Reacția lanțului polimerazei, esența și zona de aplicare. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) și utilizarea metodei de reacție a lanțului polimerazei PCR

Nu cu mult timp în urmă, a fost dezvoltată o metodă fiabilă și foarte sensibilă și rapidă de diagnosticare a diferitelor boli infecțioase ale unei persoane. Această metodă se numește analiza "PCR". Ce este, care este esența lui, pe care o poate dezvălui microorganisme și cum să-l transmită, ne vom spune în articolul nostru.

Dezactivarea istoriei

Metodele PCR sunt, de asemenea, utilizate în diagnosticul de cancer.

Beneficiile metodei

Diagnosticul PCR are o serie de beneficii:

Sensibilitate crescută. Chiar dacă există doar câteva molecule de ADN de microorganism, analiza PCR determină prezența infecției. Metoda va ajuta la boli cronice și latente. Adesea, în astfel de cazuri, microorganismul nu este cultivat în alte moduri.
Pentru studiu, orice material este potrivit, de exemplu, saliva, sânge, sex, păr, celule de epitelium de păr. Cel mai frecvent este testul de sânge și frotiul urogenital pe PCR.
Nu este necesară o cultivare lungă a culturilor. Procesul de diagnosticare automată vă permite să obțineți rezultatele studiului după 4-5 ore.
Metoda este de aproape 100% fiabilă. Sunt înregistrate numai cazuri unice ale unui rezultat fals negativ.
Abilitatea de a identifica mai multe tipuri de agenți patogeni de la un eșantion de material. Acest lucru nu numai că accelerează procesul de diagnosticare a bolii, dar, de asemenea, reduce semnificativ costurile materiale. Adesea, medicul numește o analiză completă a PCR. Prețul unui sondaj format din stabilirea a șase agenți patogeni este de aproximativ 1.500 de ruble.

Pentru ca rezultatele să fie fiabile la efectuarea unui studiu PCR, este necesar să se adopte analiza, respectarea recomandărilor pentru pregătirea preliminară pentru diagnosticare:

Înainte de a trece saliva, trebuie să vă abțineți de la mese și medicamente în 4 ore înainte de gardul materialului. Imediat înainte de procedură, clătiți cu apă fiartă.
Regulile de mai sus ar trebui să fie ghidate și când luați o probă de pe suprafața interioară a obrazului. După clătire, se recomandă efectuarea unui masaj al pielii ușoare pentru a evidenția marginea glandei.
Urina colectată de obicei la domiciliu. Pentru a face acest lucru, trebuie să cheltuiți o toaletă profundă a organelor genitale. Într-un container din plastic steril, este necesar să se colecteze 50-60 ml de urină. Pentru a asigura curățenia materialului, se recomandă introducerea unui tampon în vagin, iar mascul să tragă pielea cât mai mult posibil. Este imposibil să donați materialul în timpul perioadei de descărcare menstruală.
Pentru a pune sperma, trebuie să vă abțineți de la actul sexual în 3 zile înainte de gardul materialului. De asemenea, medicii sfătuiesc să refuze să viziteze sauna și adoptarea cadă cu hidromasaj, consumul de alcool și alimente acute. Cu 3 ore înainte de analiză, trebuie să vă abțineți de la urinare.
Pentru livrare, de exemplu, dacă analizează în Chlamydia PCR, atât femeile, cât și bărbații sunt recomandate de odihnă sexuală în termen de 3 zile. Cu 2 săptămâni înainte de analiză imposibilă luarea de medicamente antibacteriene. Pentru o săptămână, este necesar să nu mai folosim geluri intime, unguente, lumânări vaginale, pe moarte. Cu 3 ore înainte de studiu, trebuie să vă abțineți de la urinare. În timpul menstruației, gardul material nu este efectuat, numai după 3 zile după încetarea descărcării de sânge, puteți lua un frotiu urogenital.

PCR în timpul sarcinii

În timpul perioadei de așteptare, copilul are multe boli infecțioase transmise de sexual, sunt extrem de periculoase pentru dezvoltarea normală a fătului. STD pot provoca întârzierea intrauterină în dezvoltare, avort spontan sau nașteri premature, defecte congenitale din copilărie. Prin urmare, este imperativ să trecem în timpul sarcinii timpurii a metodei PCR. Asistența este necesară atunci când este înregistrată - până la 12 săptămâni.

Gardul material provine din colul uterin de col uterin utilizând o perie specială. Procedura este fără durere și nu reprezintă un pericol pentru copil. În mod obișnuit, în timpul sarcinii, analizează metoda PCR Chlamydia, precum și pe ureaplasmoză, micoplasmoză, citomegalovirus, herpes, papillomavirus. Un astfel de complex de sondaje se numește PCR-6.

PCR pentru diagnosticarea HIV

Datorită faptului că metoda este foarte sensibilă la schimbările din organism și la condițiile de efectuare a diagnosticării, mulți factori pot afecta rezultatul. Prin urmare, analiza PCR asupra infecției cu HIV nu este o metodă fiabilă, eficacitatea acestuia este de 96-98%. În restul de 2-4% din cazuri, testul oferă rezultate false pozitive.

Dar, în anumite situații fără diagnosticul PCR, HIV nu poate face. De obicei îl conduce oamenilor cu un rezultat negativ fals al ELISA. Astfel de indicatori sugerează că persoana nu a dezvoltat încă anticorpi la virus și este imposibil să se dezvăluie fără o creștere multiplă a cantității. Acesta este exact ceea ce se poate realiza prin efectuarea testului de sânge prin metoda PCR.

De asemenea, necesar pentru diagnosticul primului an de viață născut de la mama HIV-pozitivă. Metoda este singura modalitate de a determina în mod fiabil statutul unui copil.

PCR pentru diagnosticul hepatitei

Metoda de reacție în lanț a polimerazei permite detectarea ADN-ului hepatitei A virusului, B, cu mult înainte de formarea de anticorpi la infecție sau aspectul simptomelor bolii. Mai ales eficient este analiza PCR pentru hepatită C, deoarece în 85% din cazuri o astfel de boală efectuează asimptomatică și fără tratament în timp util se transformă într-o etapă cronică.

Detectarea la timp a agentului cauzator va contribui la evitarea complicațiilor și a tratamentului pe termen lung.

Examinarea cuprinzătoare a PCR

Analiza PCR cuprinzătoare: o examinare prin reacția în lanț polimezar, care include definiția mai multor tipuri de infecții: Mycoplasmis Genitaum, Hominis Myoplasma, Gardnerners Vagynis, Candida, Trichomonas, Citomegalovirus, Herpes din cele 1 și 2 Tipuri, Gonoreea, Papillomavirus. Prețul unui astfel de diagnostic variază de la 2000 la 3.500 de ruble. În funcție de clinica utilizată de materiale și echipamente, precum și pe tipul de analiză: înaltă calitate sau cantitativă. Ceea ce este necesar în cazul dvs. - medicul va decide. În unele cazuri, este suficient doar pentru a determina prezența agentului patogen, în altele, de exemplu, în infecția cu HIV, titrul cantitativ joacă un rol important. În diagnosticul tuturor agenților cauzali de mai sus, examinarea se numește "Analiza PCR-12".

Descifrarea rezultatelor analizei

Decriptarea analizei PCR nu reprezintă complexitatea. Există doar 2 scale ale indicatorului - "Rezultat pozitiv" și "rezultat negativ". La detectarea agentului cauzator, medicii pot cu o încredere de 99% confirmând prezența bolii și trece la tratamentul pacientului. Cu o metodă cantitativă de determinare a infecției în graficul corespunzător, va fi specificat un indicator numeric al bacteriilor detectate. Numai un medic poate determina gradul de boală și poate numi tratamentul necesar.

În unele cazuri, de exemplu, în determinarea infecției cu HIV prin metoda PCR, cu un rezultat negativ, este nevoie de sondaje suplimentare pentru a confirma indicatorii obținuți.

Unde să treacă analiza?

Unde să treceți analiza PCR: în clinica de stat sau într-un laborator privat? Din păcate, în instituțiile medicale municipale, echipamentele și metodele sunt adesea depășite. Prin urmare, este mai bine să oferiți preferințelor laboratoarelor private cu echipament modern și personal cu înaltă calificare. În plus, într-o clinică privată veți obține rezultate mult mai repede.

La Moscova, multe laboratoare private propun o analiză PCR la diverse infecții. De exemplu, în astfel de clinici, cum ar fi "Vita", "Clinica complexă", "Familia fericită", "Uro-Pro", efectuează o analiză PCR. Prețul sondajului este de la 200 de ruble. Pentru determinarea unui agent patogen.

Se poate concluziona că diagnosticul bolilor infecțioase prin metoda PCR în majoritatea cazurilor este o modalitate rapidă și fiabilă de a detecta agentul patogen din organism în infecția timpurie. Dar, în anumite cazuri, merită să alegeți alte modalități de diagnosticare. Numai un specialist poate determina necesitatea unui astfel de studiu. Decriptarea analizei PCR necesită, de asemenea, o abordare profesională. Urmați recomandările medicului și nu oferiți analize independente în care nu este nevoie.

Este adesea folosit ca o metodă expresă pentru a indica și identifica virușii.

Pentru prima dată, această metodă a fost dezvoltată de K. Mulis (SUA) în 1983 tone. Datorită sensibilității sale ridicate, specificității și ușurinței de execuție, este utilizat pe scară largă în genetică, medicină criminalistică, diagnostic și alte zone.

Esența metodei este amplificarea, adică o creștere a numărului de copii ale fragmentelor strict definite ale moleculei ADN in vitro. În această metodă există un mecanism de matrice și principiul complementarității. Două lanțuri unice de polinucleotidă (acid nucleic) sunt capabile de legare la legăturile de hidrogen într-un dublu, în cazul în care secvențele nucleotidice ale unuia corespund secvenței de nucleotide ale celuilalt, astfel încât bazele lor azotate să poată forma perechi de adenin-thymin și guanin-citozină .

PCR se bazează pe amplificarea ADN-ului utilizând o polimerază de ADN stabilă termică, efectuând sinteza circuitelor ADN complementare reciproc, începând cu două primeri. Primerul este un fragment ADN format din 20-30 nucleotide. Acești primeri (semințe) sunt complementari la lanțurile ADN opuse. În timpul sintezei ADN-ului, primerii sunt construiți în lanțul moleculelor ADN nou-senzoriale.

De obicei PCR a pus în 25-40 de cicluri. Fiecare ciclu include trei etape: prima - denaturare la 92-95 ° C. În același timp, două lanțuri ADN diferă; al doilea - recoacere sau adăugarea de primeri la 50-65 ° C; Al treilea - alungire sau polimerizare la 68-72 ° C, în timp ce ADN polimeraza efectuează finalizarea complementară a lanțurilor de matrice ADN utilizând patru tipuri de nucleotide. Ca rezultat al unui ciclu, apare o dublare a materialului genetic dorit. ADN-ul generat în primul ciclu servește ca matrice pentru al doilea ciclu etc. După primul ciclu, doar un fragment între două primeri amplificate. Astfel, se îndoiește de numărul de copii ale secțiunii amplificate, ceea ce permite 25-40 de cicluri la fragmentele ADN neasyzinate (2 N) - cantitatea suficientă pentru a le indica prin diferite metode (prin metoda sondei de hibridizare care conțin o anumită etichetă , electroforeză etc.). Mai des, în acest scop, se utilizează metoda de electroforeză în gelul de agaroză cu colorare cu bromură de etidiu.

În PCR, primerii care au o secvență unică de nucleotide caracteristică numai pentru un anumit agent patogen sunt utilizați la PCR din ADN-ul agentului cauzator.

Metoda de efectuare a PCR se reduce la următoarele: Matricea ADN este separată de materialul studiat; Tubul combină ADN-ul dedicat cu un amestec de amplificare, care include polimeraza ADN, toate cele 4 tipuri de nucleotide, 2 tipuri de primeri, mgl, tampon, apă deionizată și ulei mineral. Apoi, tuburile de testare sunt plasate într-un amplificator și amplificând în modul automat în conformitate cu un anumit program corespunzător aspectului patogen. Rezultatele sunt înregistrate mai des prin electroforeză în gelul de agaroză 1-2% în prezența bromurii de etidiu, care este conectată la fragmentele ADN și este detectată ca o benzile luminoase în timpul iradierii gelului UV de pe Lizitorul Transil. Toate procedurile PCR durează 1-2 zile lucrătoare.

Pentru a crește specificitatea și sensibilitatea PCR, se utilizează diferite opțiuni: PCR de cuibărit; PCR cu pornire la cald folosind straturi de parafină sau blocarea centrelor de polimerază activă prin anticorpi monoclonali. În plus, unele firme produc seturi de reactivi liofilizate pentru a realiza amplificarea ADN care vă permit să accelerați procesul de PCR și să reduceți posibilitatea apariției rezultatelor false-pozitive.

În prezent, este implementată o nouă tehnologie PCR PCR (PCR în timp real). Caracteristica sa fundamentală este monitorizarea și analiza cantitativă a acumulării de produse de reacție în lanț din polimerază și înregistrarea automată și interpretarea rezultatelor obținute. Această metodă nu necesită etapa de electroforeză, ceea ce face posibilă reducerea cerințelor de laborator pentru PCR. PCR în timp real Utilizați sonde de oligonucleotidă marcate cu fluorescente pentru detectarea ADN-ului în procesul de amplificare a acesteia. PCR în timp real vă permite să efectuați o analiză completă a eșantionului timp de 20-60 de minute și metoda teoretic este de a detecta chiar o moleculă de ADN sau ARN în eșantion.

Sistemul de detectare a produsului în reacția în lanț polimerazei "în timp real" (PCR de monitorizare) permite un ciclu de ciclu pentru a monitoriza acumularea de ADN amplificat. Sistemul include o sondă de oligonucleotidă, care este capabilă să se alăture (hibridizeze) la segmentul interior al ADN-ului țintă. La sfârșitul 5'-end, sonda este marcată cu un colorant fluorescent (vopsea reporter) și pe 3'-end - un blocant (colorant de stingere). Deoarece produsul PCR acumulează sonda hibridizează, dar strălucirea nu apare datorită proximității dintre reporter și blocant. Ca rezultat al copierii secvenței polimerazei ajunge la sfârșitul sondei 5'-capăt. Activitatea 5'-3'-exonucleică a polimerazei deconectează eticheta fluorescentă de la sfârșitul eșantionului, eliberând astfel reporterul fluorescent de la conexiunea sa la blocarea semnalului, ceea ce duce la o creștere a fluorescenței. Nivelul de fluorescență este astfel proporțional cu numărul de produs de reacție specific. Este important ca rezultatele PCR să fie înregistrate în prezența fluorescenței în tuburi închise și, astfel, una dintre problemele principale ale acestei metode este rezolvată - problema contaminării cu amplicaje.

Avantajele PCR: viteza de analiză; Sensibilitate ridicată și specificitate; cantitatea minimă de material studiat; Performanță ușoară și automatizare completă.

Datorită faptului că sensibilitatea PCR poate ajunge la detectarea unei copii a matricei ADN, există un grad ridicat de pericol de obținere a rezultatelor false pozitive. Prin urmare, un laborator de diagnostic genetic sub formularea PCR trebuie să efectueze în mod constant cerințe speciale pentru aspect și regim de muncă.

PCR este una dintre metodele complementare care există în diagnosticarea virologică. Această reacție este foarte importantă pentru diagnosticarea infecțiilor virale, atunci când antigene virale sau anticorpi specifici virali nu pot fi detectați și când prezența acidului nucleic viral poate fi singura dovadă a infecției, în special atunci când infecții latente și mixte.

Dacă ați găsit o greșeală, selectați fragmentul de text și faceți clic pe Ctrl + ENTER..

Ai un premiu Nobel.

La începutul metodei de utilizare a metodei după fiecare ciclu de răcire de încălzire, a fost necesar să se adauge la amestecul de reacție al polimerazei ADN, deoarece a fost inactivat la o temperatură ridicată necesară pentru a separa circuitele spirale ADN. Procedura de reacție a fost relativ ineficientă, a cerut o mulțime de timp și enzime. În 1986, metoda reacției în lanț a polimerazei a fost semnificativ îmbunătățită. Sa propus utilizarea polimerazelor ADN din bacterii termofile. Aceste enzime au fost termopibile și au fost capabile să reziste la multe cicluri de reacție. Utilizarea lor a făcut posibilă simplificarea și automatizarea PCR. Unul dintre primele ADN termostable polimeraz a fost evidențiat din bacterii Thermus Aquaticus. și numit Taq.- Poliimia. Lipsa acestei polimeraze este că probabilitatea de a face o nucleotidă eronată este suficient de mare, deoarece această enzimă nu are mecanisme de corecție a erorilor (3 "→ 5" activitate exonucleazică). Polimerază PFU. și PWO.Selectat dintre Arhey posedă un astfel de mecanism, utilizarea lor reduce semnificativ numărul de mutații din ADN, dar viteza (dovezile) este mai mică decât cea Taq.. Acum aplicați amestecuri Taq. și PFU.Pentru a realiza, în același timp, o rată ridicată de polimerizare și o precizie ridicată a copiei.

În momentul invenției, metoda lui Cary Mullis a lucrat ca un chimist sintetic (oligonucleotidele sintetizate, care au fost utilizate apoi pentru a detecta mutații punct prin hibridizare cu ADN-ul genomic) în compania Cetus Corporation, care, de asemenea, a brevetat metoda PCR. În 1992, Zetus a vândut dreptul la metoda și un brevet de utilizare Taq.- Polimeramentul companiei Hofman-La Rosh pentru 300 de milioane de dolari. Cu toate acestea, sa dovedit a fi Taq.- Polimeraza a fost caracterizată de biochimii sovietici A. Kaltedin, A. Slyusarenko și S. Rodetsky în 1980, precum și cu 4 ani înainte de această publicație sovietică, adică în 1976, biochimii americani Alice Chien, David B.dgar și John M. Trela. În acest sens, compania lui Promega (Promega) a încercat să forțeze Rosh să refuze drepturile exclusive la această enzimă. Brevetul american pentru metoda PCR a expirat în martie 2005

PCR

Metoda se bazează pe o copie electorală multiplă a unei anumite secțiuni de ADN cu ajutorul enzimelor în condiții artificiale ( in vitro.). În același timp, numai site-ul este copiat, ceea ce satisface condițiile specificate și numai dacă este prezent în eșantionul studiat. Spre deosebire de amplificarea ADN-ului în organismele vii (replicarea), cu ajutorul PCR, secțiunile ADN relativ scurte sunt amplificate. În procesul PCR obișnuit, lungimea secțiunilor ADN copiate nu depășește 3.000 de perechi de bază (3 kbp). Cu ajutorul unui amestec de diferite polimeraze, folosind aditivi și în anumite condiții, lungimea fragmentului PCR poate ajunge la 20-40 de mii perechi de nucleotide. Este încă semnificativ mai mică decât lungimea ADN-ului cromozomial al celulei eucariote. De exemplu, un genom uman constă din aproximativ 3 miliarde de perechi de baze.

Componentele de reacție

Pentru PCR în cel mai simplu caz, sunt necesare următoarele componente:

Matrice ADN.conținând porțiunea ADN care este necesară pentru amplificare.
Două grundcomplementar prin capetele opuse ale diferitelor circuite ale fragmentului ADN dorit.
Termostabil ADN polimerază - o enzimă care catalizează reacția de polimerizare ADN. Polimeraza pentru utilizare în PCR ar trebui să mențină activitate la temperaturi ridicate pentru o lungă perioadă de timp, astfel încât să utilizeze enzime izolate din termofiles - Thermus Aquaticus. (Polimeraza Taq), Pyrococus Furiosus. (Pfu polimerază) Pirococcus Woesei. (PWO Polymeraza) și altele.
Deoxiribonucleazedtrifhosfat (DATP, DGTP, DCTP, DTTP).
Mg 2+ ioni necesari pentru funcționarea polimerazei.
Soluție tamponFurnizarea condițiilor de reacție necesare - pH, forța de putere ionică. Conține săruri, albumină din zer de bovine.

Pentru a evita evaporarea amestecului de reacție, se adaugă ulei de înaltă fierbere la tub, de exemplu, vaselină. Dacă un amplificator este utilizat cu un capac încălzit, acest lucru nu este necesar să faceți.

Adăugarea pirofosfatazei poate crește randamentul reacției PCR. Această enzimă catalizează hidroliza pirofosfatului, produsul lateral al atașării nucleotidtriphosfați la lanțul de creștere al ADN-ului, la ortofosfat. Pirofosfatul poate inhiba reacția PCR.

Primim

Specificitatea PCR se bazează pe formarea complexelor complementare între matrice și primeri, oligonucleotide scurte sintetice de 18-30 de baze. Fiecare dintre primeri este complementară a unuia dintre lanțurile unei matrice cu două lanțuri și limitează începutul și capătul zonei amplificate.

După hibridizarea matricei cu grund (recoacere), aceasta din urmă servește ca o sămânță pentru ADN polimerază în sinteza lanțului complementar al matricei (vezi).

Cea mai importantă caracteristică a primerilor este punctul de topire (t m) al complexului de primer-matrix.

T M este temperatura la care jumătate din matricele ADN formează un complex cu un primer de oligonucleotidă. Formula de calcul medie t M pentru o scurtă oligonucleotidă (și pentru fragmente lungi de ADN), ținând cont de concentrația de ioni K + și DMSO:

În cazul în care L este numărul de nucleotide din grund, K + este concentrația molară a ionilor de potasiu, G + C - suma tuturor Guaninelor și citozinelor.

În cazul unei selecții incorecte a lungimii și a compoziției nucleotidice a grundului sau a temperaturii de recoacere, este posibil să se formeze complexe parțial complementare cu alte părți ale ADN-ului matricei, care pot duce la produse nespecifice. Limita superioară a punctului de topire este limitată la temperatura optimă a polimerazei, a cărei picături la temperaturi mai mari de 80 ° C.

Atunci când alegeți primeri, este de dorit să respectați următoarele criterii:

Amplificator

Smochin. unu: Amplificator pentru PCR

PCR se efectuează într-un amplificator - un instrument care asigură tuburi periodice de răcire și încălzire, de obicei cu o precizie de cel puțin 0,1 ° C. Amplificatoarele moderne vă permit să specificați programe complexe, inclusiv posibilitatea unui "pornire fierbinte", PCR touchdown (vezi mai jos) și depozitarea ulterioară a moleculelor amplificate la 4 ° C. Pentru PCR în timp real, sunt eliberate dispozitive echipate cu un detector fluorescent. Există, de asemenea, instrumente cu un capac automat și un compartiment pentru microplăci, ceea ce vă permite să le încorporați în sisteme automate.

Cursul de reacție

Fotografie Gel care conține ADN marker (ultimele și ultimele sloturi) și produsele PCR

În mod tipic, în timpul PCR, se efectuează 20-35 cicluri, fiecare fiind format din trei etape (figura 2).

Denaturare

Matricea ADN-ului cu două catene este încălzită la 94-96 ° C (sau până la 98 ° C dacă se utilizează o anumită polimerază termostabilă) cu 0,5-2 minute, astfel încât lanțurile ADN să fie separate. Această etapă este numită denaturareDeoarece legăturile de hidrogen sunt distruse între două lanțuri ADN. Uneori, înainte de primul ciclu (înainte de adăugarea polimerazei), o încălzire preliminară a amestecului de reacție este efectuată timp de 2-3 minute pentru denaturarea completă a matricei și a primerii. Această recepție este numită hot Start.Vă permite să reduceți numărul de produse de reacție nespecifică.

Recoacere

Când circuitele au fost separate, temperatura este coborâtă astfel încât primerii să poată contacta o matrice monitală. Această etapă este numită recoacere. Temperatura de recoacere depinde de compoziția primerilor și este de obicei selectată egală cu punctul de topire a primerii. Alegerea greșită a temperaturii de recoacere conduce fie la legarea slabă a primerilor cu o matrice (la o temperatură suprapusă), fie la legarea la locul greșit și apariția produselor nespecifice (la temperaturi scăzute). Timpul etapei de recoacere este de 30 de bucăți, în același timp, în acest timp, polimeramele au reușit deja să sintetizeze câteva sute de nucleotide. Prin urmare, se recomandă selectarea primerilor cu un punct de topire de peste 60 ° C și pentru a efectua o recoacere și alungire în același timp, la 60-72 ° C.

Elongaţie

ADN polimeraza replică circuitul matricei utilizând grundul ca semințe. Aceasta este o scenă elongaţie. Polimeraza începe sinteza celui de-al doilea lanț din 3 "-Conger al primerului, care a contactat matricea și se deplasează de-a lungul matricei, sintetizând noul lanț în direcția de 5" la 3 ". Temperatura de alungire depinde de polimerază. Polimeraziunile TAQ utilizate frecvent și Pfus sunt cele mai active la 72 ° C. Timpul de alungire depinde atât de tipul de polimerază ADN cât și de lungimea fragmentului amplificat. În mod tipic, timpul alungirii durează egal cu unul minute pentru fiecare mie de perechi de baze. După sfârșitul tuturor ciclurilor, există adesea un pas suplimentar elongația finalăPentru a completa toate fragmentele cu lanț unic. Această etapă durează 7-10 minute.

Smochin. 2.: Reprezentarea schematică a primului ciclu PCR. (1) Denaturare la 94-96 ° C. (2) recoacere la 68 ° C (de exemplu). (3) alungirea la 72 ° C (P \u003d polimerază). (4) Primul ciclu este finalizat. Cele două lanțuri ADN obținute servesc ca matrice pentru următorul ciclu, astfel încât cantitatea de ADN de matrice în timpul fiecărui ciclu dublu

Cantitatea unui produs de reacție specific (delimitat de primeri) crește teoretic proporțional cu 2 N-2N, unde n este numărul de cicluri de reacție. De fapt, eficacitatea fiecărui ciclu poate fi mai mică de 100%, prin urmare, în realitate P ~ (1 + E) N, unde p este cantitatea de produs, E este eficiența medie a ciclului.

Numărul copiilor "lungi" ale ADN-ului este, de asemenea, în creștere, dar liniar, prin urmare, un fragment specific este dominat în produsele de reacție.

Creșterea produsului dorit în progresia geometrică este limitată de numărul de reactivi, prezența inhibitorilor, formarea produselor secundare. Cu privire la ultimele cicluri ale reacției, creșterea încetinește, se numește "efect platou".

Soiuri PCR

PCR-ul imbricat (PCR imbricate (eng.)) - Este utilizat pentru a reduce numărul de produse secundare ale reacției. Utilizați două perechi de primeri și efectuați două reacții consecutive. Cea de-a doua pereche de primeri amplifică secțiunea ADN în produsul primei reacții.
PCR inversat (PCR inversă (engleză)) - este utilizat dacă numai o mică porțiune este cunoscută în interiorul secvenței dorite. Această metodă este utilă în special atunci când este necesar să se determine secvențele adiacente după introducerea ADN-ului în genom. Pentru implementarea PCR inversată, un număr de restricții de tăiere a ADN-ului se efectuează cu un compus ulterior de fragmente (ligare). Ca rezultat, fragmente bine cunoscute se află la ambele capete ale unei secțiuni necunoscute, după care PCR poate fi efectuat ca de obicei.
PCR cu transcriere inversă (Transcripția inversă PCR, RT-PCR (eng.)) - utilizat pentru amplificarea, selectarea sau identificarea unei secvențe cunoscute din biblioteca ARN. Înainte de PCR obișnuiți, sinteza unei molecule de ADN cu o singură catenă a fost efectuată pe matricea mRNA cu o reversază și se obține un cADN cu catenă unică, care este utilizat ca matrice pentru PCR. Această metodă determină adesea unde și când se exprimă datele genetice.
PCR-ul asimetric (eng. PCR asimetric.) - se efectuează atunci când este necesar să se amplifice în principal unul dintre lanțurile ADN original. Utilizate în unele metode de analiză de secvențiere și hibridizare. PCR este efectuată ca de obicei, cu excepția faptului că unul dintre primeri este luat într-un exces mare. Modificările acestei metode sunt limba engleză. L. în ureche-A. fter-T. el-E. xponențială-PCR. (Târziu-PCR), în care primerii sunt utilizați cu concentrații diferite și primerul de concentrație scăzut este selectat cu mare (temperatură de topire) decât un primer de concentrație ridicată. PCR se efectuează la o temperatură ridicată de recoacere, astfel că este posibilă menținerea eficienței reacției în cicluri.
PCR cantitativ (PCR cantitativ, Q-PCR (engleză)) sau PCR în timp real - Folosit pentru a monitoriza direct măsurarea cantității de produs PCR specific în fiecare ciclu de reacție. În această metodă, grundurile marcate cu fluorescent sau sondele ADN sunt utilizate pentru a măsura cu exactitate cantitatea produsului de reacție așa cum este acumulată; sau un colorant de intercalare fluorescentă este utilizat Sybr Green I. care se leagă la ADN-ul dublu catenar. Sybr Green I. Oferă o opțiune simplă și economică pentru detectarea și determinarea cantitativă a produselor PCR în timpul PCR în timp real, fără a fi nevoie să utilizați sonde sau primeri specifice fluorescente. În timpul vopselei de amplificare Sybr Green I. Încorporați într-o canelură mică a produselor ADN PCR și mănâncă un puternic comparativ cu un colorant independent cu un semnal fluorescent când este iradiat cu un laser albastru. Sybr Green I. Compatibil cu toate dispozitivele cunoscute până în prezent pentru PCR în timp real. Absorbție maximă pentru Sybr Green I. Situat la o lungime de undă de 494 nm. În plus față de principalul, în spectrul de colorare există două mici maximă de absorbție suplimentară - la 290 nm și 380 nm. Emisia maximă pentru Sybr Green I. Situat la o lungime de undă de 521 nm (verde).
Pasul PCR (Touchdown PCR (engleză)) - Cu ajutorul acestei abordări, reduceți efectul legării de primer nespecifică. Primele cicluri sunt efectuate la temperaturi deasupra temperaturii optime de recoacere, apoi la fiecare câteva cicluri, temperatura de recoace este redusă treptată la optimă. Acest lucru se face pentru ca grundul hibridizat cu lanțul complementar al lungimii sale; Întrucât cu temperatura optimă de recoacere, grundul este parțial hibridizat cu lanțul complementar. Hibridizarea parțială a primerului pe ADN genomic conduce la amplificare nespecifică, dacă există multe site-uri de legare pentru grund. În majoritatea cazurilor, primele zece cicluri PCR pot fi efectuate la o temperatură de recoacere de 72-75 ° C, apoi se reduce imediat la optimă, de exemplu până la 60-65 ° C.
Metoda de coloniile moleculare (PCR în gel, ing. Colonia - Colonia PCR) - Gelul de acrilamidă este polimerizat cu toate componentele PCR de pe suprafață și conduce PCR. La punctele care conțin ADN-ul analizat, amplificarea are loc cu formarea coloniilor moleculare.
PCR cu amplificare rapidă a capetelor cADN-ului (eng. Aparificarea rapidă a cADN-ului, Race-PCR ).
PCR fragmente lungi (eng. PCR cu rază lungă de acțiune) - Modificarea PCR pentru a amplifica secțiunile ADN extinse (10 mii și mai multe motive). Un amestec de două polimeraze este utilizat, dintre care unul este un polimerază Taq cu o dovadă ridicată (care este capabilă să sintetizeze lanțul lung de ADN într-o singură trecere), iar a doua poliție ADN cu activitate de exonuclează 3 "-5" este de obicei Pfu Polymeraza. Cea de-a doua polimerază este necesară pentru a regla erorile făcute de primul, deoarece Polimeraza Taq oprește sinteza ADN dacă nu a fost adăugată nucleotidă complementară. Această nucleotidă non-complementară elimină polimeraza PFU. Un amestec de polimeraz este luat în raport cu 50: 1 sau chiar mai mic de 100: 1, unde Polimeraza Taq durează de 25-100 de ori mai mult față de PFU polimerază.
Rappat. (eng. Amplificarea aleatorie a ADN-ului polimorf ), Se utilizează PCR cu amplificare aleatorie a ADN-ului polimorf - este utilizat atunci când este necesar să se facă distincția între organismele apropiate de secvența genetică, de exemplu, diferite soiuri de plante cultivate, rase de câini sau microorganisme apropiate. În această metodă, se utilizează de obicei un grund de dimensiuni mici (aproximativ 10 p.). Acest primer va fi parțial complementar de către site-urile ADN aleatoare ale organismelor studiate. Selectarea condițiilor (lungimea primerului, compoziția, temperatura etc.), este posibilă obținerea unor diferențe satisfăcătoare în picturile PCR pentru două organisme.
PCR specifice (eng. pCR specifice grupului) - PCR pentru secvențe conexe în interiorul uneia sau între diferite specii, utilizând primeri conservatori la aceste secvențe. De exemplu, selecția primerilor universali la ribozomale 18s. și 26 de ani. Genele pentru amplificarea distanțierului intergenic specific speciilor: secvența genelor 18s. și 26 de ani. Conservator între specie, astfel că PCR între aceste gene va fi ținută pentru toate speciile studiate. Metoda opusă este - pCR unic (eng. pCR unic), în care sarcina constă în selectarea primerilor pentru a amplifica doar o secvență specifică între secvențele conexe.
PCR utilizând Hot Start (eng. Hot-start PCR) - Modificarea PCR utilizând o polimerază ADN, în care activitatea polimerazei este blocată la temperatura camerei cu anticorpi sau anticorp imitând molecule mici, cum ar fi afibarea, adică la momentul reacției la prima denaturare din PCR. De obicei, prima denaturare se efectuează la 95 ° C timp de 10 minute.
PCR virtual (Engleză în silico PCR, PCR digitală, PCR electronică, E-PCR) - metoda matematică de analiză a computerelor de reacție în lanț a polimerazei teoretice utilizând secvențele de primeri (sau sonde ADN) pentru prezicerea amplificării potențiale a ADN-ului genomului sub Studiu, cromozom, ADN inel sau orice alt complot ADN.

Dacă secvența nucleotidică a matricei este cunoscută parțial sau necunoscută, puteți utiliza grundurile degenerateA căror secvență conține poziții degenerate în care poate fi localizată orice bază. De exemplu, secvența de primer poate fi astfel: ... ATH ...unde n - a, t sau s.

Aplicația PCR.

PCR este utilizat în multe zone pentru analize și în experimente științifice.

Criminalistică

PCR este folosit pentru a compara așa-numitele "amprente genetice". Avem nevoie de un eșantion de material genetic din scena crimei - sânge, saliva, sperma, părul etc. Este comparat cu materialul genetic al suspectului. Un număr foarte mic de ADN, teoretic - o copie. ADN-ul împărțit în fragmente, apoi amplificat folosind PCR. Fragmentele sunt separate prin electroforeză ADN. Modelul rezultat al benzilor ADN și se numește amprente genetice (eng. amprente genetice).

Participarea paternității

Smochin. 3.: Rezultatele electroforezei fragmentelor ADN amplificate de PCR. (1) Tatăl. (2) copil. (3) mama. Copilul a moștenit câteva caracteristici ale amprentei genetice a ambelor părinți, care au dat o nouă amprentă unică.

Deși "amprentele genetice" sunt unice (cu excepția cazului de gemeni unic), relațiile pot fi instalate în continuare făcând câteva astfel de amprente (fig.3). Aceeași metodă poate fi aplicată, modificând ușor, pentru a stabili rudenia evolutivă între organisme.

Diagnostic medical

PCR face posibilă accelerarea semnificativă și facilitarea diagnosticului bolilor ereditare și virale. Gena dorită este amplificată de PCR utilizând primerele corespunzătoare, apoi se încheie apoi pentru a determina mutațiile. Infecțiile virale pot fi detectate imediat după infecție, săptămâni sau luni înainte de simptomele bolii.

Medicină personalizată

Uneori medicamentele sunt toxice sau alergene pentru unii pacienți. Motivele acestui lucru sunt parțial în diferențele individuale în ceea ce privește susceptibilitatea și metabolismul medicamentelor și derivatele acestora. Aceste diferențe sunt determinate la nivel genetic. De exemplu, un pacient are un citocrom specific (proteina hepatică, care este responsabilă pentru metabolismul substanțelor străine) poate fi mai activă, cealaltă este mai mică. Pentru a determina ce tip de citocrom are acest pacient, se propune efectuarea unei analize PCR înainte de aplicarea medicamentelor. Această analiză se numește genotipare preliminară (eng. genotiparea prospectivă.).

Genele de clonare

Clonarea genelor (care nu sunt confundate cu clonarea organismelor) este procesul de separare a genei și, ca urmare a manipulărilor genetice, producând un număr mare de produse din această genă. PCR este utilizat pentru amplificarea genei, care este apoi introdusă în vector - Fragmentul ADN-ului, purtând gena străină în același sau diferită, convenabilă pentru cultivare, organism. Ca vectori, de exemplu, sunt utilizate plasmide sau ADN viral. Introducerea genelor la un organism străin este de obicei utilizată pentru a obține produsul acestei gene - ARN sau, cel mai adesea, proteine. Astfel, în cantitățile industriale, multe proteine \u200b\u200bsunt obținute pentru utilizare în agricultură, medicină etc.

Smochin. patru.: Gena de clonare folosind plasmidul.
(1) ADN-ul cromozomial al organismului A. (2) PCR. (3) Multe copii ale genei genetice A. (4) Introducerea unei gene în plasmidă. (5) plasmidă cu genomul organismului A. (6) Introducerea plasmidelor în corpul V. (7) Înmulțirea numărului de copii ale genei organismului A în corpul B.

ADN secvențiere

În metoda de secvențiere utilizând eticheta fluorescentă sau izotopul radioactiv al DideoXinucleotidicului PCR este o parte integrantă, deoarece tocmai în timpul polimerizării la circuitul ADN, un derivați de nucleotide etichetate cu o etichetă fluorescentă sau radioactivă. Atașarea dideoxinucleotidei la circuitul sintetizat conduce la o stâncă de sinteză, permițându-vă să determinați poziția de nucleotide specifice după separarea în gel.

Mutagenez.

În prezent, PCR a devenit principala metodă de mutageneză (de modificare a secvenței nucleotidice a ADN-ului). Utilizarea PCR a făcut posibilă simplificarea și accelerarea procedurii de conducere a mutagenezei, precum și o face mai fiabilă și mai reproductibilă.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) - o metodă de înaltă precizie în domeniul diagnosticului patologiilor ereditare, a infecțiilor, a bolilor virale în orice etapă (acută sau cronică), precum și - într-o etapă timpurie - la manifestări evidente ale bolii prin identificarea agenților patogeni , pe baza ADN-ului lor, ARN care sunt material genetic, în eșantioane obținute de la pacient. Și astăzi vom vorbi despre esența, etapele de diagnosticare și principiile metodelor de reacție a lanțului polimerazei (PCR), precum și valoarea acestuia.

Ce este o reacție în lanț a polimerazei

Baza analizei este amplificarea (dublarea) - crearea unei pluralități de copii dintr-o secțiune de ADN scurt (acid deoxiribonucleic) reprezentând complexul genetic uman. Pentru studiu, o cantitate foarte mică de substanțe fiziologice (spută, masa de tăiere, resturi de epitelium, suc de prostată, sânge, sperma, apa uleioasă, mucus, țesătură placentă, urină, saliva, lichid pleural, cerebrospinală). În același timp, de exemplu, în calea urogenitală a pacientului, poate fi detectată chiar și o singură microbeală rău intenționată.

Metodologia PCR (reacția lanțului polimerazei) a dezvoltat un om de știință american K. Mulis, în 1993 a primit Premiul Nobel.

Folosit în mod activ:

În diagnosticarea precoce a infecțiilor, genetice;
În examinarea criminalistică, dacă există un număr extrem de mic de ADN pentru a studia;
În medicina veterinară, farmaceutică, biologie, genetică moleculară;
pentru a identifica identitatea ADN-ului, confirmați paternitatea;
În paleontologie, antropologie, ecologie (la urmărirea calității produselor, factorii de mediu).

Despre faptul că o reacție în lanț a polimerazei va spune în detaliu acest videoclip:

Cui îi este prescris

Reacția în lanț a polimerazei în diagnosticarea bolilor infecțioase este una dintre cele mai fiabile tehnici de acuratețe și fiabilitate deosebită. De exemplu, exactitatea analizei PCR pe Chlamydia și pentru mulți alți agenți patogeni se apropie de 100% (absolută). Cel mai adesea, procedura de reacție a lanțului polimerazei este prescrisă pacienților care au dificultăți cu identificarea unui anumit patogen în diagnosticare.

Utilizarea PCR de laborator:

pentru a detecta organismele patogene care cauzează infecția organelor urinare și genitale, dificil de identificat atunci când se utilizează culturi sau metode de imunologie;
să diagnosticheze în mod repetat HIV la etapa inițială în cazul unui pozitiv, dar provocând orice îndoială rezultatul analizei primare (de exemplu, la nou-născuții de la părinții infectați cu SIDA);
să stabilească o boală oncologică într-un stadiu incipient (studiul mutațiilor oncogenes) și corectarea individuală a regimului de tratament la un anumit pacient;
pentru a detecta timpuriu și a tratamentului potențial al patologiilor ereditare.

Astfel, viitorii părinți predau analiza pentru a afla dacă sunt purtători ai patologiei genetice, la copii PCR determină probabilitatea de boală transmisă prin moștenire.

pentru a detecta patologiile fătului asupra perioadei timpurii de uzură (celulele individuale ale embrionului crescând sunt investigate pentru posibile mutații);
la pacienții înainte de transplantul de organe - pentru "tastarea țesăturilor" (determinarea compatibilității țesutului);
să identifice organismele patogene periculoase în sângele donatorului;
la nou-născuți, copii - pentru a identifica infecțiile ascunse;
pentru a evalua rezultatele tratamentului antivirus și antimicrobian.

De ce să treacă o astfel de procedură

Deoarece PCR este o metodă foarte eficientă de diagnosticare, dând un rezultat aproape 100%, se utilizează procedura:

pentru a confirma sau elimina diagnosticul final;
evaluarea rapidă a eficacității terapiei.

În multe cazuri, PCR este singurul test posibil pentru detectarea unei boli în curs de dezvoltare, dacă alte tehnici de diagnosticare bacteriologică, imunologică și virologică sunt inutile.

Virușii sunt detectați utilizând procedura PCR imediat după infecție și înainte de apariția semnelor bolii. Detectarea precoce a virusului vă permite să atribuiți rapid tratamentul.
Așa-numita "încărcare virală" (sau - numărul de virusuri din organism) este, de asemenea, determinată atunci când analizează ADN-ul prin metoda cantitativă.
Organismele patogene specifice (de exemplu, Wand Tuberculous Koch) este dificil și cultivat prea mult timp. Analiza PCR vă permite să identificați rapid numărul minim de agenți patogeni (vii și morți) în probele care sunt convenabile pentru cercetare.

Analiza detaliată a ADN-ului patogen este utilizată:

pentru a determina sensibilitatea la anumite tipuri de antibiotice, care vă permite să continuați imediat tratamentul;
să monitorizeze răspândirea epidemilor în rândul animalelor domestice, sălbatice;
pentru a dezvălui și a urmări noi tipuri contagioase de microbi și subtipuri de agenți patogeni care au provocat epidemii anterioare.

Tipuri de diagnosticare

Metoda standard

O analiză a reacției în lanț de polimerază este efectuată pe baza amplificării multiple (dublare) a unui anumit fragment de ADN și ARN utilizând enzime de primer special. Ca rezultat, lanțul de copiere dovedește cantitatea de material suficientă pentru studiu.

În timpul procedurii, numai fragmentul dorit (corespunzător condițiilor specifice specificate) este copiat și în cazul în care este într-adevăr prezent în eșantion.

Despre modul în care PCR trece, spune acest videoclip detaliat cu scheme utile:

Alte metode

PCR efectuat în timp real. În această formă de cercetare, procesul de detectare a unui anumit fragment ADN este lansat după trecerea fiecărui ciclu și nu după întregul lanț de 30-40 de cicluri. Acest tip de studiu vă permite să obțineți informații despre numărul de patogen (virus sau microb) în organism, adică o analiză cantitativă.
De la-PCR (modul de transcriere inversă). Această analiză este utilizată pentru a găsi ARN cu un lanț pentru a detecta virușii a căror bază genetică este tocmai ARN (de exemplu, virusul hepatitei C, imunodeficiența). Cu acest studiu, se utilizează o enzimă specială - transcriptaza inversă și un anumitor grund și un ADN cu catenă unică sunt construite pe baza ARN-ului. Apoi, din acest lanț restabiliți cel de-al doilea circuit ADN și se efectuează procedura standard.

Indicații pentru exploatație

Procedura PCR este utilizată în clinica bolilor infecțioase, neonatologiei, obstetrică, pediatrii, urologică, ginecologie, veneologie, neurologie, nefrologie, oftalmologie.

Indicații pentru atribuirea analizei:

clarificarea riscului de a dezvolta anomalii genetice la un copil în probabilitatea de patologii ereditare;
diagnosticul ambelor părinți la planificarea sarcinilor sau a stării grave a mamei care suferă de sarcină;
dificultăți cu concepția, identificarea motivelor infertilității;
suspiciunea infecțiilor sexuale în stadiul acut și cu simptomele tranziției la cronică;
detectarea cauzelor proceselor inflamatorii de origine obscură;
contacte sexuale aleatorii neprotejate și permanente;
determinarea sensibilității microorganismului patogenic la antibiotice specifice;
pacienții cu suspiciune de infecție ascunsă pentru a detecta agenții patogeni la dezvoltarea simptomelor explicite (diagnosticare preclinică);
pacienții să confirme recuperarea după boală (diagnosticare retrospectivă);

De asemenea, utilizat pentru a diagnostica, dacă este necesar, pentru a detecta cu exactitate următorii agenți patogeni ::

virusuri de hepatită (A B CG), imunodeficiență umană, citomegalovirus;
vibrion holeră;
virus de herpes, specii de herpetyforme;
retro - adeno - și rinovirusuri;
rubella Virusuri, Epstein-Barr, Varizella (Zoster - virus);
parso - și picovirovirus;
bacterii helicobacter pylori;
legionell, tipuri patogene de bastoane intestinale;
staphylococcus Golden;
agent cauzal;
clostridia, difteria și stickul hemofil;

Utilizate și pentru a determina infecțiile:

mononucleoza infectioasa;
borrelioza, lemarioza, encefalita ticky;
candida ciuperci au fost prinse;
infecții sexuale - trichomoniasis, ureplasmoză, treponema pal, Gardnereloză, Gonoreea, Mycoplasmoză, Chlamydia;
tuberculoză.

Contraindicații pentru exploatație

Deoarece procedura nu se efectuează cu un pacient, fără niciun impact asupra corpului, dar cu materiale biologice luate pentru cercetare, atunci nici o contraindicație pentru PCR nu se datorează absenței potențialului pericol.

Cu toate acestea, gardul biomaterialelor din canalul de col uterin al uterului nu este efectuat după procedura de colposcopie. Livrarea de frotiuri, răzuirea pentru analiză este permisă numai după 4-6 zile de la sfârșitul menstruației și întreruperea completă a selecției.

Este metoda în siguranță?

Nici un impact negativ asupra pacientului cu un studiu izolat al biomaterialelor sale în condiții de laborator nu este imposibil.

Pregătirea procedurii (donarea substanțelor biologice pentru analiză)

Ca o probă pentru analiza PCR, în care este detectată ADN-ul unui agent patogen străin, există orice fluid biologic, țesut, alocări organismului. Gardul substanței studiate se desfășoară sub formă de sânge care preia din vene, resturi de la Larynx, cavitatea nasului, canalul uretrei, cavitatea pleurală, colul uterin.

Înainte de procedura de diagnosticare, medicul explică pacientul, gardul căruia se va lua materialul:

La examinarea infecțiilor sexuale, se face selecția organelor genitale, urină, accident vascular cerebral din uretra.
Atunci când se analizează infecțiile herpetice, citomegalovirusul, mononucleoza - ia analiza urinei, frotiu din Zea, la hepatită, toxoplasmoză - sânge din Viena.
Pentru a diagnostica diferitele specii, lichidul cefalorahidian este luat.
În pulmonologie, mostre pentru analizarea - sputum și lichid pleural.
Atunci când există un studiu al posibilelor infecții intrauterine la introducerea fătului pentru analiză, se utilizează apă feroasă și celulele placentă.

Precizia și acuratețea analizei depind de sterilitatea condițiilor la administrarea materialului. Deoarece studiul PCR are o sensibilitate ridicată, orice contaminare a substanței studiate poate distorsiona rezultatul.

Pregătirea competentă pentru livrarea biomaterialelor nu reprezintă dificultăți pentru pacienți. Există anumite recomandări:

când analizați infecțiile sexuale:
- eliminați contactele intime cu 72 de ore înainte de material;
- opriți utilizarea unor instrumente vaginale în 3 zile;
- de la seara zilei precedente, nu conduceți igienă în zona investigată;
- excludeți urinarea timp de 3 până la 4 ore atunci când luați o probă din uretra;
nu mai luați antibiotice cu o lună înainte de încercări de infecție;
sângele este predat dimineața până la mâncare și băut;
colectarea primei porțiuni de dimineață de urină se desfășoară într-un recipient steril după o toaletă intimă atentă.

Despre cum se efectuează diagnosticarea sub metoda de reacție a lanțului polimerazei, citiți mai jos.

Cum este procedura

La efectuarea unui studiu PCR, anumite cicluri sunt repetate la un reactor (amplificator sau ciclist termic):

Primul pas - Denaturare. Saliva, sânge, bioptat, eșantioane ginecologice, spută, în care este suspectată prezența agentului patogen ADN (sau ARN), sunt plasate într-un amplificator, unde materialul este încălzit și se produce despicarea ADN-ului în două lanțuri separate.
A doua etapă - recoacere sau răcire mică a materialului și adăugarea de primeri la el capabilă să recunoască zonele dorite în molecula ADN și să le contacteze.
Pasul al treilea - EndugAtion - Apare după conectarea a 2 primeri la fiecare dintre lanțurile ADN. În timpul procesului, fragmentul ADN agentului patogen este finalizat și se formează o copie.

Aceste cicluri se repetă prin tipul de "reacție în lanț", de fiecare dată, ducând la dublarea copiilor unui fragment specific ADN (de exemplu, un segment în care este programat un anumit virus). Timp de câteva ore, se formează multe copii ale fragmentului ADN, iar prezența lor în eșantion este detectată. După aceea, analizează și comparați rezultatele cu baza de date a diferitelor tipuri de agenți patogeni pentru a determina tipul de infecție.

Despre decodarea rezultatelor și a concluziei bazate pe reacția PCR citită mai jos.

Decodarea rezultatelor

Rezultatul final al studiului este emis în 1-2 zile după trecerea materialului biologic. Adesea - deja în prima zi după analiză.

Analiza calitativa

Negativrezultatul înseamnă că, în substanța denumită studiul, nu au fost detectate urmele agenților cauzali ai infecției.
Pozitivrezultatul înseamnă detectarea virușilor patogeni sau a bacteriilor într-o probă biologică, cu un grad foarte ridicat de precizie la momentul livrării materialului.

Dacă rezultatul este pozitiv, dar semnele de infecție crescută nu au fost identificate - această condiție a corpului se numește asimptomatică "purtători sănătoși". Cel mai adesea se observă atunci când ia un biomaterial dintr-un anumit loc (canal cervical, uretra, cavitate orală) în bolile virale. Tratamentul în acest caz nu este necesar, dar neapărat observarea medicală constantă, deoarece există o șansă:

propagarea virusului de la mass-media și infecția persoanelor sănătoase;
activarea procesului și tranziția bolii în formă cronică.

Cu toate acestea, dacă testul de sânge este pozitiv, acest lucru indică faptul că infecția a lovit corpul și aceasta nu mai este o stare de transport, ci patologia care necesită terapie specifică imediată.

Analiza cantitativa

Rezultatul cantitativ definește un specialist în mod specific pentru un anumit tip de infecție. La baza sa, este posibil să se estimeze gradul de dezvoltare, stadiul bolii, ceea ce face posibilă numirea rapidă a tratamentului adecvat.

cost mediu

Prețurile pentru reacția în lanț a polimerazei sunt determinate de: Tipul de cercetare, complexitatea agentului cauzal, dificultatea de consum de material biologic, tipul de analiză (de înaltă calitate sau cantitativă), nivelul prețurilor în laborator.

Pe de altă parte, în studiul PCR, este posibil să se determine mai mulți agenți patogeni imediat în timpul gardului unui tip de material pentru analiză. Acest lucru economisește pe alte analize de laborator.

Aproximativ, costul analizării PCR în ruble:

gonokokk, Gardnerwell, Trichomonada Vagynis - de la 180
chlamydia Traimatis - de la 190
papillomavirus - de la 380 la 500
biocenoza tractului urogenital la femei (evaluarea cantitativă și de înaltă calitate a microflorei) - de la 800.

Chiar și mai multe informații utile privind studiul PCR sunt conținute în videoclipul de mai jos:

Genetica bacteriilor. Informații pentru cele două clase.

Reacția în lanț a polimerazei

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă care permite o creștere multiplă a cantității de anumite molecule ADN în proba analizată (inclusiv în material biologic sau cultura pură).

Principalele avantaje ale PCR ca metodă de diagnosticare în microbiologie sunt o sensibilitate foarte mare care permite detectarea concentrațiilor de agenți patogeni extrem de mici în eșantioane și o specificitate ajustabilă a impozitelor, care permite detectarea sau identificarea agenților patogeni pe o specie generică, specie sau sub- nivel de nivel. Principalul dezavantaj al PCR rezultă din sensibilitatea sa extrem de ridicată - imaginile sunt foarte ușor de contaminat ADN-ul de la controlul pozitiv, un alt eșantion sau produs PCR, care va duce la o reacție pozitivă falsă. Acest lucru impune restricții dure asupra condițiilor în care PCR este amestecat și funcționează cu produse PCR gata făcute.

Conducând PCR.Amestecul de reacție este preparat conținând următoarele componente:

ADN-ul selectat din eșantionul studiat,

Tampon

Mg2 + ioni (necesar pentru munca enzimatică),

Doi primeri sunt molecule de ADN catenar (lungime mai des de 18 până la 24 nucleotide), capetele complementare ale diferitelor circuite ale secvenței de ADN detectabile.

Amestec de deoxinucleotidtriphosphații.

ADN-polimerază rezistentă la căldură (polimeraza Taq este cea mai des folosită, izolată de la Termopus. aquaticus.).

Apoi, acest amestec de reacție este plasat într-un amplificator, care este de fapt un termostat programabil. În amplificator, se efectuează 30-40 cicluri de schimbare a temperaturii. Fiecare dintre aceste cicluri constă din trei etape (vezi figura 1):

Denaturarea (temperatura 94 ° C) - Lanțurile de hidrogen de spargere și lanțurile ADN sunt divergente.

Primele de recoacere (temperatura este de obicei în jurul valorii de 50-60 ° C) - primerii sunt îmbinate la capetele circuitelor ADN. În general, când temperatura scade, reunificarea circuitelor inițiale ADN originale din proba studiată (renitorizarea) este energetic mai profitabilă, dar concentrația de primeri în amestecul de reacție pentru multe ordine de mărime mai mult decât concentrația de ADN din Eșantion (cel puțin pe ciclurile inițiale PCR), prin urmare, reacția de recoacere a primerului fluxul de renaturare mai rapidă ADN. Temperatura de recoacere este selectată în funcție de temperaturile de topire (denaturare) de primeri.

Elimarea (temperatura este de obicei 72 ° C) - ADN polimeraza completează primeri în conformitate cu matricea lanțurilor ADN lungi. Temperatura corespunde temperaturii optime a polimerazei ADN utilizate.

Detectarea rezultatelor este diferită în diferite versiuni ale seturilor PCR și este descrisă în secțiunea "Soiuri PCR".

Difuzor PCR

În ciclurile PCR timpurii, numărul de molecule ADN cu două catene, dimensiunea căruia este determinată de distanța dintre locurile de primere, se dublează cu fiecare ciclu. Se formează și un număr mic de molecule de ADN mai lung, care pot fi neglijate (vezi figura 2).

Astfel, în ciclurile timpurii, cantitatea de produs PCR este descrisă de formula M * 2 N, unde M este numărul inițial de ADN din eșantion, N este numărul de cicluri. Apoi, reacția se duce la platou. Acest lucru se datorează acumulării produsului de reacție, reducând concentrația de primeri și deoxinucleotidifosfați, precum și prin creșterea concentrației pirofosfatului (vezi fig.3).

Soiuri PCR

Convenția PCR

În acest exemplu de realizare, PCR efectuează reacția este un număr predeterminat de cicluri (30-40), după care se analizează dacă acumularea de molecule de ADN cu catenă dubluă a apărut în amestecul de reacție.

Această variantă a formulărilor PCR atunci când este utilizată ca metodă de diagnosticare este o metodă calitativă. O reacție pozitivă indică prezența cel puțin a cantităților de molecule de ADN dorite din probă. Reacția negativă indică absența acestora. Evaluarea cantitativă a conținutului moleculelor ADN originale din eșantion este imposibil datorită reacției la platou.

Principala metodă de detectare a prezenței produsului este electroforeza în gel de agaroză sau poliacrilamidă. Produsele PCR sunt împărțite în gel sub acțiunea câmpului electric în funcție de greutatea lor moleculară. Un colorant de intercalare este adăugat la gel (fluorescentă în starea asociată cu ADN dublu catenar - cel mai adesea etidiu brom). Astfel, atunci când este iradiat cu ultraviolet, va fi posibil să se vadă prezența sau absența unei benzi care corespund ADN-ului greutății moleculare necesare. La efectuarea PCR pentru scopuri de diagnosticare, un control pozitiv și negativ al reacției este întotdeauna pus, cu care sunt comparate eșantioane (vezi figura 4).

PCR în timp real

În acest exemplu de realizare, PCR efectuează cantitatea de produs PCR în amestecul de reacție este înregistrată în mod constant în timpul fluxului de reacție. Acest lucru ne permite să construim o curbă de reacție (vezi Fig.3) și, pe baza acestuia, calculați numărul de molecule de ADN dorite în eșantioane.

Unul dintre tipurile de PCR în timp real - folosind intercalaterant, care este adăugat direct la amestecul de reacție (Sybrgreen este cel mai des utilizat). Un alt tip - utilizând unul dintre tipurile de sonde fluorescente, legând la o secțiune din interiorul produsului PCR, ceea ce face posibilă creșterea specificității detecției (vezi fig.5). Fluorescența fluxului are loc direct în instrument în timpul fluxului de reacție .

În plus față de posibilitatea de detectare cantitativă, există și alte avantaje ale PCR în timp real în comparație cu convenționalul. Această versiune de PCR este mai simplă, rapidă și, de asemenea, nu necesită descoperirea tuburilor cu produse PCR, ceea ce reduce probabilitatea de contaminare a altor eșantioane. Principalul dezavantaj este valoarea mai mare a amplificatorului cu posibilitatea integrată de detectare a fluorescenței comparativ cu cel obișnuit.

PCR cantitativ digital

Un nou, scump și până acum o versiune de distribuție mică a PCR, care vă permite să determinați mai precis cantitatea de ADN din eșantion. În acest exemplu de realizare, amestecul de reacție care conține un colorant fluorescent este împărțit într-un număr mare de volume microscopice (de exemplu, picături în emulsie). După ce fluxul PCR este analizat, în care fracțiunea picăturilor, reacția a fost pozitivă și, în consecință, se observă fluorescența. Această cotă va fi proporțională cu numărul moleculelor ADN dorite din eșantion.

PCR cu transcriere inversă

În acest caz, înainte de o anumită variantă PCR, transcrierea inversă (ARN în ADN) se efectuează utilizând o enzimă de revertază. Astfel, această metodă vă permite să efectuați detectarea cantitativă de înaltă calitate a moleculelor ARN. Acest lucru poate fi utilizat pentru detectarea virușilor care conțin ARN sau pentru determinarea nivelului de transcripție (număr de ARNm) al unei gene sau alta.

Imaginea 1. Etapele PCR. Primere marcate cu culori roșii.

Figura 2.Acumularea de molecule ADN cu catenă dublu limitată de primeri în timpul PCR.

Figura 3.Dinamica reacției PCR la diferite concentrații inițiale ale moleculelor ADN dorite din probă. (a) - cea mai mare concentrație (b) - concentrația intermediară (B) - cea mai mică concentrație

Figura 4.Electroforeza agaromică a produselor PCR. K + - Controlul pozitiv (ADN-ul Snoral este prezent). 1-7 - eșantioanele studiate (din care 1-2 sunt pozitive, 3-7 sunt negative). K - Controlul negativ (ADN-ul dorit lipsește evident). În multe cazuri, în plus față de produsul țintă, sunt vizibile produse de reacție nespecifice mai ușoare (dimerii primerului).

Figura 5.Metode de detectare atunci când se utilizează PCR în timp real. (a). (c) - Molecularbacon - sonda de fluorescență apare atunci când hibridizarea sondei cu un fragment țintă datorită distanței spațiale a fluoroforului și epuizării (G) - sondele Lightcycler - fluorescența acceptorului are loc în hibridizarea sondei (conținând acceptorul și donator) cu fragmentul țintă datorită transferului rezonant de energie fluorescentă (FRET).