. تتحرك جميع الجزيئات من نفس الحجم بنفس السرعة. يتم تضمين الصبغة (مقسمة) في مجموعات مستوية في جزيئات الحمض النووي. بعد نهاية الرحلان الكهربي ، الذي يستمر من 10 دقائق إلى ساعة واحدة ، يتم وضع الجل على مرشح مصباح ضوئي ينبعث منه الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (254 - 310 نانومتر). يتم نقل الطاقة فوق البنفسجية التي يمتصها الحمض النووي في منطقة 260 نانومتر إلى الصبغة ، مما يتسبب في تألقها في المنطقة البرتقالية الحمراء من الطيف المرئي (590 نانومتر).

يمكن أن يكون سطوع نطاقات منتجات التضخيم مختلفًا. ومع ذلك ، لا يمكن أن يرتبط هذا بالكمية الأولية للحمض النووي المستهدف في العينة.

3.3.2 طريقة الفصل الكهربائي العمودي

تشبه طريقة الرحلان الكهربي العمودي في الأساس طريقة الرحلان الكهربي الأفقي. يكمن اختلافهم في حقيقة أنه في هذه الحالة يتم استخدام المواد الهلامية المتعددة الأكريلاميد بدلاً من الاغاروز. يتم إجراؤه في غرفة خاصة للرحلان الكهربي العمودي. يتمتع الرحلان الكهربي للهلام البولي أكريلاميد بدقة أعلى مقارنة بالرحلان الكهربائي للأغاروز ويجعل من الممكن التمييز بين جزيئات الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة بدقة نيوكليوتيد واحد. يعد تحضير هلام بولي أكريلاميد أكثر تعقيدًا إلى حد ما من هلام الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك ، مادة الأكريلاميد مادة سامة. نظرًا لأن الحاجة إلى تحديد حجم منتج التضخيم بدقة 1 نيوكليوتيد نادرًا ما تظهر ، يتم استخدام طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي في العمل الروتيني.

3.4 التحكم في مرور تفاعل التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

يتم استخدام تحضير الحمض النووي للكائن الدقيق المطلوب "كعنصر تحكم إيجابي". تختلف الأمبليكونات غير المحددة في الحجم عن الأمبليكون المتولدة عن طريق التضخيم باستخدام التحكم في إعداد الحمض النووي. يمكن أن يكون حجم المنتجات غير المحددة أكبر أو أصغر من التحكم الإيجابي. في أسوأ الحالات ، قد تتطابق هذه الأبعاد ويتم قراءتها على أنها موجبة في الرحلان الكهربائي.

للتحكم في خصوصية منتج التضخيم الذي تم إنشاؤه ، يمكنك استخدام مجسات التهجين (مناطق الحمض النووي الموجودة داخل التسلسل المضخم) المسمى بملصقات الإنزيم أو النظائر المشعة والتفاعل مع الحمض النووي وفقًا لنفس مبادئ الاشعال. هذا يعقد التحليل ويطيل بشكل كبير ، وتزيد تكلفته بشكل كبير.

3.4.2 الضوابط الداخلية

من الضروري التحكم في تقدم التضخيم في كل أنبوب بخليط التفاعل. لهذا الغرض ، يتم استخدام عنصر إضافي يسمى "الرقابة الداخلية". هو أي تحضير DNA يختلف عن الحمض النووي للكائن الدقيق المستهدف. إذا تمت إضافة عنصر التحكم الداخلي إلى خليط التفاعل ، فسيصبح نفس الهدف من التلدين التمهيدي مثل الحمض النووي الصبغي للعامل المعدي المطلوب. يتم تحديد حجم منتج التضخيم للرقابة الداخلية بحيث يكون أكبر مرتين أو أكثر من الأمبليكونات المتكونة من تضخيم الحمض النووي المطلوب للكائن الدقيق. نتيجة لذلك ، إذا تمت إضافة الحمض النووي للرقابة الداخلية إلى خليط التفاعل مع عينة الاختبار ، فبغض النظر عن وجود الكائن الدقيق في العينة البيولوجية ، فإن التحكم الداخلي سوف يتسبب في تكوين أمبليكونات محددة ، ولكن لفترة أطول (ثقيلة) ) من أمبليكون الكائنات الحية الدقيقة. سيشير وجود الأمبليكونات الثقيلة في خليط التفاعل إلى التقدم الطبيعي لتفاعل التضخيم وغياب المثبطات. إذا لم يتم تشكيل أمبليكونات بالحجم المطلوب ، ولكن لم يتم تشكيل أمبليكونات الرقابة الداخلية أيضًا ، فيمكن استنتاج أن هناك شوائب غير مرغوب فيها في العينة التي تم تحليلها ، والتي يجب إزالتها ، ولكن ليس بسبب عدم وجود الحمض النووي المطلوب .

لسوء الحظ ، على الرغم من كل جاذبية هذا النهج ، إلا أنه يحتوي على عيب كبير. إذا كان الحمض النووي المطلوب موجودًا في خليط التفاعل ، فإن كفاءة تضخيمه تنخفض بشكل حاد بسبب المنافسة مع التحكم الداخلي في البادئات. هذا مهم بشكل خاص عند التركيزات المنخفضة للحمض النووي في عينة الاختبار ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة.

ومع ذلك ، إذا تم حل مشكلة المنافسة على البادئات ، فإن طريقة التحكم في كفاءة التضخيم ستكون بالتأكيد مفيدة للغاية.

4. طرق تعتمد على تفاعل البلمرة المتسلسل

4.1 التحليل النوعي

وجدت الطريقة الكلاسيكية لأداء PCR ، التي تم توضيح مبادئها أعلاه ، تطورها في بعض التعديلات التي تهدف إلى التغلب على قيود PCR وزيادة كفاءة التفاعل.

4.1.1 طريقة إعداد PCR باستخدام "بدء التشغيل السريع"

لتقليل مخاطر تكوين منتجات غير محددة لتفاعل التضخيم ، يتم استخدام نهج يسمى "البداية الساخنة" ("البداية الساخنة").

الحقيقة هي أنه ، اعتمادًا على تكوين GC وحجمها ، تحتوي البادئات على نقطة انصهار معينة (Tm). إذا تجاوزت درجة حرارة النظام Tm ، فلن يتمكن التمهيدي من الالتصاق بشريط الحمض النووي وتغيير الصفات. في ظل الظروف المثلى ، أي التلدين بدرجة حرارة قريبة من درجة حرارة الانصهار ، يشكل التمهيدي جزيء مزدوج الشريطة فقط بشرط تكامله الكامل ، وبالتالي يضمن خصوصية التفاعل.

هناك العديد من الخيارات لتنفيذ البدء السريع:

إدخال طاق بوليميراز في خليط التفاعل خلال الدورة الأولى بعد تسخين الأنبوب إلى درجة حرارة تمسخ.

فصل مكونات خليط التفاعل بطبقة البارافين إلى طبقات (في الجزء السفلي - البادئات ، في الجزء العلوي - بوليميريز Taq و DNA الهدف) ، والتي يتم خلطها عند ذوبان البارافين (~ 65-75 0 درجة مئوية) .

استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لـ Taq polymerase. يصبح الإنزيم المرتبط بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة نشطًا فقط بعد مرحلة التمسخ الأولى ، عندما تفسد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بشكل لا رجعة فيه وتحرر المواقع النشطة لـ Taq polymerase.

في جميع هذه الحالات ، حتى لو حدث التلدين غير المحدد قبل بدء دورة درجة الحرارة ، لا يحدث استطالة ، وعند التسخين ، يتم تغيير طبيعة معقدات DNA التمهيدي ، وبالتالي لا يتم تشكيل منتجات غير محددة. بعد ذلك ، لا تنخفض درجة الحرارة في أنبوب الاختبار عن درجة حرارة الانصهار ، مما يضمن تكوين منتج تضخيم محدد.

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي

إن إمكانية استخدام الحمض النووي الريبي كهدف لـ PCR يوسع بشكل كبير نطاق تطبيقات هذه الطريقة. على سبيل المثال ، يتم تمثيل جينومات العديد من الفيروسات (التهاب الكبد C ، وفيروس الأنفلونزا ، وفيروسات البيكورنا ، وما إلى ذلك) بواسطة الحمض النووي الريبي. في الوقت نفسه ، لا توجد مرحلة وسيطة للتحول إلى DNA في دورات حياتها. للكشف عن الحمض النووي الريبي ، من الضروري أولاً وقبل كل شيء تحويله إلى شكل الحمض النووي. لهذا الغرض ، يتم استخدام النسخ العكسي ، المعزول من فيروسين مختلفين: فيروس ورم أرومات نخاع العظم للطيور وفيروس مولوني مورين لوكيميا. يرتبط استخدام هذه الإنزيمات ببعض الصعوبات. بادئ ذي بدء ، فهي قابلة للتحلل الحراري وبالتالي يمكن استخدامها في درجات حرارة لا تزيد عن 42 درجة مئوية. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي الريبي في درجة الحرارة هذه تشكل هياكل ثانوية بسهولة ، يتم تقليل كفاءة التفاعل بشكل ملحوظ ، ووفقًا لتقديرات مختلفة ، حوالي 5٪. تُبذل محاولات للتحايل على هذا العيب باستخدام بوليميراز قابل للحرارة تم الحصول عليه من الكائن الدقيق المحب للحرارة Thermus Thermophilus ، والذي يعرض نشاط النسخ في وجود Mn 2+ ، باعتباره نسخة عكسية. إنه الإنزيم الوحيد المعروف القادر على إظهار نشاط البوليميراز والنسخ.

لتنفيذ تفاعل النسخ العكسي في خليط التفاعل ، وكذلك في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب أن تكون البادئات موجودة كطبقة أولية وخليط من 4 dNTP كمواد بناء.

بعد تفاعل النسخ العكسي ، يمكن لجزيئات cDNA الناتجة أن تكون هدفًا لـ PCR.

5. تنظيم العملية التكنولوجية لإنشاء PCR

إن الحساسية العالية المحتملة لتفاعل البلمرة المتسلسل تجعل تصميم مختبر PCR دقيقًا بشكل خاص أمرًا ضروريًا. هذا يرجع إلى المشكلة الأكثر حدة في الطريقة - التلوث.

التلوث هو دخول جزيئات DNA معينة من البيئة الخارجية إلى خليط التفاعل الذي يمكن أن يكون بمثابة أهداف في تفاعل التضخيم ويعطي نتائج إيجابية خاطئة.

هناك عدة طرق للتعامل مع هذه الظاهرة غير السارة. واحد منهم هو استخدام إنزيم N-uracil-glycosylase (UG). تعتمد هذه الطريقة على قدرة UG على شق جزيئات الحمض النووي باستخدام اليوراسيل المضمن. يتم إجراء تفاعل التضخيم باستخدام خليط dNTP ، حيث يتم استبدال dTTP بـ uracil ، وبعد التدوير الحراري ، ستحتوي جميع الأمبليكونات المتكونة في أنبوب الاختبار على اليوراسيل. إذا تمت إضافة UG إلى خليط التفاعل قبل التضخيم ، فسيتم تدمير الأمبليكون في خليط التفاعل ، بينما سيظل الحمض النووي الأصلي سليمًا وسيعمل أيضًا كهدف للتضخيم.

وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تقضي إلى حد ما فقط على مصدر التلوث ولا تضمن عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة.

هناك طريقة أخرى للتعامل مع نتائج التلوث وهي التقليل بشكل كبير من عدد دورات التفاعل (حتى 25-30 دورة). ولكن حتى مع هذا النهج ، فإن خطر الحصول على نتائج إيجابية خاطئة مرتفع ، لأنه في هذه الحالة ، في حالة عدم وجود مثبطات ، من السهل الحصول على منتج تضخيم بسبب التلوث.

وهكذا ، على الرغم من فوائد تدابير التضخيم المسبق التي تهدف إلى تعطيل جزيئات الحمض النووي التي تسبب نتائج إيجابية كاذبة ، فإن أكثر الوسائل جذرية هي التنظيم المدروس جيدًا للمختبر.

استنتاج

يتم حاليًا تلقي أكثر طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل انتشارًا كطريقة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتحديد مسببات العدوى ، حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي للعامل الممرض. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع في التشخيص المبكر لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسي وما إلى ذلك. اليوم ، لا يوجد عامل معدي تقريبًا لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

منذ وقت ليس ببعيد ، تم تطوير طريقة موثوقة وحساسة للغاية وسريعة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة لدى البشر. هذه الطريقة تسمى "تحليل PCR". ما هو ، ما هو جوهره ، ما هي الكائنات الحية الدقيقة التي يمكنه اكتشافها وكيفية تناولها بشكل صحيح ، سنخبرك في مقالتنا.

تاريخ الاكتشاف

كما تستخدم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص السرطان.

مزايا الطريقة

تشتمل تشخيصات PCR على عدد من المزايا:

1. حساسية عالية. حتى مع وجود عدد قليل من جزيئات الحمض النووي للكائن الدقيق ، فإن تحليل PCR يحدد وجود العدوى. ستساعد الطريقة في الأمراض المزمنة والكامنة. في كثير من الأحيان في مثل هذه الحالات ، تكون الكائنات الحية الدقيقة غير مزروعة بوسائل أخرى.
2. أي مادة مناسبة للبحث ، على سبيل المثال ، اللعاب والدم وإفرازات الأعضاء التناسلية والشعر والخلايا الظهارية. الأكثر شيوعًا هو فحص الدم ومسحة الجهاز البولي التناسلي لـ PCR.

   

3. زراعة المحاصيل على المدى الطويل ليست مطلوبة. تتيح لك عملية التشخيص الآلي الحصول على نتائج الدراسة بعد 4-5 ساعات.
4. الطريقة موثوقة بنسبة مائة بالمائة تقريبًا. تم تسجيل حالات قليلة فقط من نتيجة سلبية خاطئة.
5. القدرة على تحديد عدة أنواع من مسببات الأمراض من عينة واحدة من المادة. لا يؤدي ذلك إلى تسريع عملية تشخيص المرض فحسب ، بل يقلل أيضًا من تكاليف المواد بشكل كبير. غالبًا ما يصف الطبيب تحليل PCR شاملًا. تبلغ تكلفة الفحص ، الذي يتكون من تحديد ستة مسببات للأمراض ، حوالي 1500 روبل.

من أجل أن تكون النتائج موثوقة عند إجراء دراسة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الضروري اجتياز التحليل ، باتباع التوصيات الخاصة بالإعداد الأولي للتشخيص:

1. قبل التبرع باللعاب ، يجب الامتناع عن تناول الطعام والدواء لمدة 4 ساعات قبل أخذ المادة. قبل الإجراء مباشرة ، اشطف فمك بالماء المغلي.
2. يجب اتباع القواعد المذكورة أعلاه عند أخذ عينة من السطح الداخلي للخد. بعد الشطف ينصح بعمل تدليك خفيف للجلد لتحرير إفراز الغدة.
3. عادة ما يتم جمع البول في المنزل. للقيام بذلك ، تحتاج إلى إجراء مرحاض شامل للأعضاء التناسلية. اجمع 50-60 مل من البول في عبوة بلاستيكية معقمة. لضمان نقاء المادة ، يوصى بإدخال سدادة في المهبل ، ويوصى للرجال بسحب ثنية الجلد قدر الإمكان. لا يمكنك التبرع بالمواد خلال فترة تدفق الطمث.
4. للتبرع بالحيوانات المنوية ، يجب الامتناع عن الجماع لمدة 3 أيام قبل أخذ المادة. كما ينصح الأطباء بالتخلي عن زيارة الساونا والاستحمام بالماء الساخن وشرب الكحول والأطعمة الحارة. لمدة 3 ساعات قبل التحليل ، يجب الامتناع عن التبول.
5. بالنسبة للولادة ، على سبيل المثال ، إذا تم إجراء تحليل لمتدثرة البوليميراز المتسلسل ، يُنصح كل من النساء والرجال بالحصول على راحة جنسية لمدة 3 أيام. يجب عدم تناول الأدوية المضادة للبكتيريا قبل أسبوعين من التحليل. لمدة أسبوع ، تحتاج إلى التوقف عن استخدام المواد الهلامية والمراهم والتحاميل المهبلية والغسول. لمدة 3 ساعات قبل الدراسة ، يجب الامتناع عن التبول. أثناء الحيض ، لا يتم أخذ المادة ، بعد 3 أيام فقط من توقف إفراز الدم ، يمكنك أخذ مسحة من الجهاز البولي التناسلي.

تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء الحمل

أثناء انتظار الطفل ، فإن العديد من الأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي تشكل خطورة كبيرة على النمو الطبيعي للجنين. يمكن أن تؤدي الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي إلى تأخر النمو داخل الرحم أو الإجهاض أو الولادة المبكرة والتشوهات الخلقية للطفل. لذلك ، من المهم للغاية الخضوع لفحص PCR في المراحل المبكرة من الحمل. من الضروري اجتياز التحليل عند التسجيل - حتى 12 أسبوعًا.



يتم أخذ المادة من قناة عنق الرحم باستخدام فرشاة خاصة. هذا الإجراء غير مؤلم ولا يشكل خطراً على الطفل. عادة ، أثناء الحمل ، يتم إجراء تحليل للكلاميديا ​​بطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وكذلك لتحليل ureaplasmosis ، و mycoplasmosis ، والفيروس المضخم للخلايا ، والهربس ، وفيروس الورم الحليمي. يسمى مجمع الفحص هذا PCR-6.

PCR لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية

نظرًا لحقيقة أن الطريقة حساسة جدًا للتغيرات في الجسم وظروف التشخيص ، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على النتيجة. لذلك ، فإن تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعدوى فيروس العوز المناعي البشري ليس طريقة موثوقة ، وكفاءته هي 96-98٪. في النسبة المتبقية 2-4٪ من الحالات ، يعطي الاختبار نتائج إيجابية خاطئة.

ولكن في بعض الحالات ، لا غنى عن تشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لفيروس نقص المناعة البشرية. عادة ما يتم إعطاؤه للأشخاص الذين يعانون من اختبار ELISA السلبي الكاذب. تشير هذه المؤشرات إلى أن الشخص لم يطور بعد أجسامًا مضادة للفيروس ولا يمكن اكتشافها دون زيادة متعددة في العدد. هذا هو بالضبط ما يمكن تحقيقه من خلال اختبار الدم PCR.

مثل هذه التشخيصات ضرورية أيضًا للأطفال في السنة الأولى من العمر المولودين لأم مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. الطريقة هي الطريقة الوحيدة لتحديد حالة الطفل بشكل موثوق.

PCR لتشخيص التهاب الكبد

تسمح طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل باكتشاف الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد A و B و C قبل وقت طويل من تكوين الأجسام المضادة للعدوى أو ظهور أعراض المرض. يعتبر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاص بالتهاب الكبد C فعالاً بشكل خاص ، لأنه في 85٪ من الحالات يكون مثل هذا المرض بدون أعراض ، وبدون العلاج في الوقت المناسب يدخل مرحلة مزمنة.



سيساعد الكشف عن العامل الممرض في الوقت المناسب على تجنب المضاعفات والعلاج طويل الأمد.

فحص PCR الشامل

تحليل PCR الشامل: الفحص عن طريق تفاعل البوليميزر المتسلسل ، والذي يتضمن تحديد عدة أنواع من العدوى في نفس الوقت: الميكوبلازما التناسلية ، الميكوبلازما البشرية ، الجاردنيلا المهبلية ، المبيضات ، المشعرات ، الفيروس المضخم للخلايا ، الهربس 1 و 2 أنواع ، السيلان ، فيروس الورم الحليمي. يتراوح سعر هذا التشخيص من 2000 إلى 3500 روبل. اعتمادًا على العيادة والمواد والمعدات المستخدمة ، وكذلك على نوع التحليل: النوعي أو الكمي. ما هو مطلوب في حالتك - سيقرر الطبيب. في بعض الحالات ، يكفي فقط تحديد وجود العامل الممرض ، وفي حالات أخرى ، على سبيل المثال ، في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، يلعب العيار الكمي دورًا مهمًا. عند تشخيص جميع مسببات الأمراض المذكورة أعلاه ، يسمى الفحص "تحليل PCR-12".

تفسير نتائج التحليل

فك تحليل PCR ليس بالأمر الصعب. لا يوجد سوى مقياسين للمؤشر - "نتيجة إيجابية" و "نتيجة سلبية". عندما يتم الكشف عن العامل الممرض ، يمكن للأطباء تأكيد وجود المرض بنسبة 99٪ من اليقين والبدء في علاج المريض. باستخدام طريقة كمية لتحديد العدوى ، سيتم الإشارة إلى المؤشر العددي للبكتيريا المكتشفة في العمود المقابل. يمكن للطبيب فقط تحديد درجة المرض ووصف العلاج اللازم.



في بعض الحالات ، على سبيل المثال ، عند تحديد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، في حالة وجود نتيجة سلبية ، يصبح من الضروري إجراء فحوصات إضافية لتأكيد المؤشرات التي تم الحصول عليها.

أين يتم الاختبار؟

أين تأخذ تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل: في عيادة حكومية أم في مختبر خاص؟ لسوء الحظ ، غالبًا ما تكون المعدات والأساليب في المؤسسات الطبية البلدية قديمة. لذلك ، من الأفضل إعطاء الأفضلية للمختبرات الخاصة ذات المعدات الحديثة والموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا. بالإضافة إلى ذلك ، ستحصل في عيادة خاصة على نتائج أسرع بكثير.

في موسكو ، تقدم العديد من المختبرات الخاصة تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للعدوى المختلفة. على سبيل المثال ، في عيادات مثل "Vita" ، "Complex Clinic" ، "Happy Family" ، "Uro-Pro" ، يتم إجراء تحليل PCR. تكلفة الفحص من 200 روبل. لتحديد أحد مسببات الأمراض.

يمكن الاستنتاج أن تشخيص الأمراض المعدية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في معظم الحالات هو طريقة سريعة وموثوقة للكشف عن العامل الممرض في الجسم في المراحل المبكرة من الإصابة. ولكن لا يزال ، في بعض الحالات ، من الضروري اختيار طرق التشخيص الأخرى. يمكن للمتخصص فقط تحديد الحاجة إلى مثل هذه الدراسة. يتطلب فك تشفير تحليل PCR أيضًا نهجًا احترافيًا. اتبع توصيات الطبيب ولا تجري فحوصات غير ضرورية بنفسك.