पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन, इसका सार और एप्लिकेशन क्षेत्र। पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और पीसीआर पॉलिमरस चेन रिएक्शन विधि का उपयोग

बहुत पहले नहीं, किसी व्यक्ति के विभिन्न संक्रामक बीमारियों का निदान करने की एक विश्वसनीय, अत्यधिक संवेदनशील और तेज़ विधि विकसित की गई थी। इस विधि को "पीसीआर" विश्लेषण कहा जाता है। यह क्या है, उसका सार क्या है, जो वह सूक्ष्मजीवों को प्रकट कर सकता है और इसे सही तरीके से कैसे पारित कर सकता है, हम हमें अपने लेख में बताएंगे।

इतिहास उद्घाटन

पीसीआर विधियों का भी कैंसर के निदान में उपयोग किया जाता है।

विधि के लाभ

पीसीआर के निदान में कई लाभ हैं:

1. उच्च संवेदनशील। यहां तक \u200b\u200bकि अगर सूक्ष्मजीव के केवल कुछ डीएनए अणु हैं, तो पीसीआर का विश्लेषण संक्रमण की उपस्थिति निर्धारित करता है। विधि पुरानी और अव्यवस्थित बीमारियों के साथ मदद करेगी। अक्सर, ऐसे मामलों में, सूक्ष्मजीव अन्य तरीकों से गैर-खेती की जाती है।
2. अध्ययन के लिए, कोई भी सामग्री उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, लार, रक्त, लिंग, बाल, बाल उपकला कोशिकाएं। पीआरआर पर रक्त परीक्षण और यूरोजेनिक स्मीयर सबसे आम है।

   

3. फसलों की कोई लंबी खेती की आवश्यकता नहीं है। स्वचालित डायग्नोस्टिक प्रक्रिया आपको 4-5 घंटे के बाद अध्ययन के परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देती है।
4. विधि लगभग 100% विश्वसनीय है। केवल एक झूठे नकारात्मक परिणाम के एकल मामले दर्ज किए जाते हैं।
5. एक सामग्री नमूने से कई प्रकार के रोगजनकों की पहचान करने की क्षमता। यह न केवल बीमारी का निदान करने की प्रक्रिया को गति देता है, बल्कि भौतिक लागत को भी कम करता है। अक्सर डॉक्टर एक व्यापक पीसीआर विश्लेषण नियुक्त करता है। एक सर्वेक्षण की कीमत जिसमें छह रोगजनकों का निर्धारण होता है, लगभग 1,500 रूबल है।

ताकि एक पीसीआर अध्ययन आयोजित करते समय परिणाम विश्वसनीय थे, विश्लेषण को पारित करना आवश्यक है, डायग्नोस्टिक्स के लिए प्रारंभिक तैयारी के लिए सिफारिशों का अनुपालन:

1. लार से गुजरने से पहले, आपको भौतिक बाड़ से 4 घंटे पहले भोजन और दवाओं से बचना चाहिए। प्रक्रिया से तुरंत पहले, उबला हुआ पानी के साथ कुल्ला।
2. उपरोक्त नियमों को निर्देशित किया जाना चाहिए और गाल की भीतरी सतह से नमूना लेते समय। कुल्ला के बाद, ग्रंथि के किनारे को उजागर करने के लिए हल्की त्वचा मालिश करने की सिफारिश की जाती है।
3. मूत्र आमतौर पर घर पर एकत्र किया जाता है। ऐसा करने के लिए, आपको जननांग अंगों का एक पूर्ण शौचालय खर्च करने की आवश्यकता है। एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में, मूत्र के 50-60 मिलीलीटर एकत्र करना आवश्यक है। सामग्री की सफाई सुनिश्चित करने के लिए, योनि में एक टैम्पन डालने की सिफारिश की जाती है, और पुरुष त्वचा को जितना संभव हो सके खींचते हैं। मासिक धर्म निर्वहन की अवधि के दौरान सामग्री दान करना असंभव है।
4. शुक्राणु डालने के लिए, आपको सामग्री की बाड़ से 3 दिन पहले यौन संभोग से बचने की जरूरत है। इसके अलावा, डॉक्टर सौना जाने और गर्म टब को गोद लेने, शराब और तीव्र भोजन को गोद लेने से इनकार करने की सलाह देते हैं। विश्लेषण से 3 घंटे पहले, आपको पेशाब से बचने की जरूरत है।
5. डिलीवरी के लिए, उदाहरण के लिए, यदि क्लैमिडिया पीसीआर में विश्लेषण करते हैं, तो दोनों महिलाओं और पुरुषों को 3 दिनों के भीतर यौन आराम से सिफारिश की जाती है। जीवाणुरोधी दवाओं को लेने के लिए विश्लेषण असंभव से 2 सप्ताह पहले। एक सप्ताह के लिए, अंतरंग जैल, मलम, योनि मोमबत्तियों, मरने का उपयोग करना बंद करना आवश्यक है। अध्ययन से 3 घंटे पहले, आपको पेशाब से बचने की जरूरत है। मासिक धर्म के दौरान, सामग्री की बाड़ नहीं की जाती है, केवल रक्त निर्वहन के समाप्त होने के 3 दिनों के बाद, आप एक यूरोजेनिक स्मीयर ले सकते हैं।

गर्भावस्था के दौरान पीसीआर

प्रतीक्षा अवधि के दौरान, बच्चे के पास यौन रूप से प्रसारित कई संक्रामक बीमारियां होती हैं, भ्रूण के सामान्य विकास के लिए बेहद खतरनाक होती हैं। एसटीडी विकास, गर्भपात या समयपूर्व जन्म, जन्मजात बचपन के दोषों में इंट्रायूटरिन देरी को उत्तेजित कर सकते हैं। इसलिए, पीसीआर विधि की शुरुआती गर्भावस्था में गुजरना जरूरी है। पंजीकृत होने पर सहायता आवश्यक है - 12 सप्ताह तक।



भौतिक बाड़ एक विशेष ब्रश का उपयोग कर गर्भाशय ग्रीवा गर्भाशय से आता है। प्रक्रिया दर्द रहित है और बच्चे को खतरा नहीं बनाती है। आम तौर पर, गर्भावस्था के दौरान, क्लैमिडिया पीसीआर विधि के साथ-साथ यूरेप्लाज्मोसिस, माइकोप्लाज्मोसिस, साइटोमेगागागागागोवायरस, हर्पस, पेपिलोमावायरस पर विश्लेषण करता है। सर्वेक्षणों के इस तरह के एक परिसर को पीसीआर -6 कहा जाता है।

एचआईवी डायग्नोस्टिक्स के लिए पीसीआर

इस तथ्य के कारण कि विधि शरीर में परिवर्तन और निदान करने की शर्तों के लिए बहुत संवेदनशील है, कई कारक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, एचआईवी संक्रमण पर पीसीआर का विश्लेषण एक विश्वसनीय विधि नहीं है, इसकी प्रभावशीलता 96-98% है। शेष 2-4% मामलों में, परीक्षण गलत सकारात्मक परिणाम देता है।

लेकिन पीसीआर निदान के बिना कुछ स्थितियों में, एचआईवी नहीं कर सकता। यह आमतौर पर इसे एलिसा के झूठे नकारात्मक परिणाम वाले लोगों के लिए आयोजित करता है। ऐसे संकेतक सुझाव देते हैं कि व्यक्ति ने अभी तक वायरस को एंटीबॉडी विकसित नहीं की है और मात्रा में कई वृद्धि के बिना प्रकट करना असंभव है। पीसीआर विधि द्वारा रक्त परीक्षण आयोजित करके यह वास्तव में हासिल किया जा सकता है।

एचआईवी पॉजिटिव मदर से पैदा हुए जीवन के पहले वर्ष के निदान के लिए भी आवश्यक है। एक बच्चे की स्थिति को विश्वसनीय रूप से निर्धारित करने का तरीका एकमात्र तरीका है।

हेपेटाइटिस के निदान के लिए पीसीआर

पॉलिमरस चेन रिएक्शन विधि हेपेटाइटिस के डीएनए का पता लगाने की अनुमति देती है, एक वायरस, बी, संक्रमण या रोग के लक्षणों की उपस्थिति के लिए एंटीबॉडी के गठन से पहले। विशेष रूप से प्रभावी हेपेटाइटिस सी के लिए पीसीआर का विश्लेषण है, क्योंकि 85% मामलों में ऐसी बीमारी असीमित होती है और समय पर उपचार के बिना एक पुरानी चरण में जाती है।



कारक एजेंट का समय पर पता लगाने से जटिलताओं और दीर्घकालिक उपचार से बचने में मदद मिलेगी।

पीसीआर की व्यापक परीक्षा

व्यापक पीसीआर विश्लेषण: पॉलिमजर श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा एक परीक्षा, जिसमें एक साथ कई प्रकार के संक्रमणों की परिभाषा शामिल है: माइकोप्लाज्मिस जननांग, होमिनिस मायोप्लाज्मा, गार्डनर्स वागिनिस, कैंडिडा, ट्राइकोमोनास, साइटोमेगालोवायरस, 1 और दूसरे प्रकार के हर्पस, गोनोरिया, पेपिलोमावायरस। इस तरह के निदान की कीमत 2000 से 3,500 रूबल तक है। सामग्री और उपकरणों द्वारा उपयोग किए जाने वाले क्लिनिक के आधार पर, साथ ही विश्लेषण के प्रकार पर: उच्च गुणवत्ता या मात्रात्मक। आपके मामले में क्या आवश्यक है - डॉक्टर तय करेगा। कुछ मामलों में, यह रोगजनक की उपस्थिति को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है, अन्य लोगों में, उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण में, मात्रात्मक टिटर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उपरोक्त सभी कारक एजेंटों के निदान में, परीक्षा को "पीसीआर -12 का विश्लेषण" कहा जाता है।

विश्लेषण के परिणामों को समझना

पीसीआर विश्लेषण को समझना जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। संकेतक के केवल 2 पैमाने हैं - "सकारात्मक परिणाम" और "नकारात्मक परिणाम"। कारक एजेंट का पता लगाने के दौरान, डॉक्टर 99% आत्मविश्वास के साथ रोग की उपस्थिति की पुष्टि कर सकते हैं और रोगी के इलाज के लिए आगे बढ़ सकते हैं। इसी ग्राफ में संक्रमण को निर्धारित करने की मात्रात्मक विधि के साथ, ज्ञात बैक्टीरिया का एक संख्यात्मक संकेतक निर्दिष्ट किया जाएगा। केवल एक डॉक्टर रोग की डिग्री निर्धारित कर सकता है और आवश्यक उपचार नियुक्त कर सकता है।



कुछ मामलों में, उदाहरण के लिए, पीआरआर विधि द्वारा एचआईवी संक्रमण को निर्धारित करने में, नकारात्मक परिणाम के साथ, प्राप्त संकेतकों की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त सर्वेक्षणों की आवश्यकता होती है।

विश्लेषण कैसे पास करें?

पीसीआर विश्लेषण कैसे पास करें: राज्य क्लिनिक में या एक निजी प्रयोगशाला में? दुर्भाग्यवश, नगर चिकित्सा संस्थानों में, उपकरण और विधियां अक्सर अप्रचलित होती हैं। इसलिए, आधुनिक उपकरणों और अत्यधिक योग्य कर्मियों के साथ निजी प्रयोगशालाओं को प्राथमिकता देना बेहतर है। इसके अलावा, एक निजी क्लिनिक में आपको परिणाम बहुत तेज हो जाएगा।

मास्को में, कई निजी प्रयोगशालाएं विभिन्न संक्रमणों के लिए एक पीसीआर विश्लेषण का प्रस्ताव देती हैं। उदाहरण के लिए, ऐसे क्लीनिकों में, जैसे "वीटा", "कॉम्प्लेक्स क्लिनिक", "खुश परिवार", "उरो-प्रो", एक पीसीआर विश्लेषण आयोजित करते हैं। सर्वेक्षण की कीमत 200 रूबल से है। एक रोगजनक निर्धारित करने के लिए।

यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि ज्यादातर मामलों में पीसीआर विधि द्वारा संक्रामक बीमारियों का निदान प्रारंभिक संक्रमण में शरीर में रोगजनक का पता लगाने का एक तेज़ और विश्वसनीय तरीका है। लेकिन फिर भी कुछ मामलों में निदान करने के अन्य तरीकों को चुनने के लायक है। केवल एक विशेषज्ञ इस तरह के एक अध्ययन की आवश्यकता निर्धारित कर सकता है। पीसीआर विश्लेषण को समझने के लिए भी एक पेशेवर दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। डॉक्टर की सिफारिशों का पालन करें और स्वतंत्र रूप से विश्लेषण न दें जिसमें कोई आवश्यकता नहीं है।

इसे अक्सर वायरस को इंगित करने और पहचानने के लिए एक एक्सप्रेस विधि के रूप में उपयोग किया जाता है।

पहली बार, यह विधि 1 9 83 टन में के। मुलिस (यूएसए) द्वारा विकसित की गई थी। इसकी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और निष्पादन की आसानी के कारण, इसका व्यापक रूप से आनुवंशिकी, फोरेंसिक दवा, निदान और अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है।

विधि का सार प्रवर्धन है, यानी, इन विट्रो डीएनए अणु के कड़ाई से परिभाषित टुकड़ों की प्रतियों की संख्या में वृद्धि। इस विधि में एक मैट्रिक्स तंत्र और पूरकता का सिद्धांत है। दो एकल polynucleotide चेन (न्यूक्लिक एसिड) हाइड्रोजन बॉन्ड को एक डबल में बाध्यकारी करने में सक्षम हैं, अगर एक के न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम के अनुरूप है, तो एक दूसरे के न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम के अनुरूप है ताकि उनके नाइट्रोजेनस बेस एडेनाइन-थाइमिन और गुआनिन-साइटोसिन जोड़े बना सकें ।

पीसीआर एक थर्मल स्थिर डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करके डीएनए के प्रवर्धन पर आधारित है, जो दो प्राइमरों से शुरू होने वाले पारस्परिक पूरक डीएनए सर्किट का संश्लेषण करता है। प्राइमर एक डीएनए टुकड़ा है जिसमें 20-30 न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं। ये प्राइमर्स (बीज) विपरीत डीएनए श्रृंखलाओं के पूरक हैं। डीएनए के संश्लेषण के दौरान, प्राइमर्स नए-संवेदन डीएनए अणुओं की श्रृंखला में बनाए जाते हैं।

आमतौर पर पीसीआर 25-40 चक्रों में डाल दिया। प्रत्येक चक्र में तीन चरण शामिल होते हैं: पहला - denaturation 92-95 डिग्री सेल्सियस पर। उसी समय, दो डीएनए श्रृंखलाएं अलग हो जाती हैं; दूसरा - एनीलिंग, या प्राइमर्स के अतिरिक्त 50-65 डिग्री सेल्सियस पर; तीसरा - लम्बाई, या बहुलककरण 68-72 डिग्री सेल्सियस पर, जबकि डीएनए पॉलिमरस चार प्रकार के न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करके डीएनए मैट्रिक्स श्रृंखलाओं के पूरक पूर्णता को पूरा करता है। एक चक्र के परिणामस्वरूप, वांछित अनुवांशिक सामग्री का दोगुना होता है। पहले चक्र में डीएनए चेन-जेनरेटेड दूसरे चक्र के लिए मैट्रिक्स के रूप में कार्य करता है। पहले चक्र के बाद, दो प्राइमरों के बीच केवल एक टुकड़ा बढ़ाया गया। इस प्रकार, यह एम्पलीफाइड सेक्शन की प्रतियों की संख्या पर संदेह कर रहा है, जो 25-40 चक्रों को लाखों (2 एन) डीएनए टुकड़ों को नसीज़ीन करने की अनुमति देता है - विभिन्न विधियों द्वारा उन्हें इंगित करने के लिए पर्याप्त राशि (एक निश्चित लेबल युक्त हाइब्रिडाइजेशन जांच की विधि से) , इलेक्ट्रोफोरोसिस, आदि)। इस उद्देश्य के लिए अक्सर, ब्रोमाइड एथिडियम के साथ धुंधला के साथ एग्रोस जेल में इलेक्ट्रोफोरोसिस की विधि का उपयोग किया जाता है।

पीसीआर में, प्राइमर्स जिनके पास न्यूक्लियोटाइड्स का एक अद्वालिक अनुक्रम है, केवल एक निश्चित रोगजनक के लिए विशेषता है, जो कार्टिव एजेंट के डीएनए से पीसीआर में उपयोग किया जाता है।

पीसीआर करने की विधि निम्न में आती है: डीएनए मैट्रिक्स को अध्ययन के तहत सामग्री से अलग किया जाता है; ट्यूब एक प्रवर्धन मिश्रण के साथ समर्पित डीएनए को जोड़ती है, जिसमें डीएनए पॉलीमरेज़, सभी 4 प्रकार के न्यूक्लियोटाइड, 2 प्रकार के प्राइमर, एमजीसीएल, बफर, डीओनिनाइज्ड पानी और खनिज तेल शामिल हैं। फिर परीक्षण ट्यूबों को एम्पलीफायर में रखा जाता है, और रोगजनक उपस्थिति के अनुरूप किसी दिए गए कार्यक्रम के अनुसार स्वचालित मोड में बढ़ रहा है। परिणाम एथिडियम ब्रोमाइड की उपस्थिति में 1-2% agarose जेल में इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा अधिकतर पंजीकृत होते हैं, जो डीएनए टुकड़ों से जुड़ा हुआ है और ट्रांसल लाइसेंसधारक पर यूवी जेल के विकिरण के दौरान एक चमकदार बैंड के रूप में पाया जाता है। सभी पीसीआर प्रक्रियाओं में 1-2 व्यावसायिक दिन लगते हैं।

पीसीआर की विशिष्टता और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, विभिन्न विकल्पों का उपयोग किया जाता है: घोंसले पीसीआर; Paraffin परतों या monoclonal एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय polymerase केंद्रों के नाकाबंदी का उपयोग कर गर्म शुरू करने के साथ पीसीआर। इसके अलावा, कुछ कंपनियां डीएनए प्रवर्धन करने के लिए लाइफोफिलिज्ड अभिकर्मक सेट का उत्पादन करती हैं जो आपको पीसीआर की प्रक्रिया को तेज करने और झूठी सकारात्मक परिणामों को प्रदर्शित करने की संभावना को कम करने की अनुमति देती हैं।

वर्तमान में, एक नई पीसीआर पीसीआर प्रौद्योगिकी लागू की जा रही है (रीयल-टाइम पीसीआर)। इसकी मौलिक विशेषता पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन उत्पादों और प्राप्त परिणामों की स्वचालित पंजीकरण और व्याख्या के संचय के मात्रात्मक विश्लेषण और मात्रात्मक विश्लेषण है। इस विधि को इलेक्ट्रोफोरोसिस के चरण की आवश्यकता नहीं है, जो पीसीआर के लिए प्रयोगशाला आवश्यकताओं को कम करना संभव बनाता है। पीसीआर रीयल-टाइम अपने प्रवर्धन की प्रक्रिया में डीएनए डिटेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाली ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच का उपयोग करें। वास्तविक समय में पीसीआर आपको 20-60 मिनट के लिए नमूना का पूर्ण विश्लेषण करने की अनुमति देता है और सैद्धांतिक रूप से विधि नमूना में एक डीएनए अणु या आरएनए का पता लगाने के लिए है।

पॉलिमरस चेन रिएक्शन "रीयल-टाइम" (निगरानी पीसीआर) में उत्पाद पहचान प्रणाली एक चक्र चक्र को एम्पलीफाइड डीएनए के संचय की निगरानी करने की अनुमति देती है। इस प्रणाली में खुद को एक oligonucleotide जांच शामिल है, जो लक्ष्य डीएनए के आंतरिक खंड में शामिल होने में सक्षम (हाइब्रिडाइज) करने में सक्षम है। 5'-एंड पर, जांच को फ्लोरोसेंट डाई-रिपोर्टर (रिपोर्टर डाई) के साथ चिह्नित किया गया है, और 3'-एंड - एक अवरोधक (क्वेंचर डाई) पर। चूंकि पीसीआर उत्पाद जांच संकरण करता है, लेकिन रिपोर्टर और अवरोधक के बीच निकटता के कारण चमक नहीं होती है। पॉलिमरस अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाने के परिणामस्वरूप जांच के 5'-एंड तक पहुंचता है। पॉलिमरस की 5'-3-एक्सोन्यूक्लिक गतिविधि फ्लोरोसेंट लेबल को नमूना के 3 'अंत से डिस्कनेक्ट करती है, जिससे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को सिग्नल अवरोधक से कनेक्शन से मुक्त किया जाता है, जिससे फ्लोरोसेंस में वृद्धि होती है। प्रतिदीप्ति स्तर इस प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की संख्या के आनुपातिक है। यह महत्वपूर्ण है कि पीसीआर परिणाम बंद ट्यूबों में फ्लोरोसेंस की उपस्थिति में दर्ज किए गए हैं और इस प्रकार, इस विधि की मुख्य समस्याओं में से एक हल हो गया है - एम्पलीच के साथ प्रदूषण की समस्या।

पीसीआर के फायदे: विश्लेषण की गति; उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता; अध्ययन के तहत सामग्री की न्यूनतम मात्रा; आसान प्रदर्शन और पूर्ण स्वचालन।

इस तथ्य के कारण कि पीसीआर की संवेदनशीलता डीएनए मैट्रिक्स की एक प्रति का पता लगाने तक पहुंच सकती है, झूठी सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए उच्च स्तर की खतरा है। इसलिए, पीसीआर के निर्माण के तहत आनुवंशिक रूप से नैदानिक \u200b\u200bप्रयोगशाला को लेआउट और कार्य व्यवस्था के लिए विशेष आवश्यकताओं को लगातार करने की आवश्यकता होती है।

पीसीआर वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स में मौजूद पूरक तरीकों में से एक है। यह प्रतिक्रिया वायरल संक्रमण के निदान के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जब वायरल एंटीजन या वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी का पता नहीं लगाया जा सकता है और जब वायरल न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति संक्रमण का एकमात्र सबूत हो सकती है, खासकर जब गुप्त और मिश्रित संक्रमण।

यदि आपको कोई गलती मिली है, तो कृपया पाठ खंड का चयन करें और क्लिक करें CTRL + ENTER।.

नोबेल पुरस्कार मिला।

हीटिंग-शीतलन के प्रत्येक चक्र के बाद विधि का उपयोग करने की विधि की शुरुआत में, डीएनए पॉलीमरेज़ प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ना आवश्यक था, क्योंकि यह डीएनए सर्पिल सर्कल को अलग करने के लिए आवश्यक उच्च तापमान पर निष्क्रिय कर दिया गया था। प्रतिक्रिया प्रक्रिया अपेक्षाकृत अप्रभावी थी, बहुत समय और एंजाइम की मांग की। 1 9 86 में, पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया की विधि में काफी सुधार हुआ था। थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए बहुलक का उपयोग करने का प्रस्ताव दिया गया था। ये एंजाइम थर्मोस्टेबल थे और कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम थे। उनके उपयोग ने पीसीआर को सरल और स्वचालित करना संभव बना दिया। पहले थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमेराज़ में से एक बैक्टीरिया से हाइलाइट किया गया था थर्मस एक्वाटिकस। और नामित Taq।- पॉलीमिया। इस बहुलक की कमी यह है कि एक गलत न्यूक्लियोटाइड बनाने की संभावना काफी अधिक है, क्योंकि इस एंजाइम में त्रुटि सुधार तंत्र (3 "→ 5" exonuclease गतिविधि नहीं है)। पोलीमर्स पीएफयू। तथा Pwo।आर्की से चयनित एक तंत्र है, उनके उपयोग में डीएनए में उत्परिवर्तन की संख्या को काफी कम कर दिया जाता है, लेकिन उनकी गति (सबूत) इससे कम है Taq।। अब मिश्रण लागू करें Taq। तथा पीएफयू।एक ही समय में उच्च पॉलिमरराइजेशन दर और उच्च प्रतिलिपि सटीकता प्राप्त करने के लिए।

आविष्कार के इस समय, कैरी मुलिस विधि ने सिंथेटिक रसायनज्ञ (यह ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषित किया गया था, जिसे सीटस कॉर्पोरेशन कंपनी में जीनोमिक डीएनए के साथ हाइब्रिडाइजेशन द्वारा प्वाइंट म्यूटेशन का पता लगाने के लिए किया गया था), जो पीसीआर विधि भी पेटेंट करता है। 1 99 2 में, ज़ेटस ने विधि का अधिकार और उपयोग के लिए पेटेंट को बेच दिया Taq।- $ 300 मिलियन के लिए कंपनी होफमैन-ला रोश के बहुलक। हालांकि, यह पता चला Taq।- पॉलिमेराज़ा को सोवियत जैव रसायनविदों ए काल्टेडिन, ए स्लीउसरेंको और एस रोडसेटस्की द्वारा 1 9 80 में और इस सोवियत प्रकाशन से 4 साल पहले की विशेषता थी, यानी, 1 9 76 में, अमेरिकी बायोकेमिस्ट एलिस चियान, डेविड बीडीगर और जॉन एम। ट्रेला। इस संबंध में, प्रोमेगा (प्रोमेगा) की कंपनी ने रोश को इस एंजाइम के अनन्य अधिकारों से इनकार करने के लिए मजबूर करने की कोशिश की। पीसीआर विधि के लिए अमेरिकी पेटेंट मार्च 2005 में समाप्त हो गया है

पीसीआर

यह विधि कृत्रिम स्थितियों में एंजाइमों की मदद से डीएनए के एक निश्चित खंड की एकाधिक चुनावी प्रतिलिपि पर आधारित है ( कृत्रिम परिवेशीय।)। साथ ही, केवल साइट कॉपी की जाती है, जो निर्दिष्ट शर्तों को पूरा करती है, और केवल तभी यदि यह अध्ययन के तहत नमूने में मौजूद है। जीएनए में डीएनए के प्रवर्धन के विपरीत, (प्रतिकृति), पीसीआर की मदद से, अपेक्षाकृत कम डीएनए अनुभागों को बढ़ाया जाता है। सामान्य पीसीआर प्रक्रिया में, प्रतिलिपि डीएनए अनुभागों की लंबाई 3,000 से अधिक आधार जोड़े (3 केबीपी) नहीं है। विभिन्न बहुलक के मिश्रण की मदद से, additives और कुछ स्थितियों के तहत, पीसीआर खंड की लंबाई न्यूक्लियोटाइड के 20-40 हजार जोड़े तक पहुंच सकते हैं। यह अभी भी यूकेरियोटिक सेल के गुणसूत्र डीएनए की लंबाई से काफी कम है। उदाहरण के लिए, एक मानव जीनोम में लगभग 3 अरब बेस जोड़े होते हैं।

प्रतिक्रिया घटकों

पीसीआर के लिए सबसे सरल मामले में, निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता है:

• डीएनए मैट्रिक्सजिसमें डीएनए भाग शामिल है जो बढ़ाने के लिए आवश्यक है।
• दो प्राइमरवांछित डीएनए टुकड़ा के विभिन्न सर्किट के विपरीत सिरों द्वारा पूरक।
• थर्मास्टाइबल डीएनए पॉलिमरेज़ - एक एंजाइम जो डीएनए बहुलक प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करता है। पीसीआर में उपयोग के लिए पॉलिमरस को लंबे समय तक उच्च तापमान पर गतिविधि बनाए रखना चाहिए, इसलिए वे थर्मोफाइल से अलग एंजाइमों का उपयोग करते हैं - थर्मस एक्वाटिकस। (TAQ POLYMERASE), पायरोकोकस फ़ुरियोसस (PFU Polymerase) पायरोकोकस वोसेई। (Pwo polymerase) और अन्य।
• Deoxyribonuclavestrifhathate (डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी, डीटीटीपी)।
• पॉलिमरस के संचालन के लिए एमजी 2+ आयन आवश्यक हैं।
• उभयरोधी घोलआवश्यक प्रतिक्रिया शर्तों को प्रदान करना - पीएच, आयनिक शक्ति बल। लवण, बोवाइन मट्ठा एल्बमिन शामिल हैं।

प्रतिक्रिया मिश्रण की वाष्पीकरण से बचने के लिए, उच्च उबलते तेल ट्यूब में जोड़ा जाता है, उदाहरण के लिए, vaseline। यदि एक एम्पलीफायर को गर्म ढक्कन के साथ उपयोग किया जाता है, तो इसे करने की आवश्यकता नहीं है।

पायरोफॉस्फेटस जोड़ना पीसीआर प्रतिक्रिया की उपज में वृद्धि कर सकता है। यह एंजाइम डायोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस, डीएनए की बढ़ती श्रृंखला के लिए, ऑर्थोफॉस्फेट के लिए न्यूक्लियोट्रिप्ट्रिपोस्फास्ट के संलग्नक का साइड उत्पाद उत्प्रेरित करता है। पायरोफॉस्फेट पीसीआर प्रतिक्रिया को रोक सकता है।

प्राइमिमर्स

पीसीआर की विशिष्टता मैट्रिक्स और प्राइमर्स, 18-30 बेस के लघु सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बीच पूरक परिसरों के गठन पर आधारित है। प्रत्येक प्राइमर दो-श्रृंखला मैट्रिक्स की श्रृंखला में से एक के पूरक हैं और प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत को सीमित करते हैं।

प्राइमर (एनीलिंग) के साथ मैट्रिक्स के संकरण के बाद, उत्तरार्द्ध मैट्रिक्स की पूरक श्रृंखला (देखें) के संश्लेषण में डीएनए पॉलीमरेज़ के लिए एक बीज के रूप में कार्य करता है।

प्राइमर्स की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता प्राइमर-मैट्रिक्स कॉम्प्लेक्स का पिघलने बिंदु (टी एम) है।

टी एम तापमान है जिस पर डीएनए मैट्रिसेस का आधा एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर के साथ एक परिसर बनाता है। एक छोटे oligonucleotide (और लंबे डीएनए टुकड़ों के लिए) के लिए औसत गणना फॉर्मूला टी एम, के + और डीएमएसओ आयनों की एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए:

जहां एल प्राइमर में न्यूक्लियोटाइड की संख्या है, के + पोटेशियम आयनों की दाढ़ी एकाग्रता है, जी + सी - सभी गुआनिन और साइटोसिन का योग है।

प्राइमर या एनीलिंग तापमान की लंबाई और न्यूक्लियोटाइड संरचना के गलत चयन के मामले में, मैट्रिक्स डीएनए के अन्य हिस्सों के साथ आंशिक रूप से पूरक परिसरों का निर्माण करना संभव है, जो गैर-विशिष्ट उत्पादों का कारण बन सकता है। पिघलने बिंदु की ऊपरी सीमा बहुलक के इष्टतम तापमान तक सीमित है, जिसकी गतिविधि 80 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर गिरती है।

प्राइमर्स चुनते समय, निम्नलिखित मानदंडों का पालन करना वांछनीय है:

एम्पलीफायर

अंजीर। एक: पीसीआर के लिए एम्पलीफायर

पीसीआर एक एम्पलीफायर में किया जाता है - एक उपकरण आवधिक शीतलन और हीटिंग ट्यूब प्रदान करता है, आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ। आधुनिक एम्पलीफायर आपको जटिल कार्यक्रमों को निर्दिष्ट करने की अनुमति देता है, जिसमें "हॉट स्टार्ट", टचडाउन पीसीआर (नीचे देखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर एम्पलीफाइड अणुओं के बाद के भंडारण की संभावना शामिल है। वास्तविक समय में पीसीआर के लिए, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से सुसज्जित डिवाइस जारी किए जाते हैं। एक स्वचालित ढक्कन और माइक्रोप्रेट के लिए एक डिब्बे के साथ उपकरण भी हैं, जो आपको उन्हें स्वचालित सिस्टम में एम्बेड करने की अनुमति देता है।

रिएक्शन कोर्स

फोटोग्राफी जेल युक्त मार्कर डीएनए (पहला और अंतिम स्लॉट) और पीसीआर उत्पाद युक्त

आम तौर पर, पीसीआर के दौरान, 20-35 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं (चित्र 2)।

विकृतीकरण

दो-फंसे हुए डीएनए मैट्रिक्स को 94-96 डिग्री सेल्सियस (या 98 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जाता है यदि एक विशेष थर्मोस्टेबल पॉलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है) 0.5-2 मिनट से 0.5-2 मिनट ताकि डीएनए चेन अलग हो जाएं। इस चरण को कहा जाता है विकृतीकरणचूंकि हाइड्रोजन बंधन दो डीएनए श्रृंखलाओं के बीच नष्ट हो जाते हैं। कभी-कभी पहले चक्र (पॉलिमरेज़ जोड़ने से पहले) से पहले, प्रतिक्रिया मिश्रण का प्रारंभिक हीटिंग मैट्रिक्स और प्राइमरों की पूर्ण denaturation के लिए 2-3 मिनट के लिए किया जाता है। इस रिसेप्शन को कहा जाता है ठोस शुरुआतयह आपको गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की संख्या को कम करने की अनुमति देता है।

एनीलिंग

जब सर्किट अलग हो जाते थे, तो तापमान कम हो जाता है ताकि प्राइमर एकल-फंसे हुए मैट्रिक्स से संपर्क कर सकें। इस चरण को कहा जाता है एनीलिंग। एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर प्राइमरों के पिघलने बिंदु के बराबर चुना जाता है। एनीलिंग तापमान की गलत पसंद एक मैट्रिक्स (एक अतिरंजित तापमान पर) के साथ प्राइमरों की खराब बाध्यकारी होती है, या गलत जगह पर बाध्यकारी और गैर-विशिष्ट उत्पादों (कम तापमान पर) की उपस्थिति होती है। एनीलिंग चरण का समय 30 टुकड़े है, साथ ही, इस समय के दौरान, पॉलिमरम्स पहले से ही कई सौ न्यूक्लियोटाइड को संश्लेषित करने में कामयाब रहे हैं। इसलिए, 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर एक पिघलने बिंदु के साथ प्राइमरों का चयन करने और 60-72 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग और लम्बाई करने के लिए अनुशंसा की जाती है।

लम्बाई

डीएनए पॉलीमेरस एक बीज के रूप में प्राइमर का उपयोग कर मैट्रिक्स सर्किट की प्रतिलिपि बनाता है। यह एक मंच है लम्बाई। पॉलिमरस ने प्राइमर के 3 "--कॉन्टाइज़र से दूसरी श्रृंखला के संश्लेषण की शुरुआत की, जिसने मैट्रिक्स से संपर्क किया, और मैट्रिक्स के साथ चलता है, 5" से 3 "अंत की दिशा में नई श्रृंखला को संश्लेषित करता है। लम्बाई का तापमान बहुलक पर निर्भर करता है। अक्सर उपयोग किया जाने वाला TAQ पॉलिमरियन और पीएफयू 72 डिग्री सेल्सियस पर सबसे सक्रिय होते हैं। लम्बाई का समय डीएनए पॉलीमरेज़ के प्रकार और प्रवर्धित टुकड़ा की लंबाई पर निर्भर करता है। आमतौर पर, लम्बाई का समय एक के बराबर होता है प्रत्येक हजार बेस जोड़े के लिए मिनट। सभी चक्रों के अंत के बाद, अक्सर एक अतिरिक्त कदम होता है अंतिम लम्बाईसभी एकल-श्रृंखला के टुकड़ों को पूरा करने के लिए। यह चरण 7-10 मिनट तक रहता है।

अंजीर। 2।: पहले पीसीआर चक्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) 94-96 डिग्री सेल्सियस पर denaturation। (2) 68 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग (उदाहरण के लिए)। (3) 72 डिग्री सेल्सियस (पी \u003d polymerase) पर लम्बाई। (4) पहला चक्र पूरा हो गया है। दोनों प्राप्त डीएनए चेन अगले चक्र के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में कार्य करते हैं, इसलिए प्रत्येक चक्र युगल के दौरान मैट्रिक्स डीएनए की मात्रा

एक विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा (प्राइमर्स द्वारा बाध्य) सैद्धांतिक रूप से 2 एन -2 एन के अनुपात में बढ़ जाती है, जहां एन प्रतिक्रिया चक्रों की संख्या है। वास्तव में, प्रत्येक चक्र की प्रभावशीलता 100% से कम हो सकती है, इसलिए, वास्तविकता पी ~ (1 + ई) एन में, जहां पी उत्पाद की मात्रा है, ई चक्र की औसत दक्षता है।

डीएनए की "लंबी" प्रतियों की संख्या भी बढ़ रही है, लेकिन रैखिक रूप से, एक विशिष्ट खंड प्रतिक्रिया उत्पादों में प्रभुत्व है।

ज्यामितीय प्रगति में वांछित उत्पाद की वृद्धि अभिकर्मकों की संख्या, अवरोधकों की उपस्थिति, उप-उत्पादों के गठन से सीमित है। प्रतिक्रिया के अंतिम चक्र पर, विकास धीमा हो जाता है, इसे "पठार प्रभाव" कहा जाता है।

पीसीआर किस्में

• नेस्टेड पीसीआर (नेस्टेड पीसीआर (इंग्लैंड)) - इसका उपयोग प्रतिक्रिया के उप-उत्पादों की संख्या को कम करने के लिए किया जाता है। प्राइमर्स के दो जोड़े का प्रयोग करें और लगातार दो प्रतिक्रियाएं संचालित करें। प्राइमर्स की दूसरी जोड़ी पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद के भीतर डीएनए अनुभाग को बढ़ाती है।
• उलटा पीसीआर (उलटा पीसीआर (अंग्रेजी)) - यदि वांछित अनुक्रम के अंदर केवल एक छोटा सा हिस्सा जाना जाता है तो इसका उपयोग किया जाता है। यह विधि विशेष रूप से उपयोगी होती है जब जीनोम में डीएनए डालने के बाद आसन्न अनुक्रमों को निर्धारित करना आवश्यक होता है। उलटा पीसीआर के कार्यान्वयन के लिए, अंशों (बंधन) के बाद के चक्र के साथ कई काटने वाले डीएनए प्रतिबंध किए जाते हैं। नतीजतन, प्रसिद्ध टुकड़े एक अज्ञात खंड के दोनों सिरों पर हैं, जिसके बाद पीसीआर सामान्य रूप से किया जा सकता है।
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, आरटी-पीसीआर (इंग्लैंड)) - आरएनए लाइब्रेरी से ज्ञात अनुक्रम को बढ़ाने, चयन करने या पहचानने के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य पीसीआर से पहले, एक एकल फंसे हुए डीएनए अणु का संश्लेषण एमआरएनए मैट्रिक्स पर एक पुनरावृत्ति के साथ किया गया था और एक एकल श्रृंखला सीडीएनए प्राप्त किया जाता है, जिसे पीसीआर के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में उपयोग किया जाता है। यह विधि अक्सर यह निर्धारित करती है कि जीन डेटा कहां और कब व्यक्त किया जाता है।
• असममित पीसीआर (इंग्लैंड। असममित पीसीआर।) - यह मूल डीएनए की श्रृंखला में से एक को बढ़ाने के लिए आवश्यक होने पर किया जाता है। अनुक्रमण और हाइब्रिडाइजेशन विश्लेषण के कुछ तरीकों में उपयोग किया जाता है। पीसीआर सामान्य रूप से किया जाता है, सिवाय इसके कि प्राइमर्स में से एक को बड़ी अतिरिक्त में लिया जाता है। इस विधि का संशोधन अंग्रेजी है। एल कान में-ए। फटर-टी उसने-इ। xponential- पीसीआर। (देर से पीसीआर), जिसमें प्राइमरों का उपयोग विभिन्न सांद्रता के साथ किया जाता है, और कम एकाग्रता प्राइमर को उच्च सांद्रता प्राइमर की तुलना में उच्च (पिघलने वाले तापमान) के साथ चुना जाता है। पीसीआर उच्च एनीलिंग तापमान पर किया जाता है, जिससे पूरे चक्र में प्रतिक्रिया दक्षता को बनाए रखना संभव है।
• मात्रात्मक पीसीआर (मात्रात्मक पीसीआर, क्यू-पीसीआर (अंग्रेजी)) या पीसीआर रीयल-टाइम - प्रत्येक प्रतिक्रिया चक्र में विशिष्ट पीसीआर उत्पाद की मात्रा के माप की स्वचालित रूप से निगरानी करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्राइमर या डीएनए जांच का उपयोग प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा को सटीक रूप से मापने के लिए किया जाता है क्योंकि इसे जमा किया जाता है; या एक फ्लोरोसेंट इंटरक्लिंग डाई का उपयोग किया जाता है SYBR ग्रीन I. जो डबल-फंसे डीएनए से बांधता है। SYBR ग्रीन I. विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच या प्राइमरों का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय पीसीआर के दौरान पीसीआर उत्पादों का पता लगाने और मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक सरल और आर्थिक विकल्प प्रदान करता है। प्रवर्धन डाई के दौरान SYBR ग्रीन I. डीएनए पीसीआर उत्पादों के एक छोटे से नाली में एम्बेड करें और एक नीले लेजर के साथ विकिरण करते समय फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ एक असंबद्ध डाई की तुलना में मजबूत खाता है। SYBR ग्रीन I. वास्तविक समय पीसीआर के लिए तिथि के लिए ज्ञात सभी उपकरणों के साथ संगत। के लिए अधिकतम अवशोषण SYBR ग्रीन I. 494 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर स्थित है। मुख्य के अलावा, डाई स्पेक्ट्रम में दो छोटे अतिरिक्त अवशोषण मैक्सिमा - 2 9 0 एनएम और 380 एनएम पर हैं। अधिकतम उत्सर्जन SYBR ग्रीन I. 521 एनएम (हरा) की तरंग दैर्ध्य पर स्थित है।
• स्टेप पीसीआर (टचडाउन पीसीआर (अंग्रेजी)) - इस दृष्टिकोण की मदद से गैर-विशिष्ट प्राइमर बाध्यकारी के प्रभाव को कम करें। पहले चक्र इष्टतम एनीलिंग तापमान के ऊपर तापमान पर किए जाते हैं, फिर प्रत्येक कुछ चक्र घाटी तापमान धीरे-धीरे इष्टतम हो जाते हैं। यह प्राइमर हाइब्रिडिज्ड के लिए अपनी सभी लंबाई की पूरक श्रृंखला के साथ किया जाता है; जबकि इष्टतम एनीलिंग तापमान के साथ, प्राइमर आंशिक रूप से पूरक श्रृंखला के साथ संकरित है। जीनोमिक डीएनए पर प्राइमर का आंशिक संकरण गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की ओर जाता है, यदि प्राइमर के लिए कई बाध्यकारी साइटें हैं। ज्यादातर मामलों में, पहले दस पीसीआर चक्र 72-75 डिग्री सेल्सियस के एक एनीलिंग तापमान पर किए जा सकते हैं, और फिर तुरंत इष्टतम को कम कर सकते हैं, उदाहरण के लिए 60-65 डिग्री सेल्सियस तक।
• आणविक उपनिवेशों की विधि (जेल, ईएनजी में पीसीआर। कॉलोनी - पीसीआर कॉलोनी) - एक्रिलमाइड जेल सतह पर सभी पीसीआर घटकों के साथ polymerized है और पीसीआर संचालन। विश्लेषण डीएनए युक्त बिंदुओं पर, प्रवर्धन आणविक उपनिवेशों के गठन के साथ होता है।
• सीडीएनए के सिरों के त्वरित प्रवर्धन के साथ पीसीआर (इंग्लैंड। सीडीएनए समाप्त, रेस-पीसीआर का रैपिड एपलाइटिफिकेशन ).
• पीसीआर लंबे टुकड़ों (इंग्लैंड। लंबी दूरी के पीसीआर) - विस्तारित डीएनए अनुभागों (10 हजार और अधिक आधार) को बढ़ाने के लिए पीसीआर का संशोधन। दो बहुलक का मिश्रण उपयोग किया जाता है, जिनमें से एक उच्च प्रमाण के साथ एक ताक बहुलक है (यानी, एक पास में डीएनए लंबी श्रृंखला को संश्लेषित करने में सक्षम है), और दूसरा - डीएनए पॉलिमरस 3 "-5" एक्सोन्यूक्लीज गतिविधि के साथ है आमतौर पर पीएफयू polymerase। पहले द्वारा किए गए त्रुटियों को समायोजित करने के लिए दूसरा पॉलिमरस आवश्यक है, क्योंकि यदि पूरक न्यूक्लियोटाइड नहीं जोड़ा गया है तो Taq Polymerase डीएनए के संश्लेषण को रोकता है। यह गैर-पूरक न्यूक्लियोटाइड पीएफयू पॉलिमरस को हटा देता है। Polymeraz का मिश्रण 50: 1 या 100: 1 से भी कम के संबंध में लिया जाता है, जहां Taq Polymerase पीएफयू polymerase के सापेक्ष 25-100 गुना अधिक लेता है।
• रैपड। (इंग्लैंड। पॉलिमॉर्फिक डीएनए का यादृच्छिक प्रवर्धन ), पॉलिमॉर्फिक डीएनए के यादृच्छिक प्रवर्धन के साथ पीसीआर का उपयोग किया जाता है जब आनुवंशिक अनुक्रम पर संयोजन के जीवों के बीच अंतर करना आवश्यक होता है, उदाहरण के लिए, खेती के पौधों की विभिन्न किस्मों, कुत्तों की नस्लों या निकट-अच्छे सूक्ष्मजीवों। इस विधि में, आमतौर पर एक छोटे आकार के प्राइमर का उपयोग किया जाता है (लगभग 10 पी।)। यह प्राइमर अध्ययन जीवों की यादृच्छिक डीएनए साइटों द्वारा आंशिक रूप से पूरक होगा। शर्तों का चयन (प्राइमर की लंबाई, इसकी संरचना, तापमान इत्यादि), दो जीवों के लिए पीसीआर पेंटिंग्स में संतोषजनक मतभेद प्राप्त करना संभव है।
• विशिष्ट पीसीआर (इंग्लैंड। समूह-विशिष्ट पीसीआर) - इन अनुक्रमों के लिए कंज़र्वेटिव प्राइमरों का उपयोग करके, एक या विभिन्न प्रजातियों के बीच संबंधित अनुक्रमों के लिए पीसीआर। उदाहरण के लिए, रिबोसोमल के सार्वभौमिक प्राइमरों का चयन 18s। तथा 26s। प्रजाति-विशिष्ट इंटरजेनिक स्पेसर के प्रवर्धन के लिए जीन: जीन का अनुक्रम 18s। तथा 26s। प्रजातियों के बीच रूढ़िवादी, इसलिए इन जीनों के बीच पीसीआर सभी अध्ययन प्रजातियों के लिए आयोजित किया जाएगा। विपरीत विधि है - अद्वितीय पीसीआर (इंग्लैंड। अद्वितीय पीसीआर), जिसमें कार्य संबंधित अनुक्रमों के बीच केवल एक विशिष्ट अनुक्रम को बढ़ाने के लिए प्राइमरों का चयन करने में शामिल होता है।
• गर्म शुरुआत का उपयोग कर पीसीआर (इंग्लैंड। हॉट-स्टार्ट पीसीआर) - एक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग कर पीसीआर का संशोधन, जिसमें पॉलीमेरस गतिविधि एंटीबॉडी या एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर अवरुद्ध हो जाती है जो एंटीबॉडी जैसे एंटीबॉडी जैसे छोटे अणुओं का अनुकरण करती है, जो कि पीसीआर में पहली विकृति की प्रतिक्रिया के समय है। आम तौर पर पहली denaturation 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए किया जाता है।
• वर्चुअल पीसीआर (सिलिको पीसीआर में अंग्रेजी, डिजिटल पीसीआर, इलेक्ट्रॉनिक पीसीआर, ई-पीसीआर) - जीनोम के डीएनए के डीएनए के संभावित प्रवर्धन की भविष्यवाणी करने के लिए प्राइमर्स (या डीएनए जांच) अनुक्रमों की सूची का उपयोग करके सैद्धांतिक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया के कंप्यूटर विश्लेषण की गणितीय विधि अध्ययन, गुणसूत्र, अंगूठी डीएनए या कोई अन्य डीएनए साजिश।

यदि मैट्रिक्स के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को आंशिक रूप से या अज्ञात बिल्कुल भी जाना जाता है, तो आप उपयोग कर सकते हैं पतित प्राइमर्सजिनमें से अनुक्रम में अपमानजनक स्थिति होती है जिसमें कोई भी आधार स्थित हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्राइमर अनुक्रम इस तरह हो सकता है: ... एथ ...जहां एन - ए, टी या एस।

पीसीआर आवेदन

पीसीआर का उपयोग कई क्षेत्रों में विश्लेषण और वैज्ञानिक प्रयोगों में किया जाता है।

अपराधी

पीसीआर का उपयोग तथाकथित "जेनेटिक फिंगरप्रिंट" की तुलना करने के लिए किया जाता है। हमें अपराध दृश्य से आनुवांशिक सामग्री का नमूना चाहिए - रक्त, लार, शुक्राणु, बाल इत्यादि। इसकी तुलना संदिग्ध की अनुवांशिक सामग्री से की जाती है। काफी कम संख्या में डीएनए, सैद्धांतिक रूप से - एक प्रति। डीएनए टुकड़ों में विभाजित, फिर पीसीआर का उपयोग करके बढ़ाया। टुकड़ों को डीएनए इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा अलग किया जाता है। डीएनए बैंड के परिणामस्वरूप पैटर्न और कहा जाता है आनुवंशिक फिंगरप्रिंट (इंग्लैंड। आनुवंशिक फिंगरप्रिंट।).

पितृत्व स्थापना

अंजीर। 3।: पीसीआर द्वारा बढ़ाया डीएनए टुकड़ों के इलेक्ट्रोफोरोसिस के परिणाम। (1) पिता। (2) बेबी। (3) माँ। बच्चे ने माता-पिता दोनों के अनुवांशिक छाप की कुछ विशेषताओं को विरासत में मिला, जिसने एक नया, अद्वितीय छाप दिया।

हालांकि "जेनेटिक फिंगरप्रिंट" अद्वितीय हैं (सिंगल-टाइम जुड़वां के मामले के अपवाद के साथ), रिश्तों को कई ऐसे फिंगरप्रिंट (चित्र 3) बनाकर स्थापित किया जा सकता है। जीवों के बीच विकासवादी संबंध स्थापित करने के लिए, उसी विधि को लागू किया जा सकता है, थोड़ा संशोधित किया जा सकता है।

मेडिकल जांच

पीसीआर महत्वपूर्ण रूप से गतिशील और वंशानुगत और वायरल बीमारियों के निदान को सुविधाजनक बनाने के लिए संभव बनाता है। वांछित जीन को उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा बढ़ाया गया है, और फिर उत्परिवर्तन निर्धारित करने के लिए अनुक्रमित किया गया है। बीमारी के लक्षणों से हफ्तों या महीनों के लिए, संक्रमण के तुरंत बाद वायरल संक्रमण का पता लगाया जा सकता है।

व्यक्तिगत चिकित्सा

कभी-कभी दवाएं कुछ रोगियों के लिए विषाक्त या एलर्जी हैं। इसके कारण आंशिक रूप से आंशिकता और दवाओं और उनके डेरिवेटिव्स के चयापचय में व्यक्तिगत मतभेदों में हैं। ये मतभेद आनुवंशिक स्तर पर निर्धारित किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, एक रोगी के पास एक विशिष्ट साइटोक्रोम होता है (यकृत प्रोटीन, जो विदेशी पदार्थों के चयापचय के लिए जिम्मेदार है) अधिक सक्रिय हो सकता है, दूसरा कम है। यह निर्धारित करने के लिए कि किस प्रकार के साइटोक्रोम में यह रोगी है, दवा को लागू करने से पहले एक पीसीआर विश्लेषण करने का प्रस्ताव है। इस विश्लेषण को प्रारंभिक जीनोटाइपिंग (ईएनजी) कहा जाता है। भावी जीनोटाइपिंग।).

क्लोनिंग जीन

जीन की क्लोनिंग (जीवों के क्लोनिंग के साथ भ्रमित नहीं होने के लिए नहीं) जीन अलगाव की प्रक्रिया है और, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हेरफेर के परिणामस्वरूप, इस जीन के उत्पाद की एक बड़ी संख्या का उत्पादन। पीआरआर का उपयोग जीन को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिसे तब डाला जाता है वेक्टर - डीएनए का टुकड़ा, एक ही या अलग में विदेशी जीन ले जाने, खेती, जीव के लिए सुविधाजनक। वैक्टर के रूप में, उदाहरण के लिए, प्लास्मिड्स या वायरल डीएनए का उपयोग किया जाता है। एक विदेशी जीव को जीन डालने का उपयोग आमतौर पर इस जीन - आरएनए या अक्सर, प्रोटीन के उत्पाद को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, औद्योगिक मात्रा में, कृषि, चिकित्सा इत्यादि में उपयोग के लिए कई प्रोटीन प्राप्त किए जाते हैं।

अंजीर। चार: प्लाज्मिड का उपयोग कर क्लोनिंग जीन।
(1) जीव का गुणसूत्र डीएनए ए (2) पीसीआर। (3) जीन जीन ए (4) की कई प्रतियां प्लाज्मिड में एक जीन डालती हैं। (5) जीव के जीनोम के साथ प्लाज्मिड ए (6) बॉडी वी में प्लास्मिड्स का परिचय वी। (7) शरीर के जीन ए की प्रतियों की संख्या को गुणा करता है।

डीएनए श्रृंखला बनाना

Dideoxinucleotide पीसीआर के फ्लोरोसेंट लेबल या रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग कर अनुक्रमण विधि में एक अभिन्न हिस्सा है, क्योंकि यह डीएनए सर्किट के बहुलककरण के दौरान ठीक है, एक फ्लोरोसेंट या रेडियोधर्मी लेबल के साथ लेबल न्यूक्लियोटाइड के एक डेरिवेटिव्स। संश्लेषित सर्किट में dideoxinucleotide का अनुलग्नक संश्लेषण की चट्टान की ओर जाता है, जिससे आप जेल में अलगाव के बाद विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड की स्थिति निर्धारित कर सकते हैं।

Mutagenez

वर्तमान में, पीसीआर mutagenesis (डीएनए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में संशोधन) का मुख्य तरीका बन गया है। पीसीआर के उपयोग ने mutagenesis आयोजित करने के लिए प्रक्रिया को सरल बनाने और तेज करने के साथ-साथ इसे अधिक विश्वसनीय और पुनरुत्पादित करने के लिए भी संभव बना दिया।

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) - किसी भी चरण (तीव्र या पुरानी) में वंशानुगत रोगविज्ञान, संक्रमण, वायरल बीमारियों का निदान करने के क्षेत्र में एक उच्च सटीकता विधि, साथ ही - प्रारंभिक चरण में - रोगजनकों की पहचान करके रोग के स्पष्ट अभिव्यक्तियों के लिए , रोगी से प्राप्त नमूने में उनके डीएनए, आरएनए के आधार पर आनुवंशिक सामग्री हैं। और आज हम सार, नैदानिक \u200b\u200bचरणों और पॉलिमरस चेन रिएक्शन (पीसीआर) के तरीकों के सिद्धांतों के साथ-साथ इसके मूल्य के बारे में बात करेंगे।

एक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया क्या है

विश्लेषण का आधार प्रवर्धन (दोगुनी) है - मानव आनुवंशिक परिसर का प्रतिनिधित्व करने वाले एक लघु डीएनए अनुभाग (deoxyribonucleic एसिड) से प्रतियों की बहुलता का निर्माण। अध्ययन के लिए, शारीरिक पदार्थ की एक बहुत कम मात्रा (स्पुतम, गिरने वाले द्रव्यमान, उपकला स्क्रैप, प्रोस्टेट रस, रक्त, शुक्राणु, तेल, श्लेष्म, प्लेसेंटा कपड़े, मूत्र, लार, फुफ्फुसीय तरल, सेरेब्रोस्पाइनल)। साथ ही, उदाहरण के लिए, रोगी के यूरोजेनिक पथ में, यहां तक \u200b\u200bकि एक दुर्भावनापूर्ण सूक्ष्मदर्शी भी पता लगाया जा सकता है।

पीसीआर (पॉलिमरस चेन रिएक्शन) की पद्धति ने 1 99 3 में एक अमेरिकी वैज्ञानिक के। मुलिस विकसित किए, उन्हें नोबेल पुरस्कार मिला।

सक्रिय रूप से उपयोग किया जाता है:

• संक्रमण के शुरुआती निदान में, अनुवांशिक,;
• फोरेंसिक परीक्षा में, यदि अध्ययन के लिए डीएनए की बेहद छोटी संख्या है;
• पशु चिकित्सा चिकित्सा, दवा, जीवविज्ञान, आणविक आनुवंशिकी में;
• डीएनए की पहचान की पहचान करने के लिए, पितृत्व की पुष्टि करें;
• पालीटोलॉजी, मानव विज्ञान, पारिस्थितिकी में (उत्पादों की गुणवत्ता को ट्रैक करते समय, पर्यावरणीय कारक)।

इस तथ्य के बारे में कि एक पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया इस वीडियो को विस्तार से बताएगी:

जिसे यह निर्धारित किया गया है

संक्रामक बीमारियों के निदान में बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया विशेष सटीकता और विश्वसनीयता की सबसे विश्वसनीय तकनीकों में से एक है। उदाहरण के लिए, क्लैमिडिया पर पीसीआर के विश्लेषण की सटीकता और कई अन्य रोगजनकों के लिए 100% (पूर्ण) के करीब आ रहा है। अक्सर, पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया प्रक्रिया उन रोगियों को निर्धारित की जाती है जिन्हें निदान में किसी विशेष रोगजनक की पहचान के साथ कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है।

प्रयोगशाला परीक्षण पीसीआर उपयोग:

• रोगजनक जीवों का पता लगाने के लिए जो मूत्र और जननांग अंगों के संक्रमण का कारण बनता है, फसलों या इम्यूनोलॉजी के तरीकों का उपयोग करते समय पहचानने योग्य मुश्किल;
• सकारात्मक के मामले में प्रारंभिक चरण में एचआईवी का बार-बार निदान करने के लिए, लेकिन प्राथमिक विश्लेषण के परिणामस्वरूप संदेह (उदाहरण के लिए, एड्स से संक्रमित माता-पिता से नवजात शिशुओं में);
• प्रारंभिक चरण (ऑन्कोजेनेस के उत्परिवर्तनों का अध्ययन) और किसी विशेष रोगी में उपचार के व्यक्तिगत सुधार में एक जैव संबंधी बीमारी स्थापित करने के लिए;
• प्रारंभिक पहचान और वंशानुगत रोगियों के संभावित उपचार के लिए।

इस प्रकार, भविष्य के माता-पिता ने यह जानने के लिए विश्लेषण को सौंप दिया कि क्या वे आनुवांशिक रोगविज्ञान के वाहक हैं, बच्चों में पीसीआर विरासत से प्रेषित बीमारी की संभावना निर्धारित करता है।

• पहनने की शुरुआती अवधि में भ्रूण की पैथोलॉजीज का पता लगाने के लिए (बढ़ते भ्रूण की व्यक्तिगत कोशिकाओं को संभावित उत्परिवर्तन के लिए जांच की जाती है);
• अंगों के प्रत्यारोपण से पहले रोगियों में - "कपड़े टाइपिंग" (ऊतक संगतता का निर्धारण);
• दाता रक्त में खतरनाक रोगजनक जीवों की पहचान करने के लिए;
• नवजात शिशुओं में, बच्चों - छिपे संक्रमण की पहचान करने के लिए;
• एंटीवायरस और एंटीमिक्राबियल उपचार के परिणामों का आकलन करने के लिए।

ऐसी प्रक्रिया क्यों पास करें

चूंकि पीसीआर निदान की एक बेहद कुशल विधि है, लगभग 100% परिणाम दे, प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है:

• अंतिम निदान की पुष्टि या समाप्त करने के लिए;
• चिकित्सा की प्रभावशीलता का तेज़ मूल्यांकन।

कई मामलों में, पीसीआर एक विकासशील बीमारी का पता लगाने के लिए एकमात्र संभावित परीक्षण है, यदि अन्य बैक्टीरियोलॉजिकल, इम्यूनोलॉजिकल और वायरोलॉजिकल निदान तकनीक बेकार हैं।

• संक्रमण के तुरंत बाद और बीमारी के संकेतों की उपस्थिति से पहले पीसीआर प्रक्रिया का उपयोग करके वायरस का पता लगाया जाता है। वायरस का प्रारंभिक पता लगाने से आप जल्दी से उपचार सौंप सकते हैं।
• तथाकथित "वायरल लोड" (या - शरीर में वायरस की संख्या) मात्रात्मक विधि द्वारा डीएनए का विश्लेषण करते समय भी निर्धारित किया जाता है।
• विशिष्ट रोगजनक जीवों (उदाहरण के लिए, कोच ट्यूबरकुलस वंड) मुश्किल है और बहुत लंबा खेती की जाती है। पीसीआर विश्लेषण आपको शोध के लिए सुविधाजनक नमूने में न्यूनतम संख्या में रोगजनकों (जीवित और मृत) की पहचान करने की अनुमति देता है।

रोगजनक डीएनए का विस्तृत विश्लेषण प्रयोग किया जाता है:

• विशिष्ट प्रकार के एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति अपनी संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए, जो आपको तुरंत उपचार के लिए आगे बढ़ने की अनुमति देता है;
• घरेलू, जंगली जानवरों के बीच महामारी के प्रसार की निगरानी करने के लिए;
• पिछले महामारी को उत्तेजित करने वाले रोगयोगियों के सूक्ष्म जीवों और उपप्रकारों के नए संक्रामक प्रकारों को प्रकट और ट्रैक करने के लिए।

निदान के प्रकार

मानक विधि

विशेष प्राइमर एंजाइमों का उपयोग करके डीएनए और आरएनए के एक विशेष खंड के कई प्रवर्धन (दोगुनी) के आधार पर बहुलक-श्रृंखला प्रतिक्रिया का विश्लेषण किया जाता है। नतीजतन, प्रतिलिपि श्रृंखला अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री की मात्रा को बदल देती है।

प्रक्रिया के दौरान, केवल वांछित खंड (निर्दिष्ट विशिष्ट स्थितियों के अनुरूप) की प्रतिलिपि बनाई गई है और इस घटना में यह वास्तव में नमूना में मौजूद है।

पीसीआर पास कैसे करता है, इस विस्तृत वीडियो को उपयोगी योजनाओं के साथ बताता है:

अन्य तरीके

• वास्तविक समय में चलाए गए पीसी। शोध के इस रूप में, प्रत्येक चक्र को पारित करने के बाद दिए गए डीएनए टुकड़ा का पता लगाने की प्रक्रिया शुरू की जाती है, न कि 30 - 40 चक्रों की पूरी श्रृंखला के बाद। इस प्रकार का अध्ययन आपको शरीर में रोगजनक (वायरस या सूक्ष्मजीव) की संख्या पर जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है, यानी एक मात्रात्मक विश्लेषण है।
• से-पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मोड)। इस विश्लेषण का उपयोग आरएनए को एक श्रृंखला के साथ वायरस का पता लगाने के लिए किया जाता है जिनके अनुवांशिक आधार ठीक आरएनए (उदाहरण के लिए, हेपेटाइटिस सी वायरस, इम्यूनोडेफिशियेंसी) है। इस अध्ययन के साथ, एक विशेष एंजाइम का उपयोग किया जाता है - रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज और एक निश्चित प्राइमर और एक एकल श्रृंखला डीएनए आरएनए के आधार पर बनाया गया है। फिर इस श्रृंखला से दूसरे डीएनए सर्किट को पुनर्स्थापित करें और मानक प्रक्रिया की जाती है।

होल्डिंग के लिए संकेत

पीसीआर प्रक्रिया संक्रामक रोगों, नवजात विज्ञान, obstetrics, बाल चिकित्सा, मूत्रविज्ञान, स्त्री रोग, वेनियरोलॉजी, न्यूरोलॉजी, नेफ्रोलोजी, ओप्थाल्मोलॉजी के क्लिनिक में प्रयोग की जाती है।

विश्लेषण असाइन करने के लिए संकेत:

• वंशानुगत रोगियों की संभावना में एक बच्चे में आनुवंशिक असामान्यताओं के विकास के जोखिम को स्पष्ट करना;
• गर्भावस्था से गुजरने वाली मां की गर्भावस्था या गंभीर स्थिति की योजना बनाते समय दोनों माता-पिता का निदान;
• अवधारणा के साथ कठिनाइयों, बांझपन के कारणों की पहचान;
• तीव्र चरण में सेक्स संक्रमण का संदेह और पुरानी को संक्रमण के लक्षणों के साथ;
• अस्पष्ट मूल की सूजन प्रक्रियाओं के कारणों का पता लगाना;
• असुरक्षित यादृच्छिक और स्थायी सेक्स संपर्क;
• विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं के लिए रोगजनक सूक्ष्मजीव की संवेदनशीलता का निर्धारण;
• अस्पष्ट संक्रमण के संदेह वाले मरीजों को स्पष्ट लक्षणों (प्रीक्लिनिकल डायग्नोस्टिक्स) के विकास के लिए रोगजनकों का पता लगाने के लिए;
• बीमारी के बाद वसूली की पुष्टि करने के लिए मरीजों (पूर्वदर्शी निदान);

निम्नलिखित रोगजनकों को सटीक रूप से पहचानने के लिए आवश्यक होने पर भी निदान करने के लिए उपयोग किया जाता है ::

• हेपेटाइटिस वायरस (ए बी सी जी), मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी, साइटोमेगागोवायरस;
• कंपन कोलेरा;
• हर्पस, हर्पीटीफॉर्म प्रजातियों का वायरस;
• रेट्रो - एडेनो - और Rinoviruses;
• रूबेला वायरस, एपस्टीन-बार, वेरिज़ेला (ज़ोस्टर - वायरस);
• पार्सो - और पिकोविरोवायरस;
• बैक्टीरिया हेलिकोबैक्टर पिलोरी;
• legionells, आंतों की छड़ें के रोगजनक प्रकार;
• staphylococcus सुनहरा;
• कारक एजेंट;
• क्लॉस्ट्रिडिया, डिप्थीरिया और हेमोफिलिक स्टिक;

संक्रमण का निर्धारण और निर्धारित करने के लिए:

• संक्रामक मोनोन्यूक्लियोसिस;
• borreeliosis, Lemaryiois, टिकी एन्सेफलाइटिस;
• कैंडिडा मशरूम पकड़े गए;
• सेक्स संक्रमण - Trichomoniasis, yreaplasmosis, पीला treponema, gardnerellosis, gonorhea, mycoplasmosis, chlamydia;
• क्षय रोग।

धारण करने के लिए विरोधाभास

चूंकि प्रक्रिया को रोगी के साथ नहीं किया जाता है, शरीर पर किसी भी प्रभाव के बिना, लेकिन अनुसंधान के लिए जैविक सामग्री के साथ, फिर पीसीआर के लिए कोई contraindications संभावित खतरे की अनुपस्थिति के कारण नहीं हैं।

हालांकि, गर्भाशय के गर्भाशय ग्रीवा से बायोमटेरियल की बाड़ कोलोस्कॉपी प्रक्रिया के बाद नहीं किया जाता है। स्मीयर की डिलिवरी, विश्लेषण के लिए स्क्रैपिंग केवल मासिक धर्म के अंत के बाद 4 - 6 दिनों के बाद ही अनुमति दी जाती है और चयन की पूर्ण विघटन होती है।

विधि सुरक्षित है?

प्रयोगशाला स्थितियों में बायोमटेरियल के पृथक अध्ययन के साथ रोगी पर कोई नकारात्मक प्रभाव असंभव है।

प्रक्रिया के लिए तैयारी (विश्लेषण के लिए जैविक पदार्थ दान)

पीसीआर के विश्लेषण के लिए एक नमूना के रूप में, जिसमें एक विदेशी रोगजनक का डीएनए पता चला है, कोई जैविक तरल पदार्थ, ऊतक, जीव आवंटन है। अध्ययन किए गए पदार्थ की बाड़ नसों से रक्त के रूप में, लारनेक्स से स्क्रैप, नाक की गुहा, मूत्रमार्ग नहर, फुफ्फुसीय गुहा, गर्भाशय के रूप में की जाती है।

नैदानिक \u200b\u200bप्रक्रिया से पहले, डॉक्टर रोगी को बताता है, किस सामग्री की बाड़ ली जाएगी:

1. सेक्स संक्रमण की जांच करते समय, यूरेथ्रा से जननांग, मूत्र, स्ट्रोक का चयन किया जाता है।
2. जब हित्रपिक संक्रमण, साइटोमेगागोवायरस, मोनोन्यूक्लोसिस के लिए विश्लेषण - मूत्र विश्लेषण, ज़ीए से धुंध, हेपेटाइटिस, टोक्सोप्लाज्मोसिस - वियना से रक्त।
3. विभिन्न प्रजातियों का निदान करने के लिए, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ लिया जाता है।
4. पल्मोनोलॉजी में, विश्लेषण के लिए नमूने - स्पुतम और फुफ्फुसीय तरल।
5. जब विश्लेषण के लिए भ्रूण में प्रवेश करते समय संभावित इंट्रायूटरिन संक्रमण का अध्ययन होता है, तो लौह पानी और प्लेसेंटा कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है।

विश्लेषण की सटीकता और सटीकता सामग्री लेते समय स्थितियों की स्टेरिलिटी पर निर्भर करती है। चूंकि पीसीआर के अध्ययन में उच्च संवेदनशीलता है, अध्ययन किए गए पदार्थ का कोई भी प्रदूषण परिणाम को विकृत कर सकता है।

बायोमटेरियल की डिलीवरी के लिए सक्षम तैयारी रोगियों के लिए किसी भी कठिनाइयों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है। कुछ सिफारिशें हैं:

• सेक्स संक्रमण का विश्लेषण करते समय:
  • सामग्री से 72 घंटे पहले अंतरंग संपर्कों को हटा दें;
  • 3 दिनों में किसी भी योनि उपकरण का उपयोग करना बंद करो;
  • पिछले दिन की शाम से, जांच क्षेत्र के तहत स्वच्छता का संचालन न करें;
  • मूत्रमार्ग से नमूना लेने पर 3 से 4 घंटे के लिए पेशाब बहिष्कृत करें;
• संक्रमण के लिए परीक्षण से एक महीने पहले एंटीबायोटिक्स लेना बंद करो;
• खाने और पीने तक सुबह में रक्त सौंप दिया जाता है;
• एक सावधान अंतरंग शौचालय के बाद एक बाँझ कंटेनर में पेशाब के पहले सुबह का हिस्सा एकत्रित किया जाता है।

पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया की विधि के तहत निदान कैसे किया जाता है, नीचे पढ़ा जाता है।

प्रक्रिया कैसी है

एक पीसीआर अध्ययन करते समय, एक रिएक्टर (एम्पलीफायर या थर्मल साइक्लर) पर कुछ चक्र दोहराए जाते हैं:

1. पहला कदम - denaturation। लार, रक्त, बायोपटैट, स्त्री रोग नमूने, स्पुतम, जिसमें डीएनए (या आरएनए) रोगजनक की उपस्थिति संदेह है, एक एम्पलीफायर में रखी जाती है, जहां सामग्री को गर्म किया जाता है और दो अलग-अलग श्रृंखलाओं में डीएनए का विभाजन होता है।
2. दूसरा चरण - सामग्री का एनीलिंग या छोटा शीतलन और प्राइमरों को डीएनए अणु में वांछित क्षेत्रों को पहचानने में सक्षम और उनसे संपर्क करने में सक्षम है।
3. तीसरा चरण - अंत - प्रत्येक डीएनए श्रृंखलाओं में से प्रत्येक के लिए 2 प्राइमरों को जोड़ने के बाद होता है। प्रक्रिया के दौरान, रोगजनक डीएनए टुकड़ा पूरा हो गया है, और एक प्रति बनाई गई है।

इन चक्रों को "चेन रिएक्शन" के प्रकार द्वारा दोहराया जाता है, हर बार एक विशिष्ट डीएनए खंड की प्रतियों को दोगुना करने की ओर जाता है (उदाहरण के लिए, एक सेगमेंट जहां एक निश्चित वायरस प्रोग्राम किया जाता है)। कई घंटों तक, डीएनए टुकड़ा की कई प्रतियां बनती हैं, और नमूना में उनकी उपस्थिति का पता चला है। इसके बाद, संक्रमण के प्रकार को निर्धारित करने के लिए विभिन्न प्रकार के रोगजनकों के डेटाबेस के साथ परिणामों का विश्लेषण और तुलना करें।

डीकोडिंग के परिणाम और निष्कर्ष नीचे पीसीआर प्रतिक्रिया के आधार पर पढ़ें।

डिकोडिंग परिणाम

अध्ययन का अंतिम परिणाम जैविक सामग्री को पारित करने के 1 - 2 दिनों में जारी किया जाता है। अक्सर - विश्लेषण के बाद पहले दिन पहले से ही।

गुणात्मक विश्लेषण

• नकारात्मकनतीज का मतलब है कि अध्ययन पर नामित पदार्थ में, संक्रमण के कारक एजेंटों के निशान का पता नहीं लगाया गया था।
• सकारात्मकनतीजे का मतलब है कि सामग्री के वितरण के समय एक जैविक नमूने में रोगजनक वायरस या बैक्टीरिया का पता लगाना।

यदि परिणाम सकारात्मक है, लेकिन बढ़ी संक्रमण के संकेतों की पहचान नहीं की गई है - शरीर की इस स्थिति को विषम "स्वस्थ वाहक" कहा जाता है। अक्सर, वायरल बीमारियों में एक निश्चित स्थान (गर्भाशय ग्रीवा नहर, मूत्रमार्ग, मौखिक गुहा) से बायोमटेरियल लेते समय यह देखा जाता है। इस मामले में उपचार की आवश्यकता नहीं है, लेकिन अनिवार्य रूप से स्थिर चिकित्सा अवलोकन, क्योंकि एक मौका है:

• मीडिया और स्वस्थ लोगों के संक्रमण से वायरस का प्रचार;
• प्रक्रिया की सक्रियता और पुरानी रूप में बीमारी का संक्रमण।

हालांकि, अगर रक्त परीक्षण सकारात्मक है, तो यह इंगित करता है कि संक्रमण ने शरीर को मारा, और यह अब गाड़ी की स्थिति नहीं है, लेकिन पैथोलॉजी को तत्काल विशिष्ट चिकित्सा की आवश्यकता होती है।

मात्रात्मक विश्लेषण

मात्रात्मक परिणाम विशेष रूप से एक निश्चित प्रकार के संक्रमण के लिए एक विशेषज्ञ को परिभाषित करता है। इसके आधार पर, विकास की डिग्री, बीमारी का चरण, जो उचित उपचार को तुरंत नियुक्त करना संभव बनाता है।

औसत मूल्य

पॉलिमरस चेन रिएक्शन के लिए कीमतें निर्धारित की जाती हैं: अनुसंधान का प्रकार, कारक एजेंट की जटिलता, जैविक सामग्री का सेवन करने में कठिनाई, प्रयोगशाला में विश्लेषण (उच्च गुणवत्ता या मात्रात्मक), प्रयोगशाला में मूल्य स्तर।

दूसरी तरफ, पीसीआर के अध्ययन में, विश्लेषण के लिए एक प्रकार की सामग्री की बाड़ के दौरान एक बार में कई रोगजनकों को निर्धारित करना संभव है। यह अन्य प्रयोगशाला विश्लेषणों पर बचाता है।

लगभग, rubles में पीसीआर का विश्लेषण करने की लागत:

• gonokokk, Gardnerwell, Trichomonada Vagynis - 180 से
• chlamydia Tramatis - 190 से
• papillomavirus - 380 से 500 तक
• 800 से महिलाओं (मात्रात्मक और उच्च गुणवत्ता वाले मूल्यांकन) में यूरोजेनिक ट्रैक्ट का बायोकोनोसिस।

पीसीआर अध्ययन के बारे में और भी उपयोगी जानकारी नीचे दिए गए वीडियो में निहित है:

बैक्टीरिया की जेनेटिक्स। दूसरी कक्षाओं के लिए जानकारी।

पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया

पॉलिमरस चेन रिएक्शन एक विधि है जो विश्लेषण किए गए नमूने (जैविक सामग्री या शुद्ध संस्कृति सहित) में कुछ डीएनए अणुओं की मात्रा के एक से अधिक वृद्धि (प्रवर्धन) की अनुमति देती है।

माइक्रोबायोलॉजी में एक नैदानिक \u200b\u200bविधि के रूप में पीसीआर के मुख्य लाभ बहुत अधिक संवेदनशीलता हैं जो नमूने में रोगजनकों की अत्यधिक छोटी सांद्रता का पता लगाने, और कर-समायोज्य विशिष्टता, जो एक सामान्य, प्रजातियों या उप- पर रोगजनकों का पता लगाने या पहचानने की अनुमति देता है स्तर स्तर। पीसीआर की मुख्य कमी इसकी अत्यधिक उच्च संवेदनशीलता से होती है - छवियों को सकारात्मक नियंत्रण, एक और नमूना या पीसीआर उत्पाद से डीएनए को दूषित करना बहुत आसान होता है, जो झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया का कारण बनता है। यह उन परिस्थितियों पर कठोर प्रतिबंध लगाता है जिनमें पीसीआर मिश्रित होता है और तैयार किए गए पीसीआर उत्पादों के साथ काम किया जाता है।

पीसीआर का संचालन।प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नलिखित घटकों वाली तैयार है:

अध्ययन के तहत नमूना से चयनित डीएनए,

बफर

एमजी 2 + आयन (एंजाइम काम के लिए आवश्यक),

दो प्राइमर एकल-फंसे हुए डीएनए अणुओं (18 से 24 न्यूक्लियोटाइड की लंबाई लंबाई) हैं, जो पता लगाने योग्य डीएनए अनुक्रम के विभिन्न सर्किट के पूरक सिरों हैं।

Deoxinucleotidtriphosphates का मिश्रण।

हीट-प्रतिरोधी डीएनए पॉलीमरेज़ (TAQ Polymerase अक्सर इस्तेमाल किया जाता है, से अलग किया जाता है थर्मस एक्वाटिकस।).

फिर यह प्रतिक्रिया मिश्रण एक एम्पलीफायर में रखा गया है, जो वास्तव में एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टेट है। एम्पलीफायर में, 30-40 तापमान शिफ्ट चक्र किए जाते हैं। इन चक्रों में से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं (चित्र 1 देखें):

Denaturation (तापमान 94 डिग्री सेल्सियस) - विस्फोट हाइड्रोजन चेन, और डीएनए श्रृंखलाओं को अलग किया जाता है।

एनीलिंग प्राइमर्स (तापमान आमतौर पर लगभग 50-60 ओ सी) होता है - प्राइमर्स डीएनए सर्किट के सिरों तक शामिल होते हैं। सामान्य रूप से, जब तापमान कम हो जाता है, तो अध्ययन किए गए नमूने (पुनर्जागरण) से मूल डीएनए शुरू होने वाले सर्किट का पुनर्मिलन ऊर्जावान रूप से अधिक लाभदायक होता है, लेकिन डीएनए की एकाग्रता से अधिक परिमाण के कई आदेशों के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में प्राइमरों की एकाग्रता नमूना (कम से कम प्रारंभिक पीसीआर चक्रों पर), इसलिए प्राइमर एनीलिंग की प्रतिक्रिया तेजी से पुनर्जागरण डीएनए बहती है। प्राइमरों के पिघलने वाले तापमान (denaturation) के आधार पर एनीलिंग तापमान का चयन किया जाता है।

लम्बाई (तापमान आमतौर पर 72 डिग्री सेल्सियस होता है) - डीएनए पोलीमरेज ने प्राइमर्स को लंबी डीएनए श्रृंखलाओं के मैट्रिक्स के अनुसार पूरा किया। तापमान डीएनए पॉलिमरस के इष्टतम तापमान से मेल खाता है।

परिणामों का पता पार करने से पीसीआर सेट के विभिन्न संस्करणों में अलग है और "पीसीआर किस्मों" अनुभाग में वर्णित है।

पीसीआर स्पीकर

शुरुआती पीसीआर चक्रों में, दो-फंसे डीएनए अणुओं की संख्या, जिसका आकार प्राइमरों के स्थानों के बीच की दूरी से निर्धारित होता है, प्रत्येक चक्र के साथ दोगुना होता है। लंबे डीएनए अणुओं की एक छोटी संख्या भी गठित की जाती है, जिसे उपेक्षित किया जा सकता है (चित्र 2 देखें)।

इस प्रकार, शुरुआती चक्रों में, पीसीआर उत्पाद की मात्रा एम * 2 एन फॉर्मूला द्वारा वर्णित की जाती है, जहां एम नमूना में डीएनए की प्रारंभिक संख्या है, एन चक्रों की संख्या है। फिर प्रतिक्रिया पठार में जाती है। यह प्रतिक्रिया उत्पाद के संचय के कारण है, प्राइमरों और deoxynucleotidththrifoshath की एकाग्रता को कम करने के साथ-साथ पायरोफॉस्फेट की एकाग्रता को बढ़ाकर (चित्र 3 देखें)।

पीसीआर किस्में

सम्मेलन पीसीआर

इस अवतार में, पीसीआर प्रतिक्रिया करता है प्रतिक्रिया एक पूर्व निर्धारित संख्या चक्र (30-40) है, जिसके बाद इसका विश्लेषण किया जाता है कि प्रतिक्रिया मिश्रण में डबल-चेन डीएनए अणुओं का संचय हुआ है या नहीं।

डायग्नोस्टिक्स की विधि के रूप में उपयोग किए जाने पर पीसीआर फॉर्मूलेशन का यह संस्करण गुणात्मक विधि है। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की कम से कम ट्रेस मात्रा की उपस्थिति को इंगित करती है। नकारात्मक प्रतिक्रिया उनकी अनुपस्थिति को इंगित करती है। नमूना में मूल डीएनए अणुओं की सामग्री का मात्रात्मक मूल्यांकन पठार की प्रतिक्रिया के कारण असंभव है।

उत्पाद की उपस्थिति का पता लगाने का मुख्य तरीका agarose या polyacrylamide जेल में electrophoresis है। पीसीआर उत्पादों को उनके आणविक भार के अनुसार विद्युत क्षेत्र की कार्रवाई के तहत जेल में बांटा गया है। एक अंतराल डाई जेल में जोड़ा जाता है (डबल-फंसे डीएनए से जुड़ी स्थिति में फ्लोरोसेंट - अक्सर ब्रोमाइन एथिडियम)। इस प्रकार, जब पराबैंगनी के साथ विकिरणित होता है, तो आवश्यक आणविक भार के डीएनए से संबंधित एक पट्टी की उपस्थिति या अनुपस्थिति को देखना संभव होगा। डायग्नोस्टिक उद्देश्यों के लिए पीसीआर का संचालन करते समय, प्रतिक्रिया का सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण हमेशा रखा जाता है, जिसके साथ नमूने की तुलना की जाती है (चित्र 4 देखें)।

पीसीआर रीयल-टाइम

इस अवतार में, पीसीआर प्रतिक्रिया प्रवाह में प्रतिक्रिया मिश्रण में लगातार पीसीआर उत्पाद की मात्रा को निष्पादित करता है। यह हमें एक प्रतिक्रिया वक्र बनाने की अनुमति देता है (चित्र 3 देखें) और, इसके आधार पर, नमूने में वांछित डीएनए अणुओं की संख्या की गणना करें।

वास्तविक समय में पीसीआर के प्रकारों में से एक - इंटरक्लटेरेंट का उपयोग करके, जिसे सीधे प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है (सिब्रग्रीन का अक्सर उपयोग किया जाता है)। एक और प्रकार - फ्लोरोसेंट जांच के प्रकारों में से एक का उपयोग करके, पीसीआर उत्पाद के अंदर एक खंड के लिए बाध्यकारी, जो पहचान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए संभव बनाता है (चित्र 5 देखें)। प्रवाह प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया प्रवाह के दौरान सीधे उपकरण में होती है ।

मात्रात्मक पहचान की संभावना के अलावा, पारंपरिक की तुलना में वास्तविक समय में पीसीआर के अन्य फायदे हैं। पीसीआर का यह संस्करण सरल, तेज़ है, और पीसीआर उत्पादों के साथ ट्यूबों को खोजने की भी आवश्यकता नहीं है, जो अन्य नमूने के प्रदूषण की संभावना को कम कर देता है। मुख्य दोष सामान्य की तुलना में फ्लोरोसेंस की पहचान की एकीकृत संभावना के साथ एम्पलीफायर का उच्च मूल्य है।

डिजिटल मात्रात्मक पीसीआर

एक नया, महंगा और अब तक एक छोटा फैलाने वाला संस्करण, जो आपको नमूना में डीएनए की मात्रा को सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस अवतार में, एक फ्लोरोसेंट डाई युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को बड़ी संख्या में सूक्ष्म मात्रा में विभाजित किया जाता है (उदाहरण के लिए, पायस में बूंदों)। पीसीआर प्रवाह का विश्लेषण करने के बाद, बूंदों के हिस्से में प्रतिक्रिया सकारात्मक थी और तदनुसार, फ्लोरोसेंस मनाया जाता है। यह हिस्सा नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की संख्या के आनुपातिक होगा।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पीसीआर

इस मामले में, एक विशेष संस्करण पीसीआर से पहले, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (डीएनए में आरएनए) एक Revertase एंजाइम का उपयोग करके किया जाता है। इस प्रकार, यह विधि आपको आरएनए अणुओं का उच्च गुणवत्ता या मात्रात्मक पहचान करने की अनुमति देती है। इसका उपयोग आरएनए युक्त वायरस का पता लगाने या जीन या किसी अन्य के प्रतिलेखन (एमआरएनए की संख्या) के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

चित्र 1। पीसीआर के चरण। लाल रंग को चिह्नित प्राइमर्स।

चित्र 2।पीसीआर के दौरान प्राइमर्स द्वारा सीमित डबल-चेन डीएनए अणुओं का संचय।

चित्र तीन।नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की विभिन्न प्रारंभिक सांद्रता पर पीसीआर प्रतिक्रिया की गतिशीलता। (ए) - उच्चतम एकाग्रता (बी) - इंटरमीडिएट एकाग्रता (बी) - सबसे छोटी एकाग्रता

चित्रा 4।पीसीआर उत्पादों का अग्रोमिक इलेक्ट्रोफोरोसिस। के + - सकारात्मक नियंत्रण (स्नोरल डीएनए मौजूद है)। 1-7 - अध्ययन किए गए नमूने (जिनमें से 1-2 सकारात्मक हैं, 3-7 नकारात्मक हैं)। के - नकारात्मक नियंत्रण (वांछित डीएनए स्पष्ट रूप से गायब है)। कई मामलों में, लक्षित उत्पाद के अलावा, हल्का गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद दिखाई दे रहे हैं (प्राइमर डिमर्स)।

चित्रा 5।रीयल-टाइम पीसीआर का उपयोग करते समय पहचान के लिए तरीके। (ए) - इंटरक्लिटिंग डाई - फ्लोरोसेंट्स दो-फंसे डीएनए (बी) - तकमान - TAQMAN - फ्लोरोसेंस जांच तब होती है जब फ्लोरोमेरस डीएनए जांच फ्लोरोफोर और विघटन के अलगाव के कारण 5'-3 'एंडोन्यूक्लीज़ गतिविधि के साथ छिपी हुई होती है। (सी) - आणविककोश - फ्लोरोसेंस जांच तब उत्पन्न होती है जब फ्लोरोफोर की स्थानिक दूरी के कारण लक्ष्य खंड के साथ जांच का संकरण होता है और थकावट (जी) - जांच लाइटसाइक्लर - स्वीकार्य प्रतिदीपन जांच के संकरण (स्वीकार्यकर्ता युक्त) में होता है और दाता) अनुनाद फ्लोरोसेंस ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) के कारण लक्ष्य खंड के साथ।