4402 0
Nažalost, i sada se može konstatovati da je dijagnoza gljivičnih oboljenja često neblagovremena (prorijeđene zone kose, ljuštenje se često pogrešno smatraju "perut", "suvoća"). Istovremeno, subjektivni osjećaji (svrbež, bol, itd.) često se ne javljaju u lezijama, a pacijenti zbog toga ne idu dugo kod specijaliste.
Promjene na noktima (ružne, mrvljene, stanjive) smatraju se „onihodistrofijom“ nakon ozljeda, promrzlina itd. Istovremeno (čak i izolirane lezije, uključujući nokte) mogu dovesti do stvaranja alergijskog restrukturiranja tijela, utjecati na krvne i limfne žile itd. Pacijenti s ovim na neodređeno vrijeme ostaju izvor širenja gljivične infekcije. U vezi s navedenim, pravovremena laboratorijska dijagnostika mikoza, kao i moguće rano liječenje, uvijek su relevantni.
Raznolikost kliničkih varijanti gljivičnih oboljenja, koja se pretežno javljaju kod ljudi, kao i karakteristike mikrobiologije, morfostrukture, imunoloških i drugih parametara različitih tipova (i rodova) gljivica doveli su do postojanja značajnog broja metoda za dijagnosticiranje. mikoze; Treba napomenuti da se raspoložive metode stalno poboljšavaju i (relativno nedavno) imaju osebujnu pristrasnost prema imunološkim i molekularno genetskim testovima.
S druge strane, kulturološke studije su i dalje "u kategoriji standarda bliskih zlatu" i koriste se za potvrdu sumnjivih rezultata drugih studija; Postoji mišljenje da je kombinacija kulturoloških i molekularno genetskih metoda za dijagnostički "sumnjive" oblike mikoza (posebno diseminiranih, na pozadini imunosupresije bilo koje geneze, s oštećenjem unutrašnjih organa itd.) jedan od najpouzdanijih načina. registrirati mikotičnu prirodu procesa.
Međutim, ne treba zanemariti ni "stare" tehnike, a posebno bakterioskopiju (posebno prethodni pregled), tim više što se u svakodnevnoj praksi mikroskopska "verifikacija" mikoze u mnogim dermatološkim ustanovama koristi najšire u odnosu na druge testove.
S obzirom na značajno povećanje broja alergijskih manifestacija na koži (a ponekad i visceralnih) - uz produženi, kronični, periodično pogoršavajući tok mikoze (koža, nokti, itd.), preporučljivo je provesti alergološke testove kako bi se utvrdio stepen senzibilizacija tijela, uključujući kombiniranu gljivičnu i bakterijsku infekciju; ova činjenica može utjecati na specifičnosti liječenja kod određenog pacijenta - na primjer, odrediti racionalno imenovanje antimikotika i sredstava za desenzibilizaciju itd.
Tradicionalno, pretpostavljena dijagnoza gljivične bolesti postavlja se na osnovu kliničkih manifestacija i potvrđuje laboratorijskim testovima.
U ovom dijelu knjige ukratko predstavljamo osnovne metode za registraciju mikoza (bez obzira na njihovu lokaciju), uzimajući u obzir „vrstu istraživanja i uzeti materijal“. Treba napomenuti da polimorfizam kliničkih manifestacija mikoza (uključujući i one s alergijskom komponentom) određuje raznolikost patološkog materijala koji se proučava. U ovom slučaju, uspjeh potrage za elementima gljive ovisi o pravilnom hvatanju.
Dakle, periferna zona eritemato-skvamoznih, često kovrčavih erupcija je bogatija micelijumom, sporama gljivica; na dlakavim delovima lezije uzimaju se uvrnute, belkaste, obezbojene, zatamnjene dlake ili njihovi fragmenti - "konoplja" (preporučljivo je kontrolisati unos dlake pomoću Wood lampe). Određene vještine zahtijevaju uzorkovanje materijala (pomoću igle) iz tzv. "Crne tačke" - tamni rožnati češeri na ustima folikula.
U svakodnevnoj praksi obično se pregledaju ljuskice kože (sakupljene struganjem, mazanjem, ljepljivom trakom), struganje izmijenjenih noktiju, područje subungualne hiperkeratoze, kao i iscjedak sluzokože. Prema indikacijama, ispituje se sputum, tekućina za ispiranje, urin (kod pacijenata sa nekateteriziranom bešikom); urin iz kesica za urin, posude kreveta ne može se uzimati na pregled.
Dijagnostičku vrijednost ima i krv (za kulturološka istraživanja, kao i ELISA, PCR), cerebrospinalna tekućina i drugi biofluidi tijela (pleuralni, intraartikularni, intraperitonealni - uključujući i one prikupljene aspiracijom ili drenažom); u nekim slučajevima (ovisno o lokalnoj dijagnozi) važni su žuč, izmet, punktati potkožnih apscesa, fistulni iscjedak (posebno kod dubokih mikoza). Čak i jednostavni dijagnostički testovi zahtijevaju striktno pridržavanje brojnih uslova.
Trenutno se koriste metode za dijagnosticiranje gljivičnih bolesti:
- mikroskopija; na osnovu detekcije patogena u ispitivanom materijalu, uklj. u ljudskim tkivima;
- kulturalno istraživanje praćeno mikroskopskim pregledom kulture gljive;
- histološki pregled (g. kod dubokih mikoza);
- imunološke i molekularne metode.
Mikroskopska dijagnostika
Mikroskopska dijagnostika - postala je moguća u periodu pojave posebne optičke, a kasnije elektronske mikroskopske tehnologije, koja je omogućila detaljno proučavanje ultrastrukture gljiva. Istovremeno, od dijagnostičke je vrijednosti otkrivanje gljivičnih elemenata – tankih granastih filamenata koji formiraju micelij (micelij), zaobljenih tijela (spore; reproduktivni su „organ“ gljiva).Mikroskopska dijagnostika uključuje proučavanje neobojenih (nativnih) i obojenih preparata. Ova metoda je, kako je navedeno, najraširenija u dermatološkoj praksi zbog svoje komparativne jednostavnosti i niske cijene, ali, s druge strane, nije dovoljno osjetljiva, zahtijeva ponovljene analize u nekim slučajevima, potvrđivanje drugim metodama.
Dakle, u proučavanju neobojenih preparata, pored elemenata gljive, moguće je pronaći epitelne ćelije, krvna zrnca, razne kontaminante iz spoljašnje sredine, što otežava pronalaženje uzročnika mikoze, zahteva dodatne "priprema" materijala - tzv. Njegovo "prosvjetljenje" (maceracija), koncentracija, razrjeđivanje, itd.
Ipak, direktna mikroskopija nativnih preparata omogućava vam da brzo dijagnosticirate mikozu, da odredite na koji hranjivi medij (ako je potrebno) materijal treba inokulirati, postoji mišljenje da njegov pozitivan rezultat može ostati jedina laboratorijska potvrda mikoze s negativnim odgovorom. u kulturi (A.Yu. Sergeev, Yu.V. Sergeev, 2003).
Među raznim opcijama za "prosvjetljenje" lijekova, najčešći je dodatak KOH ili NaOH ispitivanom materijalu (češće se koristi za otkrivanje gljivica u kožnim ljuskama, dlakama, kao i brojnim uzročnicima dubokih mikoze u sputumu, biopsije).
Za maceraciju usitnjenog i stavljenog na stakalce koristi se 10-20% rastvor natrijum hidroksida (ili kalijuma) - 1-3 kapi, tokom 10-20 minuta; preparat se lagano pritisne pokrivnim staklom, za bržu maceraciju - zagreva se na vatri do pojave para. Gledanje se vrši prvo pod malim uvećanjem, zatim pod velikim uvećanjem (suvi sistem).
Pravilno pripremljen preparat, koji nije podvrgnut grubim mehaničkim, termičkim i hemijskim uticajima, daje sliku homogene mase, koja se sastoji od epitelnih ćelija, produkata ćelijskog raspada gljivičnih elemenata – filamenata micelijuma i spora.
Modifikovana kosa se stavlja na staklo sa 10-30% alkalija i tretira na isti način, ali duže - od 20 minuta do 3-4 sata.Uz obilan sadržaj pigmenta preporučuje se prethodno izbeljivanje. kosu sa 5% rastvorom vodikovog peroksida. Pridaju značaj otkrivanju elemenata gljivice, kao i njihovoj lokaciji u odnosu na kosu.
Priprema materijala od patološki izmijenjenih noktiju (najbolje finog praha dobivenog struganjem iz dubine žarišta) vrši se na isti način, ali uz korištenje 30% kaustične sode, obavezno pažljivo zagrijavanje na plamenu do lakih para i izlaganje za oko 1 sat (ponekad i do nekoliko sati). Alkalno tretirane preparate ne treba čuvati duže od 1,5-2 sata zbog njihovog "kvarenja" (kristalizacija reagensa, smanjenje dijagnostičke pouzdanosti utvrđene mikroskopskom slikom).
Umjesto KOH ili NOOH, možete koristiti: a) rastvor mješavine KOH sa 15% DMSO; b) mješavina fenola (2 dijela) sa hloralhidratom (2 dijela) i mliječnom kiselinom (1 dio); c) kalkofluorna bela, koja ima afinitet za higi i celulozu; za istraživanje je potreban fluorescentni mikroskop (uočava se plavi ili zeleni sjaj, ovisno o korištenom filteru). U proučavanju cerebrospinalne tekućine (uz sumnju na kriptokokozu) često se koristilo bojenje tintom.
Kulaga V.V., Romanenko I.M., Afonin S.L., Kulaga S.M.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA MIKOZA
Uzimanje materijala za laboratorijska istraživanja na gljivice.
1.OST 42-21-2-854: naredba br. 222/80 od 27.06.00.
2. Oprema: pinceta, stakalca za mikroskop, makaze, folkman kašika.
4. Indikacije: gljivične bolesti.
5. Komplikacije: ne.
Priprema sobe za tretmane:
Promjena rješenja.
pripremiti:
-1% rastvor hloramina za krpe
-3% rastvor hloramina - za dezinfekciju obloga i pinceta
- rastvor za pranje (156 ml. vodikovog peroksida + 5 g. deterdženta u prahu + 839 ml. destilovane vode) - za obradu pinceta
- 6% rastvor vodonik peroksida - za tretman rukavica.
Algoritam za izvođenje manipulacije.
Potrebno je uzeti pincetu, stakalce, Folkman kašiku, makaze;
- pozvati pacijenta u garderobu;
- pacijent sjedi na stolici ili kauču;
- m/s štandovi.
Tehnika izvođenja:
Uzmite pincetom ljuske i dlake sa lezije;
- preuzeti materijal staviti na stakalnu stakalcu i prekriti drugim stakalcem.
- operite ruke sapunom i vodom;
- preuzeti materijal poslati u laboratoriju.
ZBIRKA MATERIJALA
Uzmite makaze i stakalce;
- makazama odrežite komad sa slobodne ivice nokta;
- prekriti uzeti materijal drugim stakalcem;
Natopite makaze i pincete u 3% rastvor formalina.
Pravilno sakupljanje materijala sa zahvaćenih noktiju ključ je uspješnog mikrobiološkog istraživanja. Prilikom sakupljanja materijala, oni ne hvataju uvijek područja nokta koja sadrže održive gljivice. Naravno, neodržive gljive u kulturi neće rasti, a njihova vrsta se ne može utvrditi.
Područje nokta koje treba uzeti određuje se oblikom onihomikoze.
Dakle, s površinskim oblikom onihomikoze, potrebno je napraviti struganje s površine ploče nokta.
U najčešćem distalnom subungualnom obliku, najvitalnije gljivice nalaze se ispod ploče nokta. Materijal koji se šalje na istraživanje trebao bi uključivati ne samo obrezivanje nokatne ploče, već i struganje sa nokatne ploče, ispod ploče.
Osim toga, treba uhvatiti područja nepromijenjenog nokta, jer se najaktivnije gljivice nalaze na granici između njih i zahvaćenih područja nokta.
U proksimalnom subungualnom obliku, materijal je teško pokupiti. U tim slučajevima ponekad, posebno ako će raditi histološki pregled ili diferencijalnu dijagnozu, uzimaju biopsiju nokta, a povremeno koriste i bušilicu.
Kod paronihije, struganje se pravi sa i sa proksimalnog valjka.
U svim slučajevima, kako bi se izbjegla bakterijska kontaminacija, nokat treba tretirati etil alkoholom prije uzimanja uzorka.
MIKROSKOPSKI PREGLED
Mikroskopsko ispitivanje patološkog materijala na gljivice vrši se u nativnim i obojenim preparatima.
Za pripremu neobojenih preparata, dobijeni materijal se usitnjava skalpelom ili iglom za seciranje i stavlja u sredinu stakalca. Za jasniju identifikaciju elemenata gljive materijal je prosvijetljen (maceriran). U tu svrhu pribjegavaju raznim supstancama, najčešće kaustičnim lužinama (KOH, NaOH), koje otapaju epidermalne ljuske, sluz, gnoj, bistre pigment vlasi i na taj način čine gljive dostupnim za istraživanje.
Na omekšale ljuskice kože ili nokta, koje se stavljaju na sredinu stakalca, nanesite 1-3 kapi 20-30% rastvora KOH (NaOH). Ispitni materijal u alkalnim kapima pažljivo se zagrijava na plamenu alkoholne lampe sve dok se na periferiji kapi ne pojavi nježni bijeli rub alkalnih kristala. Nemojte prethodno zagrijati do ključanja. Nakon zagrijavanja, kap se prekriva pokrivnim staklom, izbjegavajući ulazak mjehurića zraka.
R. A. Arabiyskiy i G. I. Gorshkova (1995) preporučuju ostavljanje ljuskica kože i preparata za kosu prekrivene pokrivnim staklom 5 - 10 minuta, a ploče nokta - 30 - 40 minuta prije mikroskopije.
Prosvetljenje preparata se može izvesti bez zagrevanja, za to se ostavljaju u 20% rastvoru KOH 30 - 60 minuta ili se koriste druge metode prosvetljenja patološkog materijala: hlorallaktofenol po Amanu; laktofenol; rastvor koji sadrži 15% dimetil sulfoksida i KOH u vodi. Dobri rezultati se postižu nakon prosvjetljenja ploča nokta, stavljenih u 5% otopinu KOH na 24 sata, u ovom slučaju nije potrebno zagrijavanje.
Mikroskopski pregled se izvodi na konvencionalnom laboratorijskom mikroskopu bez potapanja.
Kondenzator mikroskopa mora biti spušten, dijafragma sužena. Na početku se lijek nalazi na staklu pri malom uvećanju (40x), naknadna studija se izvodi pri većem povećanju (100x);
preparat se detaljno proučava pri uvećanju od 400x. Neophodno je ispitati nekoliko lijekova kako bi se povećala pouzdanost testa i izbjegli lažno pozitivni rezultati.
Greške u mikroskopskoj dijagnostici gljivica mogu nastati kako zbog nedostataka u pripremi preparata, tako i zbog nedovoljnog iskustva laboratorijskog asistenta.
Greške u proizvodnji prvenstveno se odnose na:
s pregrijavanjem lijeka, što može dovesti do gubitka alkalnih kristala, uništavanja kose i pojave sitnozrnate dezintegracije u patološkom materijalu.
Linearni raspored izduženih, ujednačenih alkalnih kristala veoma podsjeća na filamente septičkog micelija čak i na čistom staklu bez patološkog materijala.
Diferencijalna dijagnostička svojstva su izuzetna uniformnost kristala, njihova staklasta prozirnost, raznovrsnost ivica i odsustvo neraskidive veze između jednog elementa i drugog. U sumnjivim slučajevima preporučuje se u pripravak dodati kapljice blago zagrijane destilovane vode koje brzo otapaju alkalne kristale.
Sljedeće se može zamijeniti za elemente gljive:
-kapljice masti,
- vazdušni mehurići,
- pamučne niti odeće
- i takozvane "mozaične gljive".
Lipidi kože, masna razgradnja ćelija i keratohijalinska zrna, posebno ona pravilnog oblika, mogu ličiti na pojedinačne spore gljivice. Ali raznolikost oblika i, što je najvažnije, veličina, odsutnost unutarnje strukture formacija (vakuole, školjke) govori protiv gljivične prirode ovih elemenata. Lipidi također mogu dospjeti u lijek kada se uzima patološki materijal iz nedovoljno pročišćene lezije.
Mjehurići zraka mogu ličiti na spore ćelija sličnih kvascu, ali za razliku od potonjih, okruženi su gustom tamnom membranom, a čak i najmanji mjehurići zraka uvijek su veći od ćelija gljive.
Konci od tkanine čarapa, odjeće i sl. obično leže odvojeno od patološkog materijala, uvijek su veće od hifa, grublje i nisu septičke.
"Mozaik gljiva" je artefakt koji nastaje tokom kristalizacije (vjerovatno zbog razgradnje holesterola). Ima oblik mreže ili petlji, čiji obrisi odgovaraju granicama rožnatih ljuski, za razliku od filamenata micelija, nikada ne prelazi zidove ćelija epiderme.
U nekim laboratorijama bistrenje preparata za mikroskopsko ispitivanje vrši se sa 15-30% rastvorom KOH, u koji se dodaje 5-10% Parkerovog komercijalnog tamnoplavog mastila (Parker's Superchrome Blue-Black Ink).
Sa ovom bojom, hife i spore postaju plave.
Mikroskopski se otkrivaju filamentozne gljivične hife ili ćelije koje pupaju (slika 1).
Dakle, mikroskopija daje zaključak samo o gljivičnoj prirodi infekcije, ali ne i o vrsti uzročnika gljivice.
Naravno, efikasnost mikroskopskog pregleda zavisi od kvalifikacija radnika laboratorije.
Rice. 1. Mikroskopija strugotina sa noktiju zahvaćenih T. rubrum. Vidljive su hife gljive.
KULTURNO ISTRAŽIVANJE
Materijal se inokulira na standardnu Sabouraud podlogu, često antibioticima. U dijagnostici dermatofitnih infekcija uobičajeno je da se u Sabouraudovu podlogu dodaje cikloheksimid, koji inhibira rast kontaminantnih gljivica koje dolaze iz zraka. Postoje komercijalni gotovi mediji s antibiotskim i cikloheksimidnim aditivima. Treba imati na umu da mnoge nedermatofitne plijesni i neke vrste Candida ne rastu na podlozi sa cikloheksimidom, stoga se preporučuje inokulacija na podlogu Sabouraud sa cikloheksimidom i na podlogu bez njega. Identifikacija vrsta se obično vrši mikroskopskim pregledom uzgojene kulture ili ponovnim zasijavanjem na selektivne podloge (Sl. 2-15).
Rice. 2. Kultura gljivice T. rubrum izolovane sa zahvaćenih noktiju. Dobijeno na Sabouraud-ovom mediju (lijevo) i kukuruznom agaru (desno).
Rice. 3. Kultura gljive T. mentagrophytes var. interdigitale izolovane iz zahvaćenih noktiju. Dobijeno u okruženju Saburo.
Rice. 4. Kultura gljive Candida albicans. Dobijeno u okruženju Saburo.
Rice. 5. Kultura gljive Torulopsis glabrata izolovana sa zaraženih noktiju. Dobijeno u okruženju Saburo.
Rice. 6. Kultura gljivice Ulocladium sp., izolovana iz zaraženih noktiju.
Rice. 7. Mikromorfologija Acremonium sp. Izolirano iz zahvaćenih noktiju.
Rice. 8. Mikromorfologija Fusarium sp Uklonjena sa zahvaćenih noktiju.
Rice. 9. Mikromorfologija Scopulariopsis sp. Izolirano iz oboljelih noktiju.
Rice. 10. Mikromorfologija Candida albicans izolovane iz zahvaćenih noktiju.
Rice. 11. Mikromorfologija Altemaria sp. Izolovana iz zahvaćenih noktiju.
Rice. 12. Mikromorfologija Aspergillus sp. Izolirano iz zahvaćenih noktiju.
Rice. 13. Mikromorfologija Ulocladium sp izolovanog iz zahvaćenih noktiju.
Rice. 14. Mikromorfologija Chaetomium sp. Izolirano iz zahvaćenih noktiju.
Slika 15. Panel hranljivih materija za identifikaciju dermatofita (levo - kultura T rubrum, desno - T mentagrophytes var. Mterdigitale).
Slijeva na desno: Sabouraudov medij, Baxterov medij, Christensenov medij, kukuruzni agar
Treba napomenuti da neke plijesni, uključujući dermatofite, rastu sporo u kulturi, u roku od 2-3 sedmice.
Čak i ako se poštuju sva pravila za prikupljanje materijala, uz dobru laboratorijsku opremu i visoku kvalifikaciju njenog osoblja, broj pozitivnih rezultata istraživanja kulture je vrlo mali.
Prema stranoj literaturi, postotak pozitivnih studija ne prelazi 50.
Procenat pozitivnih rezultata u najboljim domaćim laboratorijama jedva dostiže 30.
Stoga se u 2 od svaka 3 slučaja onihomikoze ne može utvrditi njena etiologija.
LUMINESCENTNO ISTRAŽIVANJE
Godine 1925. Margaret i Deveze su otkrili da dlake zahvaćene određenim dermatofitima daju karakterističan sjaj kada su izložene ultraljubičastim zracima koji su prošli kroz Byda filter. Byda staklo se sastoji od barijum sulfata, sadrži oko 9% nikl oksida; prenosi zrake dužine 365 nm. Kao izvor ultraljubičastih zraka mogu se koristiti različiti uređaji. Priroda sjaja nije precizno utvrđena. Kosa nastavlja blistati nakon smrti gljivice i nakon pokušaja ekstrakcije fluorescentnog materijala toplom vodom ili hladnom otopinom natrijum bromida. Intenzitet i priroda sjaja zavise od pH rastvora. Vjeruje se da se fluorescentna tvar pojavljuje u procesu interakcije između gljivice i kose koja raste.
Sjaj u ultraljubičastim zracima, koji prolazi kroz Wood filter, tipičan je samo za kosu zahvaćenu gljivama iz roda Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, povremeno M. gypseum i M. nanum), kao i Trichophyton schonleinii... Kosa zahvaćena mikrosporumima, posebno M. canis i M. audouinii, daju najsjajniji sjaj; dlake zahvaćene T. schonleinii imaju mutnu zelenkastu fluorescenciju.
Sjaj se opaža samo na kosi potpuno zahvaćenoj gljivicom. Možda nije u svježim lezijama. U tim slučajevima dlaku treba epilirati iz najaktivnije rubne zone, a sjaj se može naći u korijenskom dijelu dlake.
Luminescentna metoda se može koristiti kako za dijagnostiku tako i za praćenje efikasnosti liječenja kod pojedinačnih pacijenata i u epidemiološkim žarištima. Kompaktne mobilne jedinice pogodne su za pregled kontakt osoba u školama, vrtićima itd.
Luminescentni pregled se mora obaviti u zamračenoj prostoriji, lezije moraju biti prethodno očišćene od kora, ostataka masti itd. Luminescentna metoda se može koristiti za dijagnosticiranje pityriasis lišaja, posebno kada su lezije lokalizirane na tjemenu. Lezije kod ove bolesti imaju crvenkasto-žuti ili smeđi sjaj. Ovaj sjaj, međutim, nije striktno specifičan, jer se može uočiti u prisustvu peruti na tjemenu, pa čak i kod zdravih ljudi u predjelu usta folikula dlake na licu i gornjem dijelu tijela. Zahvaćene dlačice identificirane luminiscentnom metodom moraju se podvrgnuti mikroskopskom pregledu.
IMUNOLOŠKA I BIOLOŠKA ISTRAŽIVANJA
Imunološke metode istraživanja koriste se za identifikaciju specifičnog restrukturiranja tijela i serološke dijagnoze gljivičnih bolesti. Za otkrivanje specifičnih antitijela u serumu uzorka provode se sljedeće serološke reakcije: aglutinacija, precipitacija, vezivanje komplementa, imunofluorescencija sa odgovarajućim antigenima.
Alergijsko stanje u tijelu pacijenta otkriva se alergijskim kožnim testovima. Alergeni se nanose na skarificiranu kožu po Pirqueu ili utrljavanjem u kožu po Morou, intradermalno prema Mantouxu, a također i injekcijom u kožu. Uz pomoć ovih testova otkrivaju se alergijske reakcije trenutnog i odgođenog tipa, što omogućava procjenu stanja humoralnog i ćelijskog imuniteta.
Za identifikaciju specifične senzibilizacije limfocita koriste se degranulacija bazofila, reakcije aglomeracije i alteracije, test blast transformacije, inhibicija migracije makrofaga itd.
Poređenje rezultata seroloških i alergijskih reakcija je korisno kako za dijagnozu tako i za prognozu toka mikoza.
Biološka metoda. Koristi se za laboratorijsku dijagnostiku dubokih i posebno opasnih mikoza. Na osnovu infekcije životinja patološkim materijalom od pacijenta ili kulturom ispitivane gljive. Izvodi se u posebnim laboratorijama.
HISTOLOŠKI PREGLED
Histologija kožnih mikoza uzrokovanih dermatofitima
Patomorfološke promjene u lezijama uzrokovane su unošenjem gljivica u stratum corneum epidermisa, kose i noktiju i upalnim odgovorom kože koji može biti akutni, subakutni ili kronični. Dijagnoza se može smatrati utvrđenom samo ako se u histološkim preparatima nađu gljivični elementi. Za to se koriste različite histološke boje, a najinformativnija je reakcija periodične kiseline (PAS), koja omogućava identifikaciju polisaharida prisutnih u celulozi i hitinu ćelijskog zida većine dermatofita (Shifu mrlja i njegove modifikacije). Također možete koristiti reakcije sulfacije i impregnaciju histoloških rezova srebrom [Khmelnitsky OK, 1973; Lewer W. F. i Schaumburg-Lewerl., 1983].
Gljive u stratum corneumu epidermisa, čak i kada se koriste posebne boje, otkrivaju se u malim količinama u obliku filamenata micelija i spora. U rijetkim slučajevima, kada u lezijama ima mnogo gljivica, one se mogu naći na dijelovima obojenim hemotoksilin-eozinom, u obliku osjetljivih bazofilnih struktura u stratum corneumu.
Upalne promjene u epidermi mogu biti različite: od manjeg intra- i ekstracelularnog edema bodljastih stanica do teške spongioze. Spongioza se obično razvija s dishidrotičnim varijantama mikoza stopala i šaka, klinički se u tim slučajevima primjećuju mjehurići. Ovu reakciju obično izazivaju T. mentagrophytes var. interdigitale. Ponekad u epidermisu postoji izražena hiperkeratoza, koja se najčešće uočava kod mikoza uzrokovanih T. rubrum.
Histološke promjene u dermisu su nespecifične i odgovaraju akutnoj, subakutnoj i kroničnoj upali.
Kod mikoze glatke kože uzrokovane T. rubrum, gljivice se ponekad nalaze u vellusu dlake i folikulima dlake. Oko folikula se razvija upalna reakcija, koja zbog ulaska gljivica u dermis može dobiti granulomatozni karakter. Središnji dio infiltrata u ovim slučajevima može biti podvrgnut supuraciji i nekrozi, a periferni dio čine limfociti, histociti, epiteloidne i višejezgrene džinovske stanice, unutar kojih se ponekad nalaze spore gljivica. Veličine spora ovdje dosežu 6 mikrona u prečniku, u kosi obično ne prelaze 2 mikrona.
Kod infiltrativno-gnojnog oblika mikoza vlasišta i područja rasta brade i brkova, gljivični elementi se nalaze u folikulu dlake, unutar i oko dlake. U kosi se određuju neposredno iznad zone početka keratinizacije (otprilike na nivou od 30 mikrona). U dermisu se uočava upalna reakcija različitog intenziteta, najizraženija kod keriona Celsii. U slučaju akutne gnojne reakcije, u sastavu infiltrata bilježi se veliki broj neutrofilnih leukocita, elementi gljivica u ovom slučaju mogu potpuno nestati. U kroničnom toku procesa, infiltrat može dobiti granulomatozni karakter, u njemu se pojavljuju višenuklearne gigantske stanice. Za potvrdu dijagnoze u nedostatku gljivica u infiltratu mogu se koristiti metode imunofluorescentnog bojenja. U te svrhe koristi se antiserum obilježen fluoresceinom za T. mentagrophytes, koji omogućava otkrivanje gljivičnih antigena u kosi i perifolikularnom infiltratu.
Formiranje infiltrativno-gnojne reakcije kože s mikozom vlasišta (kerion Celsii) i područja rasta brade i brkova uzrokovanih gljivama M. canis, T. tonsurans i T. verrucosum je manifestacija imunološkog sustava. reakcija. O tome svjedoči:
1. Sklonost lezija spontanom rješavanju.
2. Odsustvo gljivičnih elemenata sa jako izraženom zapaljenskom reakcijom na dijelu kože sa mikozom uzrokovanom T. verrucosum (faviforme) i T. tonsurans.
3. Konstantna pozitivna reakcija kao odgovor na intradermalnu primjenu trihofitina u infiltrativno-gnojnim oblicima mikoza uzrokovanih zoofilnim trihofitinima (na primjer, T. tonsurans), i negativna - u površinskim mikozama uzrokovanim istim T. tonsurans.
Uz favus u stratum corneumu epidermisa, nalazi se veliki broj filamenata micelija i pojedinačnih spora gljive. Skutula je predstavljena eksudatom, parakeratotičnim ćelijama epidermisa, ćelijama upalnog infiltrata, kao i filamentima micelija i sporama gljivica, koje se nalaze uglavnom u perifernoj zoni skutule. U aktivnom stadiju bolesti, u dermisu oko degenerativnih folikula dlake uočava se izražen upalni infiltrat koji sadrži višejezgrene divovske i plazma ćelije. U starim lezijama, kosa i žlijezde lojnice su odsutne, postoje fenomeni fibroze.
Histologija mikoza kože i sluznica uzrokovanih gljivama sličnim kvascu
Kod kandidijaze kože i sluzokože, gljivice roda Candida nalaze se u stratum corneumu epidermisa ili u površinskim slojevima epitela sluznice. Elementi gljive obično su malobrojni, dobro su obojeni PAS reakcijom ili Gramom; predstavljeni su u obliku septatnih granastih micelijskih filamenata, prečnika 2-4 mikrona, ili jajastih spora, prečnika 3-5 mikrona. Detekcija micelijskog oblika gljive je od dijagnostičke vrijednosti.
U histološkom pregledu kronične granulomatozne kandidijaze kože i sluzokože, gljivični elementi se također pretežno nalaze u stratum corneumu epidermisa ili u gornjim dijelovima epitela sluznice, ali ponekad i u bodljikavom sloju, unutar kose i u dermisu. Takođe postoji izražena hiperkeratoza i papilomatoza; u dermisu - gusti upalni infiltrat koji se sastoji od limfoidnih stanica, neutrofila, plazme i divovskih multinuklearnih stanica. Infiltrat se može proširiti u potkožno masno tkivo.
Kod pityriasis versicolor, veliki broj gljivičnih elemenata nalazi se u stratum corneumu epiderme u obliku delikatnih bazofilnih struktura, koje su jasno vidljive čak i kada su preparati obojeni hemotoksilin-eozinom. Gljive su predstavljene i filamentima i sporama.
Kod folikularnog oblika pitirijaznog lišaja dolazi do nakupljanja rožnatih masa i ćelija upalnog infiltrata u proširenim ustima folikula dlake. Upalna infiltracija je također zabilježena oko folikula. U PAS reakciji, sferične ili ovalne spore gljive, prečnika 2-4 mikrona, nalaze se unutar usta folikula dlake, a ponekad i u perifolikularnom infiltratu. Micelijum nikada nije otkriven.
Poremećaj pigmentacije kože kod pacijenata sa pityriasis versicolor nastaje zbog sposobnosti gljivice Pityrosporum da proizvodi supstancu koja inhibira proces pigmentacije u epidermi. Elektronsko mikroskopsko ispitivanje biopsija kože sa hipopigmentiranih područja pokazalo je da se u melanocitima formiraju vrlo mali melanosomi, koji nisu u stanju da prodru u keratinocite. S druge strane, u hiperpigmentiranim dijelovima kože melanosomi su veliki i sadrže veliku količinu melanina.
Osnova za dijagnozu gljivičnih oboljenja je mikroskopski pregled preparata pripremljenih od zahvaćenih područja kože i noktiju. Međutim, mikroskopska slika kod različitih tipova mikoza je slična: u kožnim ljuskama i noktima vidljive su spore gljivica i razgranati septički micelij promjera 4-7 mikrona. Stoga se rod i vrsta gljive u većini slučajeva ne mogu odrediti mikroskopskom slikom u kožnim ljuskama ili struganjem s nokta. Za identifikaciju patogena inokulacije se provode na hranjivim podlogama, najčešće na Sabouraudovu mediju.
Epidermofitoza. Zahvaćen je rožnati sloj kože, najčešće stopala, te nokti donjih ekstremiteta. Kosa nikada nije pogođena. Na noktima se pojavljuju žute mrlje ili pruge, zatim se razvija hiperkeratoza (zadebljanje noktiju), njihova deformacija i uništavanje. Lamelarno ljuštenje tabana i interdigitalnih nabora, crvenilo na koži stopala. Ponekad se stvaraju mjehurići, pelenski osip, pukotine. Bolest je praćena svrabom, pečenjem, bolom.
Mikroskopskim pregledom struganja, ljuskica, poklopaca bešike otkrivaju se niskoseptični filamenti micelija prečnika 3-5 mm, neki filamenti se raspadaju u okrugle i pravougaone spore.
Trichophytosis. To je gljivično oboljenje kože i njenih dodataka sa posebnom tendencijom zahvatanja kose [lat. trichos kosa + phyton gljiva]. Na vlasištu se pojavljuju brojne lezije promjera oko 1,5 cm. Koža na njima je edematozna, hiperemična, prekrivena ljuskama. Dlaka u lezijama se lomi na nivou od 2-3 mm iznad površine kože, pa otuda i naziv "ringworm".
Mikroskopski pregled otkriva karakterističnu osobinu gljiva Trichophyton - raspored njihovih spora u lancima. U zavisnosti od svojstava gljiva, razlikuju se:
Endothrix (uzročnik površinske trihofitoze). Gljive rastu unutar kose, dramatično mijenjajući njenu strukturu. Cijela kosa je ispunjena (napunjena) paralelnim redovima lanaca, koji se sastoje od velikih zaobljenih ili četvrtastih spora;
Ectothrix (uzročnik duboke trihofitoze), kod kojeg je dlaka obavijena omotačem malih ili velikih spora raspoređenih duž osi u lancima.
Favus je krasta. Zahvaćeni su kosa i koža, rjeđe nokti. Kosa postaje tanka, bez sjaja, "napudrana", poput starih perika, ali se ne lomi. Kožne lezije karakterizira pojava žuto-sivih kora (scutes) sa podignutim rubovima, poput onih u tanjurićima.
Mikroskopski pregled otkriva mjehuriće zraka unutar zahvaćene kose.
Microsporia. Koža i kosa su pogođeni. U lezijama se dlaka lomi na nivou od 6-8 mm iznad površine kože. Oko preostalih panjeva vidljive su bjelkaste ovojnice.
Mikroskopski pregled zahvaćene kose otkriva spore koje se nalaze oko i unutar dlake u obliku mozaika (nasumično). Vrlo su male (1-3mm), otuda i naziv bolesti. Karakterističan fluorescentni sjaj kose pomaže u dijagnosticiranju mikrosporije.
Mikroskopski pregled otkriva zaobljene ćelije koje pupaju, često u obliku grozda.
Duboke (buđene) mikoze.Češće su kao profesionalna oboljenja u fabrikama antibiotika, kod poljoprivrednih radnika u kontaktu sa pljesnivim žitaricama, sijenom, kompostom itd. Uzročnik penicilioze (četkaste gljive) ima grub, širok, septički micelij koji se završava četkom. Uzročnik mukoroze ima širok neseptički micelij koji završava vrećicom spora. Uzročnik aspergiloze (buđi leukemije) često se nalazi na pljesnivom voću i kruhu. Ima grubi septirani micelij, koji se završava ekspanzijom, iz koje niti sa sporama podsjećaju na kantu za zalijevanje s mlazovima vode.
Aktinomikoza. Uzrokuju različite vrste blistavih gljivica. Karakterizira ga stvaranje gustih infiltrata na koži, sluzokožama i u unutrašnjim organima, sklonih supuraciji i pojavi fistula. Male žute granule sa karakterističnim blistavim rubom - actinomycete drusen vidljive su na oku u fistulnom iscjetku. Preparati za mikroskopiju pripremaju se od iscjetka fistula i sputuma.
Pri malom povećanju, druze blistave gljive imaju izgled žućkastih formacija okruglog oblika sa svijetlom amorfnom sredinom i tamnijom bojom na rubovima. Pri velikom povećanju, filamenti micelija se detektuju u centru druse, a otekline u obliku bočice duž periferije. Kod bojenja po Gramu, filamenti micelija su G+, a češeri G-.
Precizna dijagnoza invazivnih mikoza Nije lako. Ovo se objašnjava ne samo poteškoćama u dobivanju kulture gljiva, već i u interpretaciji rezultata istraživanja, jer gljive, i kvasne i micelijske, mogu kolonizirati sluznice i kontaminirati uzorke koji se proučavaju. S tim u vezi, dijagnoza invazivnih mikoza temelji se na integriranom pristupu, koji uključuje ne samo rezultate mikoloških (kulturoloških) i seroloških (određivanje gljivičnog antigena) studija, već i kliničke simptome gljivične infekcije, podatke iz pomoćnih istraživačkih metoda. (kompjuterska ili magnetna rezonanca, ultrazvuk).
Evropsko-američka kooperativna grupa za proučavanje invazivnih mikoza kod imunokompromitovanih pacijenata razvijeni su kriterijumi za dijagnozu invazivnih mikoza. Predstavljeni su 2001. godine na Međunarodnoj konferenciji o antimikrobnim sredstvima i hemoterapiji (ICAAC, Chicago), a 2002. u štampi. Utvrđeni su kriterijumi za dokazanu, verovatnu i moguću invazivnu mikozu, koji se preporučuju za upotrebu u kliničkim i epidemiološkim studijama.
Dokazana invazivna mikoza uzrokovana filamentoznim gljivama: otkrivanje micelija gljivica u biopsijama ili aspiratima tokom histološkog ili citološkog pregleda ili izolacija kulture iz uzoraka dobijenih u aseptičnim uvjetima iz normalno sterilnog žarišta, koji je, prema rezultatima kliničkih i radioloških studija, povezan s infekcijom, osim studije urina i sluzokože.
Dokazana invazivna mikoza uzrokovana gljivicom: otkrivanje ćelija kvasca (gljive roda Candida mogu formirati pseudomicelij ili pravi micelij) u biopsijama ili aspiratima, sa izuzetkom uzoraka sa sluzokože, ili izolovanje kulture iz uzoraka dobijenih u aseptičnim uslovima iz normalno sterilnog žarišta, koji, prema rezultatima kliničkih i radioloških studija povezanih s infekcijom, s izuzetkom uzoraka urina, sinusa i sluznice, ili detekcije mikroskopijom i specifičnim bojenjem (u kapi tinte, bojenje mucikarminom) stanica kvasca ili pozitivnog antigena Cryptococcus spp. u cerebrospinalnoj tečnosti.
Fungemija uzrokovana filamentoznim gljivama: izolacija hemokultura gljiva, osim Aspergillus spp. i Penicillium spp., uključujući Penicillium marneffei, u kombinaciji sa kliničkim simptomima infektivnog procesa u skladu sa izolovanim patogenom.
Fungemija uzrokovana gljivicama kvasca: Izolacija hemokultura Candide ili drugih gljivica kvasca kod pacijenata s kliničkim znacima infekcije povezane s ovim patogenom.
Kompleks dijagnostičkih studija za invazivne mikoze
| Studijski biomaterijal | Indikacija, korišteni mediji, vrijednost |
| Krv |
Indikacije:
perzistentna groznica (4-5 dana ili više) tokom terapije antibioticima širokog spektra; drugi "val" groznice na pozadini antibiotske terapije Sakupljanje krvi iz vene u bočice za aerobne bakterije * ili u selektivnoj podlozi za pečurke, ponavljano (2-3 puta u toku dana sa razmakom od 1 sat) Dijagnostička relevantnost: izolacija kvasca, pažljivo tumačenje pri izolaciji filamentoznih gljiva, isključujući Fusarium spp. |
| Venski kateter |
Indikacije:
izolacija kvasca iz krvi Centralni ili periferni venski kateter se uklanja u svim slučajevima izlučivanja kvasca iz krvi Za mikološki pregled koristi se aseptički uklonjeni distalni segment katetera dužine 5-6 cm. Dijagnostička relevantnost:
|
| Iscjedak gornjih disajnih puteva, sputum, ispiranje iz dušnika, bronhija, bronhoalveolarna tekućina za ispiranje |
Indikacije:
sumnja na mikoze uzrokovane filamentoznim gljivama ili Cryptococcus neoformans; produžena groznica tokom terapije antibioticima širokog spektra i neutropenija Mikroskopija uzoraka sa bijelim kalkofluorom (detekcija micelija ili pseudomicelija); sjetva na Saburovu srijedu; određivanje antigena Aspergillus u tečnosti bronhoalveolarne lavaže u prisustvu žarišta u plućima karakterističnih za invazivnu aspergilozu Dijagnostička relevantnost: Izolacija filamentoznih gljivica ili Cryptococcus neoformans |
| Cerebrospinalna tečnost |
Indikacije:
simptomi meningitisa; detekcija fokusa (žarišta) u mozgu kompjuterskom ili magnetskom rezonancom; "Moždani" simptomi povezani s groznicom i neutropenijom Mikroskopija sa belim kalkofluorom, u kapi mastila; određivanje antigena Aspergillus, Cryptococcus; sjetva za srijedu Saburo Dijagnostička relevantnost:
|
| Biopsije, aspirati, peritonealna tečnost, pleuralna tečnost |
Indikacije:
klinički i/ili radiološki znaci invazivne mikoze; groznica tokom terapije antibioticima širokog spektra. Mikroskopija sa bijelim kalkofluorom, nanošenje na Sabouraud mediju Dijagnostička relevantnost:
|
Vjerovatna invazivna mikoza dijagnosticiran kombinacijom sljedećih kriterija:
jedna osobina iz kategorije mikrobioloških kriterijuma;
jedan znak iz kategorije "značajnih" ili dva iz grupe "manje značajnih" kliničkih simptoma infektivnog procesa.
Moguća invazivna mikoza dijagnosticira se na osnovu kombinacije sljedećih kriterija:
prisustvo najmanje jednog faktora rizika koji izaziva razvoj invazivne mikoze;
jedan znak iz kategorije mikrobioloških kriterijuma ili jedan znak iz kategorije "značajnih" (dva iz grupe "manje značajnih") kliničkih simptoma infektivnog procesa.
Koncept " moguća invazivna mikoza»Ne preporučuje se za upotrebu u kliničkim ispitivanjima koja istražuju efikasnost antifungalnih lijekova. Ovaj termin možete koristiti u analizi empirijske antifungalne terapije, epidemiološkim studijama, proučavanju farmakoekonomije.
At mikološka istraživanja Sterilni aspirati ili biopsije uzimaju u obzir ne samo izolaciju gljivične kulture, već i detekciju micelija ili pseudomicelija mikroskopijom. U histološkim preparatima Aspergillus je teško razlikovati od Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum i nekih drugih filamentoznih gljiva. Za diferencijalnu dijagnozu potrebno je provesti imunohistohemijsku studiju s antitijelima na Aspergillus.
Izolacija gljivica kvasca iz krvi barem u jednoj studiji spada u kategoriju "dokazanih" invazivnih mikoza i apsolutna je indikacija za imenovanje sistemskih antimikotika u bolesnika s neutropenijom. Učestalost otkrivanja gljivica kvasca iz krvi je niska, čak i kod diseminirane kandidijaze iznosi 35-50%.
Izvođenje ponovljene hemokulture povećava vjerovatnoću postizanja pozitivnih rezultata.
Ostalo interpretacija rezultira u slučaju detekcije filamentoznih gljivica u krvi. Visoka učestalost izolacije filamentoznih gljiva karakteristična je za Fusarium spp. i iznosi 40-60%. Aspergillus se rijetko nalazi i smatra se kontaminacijom u većini slučajeva, s izuzetkom Aspergillus terreus.
Isticanje Aspergillus terreus iz krvi bolesnika s hemoblastozom može ukazivati na pravu aspergilemiju, au prisutnosti kliničkih simptoma infekcije, to je osnova za imenovanje antimikotika.
Kriterijumi za invazivnu mikozu
| Indeks | Kriterijumi |
| Faktori koji izazivaju nastanak invazivne mikoze (makroorganizam) | neutropenija (< 0,5*109/л в течение 10 дней)
Perzistentna groznica duže od 96 sati uz terapiju antibioticima širokog spektra Tjelesna temperatura iznad 38°C ili ispod 36°C i bilo koji od sljedećih predisponirajućih znakova: produžena neutropenija (više od 10 dana) u prethodnih 60 dana, intenzivna imunosupresivna terapija u posljednjih 30 dana, dokazana ili vjerovatna invazivna mikoza u prethodnim periodična neutropenija ili AIDS Simptomi GVHD, prvenstveno slučajevi teškog toka (II stepen) ili ekstenzivnog toka hronične bolesti Dugotrajna (više od 3 sedmice) primjena glukokortikoida u posljednjih 60 dana |
| Mikrobiološki znakovi | Izolacija kulture filamentoznih gljiva (uključujući Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. i zygomycetes) i Cryptococcus neqformans iz sputuma ili bronhoalveolarne lavažne tekućine Pozitivni rezultati kulture ili citološke pretrage (direktna mikroskopija) za detekciju filamentoznih gljivica iz aspirata paranazalnih sinusa Detekcija filamentoznih gljivica ili Cryptococcus neoformans citologijom/direktnom mikroskopijom iz sputuma ili bronhoalveolarne lavaže Aspergillus pozitivan antigen u tečnosti bronhoalveolarnog ispiranja, likvoru i uzorcima krvi (najmanje dva) Pozitivan antigen kriptokoka u uzorcima krvi Detekcija citološkim pregledom ili direktnom mikroskopijom gljivičnih elemenata u uzorcima normalno sterilne tečnosti (na primjer, Cryptococcus spp. u cerebrospinalnoj tekućini) Dva pozitivna rezultata studija o detekciji kulture gljivica kvasca u urinu u odsustvu urinarnog katetera Kristali Candide u urinu u odsustvu urinarnog katetera Izolacija Candida spp. iz hemokultura |
|
Klinički znakovi
Donji respiratorni trakt |
Mora biti povezan s mjestom sa kojeg se uzimaju uzorci za mikrobiološko ispitivanje Bilo koji od sljedećih tipova novih plućnih infiltrata na CT skeniranju: halo simptom, simptom polumjeseca, šupljina s područjima konsolidacije * Simptomi infekcije donjeg respiratornog trakta (kašalj, bol u grudima, hemoptiza, dispneja), šum pleuralnog trenja, svaki novi infiltrat koji nije uključen u znakove visoke težine; pleuralni izliv |
| Gornji respiratorni trakt Znakovi od velikog značaja Znakovi manjeg značaja |
Radiološki znaci invazivne infekcije sinusa (erozija zida ili širenje infekcije na susjedne strukture, opsežna destrukcija kostiju lubanje) Curenje iz nosa, začepljenost nosa, ulceracija nazalne sluznice, epistaksa, periorbitalni edem, bol u gornjoj vilici, crna nekrotična ulceracija ili perforacija tvrdog nepca |
| centralnog nervnog sistema Znakovi od velikog značaja Znakovi manjeg značaja |
rendgenski znaci sumnje na infekciju CNS-a (mastoiditis ili drugi parameningealni fokus, ekstraduralni empiem, višestruke lezije u mozgu ili kičmenoj moždini) Fokalni neurološki simptomi i znaci, uključujući fokalne napade, hemiparezu; poremećaji svijesti, meningealni simptomi, poremećaji biohemijskog sastava cerebrospinalne tekućine i njenog staničnog sastava (u odsustvu drugih patogena, prema kulturi i mikroskopiji, u odsustvu tumorskih ćelija) |
At otkrivanje u krvi ili drugih sterilnih biosupstrata gljivica kvasca, neophodno je identifikovati na vrstu i utvrditi osetljivost na antifungalne lekove, kod izolovanja filamentoznih (buđenih) gljivica - samo identifikacija na vrstu, osetljivost se ne utvrđuje.
U kliničkoj praksa osjetljivost filamentoznih gljiva se ne istražuje zbog nesavršenih standarda za određivanje osjetljivosti takvih gljiva na antimikotike. Štaviše, samo jedna studija je pokazala korelaciju između osjetljivosti Aspergillus spp. i rezultati liječenja invazivne aspergiloze u bolesnika s hemoblastozom. Nijedna od studija koje su sprovedene od tada nije dala slične rezultate.
Nedavno su se počeli pojavljivati izolirani izvještaji o formiranju stečene rezistencije gljivica A. fumigatus na itrakonazol, vorikonazol.
Identifikacija gljiva prema vrstama, posebno onih dobijenih iz sterilnih lokusa, neophodno je prvenstveno za izbor antimikotika i adekvatne antifungalne terapije. Dakle, Candida krusei je otporna na flukonazol i manje osjetljiva od drugih vrsta kvasca na amfotericin B; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. otporan na amfotericin B; Mucorales su otporni na itrakonazol, vorikonazol, Candida glabrata pokazuje dozno zavisnu osjetljivost na flukonazol, a pri izolaciji ove vrste gljivica, čak i osjetljivih sojeva, dozu flukonazola treba povećati (odraslima se propisuje 800 mg umjesto 400 mg); Candida lusitaniae otporna je na amfotericin B.
Identifikacija gljiva prema vrstama Važan je i za provođenje epidemiološke analize u bolnici – utvrđivanje uzročnika izbijanja i, ako je moguće, izvora infekcije. Opisani su izbijanja infekcije uzrokovane rijetkim gljivama kao što su C. lusitaniae, C. krusei, C. lipolytica.
Na osnovu identifikacija vrste gljiva može se pretpostaviti invazivna mikoza ili gljivična kolonizacija mukoznih membrana. Na primjer, Aspergillus niger je značajno manje vjerovatno od Aspergillus fumigatus da izazove invazivnu aspergilozu kod pacijenata s akutnom leukemijom. Izolacija Aspergillus niger iz bronhoalveolarne lavažne tekućine najčešće se smatra kolonizacijom respiratornog trakta, a iz sputuma - kontaminacijom iz zraka i zahtijeva dodatna istraživanja za potvrdu dijagnoze invazivne aspergiloze.
Na osnovu izlučivanje filamentoznih gljivica iz sputuma, bronhoalveolarne tečnosti, aspirata paranazalnih sinusa može se samo pretpostaviti invazivna mikoza, ne svrstavajući je u kategoriju "dokazana". Međutim, uvijek treba uzeti u obzir otkrivanje Aspergillus u sputumu, posebno Aspergillus fumigatus ili Aspergillus flavus, kod pacijenata s neutropenijom s alogenim primaocima koštane srži. To zahtijeva ponovljeni mikološki pregled i kompjutersku tomografiju pluća. Dakle, kod neutropenije, vjerovatnoća otkrivanja invazivne aspergiloze u slučaju pozitivne kulture Aspergillus spp. u sputumu je 80%.
Isticanje Cryptococcus neoformans kod imunokompromitovanih pacijenata iz respiratornog trakta (ispiranje, ispiranje) je dijagnostički značajan. Ako identifikacija gljivica kvasca iz tečnosti dobijenih iz respiratornog trakta (ispiranje iz dušnika, bronhija, bronhoalveolarno ispiranje) imunokompromitovanih pacijenata nije obavezna, onda je neophodan skrining za otkrivanje Cryptococcus neoformans iz ovih uzoraka.
Otkrivanje kandide u urinu kod pacijenata s neutropenijom i groznicom, obično se smatra manifestacijom diseminirane kandidoze.
Na vreme dijagnostika invasive je uspješno koristio komercijalni test za otkrivanje cirkulacije specifičnog antigena gljive Aspergillus spp. galaktomana (polisaharid vodotopiva komponenta ćelijskog zida gljivice).
Galactomann može se odrediti pomoću dvije metode: metodom lateks aglutinacije (Pastorex Aspergillus, BioRAD) i enzimskim imunosorbentnim testom (Platelia Aspergillus, BioRAD).
Prednost enzimski imunotest je donji prag osjetljivosti za određivanje nivoa galaktomana u krvi - 1 ng / ml ili manje, a uz pomoć lateks aglutinacije - 15 ng / ml. Određivanje galaktomantije u krvi (u najmanje 2 uzorka), cerebrospinalnoj tečnosti, bronhoalveolarnom ispiranju je od dijagnostičke vrednosti. Osetljivost enzimskog imunosorbentnog testa je oko 90%, specifičnost je 90-99%, kod alogenih primaoca koštane srži ovi pokazatelji su niži i jednaki 60-70% i 80-90%, respektivno, zbog profilaktičkog upotreba antifungalnih lijekova (antimikotici smanjuju granični nivo galaktomana).
U 40% slučajeva otkrivanje galaktomantija u krvi je ispred manifestacija invazivne aspergiloze, utvrđene kompjuterskom studijom pluća, au 70% je ispred kliničkih simptoma infekcije.
Dijagnostička vrijednost testa detekcije antigena Aspergillus ima u slučaju da se studija provodi više puta. Određivanje Aspergillus antigena u krvi treba izvršiti u slučaju povišene temperature tokom liječenja antibioticima širokog spektra kod pacijenata sa neutropenijom 2 puta sedmično; s upalom pluća koja se javlja ili perzistira u pozadini terapije antibioticima; nakon otkrivanja žarišta u plućnom tkivu (kompjuterska tomografija).
Glavna u etiološkoj laboratorijskoj dijagnozi mikoza do sada su klasične metode, uključujući mikroskopiju materijala, izolaciju čiste kulture patogena s njegovom naknadnom identifikacijom. Imunološke dijagnostičke metode su od sekundarnog značaja. Koriste se za identifikaciju najznačajnijih patogena: patogenih dimorfnih gljiva, kao i uzročnika kriptokokoze, kandidijaze i aspergiloze. Genoindikacijske metode (lančana reakcija polimeraze) također imaju ograničenu primjenu zbog nespecifičnosti, ali se uglavnom koriste u dijagnostici dubokih i oportunističkih mikoza.
Materijal za istraživanje u laboratorijskoj dijagnostici mikoza, zavisno od oblika bolesti, može biti: koža i njeni dodaci (kosa, nokti), iscjedak rana i fistula, sputum, krv, likvor i urin, biopsije tkiva. Točnost uzimanja patološkog materijala u velikoj mjeri ovisi o djelotvornosti daljnjih laboratorijskih istraživanja. U slučaju kožnih lezija, materijal se odabire najčešće struganjem ili ljepljivom trakom (uglavnom za površinske oblike) prije tretmana iz svježih, ali potpuno razvijenih žarišta duž periferije, gdje se nalaze najvitalniji patogeni.
Prilikom otkrivanja dermatofitnih gljivica, kosa je izuzetno informativan materijal, jer priroda oštećenja kose omogućava identifikaciju patogena. U nekim slučajevima, upotreba Wood lampe pomaže u određivanju fokusa lezije. Zahvaćena dlaka, zajedno sa ljuskama, uklanja se pincetom za epilaciju. Kod kronične trihofitoze crnih tačaka, dlake se uklanjaju s kože iglom za seciranje.
Nokti se uzimaju duž svih slojeva, režući oštrim skalpelom ili makazama. Uzorkovanje zubnom bušilicom je efikasnije. U slučaju kandidoznih lezija, materijal se bira struganjem sa valjka za nokte. Odabrani materijal se dostavlja u laboratorij u tamnim papirnim vrećicama kako bi se izbjeglo isušivanje i kontaminacija stranom mikroflorom. Materijal koji sadrži gnoj se isporučuje u sterilnim bakterijskim otiscima ili Petrijevim posudama. Sputum se sakuplja u sterilnu posudu. Pregled sputuma treba obaviti najkasnije 2 sata nakon uzimanja. Kada se razdoblje ispitivanja produži, uzorke treba čuvati u hladnjaku na +4°C, inače može doći do dijagnostičkih grešaka povezanih s pojavom pseudomicelijalnih oblika stanica kvasca.
Krv i cerebrospinalna tečnost se sakupljaju aseptički. Sjetva krvi se vrši u tečnom mediju Sabouraud. Da bi se isključila kontaminacija uzoraka krvi, oni se ponovo pregledavaju. Cerebrospinalna tekućina se centrifugira, a sediment se koristi za mikroskopiju i inokulaciju.
Urin se prikuplja ujutro u sterilnu posudu, pri čemu je potrebno izbjeći kontaminaciju materijala mikroflorom kože perineuma. Urinokultura se izvodi metodom kvantitativne kulture.
U dijagnostici mikoza koriste se preparati kako od izvornog materijala, tako i od obojenih. Prilikom ispitivanja neobojenih preparata, gusti materijal se prethodno razbistri (macerira) sa 10-30% otopinom KOH (mogu se koristiti otopine dimetil sulfoksida), a zatim se mikroskopira metodom “drobljene kapi”. Za kontrast, preparati se boje vodenom otopinom metilen plavog.
Bojenje fiksnih razmaza provodi se na različite načine: prema Gramu, metilenskom plavom, prema Romanovsky - Giemsa. Posljednja metoda vam omogućava da vidite male stanice kvasca i faze fagocitoze. Za kriptokoke koristite bojenje tintom, bojenje Southgate mucikarminom. Na primjer, pečurke koje sadrže melanin (tamne boje). Cladophialophora bandana, obojen po Mass - Fontana (boja melanina, koji je dio ćelijskog zida). Fluorescentni serumi se koriste u dijagnostici uzročnika dubokih mikoza, uzročnika dermatofitoza, gljivica roda Candida.
Izolacija čiste kulture patogena omogućava utvrđivanje generičke i vrste pripadnosti gljive, proučavanje njenih svojstava i osjetljivosti na antimikrobne lijekove. Za izolaciju i identifikaciju gljivica koriste se guste i tečne kulture Sabouraud-a, wort-agar. Ova okruženja omogućavaju rast većine patogenih i oportunističkih gljivica. Osim toga, Sabouraudovo okruženje (slika 8.2) stimulira procese pigmentacije u gljivama, što je važno za identifikaciju.
Za suzbijanje rasta kontaminirajućih bakterija u podloge se dodaju antibiotici: hloramfenikol, streptomicin, penicilin, tetraciklin. Za izolaciju hirovitih patogenih gljivica koriste se podloge obogaćene krvlju i ekstraktom moždanog srca. Za uzgoj i identifikaciju gljiva koriste se specijalne podloge: Czapekov medij - za formiranje konidija pri identifikaciji gljivica plijesni, agar od krompira (krompir-šargarepa), agar od riže - za identifikaciju tipova rasta i dobijanje klamidospora pri identifikaciji gljiva roda Candida, agar od šargarepe (povrće) - za dobijanje tipičnih kolonija gljivičnih kultura Trichophyton schonleini, Kaškinov medij - za izolaciju gljivica koje stvaraju pigment. Diferencijalna dijagnostička okruženja se također koriste, na primjer, za identifikaciju C. albicans - kromogeni medij ili medij koji vam omogućava da odredite aktivnost fosfolipaze gljive.
Vrijeme inkubacije gljiva kreće se od nekoliko dana do 1 mjeseca ili više. Ako se sumnja na patogene dimorfne gljive, kultivacija se provodi 8 sedmica kako bi se dobio negativan odgovor.
Inokulacije se vrše na podloge sipane u epruvete, bočice i Petrijeve zdjelice. Inokulacija materijala na dermatofitne gljive se vrši istovremeno na nekoliko epruveta sa podlogom. Materijali za koje se sumnja da imaju plijesan (sputum) inokuliraju se na 3 točke i inkubiraju na 28 i 37 °C. Da bi se riješilo pitanje odsustva kontaminacije prilikom uzorkovanja materijala, vrše se kontrolne zračne kulture na sadržaj plijesni u laboratorijskim prostorijama i odjeljenjima gdje se nalaze pacijenti.
Prilikom uzgoja gljiva u mikološkom laboratoriju poštuju se sigurnosne mjere, slične onima u bakteriološkim laboratorijama. Kako bi se izbjegla alergija, osoblje obavlja rad sa gljivama plijesni i mikotoksinima u kutijama u gaznim zavojima ili u stolnim kutijama sa kapuljačom. Rad sa kulturama koje pripadaju II grupi patogenosti (patogene dimorfne gljive) moguć je samo u specijalizovanim laboratorijama.
Identifikacija vrsta gljiva vrši se na osnovu kompleksa kulturnih, morfoloških i drugih karakteristika. Prvi uključuju morfologiju kolonije, njezinu boju i veličinu kada se uzgajaju na posebnim podlogama, strukturu ruba i središta, prirodu površine, prisutnost i prirodu reproduktivnih organa, drugi - mikroskopske karakteristike. građu micelija, građu, oblik i veličinu reproduktivnih organa - konidiofore, konidije, klamidospore, artrospore itd.
Gljive formiraju različite vrste kolonija na čvrstim hranjivim podlogama. Naučnici sa G. Venter instituta (SAD), uzimajući u obzir sposobnost gljivica da ispuštaju pigmentne supstance u podlogu, kreirali su „božićno drvce“ u hranljivoj podlozi (slika 8.3).
Rice. 8.3. "Božićno drvce" od gljiva (gore: Talaromyces stipitatus; drvo Aspergillus nidulans; ukrasi: Penicillium marneffei; panj: Aspergillus terreus)
Enzimske i asimilacijske sposobnosti kultura su od velike važnosti u identifikaciji kvasca (gljiva sličnih kvascu). Trenutno se komercijalni test sistemi koriste za identifikaciju uobičajenih gljiva - uzročnika bolesti ljudi i životinja: BBL Mycotube, API 20C bio Merieux, itd.
Učitavanje ...