Въведение.

1. Обща характеристика и класификация на цитокините.

1.1 Механизми на действие.

1.2 Свойства на цитокините.

1.3 Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на организма.

2. Специални изследвания на цитокини.

2.1 Ролята на цитокините в патогенезата на възпалителни заболявания на дебелото черво при деца.

2.2 Ролята на азотен оксид и цитокини в развитието на синдром на остро белодробно увреждане.

3. Методи за определяне на цитокини

3.1 Определяне на биологичната активност на цитокините

3.2 Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела

3.3 Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

3.3.1 Фактор на туморна некроза-алфа.

3.3.2 Гама интерферон.

3.3.3 Интерлевкин-4

3.3.4 Интерлевкин-8

3.3.5 Антагонист на рецептора на интерлевкин-1.

3.3.6 Алфа-интерферон.

3.3.7 Антитела към алфа-IFN.

4. Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Списък на използваната литература.

Заключение.

Въведение.

Не е минало много време от описанието на първите цитокини. Изследванията им обаче доведоха до разпределението на обширен раздел от знания - цитокинология, която е неразделна част от различни области на знанието и на първо място имунология, която даде мощен тласък за изучаването на тези медиатори. Цитокинологията прониква във всички клинични дисциплини, от етиологията и патогенезата на заболяванията до превенцията и лечението на различни патологични състояния. Следователно, научните изследователи и клиницистите трябва да се ориентират в разнообразието от регулаторни молекули и да имат ясно разбиране за ролята на всеки от цитокините в изследваните процеси. Всички клетки на имунната система имат определени функции и работят в ясно координирано взаимодействие, което се осигурява от специални биологично активни вещества - цитокини - регулатори на имунните реакции. Цитокините са специфични протеини, с помощта на които различни клетки на имунната система могат да обменят информация помежду си и да координират действията. Наборът и количеството цитокини, действащи върху рецепторите на клетъчната повърхност - "цитокиновата среда" - представляват матрица от взаимодействащи и често променящи се сигнали. Тези сигнали са сложни поради голямото разнообразие от цитокинови рецептори и поради факта, че всеки от цитокините може да активира или потисне няколко процеса, включително собствения си синтез и синтеза на други цитокини, както и образуването и появата на цитокинови рецептори върху клетъчната повърхност. Целта на нашата работа е да изследваме цитакините, техните функции и свойства, както и евентуалното им приложение в медицината. Цитокините са малки протеини (с молекулно тегло от 8 до 80 kDa), които действат автокринно (т.е. върху клетката, която ги произвежда) или паракринни (върху клетки, разположени наблизо). Образуването и освобождаването на тези високо активни молекули е краткотрайно и строго регулирано.

Литературен преглед.

Обща характеристика и класификация на цитокините.

Цитокините са група полипептидни медиатори на междуклетъчно взаимодействие, които участват главно във формирането и регулирането на защитните реакции на организма по време на въвеждането на патогени и нарушаване на целостта на тъканите, както и в регулирането на редица нормални физиологични функции. Цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима регулаторна система, която съществува заедно с нервната и ендокринната система за поддържане на хомеостазата, и трите системи са тясно взаимосвързани и взаимозависими. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. Понастоящем са известни повече от 200 отделни вещества, принадлежащи към семейството на цитокините. Историята на изследването на цитокините започва през 40 -те години на 20 век. Тогава бяха описани първите ефекти на кахектин, фактор, присъстващ в кръвния серум и способен да причини кахексия или загуба на тегло. Впоследствие този медиатор се изолира и се доказва, че е идентичен с тумор некрозисфактор (TNF). По това време изследването на цитокините се основава на принципа на откриване на всеки един биологичен ефект, който служи като отправна точка за името на съответния медиатор. Така че през 50 -те години интерферонът (IFN) е бил извикан поради способността му да повлиява или да повишава резистентността по време на повтаряща се вирусна инфекция. Интерлевкин-1 (IL-1) също първоначално се нарича ендогенен пироген, за разлика от бактериалните липополизахариди, които се считат за екзогенни пирогени. Следващият етап от изследването на цитокините, датиращ от 60-70 години, е свързан с пречистването на естествените молекули и цялостна характеристика на тяхното биологично действие. По това време принадлежи откритието на растежния фактор на Т-клетките, сега известен като IL-2, и редица други молекули, които стимулират растежа и функционалната активност на Т-, В-лимфоцити и други видове левкоцити. През 1979 г. терминът "интерлевкини" е предложен за тяхното обозначаване и систематизиране, тоест медиатори, които комуникират между левкоцитите. Много скоро обаче стана ясно, че биологичните ефекти на цитокините се простират далеч отвъд имунната система и затова предложеният по -рано термин „цитокини“, който е оцелял и до днес, стана по -приемлив. Революционен обрат в изследването на цитокините се случи в началото на 80 -те години след клонирането на гени на миши и човешки интерферон и производството на рекомбинантни молекули, които напълно повтаряха биологичните свойства на естествените цитокини. След това беше възможно да се клонират гени на други медиатори от това семейство. Важен етап в историята на цитокините е клиничната употреба на рекомбинантни интерферони и особено рекомбинантни IL-2 за лечение на рак. 90 -те години са белязани от откриването на субединичната структура на цитокиновите рецептори и формирането на концепцията за „цитокинова мрежа“, а началото на XXI век - откриването на много нови цитокини чрез генетичен анализ. Цитокините включват интерферони, колониестимулиращи фактори (CSF), хемокини, които трансформират растежни фактори; фактор на туморна некроза; интерлевкини с установени исторически серийни номера и някои други ендогенни медиатори. Интерлейкините със серийни номера, започващи от 1, не принадлежат към една и съща подгрупа цитокини, свързани с общи функции. Те от своя страна могат да бъдат разделени на провъзпалителни цитокини, фактори на растеж и диференциация на лимфоцитите и отделни регулаторни цитокини. Името "интерлевкин" се приписва на новооткрит медиатор, ако са изпълнени следните критерии, разработени от комитета по номенклатурата на Международния съюз на имунологичните общества: молекулно клониране и експресия на гена на изследвания фактор, наличието на уникален нуклеотид и съответната аминокиселинна последователност, производство на неутрализиращи моноклонални антитела. Освен това новата молекула трябва да се произвежда от клетки на имунната система (лимфоцити, моноцити или други видове левкоцити), да има важна биологична функция в регулирането на имунния отговор, както и допълнителни функции, поради което тя не може да получи функционално име. И накрая, изброените свойства на новия интерлевкин трябва да бъдат публикувани в рецензирано научно списание. Класификацията на цитокините може да се извърши според техните биохимични и биологични свойства, както и от видовете рецептори, чрез които цитокините изпълняват своите биологични функции. Класификацията на цитокините по структура (Таблица 1) взема предвид не само аминокиселинната последователност, но преди всичко третичната структура на протеина, която по -точно отразява еволюционния произход на молекулите.

Таблица 1. Класификация на цитокините по структура.

Клонирането на гени и анализът на структурата на цитокиновите рецептори показаха, че точно както самите цитокини, тези молекули могат да бъдат разделени на няколко типа според сходството на аминокиселинните последователности и особеностите на организацията на извънклетъчните домени (Таблица 2). Едно от най -големите семейства цитокинови рецептори се нарича семейство рецептори на хематопоетин или семейство цитокинови рецептори тип I. Структурна характеристика на тази група рецептори е наличието в молекулата на 4 цистеини и аминокиселинната последователност Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), разположена на кратко разстояние от клетъчната мембрана. Рецепторите на цитокин от клас II взаимодействат с интерферони и IL-10. И двата вида рецептори имат хомология помежду си. Следните групи рецептори медиират взаимодействието с цитокини от фамилията на туморната некроза и семейството IL-1. Понастоящем е известно, че повече от 20 различни хемокинови рецептори взаимодействат с различна степен на афинитет с един или повече лиганди от семейството на хемокините. Хемокиновите рецептори принадлежат към суперсемейството на родопсиновите рецептори, имат 7 трансмембранни домена и провеждат сигнал с участието на G-протеини.

Таблица 2. Класификация на цитокиновите рецептори.

Много цитокинови рецептори са съставени от 2-3 субединици, кодирани от различни гени и експресирани независимо. В този случай образуването на рецептор с висок афинитет изисква едновременното взаимодействие на всички субединици. Пример за такава организация на цитокиновите рецептори е структурата на IL-2 рецепторния комплекс. Изненадващо беше откриването на факта, че отделните субединици на рецепторния комплекс на IL-2 са общи за IL-2 и някои други цитокини. По този начин, β-веригата е едновременно компонент на рецептора за IL-15, а γ-веригата служи като обща субединица на рецепторите за IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 и IL-21. Това означава, че всички гореспоменати цитокини, чиито рецептори също се състоят от 2-3 отделни полипептида, използват γ-веригата като компонент на техните рецептори, освен това, компонент, отговорен за предаването на сигнал. Във всички случаи специфичността на взаимодействието за всеки цитокин се осигурява от други субединици, които се различават по структура. Сред цитокиновите рецептори има още 2 общи рецепторни субединици, които провеждат сигнал след взаимодействие с различни цитокини. Това е обща рецепторна субединица βc (gp140) за IL-3, IL-5 и GM-CSF рецептори, както и рецепторната субединица gp130, която е обща за членовете на семейството на IL-6. Наличието на обща сигнализираща субединица в цитокиновите рецептори служи като един от подходите за тяхната класификация, тъй като позволява да се намери общност както в структурата на лигандите, така и в биологичните ефекти.

Таблица 3 показва комбинираната структурна и функционална класификация, където всички цитокини са разделени на групи, като се отчита преди всичко тяхната биологична активност, както и горните структурни характеристики на цитокиновите молекули и техните рецептори.

Таблица 3. Структурна и функционална класификация на цитокините.

	Семейства на цитокини	Подгрупи и лиганди	Основни биологични функции
	Интерферони тип I	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Антивирусна активност, антипролиферативно, имуномодулиращо действие
	Фактори на растеж на хематопоетични клетки	Фактор на стволови клетки (комплект-лиганд, стоманен фактор), Flt-3 лиганд, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 лиганди: IL-3, IL-5, GM-KSF	Стимулиране на пролиферацията и диференциация на различни видове прогениторни клетки в костния мозък, активиране на хематопоезата Еритропоетин, тромбопоетин
	Свръхсемейството на интерлевкин-1 и FRF	Семейство FRF: Кисело FRF, основно FRF, FRF3 - FRF23 Семейство IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, антагонист на рецептора на IL-1, IL-18, IL-33 и др.	Активиране на пролиферацията на фибробласти и епителни клетки Провъзпалително действие, активиране на специфичен имунитет
	Фамилия фактор на туморна некроза	TNF, лимфотоксини α и β, Fas лиганд и др.	Провъзпалително действие, регулиране на апоптозата и междуклетъчното взаимодействие на имунокомпетентни клетки
	Семейство Interleukin-6	Gp130 лиганди: IL-6, IL-11, IL-31, онкостатин-М, кардиотропин-1, инхибиращ левкемичен фактор, цилиарен невротрофичен фактор	Провъзпалителни и имунорегулаторни ефекти
	Хемокини	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Регулиране на хемотаксиса на различни видове левкоцити
	Семейство Интерлевкин-10	IL-10,19,20,22,24,26	Имуносупресивно действие
	Семейство Interleukin-12		Регулиране на диференциацията на помощни Т-лимфоцити
	Цитокини на Т-хелперни клонове и регулаторни функции на лимфоцитите	Т-помощници тип 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg Т-помощници тип 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Γ-верижни лиганди на IL-2 рецептора: IL-7 TSLP	Активиране на клетъчния имунитет Активиране на хуморален имунитет, имуномодулиращ ефект Стимулиране на диференциацията, пролиферацията и функционалните свойства на различни видове лимфоцити, DC, NK клетки, макрофаги и др.
	Семейство Interleukin 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Активиране на синтеза на провъзпалителни цитокини
	Свръхсемейство на нервен растежен фактор, тромбоцитен растежен фактор и трансформиращи растежни фактори	Семейство на нервни растежни фактори: NGF, мозъчен невротрофичен фактор Тромбоцитни растежни фактори (PDGF), ангиогенни растежни фактори (VEGF) TRF семейство: TRFb, активини, инхибини, Nodal, костни морфогенни протеини, инхибиращо вещество на Мюлерово	Регулиране на възпалението, ангиогенезата, невронната функция, ембрионалното развитие и регенерацията на тъканите
	Семейство на епидермален растежен фактор	ERF, TRFα и др.
	Семейство на инсулиноподобни растежни фактори	IRF-I, IRF-II	Стимулиране на пролиферацията на различни типове клетки

Първата група включва интерферони тип I и е най -простата в организацията, тъй като всички молекули, включени в нея, имат подобна структура и в много отношения същите функции, свързани с антивирусната защита. Втората група включва фактори на растеж и диференциация на хематопоетични клетки, стимулиращи развитието на хематопоетични клетки -предшественици, започвайки от стволовите клетки. Тази група включва цитокини, които са тясно специфични за отделните линии на диференциация на хемопоетични клетки (еритропоетин, тромбопоетин и IL-7, който действа върху прекурсорите на туберкулозните лимфоцити), както и цитокини с по-широк спектър на биологична активност, като напр. IL-3, IL-11, колони-стимулиращи фактори. В рамките на тази група цитокини са изолирани лиганди gp140, които имат обща рецепторна субединица, както и тромбопоетин и еритропоетин поради сходството на структурната организация на молекулите. Цитокините от суперсемействата FGF и IL-1 имат висока степен на хомология и подобна структура на протеини, което потвърждава общия произход. Независимо от това, по отношение на проявите на биологична активност, FGF се различава в много отношения от агонистите на семейство IL-1. Семейството на молекули IL-1 в момента, в допълнение към функционалните имена, има обозначенията F1-F11, където F1 съответства на IL-1α, F2 на IL-1β, F3 на рецепторния антагонист на IL-1, F4 към IL- 18. Останалите членове на семейството са открити в резултат на генетичен анализ и имат доста висока хомология с молекулите на IL-1; техните биологични функции обаче не са напълно изяснени. Допълнителни групи цитокини включват семействата IL-6 (лиганди на общата рецепторна субединица gp130), фактор на туморна некроза и хемокини, които са представени с най-голям брой индивидуални лиганди и са изброени изцяло в съответните глави. Фамилията на тумор некрозис фактор се формира главно въз основа на сходството в структурата на лигандите и техните рецептори, състоящо се от три нековалентно свързани еднакви субединици, които образуват биологично активни молекули. В същото време, по отношение на биологичните свойства, това семейство включва цитокини с доста различни активности. Например, TNF е един от най -ярките провъзпалителни цитокини, Fas лигандът индуцира апоптоза на прицелните клетки, а лигандът CD40 осигурява стимулиращ сигнал по време на междуклетъчното взаимодействие на Т и В лимфоцити. Такива различия в биологичната активност на структурно сходни молекули се определят преди всичко от особеностите на експресията и структурата на техните рецептори, например наличието или отсъствието на вътреклетъчен „смъртен“ домен, който определя клетъчната апоптоза. През последните години семействата IL-10 и IL-12 също бяха попълнени с нови членове, които са получили серийни номера на интерлевкини. Следва много сложна група цитокини, които са медиатори на функционалната активност на Т-хелперните лимфоцити. Включването в тази група се основава на два основни принципа: 1) принадлежащи към цитокините, синтезирани от Th1 или Th2, което определя развитието на предимно хуморален или клетъчен тип имунологични реакции, 2) наличието на обща рецепторна субединица - гама веригата на рецепторния комплекс на IL-2. Сред лигандите на гама веригата беше допълнително изолиран IL-4, който също има общи рецепторни субединици с IL-13, което до голяма степен определя частично припокриващата се биологична активност на тези цитокини. IL-7, който има обща структура на рецептори с TSLP, се изолира по подобен начин. Предимствата на горната класификация са свързани с едновременното разглеждане на биологичните и биохимичните свойства на цитокините. Възможността на този подход в момента се потвърждава от откриването на нови цитокини чрез генетичен анализ на генома и търсене на структурно сходни гени. Благодарение на този метод семейството на интерферони от тип I, IL-1, IL-10, IL-12, се разшири значително, появи се ново семейство цитокини аналози на IL-17, което вече се състои от 6 члена. Очевидно в близко бъдеще появата на нови цитокини ще се случи много по -бавно, тъй като анализът на човешкия геном е почти завършен. Промените са най-вероятно възможни поради изясняване на вариантите на лиганд-рецепторните взаимодействия и биологичните свойства, което ще позволи класификацията на цитокините да придобие окончателна форма.

Механизми на действие.

Б. Рецептори на цитокини. Цитокините са хидрофилни сигнални вещества, чието действие се медиира от специфични рецептори от външната страна на плазмената мембрана. Свързването на цитокини към рецептора (1) води до редица междинни етапи (2-5) до активиране на транскрипцията на определени гени (6). Самите цитокинови рецептори не притежават активност на тирозин киназата (с няколко изключения). След свързване с цитокин (1), рецепторните молекули се свързват, за да образуват хомодимери. В допълнение, те могат да образуват хетеродимери чрез свързване с протеини за пренос на сигнал [STPs] или да стимулират димеризацията на самите BPSs (2). Рецепторите на цитокин от клас I могат да се агрегират с три типа BPS: протеини GP130, βc или γc. Тези спомагателни протеини сами по себе си не са в състояние да свързват цитокини, но те осъществяват трансдукция на сигнал към тирозин кинази (3.) Същите спектри на биологична активност на много цитокини се обясняват с факта, че различни цитокин-рецепторни комплекси могат да активират един и същ BPS.

Като пример за трансдукция на сигнал от цитокини, диаграмата показва как IL-6 (IL-6) рецепторът, след свързване с лиганда (1), стимулира димеризацията на GP130 (2). Димерът на мембранния протеин GP130 се свързва и активира цитоплазмената тирозин киназа от семейство YK (кинази на Янус с две активни места) (3). Янус киназите фосфорилират цитокинови рецептори, BPS и различни цитоплазмени протеини, които осъществяват по -нататъшна трансдукция на сигнал; те също фосфорилират транскрипционни фактори - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция [PSAT (STAT, от английски сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция)]. Тези протеини принадлежат към семейството на BPS, които имат SH3 домейн в структурата си, който разпознава фосфотирозинови остатъци (виж стр. 372). Следователно те имат свойството да се свързват с фосфорилиран цитокинов рецептор. Ако след това настъпи фосфорилиране на PSAT молекулата (4), факторът се трансформира в активна форма и образува димер (5). След транслокация в ядрото, димерът, като транскрипционен фактор, се свързва с промотора (виж стр. 240) на инициирания ген и индуцира неговата транскрипция (6.) Някои цитокинови рецептори могат да загубят извънклетъчния лиганд-свързващ домен поради протеолиза (не е показано на диаграмата). Домейнът навлиза в кръвния поток, където се конкурира за свързване с цитокина, което намалява концентрацията на цитокина в кръвта.Заедно цитокините образуват регулаторна мрежа (цитокинова каскада) с многофункционално действие. Припокриването между цитокините води до факта, че се наблюдава синергизъм при действието на много от тях, а някои цитокини са антагонисти. Цялата цитокинова каскада със сложна обратна връзка често може да се наблюдава в тялото.

Свойства на цитокините.

Общи свойства на цитокините, поради които тези медиатори могат да бъдат комбинирани в независима регулаторна система.

1. Цитокините са полипептиди или протеини, често гликозилирани, повечето от тях имат MW от 5 до 50 kDa. Биологично активните молекули на цитокините могат да се състоят от една, две, три или повече еднакви или различни субединици.

2. Цитокините нямат антигенна специфичност на биологичното действие. Те влияят върху функционалната активност на клетките, участващи в реакциите на вродения и придобития имунитет. Независимо от това, като действат върху Т- и В-лимфоцитите, цитокините са в състояние да стимулират антиген-индуцирани процеси в имунната система.

3. Има три варианта на експресия на цитокинови гени: а) специфична за етапа експресия на определени етапи от ембрионалното развитие, б) конститутивна експресия за регулиране на редица нормални физиологични функции, в) индуцируем тип експресия, характерен за повечето цитокини. Всъщност повечето цитокини извън възпалителния отговор и имунния отговор не се синтезират от клетки. Експресията на цитокинови гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Свързаните с патогени молекулни структури са сред най-мощните индуктори на синтеза на провъзпалителни цитокини. За да се задейства синтеза на Т-клетъчни цитокини, е необходимо активиране на клетките от специфичен антиген с участието на Т-клетъчен антигенен рецептор.

4. Цитокините се синтезират в отговор на стимулация за кратък период от време. Синтезът се прекратява поради различни авторегулаторни механизми, включително повишена нестабилност на РНК, и поради наличието на отрицателни отзиви, медиирани от простагландини, кортикостероидни хормони и други фактори.

5. Един и същ цитокин може да се произвежда от различни видове клетки в тялото в различни органи от хистогенетичен произход.

6. Цитокините могат да бъдат свързани с мембраните на клетките, които ги синтезират, притежаващи под формата на мембрана пълния спектър на биологична активност и проявяващи тяхното биологично действие по време на междуклетъчния контакт.

7. Биологичните ефекти на цитокините се медиират чрез специфични клетъчни рецепторни комплекси, които свързват цитокини с много висок афинитет, а отделните цитокини могат да използват общи рецепторни субединици. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди.

8. Цитокините имат плейотропно биологично действие. Същият цитокин може да действа върху много видове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на целевите клетки (фиг. 1). Плейотропното действие на цитокините се осигурява чрез експресията на цитокинови рецептори върху клетъчни типове с различен произход и функции и проводимост на сигнала, използвайки няколко различни вътреклетъчни пратеника и транскрипционни фактори.

9. Цитокините се характеризират с взаимозаменяемост на биологичното действие. Няколко различни цитокини могат да причинят един и същ биологичен ефект или да имат сходни активности. Цитокините индуцират или потискат синтеза на себе си, други цитокини и техните рецептори.

10. В отговор на активиращия сигнал, клетките едновременно синтезират няколко цитокини, участващи в образуването на цитокиновата мрежа. Биологичните ефекти в тъканите и на нивото на тялото зависят от наличието и концентрацията на други цитокини със синергични, адитивни или противоположни ефекти.

11. Цитокините могат да повлияят на пролиферацията, диференциацията и функционалната активност на целевите клетки.

12. Цитокините действат върху клетките по различни начини: автокринни - върху клетката, синтезираща и секретираща този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката продуцент, например, във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринни - отдалечено до клетките на всякакви органи и тъкани след навлизане в кръвообращението. Във втория случай действието на цитокините прилича на това на хормоните (фиг. 2).

Ориз. 1. Същият цитокин може да се произвежда от различни типове клетки в тялото в различни органи от хистогенетичен произход и да действа върху много видове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на целевите клетки.

Ориз. 2. Три варианта на проявление на биологичното действие на цитокините.

Очевидно образуването на цитокиновата регулаторна система еволюционно е станало наред с развитието на многоклетъчните организми и се дължи на необходимостта от образуването на медиатори на междуклетъчното взаимодействие, което може да включва хормони, невропептиди, адхезионни молекули и някои други. В това отношение цитокините са най -универсалната регулаторна система, тъй като те са в състояние да проявяват биологична активност както отдалечено след секрецията от продуциращата клетка (локално и системно), така и по време на междуклетъчния контакт, като са биологично активни под формата на мембранна форма. По този начин цитокиновата система се различава от адхезионните молекули, които изпълняват по -тесни функции само когато клетките са в пряк контакт. В същото време цитокиновата система се различава от хормоните, които се синтезират главно от специализирани органи и действат след навлизане в кръвоносната система.

Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на организма.

Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на тялото може да бъде разделена на 4 основни компонента:

1. Регулиране на ембриогенезата, създаване и развитие на органи, вкл. органи на имунната система.

2. Регулиране на определени нормални физиологични функции.

3. Регулиране на защитните реакции на организма на местно и системно ниво.

4. Регулиране на процесите на регенерация на тъканите.

Експресията на гени на отделни цитокини се случва специфично на етапа на определени етапи от ембрионалното развитие. Факторът на стволови клетки, трансформиращи растежни фактори, цитокини от семейството на TNF и хемокини регулират диференциацията и миграцията на различни клетки и установяването на органите на имунната система. След това синтезът на някои цитокини може да не се възобнови, докато други продължават да регулират нормалните физиологични процеси или да участват в развитието на защитни реакции.

Въпреки факта, че повечето цитокини са типични индуцируеми медиатори и в постнаталния период не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор, някои цитокини не попадат под това правило. В резултат на конститутивна експресия на гени, някои от тях непрекъснато се синтезират и в достатъчно големи количества са в циркулация, регулирайки пролиферацията и диференциацията на определени типове клетки през целия живот. Примери за този тип физиологична регулация на функциите от цитокини могат да бъдат постоянно високо ниво на еритропоетин и някои CSF, за да се осигури хематопоеза. Регулирането на защитните реакции на организма чрез цитокини се случва не само в рамките на имунната система, но и чрез организиране на защитни реакции на нивото на целия организъм чрез регулиране на почти всички аспекти от развитието на възпалението и имунния отговор. Тази функция, която е най -важна за цялата цитокинова система, е свързана с две основни направления на биологичното действие на цитокините - защита срещу инфекциозни агенти и възстановяване на увредените тъкани. Цитокините регулират предимно развитието на локални защитни реакции в тъканите с участието на различни видове кръвни клетки, ендотел, съединителна тъкан и епител. Защитата на местно ниво се развива чрез образуване на типична възпалителна реакция с нейните класически прояви: хиперемия, развитие на оток, поява на болка и дисфункция. Синтезът на цитокини започва, когато патогените навлизат в тъканите или се нарушава тяхната цялост, което обикновено протича паралелно. Производството на цитокини е неразделна част от клетъчния отговор, свързан с разпознаването от клетките на миеломоноцитната серия на подобни структурни компоненти на различни патогени, наречени молекулярни модели, свързани с патогени. Примери за такива патогенни структури са липополизахариди на грам-отрицателни бактерии, пептидогликани на грам-положителни микроорганизми, флагелин или ДНК, богата на CpolyG последователности, което е типично за ДНК на всички видове бактерии. Левкоцитите експресират съответните рецептори за разпознаване на образи, наричани още Toll-подобни рецептори (TLR) и специфични за определени структурни модели на микроорганизми. След взаимодействието на микроорганизми или техните компоненти с TLR се задейства каскада на вътреклетъчна трансдукция на сигнал, водеща до повишаване на функционалната активност на левкоцитите и експресията на цитокинови гени.

TLR активирането води до синтеза на две основни групи цитокини: провъзпалителни цитокини и интерферони тип I, главно IFNα / β.развитието на възпалителна реакция и осигуряване на вентилаторно разширяване на активирането на различни видове клетки, участващи в поддържането и регулиране на възпалението, включително всички видове левкоцити, дендритни клетки, Т и В-лимфоцити, NK клетки, ендотелни и епителни клетки, фибробласти и др. Това осигурява последователни етапи в развитието на възпалителния отговор, който е основният механизъм за прилагане на вродения имунитет. Освен това започва синтезът на цитокини от семейство IL-12 от дендритни клетки, стимулиращи диференциацията на Т-хелперни лимфоцити, което служи като своеобразен мост към началото на развитието на специфични имунни реакции, свързани с разпознаването на специфични антигенни структури на микроорганизми.

Вторият не по -малко важен механизъм, свързан със синтеза на IFN, осигурява прилагането на антивирусна защита. Интерфероните тип I проявяват 4 основни биологични свойства:

1. Директно антивирусно действие чрез блокиране на транскрипцията.

2. Потискане на клетъчната пролиферация, необходимо за блокиране на разпространението на вируса.

3. Активиране на функциите на NK клетки, които имат способността да лизират инфектирани с вирус телесни клетки.

4. Повишена експресия на молекули на комплекс от хистосъвместимост от клас I, необходими за повишаване на ефективността на представяне на вирусни антигени от инфектирани клетки в цитотоксични Т-лимфоцити. Това води до активиране на специфично разпознаване на инфектирани с вирус клетки от Т-лимфоцити-първият етап на лизис на инфектирани с вирус целеви клетки.

В резултат на това в допълнение към директното антивирусно действие се активират механизмите както на вродения (NK клетки), така и на придобития (Т-лимфоцитите) имунитет. Това е пример за това как една малка цитокинова молекула с ММ 10 пъти по -малка от ММ на молекулите на антителата е способна да активира напълно различни механизми на защитни реакции поради плейотропния тип биологично действие, насочено към изпълнение на една цел - премахване на вируса, който има влезе в тялото.

На тъканно ниво цитокините са отговорни за развитието на възпаление и след това за регенерация на тъканите. С развитието на системна възпалителна реакция (остра фазова реакция) цитокините засягат почти всички органи и системи на тялото, участващи в регулирането на хомеостазата. Действието на провъзпалителни цитокини върху централната нервна система води до намаляване на апетита и промяна в целия комплекс от поведенчески реакции. Временно спиране на търсенето на храна и намаляване на сексуалната активност е от полза по отношение на спестяването на енергия за една задача - за борба с нахлуващия патоген. Този сигнал се осигурява от цитокини, тъй като навлизането им в циркулацията със сигурност означава, че локалната защита не се е справила с патогена и е необходимо активиране на системен възпалителен отговор. Една от първите прояви на системна възпалителна реакция, свързана с действието на цитокините върху терморегулаторния център на хипоталамуса, е повишаване на телесната температура. Повишаването на температурата е ефективна защитна реакция, тъй като при повишени температури способността на редица бактерии да се размножават намалява, а напротив, пролиферацията на лимфоцитите се увеличава.

В черния дроб под въздействието на цитокини се увеличава синтезът на протеини в остра фаза и компоненти на комплементната система, необходими за борба с патогена, но в същото време синтезът на албумин намалява. Друг пример за селективното действие на цитокините е промяната в йонния състав на кръвната плазма по време на развитието на системна възпалителна реакция. В този случай има намаляване на нивото на железни йони, но повишаване на нивото на цинкови йони и е добре известно, че лишаването на бактериална клетка от железни йони означава намаляване на нейния пролиферативен потенциал (действието на лактоферин се основава по този). От друга страна, повишаването на нивата на цинк е необходимо за нормалното функциониране на имунната система, по -специално е необходимо за образуването на биологично активен серумен тимусен фактор - един от основните тимусни хормони, които осигуряват диференциация на лимфоцитите. Ефектът на цитокините върху хематопоетичната система е свързан със значително активиране на хематопоезата. Увеличаването на броя на левкоцитите е необходимо, за да се попълни загубата и да се увеличи броят на клетките, главно неутрофилни гранулоцити, във фокуса на гнойното възпаление. Действието върху системата за коагулация на кръвта е насочено към повишаване на коагулацията, което е необходимо за спиране на кървенето и директно блокиране на патогена.

По този начин, с развитието на системно възпаление, цитокините проявяват огромен спектър от биологични активности и пречат на работата на почти всички системи на тялото. Въпреки това, нито една от настъпващите промени не е случайна: всички те са или необходими за директно активиране на защитните реакции, или са полезни по отношение на превключването на енергийните потоци само за една задача - за борба с нахлуващия патоген. Под формата на регулиране на експресията на отделни гени, хормонални промени и промени в поведенческите реакции, цитокините осигуряват активирането и максималната ефективност на работата на онези телесни системи, които са необходими в даден момент за развитието на защитни реакции. На нивото на целия организъм цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на една единствена защитна реакция. Цитокините са именно организиращата система, която формира и регулира целия комплекс от защитни реакции на организма по време на въвеждането на патогени. Очевидно такава система за регулиране се е формирала еволюционно и носи безусловни ползи за най -оптималната защитна реакция на макроорганизма. Следователно очевидно е невъзможно да се ограничи концепцията за защитни реакции само до участието на неспецифични механизми на резистентност и специфичен имунен отговор. Цялото тяло и всички системи, които на пръв поглед не са свързани с поддържането на имунитета, участват в една единствена защитна реакция.

Специални изследвания на цитокини.

Значението на цитокините в патогенезата на възпалителни заболявания на дебелото черво при деца.

S.V. Белмер, А.С. Симбирцев, О. В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлова. Руският държавен медицински университет, Държавният изследователски център по колопроктология, Москва и Държавният научноизследователски институт по високо чисти биологични вещества, Санкт Петербург, работят за изследване на значението на цитокините в патогенезата на възпалителните заболявания на дебелото черво при деца. Хроничните възпалителни заболявания на стомашно -чревния тракт в момента заемат едно от водещите места в патологията на храносмилателната система при децата. Особено значение се придава на възпалителните заболявания на дебелото черво (IBD), честотата на които постоянно нараства в целия свят. Дълъг курс с чести, а в някои случаи и фатални рецидиви, развитие на локални и системни усложнения - всичко това води до задълбочено проучване на патогенезата на заболяването в търсене на нови подходи към лечението на IBD. През последните десетилетия честотата на улцерозен колит (UC) е 510 случая годишно на 100 хиляди население, а болестта на Crohn (CD) 16 случая на година на 100 хиляди население. Степента на разпространение в Русия, в Московския регион съответства на средните европейски данни, но значително по -ниска, отколкото в скандинавските страни, Америка, Израел и Англия. За NUC разпространението е 19,3 на 100 хиляди, честотата е 1,2 на 100 хиляди души годишно. За CD разпространението е 3,0 на 100 хиляди, честотата е 0,2 на 100 хиляди души годишно. Фактът, че най -високата честота се отбелязва във високоразвитите страни, се дължи не само на социални и икономически фактори, но и на генетични и имунологични характеристики на пациентите, които определят предразположеността към IBD. Тези фактори са основни в имунопатогенетичната теория за произхода на IBD. Вирусните и / или бактериалните теории обясняват само острото начало на заболяването, а хронизирането на процеса се дължи както на генетично предразположение, така и на характеристиките на имунния отговор, които също са генетично обусловени. Трябва да се отбележи, че понастоящем IBTC е класифициран като заболяване с генетично хетерогенна комплексна предразположеност. Идентифицирани са повече от 15 предполагаеми кандидат -гени от 2 групи (имуноспецифични и имунорегулаторни), причиняващи наследствена предразположеност. Най -вероятно предразположението се определя от няколко гена, които определят естеството на имунологичните и възпалителните реакции. Въз основа на резултатите от многобройни изследвания може да се заключи, че най -вероятната локализация на гените, свързани с развитието на IBD, са хромозоми 3, 7, 12 и 16. В момента много внимание се обръща на изучаването на особеностите на функцията на Т и В лимфоцитите, както и на цитокините медиатори на възпалението. Активно се изследва ролята на интерлевкините (IL), интерфероните (IFN), туморната некроза фактор-a (TNF-a), макрофагите и автоантителата към протеините на лигавицата на дебелото черво и към автомикрофлората. Характеристиките на техните нарушения при CD и UC бяха разкрити, но все още не е ясно дали тези промени настъпват основно или вторично. За разбиране на много аспекти на патогенезата, изследванията, проведени в предклиничния стадий на IBTC, както и при роднини от първа степен на родство, биха били много важни. Сред медиаторите на възпалението специална роля принадлежат на цитокините, които са група полипептидни молекули с маса от 5 до 50 kDa, участващи във формирането и регулирането на защитните реакции на организма. На нивото на тялото цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за тяхното включване в организацията и регулирането на защитните реакции. Класификацията на цитокините е показана в Таблица 2. Повечето цитокини не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор. Експресията на цитокинови гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Един от най -мощните индуктори на синтеза на цитокини са компонентите на бактериалните клетъчни стени: LPS, пептидогликани и мурамилдипептиди. Продуцентите на провъзпалителни цитокини са предимно моноцити, макрофаги, Т-клетки и др. В зависимост от ефекта върху възпалителния процес цитокините се разделят на две групи: провъзпалителни (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g) и противовъзпалително (IL-4, IL-10, TGF-b). Интерлевкин-1 (IL-1) е имунорегулаторен медиатор, освободен по време на възпалителни реакции, увреждане на тъканите и инфекции (провъзпалителен цитокин). IL-1 играе важна роля в активирането на Т клетките, когато те взаимодействат с антиген. Има 2 вида IL - 1: IL - 1a и IL - 1b, продукти от два различни генни локуса, разположени върху човешка хромозома 2. IL-1a остава вътре в клетката или може да бъде в мембранна форма и се появява в малки количества в извънклетъчното пространство. Ролята на мембранната форма на IL-1a е предаването на активиращи сигнали от макрофага към Т-лимфоцитите и други клетки по време на междуклетъчния контакт. IL-1a е основният посредник на къси разстояния. IL-1b, за разлика от IL-1a, се секретира активно от клетките, действайки както системно, така и локално. Днес е известно, че IL-1 е един от основните медиатори на възпалителни реакции, стимулира пролиферацията на Т-клетките, увеличава експресията на IL-2 рецептора върху Т-клетките и тяхното производство на IL-2. IL-2 заедно с антигена индуцира активирането и адхезията на неутрофилите, стимулира образуването на други цитокини (IL-2, IL-3, IL-6 и др.) От активирани Т-клетки и фибробласти, стимулира пролиферацията на фибробласти и ендотелни клетки. Системно IL-1 действа синергично с TNF-a и IL-6. С увеличаване на концентрацията в кръвта, IL-1 засяга клетките на хипоталамуса и причинява повишаване на телесната температура, треска, сънливост, намален апетит, а също така стимулира чернодробните клетки да произвеждат протеини от остра фаза (CRP, амилоид А, а-2 макроглобулин и фибриноген). IL4 (хромозома 5). Той инхибира активирането на макрофагите и блокира много от ефектите, стимулирани от IFNg, като производството на IL1, азотен оксид и простагландини, играе важна роля в противовъзпалителните реакции, има имуносупресивен ефект. IL6 (хромозома 7), един от основните провъзпалителни цитокини, е основният индуктор на крайния етап на диференциация на В клетки и макрофаги, мощен стимулатор на производството на протеини от остра фаза от чернодробните клетки. Една от основните функции на IL6 е да стимулира производството на антитела in vivo и in vitro. IL8 (хромозома 4). Отнася се за медиатори на хемокини, които причиняват насочена миграция (хемотаксис) на левкоцити във възпалителния фокус. Основната функция на IL10 е инхибирането на производството на цитокини от тип I Thelpers (TNFb, IFNg) и активирани макрофаги (TNF-a, IL1, IL12). Сега е признато, че типовете имунен отговор са свързани с един от вариантите на активиране на лимфоцитите с преобладаващото участие на клонингите на Т -лимфоцитни помощници от първия тип (TH2) или от втория тип (TH3). Продуктите TH2 и TH3 влияят отрицателно върху активирането на противоположни клонинги. Прекомерното активиране на който и да е от типовете Th клонинги може да насочи имунния отговор според една от възможностите за развитие. Хроничният дисбаланс в активирането на Th клоновете води до развитие на имунопатологични състояния. Промените в цитокините при IBTD могат да бъдат изследвани по различни начини с определяне на тяхното ниво в кръвта или in situ. Нивата на IL1 са повишени при всички възпалителни заболявания на червата. Разликите между NNC и CD са в повишената експресия на IL2. Ако в NUC се установи понижено или нормално ниво на IL2, тогава в CD се открива повишеното му ниво. Съдържанието на IL4 се увеличава в NUC, докато при CD то остава нормално или дори намалява. Нивото на IL6, което е медиатор на остра фаза, също се повишава при всички форми на възпаление. Получените данни относно профила на цитокините направиха възможно да се предположи, че двете основни форми на хроничен IBD се характеризират с различно активиране и експресия на цитокини. Резултатите от проучванията показват, че цитокиновият профил, наблюдаван при пациенти с UC, е по -съгласуван с профила на TH3, докато профилът на TH2 трябва да се счита за по -характерен за пациенти с CD. Привлекателността на тази хипотеза за ролята на профилите на TH2 и TH3 е също така, че използването на цитокини може да промени имунния отговор в една или друга посока и да доведе до ремисия с възстановяване на цитокиновия баланс. Това може да бъде потвърдено по -специално чрез използването на IL10. По -нататъшни проучвания трябва да покажат дали цитокиновият отговор е вторичен феномен в отговор на стимулация или, напротив, експресията на съответните цитокини определя реактивността на организма с развитието на последващи клинични прояви. Проучването на нивото на цитокини при IBD при деца все още не е проведено. Тази работа е първата част от научно изследване, посветено на изследването на цитокиновия статус при IBD при деца. Целта на тази работа беше да се изследва хуморалната активност на макрофагите с определяне на нива (IL1a, IL8) в кръвта на деца с NUC и CD, както и тяхната динамика по време на терапията. От 2000 г. до 2002 г. 34 деца с NUC и 19 деца с CD на възраст от 4 до 16 години бяха прегледани в отделението по гастроентерология на Руската детска клинична болница. Диагнозата е потвърдена анамнестично, ендоскопски и морфологично. Изследването на нивата на провъзпалителни цитокини IL1a, IL8 се извършва по метода на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). За да определим концентрацията на IL1a, IL8, използвахме тестови системи, произведени от OOO Cytokin (Санкт Петербург, Русия). Анализът е извършен в лабораторията по имунофармакология на Държавния научен център на Научноизследователския институт за силно чисти биопрепарати (ръководител на лабораторията, д -р, проф. А. С. Симбирцев). Резултатите, получени в хода на изследването, показват значително повишаване на нивата на IL1a, IL8 по време на периода на обостряне, по -изразено при деца с NUC, отколкото при деца с CD. Без обостряне нивата на провъзпалителни цитокини намаляват, но не достигат нормата. При UC нивата на IL-1a, IL-8 са повишени в периода на обостряне съответно при 76,2% и при 90% от децата, а в периода на ремисия-съответно в 69,2% и 92,3%. При CD нивата на IL-1a, IL-8 се повишават в периода на обостряне при 73,3% и 86,6% от децата, а в периода на ремисия-съответно в 50% и 75%.

В зависимост от тежестта на заболяването децата са получавали терапия с аминосалицилати или глюкокортикоиди. Характерът на терапията влияе значително върху динамиката на нивото на цитокини. По време на терапията с аминосалицилати нивата на провъзпалителни цитокини в групата деца с NUC и CD са значително по -високи от тези в контролната група. В същото време се наблюдават по -високи проценти в групата деца с UC. В NUC на фона на аминосалицилатна терапия, IL1a, IL8 се увеличават съответно при 82.4% и 100% от децата, докато по време на глюкокортикоидната терапия при 60% от децата за двата цитокина. При CD, IL1a, IL8 се повишават по време на терапията с аминосалицилати при всички деца и по време на глюкокортикоидната терапия съответно при 55,5% и 77,7% от децата. По този начин резултатите от това изследване показват значително участие на макрофаговата връзка на имунната система в патогенетичния процес при повечето деца с UC и CD. Данните, получени в това проучване, не се различават коренно от данните, получени по време на прегледа на възрастни пациенти. Разликите в нивата на IL1a и IL8 при пациенти с UC и CD са количествени, но не качествени, което предполага неспецифичен характер на тези промени поради хода на хроничен възпалителен процес. Следователно тези показатели нямат диагностична стойност. Резултатите от динамично изследване на нивата на IL1a и IL8 доказват по -високата ефективност на терапията с глюкокортикоидни лекарства в сравнение с терапията с аминосалицили. Представените данни са резултат от първия етап от изследването на цитокиновия статус на деца с IBT. Необходимо е по-нататъшно проучване на проблема, като се вземат предвид показателите на други провъзпалителни и противовъзпалителни цитокини.

Ролята на азотен оксид и цитокини в развитието на синдром на остро белодробно увреждане.

Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л. Г. Сухотеплая изучават този проблем: Катедра по анестезиология и реаниматология, Владивостокски държавен медицински университет. Синдром на остра белодробна травма (синдром на респираторен дистрес при възрастни, ARDS) е една от най -тежките форми на остра дихателна недостатъчност, която се проявява при пациенти с тежка травма, сепсис, перитонит, панкреатит, обилна загуба на кръв, аспирация, след обширни хирургични интервенции и при 50 60% от случаите са фатални. Данните от изследванията за патогенезата на ARDS, разработването на критерии за ранна диагностика и прогноза на синдрома са малко, доста противоречиви, което не позволява разработването на съгласувана диагностична и терапевтична концепция. Установено е, че ARDS се основава на увреждане на ендотела на белодробните капиляри и алвеоларен епител, нарушение на реологичните свойства на кръвта, което води до оток на интерстициалната и алвеоларна тъкан, възпаление, ателектаза, белодробна хипертония. В литературата от последните години има достатъчно информация за универсалния регулатор на клетъчния и тъканния метаболизъм - азотен оксид. Интересът към азотния оксид (NO) се дължи преди всичко на факта, че той участва в регулирането на много функции, включително съдов тонус, сърдечна контрактилност, агрегация на тромбоцитите, невротрансмисия, синтез на АТФ и протеини и имунна защита. В допълнение, в зависимост от избора на молекулната мишена и характеристиките на взаимодействие с нея, NO също има увреждащ ефект. Смята се, че задействащият механизъм на клетъчно активиране е небалансирана цитокинемия. Цитокините са разтворими пептиди, които действат като медиатори на имунната система и осигуряват клетъчно сътрудничество, положителна и отрицателна имунорегулация. Опитахме се да систематизираме наличната в литературата информация за ролята на NO и цитокините в развитието на синдрома на остро белодробно увреждане. NO е водоразтворим газ. Неговата молекула е нестабилен свободен радикал, лесно се дифундира в тъканта, абсорбира се и се унищожава толкова бързо, че може да засегне само клетките на непосредствената среда. Молекулата NO има всички свойства, присъщи на класическите пратеници: бързо се произвежда, действа в много ниски концентрации, след прекратяване на външния сигнал бързо се превръща в други съединения, окислявайки се до стабилни неорганични азотни оксиди: нитрити и нитрати. Продължителността на живота на NO в тъканите е, според различни източници, от 5 до 30 секунди. Основните молекулни мишени на NO са желязосъдържащи ензими и протеини: разтворима гуанилат циклаза, самата нитрооксид синтаза (NOS), хемоглобин, митохондриални ензими, ензими от цикъла на Кребс, синтез на протеини и синтез на ДНК. Синтезът на NO в организма се осъществява чрез ензимни трансформации на съдържащата азота част от аминокиселината L-аргинин под въздействието на специфичен ензим NOS и се медиира от взаимодействието на калциеви йони с калмодулин. Ензимът се инактивира при ниски концентрации и е максимално активен при 1 μM свободен калций. Идентифицирани са две изоформи на NOS: конститутивна (cNOS) и индуцирана (iNOS), които са продукти на различни гени. Калций-калмодулин-зависимият cNOS постоянно присъства в клетката и насърчава освобождаването на малки количества NO в отговор на рецептор и физическа стимулация. NO, генериран под въздействието на тази изоформа, действа като носител в редица физиологични реакции. Независимият от калций-калмодулин iNOS се образува в различни типове клетки в отговор на провъзпалителни цитокини, ендотоксини и окислители. Тази NOS изоформа се транскрибира от специфични гени на хромозома 17 и насърчава синтеза на големи количества NO. Ензимът също е класифициран в три типа: NOS-I (невронален), NOS-II (макрофаг), NOS-III (ендотелен). Семейството ензими, които синтезират NO, се намира в различни белодробни клетки: в епителни клетки на бронхите, в алвеолоцити, в алвеоларни макрофаги, в мастоцити, в ендотелни клетки на бронхиални артерии и вени, в гладки миоцити на бронхите и кръвоносните съдове, в неадренергични нехолинергични неврони. Конститутивната способност на епителните клетки на бронхите и алвеолите на хора и бозайници да секретират NO е потвърдена в множество проучвания. Установено е, че горните части на дихателните пътища на човека, както и долните части участват в образуването на NO. Проучванията, проведени при пациенти с трахеостомия, показват, че количеството газ във въздуха, издишан чрез трахеостомията, е значително по -малко, отколкото в носната и устната кухина. Синтезът на ендогенен NO при пациенти на изкуствена белодробна вентилация страда значително. Изследванията потвърждават, че освобождаването на NO се случва по време на бронходилатация и се контролира от системата на блуждаещия нерв. Получени са данни, че образуването на NO в епитела на дихателните пътища на човека се увеличава при възпалителни заболявания на дихателната система. Синтезът на газ се увеличава поради активирането на индуциран NOS под въздействието на цитокини, както и ендотоксини и липополизахариди.

В момента са известни повече от сто цитокини, които традиционно са разделени на няколко групи.

1. Интерлевкини (IL -1 - IL18) - секреторни регулаторни протеини, които осигуряват медиаторни взаимодействия в имунната система и нейната връзка с други системи на тялото.

2. Интерферони (IFN -алфа, бета, гама) - антивирусни цитокини с подчертан имунорегулиращ ефект.

3. Факторите на туморна некроза (TNF алфа, бета) са цитокини с цитотоксични и регулаторни ефекти.

4. Колони-стимулиращи фактори (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-стимулатори на растежа и диференциацията на хематопоетичните клетки, регулиращи хематопоезата.

5. Хемокини (IL-8, IL-16)-хемоатрактанти за левкоцити.

6. Фактори на растежа - регулатори на растежа, диференциация и функционална активност на клетки от различни тъкани, принадлежащи (растежен фактор на фибробласти, растежен фактор на ендотелни клетки, епидермален растежен фактор) и трансформиращи растежни фактори (TGF бета).

Тези биорегулаторни молекули определят вида и продължителността на възпалителния и имунен отговор, контролират клетъчната пролиферация, хематопоезата, ангиогенезата, зарастването на рани и много други процеси. Всички изследователи подчертават, че цитокините нямат специфичност за антигените. Експерименти с култивирани белодробни макрофаги и мастоцити показват образуването на iNOS в отговор на интерферон гама, интерлевкин-1, тумор некрозис фактор и липополизахариди. Експресия на iNOS и cNOS за провъзпалителни цитокини е открита в животински и човешки алвеолоцити. Добавянето на епидермален растежен фактор, регулатор на функцията на епителните клетки към културата, намалява активността само на индуцирания ензим. Известно е, че в зависимост от природата цитокините действат автокринно - върху самите продуциращи клетки, паракринните - върху други целеви клетки или ендокринни - върху различни клетки извън мястото на тяхното производство. В същото време те могат да взаимодействат помежду си според агонистичен или антагонистичен принцип, променяйки функционалното състояние на целевите клетки и образувайки цитокинова мрежа. По този начин цитокините не са изолирани пептиди, а интегрална система, чиито основни компоненти са продуцентските клетки, самият протеин е цитокин, неговият рецептор и клетка -мишена. Установено е, че с развитието на остро белодробно увреждане нивото на провъзпалителни цитокини се увеличава: IL-1, 6, 8, 12, TNF алфа, IFN алфа. Техният ефект е свързан с вазодилатация, увеличаване на тяхната пропускливост и натрупване на течност в белодробната тъкан. В допълнение, проучванията показват способността на IFN гама и TNF алфа да индуцират експресията на адхезионни молекули - ICAM -1 върху човешки ендотелни клетки. Адхезионните молекули, прилепнали към левкоцити, тромбоцити и ендотелни клетки, образуват „търкалящи се“ неутрофили и насърчават агрегацията на фибринови частици. Тези процеси допринасят за нарушаването на капилярния кръвен поток, увеличават пропускливостта на капилярите и предизвикват локален оток на тъканите. Забавянето на капилярния кръвен поток се насърчава от активирането на NO, което причинява разширяване на артериолите. По -нататъшната миграция на левкоцити към възпалителния фокус се контролира от специални цитокини - хемокини, които се произвеждат и секретират не само от активирани макрофаги, но и от ендотелни клетки, фибробласти, гладки миоцити. Основната им функция е да доставят неутрофили към възпалителния фокус и да активират тяхната функционална активност. Основният хемокин за неутрофили е Il-8. Най-мощните му индуктори са бактериални липополизахариди, IL-1 и TNFalpha. R. Bahra et al. вярват, че всяка стъпка от трансендотелиалната миграция на неутрофили се регулира чрез стимулиране на концентрациите на TNF алфа. С развитието на остро белодробно увреждане се активират съдови ендотелиоцити, епителни клетки на бронхите и алвеоларни макрофаги, които участват във фазови взаимодействия. В резултат на това, от една страна, настъпва тяхната мобилизация и повишаване на защитните свойства, а от друга страна е възможно увреждане на самите клетки и околните тъкани. Редица проучвания показват, че продуктът на частично намаляване на кислорода, супероксид, може да се натрупа във възпалителния фокус, което инактивира вазоактивния ефект на NO. NO и супероксидният анион реагират бързо, образувайки увреждащ клетките пероксинитрит. Тази реакция насърчава отстраняването на NO от съдовите и бронхиалните стени, както и от повърхността на алвеолоцитите. Изследвания, показващи, че традиционно считан за медиатор на NO токсичност, пероксинитритът може да има физиологичен ефект и да предизвика съдова релаксация чрез NO-медиирано повишаване на cGMP в съдовия ендотел, представлява интерес. На свой ред, пероксинитритът е мощен окислител, способен да увреди алвеоларния епител и белодробното повърхностно активно вещество. Той причинява разрушаване на мембранните протеини и липиди, уврежда ендотела, увеличава агрегацията на тромбоцитите и участва в ендотоксимията. Повишеното му образуване е отбелязано при синдром на остро белодробно увреждане. Изследователите смятат, че NO, произведен в резултат на активирането на индуцирания ензим, е предназначен за неспецифична защита на организма срещу широк спектър от патогенни агенти, инхибира агрегацията на тромбоцитите и подобрява локалното кръвообращение. Установено е, че прекомерното количество NO потиска активността на cNOS в клетките поради взаимодействие със супероксид и евентуално в резултат на десенсибилизация на гуанилат циклаза, което води до намаляване на cGMP в клетката и до увеличаване на вътреклетъчния калций . Brett et al. и Kooy et al., анализирайки значението на нитрооксидергичните механизми в патогенезата на ARDS, предполагат, че iNOS, пероксинитритът и нитротирозинът, основният продукт на ефекта на пероксинитрита върху протеините, могат да играят ключова роля в развитието на синдрома. Cuthbertson et al. смятат, че в основата на острото белодробно увреждане е ефектът на NO и пероксинитрит върху еластаза и интерлевкин-8. Kobayashi et al. също регистрира увеличение на съдържанието на iNOS, интерлевкин-1, интерлевкин-6, интерлевкин-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти със синдром на остро белодробно увреждане. Meldrum et al. показват намаляване на производството на възпалителни цитокини от белодробни макрофаги при ARDS под влияние на субстрата на локално производство на NO - L -аргинин. Установено е, че в генезиса на синдрома на остро белодробно увреждане значителна роля играе нарушението на съдовата пропускливост, причинено от действието на цитокини-TNF алфа, IL-2, GM-CSF, моноклонални антитела към CD3 лимфоцити върху съдови ендотелни клетки на белите дробове и имуноцитите. Бързото и силно увеличаване на пропускливостта на белодробните съдове води до миграция на неутрофили в белодробната тъкан и освобождаване от тях на цитотоксични медиатори, което води до развитието на патологична белодробна промяна. По време на развитието на остро белодробно увреждане, TNF алфа увеличава адхезията на неутрофилите към съдовата стена, засилва тяхната миграция в тъканите, насърчава структурните и метаболитни промени в ендотелиоцитите, нарушава пропускливостта на клетъчните мембрани, активира образуването на други цитокини и ейкозаноиди, и причинява апоптоза и некроза на белодробните епителни клетки. Получените данни показват, че апоптозата на макрофагите, индуцирана от въвеждането на LPS, до голяма степен е свързана с IFN гама и се намалява от действието на IL-4, IL-10, TGF бета. Въпреки това, Kobayashi et al. получени данни, показващи, че IFN гама може да участва в възстановяването на епитела на лигавицата на дихателните пътища. Изследванията на Хагимото съдържат информация, че епителните клетки на бронхите и алвеолите в отговор на TNF алфа или Fas лиганд освобождават IL-8, IL-12. Този процес е свързан с активирането на ядрения фактор Carr-B от лиганда Fas.

Смята се, че IL-8 е един от най-важните цитокини в патофизиологията на острото белодробно увреждане. Miller et al. при изследването на бронхо-алвеоларната течност при пациенти с ARDS на фона на сеза е установено значително повишаване на нивото на IL-8 в сравнение с пациенти с кардиогенен белодробен оток. Предполага се, че основният източник на Il-8 са белите дробове и този критерий може да се използва при диференциалната диагноза на синдрома. Grau et al. смятат, че ендотелните клетки на белодробните капиляри са важен източник на цитокини-IL-6, IL-8 при развитието на остро белодробно увреждане. Goodman et al. При изследване на динамиката на нивото на цитокини в течността на бронхо-алвеоларен лаваж при пациенти с ARDS, значително увеличение на IL-1 бета, IL-8, моноцитен хемотактичен пептид-1, епителен клетъчен неутрофилен активатор, макрофагов възпалителен пептид -1 алфа е намерен. В същото време авторите смятат, че увеличаването на съдържанието на IL-1 бета може да служи като маркер за неблагоприятен изход от синдрома. Bauer et al. беше показано, че контролът върху съдържанието на IL-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти с ARDS може да се използва за наблюдение, намаляването на нивото на IL-8 показва неблагоприятен ход на процеса. Редица проучвания съдържат също информация, че нивото на производство на цитокини от съдовия ендотел на белите дробове влияе върху развитието на остро белодробно увреждане и чийто контрол може да се използва в клиничната практика за ранна диагностика. Възможните отрицателни последици от повишаване на нивото на провъзпалителни цитокини при пациенти с ARDS се доказват от проучванията на Martin et al., Warner et al. Алвеоларните макрофаги, активирани от цитокини и бактериални ендотоксини, повишават синтеза на NO. Нивото на производство на NO от бронхиални и алвеоларни епителни клетки, неутрофили, мастоцити, ендотелни клетки и гладки миоцити на белодробните съдове също се увеличава, вероятно чрез активиране на ядрения фактор Carr-B. Авторите смятат, че азотният оксид, получен в резултат на активирането на индуцирания NOS, е предназначен предимно за неспецифична защита на тялото. Освободен от макрофагите, NO бързо прониква в бактериите и гъбите, където инхибира три жизненоважни групи ензими: Н-електронен транспорт, цикъл на Кребс и синтез на ДНК. NO участва в защитата на организма в последните етапи на имунния отговор и образно се разглежда като „наказателен меч“ на имунната система. Въпреки това, натрупвайки се в клетката в недостатъчно големи количества, NO също има увреждащ ефект. По този начин, с развитието на синдрома на остро белодробно увреждане, цитокините и NO предизвикват последователна верига от реакции, изразени в нарушена микроциркулация, тъканна хипоксия, алвеоларен и интерстициален оток и увреждане на метаболитната функция на белите дробове. Следователно може да се констатира, че изследването на физиологичните и патофизиологичните механизми на действието на цитокините и NO е обещаваща област за изследване и ще позволи в бъдеще не само да разшири разбирането за патогенезата на ARDS, но и да определи диагностични и прогностични маркери на синдрома, за разработване на възможности за патогенетично базирана терапия, насочена към намаляване на смъртността.

Методи за определяне на цитокини.

Прегледът е посветен на основните методи за изследване на цитокините, използвани в момента. Накратко са описани възможностите и предназначението на методите. Представени са предимствата и недостатъците на различните подходи за анализ на експресията на цитокинови гени на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини. (Цитокини и възпаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Цитокините са регулаторни протеини, които образуват универсална мрежа от медиатори, характерни както за имунната система, така и за клетките на други органи и тъкани. Всички клетъчни събития се провеждат под контрола на този клас регулаторни протеини: пролиферация, диференциация, апоптоза и специализирана функционална активност на клетките. Ефектите на всеки цитокин върху клетките са плейотропни, спектърът от ефекти на различни медиатори се припокрива и като цяло крайното функционално състояние на клетката зависи от влиянието на няколко цитокина, действащи синергично. По този начин цитокиновата система е универсална, полиморфна регулаторна мрежа от медиатори, предназначена да контролира процесите на пролиферация, диференциация, апоптоза и функционална активност на клетъчните елементи в хематопоетичната, имунната и други хомеостатични системи на тялото. Методите за определяне на цитокините са претърпели много бърза еволюция за 20 години от тяхното интензивно изследване и днес представляват цяла област на научните познания. Изследователите в цитокинологията в началото на своята работа са изправени пред въпроса за избор на метод. И тук изследователят трябва да знае точно каква информация трябва да получи, за да постигне поставената цел. В момента са разработени стотици различни методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация за тази система. Оценката на цитокините в различни биологични среди може да се основава на специфична биологична активност. Те могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи на имуноанализ, използващи поли- и моноклонални антитела. В допълнение към изучаването на секреторните форми на цитокините, е възможно да се изследва тяхното вътреклетъчно съдържание и производство в тъканите чрез поточна цитометрия, Western blotting и in situ имунохистохимия. Много важна информация може да бъде получена чрез изучаване на експресията на цитокинова иРНК, стабилност на тРНК, наличието на изоформи на цитокинова иРНК, естествени антисмислени нуклеотидни последователности. Изследването на алелни варианти на цитокинови гени може да предостави важна информация за генетично програмирана висока или ниска продукция на един или друг медиатор. Всеки метод има своите недостатъци и предимства, своя собствена разделителна способност и точност на определяне. Незнанието и неразбирането на изследователя от тези нюанси могат да го доведат до фалшиви заключения.

Определяне на биологичната активност на цитокините.

Историята на откритието и първите стъпки в изучаването на цитокини е тясно свързана с култивирането на имунокомпетентни клетки и клетъчни линии. След това бяха показани регулаторните ефекти (биологична активност) на редица разтворими фактори с протеинова природа върху пролиферативната активност на лимфоцитите, върху синтеза на имуноглобулини, върху развитието на имунни отговори в in vitro модели. Един от първите методи за определяне на биологичната активност на медиаторите е определянето на фактора на миграция на човешки лимфоцити и фактора на неговото инхибиране. Тъй като биологичните ефекти на цитокините са изследвани, се появяват различни методи за оценка на тяхната биологична активност. Така IL-1 се определя чрез оценка на пролиферацията на миши тимоцити in vitro, IL-2-чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3-чрез растежа на хемопоетични колонии in vitro, IL-4-чрез комитогенният ефект, чрез повишена експресия на Ia-протеини, чрез индуциране на образуването на IgG1 и IgE и др. Списъкът с тези методи може да бъде продължен, той постоянно се актуализира с откриването на нови биологични активности на разтворимите фактори. Основният им недостатък са нестандартните методи, невъзможността за тяхното унифициране. По-нататъшното развитие на методи за определяне на биологичната активност на цитокините доведе до създаването на голям брой клетъчни линии, чувствителни към един или друг цитокин, или мулти-чувствителни линии. Повечето от тези цитокин-реагиращи клетки вече могат да бъдат намерени в списъци с търговски клетъчни линии. Например, за тестване на IL-1a и b, се използва клетъчната линия D10S, за IL-2 и IL-15-клетъчната линия CTLL-2, за IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL -13, GM -CSF - клетъчна линия TF -1, за IL -6 - клетъчна линия B9, за IL -7 - клетъчна линия 2E8, за TNFa и TNFb - клетъчна линия L929, за IFNg - клетъчна линия WiDr, за IL-18-клетъчна линия линия KG-1. Този подход към изследването на имуноактивни протеини, заедно с добре известни предимства като измерване на реалната биологична активност на зрели и активни протеини, висока възпроизводимост при стандартизирани условия, има своите недостатъци. Те включват преди всичко чувствителността на клетъчните линии не към един цитокин, а към няколко сродни цитокини, чиито биологични ефекти се припокриват. В допълнение, не може да се изключи възможността за индуциране на производството на други цитокини от клетки -мишени, които могат да изкривят тествания параметър (като правило, пролиферация, цитотоксичност, хемотаксис). Все още не познаваме всички цитокини и не всичките им ефекти, затова оценяваме не самия цитокин, а общата специфична биологична активност. По този начин оценката на биологичната активност като обща активност на различните медиатори (липса на специфичност) е един от недостатъците на този метод. В допълнение, използвайки чувствителни към цитокин линии, е невъзможно да се идентифицират инактивирани молекули и свързани протеини. Това означава, че такива методи не отразяват действителното производство на редица цитокини. Друг важен недостатък на използването на клетъчни линии е необходимостта от лаборатория за клетъчна култура. В допълнение, всички процедури за отглеждане на клетки, инкубирането им с изследваните протеини и среда отнемат много време. Трябва също така да се отбележи, че дългосрочната употреба на клетъчни линии изисква подновяване или повторно сертифициране, тъй като в резултат на култивирането те могат да мутират и модифицират, което може да доведе до промяна в тяхната чувствителност към медиатори и намаляване на точността на определяне на биологичната активност. Този метод обаче е идеален за тестване на специфичната биологична активност на рекомбинантни медиатори.

Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела.

Цитокините, произведени от имунокомпетентни и други видове клетки, се освобождават в извънклетъчното пространство за паракринни и автокринни сигнални взаимодействия. По концентрацията на тези протеини в кръвния серум или в кондиционирана среда може да се прецени естеството на патологичния процес и излишъкът или липсата на определени клетъчни функции при пациента. Методите за определяне на цитокини с помощта на специфични антитела днес са най -често срещаните системи за откриване на тези протеини. Тези методи са преминали през цяла поредица от модификации, използвайки различни етикети (радиоизотопни, флуоресцентни, електрохимилуминесцентни, ензимни и др.). Ако радиоизотопните методи имат редица недостатъци, свързани с използването на радиоактивен етикет и ограничената по време възможност за използване на белязани реагенти (период на полуразпад), тогава ензимно-свързаните имуносорбентни методи са намерили най-широко приложение. Те се основават на визуализация на неразтворими продукти от ензимна реакция, поглъщащи светлина с известна дължина на вълната, в количества, еквивалентни на концентрацията на аналита. Антитела, нанесени върху твърда полимерна основа, се използват за свързване на измерваните вещества, а антителата, конюгирани с ензими, обикновено алкална фосфатаза или пероксидаза от хрян, се използват за изобразяване. Предимствата на метода са очевидни: висока точност на определяне при стандартизирани условия на съхранение на реактиви и процедури, количествен анализ и възпроизводимост. Недостатъците включват ограничен диапазон от определени концентрации, в резултат на което всички концентрации, надвишаващи определен праг, се считат за равни на него. Трябва да се отбележи, че времето, необходимо за завършване на метода, варира в зависимост от препоръките на производителя. Във всеки случай обаче говорим за няколко часа, необходими за инкубации и промиване с реагенти. Освен това се определят латентни и свързани форми на цитокини, които по своята концентрация могат значително да надвишават свободните форми, отговорни главно за биологичната активност на медиатора. Ето защо е желателно този метод да се използва заедно с методи за оценка на биологичната активност на медиатора. Друга модификация на метода на имуноанализа, която намери широко приложение, е електрохимилуминесцентният метод (ECL) за определяне на протеини с антитела, белязани с рутений и биотин. Този метод има следните предимства пред радиоизотопните и ензимните имуноанализи: лекота на изпълнение, кратко време за изпълнение на метода, без процедури за промиване, малък обем на пробата, широк диапазон от определени концентрации на цитокини в серума и в кондиционирана среда, висока чувствителност на метод и неговата възпроизводимост. Разглежданият метод е приемлив за използване както в научни изследвания, така и в клинични проучвания. Следващият метод за оценка на цитокините в биологични среди е разработен въз основа на технологията на поточна флуориметрия. Тя ви позволява едновременно да оцените до стотици протеини в проба. Понастоящем са създадени търговски комплекти за определяне на до 17 цитокини. Въпреки това, предимствата на този метод определят и неговите недостатъци. Първо, това е трудоемкостта при избора на оптимални условия за определяне на няколко протеина, и второ, производството на цитокини е каскадно с пикове на производство по различно време. Следователно определянето на голям брой протеини наведнъж не винаги е информативно. Общото изискване за методите на имуноанализ, използващи т.нар. "сандвич", е внимателен подбор на двойка антитела, позволяващ да се определи или свободната, или свързаната форма на анализирания протеин, което налага ограничения на този метод и което винаги трябва да се взема предвид при интерпретирането на получените данни. Тези методи определят общото производство на цитокини от различни клетки, като в същото време е възможно да се прецени за антиген-специфичното производство на цитокини от имунокомпетентни клетки само хипотетично. Сега е разработена системата ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), която до голяма степен премахва тези недостатъци. Методът дава възможност за полуколичествено оценяване на производството на цитокини на ниво отделни клетки. Високата разделителна способност на този метод позволява да се оцени стимулираното от антиген производство на цитокини, което е много важно за оценка на специфичен имунен отговор. Следващият, широко използван за научни цели метод е вътреклетъчното определяне на цитокини чрез поточна цитометрия. Предимствата му са очевидни. Можем фенотипно да характеризираме популацията на цитокин-продуциращи клетки и / или да определим спектъра на цитокини, произведени от отделни клетки, с възможност за относително количествено характеризиране на това производство. В същото време описаният метод е доста сложен и изисква скъпо оборудване. Следващата серия от методи, които се използват главно за научни цели, са имунохистохимични методи, използващи белязани моноклонални антитела. Предимствата са очевидни - определяне на производството на цитокини директно в тъканите (in situ), където протичат различни имунологични реакции. Разглежданите методи обаче са много трудоемки и не дават точни количествени данни.

Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

CJSC Vector-Best под ръководството на T.G. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М. Ю. Rukavishnikov активно работят за определяне на цитокини. Цитокините са група полипептидни медиатори, често гликозилирани, с молекулно тегло от 8 до 80 kDa. Цитокините участват във формирането и регулирането на защитните реакции на организма и хомеостазата. Те участват във всички връзки на хуморалния и клетъчния имунен отговор, включително диференциация на имунокомпетентни прогениторни клетки, представяне на антигена, клетъчно активиране и пролиферация, експресия на адхезионни молекули и остра фазова реакция. Някои от тях са способни да проявяват много биологични ефекти по отношение на различни целеви клетки. Действието на цитокините върху клетките се осъществява по следните начини: автокринно - върху клетка, синтезираща и секретираща този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката продуцент, например, във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринно -дистанционно - върху клетките на всякакви органи и тъкани, след като цитокинът влезе в кръвообращението. Образуването и освобождаването на цитокини обикновено е краткотрайно и строго регулирано. Цитокините действат върху клетката, като се свързват със специфични рецептори на цитоплазмената мембрана, като по този начин предизвикват каскада от реакции, водещи до индуциране, усилване или потискане на активността на редица гени, регулирани от тях. Цитокините се характеризират със сложен мрежов характер на функциониране, при който производството на един от тях влияе върху формирането или проявлението на активността на редица други. Цитокините са местни медиатори, поради което е препоръчително да се измерват техните нива в съответните тъкани след извличане на тъканни протеини от биопсии на съответните органи или в естествени течности: урина, слъзна течност, течност от венеца в джоба, бронхоалвеоларен лаваж, вагинален секрет, еякулат , измивания от кухините, гръбначния мозък или синовиалните течности и др. Допълнителна информация за състоянието на имунната система на организма може да бъде получена чрез изследване на способността на кръвните клетки да произвеждат цитокини in vitro. Нивата на плазмените цитокини отразяват настоящото състояние на имунната система и развитието на защитни реакции in vivo. Спонтанното производство на цитокини от културата на мононуклеарни клетки от периферна кръв прави възможно да се оцени състоянието на съответните клетки. Повишеното спонтанно производство на цитокини показва, че клетките вече са активирани от антигена in vivo. Индуцираното производство на цитокини дава възможност да се оцени потенциалната способност на съответните клетки да реагират на антигенна стимулация. Намалената индукция на цитокини in vitro например може да служи като един от признаците на състояние на имунодефицит. Следователно и двата варианта за изследване на нивата на цитокини както в циркулиращата кръв, така и по време на тяхното производство от клетъчни култури са важни от гледна точка на характеристиките на имунореактивността на целия организъм и функцията на отделните връзки на имунната система. Доскоро в Русия няколко групи изследователи се занимаваха с изучаване на цитокини, тъй като биологичните методи за изследване отнемат много време, а внесените имунохимични комплекти са много скъпи. С появата на наличните вътрешни комплекти имуносорбенти, свързани с ензими, практикуващите лекари проявяват все по-голям интерес към изучаването на профила на цитокините. В момента диагностичното значение на оценката на нивото на цитокините е да се посочи самият факт на повишаване или намаляване на тяхната концентрация при даден пациент със специфично заболяване. Освен това, за да се оцени тежестта и да се предскаже хода на заболяването, е препоръчително да се определи концентрацията както на противо-, така и на възпалителни цитокини в динамиката на развитието на патологията. Например, съдържанието на цитокини в периферната кръв се определя от времето на обостряне, отразява динамиката на патологичния процес при пептична язва и други заболявания на стомашно -чревния тракт. В най-ранните етапи на обостряне преобладава увеличаването на съдържанието на интерлевкин-1 бета (IL-1 бета), интерлевкин-8 (IL-8), след това концентрацията на интерлевкин-6 (IL-6), гама-интерферон (гама -INF), факторът на туморна некроза се увеличава -алфа (алфа -TNF). Концентрацията на интерлевкин-12 (IL-12), гама-INF, алфа-TNF достига своя максимум в разгара на заболяването, докато съдържанието на маркери на острата фаза през този период се доближава до нормалните стойности. В пика на обострянето нивото на алфа-TNF значително надвишава съдържанието на интерлевкин-4 (IL-4) както в кръвния серум, така и директно в засегнатата тъкан на пери-язвената зона, след което започва постепенно намаление. Тъй като явленията на острата фаза отшумяват и процесите на възстановяване се засилват, концентрацията на IL-4 се увеличава. По промяната в цитокиновия профил може да се прецени ефективността и осъществимостта на химиотерапията. При провеждане на цитокинова терапия, например, по време на терапия с алфа-интерферон (алфа-IFN), е необходимо да се контролира както нивото на съдържанието му в циркулиращата кръв, така и производството на антитела към алфа-IFN. Известно е, че когато се произвежда голям брой от тези антитела, терапията с интерферон не само престава да бъде ефективна, но може да доведе и до автоимунни заболявания. Напоследък бяха разработени и въведени на практика нови лекарства, които по един или друг начин променят цитокиновия статус на организма. Например, за лечение на ревматоиден артрит се предлага лекарство на базата на антитела към алфа-TNF, предназначено да премахне алфа-TNF, което участва в разрушаването на съединителната тъкан. Въпреки това, както според нашите данни, така и от литературата, не всички пациенти с хроничен ревматоиден артрит имат повишено ниво на TNF-алфа, поради което за тази група пациенти намаляването на нивото на TNF-алфа може допълнително да влоши дисбаланса на имунната система. По този начин правилната цитокинова терапия предполага контрол на цитокиновия статус на организма по време на лечението. Защитната роля на провъзпалителните цитокини се проявява локално, във фокуса на възпалението, но системното им производство не води до развитие на противоинфекциозен имунитет и не предотвратява развитието на бактериално-токсичен шок, който е причина за ранна смъртност при хирургични пациенти с гнойно-септични усложнения. Основата на патогенезата на хирургичните инфекции е инициирането на цитокиновата каскада, която включва, от една страна, провъзпалителни, а от друга-противовъзпалителни цитокини. Балансът между тези две противоположни групи до голяма степен определя естеството на протичането и резултата от гнойно-септични заболявания. Определянето на концентрацията в кръвта за един цитокин от тези групи (например TNF алфа или IL-4) няма да отразява адекватно състоянието на целия цитокинов баланс. Следователно е необходима едноетапна оценка на нивото на няколко медиатори (поне 2-3 от противоположните подгрупи). В момента CJSC "Vector-Best" е разработил и серийно произвежда комплекти реагенти за количествено определяне на: фактор на туморна некроза-алфа (чувствителност-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); гама интерферон (чувствителност - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); интерлевкин -4 (чувствителност - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); интерлевкин-8 (чувствителност-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); рецепторен антагонист на интерлевкин-1 (IL-1RA) (чувствителност-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); алфа интерферон (чувствителност - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); автоимунни антитела към алфа-интерферон (чувствителност-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Всички комплекти са предназначени да определят концентрацията на тези цитокини в човешки биологични течности, в супернатанти на културата, когато се изследва способността на човешките клетъчни култури да произвеждат цитокини in vitro. Принципът на анализа е "сандвич" вариант на твърдофазен тристепенен (време на инкубация-4 часа) или двустепенен (време на инкубация-3,5 часа) ензимно-свързан имуносорбентен анализ върху плаки. Анализът изисква 100 ul биологична течност или супернатант на култура на ямка. Отчитане на резултатите - спектрофотометрично при дължина на вълната 450 nm. Във всички комплекти хромогенът е тетраметилбензидин. Срокът на годност на нашите комплекти е удължен до 18 месеца от датата на издаване и 1 месец след началото на употреба. Анализът на литературните данни показа, че съдържанието на цитокини в кръвната плазма на здрави хора зависи както от комплектите, използвани за определянето им, така и от региона, където тези хора живеят. Следователно, за да разберем стойностите на нормалните концентрации на цитокини при жителите на нашия регион, ние анализирахме случайни проби от плазма (от 80 до 400 проби) на практически здрави кръводарители, представители на различни социални групи на възраст от 18 до 60 години без клинични прояви на тежка соматична патология и отсъствие на HBsAg. антитела срещу HIV, вируси на хепатит В и С.

Фактор на туморна некроза-алфа.

TNF-алфа е плейотропен провъзпалителен цитокин, състоящ се от две удължени b-вериги с молекулно тегло 17 kDa и изпълняващи регулаторни и ефекторни функции в имунния отговор и възпалението. Основните производители на алфа-TNF са моноцити и макрофаги. Този цитокин се секретира и от кръвни лимфоцити и гранулоцити, клетки естествени убийци и Т-лимфоцитни клетъчни линии. Основните индуктори на алфа-TNF са вируси, микроорганизми и продукти от техния метаболизъм, включително бактериален липополизахарид. В допълнение, някои цитокини, като IL-1, IL-2, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор, алфа- и бета-INF, също могат да играят ролята на индуктори. Основните направления на биологичната активност на алфа-TNF: проявява селективна цитотоксичност по отношение на някои туморни клетки; активира гранулоцити, макрофаги, ендотелни клетки, хепатоцити (производство на протеини в остра фаза), остеокласти и хондроцити (резорбция на костна и хрущялна тъкан), синтез на други провоспалителни цитокини; стимулира пролиферацията и диференциацията: неутрофили, фибробласти, ендотелни клетки (ангиогенеза), хематопоетични клетки, Т- и В-лимфоцити; засилва притока на неутрофили от костния мозък в кръвта; има антитуморна и антивирусна активност in vivo и in vitro; участва не само в защитните реакции, но и в процесите на унищожаване и възстановяване, придружаващи възпалението; служи като един от медиаторите на разрушаване на тъканите, което е често срещано при продължително, хронично възпаление.

Ориз. 1. Разпределение на нивото на алфа-TNF

в плазмата на здрави донори.

Повишено ниво на алфа-TNF се наблюдава в кръвния серум по време на посттравматично състояние, с белодробни дисфункции, нарушения на нормалното протичане на бременността, онкологични заболявания, бронхиална астма. Нивото на алфа-TNF е 5-10 пъти по-високо от нормата при обостряне на хроничната форма на вирусен хепатит С. През периода на обостряне на заболявания на стомашно-чревния тракт концентрацията на алфа-TNF в серума надвишава нормата средно 10 пъти, а при някои пациенти - 75-80 пъти. Високи концентрации на алфа -TNF се откриват в цереброспиналната течност при пациенти с множествена склероза и цереброспинален менингит, а при пациенти с ревматоиден артрит - в синовиалната течност. Това предполага участието на TNF алфа в патогенезата на редица автоимунни заболявания. Честотата на откриване на алфа -TNF в кръвния серум, дори при тежко възпаление, не надвишава 50%, с индуцирано и спонтанно производство - до 100%. Обхватът на концентрациите на алфа-TNF е 0-6 pg / ml, средният-1.5 pg / ml (фиг. 1).

Гама интерферон.

Ориз. 2. Разпределение на нивата на IFN-гама

в плазмата на здрави донори.

Интерлевкин-4

IL-4 е гликопротеин с молекулно тегло 18–20 kDa, естествен инхибитор на възпалението. Заедно с IFN-гама, IL-4 е ключов цитокин, произвеждан от Т клетки (главно TH-2 лимфоцити). Той поддържа баланс TH-1 / TH-2. Основните направления на биологичната активност на IL-4: усилва еозинофилията, натрупване на мастоцити, секреция на IgG4, TH-2-медииран хуморален имунен отговор; притежава локална антитуморна активност, стимулираща популацията от цитотоксични Т-лимфоцити и туморната инфилтрация от еозинофили; инхибира освобождаването на възпалителни цитокини (алфа-TNF, IL-1, IL-8) и простагландини от активирани моноцити, производството на цитокини от TH-1 лимфоцити (IL-2, гама-INF и др.).

Ориз. 3. Разпределение на нивото на IL-4 в плазмата

здрави донори.

Повишено ниво на IL-4 както в серумните, така и в стимулираните лимфоцити може да се наблюдава при алергични заболявания (особено по време на обостряне), като бронхиална астма, алергичен ринит, сенна хрема, атопичен дерматит, при заболявания на стомашно-чревния тракт. Нивото на IL-4 също е значително повишено при пациенти с хроничен хепатит С (CHC). По време на периоди на обостряне на CHC, неговото количество се увеличава почти 3 пъти в сравнение с нормата, а по време на ремисия на CHC, нивото на IL-4 намалява, особено на фона на лечение с рекомбинантен IL-2. Обхватът на концентрациите на IL-4 е 0–162 pg / ml, средният е 6,9 pg / ml, нормалният диапазон е 0–20 pg / ml (Фиг. 3).

Интерлевкин-8

IL-8 принадлежи към хемокините, това е протеин с молекулно тегло 8 kDa. IL-8 се произвежда от моноядрени фагоцити, полиморфноядрени левкоцити, ендотелни клетки и други видове клетки в отговор на различни стимули, включително бактерии и вируси и техните метаболитни продукти, включително провъзпалителни цитокини (например IL-1, алфа-TNF). Основната роля на интерлевкин-8 е да подобри хемотаксиса на левкоцитите. Той играе важна роля както при остро, така и при хронично възпаление. Повишено ниво на IL-8 се наблюдава при пациенти с бактериални инфекции, хронични белодробни заболявания, заболявания на стомашно-чревния тракт. Плазмените нива на IL-8 са повишени при пациенти със сепсис, а високите концентрации са свързани с повишена смъртност. Резултатите от измерването на съдържанието на IL-8 могат да се използват за проследяване на хода на лечението и прогнозиране на резултата от заболяването. По този начин е установено повишено съдържание на IL-8 в слъзната течност при всички пациенти с благоприятен ход на язви на роговицата. При всички пациенти със сложен ход на язва на роговицата концентрацията на IL-8 е 8 пъти по-висока, отколкото при пациенти с благоприятен ход на заболяването. По този начин съдържанието на провъзпалителни цитокини (особено IL-8) в слъзната течност при язви на роговицата може да се използва като прогностичен критерий за хода на това заболяване.

Ориз. 4. Разпределение на нивото на IL-8 в

плазма на здрави донори (Новосибирск).

Според нашите и публикувани данни, при здрави хора IL-8 се открива изключително рядко в кръвния серум; спонтанно производство на IL-8 от мононуклеарни клетки в кръвта се наблюдава при 62%, а индуцирано производство при 100% от здрави донори. Обхватът на концентрациите на IL-8 е 0–34 pg / ml, средният е 2 pg / ml, нормалният диапазон е 0-10 pg / ml (Фиг. 4).

Ориз. 5. Разпределение на нивото на IL-8 в плазмата

здрави донори (Рубцовск).

Антагонист на рецептора на интерлевкин-1.

IL-1RA принадлежи към цитокините, той е олигопептид с молекулно тегло 18-22 kDa. IL-1RA е ендогенен инхибитор на IL-1, произвеждан от макрофаги, моноцити, неутрофили, фибробласти и епителни клетки. IL-1RA инхибира биологичната активност на интерлевкините IL-1a и IL-1бета, конкурирайки се с тях за свързване с клетъчния рецептор.

Ориз. 6. Разпределение на нивото на IL-1RA

в плазмата на здрави донори

Производството на IL-1RA се стимулира от много цитокини, вирусни продукти и протеини в остра фаза. IL-1RA може активно да се експресира във възпалителни огнища при много хронични заболявания: ревматоиден и ювенилен хроничен артрит, системен лупус еритематозус, исхемични мозъчни лезии, възпалителни заболявания на червата, бронхиална астма, пиелонефрит, псориазис и други. При сепсис се отбелязва най-голямото увеличение на IL-1RA-до 55 ng / ml в някои случаи и е установено, че повишените концентрации на IL-1RA корелират с благоприятна прогноза. Високи нива на IL-1RA се наблюдават при жени със силно затлъстяване и това ниво намалява значително в рамките на 6 месеца след липосукцията. Диапазонът на концентрациите на IL-1RA е 0-3070 pg / ml, средната стойност е 316 pg / ml. Нормалният диапазон е 50–1000 pg / ml (Фиг. 6).

Алфа интерферон.

Алфа-IFN е мономерен негликозилиран протеин с молекулно тегло 18 kDa, който се синтезира главно от левкоцити (В-лимфоцити, моноцити). Този цитокин може също да бъде произведен от почти всеки клетъчен тип в отговор на подходяща стимулация, а вътреклетъчните вирусни инфекции могат да бъдат мощни стимулатори на синтеза на IFN-алфа. Индукторите на алфа-INF включват: вируси и техни продукти, сред които водещо място заемат двуверижните РНК, произведени по време на вирусна репликация, както и бактерии, микоплазми и протозои, цитокини и растежни фактори (като IL-1, IL -2, алфа -FNO, колони -стимулиращи фактори и др.). Първоначалната защитна реакция на неспецифичния антибактериален имунен отговор на организма включва индуцирането на алфа и бета IFN. В този случай той се произвежда от антиген-представящи клетки (макрофаги), които са нахлули в бактерии. Интерфероните (включително алфа-IFN) играят важна роля в неспецифичната връзка на антивирусния имунен отговор. Те повишават антивирусната резистентност, като индуцират в клетките синтеза на ензими, които потискат образуването на нуклеинови киселини и протеини на вируси. В допълнение, те имат имуномодулиращ ефект, засилват експресията на антигени на основния комплекс за хистосъвместимост в клетките. Промяна в съдържанието на алфа-IFN е открита при хепатит и цироза на черния дроб с вирусна етиология. По време на обостряне на вирусни инфекции концентрацията на този цитокин се увеличава значително при повечето пациенти, а през периода на реконвалесценция спада до нормално ниво. Доказана е връзка между серумните нива на алфа-IFN и тежестта и продължителността на грипната инфекция.

Ориз. 7. Разпределение на нивото на алфа-IFN

в плазмата на здрави донори.

Увеличение на концентрацията на алфа-IFN се отбелязва в серума на повечето пациенти, страдащи от автоимунни заболявания, като полиартрит, ревматоиден артрит, спондилоза, псориатичен артрит, ревматична полимиалгия и склеродермия, системен лупус еритематозус и системен васкулит. Високо ниво на този интерферон се наблюдава и при някои пациенти по време на обостряне на пептична язва и холелитиаза. Диапазонът на концентрациите на алфа-INF е 0–93 pg / ml, средната стойност е 20 pg / ml. Нормалният диапазон е до 45 pg / ml (фиг. 7).

Антитела към алфа-IFN.

Антитела към алфа-IFN могат да бъдат открити в серумите на пациенти със соматичен еритематозен лупус. Спонтанно индуциране на антитела към алфа-IFN се наблюдава и в серумите на пациенти с различни форми на рак. В някои случаи антитела към алфа-IFN са открити в серумите на HIV-инфектирани пациенти, както и в цереброспиналната течност и серумите на пациенти с менингит по време на острата фаза, в серумите на пациенти с хроничен полиартрит.

Ориз. 8. Разпределение на нивото на антитела към алфа-IFN

в плазмата на здрави донори.

Алфа-IFN е едно от ефективните антивирусни и противотуморни терапевтични лекарства, но продължителната му употреба може да доведе до производство на специфични антитела към алфа-IFN. Това намалява ефективността на лечението, а в някои случаи причинява различни странични ефекти: от грипоподобни до развитие на автоимунни заболявания. Предвид това, по време на INF-терапията е важно да се контролира нивото на антитела към алфа-INF в тялото на пациента. Образуването им зависи от вида на лекарството, използвано в терапията, продължителността на лечението и вида на заболяването. Обхватът на концентрациите на антитела към алфа-IFN е 0–126 ng / ml, средният е 6,2 ng / ml. Нормалният диапазон е до 15 ng / ml (фиг. 8). Оценката на нивото на цитокини с помощта на комплекти реагенти, предлагани в търговската мрежа в ЗАО "Vector-Best", позволява нов подход към изследването на състоянието на имунната система на организма в клиничната практика.

Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Интересна работа С. Симбирцева, Държавен изследователски институт за високо чисти биологични продукти, Министерство на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург) .Цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима система за регулиране на основните функции на тялото, която съществува заедно с нервната и ендокринната регулация и е свързана предимно с поддържане на хомеостазата по време на въвеждането на патогени и нарушаване целостта на тъканите. Този нов клас регулаторни молекули е създаден от природата в продължение на милиони години еволюция и има неограничен потенциал за употреба като лекарства. В рамките на имунната система цитокините медиират връзката между неспецифичните защитни реакции и специфичния имунитет, действайки в двете посоки. На нивото на тялото цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за тяхното включване в организацията и регулирането на защитните реакции. Движещата сила зад интензивното изследване на цитокините винаги е била обещаващата перспектива за тяхното клинично приложение при лечението на широко разпространени заболявания, включително рак, инфекциозни и имунодефицитни заболявания. В Русия са регистрирани няколко цитокинови препарати, включително интерферони, стимулиращи колониите фактори, интерлевкини и техните антагонисти и фактор на туморна некроза. Всички цитокинови препарати могат да бъдат разделени на естествени и рекомбинантни. Естествените препарати са препарати с различна степен на пречистване, получени от културалната среда на стимулирани еукариотни клетки, главно човешки клетки. Основните недостатъци са ниската степен на пречистване, невъзможността за стандартизация поради големия брой компоненти и използването на кръвни компоненти в производството. Очевидно бъдещето на цитокиновата терапия е свързано с генетично модифицирани лекарства, получени с помощта на най -новите постижения в биотехнологиите. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. В клиничната практика има три основни области на използване на цитокини:

1) цитокинова терапия за активиране на защитните реакции на организма, имуномодулация или запълване на липсата на ендогенни цитокини,

2) имуносупресивна терапия срещу цитокини, насочена към блокиране на биологичното действие на цитокините и техните рецептори,

3) цитокинова генна терапия с цел повишаване на антитуморния имунитет или коригиране на генетични дефекти в цитокиновата система.

Редица цитокини могат да се използват клинично за системна и локална употреба. Системното приложение е оправдано в случаите, когато е необходимо да се осигури действието на цитокините в няколко органа за по -ефективно активиране на имунитета или за активиране на целеви клетки, разположени в различни части на тялото. В други случаи локалното приложение има редица предимства, тъй като ви позволява да постигнете висока локална концентрация на активното начало, целенасочено да повлияете на целевия орган и да избегнете нежелани системни прояви. Понастоящем цитокините се считат за едно от най -обещаващите лекарства за употреба в клиничната практика.

Заключение.

По този начин понастоящем няма съмнение, че цитокините са най -важните фактори в имунопатогенезата. Изследването на нивото на цитокини позволява да се получи информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, съотношението на процесите на активиране на Т-помощници от тип I и II, което е много важно при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси. Цитокините са специфични протеини, чрез които клетките на имунната система могат да обменят информация и да си взаимодействат помежду си. Днес са открити повече от сто различни цитокини, които условно са разделени на провъзпалителни (провокиращи възпаление) и противовъзпалителни (предотвратяващи развитието на възпаление). И така, различните биологични функции на цитокините са разделени на три групи: те контролират развитието и хомеостазата на имунната система, контролират растежа и диференциацията на кръвните клетки (хематопоетичната система) и участват в неспецифични защитни реакции на организма, повлиявайки възпалителните процеси процеси, съсирване на кръвта, кръвно налягане.

Списък на използваната литература.

S.V. Белмер, А.С. Симбирцев, О. В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлова. / Руски държавен медицински университет, Държавен научен център по колопроктология, Москва и Държавен научноизследователски институт за високо чисти биологични продукти, Санкт Петербург.

S.V. Сенников, А.Н. Силков // Списание "Цитокини и възпаление", 2005, No 1 Т. 4, No 1. С.22-27.

Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М. Ю. Рукавишников, материали за работа на АД "Вектор-Бест".

А. С. Симбирцев, Държавен изследователски институт по високо чисти биологични вещества, Министерство на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Държавен изследователски институт за високо чисти биопрепарати, Санкт Петербург.

Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л. Г. Сухо-топло. Катедра по анестезиология и реаниматология, Владивостокски държавен медицински университет.

В работата са използвани материали от сайта http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

някои патогени на инфекциозни заболявания. И така, норсулфазол ...

1. Молекулярни и клетъчни механизми на антивирусен имунитет, модели на развитие и имунопато

   Резюме >> Медицина, здраве

   ... "сайт" се отнася до конкретен сайт сигуренполипептид (антиген), с който ... неговите ранни етапи. Цитокинии хемокини. Други цитокини, в допълнение към интерферони, ... произведени от тях за единица време цитокиниопределя интензивността на разпространението и ...

2. Изследване на причините за развитието на фиброза на костния мозък при миелопролиферативни заболявания чрез анализ на ефекта на тромбоцитните фактори върху мезенхимните стволови клетки

   Домашна работа >> Медицина, здраве

   Различна концентрация; - количествени определениепротеин в експериментални системи ... водят до продължително действие цитокин, който засилва процеса на фиброза ... тромбоцити. Също така повишено съдържание цитокине открит в урината ...

3. Патогенеза на туберкулоза при хора

   Резюме >> Медицина, здраве

   Но е възможно и хранително хранене. Сигурениграе роля в аерогенната инфекция ... играе, секретирана от макрофаги и моноцити цитокин- фактор на туморна некроза (TNF). ... йони, всяка клетка притежава сигуренсистема, която осигурява транспортирането на вещества ...

). Поради факта, че те активират или модулират пролиферативните свойства на клетките от този клас, те са наречени имуноцитокини. След като стана известно, че тези съединения взаимодействат не само с клетките на имунната система, тяхното име е съкратено до цитокини, които също включват колониестимулиращ фактор (CSF) и много други (вж. Вазоактивни агенти и възпаление).

Цитокини [гръцки. kytos- съд, тук е клетка и кинео- движещи се, насърчаващи] - голяма и разнообразна група от малки по размер (молекулно тегло от 8 до 80 kDa) протеинови медиатори - медиаторни молекули („комуникационни протеини“), участващи в междуклетъчната сигнализация главно в имунната система. Цитокините включват фактор на туморна некроза, интерферони, редица интерлевкини и др. Цитокините, които се синтезират от лимфоцити и са регулатори на пролиферацията и диференциацията, по -специално на хематопоетичните клетки и клетките на имунната система, се наричат ​​лимфокини. Терминът "цитокини" е предложен от S. Coen et al. през 1974 г.

Всички клетки на имунната система имат определени функции и работят в ясно координирано взаимодействие, което се осигурява от специални биологично активни вещества - цитокини - регулатори на имунните реакции. Цитокините са специфични протеини, чрез които различни клетки на имунната система могат да обменят информация помежду си и да координират действията си. Наборът и количеството цитокини, действащи върху рецепторите на клетъчната повърхност - "цитокиновата среда" - представляват матрица от взаимодействащи и често променящи се сигнали. Тези сигнали са сложни поради голямото разнообразие от цитокинови рецептори и поради факта, че всеки от цитокините може да активира или потисне няколко процеса, включително собствения си синтез и синтеза на други цитокини, както и образуването и появата на цитокинови рецептори върху клетъчната повърхност. Различните тъкани имат своя собствена здрава "цитокинова среда". Открити са повече от сто различни цитокини.

Цитокините са важен елемент във взаимодействието на различни лимфоцити помежду си и с фагоцитите (фиг. 4). Чрез цитокини Т-помощниците помагат да се координира работата на различни клетки, участващи в имунния отговор.

От откриването на интерлейкините през 70 -те години на миналия век досега са открити повече от сто биологично активни вещества. Различни цитокини регулират пролиферацията и диференциацията на имунокомпетентните клетки. И ако ефектът на цитокините върху тези процеси е проучен доста добре, тогава данните за ефекта на цитокините върху апоптозата се появяват сравнително наскоро. Те също трябва да бъдат взети под внимание при клиничната употреба на цитокини.

Междуклетъчната сигнализация в имунната система се осъществява чрез директно контактно взаимодействие на клетките или с помощта на медиатори на междуклетъчни взаимодействия. Изучаване на диференциацията на имунокомпетентни и хематопоетични клетки, както и механизмите на междуклетъчното взаимодействие, които образуват имунния отговор, голяма и разнообразна група от разтворими медиатори с протеинова природа - медиаторни молекули ("свързващи протеини"), участващи в междуклетъчната сигнализация - цитокини беше открит. Хормоните обикновено се изключват от тази категория въз основа на тяхната ендокринна (а не паракринна или автокринна) природа на действие. (вж. Цитокини: механизми на предаване на хормонален сигнал). Заедно с хормоните и невротрансмитерите, те формират основата на езика на химическата сигнализация, чрез която морфогенезата и регенерацията на тъканите се регулират в многоклетъчен организъм. Те играят централна роля в положителната и отрицателната регулация на имунния отговор. Към днешна дата повече от сто цитокини са открити и изследвани при хора в една или друга степен, както бе споменато по -горе, и има постоянни съобщения за откриването на нови. За някои са получени генно -инженерни аналози. Цитокините действат чрез активиране на цитокиновите рецептори.

Доста често разделянето на цитокините на редица семейства се извършва не от техните функции, а от естеството на триизмерната структура, която отразява вътрешногруповото сходство в конформацията и аминокиселинната последователност на специфични клетъчни цитокинови рецептори (вж. Рецептори за цитокини "). Някои от тях се произвеждат от Т-клетки (вижте "Цитокини, произведени от Т-клетки"). Основната биологична активност на цитокините е регулирането на имунния отговор на всички етапи от неговото развитие, в което те играят централна роля. Като цяло цялата тази голяма група ендогенни регулатори осигурява голямо разнообразие от процеси, като например:

Индукция на цитотоксичност в макрофаги,

Много сериозни заболявания водят до значително повишаване на нивата на IL-1 и TNF алфа. Тези цитокини насърчават активирането на фагоцитите, тяхната миграция към мястото на възпалението, както и освобождаването на възпалителни медиатори - липидни производни, тоест простагландин Е2, тромбоксани и активиращ тромбоцитите фактор. Освен това те пряко или косвено предизвикват разширяване на артериолите, синтеза на адхезивни гликопротеини и активират Т- и В-лимфоцити. IL-1 задейства синтеза на IL-8, който насърчава хемотаксиса на моноцити и неутрофили и освобождаването на ензими от неутрофилите. В черния дроб синтезът на албумин намалява и синтезът на протеини от острата фаза на възпалението се увеличава, включително протеазни инхибитори, компоненти на комплемента, фибриноген, церулоплазмин, феритин и хаптоглобин. Нивото на С-реактивен протеин, който се свързва с повредени и мъртви клетки, както и с някои микроорганизми, може да се увеличи до 1000 пъти. Възможно е също значително повишаване на серумната концентрация на амилоид А и отлагането му в различни органи, което води до вторична амилоидоза. Най-важният медиатор на острата фаза на възпалението е IL-6, въпреки че IL-1 и TNF-алфа също могат да причинят описаните промени в чернодробната функция. IL-1 и TNF-алфа усилват взаимното си влияние върху локалните и общите прояви на възпаление; следователно комбинацията от тези два цитокина, дори и в малки дози, може да причини множествена органна недостатъчност и персистираща артериална хипотония. Потискането на активността на някой от тях премахва това взаимодействие и забележимо подобрява състоянието на пациента. IL-1 активира Т- и В-лимфоцитите по-силно при 39 * С, отколкото при 37 * С. IL-1 и TNF алфа причиняват намаляване на чистата телесна маса и загуба на апетит, което води до кахексия с продължителна треска. Тези цитокини навлизат в кръвта само за кратко време, но е достатъчно да се задейства производството на IL-6. IL-6 постоянно присъства в кръвта, така че концентрацията му е по-съобразена с тежестта на треската и други прояви на инфекция. Въпреки това, IL-6, за разлика от IL-1 и TNF-алфа, не се счита за смъртоносен цитокин.

Резюме. Цитокините са малки протеини, които действат автокринно (т.е. върху клетката, която ги произвежда) или паракринни (върху клетки, разположени наблизо). Образуването и освобождаването на тези високо активни молекули е краткотрайно и строго регулирано. Цитокините, които се синтезират от лимфоцити и са регулатори на пролиферацията и диференциацията, по -специално на хематопоетичните клетки и клетките на имунната система, също се наричат ​​лимфокини и

Тази глава ще разгледа интегриран подход за оценка на цитокиновата система, използвайки описаните по -рано съвременни методи за изследване.

Първо, очертаваме основните понятия за цитокиновата система.

Понастоящем цитокините се считат за молекули протеин-пептид, произвеждани от различни клетки на тялото и осъществяващи междуклетъчни и междусистемни взаимодействия. Цитокините са универсални регулатори на жизнения цикъл на клетките, те контролират процесите на диференциация, пролиферация, функционално активиране и апоптоза на последните.

Цитокините, произвеждани от клетките на имунната система, се наричат ​​имуноцитокини; те са клас разтворими пептидни медиатори на имунната система, необходими за нейното развитие, функциониране и взаимодействие с други системи на тялото (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Като регулаторни молекули, цитокините играят важна роля в реакциите на вродения и адаптивния имунитет, осигуряват тяхната взаимовръзка, контролират хематопоезата, възпалението, зарастването на рани, образуването на нови кръвоносни съдове (ангиогенеза) и много други жизненоважни процеси.

В момента има няколко различни класификации на цитокини, като се отчита тяхната структура, функционална активност, произход, тип цитокинови рецептори. Традиционно, в съответствие с биологичните ефекти, е обичайно да се разграничават следните групи цитокини.

1. Интерлейкини(IL-1-IL-33) са секреторни регулаторни протеини на имунната система, които осигуряват медиаторни взаимодействия в имунната система и нейната връзка с други системи на тялото. Интерлейкините се класифицират според тяхната функционална активност на про- и противовъзпалителни цитокини, лимфоцитни растежни фактори, регулаторни цитокини и др.

3. Фактори на туморна некроза (TNF)- цитокини с цитотоксично и регулаторно действие: TNFa и лимфотоксини (LT).

4. Фактори на растеж на хематопоетични клетки-растежен фактор на стволови клетки (Kit-лиганд), IL-3, IL-7, IL-11, еритропоетин, тробопоетин, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор-GM-CSF, гранулоцитен CSF-G-CSF, макрофагал-

ny KSF - M -KSF).

5. Хемокини- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - регулатори на хемотаксиса на различни видове клетки.

6. Нелимфоидни клетъчни растежни фактори- регулатори на растежа, диференциация и функционална активност на клетки от различни тъканни принадлежности (растежен фактор на фибробласти - FGF, растежен фактор на ендотелните клетки, епидермален растежен фактор - EGF на епидермиса) и трансформиращи растежни фактори (TGFβ, TGFα).

Наред с други, през последните години активно се изследва фактор, който инхибира миграцията на макрофаги (инхибиращ миграцията фактор - MIF), който се счита за неврохормон с цитокин и ензимна активност (Суслов А.П., 2003; Ковалчук ​​Л.В. и др. ,

Цитокините се различават по структура, биологична активност и други свойства. Въпреки това, наред с разликите, цитокините имат общи свойства,характерни за този клас биорегулаторни молекули.

1. Цитокините обикновено са гликозилирани полипептиди със средно молекулно тегло (по -малко от 30 kD).

2. Цитокините се произвеждат от клетки на имунната система и други клетки (например ендотел, фибробласти и др.) В отговор на активиращ стимул (свързани с патогена молекулярни структури, антигени, цитокини и т.н.) и участват в реакциите на вроден и адаптивен имунитет, регулиращ тяхната сила и продължителност. Някои цитокини се синтезират конститутивно.

3. Секрецията на цитокини е краткотраен процес. Цитокините не се съхраняват като предварително формирани молекули, а техните

синтезът винаги започва с генна транскрипция. Клетките произвеждат цитокини в ниски концентрации (пикограми на милилитър).

4. В повечето случаи се произвеждат цитокини и действат върху прицелните клетки в непосредствена близост (кратко действие). Основното място на цитокиновото действие е междуклетъчният синапс.

5. Съкращаванесистемата на цитокините се проявява във факта, че всеки тип клетка е способна да произвежда няколко цитокини и всеки цитокин може да бъде секретиран от различни клетки.

6. Всички цитокини се характеризират с плейотропия,или полифункционалност на действието. По този начин проявата на признаци на възпаление се дължи на влиянието на IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Дублирането на функции гарантира надеждността на цитокиновата система.

7. Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира от силно специфични мембранни рецептори с висок афинитет, които са трансмембранни гликопротеини, обикновено състоящи се от повече от една субединица. Извънклетъчната част на рецепторите е отговорна за свързването на цитокини. Има рецептори, които елиминират излишните цитокини в патологичния фокус. Това са така наречените трап рецептори. Разтворимите рецептори са извънклетъчният домен на мембранния рецептор, разделени от ензим. Разтворимите рецептори са в състояние да неутрализират цитокините, да участват в транспортирането им до огнището на възпалението и в екскрецията им от тялото.

8. Цитокини работи на принципа на мрежа.Те могат да действат заедно. Много от функциите, първоначално приписвани на един цитокин, изглежда се медиират от съгласуваното действие на няколко цитокина. (синергиядействия). Примери за синергични взаимодействия на цитокини са стимулиране на възпалителни реакции (IL-1, IL-6 и TNF-a), както и синтез на IgE

(IL-4, IL-5 и IL-13).

Някои цитокини индуцират синтеза на други цитокини (каскада).Каскадното действие на цитокините е необходимо за развитието на възпалителни и имунни отговори. Способността на някои цитокини да засилват или отслабват производството на други определя важни положителни и отрицателни регулаторни механизми.

Антагонистичният ефект на цитокините е известен, например, производството на IL-6 в отговор на повишаване на концентрацията на TNFα може да бъде

отрицателен регулаторен механизъм за контролиране на производството на този медиатор по време на възпаление.

Цитокиновата регулация на целевите клетъчни функции се извършва с помощта на автокринни, паракринни или ендокринни механизми. Някои цитокини (IL-1, IL-6, TNFα и др.) Са в състояние да участват в изпълнението на всички горепосочени механизми.

Отговорът на клетката върху влиянието на цитокин зависи от няколко фактора:

От вида на клетките и тяхната начална функционална активност;

От локалната концентрация на цитокина;

От наличието на други молекули -медиатори.

По този начин продуцентските клетки, цитокините и техните специфични рецептори върху прицелните клетки образуват единна медиаторна мрежа. Това е набор от регулаторни пептиди, а не отделни цитокини, които определят крайния клетъчен отговор. Понастоящем цитокиновата система се разглежда като универсална система за регулиране на нивото на целия организъм, която осигурява развитието на защитни реакции (например по време на инфекция).

През последните години идеята за цитокинова система, която съчетава:

1) клетки продуценти;

2) разтворими цитокини и техните антагонисти;

3) клетки -мишени и техните рецептори (фиг. 7.1).

Нарушенията на различни компоненти на цитокиновата система водят до развитие на множество патологични процеси и затова идентифицирането на дефекти в тази регулаторна система е важно за правилната диагноза и назначаване на адекватна терапия.

Нека първо разгледаме основните компоненти на цитокиновата система.

Клетки, продуциращи цитокин

I. Основната група цитокини-продуциращи клетки в адаптивния имунен отговор са лимфоцитите. Покойните клетки не отделят цитокини. С разпознаване на антиген и с участието на рецепторни взаимодействия (CD28-CD80 / 86 за Т-лимфоцити и CD40-CD40L за В-лимфоцити), се случва клетъчно активиране, което води до транскрипция на цитокинови гени, транслация и секреция на гликозилирани пептиди в междуклетъчните пространство.

Ориз. 7.1.Цитокинова система

CD4 Т-помощниците са представени от субпопулации: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, които се различават по спектъра на секретираните цитокини в отговор на различни антигени.

Th0 произвеждат широк спектър от цитокини при много ниски концентрации.

Посока на диференциация Th0определя развитието на две форми на имунен отговор с преобладаване на хуморални или клетъчни механизми.

Естеството на антигена, неговата концентрация, локализация в клетката, видът на антиген-представящите клетки и определен набор от цитокини регулират посоката на диференциация на Th0.

След улавяне и обработка на антиген, дендритните клетки представят антигенни пептиди на Th0 клетките и произвеждат цитокини, които регулират посоката на тяхната диференциация в ефекторни клетки. Ролята на отделните цитокини в този процес е показана на фиг. 7.2. IL-12 индуцира синтеза на IFNγ от Т-лимфоцити и] HGC. IFNu осигурява диференциация на Th1, които започват да отделят цитокини (IL-2, IFNu, IL-3, TNF-a, лимфотоксини), които регулират развитието на реакции към вътреклетъчни патогени

(свръхчувствителност със забавен тип (ХЗТ) и различни видове клетъчна цитотоксичност).

IL-4 осигурява диференциация на Th0 в Th2. Активираният Th2 продуцира цитокини (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и др.), Които определят пролиферацията на В-лимфоцитите, тяхната по-нататъшна диференциация в плазмени клетки и развитието на реакции на антитела, основно към извънклетъчни патогени.

IFNu регулира отрицателно функцията на Th2 клетките и обратно, IL-4, IL-10, секретиран от Th2, инхибират Th1 функцията (Фиг. 7.3). Молекулярният механизъм на тази регулация е свързан с транскрипционни фактори. Експресията на T-bet и STAT4, определена от IFNy, насочва диференциацията на Т-клетките по пътя на Th1 и потиска развитието на Th2. IL-4 индуцира експресията на GATA-3 и STAT6, което съответно осигурява превръщането на наивен THO в Th2 клетки (Фиг. 7.2).

През последните години е описана специална субпопулация от Т-помощни клетки (Th17), продуцираща IL-17. Членовете на семейството на IL-17 могат да бъдат експресирани чрез активирани клетки с памет (CD4CD45RO), y5T клетки, NKT клетки, неутрофили, моноцити под въздействието на IL-23, IL-6, TGFβ, продуцирани от макрофаги и дендритни клетки. Основният диференциращ фактор при хората е ROR-C, при мишки-ROR-γ лПоказана е основната роля на IL-17 в развитието на хронично възпаление и автоимунна патология (виж фиг. 7.2).

В допълнение, Т-лимфоцитите в тимуса могат да се диференцират в естествени регулаторни клетки (Treg), експресиращи повърхностни маркери CD4 + CD25 + и транскрипционен фактор FOXP3. Тези клетки са в състояние да потиснат имунния отговор, медииран от Th1 и Th2 клетките чрез директен междуклетъчен контакт и синтеза на TGFβ и IL-10.

Диаграмите на диференциация на Th0 клонингите и цитокините, секретирани от тях, са показани на фиг. 7.2 и 7.3 (вижте също цветна вложка).

Т-цитотоксичните клетки (CD8 +), естествените клетки убийци са слаби продуценти на цитокини като интерферони, TNF-a и лимфотоксини.

Прекомерното активиране на една от Th субпопулациите може да определи развитието на един от вариантите на имунния отговор. Хроничният дисбаланс на активирането на Th може да доведе до образуване на имунопатологични състояния, свързани с проявата на

алергии, автоимунна патология, хронични възпалителни процеси и др.

Ориз. 7.2.Различни субпопулации на Т-лимфоцити, продуциращи цитокини

II. В вродената имунна система основните производители на цитокини са миелоидни клетки. С помощта на Toll-подобни рецептори (TLRs) те разпознават подобни молекулярни структури на различни патогени, така наречените свързани с патогени молекулни модели (RAMP), например липополизахарид (LPS) на грам-отрицателни бактерии, липотейхоеви киселини, пептидогликани на грам-положителни микроорганизми, флагелин, ДНК, богата на G повторения и др. В резултат на това

Това взаимодействие с TLR задейства каскада на вътреклетъчна трансдукция на сигнал, водеща до експресия на гени на две основни групи цитокини: провъзпалителни и IFN тип 1 (фиг. 7.4, вижте също вмъкване на цвят). Най -вече тези цитокини (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, хемокини и др.) Индуцират развитието на възпаление и участват в защитата на организма от бактериални и вирусни инфекции.

Ориз. 7.3.Спектърът на цитокини, секретирани от TH1 и TH2 клетки

III. Клетките, които не принадлежат към имунната система (клетки от съединителна тъкан, епител, ендотел) конститутивно секретират автокринни растежни фактори (FGF, EGF, TGFR и др.). и цитокини, които поддържат пролиферацията на хематопоетични клетки.

Цитокини и техните антагонистиса описани подробно в редица монографии (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ориз. 7.4. TLR-медиирана индукция на производството на цитокини от вродени имунни клетки

Свръхекспресията на цитокини е опасна за организма и може да доведе до развитие на прекомерен възпалителен отговор, реакция на остра фаза. Различни инхибитори участват в регулирането на производството на провъзпалителни цитокини. По този начин са описани редица вещества, които неспецифично свързват цитокина IL-1 и предотвратяват проявата на неговото биологично действие (а2-макроглобулин, С3-компонент на комплемента, уромодулин). Специфичните инхибитори на IL-1 включват разтворими рецептори за примамки, антитела и антагонист на IL-1 рецептор (IL-1RA). С развитието на възпаление се наблюдава увеличаване на експресията на гена IL-1RA. Но дори нормално, този антагонист присъства в кръвта във висока концентрация (до 1 ng / ml или повече), блокирайки действието на ендогенния IL-1.

Целеви клетки

Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира чрез специфични рецептори, които свързват цитокините с много висок афинитет и отделните цитокини могат да използват

общи рецепторни субединици. Всеки цитокин се свързва със своя специфичен рецептор.

Цитокиновите рецептори са трансмембранни протеини и са разделени на 5 основни типа. Най-често срещаният е така нареченият хематопоетинов тип рецептор, който има два извънклетъчни домена, единият от които съдържа обща последователност от аминокиселинни остатъци от две повторения на триптофан и серин, разделени от всяка аминокиселина (WSXWS мотив). Вторият тип рецептор може да има два извънклетъчни домена с голям брой запазени цистеини. Това са рецептори от семейството на IL-10 и IFN. Третият тип е представен от цитокинови рецептори, принадлежащи към групата на TNF. Четвъртият тип цитокинови рецептори принадлежи към свръхсемейството имуноглобулинови рецептори, които имат извънклетъчни домени, които са структурно подобни на домейните на молекулите на имуноглобулина. Петият тип рецептор, който свързва молекули от семейството на хемокините, е представен от трансмембранни протеини, които преминават през клетъчната мембрана на 7 места. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Цитокините са в състояние да повлияят на пролиферацията, диференциацията, функционалната активност и апоптозата на целевите клетки (виж Фиг. 7.1). Проявлението на биологичната активност на цитокините в клетките -мишени зависи от участието на различни вътреклетъчни системи в предаването на сигнал от рецептора, което е свързано с характеристиките на клетките -мишени. Сигналът за апоптоза се осъществява, наред с други неща, с помощта на специфичен регион от семейството на рецепторите на TNF, така нареченият „смъртен“ домен (фиг. 7.5, вижте вмъкване на цвят). Диференциращите и активиращите сигнали се предават чрез вътреклетъчните протеини Jak -STAT - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция (фиг. 7.6, вижте вмъкване на цвят). G-протеините участват в сигнализирането от хемокини, което води до повишена миграция и клетъчна адхезия.

Цялостен анализ на цитокиновата система включва следното.

I. Оценка на клетки продуценти.

1. Определяне на изразяването:

Рецептори, които разпознават патоген или антиген TCR, TLR) на ниво гени и протеинови молекули (PCR, поточна цитометрия);

Адапторни молекули, които провеждат сигнал, който задейства транскрипцията на цитокинови гени (PCR и др.);

Ориз. 7.5.Предаване на сигнал от TNF рецептора

Ориз. 7.6. Jak -STAT - сигнален път от цитокинови рецептори тип 1

Цитокинови гени (PCR); протеинови молекули на цитокини (оценка на цитокиновата синтезираща функция на човешките мононуклеарни клетки).

2. Количествено определяне на субпопулации от клетки, съдържащи определени цитокини: Th1, Th2 Th17 (метод за вътреклетъчно оцветяване на цитокини); определяне на броя на клетките, секретиращи определени цитокини (метод ELISPOT, виж гл. 4).

II. Оценка на цитокини и техните антагонисти в биологични среди на тялото.

1. Тестване на биологичната активност на цитокините.

2. Количествено определяне на цитокини с помощта на ELISA.

3. Имунохистохимично оцветяване на цитокини в тъканите.

4. Определяне на съотношението на противоположни цитокини (про- и противовъзпалителни), цитокини и антагонисти на цитокиновите рецептори.

III. Оценка на целевите клетки.

1. Определяне на експресията на цитокинови рецептори на ниво гени и протеинови молекули (PCR, поточна цитометрия).

2. Определяне на сигнални молекули във вътреклетъчното съдържание.

3. Определяне на функционалната активност на целевите клетки.

В момента са разработени множество методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация. Сред тях се отличават:

1) молекулярно -биологични методи;

2) методи за количествено определяне на цитокини с помощта на имуноанализ;

3) тестване на биологичната активност на цитокините;

4) вътреклетъчно оцветяване на цитокини;

5) метод ELISPOT, който позволява откриване на цитокини около една клетка, продуцираща цитокин;

6) имунофлуоресценция.

Ето кратко описание на тези методи.

Като се използва молекулярно -биологични методивъзможно е да се изследва експресията на гени на цитокини, техните рецептори, сигнални молекули, да се изследва полиморфизмът на тези гени. През последните години бяха проведени голям брой проучвания, които разкриха връзки между варианти на алели на гени на молекули на цитокиновата система и предразположение

към редица заболявания. Изследването на алелни варианти на цитокинови гени може да предостави информация за генетично програмираното производство на определен цитокин. Най-чувствителна е полимеразната верижна реакция в реално време-RT-PCR (виж глава 6). Метод на хибридизация на мястопозволява да се изясни тъканната и клетъчната локализация на експресията на цитокинови гени.

Количественото определяне на цитокини в биологични течности и в култури от мононуклеарни клетки от периферна кръв чрез ELISA може да се характеризира, както следва. Тъй като цитокините са локални медиатори, е по -подходящо да се измерват техните нива в съответните тъкани след извличане на тъканни протеини или в естествени течности, например при сълзи, промиване от кухини, урина, околоплодни води, цереброспинална течност и др. Нивата на цитокини в серума или други телесни течности отразяват текущото състояние на имунната система, т.е. синтез на цитокини от клетки на тялото in vivo.

Определянето на нивата на производство на цитокини от мононуклеарни клетки от периферна кръв (МНК) показва функционалното състояние на клетките. Спонтанното производство на MNC цитокини в културата показва, че клетките вече са активирани in vivo.Индуцираният синтез на цитокини (от различни стимуланти, митогени) отразява потенциалната резервна способност на клетките да реагират на антигенен стимул (по -специално на действието на лекарства). Намаленото индуцирано производство на цитокини може да служи като един от признаците на състояние на имунодефицит. Цитокините не са специфични за определен антиген. Следователно специфична диагноза на инфекциозни, автоимунни и алергични заболявания чрез определяне нивото на определени цитокини е невъзможна. В същото време оценката на нивата на цитокини позволява да се получат данни за тежестта на възпалителния процес, прехода му към системно ниво и прогноза, функционалната активност на клетките на имунната система, съотношението на Th1 и Th2 клетките, което е много важен при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси.

В биологичните среди цитокините могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи на имуноанализ,използване на поликлонални и моноклонални антитела (виж глава 4). ELISA ви позволява да разберете какви са точните концентрации на цитокини в био-

логични телесни течности. Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ на цитокини има редица предимства пред другите методи (висока чувствителност, специфичност, независимост от наличието на антагонисти, възможност за точно автоматизирано счетоводство, счетоводна стандартизация). Този метод обаче има и своите ограничения: ELISA не характеризира биологичната активност на цитокините, той може да даде фалшиви резултати поради кръстосано реагиращи епитопи.

Биологични тестовеосъществява се въз основа на познаване на основните свойства на цитокините, тяхното действие върху клетките -мишени. Изследването на биологичните ефекти на цитокините позволи разработването на четири вида цитокинови тестове:

1) чрез индуциране на пролиферация на целеви клетки;

2) чрез цитотоксичен ефект;

3) чрез индуциране на диференциация на предшественици на костен мозък;

4) за антивирусно действие.

IL-1 се определя от стимулиращия ефект върху пролиферацията на миши тимоцити, активирани от митоген инвитро; IL -2 - чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите; TNFa и лимфотоксините се тестват за цитотоксично действие върху миши фибробласти (L929). Колони-стимулиращите фактори се оценяват за тяхната способност да поддържат растежа на предшествениците на костния мозък под формата на колонии в агар. Антивирусната активност на IFN се открива чрез инхибиране на цитопатичното действие на вирусите в културата на човешки диплоидни фибробласти и туморната линия на фибробласти на мишки L-929.

Създадени са клетъчни линии, чийто растеж зависи от наличието на определени цитокини. Таблица 7.1 е списък на клетъчни линии, използвани за изследване на цитокини. Според способността да се индуцира пролиферацията на чувствителни целеви клетки, се провежда биотестване на IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 и др. Тези методи за изпитване обаче се извършват се характеризират с недостатъчна чувствителност и информационно съдържание. Инхибиторните и антагонистичните молекули могат да маскират биологичната активност на цитокините. Няколко цитокини проявяват обща биологична активност. Независимо от това, тези методи са идеални за тестване на специфичната активност на рекомбинантните цитокини.

Таблица 7.1.Клетъчни линии, използвани за тестване на биологичната активност на цитокините

Краят на масата. 7.1

Лаборатория 7-1

Определяне на биологичната активност на IL-1 чрез комитогенен ефект върху пролиферацията на миши тимоцити

Методът за биологично тестване на IL-1 се основава на способността на цитокин да стимулира пролиферацията на миши тимоцити.

IL-1 може да бъде определен в културата на моноцити, стимулирани с LPS, както и във всяка биологична течност на тялото.Необходимо е да се обърне внимание на редица подробности.

1. За тестване се използват тимоцити на мишки C3H / HeJ, стимулирани към пролиферация от митогени (конканавалин А - ConA и фитохемаглутинин - PHA). Тимоцитите C3H / HeJ не са избрани случайно: мишки от тази инбредна линия не реагират на LPS, който може да присъства в тествания материал и да причини производството на IL-1.

2. Тимоцитите реагират на IL-2 и митогени; следователно присъствието на IL-2 и митогени също трябва да се определи в препарати, тествани за IL-1.

Оперативна процедура

1. Вземете суспензия от тимоцити в концентрация 12 × 10 6 / ml среда RPMI 1640, съдържаща 10% серум от ембриони от крави и 2 -меркаптоетанол (5 × 10 -5 М).

2. Подгответе серия от последователни двукратни разреждания на експериментални (биологични телесни течности) и контролни проби. За контроли се използват биологични течности, съдържащи IL-1, или проби, получени чрез инкубиране на моноядрени клетки без LPS и лабораторен стандартен препарат, съдържащ IL-1. В 96-ямкови плаки с кръгло дъно, 50 μl се прехвърлят от всяко разреждане в 6 ямки.

3. В три ямки от всяко разреждане добавете 50 µl пречистен PHA (Wellcome), разтворен в пълна среда при концентрация 3 µg / ml, а в останалите 3 ямки - 50 µl среда.

4. Добавете 50 μl тимоцитна суспензия към всяка ямка и инкубирайте 48 часа при 37 ° С.

6. Преди края на култивирането, 50 μl разтвор (1 μCi / ml) на ["3Н] -тимидин се добавя към ямките и се инкубира за още 20 часа.

7. За да се определи нивото на радиоактивност, културните клетки се прехвърлят във филтърна хартия с помощта на автоматичен клетъчен комбайн, филтрите се изсушават и включването на етикета се определя от течен сцинтилационен брояч.

8. Резултатите се изразяват като стимулиращ фактор.

където m cp е средният брой импулси в 3 дупки.

Ако тимоцитите реагират на стимулация със стандартен IL-1, тогава индексът на стимулация на изпитваната проба над 3 надеждно показва активността на IL-1.

Биоанализът е единственият метод за оценка на цитокиновата функция, но този метод трябва да бъде допълнен от различни видове подходящ контрол за специфичност, използвайки моноклонални антитела. Добавянето на определени моноклонални антитела към цитокина в културата блокира биологичната активност на цитокина, което доказва, че откритият цитокин служи като сигнал за пролиферация на клетъчна линия.

Използването на биоанализ за откриване на интерферон.Принципът за оценка на биологичната активност на IFN се основава на неговия антивирусен ефект, който се определя от степента на инхибиране на размножаването на тествания вирус в клетъчната култура.

В работата могат да се използват клетки, чувствителни към действието на IFN: предимно трипсинизирани фибробластни клетки от пилешки и човешки ембриони, трансплантирани клетки от човешки диплоидни фибробласти и клетъчна култура на мишка (L929).

При оценката на антивирусния ефект на IFN е препоръчително да се използват вируси с кратък репродуктивен цикъл, висока чувствителност към действието на IFN: вирус на миши енцефаломиелит, миши везикуларен стоматит и др.

Лаборатория 7-2

Определяне на активността на интерферон

1. Суспензия от диплоидни фибробласти на човешки плод върху среда с 10% серум от говежди ембриони (клетъчна концентрация-15-20 × 10 6 / ml) се излива в стерилни 96-ямкови плочи с плоско дъно, 100 μl на ямка и се поставят в CO 2 инкубатор при температура 37 ° С.

2. След образуването на пълен монослой, растежната среда се отстранява от гнездата и към всяка ямка се добавят 100 ul подложка.

3. Титруването на активността на IFN в тестовите проби се извършва по метода на двукратни разреждания върху монослой от фибробласти.

Едновременно с пробите, вирусът на миши енцефаломиелит (VEM) се въвежда в ямките в доза, която причинява 100% клетъчно увреждане 48 часа след заразяването.

4. За контрол използвайте ямки с интактни (необработени) клетки, заразени с вируса.

Във всяко проучване референтните проби на IFN с известна активност се използват като референтни лекарства.

5. Плочите с разредени проби се инкубират за 24 часа при 37 ° С в атмосфера с 5% CO 2.

6. Нивото на активност на IFN се определя от реципрочното на максималното разреждане на изпитваната проба, което инхибира цитопатичния ефект на вируса с 50%и се изразява в единици активност на ml.

7. За да се определи вида на IFN, към системата се добавя антисерум срещу IFNα, IFNβ или IFNγ. Антисерумът отменя действието на съответния цитокин, което прави възможно идентифицирането на типа IFN.

Определяне на биологичната активност на миграцията на инхибиращия фактор.В момента се формират напълно нови идеи за природата и свойствата на МИТА, който е открит през 60 -те години на миналия век като медиатор на клетъчния имунитет и остава без подобаващо внимание в продължение на много години (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; David JR, 1966). Едва през последните 10-15 години стана ясно: МИТЪТ е един от най-важните биологични медиатори в организма с широк спектър от биологични функции на цитокин, хормон и ензим. Действието на MIF върху прицелните клетки се осъществява чрез CD74 - рецептора или чрез некласическия път на ендоцитоза.

МИТЪТ се счита за важен медиатор на възпалението, активиращ функцията на макрофагите (производство на цитокини, фагоцитоза, цитотоксичност и т.н.), както и ендогенен имунорегулаторен хормон, който модулира глюкокортикоидната активност.

Все повече информация се натрупва за ролята на MIF в патогенезата на много възпалителни заболявания, включително сепсис, ревматоиден артрит (RA), гломерулонефрит и др. При РА концентрацията на MIF в течността на засегнатите стави е значително увеличена, което корелира с тежестта на заболяването. Под влияние на МИТА се увеличава производството на провъзпалителни цитокини както от макрофагите, така и от синовиалните клетки.

Известни са различни методи за тестване на активността на MIF, когато мигриращите клетки (целеви клетки за MIF) се поставят в стъклена капиляра (капилярен тест), в капка агароза или в агарозна ямка.

Представяме сравнително прост метод за скрининг, основан на образуването на клетъчни микрокултури (левкоцити или макрофаги), стандартни по площ и брой клетки в дъното на ямките на плочка с 96 гнезда с плоско дъно, последвано от тяхното култивиране в хранителна среда и определяне на промяната в площта на тези микрокултури под действието на МИФ (Суслов А.П., 1989).

Лаборатория 7-3

Определение на МИТ дейност

Определянето на биологичната активност на MIF се извършва с помощта на устройство за образуване на клетъчни микрокултури (фиг. 7.7) - MIGROSKRIN (Изследователски институт по епидемиология и микробиология на името на NF Gamaleya RAMS).

1. В ямките на 96-ямкова плака (Flow, Великобритания или подобна) се добавят 100 μl от проба, разредена в културна среда, в която се определя МИТНАТА активност (всяко разреждане в 4 паралела, експериментални проби). Културната среда съдържа RPMI 1640, 2 тМ L-глутамин, 5% фетален говежди серум, 40 μg / ml гентамицин.

2. Добавете културална среда (в 4 паралела) към контролните ямки, по 100 µl всяка.

3. Пригответе клетъчна суспензия от перитонеални макрофаги, за които 2 хибридни мишки (CBAxC57B1 / 6) F1 се инжектират интраперитонеално с 10 ml разтвор на Ханкс с хепарин (10 U / ml), като масажирате леко корема за 2-3 минути. След това животното се избива чрез обезглавяване, коремната стена се пробива внимателно в областта на слабините и ексудатът се изсмуква през игла със спринцовка. Клетките на перитонеалния ексудат се промиват два пъти с разтвор на Ханкс, центрофугират се в продължение на 10-15 минути при 200 g. След това се приготвя клетъчна суспензия с концентрация 10 ± 1 млн. / Ml среда RPMI 1640. Преброяването се извършва в камера Горяев.

4. Сглобете системата MIGROSKRIN, която е стелаж за насочено и стандартно фиксиране на върхове с клетъчни култури в строго вертикално положение на дадена височина над центъра на ямка на 96-ямкова културна плоча и включва също 92 връхчета за автоматична пипета от Costar, САЩ (фиг. 7.7).

Поставете краката на триножника в ъглови кладенци на плочата. Клетъчната суспензия се взема с автоматична пипета в накрайници - 5 μl във всяка, изплаква се от излишните клетки чрез еднократно спускане в средата и се вкарва вертикално в гнездата на системната стойка. Напълненият багажник с накрайници се държи при стайна температура за 1 час върху строго хоризонтална повърхност. През това време клетките на суспензията се утаяват на дъното на ямките, където се образуват стандартни клетъчни микрокултури.

5. Поставката за върха се отстранява внимателно от плочата. Плоча с микрокултура от клетки се поставя в строго хоризонтално положение в CO 2 инкубатор, където се култивира в продължение на 20 ч. По време на култивирането клетките мигрират по дъното на ямката.

6. Количественото отчитане на резултатите след инкубацията се извършва на бинокулярна лупа, визуално оценявайки размера на колонията по скалата вътре в окуляра. Микрокултурите са кръгли. След това изследователите определят средния диаметър на колонията от измерванията на колониите в 4 тестови или контролни ямки. Грешката при измерване е ± 1 mm.

Индексът на миграция (MI) се изчислява по формулата:

Пробата има MYTH-активност, ако стойностите на MI са равни

За конвенционална единица (U) на МИТОВА активност се взема реципрочната стойност, равна на стойността на най -голямото разреждане на пробата (проба), при която индексът на миграция е 0,6 ± 0,2.

Биологична активност на FEOα се оценява чрез неговото цитотоксично действие върху линията на трансформирани фибробласти L-929. Рекомбинантният TNFa се използва като положителна контрола, а клетките в културална среда се използват като отрицателна контрола.

Изчислете цитотоксичния индекс (CI):

където а- броя на живите клетки в контролата; б- броя на живите клетки в експеримента.

Ориз. 7.7.Схема MIGROSKRIN - Устройства за количествено определяне на миграцията на клетъчни култури

Клетките се оцветяват с багрило (метиленово синьо), което се включва само в мъртвите клетки.

Стойността на реципрочното разреждане на пробата, необходима за получаване на 50% клетъчна цитотоксичност, се приема като конвенционална единица за активност на TNF. Специфичната активност на пробата е съотношението на активност в произволни единици на ml към концентрацията на протеин, съдържащ се в пробата.

Оцветяване с вътреклетъчни цитокини.Промяната в съотношението на клетки, произвеждащи различни цитокини, може да отразява патогенезата на заболяването и да служи като критерий за прогнозата на заболяването и оценката на терапията.

По метода на вътреклетъчно оцветяване се определя експресията на цитокин на нивото на една клетка. Поточната цитометрия ви позволява да преброите броя на клетките, експресиращи определен цитокин.

Нека изброим основните етапи при определянето на вътреклетъчните цитокини.

Нестимулираните клетки произвеждат малки количества цитокини, които по правило не се отлагат; следователно важен етап в оценката на вътреклетъчните цитокини е стимулирането на лимфоцитите и блокирането на освобождаването на тези продукти от клетките.

Най-често използваният индуктор на цитокини е активаторът на протеин киназа С форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) в комбинация с калциев йонофорен йономицин (IN). Използването на такава комбинация предизвиква синтеза на широк спектър от цитокини: IFNu, IL-4, IL-2, TNFa. Недостатъкът на използването на PMA-IN е проблемът с откриването на CD4 молекули на повърхността на лимфоцитите след такова активиране. Също така, производството на цитокини от Т-лимфоцитите се индуцира от митогени (PHA). В клетките и моноцитите стимулират

Моноядрените клетки се инкубират в присъствието на индуктори на производството на цитокини и блокер на техния вътреклетъчен транспорт, брефелдин А или монензин, в продължение на 2-6 часа.

След това клетките се ресуспендират в буфериран физиологичен разтвор. За фиксиране се добавя 2% формалдехид, инкубира се в продължение на 10-15 минути при стайна температура.

След това клетките се третират със сапонин, който увеличава пропускливостта на клетъчната мембрана, и се оцветяват с моноклонални антитела, специфични за откритите цитокини. Предварителното оцветяване на повърхностни маркери (CD4, CD8) увеличава количеството информация, получена за клетката и ви позволява да определите по-точно нейната популационна идентичност.

Има някои ограничения при прилагането на описаните по -горе методи. Така че с тяхна помощ е невъзможно да се анализира синтеза на цитокини от една клетка, невъзможно е да се определи броя на цитокинопродуциращите клетки в подпопулация, невъзможно е да се определи дали цитокинопродуциращите клетки експресират уникални маркери, дали различни цитокини се синтезират от различни клетки или от едни и същи. Отговорът на тези въпроси се получава с помощта на други методи на изследване. За определяне на честотата на продуциращи цитокин клетки в популация се използва методът за ограничаване на разрежданията и вариант на ELISPOT ензимно-свързан имуносорбентен анализ (вж. Глава 4).

Метод на хибридизация in situ.Методът включва:

2) фиксиране с параформалдехид;

3) откриване на иРНК с помощта на белязана сДНК. В някои случаи цитокиновата иРНК се определя на срезове с помощта на радиоизотопна PCR.

Имунофлуоресценция.Методът включва:

1) замразяване на органа и подготовка на секции от криостат;

2) фиксиране;

3) обработка на срезовете с анти-цитокинови антитела, маркирани с флуоресцеин;

4) визуално наблюдение на флуоресценцията.

Тези техники (хибридизация на мястои имунофлуоресценция) са бързи и не зависят от праговите концентрации на секретирания продукт. Те обаче не определят количествено количеството секретиран цитокин и могат да бъдат технически сложни. Необходимо е разнообразие от внимателно наблюдение за неспецифични реакции.

Използвайки представените методи за оценка на цитокините, бяха идентифицирани патологични процеси, свързани с нарушения в цитокиновата система на различни нива.

По този начин оценката на цитокиновата система е изключително важна за характеризиране на състоянието на имунната система на организма. Изследването на различни нива на цитокиновата система дава информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, за тежестта на възпалителния процес, за преминаването му към системно ниво и за прогнозата на заболяването.

Въпроси и задачи

1. Избройте общите свойства на цитокините.

2. Дайте класификация на цитокините.

3. Избройте основните компоненти на цитокиновата система.

4. Избройте клетките, продуциращи цитокин.

5. Опишете семействата на цитокинови рецептори.

6. Какви са механизмите на функциониране на цитокиновата мрежа?

7. Разкажете ни за производството на цитокини в вродената имунна система.

8. Какви са основните подходи за цялостна оценка на цитокиновата система?

9. Какви са методите за тестване на цитокини в телесните течности?

10. Какви са дефектите в цитокиновата система при различни патологии?

11. Какви са основните методи за биологично изпитване на IL-1, IFN, MIF, TNFa в биологични течности?

12. Опишете процеса на определяне на вътреклетъчното съдържание на цитокини.

13. Опишете процеса на определяне на цитокините, секретирани от една клетка.

14. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на нивото на цитокиновия рецептор.

15. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на нивото на клетки, продуциращи цитокин.

16. Каква информация може да бъде получена чрез изследване на производството на цитокини в културата на моноядрени клетки, в кръвния серум?

Въведение

Главна информация

Класификация на цитокините

Цитокинови рецептори

Цитокини и регулиране на имунния отговор

Заключение

Литература

Въведение

Цитокините са една от най -важните части на имунната система. Имунната система се нуждае от система за предупреждение от клетките на тялото, като вик за помощ. Това е може би най -доброто определение на цитокините. Когато клетката е повредена или засегната от патогенен организъм, макрофагите и увредените клетки освобождават цитокини. Това включва фактори като интерлевкин, интерферон и тумор некроза фактор-алфа. Последното също доказва, че разрушаването на туморната тъкан се контролира от имунната система. Когато цитокините се освобождават, те призовават специфични имунни клетки, като бели кръвни клетки и Т и В клетки.

Цитокините също сигнализират за конкретна цел, която тези клетки трябва да изпълнят. Цитокините и антителата са напълно различни, тъй като антителата са това, което е свързано с антигените, те позволяват на имунната система да идентифицира инвазията на чужди организми. Така може да се направи аналогия: цитокините са основният алармен сигнал за нашествениците, а антителата са скаути. Процесът на анализ на цитокини се нарича откриване на цитокини.

Главна информация

Цитокини [гръцки. kytos - съд, тук - клетка и kineo - преместване, индуциране] - голяма и разнообразна група от малки по размер (молекулно тегло от 8 до 80 kDa) протеинови медиатори - медиаторни молекули ("комуникационни протеини"), участващи в междуклетъчната сигнализация предимно в имунната система.

Цитокините включват фактор на туморна некроза, интерферони, редица интерлевкини и др. Цитокините, които се синтезират от лимфоцити и са регулатори на пролиферацията и диференциацията, по -специално на хематопоетичните клетки и клетките на имунната система, се наричат ​​лимфокини.

Всички клетки на имунната система имат определени функции и работят в ясно координирано взаимодействие, което се осигурява от специални биологично активни вещества - цитокини - регулатори на имунните реакции. Цитокините са специфични протеини, чрез които различни клетки на имунната система могат да обменят информация помежду си и да координират действията си.

Наборът и количеството цитокини, действащи върху рецепторите на клетъчната повърхност - "цитокиновата среда" - представляват матрица от взаимодействащи и често променящи се сигнали. Тези сигнали са сложни поради голямото разнообразие от цитокинови рецептори и поради факта, че всеки от цитокините може да активира или потисне няколко процеса, включително собствения си синтез и синтеза на други цитокини, както и образуването и появата на цитокинови рецептори върху клетъчната повърхност.

Междуклетъчната сигнализация в имунната система се осъществява чрез директно контактно взаимодействие на клетките или с помощта на медиатори на междуклетъчни взаимодействия. Изучаване на диференциацията на имунокомпетентни и хематопоетични клетки, както и механизмите на междуклетъчното взаимодействие, които образуват имунния отговор, голяма и разнообразна група от разтворими медиатори с протеинова природа - медиаторни молекули ("свързващи протеини"), участващи в междуклетъчната сигнализация - цитокини беше открит.

Хормоните обикновено се изключват от тази категория въз основа на тяхната ендокринна (а не паракринна или автокринна) природа на действие. (вж. Цитокини: механизми на предаване на хормонален сигнал). Заедно с хормоните и невротрансмитерите, те формират основата на езика на химическата сигнализация, чрез която морфогенезата и регенерацията на тъканите се регулират в многоклетъчен организъм.

Те играят централна роля в положителната и отрицателната регулация на имунния отговор. Към днешна дата повече от сто цитокини са открити и изследвани при хора в една или друга степен, както бе споменато по -горе, и има постоянни съобщения за откриването на нови. За някои са получени генно -инженерни аналози. Цитокините действат чрез активиране на цитокиновите рецептори.

А. Интерферони (IFN):

1. Естествено IFN (първо поколение):

2. Рекомбинантен IFN (второ поколение):

а) с кратко действие:

IFN a2b: интрон-А

IFN β: Avonex et al.

(пегилирани IFN): пегинтерферон

Б. Индуктори на интерферон (интерфероногени):

1... Синтетични- циклоферон, тилорон, дибазол и т.н.

2. Естествен- ридостин и др.

В. Интерлейкини : рекомбинантен интерлевкин-2 (ронколейкин, алдеслевкин, пролевкин, ) , рекомбинантен интерлевкин 1-бета (беталевкин).

Г. Колони-стимулиращи фактори (молграмостим и др.)

Пептидни препарати

Тимични пептидни препарати .

Пептидни съединения, произвеждани от тимусната жлеза стимулират узряването на Т-лимфоцитите(тимопоетини).

При първоначално понижени стойности, препарати от типични пептиди увеличават броя на Т-клетките и тяхната функционална активност.

Основателят на първото поколение тимиеви препарати в Русия беше Тактивин, който е комплекс от пептиди, извлечени от тимуса на говеда. Препаратите, съдържащи комплекс от тимични пептиди, също включват Тималин, Тимоптини други, както и на тези, съдържащи екстракти от тимус - Тимостимулин и Вилозен.

Пептидни препарати от говежди тимус тималин, тимостимулининжектирани интрамускулно, и тактивин, тимоптин- под кожата, главно с недостатъчен клетъчен имунитет:

С Т-имунодефицити,

Вирусни инфекции

За профилактика на инфекции с лъчева терапия и химиотерапия на тумори.

Клиничната ефикасност на тимичните препарати от първо поколение не подлежи на съмнение, но те имат един недостатък: те представляват неразделена смес от биологично активни пептиди, които е доста трудно да се стандартизират.

Напредъкът в областта на лекарствата от тимусен произход върви по линията на създаване на лекарства от второ и трето поколение - синтетични аналози на естествени тимусни хормони или фрагменти от тези хормони с биологична активност.

Съвременно лекарство Имунофан -хексапептид, синтетичен аналог на активния център на тимопоетин, се използва за имунодефицити и тумори. Лекарството стимулира образуването на IL-2 от имунокомпетентни клетки, повишава чувствителността на лимфоидните клетки към този лимфокин, намалява производството на TNF (фактор на туморна некроза), има регулаторен ефект върху производството на имунитетни медиатори (възпаление) и имуноглобулини.

Пептидни препарати за костен мозък

Миелопидниполучени от културата на клетки от костен мозък на бозайници (телета, прасета). Механизмът на действие на лекарството е свързан със стимулиране на пролиферацията и функционалната активност на В и Т клетки.

В организма се разглежда целта на това лекарство В-лимфоцити.В случай на нарушена имунна или хематопоеза, въвеждането на миелопид води до повишаване на общата митотична активност на клетките на костния мозък и посоката на тяхната диференциация към зрели В-лимфоцити.

Миелопидът се използва в комплексната терапия на състояния на вторичен имунодефицит с преобладаващо увреждане на хуморалната връзка на имунитета, за предотвратяване на инфекциозни усложнения след операция, травма, остеомиелит, за неспецифични белодробни заболявания, хронична пиодермия. Страничните ефекти на лекарството са замаяност, слабост, гадене, хиперемия и болезненост на мястото на инжектиране.

Всички лекарства от тази група са противопоказани при бременни жени, миелопид и имунофан са противопоказани при наличие на Rh-конфликт между майката и плода.

Имуноглобулинови препарати

Човешки имуноглобулини

а) Имуноглобулини за интрамускулно приложение

Неспецифични:човешки имуноглобулин нормален

Специфично:човешки имуноглобулин срещу хепатит В, човешки антистафилококов имуноглобулин, човешки тетанус имуноглобулин, човешки имуноглобулин срещу енцефалит, пренасян от кърлежи, човешки имуноглобулин срещу вируса на бяс и др.

б) Имуноглобулини за интравенозно приложение

Неспецифични:нормален човешки имуноглобулин за интравенозно приложение (габриглобин, имуновенин, интраглобин, хумаглобин)

Специфично:имуноглобулин срещу човешки хепатит В (неохепатект), пентаглобин (съдържа антибактериални IgM, IgG, IgA), имуноглобулин срещу цитомегаловирус (цитотект), човешки имуноглобулин срещу енцефалит, пренасян от кърлежи, антибесен IG и др.

в) Имуноглобулини за перорално приложение:имуноглобулинов комплексен препарат (CIP) за ентерално приложение при остри чревни инфекции; анти-ротавирусен имуноглобулин за перорално приложение.

Хетероложни имуноглобулини:

бяс имуноглобулин от конски серум, антигангренозен поливалентен конски серум и др.

Препарати от неспецифични имуноглобулини се използват за първични и вторични имунодефицити, препарати от специфични имуноглобулини - за подходящи инфекции (с терапевтични или профилактични цели).

Цитокини и препарати на тяхна основа

Регулирането на развития имунен отговор се извършва от цитокини - сложен комплекс от ендогенни имунорегулаторни молекули, които са в основата на създаването на голяма група както естествени, така и рекомбинантни имуномодулиращи лекарства.

Интерферони (IFN):

1. Естествено IFN (първо поколение):

Алфаферони: човешки левкоцитен IFN и др.

Бетаферони: човешки фибробласт IFN и други.

2. Рекомбинантен IFN (второ поколение):

а) с кратко действие:

IFN a2a: реаферон, виферон и др.

IFN a2b: интрон-А

IFN β: Avonex et al.

б) продължително действие(пегилирани IFN): пегинтерферон (IFN a2b + полиетилен гликол) и др.

Основната посока на действие на IFN лекарствата са Т-лимфоцитите (естествени клетки убийци и цитотоксични Т-лимфоцити).

Естествените интерферони се получават в културата на донорска кръв левкоцити (в културата на лимфобластоидни и други клетки) под въздействието на индукторния вирус.

Рекомбинантните интерферони се произвеждат по метода на генното инженерство - чрез култивиране на бактериални щамове, съдържащи в генетичния си апарат вграден рекомбинантен плазмид на гена на човешкия интерферон.

Интерфероните имат антивирусни, антитуморни и имуномодулиращи ефекти.

Като антивирусни средства, интерфероновите препарати са най-ефективни при лечението на херпесни очни заболявания (локално под формата на капки, субконюнктивално), херпес симплекс, локализиран върху кожата, лигавиците и гениталиите, херпес зостер (локално под формата на хидрогел). базиран мехлем), остър и хроничен вирусен хепатит В и С (парентерално, ректално в супозитории), за лечение и профилактика на грип и остри респираторни вирусни инфекции (интраназално под формата на капки). При HIV инфекция, рекомбинантните интерферонови препарати нормализират имунологичните параметри, намаляват тежестта на хода на заболяването в повече от 50% от случаите и причиняват намаляване на нивото на виремия и съдържанието на серумни маркери на заболяването. При СПИН се провежда комбинирана терапия с азидотимидин.

Антитуморният ефект на интерфероновите препарати е свързан с антипролиферативния ефект и стимулирането на активността на естествените клетки убийци. Като антинеопластични средства се използват IFN-алфа, IFN-алфа 2а, IFN-алфа-2b, IFN-алфа-n1, IFN-бета.

IFN-бета-lb се използва като имуномодулатор при множествена склероза.

Препаратите на интерферон причиняват подобно странични ефекти... Характеризира се с грипоподобен синдром; промени в централната нервна система: замаяност, замъглено зрение, объркване, депресия, безсъние, парестезия, тремор. От стомашно -чревния тракт: загуба на апетит, гадене; от страна на сърдечно -съдовата система са възможни симптоми на сърдечна недостатъчност; от отделителната система - протеинурия; от страна на хематопоетичната система - преходна левкопения. Може също да се появят обрив, сърбеж, алопеция, временна импотентност, кървене от носа.

Индуктори на интерферон (интерфероногени):

1. Синтетични - циклоферон, тилорон, полудан и др.

2. Естествено - ридостин и др.

Индукторите на интерферон са лекарства, които засилват синтеза на ендогенен интерферон. Тези лекарства имат няколко предимства пред рекомбинантните интерферони. Те нямат антигенна активност. Стимулираният синтез на ендогенен интерферон не причинява хиперинтерферонемия.

Тилорон(амиксин) се отнася до синтетични съединения с ниско молекулно тегло, е перорален индуктор на интерферон. Притежава широк спектър от антивирусна активност срещу ДНК и РНК вируси. Като антивирусно и имуномодулиращо средство се използва за профилактика и лечение на грип, остри респираторни вирусни инфекции, хепатит А, за лечение на вирусен хепатит, херпес симплекс (включително урогенитален) и херпес зостер, в комплексната терапия на хламидийни инфекции, невровирусни и инфекциозно-алергични заболявания, с вторични имунодефицити. Лекарството се понася добре. Възможни диспептични симптоми, краткотрайни студени тръпки, повишен общ тонус, което не изисква прекратяване на лекарството.

Полудане биосинтетичен полирибонуклеотиден комплекс от полиаденилова и полиуридилова киселина (в еквимоларни съотношения). Лекарството има изразен инхибиторен ефект върху вирусите на херпес симплекс. Използва се под формата на капки за очи и инжекции под конюнктивата. Лекарството се предписва на възрастни за лечение на вирусни очни заболявания: херпетичен и аденовирусен конюнктивит, кератоконюнктивит, кератит и кератоиридоциклит (кератоувеит), иридоциклит, хориоретинит, оптичен неврит.

Странични ефектисе срещат рядко и се проявяват с развитието на алергични реакции: сърбеж и усещане за чуждо тяло в окото.

Циклоферон- индуктор на интерферон с ниско молекулно тегло Има антивирусни, имуномодулиращи и противовъзпалителни ефекти. Циклоферонът е ефективен срещу вируси на енцефалит, пренасян от кърлежи, херпес, цитомегаловирус, ХИВ и др. Има антихламидиен ефект. Ефективен при системни заболявания на съединителната тъкан. Радиозащитният и противовъзпалителен ефект на лекарството е установен.

Арбидолсе предписват вътрешно за профилактика и лечение на грип и други остри респираторни вирусни инфекции, както и за херпесни заболявания.

Интерлейкини:

рекомбинантен IL-2 (алдеслевкин, пролевкин, ронколевкин ) , рекомбинантен IL-1 бета ( беталевкин).

За цитокинови препарати с естествен произход, съдържащи доста голям набор от цитокини на възпаление и първата фаза на имунния отговор, е характерен многостранен ефект върху човешкото тяло. Тези лекарства действат върху клетки, участващи в възпалението, регенерацията и имунния отговор.

Алдеслевкин- рекомбинантен аналог на IL-2. Има имуномодулиращ и антитуморен ефект. Активира клетъчния имунитет. Подобрява пролиферацията на Т-лимфоцити и IL-2-зависими клетъчни популации. Увеличава цитотоксичността на лимфоцитите и клетките убийци, които разпознават и унищожават туморните клетки. Подобрява производството на интерферон гама, TNF, IL-1. Използва се при рак на бъбреците.

Беталевкин- рекомбинантен човешки IL-1 бета. Стимулира левкопоезата и имунната защита. Прилага се подкожно или интравенозно при гнойни процеси с имунодефицит, при левкопения в резултат на химиотерапия, при тумори.

Ронколейкин- рекомбинантен препарат на интерлевкин-2 се прилага интравенозно за сепсис с имунодефицит, както и за рак на бъбреците.

Колони-стимулиращи фактори:

Молграмостим(Leukomax) е рекомбинантен препарат от човешки гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор. Стимулира левкопоезата, има имунотропна активност. Той засилва пролиферацията и диференциацията на прекурсорите, увеличава съдържанието на зрели клетки в периферната кръв, растежа на гранулоцити, моноцити, макрофаги. Увеличава функционалната активност на зрелите неутрофили, засилва фагоцитозата и окислителния метаболизъм, осигурява механизмите на фагоцитоза, повишава цитотоксичността срещу злокачествени клетки.

Филграстим(Neupogen) е рекомбинантен препарат от човешки гранулоцитен колониестимулиращ фактор. Филграстим регулира производството на неутрофили и навлизането им в кръвта от костния мозък.

Ленограстим- рекомбинантен препарат от човешки гранулоцитен колониестимулиращ фактор. Това е високо рафиниран протеин. Той е имуномодулатор и стимулатор на левкопоезата.

Синтетични имуностимуланти: левамизол, изопринозин полиоксидоний, галавит.

Левамизол(decaris), производно на имидазол, се използва като имуностимулатор, както и антихелминтно средство при аскаридоза. Имуностимулиращите свойства на левамизол са свързани с повишаване на активността на макрофагите и Т-лимфоцитите.

Левамизол се предписва перорално при повтарящи се херпесни инфекции, хроничен вирусен хепатит, автоимунни заболявания (ревматоиден артрит, системен лупус еритематозус, болест на Crohn). Лекарството се използва и при тумори на дебелото черво след хирургична, лъчева или медикаментозна терапия на тумори.

Изопринозин- препарат, съдържащ инозин. Стимулира активността на макрофагите, производството на интерлевкини, пролиферацията на Т-лимфоцити.

Назначете вътре за вирусни инфекции, хронични инфекции на дихателните и пикочните пътища, имунодефицит.

Полиоксидоний- синтетично водоразтворимо полимерно съединение. Лекарството има имуностимулиращ и детоксикиращ ефект, повишава имунната устойчивост на организма срещу локални и генерализирани инфекции. Полиоксидоний активира всички фактори на естествената резистентност: клетки от моноцитно-макрофагната система, неутрофили и естествени клетки убийци, повишавайки тяхната функционална активност с първоначално намалени темпове.

Галавит- производно на фталхидразид. Особеността на това лекарство се крие в наличието не само на имуномодулиращи, но и изразени противовъзпалителни свойства.

Лекарства от други фармакологични класове с имуностимулираща активност

1. Адаптогени и билкови препарати (фитопрепарати):препарати от ехинацея (имунна), елеутерокок, женшен, родиола роза и др.

2. Витамини:аскорбинова киселина (витамин С), токоферол ацетат (витамин Е), ретинол ацетат (витамин А) (вижте раздела "Витамини").

Препарати от ехинацеяимат имуностимулиращи и противовъзпалителни свойства. Когато се приемат през устата, тези лекарства повишават фагоцитната активност на макрофагите и неутрофилите, стимулират производството на интерлевкин-1, активността на Т-помощниците и диференциацията на В-лимфоцитите.

Препаратите от ехинацея се използват при имунодефицити и хронични възпалителни заболявания. В частност, имуненсе предписват перорално на капки за профилактика и лечение на остри респираторни инфекции, както и заедно с антибактериални средства за инфекции на кожата, дихателните и пикочните пътища.

Общи принципи на използването на имуностимуланти при пациенти със вторичен имунодефицит

Най -разумното използване на имуностимуланти изглежда е в случай на имунодефицити, проявяващи се с повишена инфекциозна заболеваемост. Основната цел на имуностимулиращите лекарства остават вторични имунодефицити, които се проявяват с чести повтарящи се, трудни за лечение инфекциозни и възпалителни заболявания от всяка локализация и всякаква етиология. В основата на всеки хроничен инфекциозен и възпалителен процес са промените в имунната система, които са една от причините за продължителността на този процес.

· Имуномодулаторите се предписват в комплексната терапия едновременно с антибиотици, противогъбични, антипротозойни или антивирусни средства.

· При провеждане на имунорехабилитационни мерки, по -специално при непълно възстановяване след остро инфекциозно заболяване, имуномодулаторите могат да се използват като монотерапия.

· Препоръчително е да се използват имуномодулатори на фона на имунологично наблюдение, което трябва да се извършва независимо от наличието или отсъствието на първоначални промени в имунната система.

· Имуномодулатори, действащи върху фагоцитната връзка на имунитета, могат да се предписват на пациенти както с идентифицирани, така и с неоткрити нарушения на имунния статус, т.е. основата за тяхното използване е клиничната картина.

Намаляване на който и да е параметър на имунитета, установено по време на имунодиагностично проучване при практически здрав човек, незадължителное основание за назначаване на имуномодулираща терапия.

Контролни въпроси:

1. Какво представляват имуностимулаторите, какви са показанията за имунотерапия, на какви видове се делят имунодефицитни състояния?

2. Класификация на имуномодулаторите според преференциалната селективност на действие?

3. Имуностимуланти с микробен произход и техните синтетични аналози, техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

4. Ендогенни имуностимуланти и техните синтетични аналози, техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

5. Препарати от пептиди на тимус и костен мозък, техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

6. Препарати от имуноглобулини и интерферони (IFN), техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

7. Препарати на индуктори на интерферон (интерфероногени), техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

8. Препарати на интерлевкини и колони-стимулиращи фактори, техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

9. Синтетични имуностимуланти, техните фармакологични свойства, индикации за употреба, противопоказания, странични ефекти?

10. Лекарства от други фармакологични класове с имуностимулираща активност и общи принципи за използване на имуностимуланти при пациенти с вторичен имунодефицит?