Tsütokiinide toime rakkudele toimub läbi. Tsütokiinid. Viirusevastase immuunsuse molekulaarsed ja rakulised mehhanismid, arengumustrid ja immunopaatia

Kuni viimase ajani oli 4. staadiumi vähk patsiendile tegelikult surmaotsus. Traditsioonilised ravimeetodid suurt ei aidanud, kogu teraapia piirdus sümptomite leevendamisega. Kuid mitu aastakümmet tagasi hakkasid nad aktiivselt arendama immuno-onkoloogiat ja eriti tsütokiiniteraapiat - kehavalkudel põhinevat ravimeetodit, mis on ülevaadete kohaselt väga tõhus. Moskva onkoimmunoloogia ja tsütokiinravi kliinikut peetakse positiivsete näitajate poolest üheks parimaks maailmas.

Mis on tsütokiiniteraapia

See ravimeetod on välja töötatud immuno-onkoloogia baasil - onkoloogia osa, mis uurib immuunsüsteemi toimimist vähi korral. Meetod põhineb vähi ja muude haiguste ravil inimorganismi valkudel (tsütokiinidel) põhinevate ravimitega. Teatud tingimustel võivad nad hävitada mitmesuguseid patogeene: võõrrakke, viirusi, antigeene, endotoksiine jne. Kuidas tsütokiinid töötavad:

• organismi immunoloogilise vastuse aktiveerimine patogeenide rünnakule;
• immuunsüsteemi töö kontroll, tapjarakud (elemendid, mis otseselt võitlevad haigusega);
• provotseerida rakumassi uuenemist tervislikuks;
• kehasüsteemide normaliseerimine.

Positiivne tegevus

Tsütokiinidega töö lisamine onkoloogia kompleksravis aitab saavutada absoluutselt positiivset ravi 10-30% patsientidest ja osaline edu ulatub 90% -ni. Võib tunduda, et sellest ei piisa, kuid viimaste etappide raskete vähkkasvajate puhul on see tohutu saavutus. Lisaks saab ja tuleks seda tehnikat kombineerida traditsiooniliste meetoditega (ravimid, keemiaravi).

Tsütokiiniteraapia toimib kvalitatiivselt ja sihipäraselt kasvajate, metastaaside vastu ning samal ajal ei avalda organismile toksilist toimet. Eraldi väärib märkimist keemiaravi kvaliteedi positiivne tõus. Meetod on juba kliinilistes uuringutes oma tõhusust tõestanud (Vene Föderatsioonis on selle tehnikaga lubatud ravida enam kui 50 erinevat tüüpi patoloogiat). Lisaks onkoloogilistele haigustele võitleb tsütokiiniteraapia edukalt ka teiste patoloogiatega:

• onkoloogia kuni 4. etapini;
• viirushepatiit B, C;
• melanoom;
• Kaposi sarkoom HIV taustal;
• AIDS ja HIV;
• SARS, gripp, bakteriaalsed soole- ja rotaviirusnakkused;
• tuberkuloos;
• vöötohatis;
• skisofreenia;
• hulgiskleroos.

Onkoimmunoloogia ja tsütokiiniteraapia

Tegelikult tekivad kõik raskekujulised pahaloomulised kasvajad nõrgenenud immuunsuse taustal. Onkoimmunoloogid (immuno-onkoloogia spetsialistid) töötavad kliiniliste uuringute taustal välja uusi vähiravi meetodeid ja ravimeid, mis põhinevad immuunsüsteemi toimel. Tsütokiiniteraapia meetod põhineb tsütokiinide, spetsiaalsete valkude kasutamisel ja tehnika ise ilmus 20. sajandi 80ndatel. Peamine probleem oli ravimite kõrge toksilisus. Kaasaegsed tsütokiinidel põhinevad ravimid on 100 korda väiksema toksilisusega.

Tsütokiinide funktsioonid kehas

Inimese kehas on tohutul hulgal tsütokiine, need kõik täidavad erinevaid funktsioone. Tsütokiiniteraapias kasutatakse seda mitmekesisust väga erinevate haiguste raviks ja organismi sisemiste protsesside aktiveerimiseks. On tõestatud, et tegelikult suudavad inimsüsteemid võidelda mis tahes probleemiga. Peaasi on vajalike protsesside käivitamine. Tsütokiinide funktsioonid kehas:

• kontroll immuunvastuse kestuse ja kvaliteedi üle;
• põletikuvastased tsütokiinid kontrollivad põletikku;
• autoimmuunreaktsioonide (põletikuvastased ja põletikueelsed tsütokiinid) arengu stimuleerimine;
• osalemine allergia mehaanikas;
• kasvaja vähenemine või selle hävitamine;
• rakkude kasvu stimuleerimine või pärssimine;
• onkoloogia arengu aeglustamine;
• immuun-, endokriin- ja närvisüsteemi koordineerimine;
• kasvaja kordumise ennetamine;
• keha homöostaasi (tervisliku püsivuse) säilitamine.

Uuritud tsütokiini valkude arv on juba ületanud 200 nimetust. Tsütokiinide interaktsioonid on erinevate funktsioonidega keerukad. Esialgu jagatakse need tegevuse tüübi järgi. Lihtsustatud klassifikatsioon eeldab jagamist bioloogilise toime järgi: põletiku regulaatorid (põletikuvastased ja põletikueelsed tsütokiinid), rakulise immuunsuse ja humoraalse immuunjaotuse reguleerimine. Täpsem süstematiseerimine lagundab valgud vastavalt nende toime olemusele. Tsütokiinide tüübid:

• immuunaktiivsuse regulaatorid (interleukiinid ja nende bioloogilised funktsioonid tagavad immuunsuse õige interaktsiooni teiste kehasüsteemidega);
• viirusevastased regulaatorid - interferoonid;
• TNF (tuumornekroosifaktorid) – regulatiivne või toksiline toime rakkudele;
• kemokiinid - igat tüüpi leukotsüütide, muude rakkude liikumise kontroll;
• kasvufaktorid – rakkude kasvu kontroll;
• kolooniaid stimuleerivad tegurid - hematopoeetiliste rakkude arengu stimuleerimine.

Tsütokiinid kui ravimid

Ingaron on tsütokiinide terapeutiline aine, mis suurendab keemiaravi toimet, kaitstes samal ajal keha toksiliste mõjude eest. Lisaks vähendab see metastaaside ja kasvajate võimalikku esinemist. Ingaroni ravim kutsub esile immuunsuse tekke, mis pärast keemiaravi ei võimalda nakkushaiguste teket, vähendab vajadust antibakteriaalsete ravimite järele. Tööriistal on lääne kolleegidega võrreldes minimaalne toksilisus.

Ravim Refnot on suunatud neoplasmide tekke piiramisele kompositsioonis sisalduva TNF tsütokiini tõttu. Agensil on ka kvalitatiivselt vähenenud toksilisus, mis võimaldab selle subkutaanset või intravenoosset manustamist, stimuleerib pahaloomuliste kasvajate hävitamist ilma kaasnevaid kudesid mõjutamata. Ravi dünaamika määramiseks on vaja 1-2 kursust. Maksimaalse efekti saavutamiseks kasutatakse mõlemat ravimit koos onkoloogias vajalike tsütokiinide aktiveerimiseks.

Kõrvalmõjud

Ravi tsütokiinidega võib põhjustada negatiivseid mõjusid sõltuvalt haiguse morfoloogiast, patsiendi üldisest seisundist ja ravimite kombinatsioonist. Enamasti ei kujuta kõrvaltoimed patsiendile ohtu, vaid viitavad kasvaja reaktsioonile ravimile. Sekundaarsete reaktsioonide ilmnemisel ravikuur peatatakse või raviskeemi kohandatakse. Keha võimalikud negatiivsed ilmingud:

• kehatemperatuuri tõus 2-3 kraadi võrra 4-6 tundi pärast tsütokiinide sissetoomist;
• valulikkus ja punetus süstekohas;
• organismi mürgitamine kasvaja lagunemissaadustega (suure moodustumise korral).

Kellele tsütokiinravi meetod ei sobi

Tsütokiinipõhistel ravimitel pole praktiliselt vastunäidustusi ja neid saab kasutada iga patsiendi jaoks. Kuid nagu ka teiste ravimite puhul, on ka hulk patsiente, kellel ei soovitata seda ravimeetodit kasutada. Ärge kasutage tsütokiinravi rasedatele naistele, imetamise ajal, autoimmuunhaiguste esinemisel, organismi harvaesinevale isiklikule allergiale ravimitele.

Tsütokiiniteraapia maksumus

Tsütokiiniravimite tõhus kasutamine saavutatakse spetsialiseeritud keskustes (näiteks Moskva onkoimmunoloogia ja tsütokiiniteraapia keskus on päästetud patsientide arvates parim kliinik). Seda tüüpi ravi maksumus varieerub suuresti sõltuvalt kasutatava ravimi tüübist ja konkreetsest haigusest. Mõnede tsütokiiniravimite ligikaudsed hinnad Moskvas.

Selles peatükis käsitletakse integreeritud lähenemisviisi tsütokiinisüsteemi hindamiseks, kasutades eelnevalt kirjeldatud kaasaegseid uurimismeetodeid.

Esiteks kirjeldame tsütokiinisüsteemi põhikontseptsioone.

Tsütokiine peetakse praegu valk-peptiidmolekulideks, mida toodavad erinevad keharakud ja mis viivad läbi rakkudevahelisi ja süsteemidevahelisi interaktsioone. Tsütokiinid on rakkude elutsükli universaalsed regulaatorid, mis juhivad viimaste diferentseerumise, proliferatsiooni, funktsionaalse aktivatsiooni ja apoptoosi protsesse.

Immuunsüsteemi rakkude poolt toodetud tsütokiine nimetatakse immunotsütokiinideks; need on immuunsüsteemi lahustuvate peptiidide vahendajate klass, mis on vajalikud selle arenguks, toimimiseks ja koostoimeks teiste kehasüsteemidega (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Reguleerivate molekulidena mängivad tsütokiinid olulist rolli kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuse reaktsioonides, tagavad nende omavahelist seost, kontrollivad vereloomet, põletikke, haavade paranemist, uute veresoonte teket (angiogenees) ja paljusid muid elutähtsaid protsesse.

Praegu on tsütokiinidel mitu erinevat klassifikatsiooni, võttes arvesse nende struktuuri, funktsionaalset aktiivsust, päritolu, tsütokiini retseptorite tüüpi. Traditsiooniliselt, vastavalt bioloogilistele mõjudele, on tavaks eristada järgmisi tsütokiinide rühmi.

1. Interleukiinid(IL-1-IL-33) - immuunsüsteemi sekretoorseid regulaatorvalgud, mis tagavad vahendajate interaktsiooni immuunsüsteemis ja selle seose teiste kehasüsteemidega. Interleukiinid liigitatakse nende funktsionaalse aktiivsuse järgi pro- ja põletikuvastasteks tsütokiinideks, lümfotsüütide kasvufaktoriteks, regulatoorseteks tsütokiinideks jne.

3. Kasvaja nekroosifaktorid (TNF)- tsütotoksilise ja reguleeriva toimega tsütokiinid: TNFa ja lümfotoksiinid (LT).

4. Hematopoeetiliste rakkude kasvufaktorid- tüvirakkude kasvufaktor (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, erütropoetiin, trobopoetiin, granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor - GM-CSF, granulotsüütide CSF - G-CSF, makrofaag -

ny KSF – M-KSF).

5. Kemokiinid- С, CC, СХС (IL-8), СХ3С - erinevat tüüpi rakkude kemotaksise regulaatorid.

6. Mitte-lümfoidsete rakkude kasvufaktorid- erinevate kudede hulka kuuluvate rakkude kasvu, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiivsuse regulaatorid (fibroblastide kasvufaktor - FGF, endoteelirakkude kasvufaktor, epidermise kasvufaktor - epidermise EGF) ja transformeerivad kasvufaktorid (TGFβ, TGFα).

Muuhulgas on viimastel aastatel aktiivselt uuritud makrofaagide migratsiooni pärssivat tegurit (migratsiooni inhibeeriv faktor – MIF), mida peetakse tsütokiini ja ensümaatilise aktiivsusega neurohormooniks (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Tsütokiinid erinevad struktuuri, bioloogilise aktiivsuse ja muude omaduste poolest. Kuid koos erinevustega on tsütokiinidel üldised omadused, iseloomulik sellele bioregulatoorsete molekulide klassile.

1. Tsütokiinid on reeglina keskmise molekulmassiga (alla 30 kD) glükosüülitud polüpeptiidid.

2. Tsütokiine toodavad immuunsüsteemi rakud ja teised rakud (näiteks endoteel, fibroblastid jne) vastusena aktiveerivale stiimulile (patogeeniga seotud molekulaarstruktuurid, antigeenid, tsütokiinid jne) ning nad osalevad reaktsioonides. kaasasündinud ja kohanemisvõimeline immuunsus, reguleerides nende tugevust ja kestust. Mõned tsütokiinid sünteesitakse konstitutiivselt.

3. Tsütokiinide sekretsioon on lühiajaline protsess. Tsütokiine ei säilitata eelvormitud molekulidena, vaid nendena

süntees algab alati geeni transkriptsiooniga. Rakud toodavad tsütokiine madalas kontsentratsioonis (pikogrammi milliliitri kohta).

4. Enamikul juhtudel toodetakse tsütokiine ja need toimivad sihtrakkudele vahetus läheduses (lühitoime). Tsütokiinide peamine toimekoht on rakkudevaheline sünaps.

5. Koondamine tsütokiinide süsteem avaldub selles, et iga rakutüüp on võimeline tootma mitut tsütokiini ja iga tsütokiini võivad sekreteerida erinevad rakud.

6. Kõiki tsütokiine iseloomustavad pleiotroopia, või tegevuse polüfunktsionaalsus. Seega on põletikunähtude ilmnemine tingitud IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 mõjust. Funktsioonide dubleerimine tagab tsütokiinisüsteemi töökindluse.

7. Tsütokiinide toimet sihtrakkudele vahendavad väga spetsiifilised kõrge afiinsusega membraaniretseptorid, mis on transmembraansed glükoproteiinid, mis koosnevad tavaliselt rohkem kui ühest subühikust. Tsütokiinide sidumise eest vastutab retseptorite rakuväline osa. On retseptoreid, mis kõrvaldavad patoloogilises fookuses liigsed tsütokiinid. Need on niinimetatud lõksu retseptorid. Lahustuvad retseptorid on membraaniretseptori rakuväline domeen, mida eraldab ensüüm. Lahustuvad retseptorid on võimelised neutraliseerima tsütokiine, osalema nende transpordis põletikukoldesse ja organismist väljutamisel.

8. Tsütokiinid töötada võrgu põhimõttel. Nad võivad tegutseda kooskõlastatult. Paljud funktsioonid, mis algselt omistati ühele tsütokiinile, näivad olevat vahendatud mitme tsütokiini kooskõlastatud tegevuse kaudu. (sünergia toimingud). Tsütokiinide sünergistlike interaktsioonide näideteks on põletikuliste reaktsioonide (IL-1, IL-6 ja TNF-a) stimuleerimine, samuti IgE süntees

(IL-4, IL-5 ja IL-13).

Mõned tsütokiinid indutseerivad teiste tsütokiinide sünteesi (kaskaad). Tsütokiinide kaskaadne toime on vajalik põletikuliste ja immuunvastuste tekkeks. Mõnede tsütokiinide võime suurendada või nõrgendada teiste tootmist määrab olulised positiivsed ja negatiivsed regulatsioonimehhanismid.

Tsütokiinide antagonistlik toime on teada, näiteks IL-6 tootmine vastusena TNFα kontsentratsiooni suurenemisele võib olla

negatiivne regulatiivne mehhanism selle vahendaja tootmise kontrollimiseks põletiku ajal.

Sihtrakkude funktsioonide tsütokiinide reguleerimine toimub autokriinsete, parakriinsete või endokriinsete mehhanismide abil. Mõned tsütokiinid (IL-1, IL-6, TNFα jne) on võimelised osalema kõigi ülaltoodud mehhanismide rakendamises.

Raku reaktsioon tsütokiini mõjule sõltub mitmest tegurist:

Rakkude tüübist ja nende esialgsest funktsionaalsest aktiivsusest;

Tsütokiini kohalikust kontsentratsioonist;

Teiste vahendaja molekulide olemasolust.

Seega moodustavad sihtrakkudel olevad tootjarakud, tsütokiinid ja nende spetsiifilised retseptorid ühtse vahendajavõrgu. Raku lõpliku vastuse määrab reguleerivate peptiidide kogum, mitte üksikud tsütokiinid. Praegu käsitletakse tsütokiinisüsteemi kui universaalset regulatsioonisüsteemi kogu organismi tasandil, mis tagab kaitsereaktsioonide tekke (näiteks nakatumise ajal).

Viimastel aastatel on tsütokiinisüsteemi idee, mis ühendab:

1) tootjarakud;

2) lahustuvad tsütokiinid ja nende antagonistid;

3) sihtrakud ja nende retseptorid (joonis 7.1).

Tsütokiinisüsteemi erinevate komponentide rikkumised põhjustavad arvukate patoloogiliste protsesside arengut ja seetõttu on selle regulatsioonisüsteemi defektide tuvastamine oluline õigeks diagnoosimiseks ja piisava ravi määramiseks.

Vaatleme kõigepealt tsütokiinisüsteemi põhikomponente.

Tsütokiine tootvad rakud

I. Adaptiivse immuunvastuse tsütokiini tootvate rakkude põhirühm on lümfotsüüdid. Puhkavad rakud ei erita tsütokiine. Antigeeni äratundmisega ja retseptori interaktsioonide (CD28-CD80 / 86 T-lümfotsüütide ja CD40-CD40L B-lümfotsüütide jaoks) osalusel toimub rakkude aktivatsioon, mis viib tsütokiini geenide transkriptsioonini, glükosüülitud peptiidide translatsiooni ja sekretsiooni rakkudevahelistesse rakkudesse. ruumi.

Riis. 7.1. Tsütokiini süsteem

CD4 T-abistajaid esindavad alampopulatsioonid: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, mis erinevad vastusena erinevatele antigeenidele sekreteeritud tsütokiinide spektri poolest.

Th0 toodab väga madalatel kontsentratsioonidel laias valikus tsütokiine.

Diferentseerumise suund Th0 määrab kahe immuunvastuse vormi kujunemise, kus domineerivad humoraalsed või rakulised mehhanismid.

Antigeeni olemus, selle kontsentratsioon, lokaliseerimine rakus, antigeeni esitlevate rakkude tüüp ja teatud tsütokiinide komplekt reguleerivad Th0 diferentseerumise suunda.

Pärast antigeeni püüdmist ja töötlemist esitlevad dendriitrakud Th0-rakkudele antigeenseid peptiide ja toodavad tsütokiine, mis reguleerivad nende efektorrakkudeks diferentseerumise suunda. Üksikute tsütokiinide roll selles protsessis on näidatud joonisel fig. 7.2. IL-12 indutseerib IFNy sünteesi T-lümfotsüütide ja] HGC poolt. IFNu tagab Th1 diferentseerumise, mis hakkab sekreteerima tsütokiine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, lümfotoksiinid), mis reguleerivad reaktsioonide teket rakusiseste patogeenide suhtes.

(hilinenud tüüpi ülitundlikkus (HRT) ja mitmesugused raku tsütotoksilisuse tüübid).

IL-4 tagab Th0 diferentseerumise Th2-ks. Aktiveeritud Th2 toodab tsütokiine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 jne), mis määravad B-lümfotsüütide proliferatsiooni, nende edasise diferentseerumise plasmarakkudeks ja antikehade vastuste tekke, peamiselt rakuvälised patogeenid.

IFNu reguleerib negatiivselt Th2 rakkude funktsiooni ja vastupidi, IL-4, Th2 poolt sekreteeritud IL-10 inhibeerib Th1 funktsiooni (joonis 7.3). Selle regulatsiooni molekulaarne mehhanism on seotud transkriptsioonifaktoritega. IFNy poolt määratud T-bet ja STAT4 ekspressioon suunab T-rakkude diferentseerumist mööda Th1 rada ja pärsib Th2 arengut. IL-4 indutseerib GATA-3 ja STAT6 ekspressiooni, mis tagab vastavalt naiivse THO muundumise Th2 rakkudeks (joonis 7.2).

Viimastel aastatel on kirjeldatud IL-17 tootvate T-abistajarakkude (Th17) erilist alampopulatsiooni. IL-17 perekonna liikmeid võivad ekspresseerida aktiveeritud mälurakud (CD4 CD45RO), y5T-rakud, NKT-rakud, neutrofiilid, monotsüüdid IL-23, IL-6, makrofaagide ja dendriitrakkude poolt toodetud TGFβ mõjul. Peamine eristav tegur inimestel on ROR-C, hiirtel - ROR-γ l Näidati IL-17 olulist rolli kroonilise põletiku ja autoimmuunpatoloogia tekkes (vt joonis 7.2).

Lisaks võivad tüümuse T-lümfotsüüdid diferentseeruda looduslikeks regulatoorseteks rakkudeks (Treg), mis ekspresseerivad pinnamarkereid CD4 + CD25 + ja transkriptsioonifaktorit FOXP3. Need rakud on võimelised suruma alla Th1- ja Th2-rakkude poolt vahendatud immuunvastust otsese rakkudevahelise kontakti ning TGFβ ja IL-10 sünteesi kaudu.

Th0 kloonide ja nende poolt sekreteeritud tsütokiinide diferentseerimisskeemid on näidatud joonisel fig. 7.2 ja 7.3 (vt ka värvilisa).

T-tsütotoksilised rakud (CD8+), looduslikud tapjarakud on nõrgad tsütokiinide, nagu interferoonid, TNF-a ja lümfotoksiinid, tootjad.

Ühe Th-alapopulatsiooni liigne aktiveerimine võib määrata ühe immuunvastuse variandi kujunemise. Th-aktivatsiooni krooniline tasakaalustamatus võib põhjustada immunopatoloogiliste seisundite teket, mis on seotud

allergiad, autoimmuunpatoloogia, kroonilised põletikulised protsessid jne.

Riis. 7.2. Tsütokiine tootvate T-lümfotsüütide erinevad alampopulatsioonid

II. Kaasasündinud immuunsüsteemis on peamised tsütokiinide tootjad müeloidrakud. Toll-like retseptorite (TLR) abil tunnevad nad ära erinevate patogeenide sarnased molekulaarstruktuurid, nn patogeeniga seotud molekulaarmustrid (RAMP), näiteks gramnegatiivsete bakterite lipopolüsahhariidid (LPS), lipoteikoiinhapped, grampositiivsete mikroorganismide peptidoglükaanid, flagelliin, G-korduste poolest rikas DNA jne.

See interaktsioon TLR-iga käivitab rakusisese signaaliülekande kaskaadi, mis viib kahe peamise tsütokiinirühma geenide ekspressioonini: proinflammatoorsed ja 1. tüüpi IFN (joonis 7.4, vt ka värvide sisestus). Peamiselt kutsuvad need tsütokiinid (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, kemokiinid jt) esile põletiku teket ning osalevad organismi kaitsmisel bakteriaalsete ja viirusnakkuste eest.

Riis. 7.3. TH1 ja TH2 rakkude poolt sekreteeritud tsütokiinide spekter

III. Immuunsüsteemi mittekuuluvad rakud (sidekoe-, epiteeli-, endoteelirakud) eritavad konstitutiivselt autokriinseid kasvufaktoreid (FGF, EGF, TGFR jne). ja tsütokiinid, mis toetavad hematopoeetiliste rakkude proliferatsiooni.

Tsütokiinid ja nende antagonistid on üksikasjalikult kirjeldatud paljudes monograafiates (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Riis. 7.4. TLR-vahendatud tsütokiinide tootmise indutseerimine kaasasündinud immuunrakkude poolt

Tsütokiinide üleekspressioon on organismile ohtlik ja võib viia liigse põletikulise reaktsiooni ehk ägeda faasi reaktsiooni tekkeni. Põletikueelsete tsütokiinide tootmise reguleerimisse on kaasatud mitmesugused inhibiitorid. Seega on kirjeldatud mitmeid aineid, mis seovad mittespetsiifiliselt tsütokiini IL-1 ja takistavad selle bioloogilise toime avaldumist (a2-makroglobuliin, komplemendi C3-komponent, uromoduliin). IL-1 spetsiifilised inhibiitorid hõlmavad lahustuvaid peibutusretseptoreid, antikehi ja IL-1 retseptori antagonisti (IL-1RA). Põletiku tekkega suureneb IL-1RA geeni ekspressioon. Kuid isegi tavaliselt esineb see antagonist veres suurtes kontsentratsioonides (kuni 1 ng / ml või rohkem), blokeerides endogeense IL-1 toime.

Sihtrakud

Tsütokiinide toimet sihtrakkudele vahendavad spetsiifilised retseptorid, mis seovad tsütokiine väga kõrge afiinsusega ning üksikud tsütokiinid võivad kasutada

ühised retseptori subühikud. Iga tsütokiin seondub oma spetsiifilise retseptoriga.

Tsütokiini retseptorid on transmembraansed valgud ja jagunevad 5 põhitüüpi. Kõige tavalisem on nn hematopoetiini tüüpi retseptor, millel on kaks ekstratsellulaarset domeeni, millest üks sisaldab trüptofaani ja seriini kahe korduse aminohappejääkide ühist järjestust, mis on eraldatud mis tahes aminohappega (WSXWS motiiv). Teist tüüpi retseptoritel võib olla kaks ekstratsellulaarset domeeni suure hulga konserveerunud tsüsteiinidega. Need on IL-10 ja IFN perekonna retseptorid. Kolmandat tüüpi esindavad TNF rühma kuuluvad tsütokiini retseptorid. Neljas tsütokiini retseptorite tüüp kuulub immunoglobuliini retseptorite superperekonda, mille rakuvälised domeenid meenutavad struktuurilt immunoglobuliini molekulide domeene. Viiendat tüüpi retseptoreid, mis seob kemokiinide perekonna molekule, esindavad transmembraansed valgud, mis läbivad rakumembraani 7 kohas. Tsütokiini retseptorid võivad eksisteerida lahustuval kujul, säilitades võime ligandide siduda (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Tsütokiinid on võimelised mõjutama sihtrakkude proliferatsiooni, diferentseerumist, funktsionaalset aktiivsust ja apoptoosi (vt joonis 7.1). Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse avaldumine sihtrakkudes sõltub erinevate rakusiseste süsteemide osalemisest retseptori signaaliülekandes, mis on seotud sihtrakkude omadustega. Apoptoosi signaal viiakse muuhulgas läbi TNF-i retseptorite perekonna spetsiifilise piirkonna, nn "surma" domeeni abil (joonis 7.5, vt värviline sisestus). Diferentseeruvad ja aktiveerivad signaalid edastatakse intratsellulaarsete Jak-STAT valkude kaudu – signaalimuundurid ja transkriptsiooni aktivaatorid (joonis 7.6, vt värviline sisestus). G-valgud osalevad kemokiinide signaaliülekandes, mis põhjustab suurenenud migratsiooni ja rakkude adhesiooni.

Tsütokiinisüsteemi põhjalik analüüs sisaldab järgmist.

I. Tootjarakkude hindamine.

1. Väljendi määramine:

Retseptorid, mis tunnevad ära patogeeni või antigeeni TCR, TLR) geenide ja valgumolekulide tasemel (PCR, voolutsütomeetria);

Adaptermolekulid, mis juhivad signaali, mis käivitab tsütokiini geenide transkriptsiooni (PCR jne);

Riis. 7.5. Signaali ülekanne TNF retseptorilt

Riis. 7.6. Jak-STAT – signaalirada 1. tüüpi tsütokiini retseptoritelt

Tsütokiini geenid (PCR); tsütokiinide valgumolekulid (inimese mononukleaarsete rakkude tsütokiine sünteesiva funktsiooni hindamine).

2. Teatud tsütokiine sisaldavate rakkude alampopulatsioonide kvantifitseerimine: Th1, Th2 Th17 (tsütokiinide intratsellulaarse värvimise meetod); teatud tsütokiine sekreteerivate rakkude arvu määramine (ELISPOT meetod, vt ptk 4).

II. Tsütokiinide ja nende antagonistide hindamine organismi bioloogilises keskkonnas.

1. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine.

2. Tsütokiinide kvantitatiivne määramine ELISA abil.

3. Tsütokiinide immunohistokeemiline värvimine kudedes.

4. Vastandlike tsütokiinide (pro- ja põletikuvastaste), tsütokiinide ja tsütokiini retseptori antagonistide vahekorra määramine.

III. Sihtrakkude hindamine.

1. Tsütokiini retseptorite ekspressiooni määramine geenide ja valgumolekulide tasemel (PCR, voolutsütomeetria meetod).

2. Signaalmolekulide määramine intratsellulaarses sisus.

3. Sihtrakkude funktsionaalse aktiivsuse määramine.

Praegu on tsütokiinisüsteemi hindamiseks välja töötatud arvukalt meetodeid, mis annavad mitmekesist teavet. Nende hulgas eristatakse:

1) molekulaarbioloogilised meetodid;

2) meetodid tsütokiinide kvantitatiivseks määramiseks immuunanalüüsi abil;

3) tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine;

4) tsütokiinide rakusisene värvimine;

5) ELISPOT meetod, mis võimaldab tuvastada tsütokiine üksiku tsütokiini tootva raku ümber;

6) immunofluorestsents.

Siin on nende meetodite lühikirjeldus.

Kasutades molekulaarbioloogilised meetodid on võimalik uurida tsütokiinide geenide ekspressiooni, nende retseptoreid, signaalmolekule, uurida nende geenide polümorfismi. Viimastel aastatel on läbi viidud suur hulk uuringuid, mis on näidanud seoseid tsütokiinisüsteemi molekulide geenide alleelide variantide ja eelsoodumuse vahel.

mitmete haiguste vastu. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda teavet konkreetse tsütokiini geneetiliselt programmeeritud tootmise kohta. Kõige tundlikum on reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon – RT-PCR (vt ptk 6). Hübridisatsiooni meetod kohapeal võimaldab selgitada tsütokiini geeniekspressiooni kudede ja raku lokaliseerimist.

Tsütokiinide kvantitatiivset määramist bioloogilistes vedelikes ja perifeerse vere mononukleaarsete rakkude kultuurides ELISA abil saab iseloomustada järgmiselt. Kuna tsütokiinid on lokaalsed vahendajad, on õigem mõõta nende taset vastavates kudedes pärast koevalkude ekstraheerimist või looduslikes vedelikes, näiteks pisarates, õõnsustest loputades, uriinis, lootevees, tserebrospinaalvedelikus jne. Tsütokiinide tase seerumis või teistes kehavedelikes peegeldab immuunsüsteemi hetkeseisu, s.t. tsütokiinide süntees keharakkude poolt in vivo.

Tsütokiinide tootmise taseme määramine perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (MNC) abil näitab rakkude funktsionaalset seisundit. MNC tsütokiinide spontaanne tootmine kultuuris näitab, et rakud on juba aktiveeritud in vivo. Tsütokiinide indutseeritud (erinevate stimulantide, mitogeenide) süntees peegeldab rakkude potentsiaalset reservvõimet reageerida antigeensele stiimulile (eriti ravimite toimele). Tsütokiinide vähenenud indutseeritud tootmine võib olla üks immuunpuudulikkuse tunnuseid. Tsütokiinid ei ole konkreetse antigeeni suhtes spetsiifilised. Seetõttu on nakkus-, autoimmuun- ja allergiliste haiguste spetsiifiline diagnoosimine teatud tsütokiinide taseme määramise teel võimatu. Samas võimaldab tsütokiinide taseme hindamine saada andmeid põletikulise protsessi raskusastme, selle ülemineku kohta süsteemsele tasemele ja prognoosi kohta, immuunsüsteemi rakkude funktsionaalse aktiivsuse, Th1 ja Th2 rakkude vahekorra kohta, mis näitab, milline on tsütokiini taseme hindamine. on väga oluline mitmete nakkuslike ja immunopatoloogiliste protsesside diferentsiaaldiagnostikas.

Bioloogilises keskkonnas saab tsütokiine kvantifitseerida, kasutades erinevaid immuunanalüüsi meetodid, kasutades polüklonaalseid ja monoklonaalseid antikehi (vt ptk 4). ELISA võimaldab teil teada saada, millised on tsütokiinide täpsed kontsentratsioonid bio-

loogilised kehavedelikud. Tsütokiinide ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsil on teiste meetodite ees mitmeid eeliseid (kõrge tundlikkus, spetsiifilisus, sõltumatus antagonistide olemasolust, täpse automatiseeritud arvestuse võimalus, raamatupidamise standardiseerimine). Sellel meetodil on aga ka omad piirangud: ELISA ei iseloomusta tsütokiinide bioloogilist aktiivsust, see võib anda valetulemusi ristreageerivate epitoopide tõttu.

Bioloogiline testimine viiakse läbi teadmiste põhjal tsütokiinide põhiomadustest ja nende toimest sihtrakkudele. Tsütokiinide bioloogiliste mõjude uurimine on võimaldanud välja töötada nelja tüüpi tsütokiinide testimist:

1) sihtrakkude proliferatsiooni esilekutsumisega;

2) tsütotoksilise toimega;

3) luuüdi eellasrakkude diferentseerumise esilekutsumisega;

4) viirusevastase toime jaoks.

IL-1 määratakse mitogeeni poolt aktiveeritud hiire tümotsüütide proliferatsiooni stimuleeriva toime järgi in vitro; IL-2 - võimega stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust; TNFa ja lümfotoksiinide tsütotoksilist toimet testitakse hiire fibroblastidele (L929). Kolooniaid stimuleerivaid tegureid hinnatakse nende võime järgi toetada luuüdi eellasrakkude kasvu agaris kolooniate kujul. IFN viirusevastast toimet tuvastatakse viiruste tsütopaatilise toime pärssimisega inimese diploidsete fibroblastide kultuuris ja hiirte L-929 fibroblastide kasvajaliinis.

Loodud on rakuliinid, mille kasv sõltub teatud tsütokiinide olemasolust. Tabel 7.1 on loetelu rakuliinidest, mida kasutatakse tsütokiinide testimiseks. Vastavalt võimele indutseerida tundlike sihtrakkude proliferatsiooni viiakse läbi IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 jne biotestimine. Kuid need testimismeetodid iseloomustab ebapiisav tundlikkus ja infosisu. Inhibiitori ja antagonisti molekulid võivad varjata tsütokiinide bioloogilist aktiivsust. Mitmetel tsütokiinidel on üldine bioloogiline aktiivsus. Sellest hoolimata on need meetodid ideaalsed rekombinantsete tsütokiinide spetsiifilise aktiivsuse testimiseks.

Tabel 7.1. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimiseks kasutatavad rakuliinid

Tabeli lõpp. 7.1

Labor 7-1

IL-1 bioloogilise aktiivsuse määramine komitogeense toime järgi hiire tümotsüütide proliferatsioonile

IL-1 bioloogilise testimise meetod põhineb tsütokiini võimel stimuleerida hiire tümotsüütide proliferatsiooni.

IL-1 saab määrata nii LPS-iga stimuleeritud monotsüütide kultuuris kui ka mis tahes bioloogilises kehavedelikus. Tähelepanu tuleb pöörata paljudele üksikasjadele.

1. Testimiseks kasutatakse mitogeenide (konkanaliin A - ConA ja fütohemaglutiniin - PHA) poolt proliferatsiooni stimuleeritud C3H/HeJ hiirte tümotsüüte. Tümotsüüte C3H / HeJ ei valitud juhuslikult: selle inbredliini hiired ei reageeri LPS-ile, mis võib esineda testitavas materjalis ja põhjustada IL-1 tootmist.

2. Tümotsüüdid reageerivad IL-2-le ja mitogeenidele, seetõttu tuleks IL-1 suhtes testitud preparaatides määrata ka IL-2 ja mitogeenide olemasolu.

Tööprotseduur

1. Valmistage tümotsüütide suspensioon kontsentratsiooniga 12 × 10 6 / ml söödet RPMI 1640, mis sisaldab 10% lehmade embrüote seerumit ja 2-merkaptoetanooli (5 × 10 -5 M).

2. Valmistage eksperimentaalsete (bioloogiliste kehavedelike) ja kontrollproovide järjestikuste kahekordsete lahjenduste seeria. Kontrollidena kasutatakse IL-1 sisaldavaid bioloogilisi vedelikke või proove, mis on saadud mononukleaarsete rakkude inkubeerimisel ilma LPS-ita ja laboratoorset standardset IL-1 sisaldavat preparaati. 96 süvendiga ümarapõhjalistel plaatidel kantakse 50 μl igast lahjendusest 6 süvendisse.

3. Iga lahjenduse kolme süvendisse lisage 50 µl puhastatud PHA-d (Wellcome), mis on lahustatud täissöötmes kontsentratsiooniga 3 µg/ml, ja ülejäänud 3 süvendisse – 50 µl söödet.

4. Lisage igasse süvendisse 50 μl tümotsüütide suspensiooni ja inkubeerige 48 tundi 37 °C juures.

6. Enne kultiveerimise lõppu lisatakse süvenditesse 50 μl ["3H]-tümidiini lahust (1 μCi / ml) ja inkubeeritakse veel 20 tundi.

7. Radioaktiivsuse taseme määramiseks kantakse kultuurirakud automaatse rakukoguja abil filterpaberile, filtrid kuivatatakse ja märgise kaasamine määrataksega.

8. Tulemused on väljendatud stimulatsioonifaktorina.

kus m cp on keskmine impulsside arv 3 augus.

Kui tümotsüüdid reageerivad stimulatsioonile standardse IL-1-ga, näitab testitava proovi stimulatsiooniindeks, mis ületab 3, usaldusväärselt IL-1 aktiivsust.

Bioanalüüs on ainus meetod tsütokiini funktsiooni hindamiseks, kuid seda meetodit tuleks täiendada erinevat tüüpi sobiva spetsiifilisuse kontrolliga, kasutades monoklonaalseid antikehi. Tsütokiinile teatud monoklonaalsete antikehade lisamine kultuuri blokeerib tsütokiini bioloogilise aktiivsuse, mis tõestab, et tuvastatud tsütokiin toimib signaalina rakuliini proliferatsioonile.

Biotesti kasutamine interferooni tuvastamiseks. IFN-i bioloogilise aktiivsuse hindamise põhimõte põhineb selle viirusevastasel toimel, mille määrab rakukultuuris uuritava viiruse paljunemise inhibeerimise määr.

Töös saab kasutada IFN-i toime suhtes tundlikke rakke: eeskätt kana ja inimese embrüote trüpsiinitud fibroblastirakke, inimese diploidsete fibroblastide siirdatud rakke ja hiire rakukultuuri (L929).

IFN-i viirusevastase toime hindamisel on soovitav kasutada lühikese paljunemistsükliga, IFN-i toime suhtes kõrge tundlikkusega viiruseid: hiire entsefalomüeliidi viirus, hiire vesikulaarne stomatiit jne.

Labor 7-2

Interferooni aktiivsuse määramine

1. Inimloote diploidsete fibroblastide suspensioon söötmel, mis sisaldab 10% veise embrüote seerumit (rakkude kontsentratsioon - 15-20 × 10 6 / ml), valatakse steriilsetele 96-süvendilistele lamedapõhjalistele plaatidele, 100 μl süvendi kohta. ja asetatakse CO2 inkubaatorisse temperatuuril 37 °C.

2. Pärast täieliku monokihi moodustumist eemaldatakse kasvusööde süvenditest ja igasse süvendisse lisatakse 100 µl tugisöödet.

3. IFN aktiivsuse tiitrimine uuritavates proovides viiakse läbi kahekordsete lahjenduste meetodil fibroblastide monokihil.

Samaaegselt proovidega sisestatakse kaevudesse hiire entsefalomüeliidi viirus (VEM) annuses, mis põhjustab 100% rakukahjustuse 48 tundi pärast nakatumist.

4. Kontrolliks kasutage süvendeid tervete (töötlemata) viirusega nakatunud rakkudega.

Igas uuringus kasutatakse võrdlusravimina teadaoleva aktiivsusega IFN-i võrdlusproove.

5. Proovilahjendustega plaate inkubeeritakse 24 tundi temperatuuril 37 °C 5% CO 2 atmosfääris.

6. IFN aktiivsuse tase määratakse uuritava proovi maksimaalse lahjenduse pöördväärtusega, mis pärsib viiruse tsütopaatilist toimet 50% võrra ja seda väljendatakse aktiivsuse ühikutes ml kohta.

7. IFN tüübi määramiseks lisatakse süsteemi IFNα, IFNβ või IFNγ vastane antiseerum. Antiseerum tühistab vastava tsütokiini toime, mis võimaldab tuvastada IFN tüüpi.

Inhibeeriva faktori migratsiooni bioloogilise aktiivsuse määramine. Praeguseks on kujunenud täiesti uued ideed MÜÜDI olemuse ja omaduste kohta, mis avastati eelmise sajandi 60ndatel rakulise immuunsuse vahendajana ja jäi paljudeks aastateks tähelepanuta (Bloom BR, Bennet B., 1966). David JR, 1966). Alles viimase 10-15 aastaga on selgunud: MÜÜT on üks olulisemaid bioloogilisi vahendajaid organismis, millel on lai valik tsütokiini, hormooni ja ensüümi bioloogilisi funktsioone. MIF-i toime sihtrakkudele realiseerub CD74-retseptori või endotsütoosi mitteklassikalise raja kaudu.

MÜÜTI peetakse oluliseks põletiku vahendajaks, mis aktiveerib makrofaagide funktsiooni (tsütokiinide tootmine, fagotsütoos, tsütotoksilisus jne), aga ka endogeenseks immunoregulatoorseks hormooniks, mis moduleerib glükokortikoidide aktiivsust.

Üha rohkem koguneb teavet MIF-i rolli kohta paljude põletikuliste haiguste, sealhulgas sepsise, reumatoidartriidi (RA), glomerulonefriidi jne patogeneesis. RA korral on MIF-i kontsentratsioon kahjustatud liigeste vedelikus oluliselt suurenenud. mis on korrelatsioonis haiguse tõsidusega. MÜÜTI mõjul suureneb põletikueelsete tsütokiinide tootmine nii makrofaagide kui ka sünoviaalrakkude poolt.

MIF-i aktiivsuse testimiseks on teada erinevaid meetodeid, mil migreeruvad rakud (MIF-i sihtrakud) asetatakse klaaskapillaari (kapillaartest), agaroositilga või agaroosi süvendisse.

Tutvustame suhteliselt lihtsat sõelumismeetodit, mis põhineb raku mikrokultuuride (leukotsüüdid või makrofaagid) moodustamisel standardse pindala ja rakkude arvu järgi 96-augulise lamedapõhjalise plaadi süvendite põhjas, millele järgneb nende kultiveerimine toitainekeskkonnas. ja nende mikrokultuuride pindala muutuse määramine MIF-i toimel (Suslov A.P., 1989).

Labor 7-3

MÜÜDI tegevuse definitsioon

MIF-i bioloogilise aktiivsuse määramine toimub raku mikrokultuuride moodustamise seadme abil (joonis 7.7) - MIGROSKRIN (NF Gamaleya RAMSi nime saanud epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut).

1. 96 süvendiga plaadi süvenditesse (Flow, UK vms) lisage 100 μl söötmega lahjendatud proovi, milles määratakse MYTH aktiivsus (iga lahjendus 4 paralleeli, katseproovid). Kultuurisööde sisaldab RPMI 1640, 2 mM L-glutamiini, 5% veise loote seerumit, 40 μg/ml gentamütsiini.

2. Lisage sööde (4 paralleelselt) kontrollsüvenditesse, igaüks 100 µl.

3. Valmistage peritoneaalsetest makrofaagidest rakususpensioon, mille jaoks süstitakse 2 hübriidhiirele (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitoneaalselt 10 ml Hanksi lahust hepariiniga (10 U / ml), masseerige kõhtu õrnalt 2-3 minutit. Seejärel loom tapetakse pea maharaiumisega, kõhusein torgatakse ettevaatlikult kubemepiirkonda ja eksudaat imetakse läbi nõela süstlaga välja. Peritoneaalse eksudaadi rakke pestakse kaks korda Hanksi lahusega, tsentrifuugides neid 10-15 minutit 200 g juures. Seejärel valmistatakse rakususpensioon, mille kontsentratsioon on 10 ± 1 miljonit/ml söötmes RPMI 1640. Loendamine viiakse läbi Gorjajevi kambris.

4. Pane kokku MIGROSKRIN-süsteem, mis on raamotsade suunatud ja standardne fikseerimine rakukultuuridega rangelt vertikaalses asendis, etteantud kõrgusel 96-süvendilise kultuuriplaadi süvendi keskpunktist kõrgemal, ning sisaldab ka 92 otsikut automaatne pipett USAst Costarist (joonis 7.7).

Sisestage statiivi jalad plaadi nurgasüvenditesse. Rakususpensioon kogutakse automaatse pipetiga otsikutesse – igas 5 μl, loputatakse liigsetest rakkudest ühekordse söötmesse langetamisega ja sisestatakse vertikaalselt süsteemiriiuli pesadesse. Otsikutega täidetud resti hoitakse 1 tund toatemperatuuril rangelt horisontaalsel pinnal. Selle aja jooksul settivad suspensiooni rakud süvendite põhja, kus moodustuvad standardsed raku mikrokultuurid.

5. Otsirest eemaldatakse ettevaatlikult plaadilt. Rakkude mikrokultuuriga plaat asetatakse rangelt horisontaalsesse asendisse CO 2 inkubaatorisse, kus seda kultiveeritakse 20 tundi.Kasvatamise ajal migreeruvad rakud piki süvendi põhja.

6. Tulemuste kvantitatiivne registreerimine pärast inkubeerimist teostatakse binokulaarse luubiga, hinnates visuaalselt koloonia suurust okulaari sees oleval skaalal. Mikrokultuurid on ringikujulised. Seejärel määravad teadlased 4 katse- või kontrollkaevu kolooniate mõõtmiste põhjal koloonia keskmise läbimõõdu. Mõõtmisviga on ± 1 mm.

Migratsiooniindeks (MI) arvutatakse järgmise valemiga:

Proovil on MÜÜT-aktiivsus, kui MI väärtused on võrdsed

MYTH aktiivsuse kokkuleppelise ühiku (U) puhul võetakse pöördväärtus, mis võrdub proovi (proovi) suurima lahjenduse väärtusega, mille migratsiooniindeks on 0,6 ± 0,2.

FEO bioloogiline aktiivsusα-d hinnatakse selle tsütotoksilise toime järgi transformeeritud fibroblastide L-929 liinile. Positiivse kontrollina kasutati rekombinantset TNFa ja negatiivse kontrollina söötmes olevaid rakke.

Arvutage tsütotoksiline indeks (CI):

kus a- elusrakkude arv kontrollis; b- elusrakkude arv katses.

Riis. 7.7. MIGROSKRINi skeem – seadmed rakukultuuride migratsiooni kvantifitseerimiseks

Rakud värvitakse värvainega (metüleensinine), mis lisatakse ainult surnud rakkudesse.

Proovi vastastikuse lahjenduse väärtust, mis on vajalik 50% rakulise tsütotoksilisuse saavutamiseks, võetakse TNF aktiivsuse tavapäraseks ühikuks. Proovi eriaktiivsus - aktiivsuse suhe suvalistes ühikutes 1 ml kohta proovis sisalduva valgu kontsentratsiooniga.

Intratsellulaarne tsütokiinide värvimine. Erinevaid tsütokiine tootvate rakkude vahekorra muutus võib peegeldada haiguse patogeneesi ning olla haiguse prognoosi ja ravi hindamise kriteeriumiks.

Intratsellulaarse värvimise meetodil määratakse tsütokiini ekspressioon ühe raku tasemel. Voolutsütomeetria võimaldab teil lugeda konkreetset tsütokiini ekspresseerivate rakkude arvu.

Loetleme intratsellulaarsete tsütokiinide määramise peamised etapid.

Stimuleerimata rakud toodavad väikeses koguses tsütokiine, mis reeglina ei ladestu, seetõttu on intratsellulaarsete tsütokiinide hindamisel oluline samm lümfotsüütide stimuleerimine ja nende produktide rakkudest vabanemise blokeerimine.

Kõige sagedamini kasutatav tsütokiini indutseerija on proteiinkinaas C aktivaator forbol-12-müristaat-13-atsetaat (PMA) kombinatsioonis kaltsiumionofoori ionomütsiiniga (IN). Sellise kombinatsiooni kasutamine põhjustab paljude tsütokiinide sünteesi: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. PMA-IN kasutamise puuduseks on probleem CD4 molekulide tuvastamisel lümfotsüütide pinnal pärast sellist aktiveerimist. Samuti indutseerivad mitogeenid (PHA) T-lümfotsüütide tsütokiinide tootmist. B-rakud ja monotsüüdid stimuleerivad

Mononukleaarseid rakke inkubeeritakse tsütokiinide tootmise indutseerijate ja nende rakusisese transpordi blokaatori, brefeldiin A või monensiini juuresolekul 2-6 tundi.

Seejärel resuspendeeritakse rakud puhverdatud soolalahuses. Fikseerimiseks lisatakse 2% formaldehüüdi, inkubeeritakse 10-15 minutit toatemperatuuril.

Seejärel töödeldakse rakke saponiiniga, mis suurendab rakumembraani läbilaskvust, ja värvitakse tuvastatud tsütokiinidele spetsiifiliste monoklonaalsete antikehadega. Pinnamarkerite (CD4, CD8) eelvärvimine suurendab raku kohta saadava informatsiooni hulka ja võimaldab täpsemalt määrata selle populatsiooni identiteedi.

Eespool kirjeldatud meetodite rakendamisel on mõned piirangud. Seega on nende abiga võimatu analüüsida tsütokiinide sünteesi ühe raku poolt, on võimatu määrata tsütokiini tootvate rakkude arvu alampopulatsioonis, pole võimalik kindlaks teha, kas tsütokiini tootvad rakud ekspresseerivad ainulaadseid markereid, kas erinevaid tsütokiine sünteesivad erinevad rakud või samad. Vastus neile küsimustele saadakse teiste uurimismeetodite abil. Tsütokiine tootvate rakkude esinemissageduse määramiseks populatsioonis kasutatakse piiravate lahjenduste meetodit ja ELISPOT ensüümseotud immunosorbentanalüüsi varianti (vt 4. peatükk).

In situ hübridisatsiooni meetod. Meetod sisaldab:

2) fikseerimine paraformaldehüüdiga;

3) mRNA tuvastamine märgistatud cDNA abil. Mõnel juhul määratakse tsütokiini mRNA sektsioonides, kasutades radioisotoopide PCR-i.

Immunofluorestsents. Meetod sisaldab:

1) elundi külmutamine ja krüostaadi sektsioonide valmistamine;

2) fikseerimine;

3) lõikude töötlemine fluorestseiiniga märgistatud tsütokiinivastaste antikehadega;

4) fluorestsentsi visuaalne jälgimine.

Need tehnikad (hübridiseerimine kohapeal ja immunofluorestsents) on kiired ega sõltu sekreteeritava toote lävikontsentratsioonist. Kuid need ei määra sekreteeritava tsütokiini kogust ja võivad olla tehniliselt keerulised. Mittespetsiifiliste reaktsioonide suhtes on vajalik mitmekülgne hoolikas jälgimine.

Kasutades esitatud meetodeid tsütokiinide hindamiseks, tuvastati patoloogilised protsessid, mis on seotud tsütokiinide süsteemi häiretega erinevatel tasanditel.

Seega on tsütokiinisüsteemi hindamine organismi immuunsüsteemi seisundi iseloomustamiseks äärmiselt oluline. Tsütokiinisüsteemi erinevate tasemete uurimine annab teavet erinevat tüüpi immunokompetentsete rakkude funktsionaalse aktiivsuse, põletikulise protsessi raskusastme, selle ülemineku kohta süsteemsele tasemele ja haiguse prognoosi kohta.

Küsimused ja ülesanded

1. Loetlege tsütokiinide üldised omadused.

2. Esitage tsütokiinide klassifikatsioon.

3. Loetlege tsütokiinisüsteemi põhikomponendid.

4. Loetlege tsütokiini tootvad rakud.

5. Kirjeldage tsütokiini retseptorite perekondi.

6. Millised on tsütokiinivõrgustiku toimimise mehhanismid?

7. Rääkige meile tsütokiinide tootmisest kaasasündinud immuunsüsteemis.

8. Millised on peamised lähenemisviisid tsütokiinisüsteemi igakülgseks hindamiseks?

9. Millised on tsütokiinide testimise meetodid kehavedelikes?

10. Millised on tsütokiinisüsteemi defektid erinevate patoloogiate korral?

11. Millised on peamised meetodid IL-1, IFN, MIF, TNFa bioloogiliseks testimiseks bioloogilistes vedelikes?

12. Kirjeldage tsütokiinide rakusisese sisalduse määramise protsessi.

13. Kirjeldage ühe raku poolt eritatavate tsütokiinide määramise protsessi.

14. Kirjeldage meetodite järjestust, mida kasutatakse defekti tuvastamiseks tsütokiini retseptori tasemel.

15. Kirjeldage meetodite järjestust, mida kasutatakse defekti tuvastamiseks tsütokiini tootvate rakkude tasemel.

16. Millist teavet saab, kui uurida tsütokiinide tootmist mononukleaarsete rakkude kultuuris, vereseerumis?

Põletikueelsed tsütokiinid sünteesitakse, sekreteeritakse ja toimivad oma retseptorite kaudu sihtrakkudel põletiku varases staadiumis, osaledes nii spetsiifilise immuunvastuse vallandamises kui ka selle efektorfaasis. Allpool anname peamiste põletikueelsete tsütokiinide lühikirjelduse.

IL-1 - ühend, mis eritub antigeense stimulatsiooni käigus monotsüütide, makrofaagide, Langerhansi rakkude, dendriitrakkude, keratinotsüütide, aju astrotsüütide ja mikrogliia, endoteeli-, epiteeli-, mesoteelirakkude, fibroblastide, NK-lümfotsüütide, neutrofiilide, B-raku lümfotsüütide, C-rakkude jt poolt. Ligikaudu 10% basofiilidest ja nuumrakkudest toodavad samuti IL-1. Need faktid näitavad, et IL-1 võib erituda otse verre, koevedelikku ja lümfi. Kõik rakud, milles see tsütokiin moodustub, ei ole võimelised IL-1 spontaanseks sünteesiks ning reageerivad selle tootmise ja sekretsiooniga vastusena nakkus- ja põletikutekitajate, mikroobsete toksiinide, erinevate tsütokiinide, aktiivse komplemendi fragmentide, mõne aktiivse vere hüübimisfaktori toimele. , ja teised. A. Bellau piltlikus väljenduses on IL-1 molekulide perekond, mis sobib igaks juhuks. IL-1 jaguneb 2 fraktsiooniks - a ja b, mis on erinevate geenide produktid, kuid millel on sarnased bioloogilised omadused. Mõlemad vormid on moodustatud vastavatest sama molekulmassiga - 31 kDa - lähtemolekulidest. Biokeemiliste transformatsioonide tulemusena moodustuvad lõpuks üheahelalised bioloogiliselt aktiivsed polüpeptiidid molekulmassiga 17,5 kDa. Peaaegu kogu IL-1a jääb rakku või seondub membraaniga. Erinevalt IL-1a-st sekreteerivad rakud aktiivselt IL-1b-d ja inimestel on see IL-1 peamine sekretoorne vorm. Samal ajal on mõlemal interleukiinil sama bioloogilise aktiivsuse spekter ja nad konkureerivad sama retseptoriga seondumise pärast. Siiski tuleb meeles pidada, et IL-1a on peamiselt kohalike kaitsereaktsioonide vahendaja, samas kui IL-1b toimib nii lokaalsel kui ka süsteemsel tasandil. Katsed rekombinantse IL-1-ga on näidanud, et sellel tsütokiinil on vähemalt 50 erinevat funktsiooni ning sihtmärkideks on peaaegu kõigi elundite ja kudede rakud. IL-1 mõju on peamiselt suunatud Th1-le, kuigi see on võimeline stimuleerima Th2- ja B-lümfotsüüte. Luuüdis suureneb selle mõju all mitoosi staadiumis vereloomerakkude arv. IL-1 võib toimida neutrofiilidele, suurendades nende liikumisaktiivsust ja soodustades seega fagotsütoosi. See tsütokiin osaleb endoteeli ja verehüübimissüsteemi funktsioonide reguleerimises, indutseerides prokoagulandi aktiivsust, põletikku soodustavate tsütokiinide sünteesi ja adhesiivsete molekulide ekspressiooni endoteeli pinnal, mis tagavad neutrofiilide ja lümfotsüütide rullimise ja kinnitumise, mille tagajärjel tekivad veresoonkonnas leukopeenia ja neutropeenia. Toimides maksarakkudele, stimuleerib see ägeda faasi valkude moodustumist. Leiti, et IL-1 on lokaalse põletiku ja ägeda faasi vastuse tekke peamine vahendaja organismi tasandil. Lisaks kiirendab see veresoonte kasvu pärast kahjustusi. IL-1 mõjul veres väheneb raua ja tsingi kontsentratsioon ning suureneb naatriumi eritumine. Lõpuks leiti hiljuti, et IL-1 on võimeline suurendama ringleva lämmastikoksiidi kogust. Viimasel on teadaolevalt äärmiselt oluline roll vererõhu reguleerimisel, see soodustab trombotsüütide lagunemist ja võimendab fibrinolüüsi. Tuleb märkida, et IL-1 mõjul suureneb neutrofiilide ja lümfotsüütide rosettide moodustumine trombotsüütidega, mis mängib olulist rolli mittespetsiifilise resistentsuse, immuunsuse ja hemostaasi rakendamisel (Yu.A. Vitkovsky). Kõik see viitab sellele, et IL-1 stimuleerib terve keha kaitsereaktsioonide kompleksi arengut, mille eesmärk on piirata nakkuse levikut, kõrvaldada sissetungivad mikroorganismid ja taastada kahjustatud kudede terviklikkus. IL-1 mõjutab kondrotsüüte, osteoklaste, fibroblaste ja pankrease b-rakke. Selle mõjul suureneb insuliini, ACTH ja kortisooli sekretsioon. IL-1b või TNFa lisamine hüpofüüsi rakkude primaarsele kultuurile vähendab kilpnääret stimuleeriva hormooni sekretsiooni.

IL-1 toodetakse kesknärvisüsteemis, kus see võib toimida edastajana. IL-1 mõjul tekib uni, millega kaasneb a-rütm (aeglase laine uni). Samuti soodustab see närvikasvufaktori sünteesi ja sekretsiooni astrotsüütide poolt. On näidatud, et IL-1 sisaldus suureneb koos lihaste tööga. IL-1 mõjul intensiivistub nii IL-1 enda kui ka IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 ja TNFa tootmine. Viimane indutseerib lisaks IL-1, IL-6 ja IL-8 sünteesi.

Kombinatsioonis TNFa ja IL-6-ga toimivad paljud IL-1 põletikuvastased toimed: palaviku esilekutsumine, anoreksia, mõju vereloomele, osalemine mittespetsiifilises infektsioonivastases kaitses, ägeda faasi valkude sekretsioon ja muud (AS Simbirtsev) .

IL-6- monomeer molekulmassiga 19-34 kDa. Seda toodavad stimuleeritud monotsüüdid, makrofaagid, endoteliotsüüdid, Th2, fibroblastid, hepatotsüüdid, Sertoli rakud, närvisüsteemi rakud, türotsüüdid, Langerhansi saarekeste rakud jne. Koos IL-4 ja IL-10-ga tagab see B-lümfotsüütide kasvu ja diferentseerumist, hõlbustades viimaste üleminekut antikehadesse. Lisaks stimuleerib see, nagu IL-1, hepatotsüüte, mis viib ägeda faasi valkude moodustumiseni. IL-6 toimib vereloome eellasrakkudele ja stimuleerib eelkõige megakarüotsütopoeesi. Sellel ühendil on viirusevastane toime. Seal on IL-6 perekonda kuuluvad tsütokiinid – onkostatiin M (OnM), leukeemiat pärssiv tegur, tsiliaarne neurotroopne faktor, kardiotropiin-1. Nende mõju ei mõjuta immuunsüsteemi. IL-6 perekond avaldab mõju embrüonaalsetele tüvirakkudele, põhjustab müokardi hüpertroofiat, CWA sünteesi, müeloomirakkude ja hematopoeetiliste eellasrakkude proliferatsiooni säilitamist, makrofaagide, osteoklastide, närvirakkude diferentseerumist, trombotsütopoeesi suurenemist jne.

Tuleb märkida, et IL-6 perekonna tsütokiinide ühist retseptori komponenti kodeeriva geeni sihipärase inaktiveerimisega (knockout) hiirtel tekib erinevates kehasüsteemides arvukalt kõrvalekaldeid, mis ei sobi kokku eluga. Koos kardiogeneesi häiretega selliste hiirte embrüodes väheneb järsult erinevate vereloome ridade eellasrakkude arv, samuti tüümuse suuruse järsk vähenemine. Need faktid näitavad IL-6 äärmist tähtsust füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel (A.A.Yarilin).

Sünergistidena toimivate põletikueelsete tsütokiinide vahel on väga keeruline vastastikku reguleeriv seos. Seega inhibeerib IL-6 IL-1 ja TNFa tootmist, kuigi mõlemad need tsütokiinid on IL-6 sünteesi indutseerijad. Lisaks põhjustab hüpotalamuse-hüpofüüsi süsteemile toimiv IL-6 kortisooli tootmise suurenemist, mis pärsib IL-6 geeni, aga ka teiste põletikueelsete tsütokiinide geenide ekspressiooni.

IL-6 perekonda kuuluvad ka onkostatiin M (OnM), millel on äärmiselt lai toimespekter. Selle molekulmass on 28 kDa. Leiti, et OnM on võimeline pärssima mitmete kasvajate kasvu. See stimuleerib IL-6, plasminogeeni aktivaatori, vasoaktiivsete soolepeptiidide ja CWA moodustumist. Eeltoodust järeldub, et OnM peaks mängima olulist rolli immuunvastuse, vere hüübimise ja fibrinolüüsi reguleerimisel.

IL-8 kuulub niinimetatud kemokiinide perekonda, mis stimuleerivad kemotaksist ja kemokineesi ning sisaldavad kuni 60 üksikut ainet, millel on oma struktuursed ja bioloogilised omadused. Küps IL-8 eksisteerib mitmel kujul, mis erinevad polüpeptiidahela pikkuse poolest. Ühe või teise vormi moodustumine sõltub spetsiifilistest proteaasidest, mis toimivad glükosüülimata prekursormolekuli N-otsa. Sõltuvalt sellest, millised rakud sünteesivad IL-8, sisaldab see erinevat arvu aminohappeid. Suurim bioloogiline aktiivsus on IL-8 vormil, mis koosneb 72 aminohappest (A.S. Simbirtsev).

IL-8 vabastavad polümorfonukleaarsed leukotsüüdid, monotsüüdid, makrofaagid, megakarüotsüüdid, neutrofiilid, T-lümfotsüüdid (Tx), fibroblastid, kondrotsüüdid, keratinotsüüdid, endoteeli- ja epiteelirakud, hepatotsüüdid ja mikrogliia.

IL-8 toodetakse vastusena bioloogiliselt aktiivsete ühendite, sealhulgas põletikueelsete tsütokiinide, aga ka IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, erinevate mitogeenide, lipopolüsahhariidide, lektiinide ja viiruse lagunemissaaduste toimele. samas kui põletikuvastased tsütokiinid (IL-4, IL-10) vähendavad IL-8 tootmist. Selle aktiveerimine ja vabanemine toimub ka trombiini, plasminogeeni aktivaatori, streptokinaasi ja trüpsiini mõjul, mis näitab tihedat seost selle tsütokiini funktsiooni ja hemostaatilise süsteemi vahel.

IL-8 süntees viiakse läbi mitmesuguste endogeensete või eksogeensete stiimulite toimel, mis tekivad põletiku fookuses lokaalse kaitsereaktsiooni tekkimisel patogeense aine sissetoomisele. Selles suhtes on IL-8 tootmisel palju sarnasusi teiste põletikueelsete tsütokiinidega. Samal ajal pärsivad IL-8 sünteesi steroidhormoonid IL-4, IL-10, Ifa ja Ifg.

IL-8 stimuleerib neutrofiilide, basofiilide, T-lümfotsüütide (vähemal määral) ja keratinotsüütide kemotaksist ja kemokineesi, põhjustades nende rakkude degranulatsiooni. IL-8 intravaskulaarse süstimise korral tekib kiire ja terav granulotsütopeenia, millele järgneb neutrofiilide taseme tõus perifeerses veres. Sel juhul migreeruvad neutrofiilid maksa, põrna, kopsudesse, kuid mitte kahjustatud kudedesse. Veelgi enam, katse näitas, et IL-8 intravenoosne manustamine blokeerib neutrofiilide migratsiooni põletiku intradermaalsetesse piirkondadesse.

Stimuleerimata neutrofiilides põhjustab IL-8 B12-vitamiiniga seotud valgu vabanemist spetsiifilistest graanulitest ja želatinaasi vabanemist sekretoorsetest vesiikulitest. Asurofiilsete graanulite degranulatsioon neutrofiilides toimub alles pärast nende stimuleerimist tsütokalasiin-B-ga. Samal ajal vabanevad elastaas, müeloperoksidaas, b-glükuronidaas ja teised elastaasid ning leukotsüütide membraanil toimub kleepuvate molekulide ekspressioon, tagades neutrofiilide interaktsiooni endoteeliga. Tuleb märkida, et IL-8 ei ole võimeline esile kutsuma hingamispurske, kuid võib tugevdada teiste kemokiinide mõju sellele protsessile.

IL-8 on võimeline stimuleerima angiogeneesi, aktiveerides proliferatiivseid protsesse endoteelirakkudes ja silelihasrakkudes, mis mängib olulist rolli kudede paranemisel. Lisaks võib see inhibeerida IL-4-indutseeritud IgE sünteesi.

Ilmselt on IL-8-l oluline roll limaskestade lokaalses immuunsuses. Tervetel inimestel leidub seda sülje-, pisara-, higinäärmete sekretsioonis, ternespiimas. On leitud, et inimese hingetoru silelihasrakud on võimelised tootma ebaolulises koguses IL-8. Bradükiniini mõjul suureneb IL-8 tootmine 50 korda. Valgusünteesi blokaatorid inhibeerivad IL-8 sünteesi. On põhjust arvata, et lokaalselt tagab IL-8 kaitsereaktsioonide kulgu, kui see puutub kokku ülemiste hingamisteede patogeense taimestikuga.

IL-12 avastati rohkem kui kümme aastat tagasi, kuid selle omadusi on uuritud alles viimastel aastatel. Seda toodavad makrofaagid, monotsüüdid, neutrofiilid, dendriitrakud ja aktiveeritud B-lümfotsüüdid. Palju vähemal määral on IL-12 võimeline sekreteerima keratinotsüüte, Langerhansi rakke ja puhkeasendis B-lümfotsüüte. Lisaks toodavad seda mikrogliiarakud ja astrotsüüdid, mis nõuab nende koostööd. IL-12 on heterodimeer, mis koosneb kahest kovalentselt seotud polüpeptiidahelast: raskest (45 kDa) ja kergest (35 kDa). Bioloogiline aktiivsus on omane ainult dimeerile, igal üksikul ahelal ei ole sarnaseid omadusi.

Sellest hoolimata jäävad IL-12 peamisteks sihtrakkudeks NK, T-lümfotsüüdid (CD4+ ja CD8+) ning vähemal määral B-lümfotsüüdid. Võib arvata, et see toimib ühenduslülina makrofaagide ja monotsüütide vahel, aidates kaasa Th1 ja tsütotoksiliste rakkude aktiivsuse suurenemisele. Seega annab see tsütokiin olulise panuse viiruse- ja kasvajavastase kaitse tagamisse. IL-12 sünteesi indutseerijad on mikroobsed komponendid ja põletikueelsed tsütokiinid.

IL-12 kuulub hepariini siduvate tsütokiinide hulka, mis viitab selle osalemisele hemostaasi protsessis.

Viimastel aastatel on näidatud, et IL-12 on võtmetähtsusega tsütokiin rakuvahendatud immuunvastuse tugevdamiseks ja tõhusaks infektsioonivastaseks kaitseks viiruste, bakterite, seente ja algloomade vastu. IL-12 kaitsvat toimet infektsioonide korral vahendavad Ifg-sõltuvad mehhanismid, suurenenud lämmastikoksiidi tootmine ja T-rakkude infiltratsioon. Selle peamine toime on aga Ifg sünteesimine. Viimane, kuhjudes kehas, soodustab makrofaagide poolt IL-12 sünteesi. IL-12 kõige olulisem funktsioon on Tx0 diferentseerumise suund Tx1 suunas. Selles protsessis on IL-12 Ifg sünergist. Vahepeal, pärast diferentseerumist, ei vaja Th1 IL-12 kaasstimuleeriva molekulina. Immuunvastuse olemus sõltub suuresti IL-12-st: kas see areneb vastavalt rakulisele või humoraalsele immuunsusele.

IL-12 üks olulisemaid funktsioone on B-lümfotsüütide diferentseerumise järsk tõus antikehi tootvateks rakkudeks. Seda tsütokiini kasutatakse allergiliste ja bronhiaalastmaga patsientide raviks.

IL-12 pärsib IL-4 tootmist mälu T-lümfotsüütide poolt, mida vahendab APC. IL-4 omakorda pärsib IL-12 tootmist ja sekretsiooni.

IL-12 sünergistid on IL-2 ja IL-7, kuigi mõlemad need tsütokiinid toimivad sageli erinevatele sihtrakkudele. IL-12 füsioloogiline antagonist ja inhibiitor on IL-10, tüüpiline põletikuvastane tsütokiin, mis pärsib Th1 funktsiooni.

IL-16- sekreteeritakse T-lümfotsüütide poolt, peamiselt stimuleerivad CD4+, CD8+, eosinofiilid ja bronhide epiteelirakud. IL-16 suurenenud sekretsioon leiti, kui T-rakke töödeldi histamiiniga. Keemiliselt on see homotetrameer molekulmassiga 56 000–80 000 D. See on immunomoduleeriv ja põletikku soodustav tsütokiin, kuna see on monotsüütide ja eosinofiilide, aga ka T-lümfotsüütide (CD4+) kemotaktiline faktor, suurendades nende adhesiooni.

Tuleb märkida, et CD4+ eeltöötlemine rekombinantse IL-16-ga pärsib HIV-1 promootori aktiivsust ligikaudu 60%. Ülaltoodud faktide põhjal on püstitatud hüpotees, mille kohaselt IL-16 toimet HIV-1 replikatsioonile täheldatakse viiruse ekspressiooni tasemel.

IL-17 moodustatud makrofaagide poolt. Praegu on saadud rekombinantset IL-17 ja selle omadusi on uuritud. Selgus, et IL-17 mõjul sünteesivad ja eritavad inimese makrofaagid intensiivselt põletikueelseid tsütokiine – IL-1b ja TNFa, mis on otseses proportsioonis uuritava tsütokiini annusega. Maksimaalset toimet täheldatakse ligikaudu 9 tundi pärast makrofaagide inkubeerimise algust rekombinantse IL-17-ga. Lisaks stimuleerib IL-17 IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1 antagonisti ja stromalüsiini sünteesi ja sekretsiooni. Põletikuvastased tsütokiinid – IL-4 ja IL-10 – tühistavad täielikult IL-17 poolt indutseeritud IL-1b vabanemise, samas kui GTFb 2 ja IL-13 blokeerivad selle toime vaid osaliselt. IL-10 pärsib TNFa indutseeritud vabanemist, samas kui IL-4, IL-13 ja GTFb 2 pärsivad selle tsütokiini sekretsiooni vähemal määral. Esitatud faktid viitavad kindlalt sellele, et IL-17 peaks mängima olulist rolli põletikulise protsessi käivitamisel ja säilitamisel.

IL-18 bioloogiliste mõjude poolest on see IL-12 funktsionaalne kahekordistaja ja sünergist. Peamised IL-18 tootjad on makrofaagid ja monotsüüdid. Selle struktuur on väga sarnane IL-1-ga. IL-18 sünteesitakse inaktiivse prekursormolekuli kujul, mis nõuab IL-1b-d konverteeriva ensüümi osalemist, et muuta see aktiivseks vormiks.

IL-18 mõjul suureneb organismi antimikroobne resistentsus. Bakteriaalse infektsiooni korral reguleerib IL-18 koos IL-12 või Ifa / b-ga Ifg tootmist Tx- ja NK-rakkude poolt ning suurendab Fas ligandi ekspressiooni NK- ja T-lümfotsüütidel. Hiljuti on leitud, et IL-18 on CTL aktivaator. Selle mõjul suureneb CD8+ rakkude aktiivsus pahaloomuliste kasvajate rakkude suhtes.

Nagu IL-12, soodustab IL-18 Th0 eelistatavat diferentseerumist Th1-ks. Lisaks põhjustab IL-18 GM-CSF moodustumist ja suurendab seeläbi leukopoeesi ja inhibeerib osteoklastide moodustumist.

IL-23 koosneb 2 subühikust (p19 ja p40), mis on osa IL-12-st. Eraldi ei ole igal loetletud alaühikul bioloogilist aktiivsust, kuid koos suurendavad nad, nagu IL-12, T-lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust ja Ifg sekretsiooni. IL-23 on vähem tõhus kui IL-12.

TNF on polüpeptiid, mille molekulmass on umbes 17 kDa (koosneb 157 aminohappest) ja jaguneb 2 fraktsiooniks - a ja b. Mõlemal fraktsioonil on ligikaudu samad bioloogilised omadused ja need toimivad samadele raku retseptoritele. TNFa-d sekreteerivad monotsüüdid ja makrofaagid, Th1, endoteeli- ja silelihasrakud, keratinotsüüdid, NK-lümfotsüüdid, neutrofiilid, astrotsüüdid, osteoblastid jne. Vähemal määral toodavad TNFa-d mõned kasvajarakud. TNFa sünteesi peamiseks indutseerijaks on bakteriaalne lipopolüsahhariid, aga ka muud bakteriaalset päritolu komponendid. Lisaks stimuleerivad TNFa sünteesi ja sekretsiooni tsütokiinid: IL-1, IL-2, Ifa ja b, GM-CSF jne. Epsteini-Barri viirus, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb jne.

TNFa bioloogilise aktiivsuse peamine ilming on mõju mõnele kasvajarakkudele. Sel juhul põhjustab TNFa hemorraagilise nekroosi ja varustavate veresoonte tromboosi. Samal ajal suureneb TNFa mõjul monotsüütide, makrofaagide ja NK-rakkude loomulik tsütotoksilisus. Kasvajarakkude taandareng toimub eriti intensiivselt TNFa ja Ifg koosmõjul.

TNFa mõjul inhibeeritakse lipoproteiinkinaasi süntees, mis on üks peamisi lipogeneesi reguleerivaid ensüüme.

TNFa kui tsütotoksilisuse vahendaja on võimeline pärssima rakkude proliferatsiooni, diferentseerumist ja paljude rakkude funktsionaalset aktiivsust.

TNFa on otseselt seotud immuunvastusega. Sellel on äärmiselt oluline roll põletikulise reaktsiooni alguse esimestel hetkedel, kuna see aktiveerib endoteeli ja soodustab kleepuvate molekulide ekspressiooni, mis viib granulotsüütide adhesioonini veresoone sisepinnale. TNFa mõjul toimub leukotsüütide transendoteliaalne migratsioon põletikukoldesse. See tsütokiin aktiveerib granulotsüüte, monotsüüte ja lümfotsüüte ning indutseerib teiste põletikueelsete tsütokiinide tootmist – IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, mis on TNFa sünergistid.

Lokaalselt moodustunud TNFa põletiku või nakkusprotsessi fookuses suurendab järsult monotsüütide ja neutrofiilide fagotsüütilist aktiivsust ning soodustab peroksüdatsiooniprotsesse ning aitab kaasa täieliku fagotsütoosi tekkele. Koos IL-2-ga suurendab TNFa oluliselt T-lümfotsüütide Ifg tootmist.

TNFa osaleb ka hävitamise ja parandamise protsessides, kuna see põhjustab fibroblastide kasvu ja stimuleerib angiogeneesi.

Viimastel aastatel on kindlaks tehtud, et TNF on oluline vereloome regulaator. Otseselt või koos teiste tsütokiinidega mõjutab TNF igat tüüpi hematopoeetilisi rakke.

Selle mõjul paraneb hüpotalamuse-hüpofüüsi-neerupealiste süsteemi, aga ka mõnede endokriinsete näärmete - kilpnääre, munandite, munasarjade, kõhunäärme ja teiste - funktsioon (A.F. Vozianov).

Interferoonid moodustavad peaaegu kõik inimkeha rakud, kuid peamiselt toodavad neid vere- ja luuüdirakud. Interferoonide süntees toimub antigeense stimulatsiooni mõjul, kuigi väga väikeses kontsentratsioonis neid ühendeid võib normaalselt leida luuüdis, bronhides, seedetrakti erinevates organites, nahas ja mujal. Interferooni sünteesi tase on mittejagunevates rakkudes alati kõrgem kui kiiresti jagunevates rakkudes.

Sissejuhatus.

1. Tsütokiinide üldtunnused ja klassifikatsioon.

1.1 Toimemehhanismid.

1.2 Tsütokiinide omadused.

1.3 Tsütokiinide roll organismi füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel.

2. Tsütokiinide eriuuringud.

2.1 Tsütokiinide roll käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis lastel.

2.2 Lämmastikoksiidi ja tsütokiinide roll ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkes.

3. Tsütokiinide määramise meetodid

3.1 Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramine

3.2 Tsütokiinide kvantifitseerimine antikehade abil

3.3 Tsütokiinide määramine ensüümi immuunanalüüsiga.

3.3.1 Kasvajanekroosifaktor-alfa.

3.3.2 Gamma-interferoon.

3.3.3 Interleukiin-4

3.3.4 Interleukiin-8

3.3.5 Interleukiin-1 retseptori antagonist.

3.3.6 Alfa-interferoon.

3.3.7 Alfa-IFN-vastased antikehad.

4. Tsütokiinidel põhinevad immunotroopsed ravimid.

Kasutatud kirjanduse loetelu.

Järeldus.

Sissejuhatus.

Esimeste tsütokiinide kirjeldamisest on veidi aega möödas. Nende uurimistöö viis aga ulatusliku teadmiste osa eraldamiseni - tsütokinoloogia, mis on erinevate teadmiste valdkondade lahutamatu osa, ja ennekõike immunoloogia, mis andis nende vahendajate uurimisele võimsa tõuke. Tsütokineoloogia läbib kõiki kliinilisi distsipliine, alates haiguste etioloogiast ja patogeneesist kuni erinevate patoloogiliste seisundite ennetamise ja ravini. Järelikult peavad teadlased ja arstid navigeerima reguleerivate molekulide mitmekesisuses ja omama selget arusaama iga tsütokiini rollist uuritavates protsessides. Kõik immuunsüsteemi rakud täidavad teatud funktsioone ja töötavad selgelt koordineeritud interaktsioonis, mille tagavad spetsiaalsed bioloogiliselt aktiivsed ained - tsütokiinid - immuunreaktsioonide regulaatorid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mille abil saavad erinevad immuunsüsteemi rakud omavahel infot vahetada ja tegevusi koordineerida. Rakupinna retseptoritele mõjuvate tsütokiinide kogum ja kogus - "tsütokiinikeskkond" - kujutavad endast interakteeruvate ja sageli muutuvate signaalide maatriksit. Need signaalid on keerulised tsütokiini retseptorite suure mitmekesisuse ja asjaolu tõttu, et iga tsütokiin võib aktiveerida või alla suruda mitmeid protsesse, sealhulgas oma sünteesi ja teiste tsütokiinide sünteesi, samuti tsütokiini retseptorite moodustumist ja välimust. raku pinnal. Meie töö eesmärgiks on uurida tsütakiine, nende funktsioone ja omadusi ning nende võimalikku rakendamist meditsiinis. Tsütokiinid on väikesed valgud (molekulmass 8 kuni 80 KDa), mis toimivad autokriinselt (st neid tootvale rakule) või parakriinselt (lähedal asuvatele rakkudele). Nende väga aktiivsete molekulide moodustumine ja vabanemine on lühiajaline ja rangelt reguleeritud.

Kirjanduse arvustus.

Tsütokiinide üldised omadused ja klassifikatsioon.

Tsütokiinid on rühm rakkudevahelise interaktsiooni polüpeptiidseid vahendajaid, mis osalevad peamiselt organismi kaitsereaktsioonide moodustamises ja reguleerimises patogeenide sissetoomise ja koe terviklikkuse häirimise ajal, samuti mitmete normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimises. Tsütokiine saab eraldada uude sõltumatusse regulatsioonisüsteemi, mis eksisteerib koos närvi- ja endokriinsüsteemidega homöostaasi säilitamiseks, ning kõik kolm süsteemi on omavahel tihedalt seotud ja üksteisest sõltuvad. Viimase kahe aastakümne jooksul on enamiku tsütokiinide geene kloonitud ja saadud rekombinantseid analooge, mis kordavad täielikult looduslike molekulide bioloogilisi omadusi. Nüüd on teada rohkem kui 200 tsütokiinide perekonda kuuluvat ainet. Tsütokiinide uurimise ajalugu sai alguse 20. sajandi 40. aastatel. Siis kirjeldati kahektiini, vereseerumis esineva teguri, mis võib põhjustada kahheksiat või kehakaalu langust, esimesi toimeid. Seejärel see vahendaja eraldati ja näidati olevat identne kasvaja nekroosifaktoriga (TNF). Sel ajal toimus tsütokiinide uurimine põhimõttel tuvastada mis tahes üks bioloogiline efekt, millest sai alguse vastava vahendaja nimetus. Nii kutsuti 50ndatel interferooni (IFN) selle võime tõttu häirida või suurendada resistentsust korduva viirusinfektsiooni ajal. Interleukiin-1 (IL-1) nimetati algselt ka endogeenseks pürogeeniks, erinevalt bakteriaalsetest lipopolüsahhariididest, mida peeti eksogeenseteks pürogeenideks. Tsütokiinide uurimise järgmine etapp, mis ulatub 60–70 aasta taha, on seotud looduslike molekulide puhastamise ja nende bioloogilise toime põhjaliku iseloomustamisega. Selleks ajaks on avastatud T-rakkude kasvufaktor, mida nüüd tuntakse IL-2 nime all, ja mitmed teised molekulid, mis stimuleerivad T-, B-lümfotsüütide ja muud tüüpi leukotsüütide kasvu ja funktsionaalset aktiivsust. 1979. aastal pakuti nende tähistamiseks ja süstematiseerimiseks terminit "interleukiinid", st vahendajad, mis suhtlevad leukotsüütide vahel. Üsna pea sai aga selgeks, et tsütokiinide bioloogiline toime ulatub immuunsüsteemist palju kaugemale ja seetõttu muutus vastuvõetavamaks varem pakutud termin "tsütokiinid", mis on säilinud tänapäevani. Revolutsiooniline pööre tsütokiinide uurimisel toimus 1980. aastate alguses pärast hiire ja inimese interferooni geenide kloonimist ning rekombinantsete molekulide tootmist, mis kordasid täielikult looduslike tsütokiinide bioloogilisi omadusi. Pärast seda oli võimalik kloonida teiste selle perekonna vahendajate geene. Oluline verstapost tsütokiinide ajaloos oli rekombinantsete interferoonide ja eriti rekombinantse IL-2 kliiniline kasutamine vähi raviks. 90ndaid iseloomustasid tsütokiiniretseptorite subühikustruktuuri avastamine ja "tsütokiinivõrgustiku" mõiste kujunemine ning XXI sajandi algus - paljude uute tsütokiinide avastamine geneetilise analüüsi abil. Tsütokiinide hulka kuuluvad interferoonid, kolooniaid stimuleerivad faktorid (CSF), kemokiinid, mis transformeerivad kasvufaktoreid; kasvaja nekroosi faktor; ajalooliselt väljakujunenud seerianumbritega interleukiinid ja mõned muud endogeensed vahendajad. Interleukiinid, mille seerianumbrid algavad 1-st, ei kuulu samasse tsütokiinide alarühma, mis on seotud ühiste funktsioonidega. Need võib omakorda jagada põletikueelseteks tsütokiinideks, lümfotsüütide kasvu- ja diferentseerumisfaktoriteks ning individuaalseteks regulatoorseteks tsütokiinideks. Nimetus "interleukiin" määratakse äsja avastatud vahendajale, kui on täidetud järgmised Rahvusvahelise Immunoloogiaühingute Liidu nomenklatuurikomitee poolt välja töötatud kriteeriumid: molekulaarne kloonimine ja uuritava faktori geeni ekspressioon, unikaalse nukleotiidi olemasolu. ja vastavat aminohappejärjestust, saades neutraliseerivad monoklonaalsed antikehad. Lisaks peavad uut molekuli tootma immuunsüsteemi rakud (lümfotsüüdid, monotsüüdid või muud tüüpi leukotsüüdid), omama olulist bioloogilist funktsiooni immuunvastuse reguleerimisel, aga ka lisafunktsioone, mistõttu see ei saa anda funktsionaalne nimi. Lõpuks tuleks uue interleukiini loetletud omadused avaldada eelretsenseeritavas teadusajakirjas. Tsütokiinide klassifitseerimist saab läbi viia vastavalt nende biokeemilistele ja bioloogilistele omadustele, samuti retseptoritüüpidele, mille kaudu tsütokiinid oma bioloogilisi funktsioone täidavad. Tsütokiinide klassifikatsioon struktuuri järgi (tabel 1) ei võta arvesse mitte ainult aminohappejärjestust, vaid eelkõige valgu tertsiaarset struktuuri, mis peegeldab täpsemalt molekulide evolutsioonilist päritolu.

Tabel 1. Tsütokiinide klassifikatsioon struktuuri järgi.

Geeni kloonimine ja tsütokiini retseptorite struktuuri analüüs näitas, et nii nagu tsütokiinid ise, võib ka neid molekule jagada mitmeks tüübiks vastavalt aminohappejärjestuste sarnasusele ja rakuväliste domeenide organiseerituse iseärasustele (tabel 2). Ühte suurimat tsütokiini retseptorite perekonda nimetatakse hematopoetiini retseptorite perekonnaks või I tüüpi tsütokiini retseptorite perekonnaks. Selle retseptorite rühma struktuurseks tunnuseks on 4 tsüsteiini ja aminohappejärjestuse Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) olemasolu molekulis, mis paiknevad rakumembraanist lühikese vahemaa kaugusel. II klassi tsütokiini retseptorid interferoonide ja IL-10-ga. Mõlemal esimest tüüpi retseptoritel on üksteisega homoloogia. Järgmised retseptorite rühmad vahendavad interaktsiooni tuumori nekroosifaktori perekonna ja IL-1 perekonna tsütokiinidega. Praegu on teada, et rohkem kui 20 erinevat kemokiini retseptorit interakteeruvad erineva afiinsusastmega ühe või enama kemokiinide perekonna ligandiga. Kemokiini retseptorid kuuluvad rodopsiini retseptorite superperekonda, neil on 7 transmembraanset domeeni ja nad juhivad signaali G-valkude osalusel.

Tabel 2. Tsütokiini retseptorite klassifikatsioon.

Paljud tsütokiini retseptorid koosnevad 2-3 subühikust, mida kodeerivad erinevad geenid ja mida ekspresseeritakse sõltumatult. Sel juhul eeldab kõrge afiinsusega retseptori moodustamine kõigi allüksuste samaaegset interaktsiooni. Sellise tsütokiini retseptorite organiseerituse näiteks on IL-2 retseptori kompleksi struktuur. Üllatav oli asjaolu, et IL-2 retseptori kompleksi üksikud subühikud on IL-2 ja mõnede teiste tsütokiinide jaoks ühised. Seega on β-ahel samaaegselt IL-15 retseptori komponent ja γ-ahel toimib IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-retseptorite ühise alaühikuna. 15 ja IL-21. See tähendab, et kõik eelnimetatud tsütokiinid, mille retseptorid koosnevad samuti 2-3 individuaalsest polüpeptiidist, kasutavad oma retseptorite komponendina γ-ahelat, pealegi signaaliülekande eest vastutavat komponenti. Kõigil juhtudel tagavad iga tsütokiini interaktsiooni spetsiifilisuse teised struktuurilt erinevad subühikud. Tsütokiini retseptorite hulgas on veel 2 levinumat retseptori alaühikut, mis juhivad signaali pärast interaktsiooni erinevate tsütokiinidega. See on tavaline retseptori subühik βc (gp140) IL-3, IL-5 ja GM-CSF retseptorite jaoks, samuti gp130 retseptori alaühik, mis on ühine IL-6 perekonna liikmetele. Ühise signaaliülekande alaühiku olemasolu tsütokiini retseptorites on üks nende klassifitseerimise lähenemisviise, kuna see võimaldab leida ühist nii ligandide struktuuris kui ka bioloogilistes mõjudes.

Tabelis 3 on näidatud kombineeritud struktuurne ja funktsionaalne klassifikatsioon, kus kõik tsütokiinid on jagatud rühmadesse, võttes eelkõige arvesse nende bioloogilist aktiivsust, samuti tsütokiini molekulide ja nende retseptorite ülaltoodud struktuurilisi iseärasusi.

Tabel 3. Tsütokiinide struktuurne ja funktsionaalne klassifikatsioon.

	Tsütokiinide perekonnad	Alarühmad ja ligandid	Põhilised bioloogilised funktsioonid
	I tüüpi interferoonid	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Viirusevastane toime, antiproliferatiivne, immunomoduleeriv toime
	Hematopoeetiliste rakkude kasvufaktorid	Tüvirakufaktor (komplekt-ligand, terasfaktor), Flt-3 ligand, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandid: IL-3, IL-5, GM-KSF	Erinevat tüüpi eellasrakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise stimuleerimine luuüdis, hematopoeesi aktiveerimine Erütropoetiin, trombopoetiin
	Interleukiin-1 ja FRF-i superperekond	FRF perekond: Hapu FRF, tavaline FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) perekond: IL-1α, IL-1β, IL-1 retseptori antagonist, IL-18, IL-33 jne.	Fibroblastide ja epiteelirakkude proliferatsiooni aktiveerimine Põletikuvastane toime, spetsiifilise immuunsuse aktiveerimine
	Kasvaja nekroosifaktori perekond	TNF, lümfotoksiinid α ja β, Fas ligand jne.	Põletikuvastane toime, apoptoosi reguleerimine ja immunokompetentsete rakkude rakkudevaheline interaktsioon
	Interleukiin-6 perekond	Gp130 ligandid: IL-6, IL-11, IL-31, onkostatiin-M, kardiotropiin-1, leukeemiat inhibeeriv faktor, tsiliaarne neurotroofne faktor	Põletikuvastane ja immunoregulatoorne toime
	Kemokiinid	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Erinevat tüüpi leukotsüütide kemotaksise reguleerimine
	Interleukiin-10 perekond	IL-10,19,20,22,24,26	Immunosupressiivne toime
	Interleukiin-12 perekond		Abistaja T-lümfotsüütide diferentseerumise reguleerimine
	T-abistaja kloonide tsütokiinid ja lümfotsüütide regulatsioonifunktsioonid	T-abilised tüüp 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-abilised tüüp 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 retseptori y-ahela ligandid: IL-7 TSLP	Rakulise immuunsuse aktiveerimine Humoraalse immuunsuse aktiveerimine, immunomoduleeriv toime Erinevat tüüpi lümfotsüütide, DC, NK-rakkude, makrofaagide jne diferentseerumise, proliferatsiooni ja funktsionaalsete omaduste stimuleerimine.
	Interleukin 17 perekond	IL-17A, B, C, D, E, F	Põletikueelsete tsütokiinide sünteesi aktiveerimine
	Närvikasvufaktori, trombotsüütide kasvufaktori ja transformeerivate kasvufaktorite supersugukond	Närvikasvufaktorite perekond: NGF, aju neurotroofne faktor Trombotsüütidest pärinevad kasvufaktorid (PDGF), angiogeensed kasvufaktorid (VEGF) TRF perekond: TPPb, aktiviinid, inhibiinid, sõlmed, luu morfogeensed valgud, Mulleri inhibeeriv aine	Põletiku, angiogeneesi, neuronite funktsiooni, embrüonaalse arengu ja kudede regeneratsiooni reguleerimine
	Epidermi kasvufaktorite perekond	ERF, TRFα jne.
	Insuliinitaoliste kasvufaktorite perekond	IRF-I, IRF-II	Erinevate rakutüüpide proliferatsiooni stimuleerimine

Esimesse rühma kuuluvad I tüüpi interferoonid ja see on ülesehituselt kõige lihtsam, kuna kõigil selles sisalduvatel molekulidel on sarnane struktuur ja paljudes aspektides samad viirusevastase kaitsega seotud funktsioonid. Teise rühma kuulusid hematopoeetiliste rakkude kasvu- ja diferentseerumisfaktorid, mis stimuleerisid vereloome eellasrakkude arengut, alustades tüvirakust. Sellesse rühma kuuluvad tsütokiinid, mis on kitsalt spetsiifilised hematopoeetiliste rakkude üksikute diferentseerumisliinide suhtes (erütropoetiin, trombopoetiin ja IL-7, mis toimib tuberkuloosi lümfotsüütide prekursoritele), aga ka laiema bioloogilise aktiivsuse spektriga tsütokiine, nagu nt. IL-3, IL-11, kolooniaid stimuleerivad tegurid. Selles tsütokiinide rühmas on molekulide struktuurilise ülesehituse sarnasuse tõttu eraldatud gp140 ligandid, millel on ühine retseptor-subühik, samuti trombopoetiin ja erütropoetiin. FGF ja IL-1 superperekondade tsütokiinidel on kõrge homoloogia ja sarnane valkude struktuur, mis kinnitab ühist päritolu. Sellest hoolimata erineb FGF bioloogilise aktiivsuse ilmingute poolest paljudes aspektides IL-1 perekonna agonistidest. IL-1 molekulide perekond kannab praegu lisaks funktsionaalsetele nimetustele tähistusi F1-F11, kus F1 vastab IL-1α-le, F2 vastab IL-1β-le, F3 vastab IL-1 retseptori antagonistile, F4 vastab IL- 18. Ülejäänud pereliikmed on avastatud geneetilise analüüsi tulemusena ja neil on üsna kõrge homoloogia IL-1 molekulidega, kuid nende bioloogilised funktsioonid pole täielikult välja selgitatud. Täiendavad tsütokiinide rühmad hõlmavad IL-6 perekondi (ühise retseptori alaühiku gp130 ligandid), tuumori nekroosifaktorit ja kemokiine, mis on esindatud suurima arvu üksikute liganditega ja on vastavates peatükkides täielikult loetletud. Kasvajanekroosifaktori perekond moodustub peamiselt ligandide ja nende retseptorite struktuuri sarnasuste põhjal, mis koosneb kolmest mittekovalentselt seotud identsest subühikust, mis moodustavad bioloogiliselt aktiivseid molekule. Samas kuuluvad sellesse perekonda bioloogiliste omaduste poolest üsna erineva aktiivsusega tsütokiinid. Näiteks TNF on üks silmatorkavamaid põletikuvastaseid tsütokiine, Fas ligand indutseerib sihtrakkude apoptoosi ja CD40 ligand annab stimuleeriva signaali T- ja B-lümfotsüütide rakkudevahelise interaktsiooni ajal. Sellised erinevused struktuurselt sarnaste molekulide bioloogilises aktiivsuses on peamiselt määratud nende retseptorite ekspressiooni ja struktuuri tunnustega, näiteks rakusisese "surma" domeeni olemasolu või puudumine, mis määrab raku apoptoosi. Viimastel aastatel on ka perekonnad IL-10 ja IL-12 täienenud uute liikmetega, kes on saanud interleukiinide seerianumbrid. Sellele järgneb väga keeruline tsütokiinide rühm, mis on T-helper-lümfotsüütide funktsionaalse aktiivsuse vahendajad. Sellesse rühma kuulumine põhineb kahel põhiprintsiibil: 1) kuulumine Th1 või Th2 poolt sünteesitavate tsütokiinide hulka, mis määrab valdavalt humoraalset või rakulist tüüpi immunoloogiliste reaktsioonide väljakujunemise, 2) ühise retseptori alaühiku – gammaahela olemasolu. IL-2 retseptori kompleksi. Gammaahela ligandidest eraldati täiendavalt IL-4, millel on ka IL-13-ga ühised retseptori alaühikud, mis määrab suuresti nende tsütokiinide osaliselt kattuva bioloogilise aktiivsuse. IL-7, millel on TSLP-ga ühine retseptorite struktuur, eraldati sarnasel viisil. Ülaltoodud klassifikatsiooni eelised on seotud tsütokiinide bioloogiliste ja biokeemiliste omaduste samaaegse arvestamisega. Selle lähenemisviisi teostatavust kinnitab praegu uute tsütokiinide avastamine genoomi geneetilise analüüsi abil ja struktuurilt sarnaste geenide otsimine. Tänu sellele meetodile on oluliselt laienenud I tüüpi interferoonide perekond IL-1, IL-10, IL-12, on tekkinud uus IL-17 analoogsete tsütokiinide perekond, mis koosneb juba 6 liikmest. Ilmselt toimub lähitulevikus uute tsütokiinide tekkimine palju aeglasemalt, kuna inimese genoomi analüüs on peaaegu lõppenud. Tõenäoliselt on muutused võimalikud ligandi-retseptori interaktsiooni variantide ja bioloogiliste omaduste selgitamise tõttu, mis võimaldab tsütokiinide klassifikatsioonil omandada lõpliku vormi.

Toimemehhanismid.

B. Tsütokiinide retseptorid. Tsütokiinid on hüdrofiilsed signaalained, mille toimet vahendavad plasmamembraani välisküljel asuvad spetsiifilised retseptorid. Tsütokiinide seondumine retseptoriga (1) viib läbi mitmete vaheetappide (2-5) teatud geenide transkriptsiooni aktiveerimiseni (6). Tsütokiini retseptoritel endil ei ole türosiinkinaasi aktiivsust (mõnede eranditega) . Pärast tsütokiiniga (1) seondumist seostuvad retseptori molekulid, moodustades homodimeerid. Lisaks võivad nad signaaliülekandevalkudega [STP-dega] seostudes moodustada heterodimeere või stimuleerida BPS-ide endi dimeriseerumist (2). I klassi tsütokiini retseptorid võivad agregeeruda kolme tüüpi BPS-iga: valgud GP130, βc või γc. Need abivalgud ise ei ole võimelised tsütokiine siduma, küll aga teostavad signaaliülekannet türosiinkinaasidele (3) Paljude tsütokiinide samasugused bioloogilise aktiivsuse spektrid on seletatavad sellega, et erinevad tsütokiini-retseptori kompleksid võivad aktiveerida sama BPS-i.

Tsütokiinide signaaliülekande näitena näitab diagramm, kuidas IL-6 (IL-6) retseptor pärast ligandiga (1) seondumist stimuleerib GP130 (2) dimeriseerumist. Membraanvalgu dimeer GP130 seob ja aktiveerib YK perekonna tsütoplasmaatilist türosiinkinaasi (kahe aktiivse saidiga Januse kinaasid) (3). Januse kinaasid fosforüleerivad tsütokiini retseptoreid, BPS-i ja mitmesuguseid tsütoplasma valke, mis teostavad edasist signaaliülekannet; nad fosforüülivad ka transkriptsioonifaktoreid – signaalimuundureid ja transkriptsiooni aktivaatoreid [PSAT (STAT, inglise keelest signal transducers and activators of transscription)]. Need valgud kuuluvad BPS perekonda, mille struktuuris on SH3 domeen, mis tunneb ära fosfotürosiini jääke (vt lk 372). Seetõttu on neil omadus seostuda fosforüülitud tsütokiini retseptoriga. Kui seejärel toimub PSAT-molekuli (4) fosforüülimine, muutub faktor aktiivseks vormiks ja moodustab dimeeri (5). Pärast tuumasse translokatsiooni seondub dimeer transkriptsioonifaktorina initsieeritud geeni promootoriga (vt lk 240) ja indutseerib selle transkriptsiooni (6) Mõned tsütokiini retseptorid võivad proteolüüsi tõttu kaotada ekstratsellulaarse ligandi siduva domeeni (pole skeemil näidatud). Domeen siseneb verre, kus konkureerib seondumisel tsütokiiniga, mis vähendab tsütokiinide kontsentratsiooni veres.Koos moodustavad tsütokiinid multifunktsionaalse toimega regulatsioonivõrgustiku (tsütokiinikaskaadi). Tsütokiinide kattumine toob kaasa asjaolu, et paljude nende toimel täheldatakse sünergismi ja mõned tsütokiinid on antagonistid. Sageli võib kehas jälgida kogu tsütokiinide kaskaadi koos keeruka tagasisidega.

Tsütokiinide omadused.

Tsütokiinide üldised omadused, mille tõttu saab neid vahendajaid ühendada iseseisvaks regulatsioonisüsteemiks.

1. Tsütokiinid on polüpeptiidid või valgud, sageli glükosüülitud, enamiku nende MW on 5 kuni 50 kDa. Tsütokiinide bioloogiliselt aktiivsed molekulid võivad koosneda ühest, kahest, kolmest või enamast identsest või erinevast subühikust.

2. Tsütokiinidel puudub bioloogilise toime antigeenne spetsiifilisus. Need mõjutavad kaasasündinud ja omandatud immuunsuse reaktsioonides osalevate rakkude funktsionaalset aktiivsust. Sellegipoolest on tsütokiinid T- ja B-lümfotsüütidele toimides võimelised stimuleerima immuunsüsteemis antigeeni poolt indutseeritud protsesse.

3. Tsütokiini geenidel on kolm ekspressioonivõimalust: a) staadiumispetsiifiline ekspressioon teatud embrüonaalse arengu staadiumides, b) konstitutiivne ekspressioon mitmete normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimiseks, c) enamikule tsütokiinidele omane indutseeritav ekspressioonitüüp. Tõepoolest, rakud ei sünteesi enamikku tsütokiine väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust. Tsütokiini geenide ekspressioon algab vastusena patogeenide tungimisele organismi, antigeensele ärritusele või koekahjustusele. Patogeeniga seotud molekulaarstruktuurid on ühed kõige tugevamad põletikueelsete tsütokiinide sünteesi indutseerijad. T-raku tsütokiinide sünteesi käivitamiseks on vajalik rakkude aktiveerimine spetsiifilise antigeeniga T-raku antigeeni retseptori osalusel.

4. Tsütokiine sünteesitakse vastusena stimulatsioonile lühikese aja jooksul. Süntees katkeb mitmesuguste autoregulatsioonimehhanismide, sealhulgas RNA suurenenud ebastabiilsuse ning prostaglandiinide, kortikosteroidhormoonide ja muude tegurite poolt vahendatud negatiivse tagasiside tõttu.

5. Ühte ja sama tsütokiini võivad histogeneetilise päritolu poolest toota erinevat tüüpi keharakud erinevates organites.

6. Tsütokiine võib seostada neid sünteesivate rakkude membraanidega, mis omavad membraani kujul kogu bioloogilise aktiivsuse spektrit ja avaldavad oma bioloogilist toimet rakkudevahelise kontakti ajal.

7. Tsütokiinide bioloogilisi toimeid vahendavad spetsiifilised rakulised retseptori kompleksid, mis seovad tsütokiine väga kõrge afiinsusega ning üksikud tsütokiinid võivad kasutada ühiseid retseptori alaühikuid. Tsütokiini retseptorid võivad eksisteerida lahustuval kujul, säilitades võime ligandide siduda.

8. Tsütokiinidel on pleiotroopne bioloogiline toime. Sama tsütokiin võib toimida mitut tüüpi rakkudele, põhjustades olenevalt sihtrakkude tüübist erinevaid toimeid (joonis 1). Tsütokiinide pleiotroopse toime tagab tsütokiini retseptorite ekspressioon erineva päritolu ja funktsiooniga rakutüüpidel ning signaalijuhtivus, kasutades mitmeid erinevaid rakusiseseid sõnumitoojaid ja transkriptsioonifaktoreid.

9. Tsütokiine iseloomustab bioloogilise toime vahetatavus. Mitmed erinevad tsütokiinid võivad põhjustada sama bioloogilist toimet või omada sarnast toimet. Tsütokiinid indutseerivad või pärsivad enda, teiste tsütokiinide ja nende retseptorite sünteesi.

10. Vastuseks aktiveerimissignaalile sünteesivad rakud samaaegselt mitut tsütokiini, mis osalevad tsütokiinivõrgustiku moodustamises. Bioloogilised toimed kudedes ja organismi tasandil sõltuvad teiste sünergilise, aditiivse või vastupidise toimega tsütokiinide olemasolust ja kontsentratsioonist.

11. Tsütokiinid võivad mõjutada sihtrakkude proliferatsiooni, diferentseerumist ja funktsionaalset aktiivsust.

12. Tsütokiinid toimivad rakkudele erineval viisil: autokriinne – seda tsütokiini sünteesival ja sekreteerival rakul; parakriin - rakkudel, mis asuvad tootjaraku lähedal, näiteks põletikukoldes või lümfoidorganis; endokriinne - kaugel mis tahes elundite ja kudede rakkudest pärast vereringesse sisenemist. Viimasel juhul sarnaneb tsütokiinide toime hormoonide toimega (joonis 2).

Riis. 1. Sama tsütokiini võivad toota erinevat tüüpi rakud organismis erinevates histogeneetilise päritoluga organites ja toimida mitut tüüpi rakkudele, põhjustades erinevat mõju olenevalt sihtrakkude tüübist.

Riis. 2. Tsütokiinide bioloogilise toime avaldumise kolm varianti.

Ilmselt toimus tsütokiinide regulatsioonisüsteemi moodustumine evolutsiooniliselt koos mitmerakuliste organismide arenguga ja see oli tingitud vajadusest moodustada rakkudevahelise interaktsiooni vahendajaid, mis võivad hõlmata hormoone, neuropeptiide, adhesioonimolekule ja mõnda muud. Seoses sellega on tsütokiinid kõige mitmekülgsem reguleerimissüsteem, kuna nad on võimelised avaldama bioloogilist aktiivsust nii kaugel pärast sekretsiooni tootva raku poolt (lokaalselt kui süsteemselt) kui ka rakkudevahelise kontakti ajal, olles bioloogiliselt aktiivsed membraani kujul. Nii erineb tsütokiinide süsteem adhesioonimolekulidest, mis täidavad kitsamaid funktsioone ainult rakkude otseses kontaktis. Samal ajal erineb tsütokiinide süsteem hormoonidest, mida sünteesivad peamiselt spetsiaalsed organid ja mis toimivad pärast vereringesüsteemi sisenemist.

Tsütokiinide roll keha füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel.

Tsütokiinide rolli keha füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel võib jagada neljaks põhikomponendiks:

1. Embrüogeneesi reguleerimine, elundite rajamine ja areng, sh. immuunsüsteemi organid.

2. Teatud normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimine.

3. Organismi kaitsereaktsioonide reguleerimine lokaalsel ja süsteemsel tasandil.

4. Kudede regeneratsiooniprotsesside reguleerimine.

Individuaalsete tsütokiinide geenide ekspressioon toimub teatud embrüonaalse arengu etappides staadiumispetsiifiliselt. Tüvirakufaktor, transformeerivad kasvufaktorid, TNF perekonna tsütokiinid ja kemokiinid reguleerivad erinevate rakkude diferentseerumist ja migratsiooni ning immuunsüsteemi organite loomist. Pärast seda ei pruugi mõne tsütokiini süntees taastuda, samas kui teised jätkavad normaalsete füsioloogiliste protsesside reguleerimist või osalevad kaitsereaktsioonide tekkes.

Hoolimata asjaolust, et enamik tsütokiine on tüüpilised indutseeritavad vahendajad ja postnataalsel perioodil ei sünteesi rakud väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust, ei kuulu mõned tsütokiinid selle reegli alla. Geenide konstitutiivse ekspressiooni tulemusena sünteesitakse osa neist pidevalt ja on ringluses piisavalt suurtes kogustes, reguleerides teatud rakutüüpide proliferatsiooni ja diferentseerumist kogu elu jooksul. Seda tüüpi funktsioonide füsioloogilise reguleerimise näited tsütokiinide poolt võivad olla pidevalt kõrge erütropoetiini tase ja mõned CSF-d, et tagada vereloome. Organismi kaitsereaktsioonide reguleerimine tsütokiinide poolt ei toimu mitte ainult immuunsüsteemi sees, vaid ka kaitsereaktsioonide korraldamise kaudu kogu organismi tasandil, reguleerides peaaegu kõiki põletiku ja immuunvastuse tekke aspekte. See funktsioon, mis on kogu tsütokiinisüsteemi jaoks kõige olulisem, on seotud tsütokiinide bioloogilise toime kahe peamise suunaga - kaitse nakkusetekitajate eest ja kahjustatud kudede taastamine. Tsütokiinid reguleerivad peamiselt lokaalsete kaitsereaktsioonide teket kudedes erinevat tüüpi vererakkude, endoteeli, sidekoe ja epiteeli osalusel. Kaitse kohalikul tasandil areneb tüüpilise põletikulise reaktsiooni moodustumisega selle klassikaliste ilmingutega: hüperemia, turse areng, valu ja talitlushäired. Tsütokiinide süntees algab siis, kui patogeenid sisenevad kudedesse või rikutakse nende terviklikkust, mis tavaliselt toimub paralleelselt. Tsütokiinide tootmine on rakulise vastuse lahutamatu osa, mis on seotud erinevate patogeenide sarnaste struktuurikomponentide müelomonotsüütide seeria rakkude poolt äratundmisega, mida nimetatakse patogeeniga seotud molekulaarseteks mustriteks. Selliste patogeensete struktuuride näideteks on gramnegatiivsete bakterite lipopolüsahhariidid, grampositiivsete mikroorganismide peptidoglükaanid, flagelliin või DNA, mis on rikas CpolyG järjestuste poolest, mis on tüüpiline igat tüüpi bakterite DNA-le. Leukotsüüdid ekspresseerivad vastavaid mustri äratundmise retseptoreid, mida nimetatakse ka Toll-likeks retseptoriteks (TLR) ja mis on spetsiifilised mikroorganismide teatud struktuurimustrite suhtes. Pärast mikroorganismide või nende komponentide interaktsiooni TLR-idega vallandub rakusisene signaaliülekande kaskaad, mis viib leukotsüütide funktsionaalse aktiivsuse ja tsütokiini geenide ekspressiooni suurenemiseni.

TLR-i aktiveerimine viib kahe peamise tsütokiinirühma sünteesini: põletikueelsed tsütokiinid ja I tüüpi interferoonid, peamiselt IFNα / β. Põletikulise reaktsiooni väljakujunemine ja hoolduses osalevate eri tüüpi rakkude aktiveerimise ventilaatorilaadne laienemine. ja põletiku reguleerimine, sealhulgas igat tüüpi leukotsüüdid, dendriitrakud, T- ja B-lümfotsüüdid, NK-rakud, endoteeli- ja epiteelirakud, fibroblastid ja teised. See annab järjekindlad etapid põletikulise vastuse arengus, mis on kaasasündinud immuunsuse rakendamise peamine mehhanism. Lisaks algab IL-12 perekonna tsütokiinide süntees dendriitrakkude poolt, stimuleerides T-abistaja lümfotsüütide diferentseerumist, mis toimib omamoodi sillana spetsiifiliste immuunreaktsioonide tekke algusesse, mis on seotud spetsiifiliste rakkude äratundmisega. mikroorganismide antigeensed struktuurid.

Teine mitte vähem oluline IFN-i sünteesiga seotud mehhanism näeb ette viirusevastase kaitse rakendamise. I tüüpi interferoonidel on neli peamist bioloogilist omadust:

1. Otsene viirusevastane toime, blokeerides transkriptsiooni.

2. Rakkude proliferatsiooni pärssimine, mis on vajalik viiruse leviku tõkestamiseks.

3. NK-rakkude funktsioonide aktiveerimine, millel on võime lüüsida viirusega nakatunud keharakke.

4. I klassi peamiste histo-sobivuskompleksi molekulide tõhustatud ekspressioon, mis on vajalik viiruse antigeenide nakatatud rakkude poolt tsütotoksilistele T-lümfotsüütidele esitlemise efektiivsuse suurendamiseks. See viib viirusega nakatunud rakkude spetsiifilise äratundmise aktiveerimiseni T-lümfotsüütide poolt - see on viirusega nakatunud sihtrakkude lüüsi esimene etapp.

Selle tulemusena aktiveeruvad lisaks otsesele viirusevastasele toimele nii kaasasündinud (NK-rakud) kui ka omandatud (T-lümfotsüüdid) immuunsuse mehhanismid. See on näide sellest, kuidas üks väike tsütokiinimolekul, mille MM on 10 korda väiksem kui antikehamolekulide MM, on pleiotroopse bioloogilise toime tõttu võimeline aktiveerima täiesti erinevaid kaitsereaktsioonide mehhanisme, mis on suunatud ühe eesmärgi täitmisele - viiruse eemaldamisele. sisenes kehasse.

Kudede tasandil vastutavad tsütokiinid põletiku tekke ja seejärel kudede regenereerimise eest. Süsteemse põletikulise reaktsiooni (ägeda faasi reaktsioon) väljakujunemisega mõjutavad tsütokiinid peaaegu kõiki homöostaasi reguleerimisega seotud organeid ja kehasüsteeme. Põletikueelsete tsütokiinide toime kesknärvisüsteemile viib söögiisu vähenemiseni ja kogu käitumuslike reaktsioonide kompleksi muutumiseni. Toiduotsingu ajutine peatamine ja seksuaalse aktiivsuse vähendamine on kasulik energia säästmise seisukohalt vaid ühe ülesande jaoks – võidelda sissetungiva patogeeniga. Selle signaali annavad tsütokiinid, kuna nende vereringesse sattumine tähendab kindlasti seda, et lokaalne kaitse ei ole patogeeniga toime tulnud ning vajalik on süsteemse põletikulise vastuse aktiveerimine. Üks esimesi süsteemse põletikulise reaktsiooni ilminguid, mis on seotud tsütokiinide toimega hüpotalamuse termoregulatsioonikeskusele, on kehatemperatuuri tõus. Temperatuuri tõus on tõhus kaitsereaktsioon, kuna kõrgel temperatuuril väheneb paljude bakterite paljunemisvõime, kuid vastupidi, lümfotsüütide proliferatsioon suureneb.

Maksas suureneb tsütokiinide mõjul patogeeniga võitlemiseks vajalike ägeda faasi valkude ja komplementsüsteemi komponentide süntees, kuid samal ajal väheneb albumiini süntees. Teine näide tsütokiinide selektiivsest toimest on vereplasma ioonse koostise muutumine süsteemse põletikulise reaktsiooni tekkimisel. Sel juhul toimub rauaioonide taseme langus, kuid tsingiioonide taseme tõus ning on hästi teada, et bakteriraku raua ioonidest ilmajätmine tähendab selle proliferatsioonipotentsiaali vähendamist (laktoferriini toime põhineb sellel). Teisest küljest on tsingi taseme tõus vajalik immuunsüsteemi normaalseks toimimiseks, eelkõige on see vajalik bioloogiliselt aktiivse seerumi tüümuse faktori – ühe peamise lümfotsüütide diferentseerumist tagava tüümuse hormooni – tekkeks. Tsütokiinide mõju vereloomesüsteemile on seotud hematopoeesi olulise aktiveerumisega. Leukotsüütide arvu suurenemine on vajalik kaotuse täiendamiseks ja rakkude, peamiselt neutrofiilsete granulotsüütide arvu suurendamiseks mädase põletiku fookuses. Toime verehüübimissüsteemile on suunatud hüübivuse suurendamisele, mis on vajalik verejooksu peatamiseks ja patogeeni otseseks blokeerimiseks.

Seega avaldavad tsütokiinid süsteemse põletiku tekkega tohutul hulgal bioloogilisi aktiivsusi ja häirivad peaaegu kõigi kehasüsteemide tööd. Kuid ükski toimuvatest muutustest ei ole juhuslikku laadi: neid kõiki on vaja kaitsereaktsioonide otseseks aktiveerimiseks või on need kasulikud energiavoogude ümberlülitamiseks ainult ühe ülesande jaoks - võidelda sissetungiva patogeeniga. Üksikute geenide ekspressiooni reguleerimise, hormonaalsete nihkete ja käitumisreaktsioonide muutuste näol tagavad tsütokiinid nende kehasüsteemide töö aktiveerumise ja maksimaalse efektiivsuse, mis on teatud ajahetkel vajalikud kaitsereaktsioonide tekkeks. Kogu organismi tasandil suhtlevad tsütokiinid immuun-, närvi-, endokriin-, vereloome- ja muude süsteemide vahel ning kaasavad need ühe kaitsereaktsiooni korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinid toimivad organiseerimissüsteemina, mis moodustab ja reguleerib kogu organismi kaitsereaktsioonide kompleksi patogeenide sissetoomise ajal. Ilmselt tekkis selline regulatsioonisüsteem evolutsiooniliselt ja sellel on makroorganismi kõige optimaalsema kaitsereaktsiooni jaoks tingimusteta kasu. Seetõttu on ilmselt võimatu piirata kaitsereaktsioonide mõistet ainult mittespetsiifiliste resistentsuse mehhanismide ja spetsiifilise immuunvastuse osalemisega. Kogu keha ja kõik süsteemid, mis esmapilgul ei ole seotud immuunsuse säilitamisega, osalevad ühes kaitsereaktsioonis.

Tsütokiinide eriuuringud.

Tsütokiinide tähtsus laste käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihhailova. Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool, Moskva Riiklik Koloproktoloogia Uurimiskeskus ja Peterburi Riiklik Väga Puhta Bioloogia Uurimise Instituut tegelevad tsütokiinide tähtsuse uurimisega laste käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis. Seedetrakti kroonilised põletikulised haigused on praegu laste seedesüsteemi patoloogias üks juhtivaid kohti. Erilist tähtsust omistatakse käärsoole põletikulistele haigustele (IBD), mille esinemissagedus kasvab pidevalt kogu maailmas. Pikk ravikuur koos sagedaste ja mõnel juhul surmaga lõppevate ägenemistega, lokaalsete ja süsteemsete tüsistuste tekkega – kõik see tingib põhjaliku haiguse patogeneesi uurimise, et otsida uusi lähenemisviise IBD ravile. Viimastel aastakümnetel oli haavandilise koliidi (UC) esinemissagedus 510 juhtu aastas 100 tuhande elaniku kohta, Crohni tõvega (CD) 16 juhtu aastas 100 tuhande elaniku kohta. Levimused Venemaal ja Moskva piirkonnas vastavad Euroopa keskmistele andmetele, kuid oluliselt madalamad kui Skandinaavia riikides, Ameerikas, Iisraelis ja Inglismaal. NUC puhul on levimus 19,3 juhtu 100 tuhande kohta, esinemissagedus 1,2 juhtu 100 tuhande inimese kohta aastas. CD puhul on levimus 3,0 100 tuhande inimese kohta, esinemissagedus 0,2 100 tuhande inimese kohta aastas. Asjaolu, et kõrgeimat esinemissagedust täheldati kõrgelt arenenud riikides, ei tulene mitte ainult sotsiaalsetest ja majanduslikest teguritest, vaid ka patsientide geneetilistest ja immunoloogilistest omadustest, mis määravad IBD eelsoodumuse. Need tegurid on IBD päritolu immunopatogeneetilises teoorias põhilised. Viirus- ja/või bakteriteooria seletab ainult haiguse ägedat algust ning protsessi kroniseerimine on tingitud nii geneetilisest eelsoodumusest kui ka immuunvastuse omadustest, mis on samuti geneetiliselt määratud. Tuleb märkida, et IBTC klassifitseeritakse praegu geneetiliselt heterogeense kompleksse eelsoodumusega haiguseks. On tuvastatud enam kui 15 oletatavat kandidaatgeeni kahest rühmast (immunospetsiifilised ja immunoregulatoorsed), mis põhjustavad pärilikku eelsoodumust. Tõenäoliselt määravad eelsoodumuse mitmed geenid, mis määravad immunoloogiliste ja põletikuliste reaktsioonide olemuse. Arvukate uuringute tulemuste põhjal võib järeldada, et IBT tekkega seotud geenide kõige tõenäolisem lokaliseerimine on 3., 7., 12. ja 16. kromosoomid. Praegu pööratakse suurt tähelepanu T- ja B-lümfotsüütide funktsiooni, samuti põletiku vahendajate tsütokiinide funktsioonide uurimisele. Aktiivselt uuritakse interleukiinide (IL), interferoonide (IFN), tuumori nekroosifaktori-a (TNF-a), makrofaagide ja autoantikehade rolli jämesoole limaskesta valkudele ja automikrofloorale. Nende häirete tunnused CD ja UC puhul selgusid, kuid siiani on ebaselge, kas need muutused esinevad peamiselt või sekundaarselt. Patogeneesi paljude aspektide mõistmiseks oleksid väga olulised nii IBD prekliinilises staadiumis kui ka esimese astme sugulastel läbi viidud uuringud. Põletiku vahendajate hulgas on eriline roll tsütokiinidel, mis on 5–50 kDa massiga polüpeptiidmolekulide rühm, mis osalevad organismi kaitsereaktsioonide tekkes ja reguleerimises. Keha tasandil suhtlevad tsütokiinid immuun-, närvi-, endokriin-, vereloome- ja muude süsteemide vahel ning aitavad neid kaasata kaitsereaktsioonide korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinide klassifikatsioon on näidatud tabelis 2. Enamikku tsütokiine ei sünteesi rakud väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust. Tsütokiini geenide ekspressioon algab vastusena patogeenide tungimisele organismi, antigeensele ärritusele või koekahjustusele. Üks võimsamaid tsütokiinide sünteesi indutseerijaid on bakteriraku seinte komponendid: LPS, peptidoglükaanid ja muramüüldipeptiidid. Põletikueelsete tsütokiinide tootjad on peamiselt monotsüüdid, makrofaagid, T-rakud jne. Sõltuvalt mõjust põletikulisele protsessile jagunevad tsütokiinid kahte rühma: põletikueelsed (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g ) ja põletikuvastased (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukiin-1 (IL-1) on immunoregulatoorne vahendaja, mis vabaneb põletikuliste reaktsioonide, koekahjustuste ja infektsioonide käigus (põletikku soodustav tsütokiin). IL-1 mängib olulist rolli T-rakkude aktiveerimisel, kui nad interakteeruvad antigeeniga. IL-1 on kahte tüüpi: IL-1a ja IL-1b, kahe erineva geeni lookuse saadused, mis asuvad inimese kromosoomis 2. IL-1a jääb raku sisse või võib olla membraani kujul ja esineb väikestes kogustes rakuvälises ruumis. IL-1a membraanivormi roll on aktiveerivate signaalide edastamine makrofaagidest T-lümfotsüütidele ja teistele rakkudele rakkudevahelise kontakti käigus. IL – 1a on peamine lühitoimevahendaja. Erinevalt IL-1a-st sekreteerivad rakud aktiivselt IL-1b, toimides nii süsteemselt kui ka lokaalselt. Tänapäeval on teada, et IL-1 on üks peamisi põletikuliste reaktsioonide vahendajaid, stimuleerib T-rakkude proliferatsiooni, suurendab IL-2 retseptori ekspressiooni T-rakkudel ja nende IL-2 tootmist. IL-2 koos antigeeniga indutseerib neutrofiilide aktivatsiooni ja adhesiooni, stimuleerib teiste tsütokiinide (IL-2, IL-3, IL-6 jne) teket aktiveeritud T-rakkude ja fibroblastide poolt, stimuleerib fibroblastide proliferatsiooni. ja endoteelirakud. Süsteemselt toimib IL-1 sünergistlikult TNF-a ja IL-6-ga. Kontsentratsiooni suurenemisega veres mõjutab IL-1 hüpotalamuse rakke ja põhjustab kehatemperatuuri tõusu, palavikku, uimasust, söögiisu vähenemist ning stimuleerib maksarakke tootma ägeda faasi valke (CRP, amüloid A, a-2 makroglobuliin ja fibrinogeen). IL4 (kromosoom 5). See pärsib makrofaagide aktivatsiooni ja blokeerib paljusid IFNg poolt stimuleeritud toimeid, nagu IL1, lämmastikoksiidi ja prostaglandiinide tootmine, mängib olulist rolli põletikuvastastes reaktsioonides ja omab immunosupressiivset toimet. IL6 (kromosoom 7), üks peamisi põletikuvastaseid tsütokiine, on B-rakkude ja makrofaagide diferentseerumise viimase etapi peamine indutseerija, võimas stimulaator ägeda faasi valkude tootmisel maksarakkude poolt. Üks IL6 põhifunktsioone on stimuleerida antikehade tootmist in vivo ja in vitro. IL8 (kromosoom 4). Viitab kemokiinide vahendajatele, mis põhjustavad leukotsüütide suunatud migratsiooni (kemotaksist) põletikukoldesse. IL10 põhifunktsioon on tsütokiinide tootmise pärssimine I tüüpi Thelperite (TNFb, IFNg) ja aktiveeritud makrofaagide (TNF-a, IL1, IL12) poolt. Nüüdseks on teada, et immuunvastuse tüübid on seotud ühe lümfotsüütide aktiveerimise variandiga, kus domineerivad esimest tüüpi (TH2) või teist tüüpi (TH3) T-lümfotsüütide abistajate kloonid. Tooted TH2 ja TH3 mõjutavad negatiivselt vastandkloonide aktiveerimist. Mis tahes tüüpi Th-kloonide liigne aktiveerimine võib suunata immuunvastuse vastavalt ühele arenguvõimalustest. Krooniline tasakaalustamatus Th-kloonide aktiveerimisel põhjustab immunopatoloogiliste seisundite arengut. IBTD tsütokiinide muutusi saab uurida mitmel viisil, määrates nende taseme veres või in situ. IL1 tase on kõrgenenud kõigi põletikuliste soolehaiguste korral. Erinevused NNC ja CD vahel on IL2 suurenenud ekspressioonis. Kui NUC-s leitakse IL2 vähenenud või normaalne tase, siis CD-s tuvastatakse selle suurenenud tase. IL4 sisaldus suureneb NUC-s, samas kui CD puhul jääb see normaalseks või isegi väheneb. Ägeda faasi reaktsioone vahendava IL6 tase on samuti tõusnud kõikide põletikuvormide korral. Tsütokiinide profiili kohta saadud andmed võimaldasid oletada, et kroonilise IBD kahte peamist vormi iseloomustab tsütokiinide erinev aktivatsioon ja ekspressioon. Uuringute tulemused näitavad, et UC-ga patsientidel täheldatud tsütokiiniprofiil on rohkem kooskõlas TH3 profiiliga, samas kui TH2 profiili tuleks pidada CD-ga patsientidele iseloomulikumaks. Selle TH2 ja TH3 profiilide rolli käsitleva hüpoteesi atraktiivsus seisneb selles, et tsütokiinide kasutamine võib muuta immuunvastust ühes või teises suunas ja viia tsütokiinide tasakaalu taastamisega remissioonini. Seda saab kinnitada eelkõige IL10 kasutamisega. Edasised uuringud peaksid näitama, kas tsütokiini vastus on stimulatsioonile reageerimisel sekundaarne nähtus või, vastupidi, määrab vastavate tsütokiinide ekspressioon organismi reaktiivsuse koos järgnevate kliiniliste ilmingute tekkega. Laste IBD tsütokiinide taseme uuringut ei ole veel läbi viidud. See töö on esimene osa teaduslikust uuringust, mis on pühendatud IBD tsütokiinide seisundi uurimisele lastel. Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida makrofaagide humoraalset aktiivsust NUC ja CD-ga laste veres sisalduvate (IL1a, IL8) tasemete määramisega, samuti nende dünaamikat ravi ajal. Aastatel 2000–2002 uuriti Venemaa Kliinilise Lastehaigla gastroenteroloogia osakonnas 34 NUC-ga last ja 19 CD-ga last vanuses 4–16 aastat. Diagnoos kinnitati anamnestiliselt, endoskoopiliselt ja morfoloogiliselt. Põletikueelsete tsütokiinide IL1a, IL8 taseme uuring viidi läbi ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) meetodil. IL1a, IL8 kontsentratsiooni määramiseks kasutasime OOO Cytokin (Peterburi, Venemaa) toodetud testsüsteeme. Analüüs viidi läbi Kõrgpuhaste Biopreparaatide Uurimise Instituudi Riikliku Teadusliku Keskuse immunofarmakoloogia laboris (laborijuhataja, MD, prof AS Simbirtsev). Uuringu käigus saadud tulemused näitasid IL1a, IL8 taseme olulist tõusu ägenemise perioodil, mis oli NUC-ga lastel rohkem väljendunud kui CD-ga lastel. Ilma ägenemiseta proinflammatoorsete tsütokiinide tase väheneb, kuid ei saavuta normi. UC korral tõusis IL-1a, IL-8 tase ägenemise perioodil 76,2% ja 90% lastest ning remissiooniperioodil vastavalt 69,2% ja 92,3%. CD-s on IL-1a, IL-8 tasemed tõusnud ägenemise perioodil 73,3% ja 86,6% lastest ning remissiooniperioodil vastavalt 50% ja 75%.

Olenevalt haiguse tõsidusest said lapsed ravi aminosalitsülaatide või glükokortikoididega. Ravi iseloom mõjutas oluliselt tsütokiinitaseme dünaamikat. Aminosalitsülaatravi ajal oli põletikueelsete tsütokiinide tase NUC ja CD-ga laste rühmas oluliselt kõrgem kui kontrollrühmas. Samal ajal täheldati kõrgemat esinemissagedust UC-ga laste rühmas. NUC-s suurenevad aminosalitsülaatravi taustal IL1a, IL8 tasemed vastavalt 82,4% ja 100% lastest, glükokortikoidravi ajal aga 60% lastest mõlema tsütokiini puhul. CD-s on IL1a, IL8 tõus aminosalitsülaatidega ravi ajal kõigil lastel ning glükokortikoidravi ajal vastavalt 55,5% ja 77,7% lastest. Seega näitavad selle uuringu tulemused immuunsüsteemi makrofaagide lüli märkimisväärset osalust patogeneetilises protsessis enamikul UC ja CD-ga lastel. Selles uuringus saadud andmed ei erine põhimõtteliselt täiskasvanud patsientide uurimisel saadud andmetest. Erinevused IL1a ja IL8 tasemetes UC ja CD-ga patsientidel on kvantitatiivsed, kuid mitte kvalitatiivsed, mis viitab nende muutuste mittespetsiifilisusele, mis on tingitud kroonilise põletikulise protsessi käigust. Seetõttu pole neil näitajatel diagnostilist väärtust. IL1a ja IL8 taseme dünaamilise uuringu tulemused kinnitavad glükokortikoidravimitega ravi suuremat efektiivsust võrreldes aminosalitsüülidega. Esitatud andmed on IBT-ga laste tsütokiinide seisundi uuringu esimese etapi tulemus. Probleemi edasine uurimine on vajalik, võttes arvesse teiste põletikueelsete ja põletikuvastaste tsütokiinide näitajaid.

Lämmastikoksiidi ja tsütokiinide roll ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkes.

Seda probleemi uurivad T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya: Vladivostoki Riikliku Meditsiiniülikooli anestesioloogia ja reanimatoloogia osakond. Ägeda kopsukahjustuse sündroom (täiskasvanu respiratoorse distressi sündroom, ARDS) on üks raskemaid ägeda hingamispuudulikkuse vorme, mis esineb raske trauma, sepsise, peritoniidi, pankreatiidi, suure verekaotuse, aspiratsiooniga patsientidel pärast ulatuslikke kirurgilisi sekkumisi ja 50. 60% juhtudest on surmavad. Uurimisandmed ARDS-i patogeneesi, sündroomi varajase diagnoosimise ja prognoosi kriteeriumide väljatöötamise kohta on vähesed, pigem vastuolulised, mis ei võimalda välja töötada ühtset diagnostilist ja terapeutilist kontseptsiooni. Leiti, et ARDS põhineb kopsukapillaaride ja alveolaarepiteeli endoteeli kahjustusel, vere reoloogiliste omaduste rikkumisel, mis põhjustab interstitsiaalse ja alveolaarkoe turset, põletikku, atelektaasid, pulmonaalset hüpertensiooni. Viimaste aastate kirjanduses on piisavalt teavet rakkude ja kudede metabolismi universaalse regulaatori - lämmastikoksiidi kohta. Huvi lämmastikoksiidi (NO) vastu tuleneb eelkõige sellest, et see on seotud paljude funktsioonide reguleerimisega, sealhulgas veresoonte toonuse, südame kontraktiilsuse, trombotsüütide agregatsiooni, neurotransmissiooni, ATP ja valkude sünteesi ning immuunkaitse reguleerimisega. Lisaks on NO-l olenevalt molekulaarse sihtmärgi valikust ja sellega interaktsiooni omadustest ka kahjulik mõju. Arvatakse, et rakkude aktivatsiooni käivitav mehhanism on tasakaalustamata tsütokineemia. Tsütokiinid on lahustuvad peptiidid, mis toimivad immuunsüsteemi vahendajatena ja tagavad rakulise koostöö, positiivse ja negatiivse immunoregulatsiooni. Püüdsime süstematiseerida kirjanduses leiduvat teavet NO ja tsütokiinide rolli kohta ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkes. NO on vees ja rasvlahustuv gaas. Selle molekul on ebastabiilne vaba radikaal, difundeerub kergesti kudedesse, imendub ja hävib nii kiiresti, et suudab mõjutada vaid lähikeskkonna rakke. NO molekulil on kõik klassikalistele sõnumitoojatele omased omadused: see toodetakse kiiresti, toimib väga madalates kontsentratsioonides, pärast välissignaali lakkamist muutub see kiiresti muudeks ühenditeks, oksüdeerudes stabiilseteks anorgaanilisteks lämmastikoksiidideks: nitrititeks ja nitraadideks. NO eluiga kudedes on erinevate allikate kohaselt 5 kuni 30 sekundit. NO peamised molekulaarsed sihtmärgid on rauda sisaldavad ensüümid ja valgud: lahustuv guanülaattsüklaas, nitrooksiidi süntaas (NOS) ise, hemoglobiin, mitokondriaalsed ensüümid, Krebsi tsükli ensüümid, valgusüntees ja DNA süntees. NO süntees organismis toimub aminohappe L-arginiini lämmastikku sisaldava osa ensümaatiliste transformatsioonide kaudu spetsiifilise ensüümi NOS mõjul ja seda vahendab kaltsiumiioonide interaktsioon kalmoduliiniga. Ensüüm inaktiveeritakse madalatel kontsentratsioonidel ja on maksimaalselt aktiivne 1 μM vaba kaltsiumi juures. On tuvastatud kaks NOS-i isovormi: konstitutiivne (cNOS) ja indutseeritud (iNOS), mis on erinevate geenide produktid. Kaltsium-kalmoduliinist sõltuv cNOS on rakus pidevalt olemas ja soodustab väikeste koguste NO vabanemist vastusena retseptorile ja füüsilisele stimulatsioonile. Selle isovormi mõjul tekkiv NO toimib kandjana paljudes füsioloogilistes reaktsioonides. Kaltsiumist kalmoduliinist sõltumatu iNOS moodustub erinevates rakutüüpides vastusena põletikueelsetele tsütokiinidele, endotoksiinidele ja oksüdeerijatele. See NOS-i isovorm transkribeeritakse 17. kromosoomi spetsiifiliste geenide poolt ja see soodustab suures koguses NO sünteesi. Ensüüm jaguneb ka kolme tüüpi: NOS-I (neuronaalne), NOS-II (makrofaag), NOS-III (endoteliaalne). NO sünteesivate ensüümide perekonda leidub mitmesugustes kopsurakkudes: bronhide epiteelirakkudes, alveolotsüütides, alveolaarsetes makrofaagides, nuumrakkudes, bronhide arterite ja veenide endoteelirakkudes, bronhide ja veresoonte siledates müotsüütides, mitteadrenergilistes mittekolinergilistes neuronites. Inimeste ja imetajate bronhide ja alveoolide epiteelirakkude konstitutiivne võime NO-d sekreteerida on kinnitatud paljudes uuringutes. On kindlaks tehtud, et NO moodustumisel osalevad inimese hingamisteede ülemised osad, aga ka alumised osad. Trahheostoomiga patsientidel läbiviidud uuringud on näidanud, et läbi trahheostoomia väljahingatavas õhus on gaaside hulk oluliselt väiksem kui nina- ja suuõõnes. Endogeense NO süntees mehaanilise ventilatsiooniga patsientidel kannatab oluliselt. Uuringud kinnitavad, et NO vabanemine toimub bronhodilatatsiooni ajal ja seda kontrollib vaguse närvisüsteem. On saadud andmeid, et NO moodustumine inimese hingamisteede epiteelis suureneb hingamisteede põletikuliste haiguste korral. Gaasi süntees suureneb tsütokiinide, aga ka endotoksiinide ja lipopolüsahhariidide mõjul indutseeritud NOS-i aktiveerimise tõttu.

Praegu on teada üle saja tsütokiini, mis on traditsiooniliselt jagatud mitmeks rühmaks.

1. Interleukiinid (IL-1 - IL18) – sekretsiooni reguleerivad valgud, mis tagavad vahendajate vastasmõju immuunsüsteemis ja selle seose teiste kehasüsteemidega.

2. Interferoonid (IFN-alfa, beeta, gamma) - viirusevastased tsütokiinid, millel on väljendunud immunoregulatoorne toime.

3. Kasvajanekroosifaktorid (TNF alfa, beeta) on tsütokiinid, millel on tsütotoksiline ja reguleeriv toime.

4. Kolooniaid stimuleerivad tegurid (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - vereloomerakkude kasvu ja diferentseerumise stimulaatorid, reguleerivad vereloomet.

5. Kemokiinid (IL-8, IL-16) – leukotsüütide kemoatraktandid.

6. Kasvufaktorid - erinevate kudede rakkude kasvu, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiivsuse regulaatorid (fibroblastide kasvufaktor, endoteelirakkude kasvufaktor, epidermise kasvufaktor) ja transformeerivad kasvufaktorid (TGF beeta).

Need bioregulatoorsed molekulid määravad kindlaks põletikulise ja immuunvastuse tüübi ja kestuse, kontrollivad rakkude proliferatsiooni, vereloomet, angiogeneesi, haavade paranemist ja paljusid muid protsesse. Kõik teadlased rõhutavad, et tsütokiinidel puudub spetsiifilisus antigeenide suhtes. Kultiveeritud kopsumakrofaagide ja nuumrakkudega tehtud katsed on näidanud iNOS-i moodustumist vastusena gamma-interferoonile, interleukiin-1-le, kasvaja nekroosifaktorile ja lipopolüsahhariididele. iNOS-i ja cNOS-i ekspressioon põletikueelsete tsütokiinide jaoks leiti loomade ja inimeste alveolotsüütides. Epiteelirakkude funktsiooni regulaatori epidermaalse kasvufaktori lisamine kultuurile vähendas ainult indutseeritud ensüümi aktiivsust. On teada, et olenevalt olemusest toimivad tsütokiinid autokriinselt – tootvatele rakkudele endile, parakriinselt – teistele sihtrakkudele või endokriinsetele – erinevatele rakkudele väljaspool nende tootmiskohta. Samal ajal võivad nad üksteisega suhelda vastavalt agonistlikule või antagonistlikule põhimõttele, muutes sihtrakkude funktsionaalset seisundit ja moodustades tsütokiinide võrgustiku. Seega ei ole tsütokiinid isoleeritud peptiidid, vaid terviklik süsteem, mille põhikomponentideks on produtseerivad rakud, valk ise on tsütokiin, selle retseptor ja sihtrakk. Leiti, et ägeda kopsukahjustuse tekkega tõuseb proinflammatoorsete tsütokiinide tase: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Nende toime on seotud vasodilatatsiooniga, nende läbilaskvuse suurenemisega ja vedeliku kogunemisega kopsukoesse. Lisaks on uuringud näidanud IFN gamma ja TNF alfa võimet indutseerida adhesioonimolekulide – ICAM-1 ekspressiooni inimese endoteelirakkudel. Leukotsüütide, trombotsüütide ja endoteelirakkude külge kleepuvad adhesioonimolekulid moodustavad "rulluvaid" neutrofiile ja soodustavad fibriiniosakeste agregatsiooni. Need protsessid aitavad kaasa kapillaaride verevoolu rikkumisele, suurendavad kapillaaride läbilaskvust ja kutsuvad esile lokaalse koeödeemi. Kapillaarverevoolu aeglustumist soodustab NO aktiveerumine, mis põhjustab arterioolide laienemist. Leukotsüütide edasist migratsiooni põletikukoldesse kontrollivad spetsiaalsed tsütokiinid – kemokiinid, mida toodavad ja sekreteerivad mitte ainult aktiveeritud makrofaagid, vaid ka endoteelirakud, fibroblastid, siledad müotsüüdid. Nende peamine ülesanne on varustada neutrofiile põletikulise fookusega ja aktiveerida nende funktsionaalset aktiivsust. Neutrofiilide peamine kemokiin on Il-8. Selle kõige tugevamad indutseerijad on bakteriaalsed lipopolüsahhariidid, IL-1 ja TNFalpha. R. Bahra et al. usuvad, et neutrofiilide transendoteliaalse migratsiooni iga etappi reguleeritakse TNF-alfa kontsentratsioonide stimuleerimisega. Ägeda kopsukahjustuse tekkimisel aktiveeruvad veresoonte endoteliotsüüdid, bronhide epiteelirakud ja alveolaarsed makrofaagid, mis osalevad faaside interaktsioonides. Selle tulemusena toimub ühelt poolt nende mobiliseerumine ja kaitseomaduste tugevnemine, teiselt poolt on võimalik rakkude endi ja ümbritsevate kudede kahjustamine. Mitmed uuringud on näidanud, et hapniku osalise redutseerimise produkt superoksiid võib koguneda põletikukoldesse, mis inaktiveerib NO vasoaktiivset toimet. NO ja superoksiidi anioon reageerivad kiiresti, moodustades rakke kahjustava peroksünitriti. See reaktsioon soodustab NO eemaldamist veresoonte ja bronhide seintelt, samuti alveolotsüütide pinnalt. Uuringud, mis näitavad, et traditsiooniliselt NO toksilisuse vahendajaks peetud peroksünitritil võib olla füsioloogiline toime ja indutseerida veresoonte lõdvestamist NO-vahendatud cGMP suurenemise kaudu veresoonte endoteelis. Peroksünitrit on omakorda võimas oksüdeerija, mis on võimeline kahjustama alveolaarset epiteeli ja kopsude pindaktiivset ainet. See põhjustab membraanivalkude ja lipiidide hävitamist, kahjustab endoteeli, suurendab trombotsüütide agregatsiooni ja osaleb endotokseemias. Selle suurenenud moodustumist täheldati ägeda kopsukahjustuse sündroomi korral. Teadlased usuvad, et indutseeritud ensüümi aktiveerimise tulemusena tekkiv NO on mõeldud organismi mittespetsiifiliseks kaitseks väga paljude patogeensete mõjurite eest, pärsib trombotsüütide agregatsiooni ja parandab lokaalset vereringet. Leiti, et liigne NO kogus pärsib cNOS-i aktiivsust rakkudes interaktsiooni tõttu superoksiidiga ja võib-olla ka guanülaattsüklaasi desensibiliseerimise tulemusena, mille tulemuseks on cGMP vähenemine rakus ja rakusisese kaltsiumi sisalduse suurenemine. . Brett et al. ja Kooy jt, analüüsides nitrooksüdergiliste mehhanismide tähtsust ARDS-i patogeneesis, viitasid sellele, et iNOS, peroksünitrit ja nitrotürosiin, mis on peroksünitriti valkudele avaldatava toime põhiprodukt, võivad mängida võtmerolli sündroomi kujunemisel. Cuthbertson et al. usuvad, et ägeda kopsukahjustuse aluseks on NO ja peroksünitriti mõju elastaasile ja interleukiin-8-le. Kobayashi et al. Samuti registreeriti ägeda kopsukahjustuse sündroomiga patsientidel iNOS-i, interleukiin-1, interleukiin-6, interleukiin-8 sisalduse suurenemine bronhoalveolaarvedelikus. Meldrum et al. näitas ARDS-is põletikuliste tsütokiinide tootmise vähenemist kopsumakrofaagide poolt NO-L-arginiini kohaliku tootmise substraadi mõjul. Leiti, et ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkes mängib olulist rolli veresoonte läbilaskvuse kahjustus, mis on põhjustatud tsütokiinide - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, CD3 lümfotsüütide vastaste monoklonaalsete antikehade toimest veresoonte endoteelirakkudel. kopsud ja immunotsüüdid. Kopsuveresoonte läbilaskvuse kiire ja tugev suurenemine viib neutrofiilide migreerumiseni kopsukoesse ja nende poolt tsütotoksiliste vahendajate vabanemiseni, mis viib patoloogiliste kopsumuutuste tekkeni. Ägeda kopsukahjustuse tekkimisel suurendab TNF-alfa neutrofiilide adhesiooni veresoone seinale, soodustab nende migratsiooni kudedesse, soodustab struktuurseid ja metaboolseid muutusi endoteliotsüütides, häirib rakumembraanide läbilaskvust, aktiveerib teiste tsütokiinide ja eikosanoidide teket, ja põhjustab kopsuepiteelirakkude apoptoosi ja nekroosi. Saadud andmed näitavad, et LPS-i sisseviimisega indutseeritud makrofaagide apoptoos on suures osas seotud IFN-gammaga ja seda vähendab IL-4, IL-10, TGF beeta toime. Kuid Kobayashi et al. saadud andmed, mis näitavad, et gamma-IFN võib olla seotud hingamisteede limaskesta epiteeli parandamisega. Hagimoto uuringud sisaldavad teavet selle kohta, et bronhide ja alveoolide epiteelirakud vabastavad vastusena TNF alfa või Fas ligandile IL-8, IL-12. See protsess on seotud tuumafaktori Carr-B aktiveerimisega Fas ligandi poolt.

Arvatakse, et IL-8 on üks olulisemaid tsütokiine ägeda kopsukahjustuse patofüsioloogias. Miller et al. ARDS-iga patsientide bronho-alveolaarvedeliku uuringus sesise taustal leiti IL-8 taseme märkimisväärne tõus võrreldes kardiogeense kopsutursega patsientidega. On oletatud, et Il-8 esmane allikas on kopsud ja seda kriteeriumi saab kasutada sündroomi diferentsiaaldiagnostikas. Grau et al. usun, et kopsukapillaaride endoteelirakud on tsütokiinide - IL-6, IL-8 - oluline allikas ägeda kopsukahjustuse tekkes. Goodman et al. ARDS-iga patsientidel bronhoalveolaarse loputusvedeliku tsütokiinide taseme dünaamika uurimisel suurenes IL-1 beeta, IL-8, monotsüütilise kemotaktilise peptiidi-1, epiteeli raku neutrofiilse aktivaatori, makrofaagide põletikulise peptiidi -1 sisaldus. alfa leiti. Samal ajal usuvad autorid, et IL-1 beeta sisalduse suurenemine võib olla sündroomi ebasoodsa tulemuse marker. Bauer et al. Näidati, et ARDS-ga patsientide IL-8 sisalduse kontrolli bronhoalveolaarvedelikus saab jälgida, IL-8 taseme langus viitab protsessi ebasoodsale kulgemisele. Mitmed uuringud sisaldavad ka teavet selle kohta, et kopsu veresoonte endoteeli tsütokiinide tootmise tase mõjutab ägeda kopsukahjustuse teket ja mille kontrolli saab kliinilises praktikas kasutada varajaseks diagnoosimiseks. Põletikueelsete tsütokiinide taseme tõusu võimalikud negatiivsed tagajärjed ARDS-iga patsientidel on tõestatud Martini jt, Warneri jt uuringutega Tsütokiinide ja bakteriaalsete endotoksiinide poolt aktiveeritud alveolaarsed makrofaagid suurendavad NO sünteesi. Suureneb ka bronhide ja alveolaarsete epiteelirakkude, neutrofiilide, nuumrakkude, endoteelirakkude ja kopsuveresoonte siledate müotsüütide NO tootmise tase, tõenäoliselt tuumafaktori Carr-B aktiveerimise tõttu. Autorid usuvad, et indutseeritud NOS-i aktiveerimise tulemusena tekkiv lämmastikoksiid on mõeldud eelkõige organismi mittespetsiifiliseks kaitseks. Makrofaagidest vabanedes tungib NO kiiresti bakteritesse ja seentesse, kus pärsib kolme elutähtsat ensüümide rühma: H-elektronide transporti, Krebsi tsüklit ja DNA sünteesi. NO osaleb organismi kaitses immuunvastuse viimastel etappidel ja seda peetakse piltlikult öeldes immuunsüsteemi "karistusmõõgaks". Rakku ebapiisavalt suurtes kogustes kuhjudes mõjub NO aga ka kahjustavalt. Seega käivitavad tsütokiinid ja NO ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkega järjestikuse reaktsiooniahela, mis väljendub mikrotsirkulatsiooni kahjustuses, kudede hüpoksias, alveolaarses ja interstitsiaalses turses ning kopsude metaboolse funktsiooni kahjustuses. Seetõttu võib väita, et tsütokiinide ja NO füsioloogiliste ja patofüsioloogiliste toimemehhanismide uurimine on paljulubav uurimissuund ning võimaldab tulevikus mitte ainult laiendada arusaama ARDS-i patogeneesist, vaid määrata ka diagnostilisi. ja sündroomi prognostilised markerid, et töötada välja võimalused patogeneetiliselt põhinevaks teraapiaks, mille eesmärk on vähendada letaalsust.

Tsütokiinide määramise meetodid.

Ülevaade on pühendatud praegu kasutatavatele tsütokiinide uurimise peamistele meetoditele. Lühidalt kirjeldatakse meetodite võimalusi ja eesmärki. Esitatakse erinevate lähenemisviiside eelised ja puudused tsütokiini geenide ekspressiooni analüüsimiseks nukleiinhapete tasemel ja valgu tootmise tasemel. (Tsütokiinid ja põletikud. 2005. T. 4, nr 1. S. 22-27.)

Tsütokiinid on reguleerivad valgud, mis moodustavad universaalse vahendajate võrgustiku, mis on iseloomulik nii immuunsüsteemile kui ka teiste elundite ja kudede rakkudele. Kõik rakulised sündmused toimuvad selle regulatoorsete valkude klassi kontrolli all: proliferatsioon, diferentseerumine, apoptoos ja rakkude spetsiifiline funktsionaalne aktiivsus. Iga tsütokiini mõju rakkudele iseloomustab pleiotroopia, erinevate vahendajate toimespekter kattub ja üldiselt sõltub raku funktsionaalne lõppseisund mitmete sünergistlikult toimivate tsütokiinide mõjust. Seega on tsütokiinisüsteem universaalne, polümorfne vahendajate reguleeriv võrgustik, mille eesmärk on kontrollida rakuliste elementide proliferatsiooni, diferentseerumist, apoptoosi ja funktsionaalset aktiivsust keha vereloome-, immuun- ja muudes homöostaatilistes süsteemides. Tsütokiinide määramise meetodid on 20-aastase intensiivse uurimistöö jooksul väga kiiresti arenenud ja esindavad tänapäeval tervet teaduslike teadmiste valdkonda. Tsütokineoloogia teadlased seisavad oma töö alguses silmitsi meetodi valimise küsimusega. Ja siin peab uurija täpselt teadma, millist infot on tal vaja seatud eesmärgi saavutamiseks hankida. Praeguseks on tsütokiinisüsteemi hindamiseks välja töötatud sadu erinevaid meetodeid, mis annavad selle süsteemi kohta mitmekesist teavet. Tsütokiinide hindamine erinevates bioloogilistes söötmetes võib põhineda spetsiifilisel bioloogilisel aktiivsusel. Neid saab kvantifitseerida, kasutades erinevaid immunoanalüüsi meetodeid, kasutades polü- ja monoklonaalseid antikehi. Lisaks tsütokiinide sekretoorsete vormide uurimisele on võimalik uurida nende rakusisest sisaldust ja tootmist kudedes voolutsütomeetria, Western blot analüüsi ja in situ immunohistokeemia abil. Väga olulist teavet saab tsütokiini mRNA ekspressiooni, mRNA stabiilsuse, tsütokiini mRNA isovormide esinemise, looduslike antisenss-nukleotiidjärjestuste uurimisel. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda olulist teavet ühe või teise vahendaja geneetiliselt programmeeritud kõrge või madala produktsiooni kohta. Igal meetodil on oma puudused ja eelised, oma eraldusvõime ja määramise täpsus. Teadlase teadmatus ja nendest nüanssidest arusaamatus võib viia ta valejäreldusteni.

Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramine.

Avastuse ajalugu ja esimesed sammud tsütokiinide uurimisel olid tihedalt seotud immunokompetentsete rakkude ja rakuliinide kasvatamisega. Seejärel näidati mitmete valgulise iseloomuga lahustuvate tegurite regulatiivset mõju (bioloogilist aktiivsust) lümfotsüütide proliferatiivsele aktiivsusele, immunoglobuliinide sünteesile, immuunvastuste kujunemisele in vitro mudelites. Üks esimesi meetodeid vahendajate bioloogilise aktiivsuse määramiseks on inimese lümfotsüütide migratsioonifaktori ja selle inhibeerimise teguri määramine. Kuna tsütokiinide bioloogilisi mõjusid on uuritud, on tekkinud erinevaid meetodeid nende bioloogilise aktiivsuse hindamiseks. Seega määrati IL-1, hinnates hiire tümotsüütide proliferatsiooni in vitro, IL-2 - võimega stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust, IL-3 - vereloomekolooniate kasvuga in vitro, IL-4 - vastavalt võimele stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust. komitogeenne toime Ia-valkude suurenenud ekspressiooni, IgG1 ja IgE moodustumise indutseerimise kaudu jne. Nende meetodite loetelu võib jätkata, seda ajakohastatakse pidevalt, kui avastatakse lahustuvate tegurite uusi bioloogilisi aktiivsusi. Nende peamine puudus on mittestandardsed meetodid, nende ühendamise võimatus. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramise meetodite edasiarendamine tõi kaasa suure hulga ühe või teise tsütokiini suhtes tundlike rakuliinide või multitundlike liinide loomise. Enamikku neist tsütokiinidele reageerivatest rakkudest võib nüüd leida kaubanduslike rakuliinide loenditest. Näiteks IL-1a ja b testimiseks kasutatakse D10S rakuliini, IL-2 ja IL-15 puhul CTLL-2 rakuliini, IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 jaoks. , IL-13, GM-CSF - rakuliin TF-1, IL-6 jaoks - rakuliin B9, IL-7 jaoks - rakuliin 2E8, TNFa ja TNFb - rakuliin L929, IFNg - rakuliin WiDr, jaoks IL-18 - rakuliin KG-1. Sellel immunoaktiivsete valkude uurimise lähenemisviisil koos tuntud eelistega, nagu küpsete ja aktiivsete valkude tegeliku bioloogilise aktiivsuse mõõtmine, kõrge reprodutseeritavus standardtingimustes, on aga omad puudused. Nende hulka kuuluvad ennekõike rakuliinide tundlikkus mitte ühe tsütokiini, vaid mitme seotud tsütokiini suhtes, mille bioloogilised toimed kattuvad. Lisaks ei saa välistada võimalust, et sihtrakud indutseerivad teiste tsütokiinide tootmist, mis võivad testitud parameetrit moonutada (reeglina proliferatsioon, tsütotoksilisus, kemotaksis). Me ei tea veel kõiki tsütokiine ja mitte kõiki nende mõjusid, seetõttu ei hinda me mitte tsütokiini ennast, vaid kogu spetsiifilist bioloogilist aktiivsust. Seega on bioloogilise aktiivsuse hindamine erinevate vahendajate koguaktiivsusena (spetsiifilisuse puudumine) selle meetodi üks puudusi. Lisaks on tsütokiinitundlike liinide abil võimatu tuvastada inaktiveeritud molekule ja nendega seotud valke. See tähendab, et sellised meetodid ei kajasta paljude tsütokiinide tegelikku tootmist. Rakuliinide kasutamise teine ​​oluline puudus on vajadus rakukultuuri labori järele. Lisaks on kõik protseduurid rakkude kasvatamiseks, nende inkubeerimiseks uuritavate valkude ja söötmega aeganõudvad. Samuti tuleb märkida, et rakuliinide pikaajaline kasutamine nõuab uuendamist või uuesti sertifitseerimist, kuna kultiveerimise tulemusena võivad nad muteeruda ja muutuda, mis võib viia nende tundlikkuse muutumiseni vahendajate suhtes ja rakuliinide täpsuse vähenemiseni. bioloogilise aktiivsuse määramine. See meetod sobib aga ideaalselt rekombinantsete vahendajate spetsiifilise bioloogilise aktiivsuse testimiseks.

Tsütokiinide kvantifitseerimine antikehade abil.

Immunokompetentsete ja muud tüüpi rakkude toodetud tsütokiinid vabanevad rakuvälisesse ruumi parakriinsete ja autokriinsete signaalide interaktsioonide jaoks. Nende valkude kontsentratsiooni järgi vereseerumis või konditsioneeritud keskkonnas saab hinnata patoloogilise protsessi olemust ja teatud rakufunktsioonide liigset või puudumist patsiendil. Tsütokiinide määramise meetodid spetsiifiliste antikehade abil on tänapäeval kõige levinumad süsteemid nende valkude tuvastamiseks. Need meetodid on läbinud terve rea modifikatsioone, kasutades erinevaid märgiseid (radioisotoop, fluorestsents, elektrokemoluminestsents, ensüüm jne). Kui radioisotoopmeetoditel on mitmeid puudusi, mis on seotud radioaktiivse märgise kasutamisega ja piiratud aja jooksul märgistatud reaktiivide kasutamise võimalusega (poolväärtusaeg), siis ensümaatilised immunosorbentmeetodid on leidnud kõige laialdasema kasutuse. Need põhinevad ensümaatilise reaktsiooni lahustumatute produktide visualiseerimisel, mis neelavad valgust teadaoleva lainepikkusega kogustes, mis on ekvivalentsed analüüdi kontsentratsiooniga. Mõõdetavate ainete sidumiseks kasutatakse tahkele polümeeralusele kantud antikehi, visualiseerimiseks aga ensüümidega konjugeeritud antikehi, tavaliselt leeliselise fosfataasi või mädarõika peroksidaasiga. Meetodi eelised on ilmsed: määramise kõrge täpsus reaktiivide ja protseduuride standardsetes ladustamistingimustes, kvantitatiivne analüüs ja reprodutseeritavus. Puudusteks on määratud kontsentratsioonide piiratud vahemik, mille tulemusena loetakse kõik teatud läve ületavad kontsentratsioonid sellega võrdseks. Tuleb märkida, et meetodi täitmiseks kuluv aeg varieerub sõltuvalt tootja soovitustest. Kuid igal juhul räägime mitmest tunnist, mis kulub reaktiivide inkubeerimiseks ja pesemiseks. Lisaks määratakse tsütokiinide varjatud ja seotud vormid, mis oma kontsentratsioonis võivad oluliselt ületada vabu vorme, mis vastutavad peamiselt vahendaja bioloogilise aktiivsuse eest. Seetõttu on soovitav kasutada seda meetodit koos vahendaja bioloogilise aktiivsuse hindamise meetoditega. Immunoanalüüsi meetodi teine ​​modifikatsioon, mis on leidnud laialdast rakendust, on elektrokemiluminestsentsmeetod (ECL) valkude määramiseks ruteeniumi ja biotiiniga märgistatud antikehadega. Sellel meetodil on radioisotoopide ja ensüümide immunoanalüüside ees järgmised eelised: rakendamise lihtsus, meetodi lühike täitmisaeg, pesemisprotseduuride puudumine, väike proovi maht, lai tsütokiinide kontsentratsioonide vahemik seerumis ja konditsioneeritud keskkonnas, meetodi kõrge tundlikkus. meetod ja selle reprodutseeritavus. Vaadeldav meetod on vastuvõetav kasutamiseks nii teaduslikus kui ka kliinilises uurimistöös. Järgmine meetod tsütokiinide hindamiseks bioloogilises keskkonnas töötatakse välja voolufluorimeetria tehnoloogial. See võimaldab teil üheaegselt hinnata kuni sadu valke proovis. Praegu on kaubanduslikud komplektid loodud kuni 17 tsütokiini määramiseks. Kuid selle meetodi eelised määravad ka selle puudused. Esiteks on see mitme valgu määramiseks optimaalsete tingimuste valiku töömahukus ja teiseks on tsütokiinide tootmine kaskaadne, erinevatel aegadel tootmispiigid. Seetõttu ei ole suure hulga valkude samaaegne määramine alati informatiivne. Immuunanalüüsi meetodite üldine nõue, kasutades nn. "sandwich" on antikehade paari hoolikas valik, mis võimaldab määrata analüüsitava valgu vaba või seotud vormi, mis seab sellele meetodile piirangud ja mida tuleb saadud andmete tõlgendamisel alati arvesse võtta. Need meetodid määravad tsütokiinide koguproduktsiooni erinevate rakkude poolt, samal ajal on võimalik hinnata tsütokiinide antigeenispetsiifilist tootmist immunokompetentsete rakkude poolt ainult hüpoteetiliselt. Nüüd on välja töötatud ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) süsteem, mis need puudused suures osas kõrvaldab. Meetod võimaldab poolkvantitatiivselt hinnata tsütokiinide tootmist üksikute rakkude tasemel. Selle meetodi kõrge eraldusvõime võimaldab hinnata antigeeniga stimuleeritud tsütokiinide tootmist, mis on spetsiifilise immuunvastuse hindamiseks väga oluline. Järgmine, teaduslikel eesmärkidel laialdaselt kasutatav meetod on tsütokiinide rakusisene määramine voolutsütomeetria abil. Selle eelised on ilmsed. Me saame fenotüüpiliselt iseloomustada tsütokiini tootvate rakkude populatsiooni ja/või määrata üksikute rakkude poolt toodetud tsütokiinide spektri koos võimalusega seda produktsiooni suhteliselt kvantitatiivselt iseloomustada. Samal ajal on kirjeldatud meetod üsna keeruline ja nõuab kalleid seadmeid. Järgmised meetodid, mida kasutatakse peamiselt teaduslikel eesmärkidel, on immunohistokeemilised meetodid, mis kasutavad märgistatud monoklonaalseid antikehi. Eelised on ilmsed – tsütokiinide produktsiooni määramine otse kudedes (in situ), kus toimuvad mitmesugused immunoloogilised reaktsioonid. Vaadeldavad meetodid on aga väga töömahukad ega anna täpseid kvantitatiivseid andmeid.

Tsütokiinide määramine ensüümi immuunanalüüsiga.

Vector-Best CJSC T.G. juhtimisel. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavishnikov töötab aktiivselt tsütokiinide määramise nimel. Tsütokiinid on polüpeptiidide vahendajate rühm, mis on sageli glükosüülitud ja mille molekulmass on vahemikus 8 kuni 80 kDa. Tsütokiinid osalevad organismi kaitsereaktsioonide ja homöostaasi moodustamises ja reguleerimises. Nad osalevad kõigis humoraalse ja rakulise immuunvastuse lülides, sealhulgas immunokompetentsete eellasrakkude diferentseerumises, antigeeni esitlemises, rakkude aktiveerimises ja proliferatsioonis, adhesioonimolekulide ekspressioonis ja ägeda faasi vastuses. Mõned neist on võimelised avaldama erinevatele sihtrakkudele palju bioloogilisi toimeid. Tsütokiinide toime rakkudele toimub järgmistel viisidel: autokriinne - seda tsütokiini sünteesival ja sekreteerival rakul; parakriin - rakkudel, mis asuvad tootjaraku lähedal, näiteks põletikukoldes või lümfoidorganis; endokriinselt kaugjuhtimisega - mis tahes organite ja kudede rakkudel pärast tsütokiini sisenemist vereringesse. Tsütokiinide moodustumine ja vabanemine on tavaliselt lühiajaline ja rangelt reguleeritud. Tsütokiinid toimivad rakule, seondudes tsütoplasmaatilise membraani spetsiifiliste retseptoritega, põhjustades seeläbi reaktsioonide kaskaadi, mis viib mitmete nende poolt reguleeritud geenide aktiivsuse esilekutsumiseni, võimendamiseni või pärssimiseni. Tsütokiine iseloomustab funktsioneerimise kompleksne võrgulaad, mille puhul ühe neist tootmine mõjutab paljude teiste aktiivsuse teket või avaldumist. Tsütokiinid on lokaalsed vahendajad, seetõttu on soovitatav mõõta nende taset vastavates kudedes pärast koevalkude ekstraheerimist vastavate elundite biopsiatest või looduslikest vedelikest: uriin, pisaravedelik, igemetaskuvedelik, bronhoalveolaarne loputus, tupesekretid, ejakulaat. , peseb õõnsustest, seljaaju või sünoviaalvedelikest jne. Täiendavat teavet organismi immuunsüsteemi seisundi kohta saab, kui uurida vererakkude võimet toota in vitro tsütokiine. Plasma tsütokiinide tase peegeldab immuunsüsteemi hetkeseisu ja kaitsereaktsioonide arengut in vivo. Tsütokiinide spontaanne tootmine perifeerse vere mononukleaarsete rakkude kultuuris võimaldab hinnata vastavate rakkude seisundit. Tsütokiinide suurenenud spontaanne tootmine näitab, et rakud on juba in vivo antigeeni poolt aktiveeritud. Tsütokiinide indutseeritud tootmine võimaldab hinnata vastavate rakkude potentsiaalset võimet reageerida antigeensele stimulatsioonile. Näiteks tsütokiinide vähenenud indutseerimine in vitro võib olla immuunpuudulikkuse seisundi üks tunnuseid. Seetõttu on kogu organismi immunoreaktiivsuse tunnuste ja immuunsüsteemi üksikute lülide talitluse seisukohalt olulised mõlemad võimalused tsütokiinide taseme uurimiseks nii ringlevas veres kui ka nende tootmisel rakukultuuride abil. Kuni viimase ajani tegelesid Venemaal mõned teadlaste rühmad tsütokiinide uurimisega, kuna bioloogilised uurimismeetodid on väga aeganõudvad ja imporditud immunokeemilised komplektid on väga kallid. Kodumaiste ensüümiga seotud immunosorbentide komplektide tulekuga näitavad praktiseerivad arstid üha suuremat huvi tsütokiini profiili uurimise vastu. Praegu seisneb tsütokiinide taseme hindamise diagnostiline tähtsus nende kontsentratsiooni suurenemise või vähenemise fakti väljaselgitamises konkreetse haigusega patsiendil. Veelgi enam, haiguse raskusastme hindamiseks ja haiguse kulgu ennustamiseks on soovitatav määrata nii põletikuvastaste kui ka pro-põletikuliste tsütokiinide kontsentratsioon patoloogia arengu dünaamikas. Näiteks tsütokiinide sisaldus perifeerses veres määratakse ägenemise ajastuse järgi, peegeldab peptilise haavandi ja teiste seedetrakti haiguste patoloogilise protsessi dünaamikat. Ägenemise varases staadiumis on ülekaalus interleukiin-1beeta (IL-1beeta), interleukiin-8 (IL-8) sisalduse suurenemine, seejärel interleukiin-6 (IL-6), gamma-interferooni (gamma) kontsentratsioon. -INF), suurendab kasvaja nekroosifaktor -alfa (alfa-TNF). Interleukiin-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF kontsentratsioon saavutas maksimumi haiguse kõrgpunktis, samas kui ägeda faasi markerite sisaldus lähenes sel perioodil normaalväärtustele. Ägenemise haripunktis ületas alfa-TNF tase oluliselt interleukiin-4 (IL-4) sisaldust nii vereseerumis kui ka vahetult haavandi peri-piirkonna kahjustatud koes, misjärel hakkas see järk-järgult langema. vähenema. Kui ägeda faasi nähtused taandusid ja paranemisprotsessid intensiivistusid, suurenes IL-4 kontsentratsioon. Tsütokiiniprofiili muutuse järgi saab hinnata keemiaravi tõhusust ja teostatavust. Tsütokiinravi läbiviimisel, näiteks ravi ajal alfa-interferooniga (alfa-IFN), on vaja kontrollida nii selle sisaldust ringlevas veres kui ka alfa-IFN-i vastaste antikehade tootmist. On teada, et kui toodetakse suurel hulgal neid antikehi, ei lakka interferoonravi mitte ainult tõhusalt, vaid võib põhjustada ka autoimmuunhaigusi. Viimasel ajal on välja töötatud ja praktikasse viidud uusi ravimeid, mis ühel või teisel viisil muudavad organismi tsütokiinide seisundit. Näiteks reumatoidartriidi raviks pakutakse välja alfa-TNF-i vastastel antikehadel põhinevat ravimit, mis on ette nähtud sidekoe hävitamises osaleva alfa-TNF eemaldamiseks. Kuid nii meie andmetel kui ka kirjanduse põhjal ei ole kõigil kroonilise reumatoidartriidiga patsientidel TNF-alfa tase suurenenud, mistõttu võib selle patsientide rühma puhul TNF-alfa taseme langus veelgi süvendada immuunsüsteem. Seega eeldab õige tsütokiiniteraapia organismi tsütokiinide seisundi kontrolli ravi ajal. Põletikueelsete tsütokiinide kaitsev roll avaldub lokaalselt, põletikukoldes, kuid nende süsteemne tootmine ei too kaasa nakkusvastase immuunsuse teket ega takista bakteriaalset toksilise šoki teket, mis on põletike põhjustajaks. mädaste-septiliste tüsistustega kirurgiliste patsientide varajane suremus. Kirurgiliste infektsioonide patogeneesi aluseks on tsütokiinide kaskaadi käivitamine, mis hõlmab ühelt poolt põletikueelseid ja teiselt poolt põletikuvastaseid tsütokiine. Tasakaal nende kahe vastandliku rühma vahel määrab suuresti mäda-septiliste haiguste kulgemise ja tulemuse. Siiski ei kajasta nende rühmade ühe tsütokiini (näiteks TNF alfa või IL-4) kontsentratsiooni määramine veres piisavalt kogu tsütokiini tasakaalu seisundit. Seetõttu on vajalik mitme vahendaja taseme üheetapiline hindamine (vähemalt 2-3 vastandlikku alagruppi). Praegu on CJSC "Vector-Best" välja töötanud ja seeriaviisiliselt toodetud reaktiivide komplektid järgmiste kvantitatiivseks määramiseks: kasvaja nekroosifaktor-alfa (tundlikkus - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gamma-interferoon (tundlikkus - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukiin-4 (tundlikkus - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); interleukiin-8 (tundlikkus - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interleukiin-1 (IL-1RA) retseptori antagonist (tundlikkus - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa-interferoon (tundlikkus - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimmuunsed antikehad alfa-interferoonile (tundlikkus - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Kõik komplektid on mõeldud nende tsütokiinide kontsentratsiooni määramiseks inimese bioloogilistes vedelikes, kultuuri supernatantides, kui uuritakse inimese rakukultuuride võimet toota tsütokiine in vitro. Analüüsi põhimõte on tahkefaasilise kolmeastmelise (inkubatsiooniaeg - 4 h) või kaheetapilise (inkubatsiooniaeg - 3,5 h) ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi "võileiva" variant plaatidel. Analüüs nõuab 100 µl bioloogilist vedelikku või kultuuri supernatanti süvendi kohta. Tulemuste arvestus - spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 450 nm. Kõigis komplektides on kromogeeniks tetrametüülbensidiin. Meie komplektide säilivusaega on pikendatud 18 kuuni alates väljaandmise kuupäevast ja 1 kuuni pärast kasutamise algust. Kirjanduse andmete analüüs näitas, et tsütokiinide sisaldus tervete inimeste vereplasmas sõltub nii nende määramiseks kasutatavatest komplektidest kui ka nende inimeste elupiirkonnast. Seetõttu analüüsisime meie piirkonna elanike normaalsete tsütokiinikontsentratsioonide väärtuste väljaselgitamiseks praktiliselt tervete veredoonorite, erinevate sotsiaalsete rühmade esindajate vanuses 18–60 aastat, juhuslikke plasmaproove (80 kuni 400 proovi). raske somaatilise patoloogia ilmingud ja HIV-, B- ja C-hepatiidi viiruste vastaste HBsAg antikehade puudumine.

Kasvaja nekroosifaktor-alfa.

TNF-alfa on pleiotroopne põletikuvastane tsütokiin, mis koosneb kahest piklikust b-ahelast molekulmassiga 17 kDa ning täidab immuunvastuse ja põletiku reguleerivaid ja efektorfunktsioone. Peamised alfa-TNF tootjad on monotsüüdid ja makrofaagid. Seda tsütokiini sekreteerivad ka vere lümfotsüüdid ja granulotsüüdid, looduslikud tapjarakud ja T-lümfotsütaarsed rakuliinid. Alfa-TNF-i peamised indutseerijad on viirused, mikroorganismid ja nende ainevahetusproduktid, sealhulgas bakteriaalne lipopolüsahhariid. Lisaks võivad indutseerijate rolli mängida ka mõned tsütokiinid, nagu IL-1, IL-2, granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor, alfa- ja beeta-INF. Alfa-TNF bioloogilise aktiivsuse põhisuunad: avaldab mõningate kasvajarakkude suhtes selektiivset tsütotoksilisust; aktiveerib granulotsüüte, makrofaage, endoteelirakke, hepatotsüüte (ägeda faasi valkude tootmine), osteoklaste ja kondrotsüüte (luu- ja kõhrekoe resorptsioon), teiste põletikueelsete tsütokiinide sünteesi; stimuleerib proliferatsiooni ja diferentseerumist: neutrofiilid, fibroblastid, endoteelirakud (angiogenees), hematopoeetilised rakud, T- ja B-lümfotsüüdid; suurendab neutrofiilide voolu luuüdist verre; omab kasvaja- ja viirusevastast toimet in vivo ja in vitro; osaleb mitte ainult kaitsereaktsioonides, vaid ka põletikuga kaasnevate hävitamise ja parandamise protsessides; toimib ühe vahendaja kudede hävitamisel, mis on levinud pikaajalise kroonilise põletiku korral.

Riis. 1. Alfa-TNF taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Posttraumaatilise seisundi, kopsufunktsiooni häirete, raseduse normaalse kulgemise, onkoloogiliste haiguste, bronhiaalastma korral täheldatakse vereseerumis alfa-TNF taseme tõusu. Viirusliku C-hepatiidi kroonilise vormi ägenemise ajal on alfa-TNF tase normist 5-10 korda kõrgem. Seedetrakti haiguste ägenemise perioodil ületab alfa-TNF kontsentratsioon seerumis normi keskmiselt 10 korda ja mõnel patsiendil 75–80 korda. Suurtes kontsentratsioonides alfa-TNF leidub tserebrospinaalvedelikus hulgiskleroosi ja tserebrospinaalse meningiidiga patsientidel ning reumatoidartriidiga patsientidel sünoviaalvedelikus. See viitab TNF-alfa osalemisele mitmete autoimmuunhaiguste patogeneesis. Alfa-TNF tuvastamise sagedus vereseerumis isegi raske põletiku korral ei ületa 50%, indutseeritud ja spontaanse tootmise korral - kuni 100%. Alfa-TNF kontsentratsioonide vahemik oli 0-6 pg / ml, keskmine - 1,5 pg / ml (joonis 1).

Gamma interferoon.

Riis. 2. IFN-gamma tasemete jaotus

tervete doonorite plasmas.

Interleukiin-4

IL-4 on glükoproteiin molekulmassiga 18–20 kDa, loomulik põletiku inhibiitor. Koos IFN-gammaga on IL-4 võtmetähtsusega tsütokiin, mida toodavad T-rakud (peamiselt TH-2 lümfotsüüdid). See toetab TH-1 / TH-2 tasakaalu. IL-4 bioloogilise aktiivsuse põhisuunad: suurendab eosinofiiliat, nuumrakkude akumulatsiooni, IgG4 sekretsiooni, TH-2-vahendatud humoraalset immuunvastust; omab kohalikku kasvajavastast toimet, stimuleerides tsütotoksiliste T-lümfotsüütide populatsiooni ja tuumori infiltratsiooni eosinofiilide poolt; inhibeerib põletikuliste tsütokiinide (alfa-TNF, IL-1, IL-8) ja prostaglandiinide vabanemist aktiveeritud monotsüütidest, tsütokiinide tootmist TH-1-lümfotsüütide poolt (IL-2, gamma-INF jne).

Riis. 3. IL-4 taseme jaotus plasmas

terved doonorid.

IL-4 taseme tõusu nii seerumis kui ka stimuleeritud lümfotsüütides võib täheldada allergiliste haiguste korral (eriti ägenemise ajal), nagu bronhiaalastma, allergiline riniit, heinapalavik, atoopiline dermatiit, seedetrakti haiguste korral. IL-4 tase on märkimisväärselt tõusnud ka kroonilise C-hepatiidi (CHC) patsientidel. CHC ägenemise perioodidel suureneb selle kogus peaaegu 3 korda võrreldes normiga ja CHC remissiooni ajal väheneb IL-4 tase, eriti rekombinantse IL-2-ga ravi taustal. IL-4 kontsentratsioonide vahemik oli 0–162 pg/ml, keskmine 6,9 ​​pg/ml, normaalne vahemik 0–20 pg/ml (joonis 3).

Interleukiin-8

IL-8 kuulub kemokiinide hulka, see on valk molekulmassiga 8 kDa. IL-8 toodavad mononukleaarsed fagotsüüdid, polümorfonukleaarsed leukotsüüdid, endoteelirakud ja muud tüüpi rakud vastusena erinevatele stiimulitele, sealhulgas bakteritele ja viirustele ning nende ainevahetusproduktidele, sealhulgas põletikueelsetele tsütokiinidele (näiteks IL-1, TNF alfa). Interleukiin-8 peamine roll on suurendada leukotsüütide kemotaksist. See mängib olulist rolli nii ägeda kui ka kroonilise põletiku korral. IL-8 taseme tõusu täheldatakse patsientidel, kellel on bakteriaalsed infektsioonid, kroonilised kopsuhaigused, seedetrakti haigused. Sepsisega patsientidel suureneb IL-8 tase plasmas ja kõrgeid kontsentratsioone seostatakse suurenenud suremusega. IL-8 sisalduse mõõtmise tulemusi saab kasutada ravikuuri jälgimiseks ja haiguse tagajärgede ennustamiseks. Seega leiti IL-8 suurenenud sisaldus pisaravedelikus kõigil patsientidel, kellel oli soodne sarvkesta haavandite kulg. Kõigil sarvkesta haavandi keerulise kuluga patsientidel oli IL-8 kontsentratsioon 8 korda kõrgem kui haiguse soodsa kulgemisega patsientidel. Seega võib põletikueelsete tsütokiinide (eriti IL-8) sisaldust sarvkesta haavandite pisaravedelikus kasutada selle haiguse kulgemise prognostilise kriteeriumina.

Riis. 4. IL-8 taseme jaotus

tervete doonorite plasma (Novosibirsk).

Meie ja avaldatud andmetel tuvastatakse tervetel inimestel vereseerumis IL-8 üliharva; IL-8 spontaanset tootmist vere mononukleaarsete rakkude poolt täheldatakse 62% ja indutseeritud tootmist 100% tervetel doonoritel. IL-8 kontsentratsioonide vahemik oli 0–34 pg/ml, keskmine 2 pg/ml, normaalne vahemik 0–10 pg/ml (joonis 4).

Riis. 5. IL-8 taseme jaotus plasmas

terved doonorid (Rubtsovsk).

Interleukiin-1 retseptori antagonist.

IL-1RA kuulub tsütokiinide hulka, see on oligopeptiid molekulmassiga 18-22 kDa. IL-1RA on IL-1 endogeenne inhibiitor, mida toodavad makrofaagid, monotsüütide, neutrofiilid, fibroblastid ja epiteelirakud. IL-1RA inhibeerib interleukiinide IL-1alfa ja IL-1beeta bioloogilist aktiivsust, konkureerides nendega rakuretseptoriga seondumise pärast.

Riis. 6. IL-1RA taseme jaotus

tervete doonorite plasmas

IL-1RA tootmist stimuleerivad paljud tsütokiinid, viirusproduktid ja ägeda faasi valgud. IL-1RA võib aktiivselt ekspresseerida põletikukolletes mitmesuguste krooniliste haiguste korral: reumatoid- ja juveniilne krooniline artriit, süsteemne erütematoosluupus, isheemilised ajukahjustused, põletikulised soolehaigused, bronhiaalastma, püelonefriit, psoriaas jt. Sepsise korral täheldatakse IL-1RA suurimat tõusu - mõnel juhul kuni 55 ng / ml ja leiti, et IL-1RA suurenenud kontsentratsioon korreleerub soodsa prognoosiga. Kõrget IL-1RA taset täheldatakse väga rasvunud naistel ja see tase väheneb märgatavalt 6 kuu jooksul pärast rasvaimu. IL-1RA kontsentratsioonide vahemik oli 0–3070 pg / ml, keskmine oli 316 pg / ml. Normaalne vahemik on 50–1000 pg/ml (joonis 6).

Alfa interferoon.

Alfa-IFN on monomeerne glükosüülimata valk molekulmassiga 18 kDa, mida sünteesivad peamiselt leukotsüüdid (B-lümfotsüüdid, monotsüüdid). Seda tsütokiini võivad vastusena sobivale stimulatsioonile toota ka praktiliselt iga rakutüüp ja rakusisesed viirusinfektsioonid võivad olla alfa-IFN sünteesi võimsad stimulaatorid. Alfa-IFN indutseerijate hulka kuuluvad: viirused ja nende tooted, mille hulgas on juhtival kohal viiruse replikatsiooni käigus tekkivad kaheahelalised RNA-d, samuti bakterid, mükoplasmad ja algloomad, tsütokiinid ja kasvufaktorid (nagu IL-1, IL- 2, alfa -FNO, kolooniaid stimuleerivad tegurid jne). Keha mittespetsiifilise antibakteriaalse immuunvastuse esialgne kaitsereaktsioon hõlmab alfa- ja beeta-IFN-i esilekutsumist. Sel juhul toodavad seda antigeeni esitlevad rakud (makrofaagid), mis on tunginud bakteritesse. Interferoonid (sealhulgas alfa-IFN) mängivad olulist rolli viirusevastase immuunvastuse mittespetsiifilises lülis. Nad suurendavad viirusevastast resistentsust, indutseerides rakkudes ensüümide sünteesi, mis pärsivad viiruste nukleiinhapete ja valkude moodustumist. Lisaks on neil immunomoduleeriv toime, need suurendavad peamise histo-sobivuse kompleksi antigeenide ekspressiooni rakkudes. Alfa-IFN sisalduse muutus tuvastati viirusliku etioloogiaga hepatiidi ja maksatsirroosi korral. Viirusnakkuste ägenemise hetkel suureneb selle tsütokiini kontsentratsioon enamikul patsientidest märkimisväärselt ja taastumise perioodil langeb see normaalsele tasemele. On näidatud seost seerumi alfa-INF taseme ning gripiinfektsiooni raskuse ja kestuse vahel.

Riis. 7. Alfa-IFN taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Enamiku autoimmuunhaiguste, nagu polüartriit, reumatoidartriit, spondüloos, psoriaatiline artriit, rheumaatiline polümüalgia ja sklerodermia, süsteemne erütematoosluupus ja süsteemne vaskuliit, all kannatavate patsientide seerumis on täheldatud alfa-IFN kontsentratsiooni tõusu. Selle interferooni kõrget taset täheldatakse ka mõnel patsiendil peptilise haavandi ja sapikivitõve ägenemise ajal. Alfa-INF kontsentratsioonide vahemik oli 0–93 pg / ml, keskmine oli 20 pg / ml. Normaalne vahemik on kuni 45 pg/ml (joonis 7).

Alfa-IFN-vastased antikehad.

Alfa-IFN-i vastaseid antikehi saab tuvastada somaatilise erütematoosse luupusega patsientide seerumis. Alfa-IFN-i vastaste antikehade spontaanset indutseerimist täheldatakse ka erinevate vähivormidega patsientide seerumis. Mõnel juhul leiti alfa-IFN-i antikehi HIV-nakkusega patsientide seerumis, samuti ägedas faasis meningiidiga patsientide tserebrospinaalvedelikus ja seerumis, kroonilise polüartriidiga patsientide seerumis.

Riis. 8. Alfa-IFN-i vastaste antikehade taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Alfa-IFN on üks tõhusamaid viiruse- ja kasvajavastaseid terapeutilisi ravimeid, kuid selle pikaajaline kasutamine võib viia alfa-IFN-i spetsiifiliste antikehade tekkeni. See vähendab ravi efektiivsust ja mõnel juhul põhjustab erinevaid kõrvalnähte: gripilaadsusest autoimmuunhaiguste tekkeni. Seda silmas pidades on INF-ravi ajal oluline kontrollida alfa-INF-i vastaste antikehade taset patsiendi kehas. Nende moodustumine sõltub ravis kasutatava ravimi tüübist, ravi kestusest ja haiguse tüübist. Alfa-IFN-i vastaste antikehade kontsentratsioonide vahemik oli 0–126 ng / ml, keskmine oli 6,2 ng / ml. Normaalne vahemik on kuni 15 ng / ml (joonis 8). Tsütokiinide taseme hindamine CJSC "Vector-Best" kaubanduslikult saadavate reaktiivikomplektide abil võimaldab uut lähenemist organismi immuunsüsteemi seisundi uurimisele kliinilises praktikas.

Tsütokiinidel põhinevad immunotroopsed ravimid.

Huvitav töö S. Simbirtseva, Väga puhaste bioloogiliste toodete riiklik uurimisinstituut, Venemaa tervishoiuministeerium, Peterburi). Tsütokiinid saab eraldada uude sõltumatusse keha põhifunktsioonide reguleerimise süsteemi, mis eksisteerib koos närvi- ja endokriinsüsteemiga. reguleerimine ja on peamiselt seotud homöostaasi säilitamisega patogeenide sissetoomise ja kudede terviklikkuse rikkumise ajal. Selle uue reguleerivate molekulide klassi lõi loodus miljonite aastate pikkuse evolutsiooni käigus ja sellel on piiramatu potentsiaal ravimitena kasutamiseks. Immuunsüsteemis vahendavad tsütokiinid seost mittespetsiifiliste kaitsereaktsioonide ja spetsiifilise immuunsuse vahel, toimides mõlemas suunas. Keha tasandil suhtlevad tsütokiinid immuun-, närvi-, endokriin-, vereloome- ja muude süsteemide vahel ning aitavad neid kaasata kaitsereaktsioonide korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinide intensiivse uurimise liikumapanev jõud on alati olnud paljutõotav väljavaade nende kliiniliseks kasutamiseks laialt levinud haiguste, sealhulgas vähi, nakkus- ja immuunpuudulikkuse haiguste raviks. Venemaal on registreeritud mitmeid tsütokiinipreparaate, sealhulgas interferoonid, kolooniaid stimuleerivad tegurid, interleukiinid ja nende antagonistid ning tuumori nekroosifaktor. Kõik tsütokiinipreparaadid võib jagada looduslikeks ja rekombinantseteks. Looduslikud preparaadid on erineva puhastusastmega preparaadid, mis on saadud stimuleeritud eukarüootsete rakkude, peamiselt inimrakkude söötmest. Peamised puudused on madal puhastusaste, standardimise võimatus komponentide suure arvu tõttu ja verekomponentide kasutamine tootmises. Ilmselt on tsütokiiniteraapia tulevik seotud biotehnoloogia uusimate edusammude abil saadud geneetiliselt muundatud ravimitega. Viimase kahe aastakümne jooksul on enamiku tsütokiinide geene kloonitud ja saadud rekombinantseid analooge, mis kordavad täielikult looduslike molekulide bioloogilisi omadusi. Kliinilises praktikas on tsütokiinide kasutamisel kolm peamist valdkonda:

1) tsütokiiniteraapia organismi kaitsereaktsioonide aktiveerimiseks, immunomodulatsiooniks või endogeensete tsütokiinide puuduse täiendamiseks;

2) tsütokiinide vastane immunosupressiivne ravi, mille eesmärk on tsütokiinide ja nende retseptorite bioloogilise toime blokeerimine;

3) tsütokiini geeniteraapia kasvajavastase immuunsuse tugevdamiseks või tsütokiinisüsteemi geneetiliste defektide korrigeerimiseks.

Mitmeid tsütokiine saab kliiniliselt kasutada süsteemseks ja lokaalseks kasutamiseks. Süsteemne manustamine on põhjendatud juhtudel, kui immuunsuse tõhusamaks aktiveerimiseks on vaja tagada tsütokiinide toime mitmes elundis või aktiveerida erinevates kehaosades paiknevad sihtrakud. Muudel juhtudel on paiksel kasutamisel mitmeid eeliseid, kuna see võimaldab saavutada toimeaine kõrge lokaalse kontsentratsiooni, sihipäraselt mõjutada sihtorganit ja vältida soovimatuid süsteemseid ilminguid. Praegu peetakse tsütokiine üheks kõige lootustandvamaks ravimiks kliinilises praktikas.

Järeldus.

Seega ei ole praegu kahtlust, et tsütokiinid on immunopatogeneesi kõige olulisemad tegurid. Tsütokiinide taseme uurimine annab teavet erinevat tüüpi immunokompetentsete rakkude funktsionaalse aktiivsuse, I ja II tüüpi T-abistajate aktivatsiooniprotsesside suhte kohta, mis on väga oluline mitmete nakkushaiguste ja haiguste diferentsiaaldiagnostikas. immunopatoloogilised protsessid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mille kaudu immuunsüsteemi rakud saavad teavet vahetada ja üksteisega suhelda. Tänaseks on avastatud üle saja erineva tsütokiini, mis tinglikult jagunevad põletikueelseteks (põletikku provotseerivateks) ja põletikuvastasteks (põletiku arengut ennetavateks). Niisiis jagunevad tsütokiinide erinevad bioloogilised funktsioonid kolme rühma: nad kontrollivad immuunsüsteemi arengut ja homöostaasi, kontrollivad vererakkude kasvu ja diferentseerumist (vereloomesüsteem) ning osalevad keha mittespetsiifilistes kaitsereaktsioonides, mõjutades põletikulisi protsesse. protsessid, vere hüübimine, vererõhk.

Kasutatud kirjanduse loetelu.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihhailova. / Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool, Riiklik Koloproktoloogia Teaduskeskus, Moskva ja Riiklik Väga puhaste bioloogiliste toodete uurimisinstituut, Peterburi.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Ajakiri "Tsütokiinid ja põletikud", 2005, nr 1 T. 4, nr 1. Lk 22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavishnikov, JSC "Vector-Best" töö materjalid.

A.S. Simbirtsev, Venemaa tervishoiuministeeriumi ülipuhaste bioloogiliste toodete riiklik uurimisinstituut, Peterburi.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Riiklik ülipuhaste biopreparaatide uurimisinstituut, Peterburi.

T.A. Šumatova, V. B. Šumatov, E. V. Markelova, L. G. Kuiv-soe. Vladivostoki Riikliku Meditsiiniülikooli anestesioloogia ja reanimatoloogia osakond.

Töös kasutati materjale saidilt http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

teatud nakkushaiguste patogeenid. Niisiis, norsulfasool ...

1. Viirusevastase immuunsuse molekulaarsed ja rakulised mehhanismid, arengumustrid ja immunopaatia

   Abstraktne >> Meditsiin, tervis

   ... "sait" viitab konkreetsele saidile teatud polüpeptiid (antigeen), millega ... selle varases staadiumis. Tsütokiinid ja kemokiinid. muud tsütokiinid, lisaks interferoonidele ... toodetud nende poolt ajaühikus tsütokiinid määrab vohamise intensiivsuse ja ...

2. Luuüdi fibroosi tekke põhjuste uurimine müeloproliferatiivsete haiguste korral, analüüsides trombotsüütide faktorite mõju mesenhümaalsetele tüvirakkudele

   Kodutöö >> Meditsiin, tervis

   Erinevad kontsentratsioonid; - kvantitatiivne määratlus valk katsesüsteemides ... viivad pikaajalise toimeni tsütokiin, mis suurendab fibroosi protsessi ... trombotsüüdid. Samuti suurenenud sisu tsütokiin leiti uriinist...

3. Tuberkuloosi patogenees inimestel

   Abstraktne >> Meditsiin, tervis

   Kuid võimalik on ka toitumine. Teatud mängib rolli aerogeenses infektsioonis ... mängib, erituvad makrofaagide ja monotsüütide poolt tsütokiin- kasvaja nekroosifaktor (TNF). ... ioone, iga rakk omab teatud süsteem, mis tagab ainete transpordi ...

Tsütokiinid on põletiku peamised humoraalsed tegurid, mis on vajalikud kaasasündinud immuunsuse kaitsefunktsioonide rakendamiseks. Põletiku tekkega on seotud kolm tsütokiinide rühma – põletikulised või põletikueelsed tsütokiinid, kemokiinid, kolooniaid stimuleerivad faktorid, aga ka funktsionaalselt seotud tegurid IL-12 ja IFNy. Tsütokiinid mängivad olulist rolli ka põletikulise reaktsiooni mahasurumisel ja kontrolli all hoidmisel. Põletikuvastased tsütokiinid hõlmavad transformeerivat kasvufaktorit β (TGFp), IL-10; sageli mängib põletikuvastase faktori rolli IL-4.
Põletikueelsete tsütokiinide rühmas on 3 peamist esindajat - TNFa, IL-1 ja IL-6; suhteliselt hiljuti lisati neile IL-17 ja IL-18. Neid tsütokiine toodavad peamiselt aktiveeritud monotsüüdid ja makrofaagid, peamiselt põletikukohas. Põletikueelseid tsütokiine võivad toota ka neutrofiilid, dendriitrakud, aktiveeritud B-, NK- ja T-lümfotsüüdid. Patogeeni tungimise fookuses on tsütokiinid esimesed, mis sünteesivad mõned kohalikud põletikulised makrofaagid. Seejärel suureneb leukotsüütide vereringest väljarände käigus produtseerivate rakkude arv ja nende spekter laieneb. Eelkõige on põletikueelsete tsütokiinide sünteesiga seotud mikroorganismide saaduste ja põletikufaktorite poolt stimuleeritud epiteeli-, endoteeli-, sünoviaal-, gliiarakud ja fibroblastid. Tsütokiini geenid klassifitseeritakse indutseeritavateks. Nende ekspressiooni loomulikud indutseerijad on patogeenid ja nende tooted, mis toimivad TLR-ide ja muude patogeensete retseptorite kaudu. Klassikaline induktor on bakteriaalne LPS. Samal ajal on mõned põletikueelsed tsütokiinid (IL-1, TNFa) ise võimelised indutseerima põletikueelsete tsütokiinide sünteesi.
Põletikueelsed tsütokiinid sünteesitakse ja sekreteeritakse üsna kiiresti, kuigi selle rühma erinevate tsütokiinide sünteesi kineetika ei ole sama. Tüüpilistel juhtudel (kiire valik) täheldatakse nende mRNA ekspressiooni 15-30 minutit pärast induktsiooni, valguprodukti ilmumist tsütoplasmas - 30-60 minuti pärast saavutab selle sisaldus rakuvälises keskkonnas maksimumi 3-3 4 tundi.Tsütokiinide süntees konkreetse raku poolt jätkub üsna lühikest aega – tavaliselt veidi rohkem kui ööpäeva. Mitte kogu sünteesitud materjal ei eritu. Teatud kogus tsütokiine ekspresseerub raku pinnal või sisaldub tsütoplasmaatilistes graanulites. Graanulite vabanemine võib põhjustada samu aktiveerivaid signaale kui tsütokiinide tootmine. See tagab tsütokiinide kiire (20 minuti jooksul) voolu kahjustuse fookusesse.
Põletikueelsed tsütokiinid täidavad paljusid funktsioone. Nende peamine roll on põletikulise reaktsiooni "organiseerimine" (joonis 2.55). Põletikueelsete tsütokiinide üks olulisemaid ja varajasemaid mõjusid on adhesioonimolekulide ekspressiooni suurenemine endoteelirakkudel, aga ka leukotsüütidel endil, mis viib leukotsüütide migreerumiseni vereringest põletikukoldesse (vt lõik 2.3.3). ). Lisaks indutseerivad tsütokiinid rakkude hapniku metabolismi suurenemist, nende tsütokiinide ja teiste põletikuliste tegurite retseptorite ekspressiooni, tsütokiinide, bakteritsiidsete peptiidide tootmise stimuleerimist jne. Põletikueelsetel tsütokiinidel on valdavalt lokaalne toime. Liiga sekreteeritud proinflammatoorsete tsütokiinide sattumine vereringesse soodustab põletiku süsteemsete mõjude avaldumist ning stimuleerib ka tsütokiinide tootmist põletikukoldest kaugemal asuvates rakkudes. Süsteemsel tasandil stimuleerivad põletikueelsed tsütokiinid ägeda faasi valkude tootmist, põhjustavad kehatemperatuuri tõusu ja toimivad

Riis. 2.55. Intratsellulaarne signaalimine, mille käivitavad põletikueelsed tsütokiinid ja põletikueelse geeni aktiveerimise mehhanismid

endokriin- ja närvisüsteemid ning suurtes annustes põhjustavad patoloogiliste mõjude (lihast kuni šokini, sarnane septilisele) tekkele.
IL-1 on rohkem kui 11 molekuli sisaldava valkude perekonna kollektiivne nimetus. Enamiku nende funktsioon on teadmata, kuid 5 molekuli - IL-1a (tänapäevase klassifikatsiooni järgi - IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL) -1F4) ja IL-33 (IL-1F11) on aktiivsed tsütokiinid.
IL-1a ja IL-1P nimetatakse traditsiooniliselt IL-1-ks, kuna need interakteeruvad sama retseptoriga ja nende mõju on eristamatu. Nende tsütokiinide geenid asuvad inimese 2. kromosoomi pikas harus. Nendevaheline homoloogia nukleotiidide tasemel on 45%, aminohapete tasemel - 26%. Mõlemad molekulid on p-volditud struktuuriga: need sisaldavad 6 paari antiparalleelseid p-kihte ja on trefoili kujuga. Rakud sünteesivad umbes 30 kDa molekulmassiga prekursormolekuli, millel puuduvad signaalpeptiidid, mis viitab IL-1 molekuli ebatavalisele töötlemisele. Küpsete valkude molekulmass on umbes 18 kDa.
IL-1a esineb kolmel kujul – rakusisene (lahustuv molekul esineb tsütosoolis ja täidab regulatoorseid funktsioone), membraan (molekul toimetatakse raku pinnale mehhanismi kaudu, mis sarnaneb retseptori ringlussevõtule ja ankurdatakse membraani) ja sekretsioon. (molekul eritub algsel kujul, kuid läbib töötlemise – lõhustatakse rakuväliste proteaaside poolt, moodustades aktiivse tsütokiini massiga 18 kDa). IL-1a molekuli peamine variant inimestel on membraanivariant. Sellisel kujul on tsütokiini toime rohkem väljendunud, kuid avaldub ainult lokaalselt.
IL-1P töötlemine toimub rakus spetsiaalse ensüümi IL-1 konvertaasi (kaspaas 1) osalusel, mis asub lüsosoomides.
See ensüüm aktiveerub põletikulise osana – ajutine supramolekulaarne struktuur, mis sisaldab lisaks inaktiivsele kaspaasile 1 ka NLR perekonna rakusiseseid retseptoreid (vt punkt 2.2.3) – NOD1, NOD2, IPAF jne, mis põhjustab arengut. aktiveerimissignaalist. Selle tulemusena moodustub transkriptsioonifaktor NF-kB ja indutseeritakse põletikku soodustavad geenid, samuti aktiveeruvad inflammosoom ja selles sisalduv kaspaas 1. Aktiveeritud ensüüm lõhustab IL-1P prekursormolekuli ja saadud küpset tsütokiini molekulmassiga 18 kDa sekreteerib rakk.
IL-1a, IL-1P ja IL-1 retseptori antagonistil on ühised retseptorid, mis ekspresseeruvad spontaanselt paljudel rakutüüpidel. Kui rakud on aktiveeritud, suureneb nendes IL-1 membraaniretseptorite arv. Peamine, IL-1RI, sisaldab rakuvälises osas 3 immunoglobuliinilaadset domeeni. Selle rakusisene osa on TIR domeen, mis on struktuurilt sarnane analoogsete TLR domeenidega ja käivitab samad signaalirajad (vt punkt 2.2.1). Nende retseptorite arv on väike (200-300 raku kohta), kuid neil on kõrge afiinsus IL-1 suhtes (Kd on 10-11 M). Teisel retseptoril, IL-1RII, puudub tsütoplasmaatilises osas signaalikomponent, see ei edasta signaali ja toimib peibutusretseptorina. Signaali ülekanne IL-1RI-st hõlmab samu tegureid, mis TLR-ide puhul (näiteks MyD88, IRAK ja TRAF6), mis viib sarnaste tulemusteni - transkriptsioonifaktorite NF-kB ja AP-1 moodustumine, mis põhjustavad sama geenide komplekt (vt joonis 2.12). Need geenid vastutavad põletikueelsete tsütokiinide, kemokiinide, adhesioonimolekulide, fagotsüütide bakteritsiidset toimet tagavate ensüümide ja teiste geenide sünteesi eest, mille saadused on seotud põletikulise vastuse väljakujunemisega. IL-1 ise kuulub toodete hulka, mille sekretsiooni indutseerib IL-1, st. sel juhul vallandub positiivne tagasiside ahel.
Kõik keharakud võivad potentsiaalselt olla IL-1 sihtmärgid. Selle toime mõjutab kõige enam endoteelirakke, igat tüüpi leukotsüüte, kõhre- ja luukoe rakke, sünoviaal- ja epiteelirakke ning mitut tüüpi närvirakke. IL-1 mõjul indutseeritakse enam kui 100 geeni ekspressioon; selle osalusel realiseeritakse enam kui 50 erinevat bioloogilist reaktsiooni. IL-1 peamised mõjud on leukotsüütide väljaränne ning nende fagotsüütilise ja bakteritsiidse aktiivsuse aktiveerimine. Need mõjutavad ka hüübimissüsteemi ja veresoonte toonust, määrates hemodünaamika tunnused põletiku fookuses. IL-1 avaldab mitmekülgset mõju mitte ainult kaasasündinud, vaid ka adaptiivse immuunsuse rakkudele, stimuleerides tavaliselt mõlema avaldumist.
IL-1-l on palju süsteemseid toimeid. See stimuleerib ägeda faasi valkude tootmist hepatotsüütide poolt, kui hüpotalamuse termoregulatsiooni keskusele toimides põhjustab palaviku teket, osaleb põletikulise protsessi süsteemsete ilmingute (nt halb enesetunne, söögiisu vähenemine, unisus, adünaamia) väljakujunemises. ), mis on seotud IL-1 toimega kesknärvisüsteemile. Suurendades kolooniaid stimuleerivate tegurite retseptorite ekspressiooni, suurendab IL-1 vereloomet, mis on seotud selle radioprotektiivse toimega. IL-1 stimuleerib leukotsüütide, peamiselt neutrofiilide, sealhulgas ebaküpsete vabanemist luuüdist, mis põhjustab põletiku ajal leukotsütoosi ilmnemist ja leukotsüütide valemi nihkumist vasakule (ebaküpsete rakuvormide kuhjumine). IL-1 mõju mõjutab autonoomseid funktsioone ja isegi kõrgemat närviaktiivsust (muutused käitumuslikes reaktsioonides jne). Kondrotsüüdid ja osteotsüüdid võivad olla ka IL-1 sihtmärgid, mis on seotud IL-1 võimega põhjustada kõhre ja luu hävimist, kui nad osalevad põletikulises protsessis, ja vastupidi, patoloogiliste kudede hüperplaasiat (reumatoidsetel juhtudel pannus). artriit). IL-1 kahjustav toime avaldub ka septilises šokis, reumatoidartriidi liigesekahjustuses ja mitmetes muudes patoloogilistes protsessides.
Bakteriaalsete toodete IL-1 toimete dubleerimine on seotud patogeenide aktiveeriva toime mitmekordse reprodutseerimise vajadusega ilma nende levikuta. Mikroorganismid stimuleerivad ainult sisenemiskoha vahetus läheduses olevaid rakke, peamiselt kohalikke makrofaage. Seejärel kordavad IL-1p molekulid sama efekti mitu korda. Selle funktsiooni täitmist IL-1 poolt soodustab nende retseptorite ekspressioon peaaegu kõigis keharakkudes pärast aktiveerimist (esineb peamiselt põletikukoldes).
IL-1 retseptori antagonist (IL-1RA) on homoloogne IL-1a ja IL-1P-ga (homoloogia on vastavalt 26% ja 19%). See interakteerub IL-1 retseptoritega, kuid ei suuda rakku signaali edastada. Selle tulemusena toimib IL-1RA IL-1 spetsiifilise antagonistina. IL-1RA-d sekreteerivad samad rakud mis IL-1, see protsess ei nõua kaspaas 1 osalemist. IL-1RA tootmist kutsuvad esile samad tegurid, mis IL-1 sünteesi, kuid osa sellest on spontaanselt toodetud makrofaagide ja hepatotsüütide poolt. Selle tulemusena on see tegur vereseerumis pidevalt olemas. See on tõenäoliselt vajalik ägeda põletiku korral märkimisväärses koguses toodetava IL-1 süsteemse toime negatiivsete tagajärgede ärahoidmiseks. Rekombinantset IL-1RA-d testitakse praegu ravimina krooniliste põletikuliste haiguste (reumatoidartriit jne) ravis.
IL-18 on IL-f-ga ​​seotud põletikueelne tsütokiin: seda sünteesitakse ka kaspaas 1 poolt muundatuna prekursorina; interakteerub retseptoriga, mille tsütoplasmaatiline osa sisaldab TIR domeeni ja edastab signaali, mis viib NF-kB aktiveerimiseni. Selle tulemusena aktiveeruvad kõik põletikueelsed geenid, kuid see on vähem väljendunud kui IL-1 toimel. IL-18 eraldiseisvaks omaduseks on IFNy sünteesi indutseerimine (eriti kombinatsioonis IL-12-ga) rakkude poolt. IL-12 puudumisel indutseerib IL-18 IFNy antagonisti IL-4 sünteesi ja soodustab allergiliste reaktsioonide teket. IL-18 toimet piirab lahustuv antagonist, mis seob seda vedelas faasis.
IL-33 on struktuurilt väga sarnane IL-18-ga. IL-33 töötlemine toimub ka kaspaas 1 osalusel. Kuid see tsütokiin erineb teistest IL-1 perekonna liikmetest oma funktsioonide poolest. IL-33 toime eripära on suuresti tingitud asjaolust, et selle retseptorit ekspresseeritakse selektiivselt Ig2 rakkudel. Sellega seoses soodustab IL-33 ^ 2-tsütokiinide IL-4, IL-5, IL-13 sekretsiooni ja allergiliste protsesside arengut. Sellel puudub märkimisväärne põletikuvastane toime.
Kasvajanekroosifaktor a (TNFa või TNFa) on teise immunoloogiliselt oluliste valkude perekonna liige. See on laia toimespektriga põletikueelne tsütokiin. TNFa-l on b-kordne struktuur. See sünteesitakse funktsionaalselt aktiivse membraanimolekulina pro-TNFa molekulmassiga 27 kDa, mis on II tüüpi transmembraanne valk (st selle N-terminaalne osa on suunatud rakku). Proteolüüsi tulemusena moodustub rakuvälises domeenis lahustuv monomeer molekulmassiga 17 kDa. TNFa monomeerid moodustavad spontaanselt 52 kDa trimeeri, mis esindab selle tsütokiini peamist vormi. Trimeeril on kellakujuline kuju ja subühikud on ühendatud nende C-otstega, millest igaüks sisaldab 3 sidumissaiti retseptoriga, samas kui N-otsad ei ole üksteisega ühendatud ega osale interaktsioonis retseptoritega (ja seega oma funktsioonide täitmisel tsütokiini poolt). Happeliste pH väärtuste korral omandab TNFa a-spiraalse struktuuri, mis põhjustab muutusi mõnes selle funktsioonis, eriti tsütotoksilisuse suurenemist. TNF on TNF-i superperekonna molekulide suure perekonna prototüüpne liige (tabel 2.31). See sisaldab lümfotoksiine a ja b (ainult esimene eksisteerib lahustuval kujul), samuti paljusid rakkudevahelistes interaktsioonides osalevaid membraanimolekule (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), mida mainitakse allpool. erinevates kontekstides. Tänapäevase nomenklatuuri järgi koosneb superperekonna liikmete nimi lühendist TNFSF ja seerianumbrist (TNFa puhul - TNFSF2, lümfotoksiin a puhul - TNFSF1).
Tabel 2.31. Kasvaja nekroosifaktori ja selle retseptorite perekondade peamised esindajad

Tegur (ligand)	Chro mosoma	Molekulmass, kDa	Retseptor
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimer - 52; glükosüülitud vorm - 25,6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Lümfotoksiin (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Lümfotoksiin B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
RADA (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
APRILL (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
KERGUS (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

TNFa, nagu IL-1, peamised tootjad on monotsüüdid ja makrofaagid. Seda sekreteerivad ka neutrofiilid, endoteeli- ja epiteelirakud, eosinofiilid, nuumrakud, B- ja T-lümfotsüüdid, kui nad osalevad põletikulises protsessis. TNFa tuvastatakse vereringes varem kui teised põletikueelsed tsütokiinid - juba 20-30 minutit pärast põletiku esilekutsumist, mis on seotud molekuli membraanivormi "dumpinguga" rakkude poolt ja võib-olla ka TNFa vabanemisega. graanulite sisus.
TNFa ja lümfotoksiin a jaoks on ühiseid kahte tüüpi TNF-retseptoreid – TNFRI (tuumori nekroosifaktori retseptorist I) ja TNFRII molekulmassiga vastavalt 55 ja 75 kDa. TNFRI esineb peaaegu kõigil keharakkudel, välja arvatud erütrotsüüdid, ja TNFRII esineb peamiselt immuunsüsteemi rakkudel. TNFR-id moodustavad suure perekonna, mis hõlmab molekule, mis on seotud rakkude interaktsiooni ja rakusurma – apoptoosi – esilekutsumisega. TNFa afiinsus TNFRI suhtes on madalam kui TNFRI puhul (vastavalt umbes 5x10-10 M ja 55x10-11 M) TNFa-trimeeri seondumisel toimub selle retseptorite signaaliülekandeks vajalik trimerisatsioon.
Nende retseptorite signaaliülekande omadused on suures osas määratud nende rakusisese osa struktuuriga. TNFRI tsütoplasmaatilist osa esindab nn surmadomeen, kust võetakse vastu signaale, mis viivad apoptoosimehhanismi aktiveerumiseni; TNFRII-l puudub surma domeen. TNFRI signaalimine toimub adaptervalkude TRADD (TNFR-ga seotud surmadomeen) ja FADD (Fas-assotsieerunud surmadomeen) osalusel, mis sisaldavad ka surma domeene. Lisaks apoptoosi tekkeni viivale rajale (kaspaas 8 aktiveerimise või keramiidi sünteesi kaudu) eristatakse mitmeid signalisatsiooniteid, mis aktiveeruvad faktorite TRAF2 / 5 ja RIP-1 osalusel. Esimene neist teguritest edastab signaali mööda rada, mis viib NF-kB faktori aktiveerumiseni, st. klassikalise põletikueelsete geenide indutseerimise teel (vt joonis 2.55). Faktori RIP-1 poolt aktiveeritud signaalirada viib MAP-kaskaadi aktiveerimiseni lõpptootega, transkriptsioonifaktoriga AP-1. See tegur hõlmab geene, mis tagavad rakkude aktivatsiooni ja takistavad apoptoosi teket. Seega määrab raku saatuse pro- ja anti-apoptootiliste mehhanismide tasakaal, mis käivituvad, kui TNFa seondub TNFRI-ga.
TNFa funktsioonide rakendamine on peamiselt seotud TNFRI kaudu toimuva toimega - vastava geeni väljalülitamine viib raske immuunpuudulikkuse tekkeni, samas kui TNFRII geeni inaktiveerimise tagajärjed on ebaolulised. Põletikulise vastuse haripunktis saab TNFa retseptoreid membraanilt "välja visata" ja vabastada rakkudevahelisse ruumi, kus nad seovad TNFa-d, avaldades põletikuvastast toimet. Sellega seoses kasutatakse krooniliste põletikuliste haiguste ravis TNFR-i lahustuvaid vorme. Selgus, et lahustuval TNFRII-l põhinev ravim osutus kliiniliselt kõige tõhusamaks.
Sarnaselt IL-1-le suurendab TNFa adhesioonimolekulide ekspressiooni, põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide, ägeda faasi valkude, fagotsüütiliste rakkude ensüümide jne sünteesi. Koos IL-1-ga osaleb TNFa kõigi peamiste lokaalsete ja ka mõnede põletikuliste süsteemsete ilmingute tekkes. See aktiveerib endoteelirakke, stimuleerib angiogeneesi, suurendab migratsiooni ja aktiveerib leukotsüüte. TNFa mõjutab lümfotsüütide aktivatsiooni ja proliferatsiooni suuremal määral kui IL-1. Kombinatsioonis IFNy-ga indutseerib TNFa NO süntaasi aktiivsust fagotsüütides, mis suurendab oluliselt nende bakteritsiidset potentsiaali. TNFa stimuleerib fibroblastide proliferatsiooni, soodustades haavade paranemist. Suurenenud kohaliku TNFa tootmisega domineerivad koekahjustused, mis väljenduvad hemorraagilise nekroosi tekkes. Lisaks pärsib TNFa lipoproteiini lipaasi aktiivsust, mis nõrgendab lipogeneesi ja viib kahheksia tekkeni (üks TNFa algseid nimetusi on kahheksiin). TNFa suurenenud vabanemine ja selle kogunemine vereringesse, näiteks suurtes annustes bakteriaalsete superantigeenide toimel, põhjustab raske patoloogia - septilise šoki - arengu. Seega võib TNFa toimega, mille eesmärk on täita kaitsefunktsiooni ja säilitada homöostaasi, kaasneda tõsine toksiline toime (lokaalne ja süsteemne), mis põhjustab sageli surma.
IL-6 on laia toimespektriga põletikku soodustav tsütokiin. See toimib ka prototüüpse tegurina tsütokiinide perekonnas, mis sisaldab lisaks IL-6-le endale onkostatiin M (OSM), leukeemiat inhibeeriv faktor (LIF), tsiliaarne neurotroofne faktor (CNTF), kardiotropiin-1 (CT-1). ) ning IL-11 ja IL-31. IL-6 molekulmass on 21 kDa. IL-6 toodavad monotsüüdid ja makrofaagid, endoteeli-, epiteeli-, gliia-, silelihasrakud, fibroblastid, Th2 tüüpi T-lümfotsüüdid, aga ka paljud kasvajarakud. IL-6 tootmine müeloidrakkude poolt indutseeritakse, kui nende TLR interakteerub mikroorganismide ja nende saadustega, samuti IL-1 ja TNFa mõjul. Samal ajal suureneb IL-6 sisaldus vereplasmas 2 tunni jooksul 1000 korda.
IL-6 perekonna kõigi tegurite retseptorid sisaldavad ühist komponenti - gp130 ahelat, mis esineb peaaegu kõigis keharakkudes. Retseptori teine ​​komponent on iga tsütokiini jaoks individuaalne. Selle tsütokiini seondumise eest vastutab IL-6 retseptori spetsiifiline ahel (gp80), samas kui gp130 on seotud signaaliülekandega, kuna see on seotud türosiinkinaasidega Jak1 ja Jak2. Kui IL-6 interakteerub retseptoriga, käivitatakse järgmine sündmuste jada: IL-6 monomeer interakteerub gp80 ahelaga, toimub komplekside dimerisatsioon (2 tsütokiini molekuli - 2 gp80 ahelat), mille järel kinnitub 2 gp130 ahelat. kompleks, mis viib Jak-kinaasi fosforüülimiseni. Viimased fosforüülivad faktoreid STAT1 ja STAT3, mis dimeriseerivad, liiguvad tuuma ja seovad sihtgeenide promootoreid. gp80 ahel pestakse rakult kergesti maha; vabal kujul interakteerub tsütokiiniga, inaktiveerides selle, s.t. toimib spetsiifilise IL-6 inhibiitorina.
IL-6 osaleb peaaegu kogu põletiku lokaalsete ilmingute kompleksi esilekutsumises. See mõjutab fagotsüütide migratsiooni, suurendades monotsüüte ja lümfotsüüte meelitavate CC-kemokiinide tootmist ning nõrgestades neutrofiile meelitavate CX-kemokiinide tootmist. IL-6 põletikueelne toime on nõrgem kui IL-1 ja TNFa oma, vastupidiselt sellele see ei suurenda, vaid pärsib põletikueelsete tsütokiinide (IL-1, TNFa ja IL-6) ja kemokiinide tootmist kaasatud rakkude poolt. põletikulises protsessis. Seega ühendab IL-6 põletikueelsete ja põletikuvastaste tsütokiinide omadused ning osaleb mitte ainult põletikulise vastuse väljatöötamises, vaid ka selle piiramises.
IL-6 on peamine tegur, mis indutseerib ägeda faasi valgu geenide ekspressiooni hepatotsüütides. IL-6 mõjutab hematopoeesi erinevaid etappe, sealhulgas tüvirakkude proliferatsiooni ja diferentseerumist. See toimib ebaküpsete plasmarakkude kasvufaktorina, suurendades oluliselt humoraalset immuunvastust. IL-6 mõjutab ka T-lümfotsüüte, suurendades tsütotoksiliste T-rakkude aktiivsust.
IL-17 ja sellega seotud tsütokiinid. Tsütokiinide rühm, sealhulgas IL-17 liigid, on pälvinud laialdast tähelepanu seoses spetsiaalse T-abistajate tüübi Th17 avastamisega, mis osaleb teatud põletikuliste reaktsioonide kahjustavate vormide väljatöötamises, eriti autoimmuunprotsessid (vt punkt 3.4.3.2). Nende tsütokiinide rolli adaptiivse immuunvastuse vastustes käsitletakse allpool. Siin anname tsütokiinide üldise kirjelduse ja käsitleme lühidalt nende rolli kaasasündinud immuunsuse reaktsioonides.
IL-17 perekonda kuulub 6 valku, mis on tähistatud tähtedega A kuni F. Nende põletikueelsete tsütokiinide omadused on IL-17A ja IL-17F. Need on disulfiidsidemega homodimeerid; nende molekulmass on 17,5 kDa. Neid tsütokiine toodavad mainitud Th17, aga ka CD8+ T-rakud, eosinofiilid, neutrofiilid. IL-23 stimuleerib TH7 rakkude arengut ja IL-17 tootmist.
IL-17 retseptoreid ekspresseerivad paljud rakud - epiteelirakud, fibroblastid, immuunsüsteemi rakud, eriti neutrofiilid. IL-17 interaktsiooni retseptoriga peamine tulemus, nagu ka teiste põletikueelsete tsütokiinide toime puhul, on NF-kB faktori indutseerimine ja paljude NF-KB-sõltuvate põletikugeenide ekspressioon.
Üks IL-17 (koos IL-23-ga) olulisi bioloogilisi toimeid on neutrofiilide homöostaasi säilitamine. Need tsütokiinid suurendavad neutrofiilide tootmist, stimuleerides G-CSF tootmist. Samal ajal reguleerib IL-17 ja IL-23 tootmise suurenemist või vähenemist perifeersetes kudedes neutrofiilide arv: nende rakkude arvu vähenemine apoptoosi tagajärjel põhjustab rakkude arvu suurenemist. tsütokiinide tootmine.
IL-17 põletikku soodustav toime realiseerub peamiselt teiste tsütokiinide (IL-8, IL-6, y-CSF, mitmed kemokiinid) tootmise ja adhesioonimolekulide ekspressiooni suurenemise kaudu. Hiirtel, kes on transgeensed IL-17 või IL-23 suhtes, areneb süsteemne krooniline interstitsiaalne põletik, millega kaasneb neutrofiilide, eosinofiilide, makrofaagide ja erinevate organite lümfotsüütide infiltratsioon. Neid tsütokiine peetakse krooniliste autoimmuunhaiguste tekkes juhtivaks rolliks.
IL-12 perekond
On tuvastatud, et IL-12 suudab aktiveerida NK-rakke, indutseerida T-lümfotsüütide proliferatsiooni ja indutseerida IFNy sünteesi. IL-12 on kaasasündinud immuunsüsteemi rakkude poolt toodetavate tsütokiinide seas erilisel kohal, kuna see (nagu selle peamised tootjad dendriitrakud) toimib lülina kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuse vahel. Teisest küljest on IL-12 osa IL-12-IFNy tandemist, mis mängib võtmerolli immuunkaitses rakusiseste patogeenide vastu.
IL-12 on dimeer, mis koosneb p40 ja p35 subühikutest. Selle kogumolekulmass on 75 kDa. IL-12 funktsionaalne aktiivsus on seotud selle p40 subühikuga. "Täismahus" IL-12 sekreteerivad aktiveeritud monotsüüdid, makrofaagid, müeloidsed dendriitrakud, neutrofiilid ja barjäärkudede epiteelirakud (need toodavad nii Ig-12p35 kui ka IL-12p40 tsütokiini subühikuid). Enamik keharakke sünteesib ainult funktsionaalselt inaktiivset subühikut ^ -12p35. Raku poolt sekreteeritava IL-12 heterodimeeri kogus on piiratud p35 subühikuga. IL-12p40 sünteesitakse liigselt ja see võib dimeriseerida, moodustades homodimeeri, mis toimib nii IL-12 antagonistina kui ka kemoatraktandina. IL-12 tootmise indutseerijad on peamiselt patogeenid, mida tunnevad ära TLR-id ja muud mustrituvastusretseptorid. IL-12 tootmist võimendavad IL-1, IFNy, samuti rakkudevahelised interaktsioonid, mida vahendavad CD40-CD154 ja teised perekonda kuuluvate molekulide paarid - TNFR.
IL-12 retseptor ekspresseerub kõige tugevamalt NK-rakkudel, aktiveeritud TH-rakkudel ja tsütotoksilistel T-lümfotsüütidel ning vähemal määral dendriitrakkudel. IL-12 retseptori ekspressioon aktiveeritud T-rakkude poolt suureneb IL-12, IFNy, IFNa, TNFa mõjul ja kostimulatsioonil CD28 retseptori kaudu. IL-12 retseptor on dimeer, mille moodustavad IL-12RP1 (100 kDa) ja IL-12RP2 (130 kDa, CD212) subühikud, millega on seotud 85 kDa valk. Nii Pj kui ka p2 ahelad osalevad IL-12 seondumises, samas kui IL-12RP2 subühik on valdavalt seotud signaaliülekandega. Pj ahela rakusisene domeen on seotud JAK2 kinaasiga, P2 ahela rakusisene domeen on seotud Tyk2 kinaasiga. Kinaasid fosforüülivad transkriptsioonifaktoreid STAT1, STAT3, STAT4 ja STAT5.
IL-12 põhifunktsioon, kuna see suudab stimuleerida tsütotoksilisi lümfotsüüte (NK ja T) ja indutseerida Thl-rakkude diferentseerumist (vt punkt 3.4.3.1), on käivitada rakusisesed kaitsemehhanismid rakusiseste patogeenide vastu. IL-12 mõjutab NK- ja NKT-rakke juba immuunprotsesside varases staadiumis, suurendades NK-rakkude proliferatsiooni ja tsütotoksilist aktiivsust ning hiljem tsütotoksilisi T-lümfotsüüte ja IFNy sünteesi kõigi nende rakkude poolt. Veidi hiljem indutseerib IL-12 Thl-rakkude diferentseerumist, mis toodavad ka IFNy-d. Thl-rakkude indutseerimise tingimuseks on IL-12RP2 retseptori subühiku esialgne ekspressioon aktiveeritud CD4+ T-rakkude poolt. Pärast seda omandavad rakud võime siduda IL-12, mis viib STAT4 faktori aktiveerumiseni, mis reguleerib Thl-rakkudele iseloomulike geenide ekspressiooni (IFNG geeni ekspressiooniks transkriptsioonifaktori T toime). -panus on olulisem). Samal ajal pärsib IL-12 ^ 2 rakkude diferentseerumist ja nõrgendab rakkude tootmist
IgE ja IgA klasside antikehade B-seeria. Toimides dendriitidele ja teistele APC-dele, indutseerib IL-12 kostimuleerivate molekulide (CD80 / 86 jne), aga ka MHC-II APC-produktide ekspressiooni. Seega mängib IL-12 kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuse vahelist siduvat rolli ning tugevdab immuunmehhanisme, mis vastutavad rakusiseste patogeenide ja kasvajate eest kaitsmise eest.
IL-12 perekonda kuuluvad IL-23, IL-27 ja IL-35. Need tsütokiinid on heterodimeerid: IL-23 moodustavad kaks alaühikut - I-23p19 ja IL-12p40 (identne IL-12 vastava subühikuga), IL-27 - subühikute Ebi3 ja IL-27p28, IL-35 - poolt. subühikud Ebi3 ja IL-12p35. Neid tsütokiine toodavad peamiselt dendriitrakud. IL-12 perekonna tsütokiinide tootmist käivitavad PAMP ja patogeenidel, eelkõige GM-CSF-il esinevad tsütokiinid.
IL-23 vastuvõtt toimub kahe erineva struktuuri kaudu: IL-12p40 subühiku tunneb ära IL-12 retseptori p-ahel ja R-23p19 alaühikut tunneb ära spetsiaalne retseptor IL-23R. STAT4 mängib IL-23 signaali edastamisel peamist rolli. IL-27 retseptor aktiveerib molekulid WSX-1 (IL-12R p2-subühiku homoloog) ja gp130 (polüpeptiidahel, mis on osa IL-6 perekonna tsütokiinide retseptoritest).
Nagu IL-12, toimivad IL-23 ja IL-27 valdavalt CD4+ T-rakkudele, soodustades nende diferentseerumist mööda Th1 rada. IL-23 omadused - domineeriv mõju mälu T-rakkudele, samuti võime toetada Th17 tüüpi T-abistajate arengut. IL-27 erineb perekonna kahest teisest tsütokiinist selle poolest, et suudab indutseerida mitte ainult aktiveeritud, vaid ka puhkeolekus CD4+ T-rakkude proliferatsiooni. Hiljuti näidati, et IL-27 ja IL-35 võivad toimida reguleerivate (supressor) teguritena, kuna nende Ebi3 subühik on FOXP3 regulatoorsete T-rakkude võtmeteguri sihtmärk.
Kolooniaid stimuleerivaid faktoreid (CSF) (tabel 2.32) ehk hematopoetiinid esindavad kolm tsütokiini – GM-CSF, G-CSF ja M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) on neile funktsionaalselt lähedane. Neid tegureid nimetatakse kolooniaid stimuleerivateks teguriteks, kuna need tuvastati esmalt nende võime järgi toetada vastava koostisega hematopoeetiliste rakukolooniate kasvu in vitro. IL-3-l on kõige laiem toimespekter, kuna see toetab mis tahes hematopoeetiliste rakukolooniate kasvu, välja arvatud lümfoidrakud. GM-CSF toetab nii granulotsüütide-monotsüütide segakolooniate kui ka eraldi granulotsüütide ja monotsüütide/makrofaagide kolooniate kasvu. G-CSF ja M-CSF on spetsialiseerunud oma vastavate kolooniate kasvu ja diferentseerumise säilitamisele. Need tegurid mitte ainult ei taga seda tüüpi hematopoeetiliste rakkude ellujäämist ja vohamist, vaid on võimelised aktiveerima ka juba küpseid diferentseerunud rakke (M-CSF - makrofaagid, G-CSF - neutrofiilid). M-CSF osaleb monotsüütide diferentseerumises makrofaagideks ja pärsib monotsüütide diferentseerumist dendriitrakkudeks. Lisaks sellele, et G-CSF mõjutab vereloome granulotsüütilist haru, põhjustab see hematopoeetiliste tüvirakkude mobilisatsiooni luuüdist vereringesse.
Tabel 2.32. Kolooniaid stimuleerivate tegurite iseloomustus

Nimi ei	Chromo säga	Molekulmass, kDa	Rakud tootjad	Rakud sihtmärk	Retsept tori
GM-CSF	5q	22	Makrofaagid, T-rakud, NK-rakud, stroomarakud, epiteelirakud	Makrofaagid, neutrofiilid, eosinofiilid, T-rakud, dendriitrakud, hematopoeetilised rakud	GM- CSFR a / p
G-CSF	17q	18-22		Neutrofiilid, eosinofiilid, T-rakud, hematopoeetilised rakud	G-CSFR (1 kett)
M-CSF	5q	45/70 (dimeer)	Makrofaagid, stroomarakud, epiteelirakud	Makrofaagid, hematopoeetiline rakud	c-Fms
Tüvirakkude faktor	12q	32	Stromal rakud	Hematopoeetilised rakud, B-rakud, nuumrakud	c-Kit
Flt-3- ligand	19q	26,4	Stromal rakud	Hematopoeetilised rakud, nuumrakud	Flt-3

G-CSF, GM-CSF ja IL-3 on struktuurselt iseloomustatud kui hematopoetiinid, mis sisaldavad 4 a-spiraalset domeeni. Nende retseptorid sisaldavad 2 polüpeptiidahelat, nad kuuluvad hematopoetiini retseptorite perekonda. M-CSF erineb teistest CSF-idest. See on dimeerne molekul ja eksisteerib nii lahustuva kui ka membraaniga seotud kujul. Selle retseptoril on ekstratsellulaarsed Ig-sarnased domeenid ja türosiinkinaasi aktiivsusega rakusisene domeen (selle proto-onkogeenkinaasi nimi - c-Fms - kantakse mõnikord üle kogu retseptorile). Kui M-CSF seondub retseptoritega, toimub nende dimerisatsioon ja kinaasi aktivatsioon.
Kolooniaid stimuleerivaid tegureid toodavad endoteelirakud ja fibroblastid, samuti monotsüüdid/makrofaagid. GM-CSF ja IL-3 sünteesivad ka T-lümfotsüüdid. Bakteriaalsete saaduste (läbi mustrit tuvastavate retseptorite) ja põletikku soodustavate tsütokiinide mõjul suureneb oluliselt kolooniaid stimuleerivate faktorite süntees ja sekretsioon, mis viib müelopoeesi suurenemiseni. Eriti tugevalt stimuleeritakse granulotsütopoeesi, millega kaasneb rakkude, sealhulgas ebaküpsete rakkude kiirenenud emigreerumine perifeeriasse. See loob pildi neutrofiilsest leukotsütoosist koos valemi nihkega paremale, mis on põletikule väga iseloomulik. GM- ja G-CSF-il põhinevaid ravimeid kasutatakse kliinilises praktikas tsütotoksilistest mõjudest nõrgenenud granulotsütopoeesi stimuleerimiseks (kiirgus, kasvajahaiguste ravi keemiaravi jne). G-CSF-i kasutatakse hematopoeetiliste tüvirakkude mobiliseerimiseks, millele järgneb indutseeritud leukoomi kasutamine kahjustatud vereloome taastamiseks.
Tüvirakufaktorit (SCF – stem cell factor, c-kit ligand) eritavad luuüdi stroomarakud (fibroblastid, endoteelirakud), aga ka erinevat tüüpi rakud embrüonaalse arengu käigus. SCF eksisteerib transmembraanse ja lahustuva molekulina (viimane moodustub ekstratsellulaarse osa proteolüütilise lõhustamise tulemusena). SCF tuvastatakse vereplasmas. Selle molekulis on kaks disulfiidsidet. SCF retseptoril c-Kk on türosiinkinaasi aktiivsus ja see on struktuurilt sarnane Flt-3 ja c-Fms-iga (M-CSF retseptor). Kui SCF seondub, retseptorid dimeriseeritakse ja fosforüülitakse. Signaali edastamine toimub PI3K ja MAP-kaskaadi osalusel.
SCF geeni ja selle retseptori mutatsioone on kirjeldatud juba ammu (terasmutatsioonid); hiirtel väljenduvad need karvkatte värvuse muutuses ja vereloome rikkumises. Mutatsioonid, mis häirivad faktori membraanivormi sünteesi, põhjustavad embrüo arengus suuri defekte. Koos teiste teguritega osaleb SCF vereloome tüvirakkude elujõulisuse säilitamises, tagab nende proliferatsiooni ja toetab vereloome varajases staadiumis. SCF on eriti oluline erütropoeesi ja nuumrakkude arengu jaoks ning toimib ka tümotsüütide kasvufaktorina DN1 ja DN2 staadiumis.
Struktuuri ja bioloogilise aktiivsuse poolest on Flt-3L-faktoril (Fms-sarnane türosinkinaasi 3-ligand) SCF-ga sarnased omadused, mis koos teiste teguritega toetab müelopoeesi varajases staadiumis ja B-lümfotsüütide arengut. SCF mängib leukeemiliste müeloblastide kasvufaktori rolli.
Kemokiine, mis on põletiku ja kaasasündinud immuunsuse oluline humoraalne tegur, käsitletakse eespool leukotsüütide kemotaksise kirjelduses (vt punkt 2.3.2).