Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

L'essence de la méthode PCR. ADN polymérase

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode expérimentale de biologie moléculaire qui permet d'obtenir une augmentation significative de petites concentrations de certains fragments d'acide nucléique dans du matériel biologique. Ce processus d'augmentation du nombre de copies d'ADN est appelé amplification. La copie d'ADN pendant la PCR est réalisée par une enzyme spéciale - polymérase. L'ADN polymérase (Fig. 3) est une enzyme impliquée dans la réplication (amplification de l'ADN dans les organismes vivants) de l'ADN. Les enzymes de cette classe catalysent la polymérisation des désoxyribonucléotides le long de la chaîne nucléotidique de l'ADN, que l'enzyme "lit" et utilise comme matrice. Le type d'un nouveau nucléotide est déterminé par le principe de complémentarité avec la matrice à partir de laquelle la lecture est effectuée.

L'ADN polymérase ajoute des nucléotides libres à l'extrémité 3 "de la chaîne assemblée. Cela conduit à un allongement de la chaîne dans le sens 5"-3. Aucune des ADN polymérases connues n'est capable de créer une chaîne "à partir de zéro": elles sont seulement capable d'ajouter des nucléotides au groupe 3"-hydroxyle déjà existant. Pour cette raison, l'ADN polymérase a besoin apprêt- une courte séquence de nucléotides (généralement 20-25), complémentaires des sections terminales du gène étudié - à laquelle elle pourrait ajouter le premier nucléotide. Les amorces sont toujours composées de bases d'ADN et d'ARN, les deux premières bases étant toujours des bases d'ARN. Les amorces sont synthétisées par une autre enzyme - primase. Une autre enzyme est hélicase- nécessaire au déroulement de la double hélice d'ADN avec la formation d'une structure simple brin, qui assure la réplication des deux brins conformément au modèle semi-conservateur de réplication de l'ADN.

Certaines ADN polymérases ont également la capacité de corriger les erreurs dans le brin d'ADN nouvellement assemblé. Si une paire incorrecte de nucléotides est détectée, l'ADN polymérase revient en arrière d'une étape, supprime le mauvais nucléotide de la chaîne, puis insère le bon à sa place, après quoi la réplication se poursuit comme d'habitude.

Réalisation de PCR

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode d'amplification de l'ADN qui peut isoler et multiplier une certaine séquence d'ADN des milliards de fois en quelques heures. La possibilité d'obtenir un grand nombre de copies d'une région strictement définie du génome simplifie grandement l'étude d'un échantillon d'ADN existant.

Pour que la réaction en chaîne par polymérase ait lieu, un certain nombre de conditions doivent être remplies. Pour la PCR, dans le cas le plus simple, les composants suivants sont requis :

Une matrice d'ADN contenant la section d'ADN à amplifier.

Deux amorces complémentaires aux extrémités du fragment recherché. (Une paire d'oligonucléotides synthétisés artificiellement, généralement de 15 à 30 pb, identiques aux régions correspondantes de l'ADN cible. Ils jouent un rôle clé dans la formation des produits de réaction d'amplification. Des amorces correctement sélectionnées garantissent la spécificité et la sensibilité du test système.)

ADN polymérase thermostable. La polymérase utilisée dans la PCR doit rester active à haute température pendant une longue période, par conséquent, des enzymes isolées de thermophiles - Thermus aquaticus (Taq polymérase) et d'autres sont utilisées.

Désoxynucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ions Mg 2+ nécessaires au fonctionnement de la polymérase.

Une solution tampon qui fournit les conditions de réaction nécessaires - pH, force ionique de la solution. Contient des sels, de l'albumine sérique.

Pour éviter l'évaporation du mélange réactionnel, une huile à point d'ébullition élevé, telle que la vaseline, est ajoutée au tube à essai. Si un appareil avec un couvercle chauffant est utilisé, cela n'est pas nécessaire.

L'ajout de pyrophosphatase peut augmenter le rendement de la réaction PCR. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse du pyrophosphate, un sous-produit de l'addition de nucléotides triphosphates au brin d'ADN en croissance, en orthophosphate. Le pyrophosphate peut inhiber la réaction PCR.

Pour multiplier le nombre de copies de l'ADN d'origine, une réaction cyclique est nécessaire. En règle générale, chacun des cycles de PCR répétés séquentiellement se compose de trois étapes :

1. Dénaturation ou "fusion" de l'ADN. La matrice d'ADN double brin est chauffée à 94 - 96°C (ou 98°C si une polymérase particulièrement thermostable est utilisée) pendant 0,5 à 2 minutes pour permettre aux brins d'ADN de se séparer. Cette étape est appelée dénaturation car les liaisons hydrogène entre les deux brins d'ADN sont rompues. Parfois, avant le premier cycle (avant d'ajouter la polymérase), le mélange réactionnel est préchauffé pendant 2 à 5 minutes pour dénaturer complètement la matrice et les amorces. Cette approche est appelée démarrage à chaud, il permet de réduire la quantité de produits de réaction non spécifiques.

2. Recuit - liaison des amorces à l'ADN matrice. Une fois les brins séparés, la température est lentement abaissée pour permettre aux amorces de se lier à la matrice simple brin. La température de recuit dépend de la composition de l'apprêt et est généralement choisie entre 50 et 65 °C. Temps de scène - 20 - 60 secondes. Un mauvais choix de température de recuit conduit soit à une mauvaise liaison des amorces à la matrice (à température élevée), soit à une liaison au mauvais endroit et à l'apparition de produits non spécifiques (à basse température).

3. La synthèse (allongement de la chaîne). L'ADN polymérase réplique le brin matrice en utilisant l'amorce comme "graine". La polymérase démarre la synthèse du deuxième brin à partir de l'extrémité 3" de l'amorce, qui s'est liée à la matrice et se déplace le long de la matrice. La température d'élongation dépend de la polymérase. Les polymérases Taq et Pfu couramment utilisées sont les plus actives à 72 ° C. la longueur du fragment à amplifier En règle générale, le temps d'élongation est pris à une minute pour mille paires de bases Une fois tous les cycles terminés, une étape supplémentaire est souvent effectuée allongement final pour compléter tous les fragments simple brin. Cette étape dure 7 à 10 minutes.

Par la suite, les étapes de dénaturation, de recuit et d'élongation sont répétées plusieurs fois (30 fois ou plus). A chaque cycle, le nombre de copies synthétisées d'un fragment d'ADN double.

Toutes les réactions sont effectuées dans des tubes à essai immergés dans un thermostat. La modification du régime de température et son entretien sont effectués automatiquement.

Pour comprendre exactement comment l'amplification d'un certain segment d'ADN se produit pendant la PCR, il est nécessaire de comprendre clairement la position de toutes les amorces et leurs séquences complémentaires dans les chaînes amplifiables à chaque tour. Au premier tour, chacune des chaînes nouvellement synthétisées est beaucoup plus longue que la distance entre le groupe 3"-hydroxyle de son amorce et le nucléotide terminal de la séquence complémentaire de la seconde amorce. De telles chaînes sont appelées "modèles longs", il c'est sur eux que s'effectuera la synthèse.

Dans le deuxième tour, l'ADN double brin, constitué de brins similaires et nouvellement synthétisés (matrice longue), est à nouveau dénaturé puis recuit avec des amorces. Au cours de la synthèse dans ce cycle, des "modèles longs" sont à nouveau synthétisés, ainsi qu'un certain nombre de brins avec une amorce à une extrémité et avec une séquence complémentaire de la seconde amorce à l'autre ("modèles courts"). Au cours du troisième tour, tous les hétéroduplex formés précédemment sont simultanément dénaturés et recuits avec des amorces, puis répliqués. Dans les tours suivants, il y a de plus en plus de "matrices courtes", et au 30ème tour leur nombre est déjà 10 6 fois supérieur au nombre de chaînes initiales ou "matrices longues".

La quantité de produit de réaction spécifique (limitée par les amorces) augmente théoriquement proportionnellement à 2 n , où n est le nombre de cycles de réaction. En fait, l'efficacité de chaque cycle peut être inférieure à 100 %, donc en réalité :

où P est la quantité de produit, E est le rendement moyen du cycle.

Le nombre de copies d'ADN "longues" augmente également, mais de manière linéaire, de sorte qu'un fragment spécifique domine dans les produits de réaction. La croissance du produit requis est exponentiellement limitée par la quantité de réactifs, la présence d'inhibiteurs et la formation de sous-produits.

La PCR est une méthode très sensible, par conséquent, s'il y a même une quantité insignifiante d'ADN dans l'échantillon de test qui passe accidentellement d'un mélange réactionnel à un autre, des résultats faussement positifs peuvent être obtenus. Il est donc nécessaire de contrôler soigneusement toutes les solutions et tous les ustensiles utilisés pour la PCR.

Principes de base de la sélection des amorces.

Lors de la création d'un système de test PCR, l'une des tâches principales est la sélection correcte des amorces qui doivent répondre à un certain nombre de critères :

1. Les amorces doivent être spécifiques. Une attention particulière est portée aux extrémités 3 "des amorces, car c'est à partir d'elles que la Taq polymérase commence à compléter la chaîne d'ADN complémentaire. Si leur spécificité est insuffisante, des processus indésirables se produiront très probablement dans le tube à essai avec le mélange réactionnel , à savoir la synthèse d'ADN non spécifique (fragments courts ou longs). Il est visible en électrophorèse sous forme de bandes supplémentaires lourdes ou légères. Cela rend difficile l'évaluation des résultats de la réaction, car il est facile de confondre un produit d'amplification avec de l'ADN étranger synthétisé. Certaines amorces et dNTP sont consommés pour la synthèse d'ADN non spécifique, ce qui entraîne une perte de sensation importante.

2. Les amorces ne doivent pas former de dimères et de boucles, c'est-à-dire aucun double brin stable ne doit être formé en annelant les amorces à elles-mêmes ou les unes aux autres.

Ce qui vous permet de détecter dans le matériel biologique de petites quantités, plus précisément, de certains fragments de celui-ci, et de les multiplier plusieurs fois. Ils sont ensuite identifiés visuellement par électrophorèse sur gel. La réaction a été développée en 1983 par K. Mullis et incluse dans la liste des découvertes exceptionnelles de ces dernières années.

Quels sont les mécanismes de la PCR

Toute la technique est basée sur la capacité des acides nucléiques à s'auto-répliquer, qui dans ce cas est réalisée artificiellement en laboratoire. La reproduction de l'ADN ne peut commencer dans aucune région de la molécule, mais uniquement dans les régions avec une certaine séquence de nucléotides - fragments de départ. Pour que la réaction en chaîne par polymérase démarre, des amorces (ou des sondes d'ADN) sont nécessaires. Ce sont de courts fragments d'une chaîne d'ADN avec une séquence nucléotidique donnée. Ils sont complémentaires (c'est-à-dire correspondants) aux sites de départ

Bien sûr, pour créer des amorces, les scientifiques doivent étudier la séquence nucléotidique de celui impliqué dans la technique. Ce sont ces sondes ADN qui assurent la spécificité de la réaction et son initiation. ne fonctionnera pas si au moins une molécule de l'ADN souhaité n'est pas trouvée dans l'échantillon. En général, les amorces ci-dessus, un ensemble de nucléotides, une ADN polymérase résistante à la chaleur sont nécessaires pour que la réaction ait lieu. Cette dernière est une enzyme qui catalyse la synthèse de nouvelles molécules d'acide nucléique à partir de l'échantillon. Toutes ces substances, y compris le matériel biologique dans lequel il est nécessaire de détecter l'ADN, sont combinées dans un mélange réactionnel (solution). Il est placé dans un thermostat spécial qui effectue un chauffage et un refroidissement très rapides pendant un temps donné - un cycle. Il y en a généralement 30 à 50.

Comment se déroule cette réaction ?

Son essence est qu'au cours d'un cycle, les amorces sont attachées aux sections d'ADN souhaitées, après quoi elles sont doublées sous l'action de l'enzyme. Sur la base des brins d'ADN résultants, de nouveaux et de nouveaux fragments identiques de la molécule sont synthétisés dans les cycles suivants.

La réaction en chaîne par polymérase se déroule de manière séquentielle, ses étapes suivantes sont distinguées. La première se caractérise par un doublement de la quantité de produit lors de chaque cycle de chauffage et de refroidissement. Dans la deuxième étape, la réaction ralentit, car l'enzyme est endommagée et perd également son activité. De plus, les réserves de nucléotides et d'amorces sont épuisées. A la dernière étape - un plateau - les produits ne s'accumulent plus, puisque les réactifs sont épuisés.

Où est-il utilisé

Sans aucun doute, la réaction en chaîne par polymérase trouve l'application la plus large en médecine et en science. Il est utilisé en biologie générale et privée, en médecine vétérinaire, en pharmacie ou encore en écologie. De plus, dans ces derniers, ils le font pour surveiller la qualité des produits alimentaires et des objets environnementaux. La réaction en chaîne par polymérase est activement utilisée dans la pratique médico-légale pour confirmer la paternité et identifier une personne. En médecine légale, ainsi qu'en paléontologie, cette technique est souvent la seule issue, car généralement très peu d'ADN est disponible pour la recherche. Bien sûr, la méthode a trouvé une très large application en médecine pratique. Il est nécessaire dans des domaines tels que la génétique, les maladies infectieuses et oncologiques.

Cependant, à cette époque, cette idée restait non revendiquée. La réaction en chaîne par polymérase a été redécouverte en 1983 par Kary Mullis. Son objectif était de créer une méthode qui permettrait l'amplification de l'ADN lors de multiples duplications consécutives de la molécule d'ADN d'origine à l'aide de l'enzyme ADN polymérase. 7 ans après la publication de cette idée, en 1993, Mullis a reçu le prix Nobel pour celle-ci.

Au début de l'utilisation de la méthode, après chaque cycle de chauffage-refroidissement, de l'ADN polymérase devait être ajoutée au mélange réactionnel, car elle était rapidement inactivée à la température élevée nécessaire pour séparer les chaînes en hélice d'ADN. La procédure était très inefficace, nécessitant beaucoup de temps et d'enzymes. En 1986, il a été considérablement amélioré. Il a été proposé d'utiliser des ADN polymérases de bactéries thermophiles. Ces enzymes se sont avérées thermostables et ont pu résister à de nombreux cycles de réaction. Leur utilisation a permis de simplifier et d'automatiser la PCR. L'une des premières ADN polymérases thermostables a été isolée à partir de bactéries Thermus aquaticus et nommé Taq-polymérase. L'inconvénient de cette polymérase est que la probabilité d'introduire un nucléotide erroné est assez élevée, car cette enzyme est dépourvue de mécanismes de correction d'erreur (activité exonucléase 3" → 5"). Polymérases pfu et Pwo, isolés d'archaea, ont un tel mécanisme, leur utilisation réduit considérablement le nombre de mutations dans l'ADN, mais la vitesse de leur travail (processivité) est inférieure à celle de Taq. Utilise actuellement des mélanges Taq et pfu pour obtenir à la fois une vitesse de polymérisation élevée et une grande précision de copie.

Au moment de l'invention de la méthode, Mullis travaillait pour la société Cetus (en: Cetus Corporation), qui a breveté la méthode PCR. En 1992, Cetus a vendu les droits de la méthode et le brevet d'utilisation Taq-société de polymérase Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) pour 300 millions de dollars. Cependant, il s'est avéré que Taq-la polymérase a été caractérisée par le biochimiste russe Alexei Kaledin en 1980, à propos de laquelle la société Promega (Promega) a tenté de forcer Roche à renoncer aux droits exclusifs sur cette enzyme devant les tribunaux. Le brevet américain pour la méthode PCR a expiré en mars 2005.

Réalisation de PCR

La méthode est basée sur la copie sélective multiple d'une certaine région d'ADN à l'aide d'enzymes dans des conditions artificielles ( in vitro). Dans ce cas, seule la zone qui satisfait aux conditions spécifiées est copiée, et uniquement si elle est présente dans l'échantillon à l'étude. Contrairement à l'amplification de l'ADN dans les organismes vivants (réplication), des sections relativement courtes d'ADN sont amplifiées par PCR. Dans un processus de PCR conventionnel, la longueur des régions d'ADN répliquées n'est pas supérieure à 3000 paires de bases (3 kpb). À l'aide d'un mélange de différentes polymérases, avec l'utilisation d'additifs et dans certaines conditions, la longueur du fragment PCR peut atteindre 20 à 40 000 paires de bases. C'est encore beaucoup moins que la longueur de l'ADN chromosomique d'une cellule eucaryote. Par exemple, le génome humain est long d'environ 3 milliards de paires de bases.

Composants de réaction

Pour la PCR, dans le cas le plus simple, les composants suivants sont requis :

modèle d'ADN, qui contient la section d'ADN qui doit être amplifiée.
Deux amorces, complémentaires aux extrémités opposées de différents brins du fragment d'ADN souhaité.
thermostable ADN polymérase est une enzyme qui catalyse la polymérisation de l'ADN. La polymérase à utiliser en PCR doit rester active à haute température pendant une longue période, par conséquent, des enzymes isolées des thermophiles sont utilisées - Thermus aquaticus(Taq polymérase), Pyrocoque furiosus(Pfu polymérase), Pyrococcus woesei(Pwo-polymérase) et autres.
Désoxynucléosides triphosphates(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ions Mg 2+ nécessaires au fonctionnement de la polymérase.
solution tampon, fournissant les conditions de réaction nécessaires - pH, force ionique de la solution. Contient des sels, albumine de sérum bovin.

Pour éviter l'évaporation du mélange réactionnel, une huile à point d'ébullition élevé, telle que la vaseline, est ajoutée au tube à essai. Si un cycleur à couvercle chauffant est utilisé, cela n'est pas nécessaire.

Amorces

La spécificité de la PCR repose sur la formation de complexes complémentaires entre la matrice et les amorces, de courts oligonucléotides synthétiques de 18 à 30 bases de long. Chacune des amorces est complémentaire d'une des chaînes de la matrice double brin et limite le début et la fin de la région amplifiée.

Après hybridation de la matrice avec l'amorce (annealing), cette dernière sert d'amorce pour l'ADN polymérase dans la synthèse du brin complémentaire de la matrice (voir).

La caractéristique la plus importante des amorces est le point de fusion (Tm) du complexe amorce-matrice. Tm est la température à laquelle la moitié de l'ADN matrice forme un complexe avec l'amorce oligonucléotidique. Le point de fusion peut être approximativement déterminé par la formule , où n X est le nombre de nucléotides X dans l'amorce. Si la longueur et la composition nucléotidique de l'amorce ou la température d'hybridation sont mal choisies, la formation de complexes partiellement complémentaires avec d'autres régions de l'ADN matrice est possible, ce qui peut conduire à l'apparition de produits non spécifiques. La limite supérieure de la température de fusion est limitée par la température optimale d'action de la polymérase, dont l'activité chute à des températures supérieures à 80 °C.

Lors du choix des amorces, il est souhaitable de respecter les critères suivants:

amplificateur

Riz. un: Cycleur PCR

La PCR est réalisée dans un amplificateur - un appareil qui assure le refroidissement et le chauffage périodiques des tubes à essai, généralement avec une précision d'au moins 0,1 ° C. Les cycleurs modernes vous permettent de définir des programmes complexes, y compris la possibilité de "démarrage à chaud", Touchdown PCR (voir ci-dessous) et le stockage ultérieur des molécules amplifiées à 4 °C. Pour la PCR en temps réel, des appareils équipés d'un détecteur fluorescent sont produits. Les instruments sont également disponibles avec un couvercle automatique et un compartiment pour microplaques, ce qui leur permet d'être intégrés dans des systèmes automatisés.

Progression de la réaction

Photographie d'un gel contenant de l'ADN marqueur (1) et des produits de réaction PCR (2,3). Les nombres indiquent la longueur des fragments d'ADN en paires de nucléotides.

En règle générale, lors de la réalisation d'une PCR, 20 à 35 cycles sont effectués, chacun comprenant trois étapes (Fig. 2).

Dénaturation

La matrice d'ADN double brin est chauffée à 94-96°C (ou 98°C si une polymérase particulièrement thermostable est utilisée) pendant 0,5 à 2 minutes pour permettre aux brins d'ADN de se séparer. Cette étape s'appelle dénaturation parce que les liaisons hydrogène entre les deux brins d'ADN sont rompues. Parfois, avant le premier cycle (avant d'ajouter la polymérase), le mélange réactionnel est préchauffé pendant 2 à 5 min. pour une dénaturation complète de la matrice et des amorces. Une telle approche est appelée démarrage à chaud, il permet de réduire la quantité de produits de réaction non spécifiques.

Recuit

Lorsque les brins sont séparés, la température est abaissée pour permettre aux amorces de se lier à la matrice simple brin. Cette étape s'appelle recuit. La température de recuit dépend de la composition des amorces et est généralement choisie à 4-5°C en dessous de leur point de fusion. Temps de scène - 0,5-2 min. Un choix incorrect de la température de recuit conduit soit à une mauvaise liaison des amorces à la matrice (à température élevée), soit à une liaison au mauvais endroit et à l'apparition de produits non spécifiques (à basse température).

Élongation

Variétés de PCR

PCR "nichée" (Nested PCR (eng.)) - est utilisée pour réduire le nombre de sous-produits de la réaction. Utiliser deux paires d'amorces et effectuer deux réactions consécutives. La deuxième paire d'amorces amplifie la région d'ADN dans le produit de la première réaction.
PCR "inversée" (Inverse PCR (eng.)) - est utilisée si seule une petite zone est connue dans la séquence souhaitée. Cette méthode est particulièrement utile lorsqu'il est nécessaire de déterminer des séquences voisines après l'insertion d'ADN dans le génome. Pour la mise en œuvre de la PCR inversée, une série de coupes d'ADN avec des enzymes de restriction est réalisée, suivie de la connexion de fragments (ligation). En conséquence, des fragments connus se trouvent aux deux extrémités de la région inconnue, après quoi la PCR peut être effectuée comme d'habitude.
La PCR de transcription inverse (RT-PCR) est utilisée pour amplifier, isoler ou identifier une séquence connue à partir d'une bibliothèque d'ARN. Avant la PCR conventionnelle, une molécule d'ADN simple brin est synthétisée sur la matrice d'ARNm à l'aide de la reversetase et un ADNc simple brin est obtenu, qui est utilisé comme matrice pour la PCR. Cette méthode détermine souvent où et quand ces gènes sont exprimés.
PCR asymétrique. PCR asymétrique) - est réalisée lorsqu'il est nécessaire d'amplifier principalement l'une des chaînes de l'ADN d'origine. Utilisé dans certaines techniques d'analyse de séquençage et d'hybridation. La PCR est réalisée comme d'habitude, sauf que l'une des amorces est prise en large excès.
La PCR quantitative (Q-PCR) est utilisée pour mesurer rapidement la quantité d'ADN, d'ADNc ou d'ARN spécifique dans un échantillon.
PCR quantitative en temps réel - cette méthode utilise des réactifs marqués par fluorescence pour mesurer avec précision la quantité de produit de réaction à mesure qu'il s'accumule.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - en utilisant cette méthode, l'influence de la liaison non spécifique des amorces sur la formation du produit est réduite. Les premiers cycles sont effectués à une température supérieure à la température de recuit, puis tous les quelques cycles la température est réduite. A une certaine température, le système traversera la bande de spécificité d'amorce optimale pour l'ADN.
Méthode des colonies moléculaires (PCR en gel) Colonie de Polony-PCR) - le gel d'acrylamide est polymérisé avec tous les composants PCR sur la surface et la PCR est effectuée. Aux points contenant l'ADN analysé, l'amplification se produit avec la formation de colonies moléculaires.
PCR avec amplification rapide des extrémités d'ADNc Amplification rapide des extrémités d'ADNc, RACE-PCR )
PCR de fragments longs PCR longue portée) - modification de la PCR pour l'amplification de segments d'ADN étendus (10 000 bases ou plus). Deux polymérases sont utilisées, dont l'une est une polymérase Taq à haute processivité (c'est-à-dire capable de synthétiser une longue chaîne d'ADN en un seul passage), et la seconde est une ADN polymérase à activité endonucléase 3'-5'. La deuxième polymérase est nécessaire pour corriger les erreurs introduites par la première.
RAPD-PCR Amplification aléatoire de l'ADN polymorphe PCR , PCR avec amplification aléatoire d'ADN polymorphe - est utilisé lorsqu'il est nécessaire de distinguer des organismes dont la séquence génétique est proche, par exemple différentes variétés de plantes cultivées, des races de chiens ou des micro-organismes étroitement apparentés. Cette méthode utilise généralement une seule petite amorce (20-25 pb). Cette amorce sera partiellement complémentaire des régions d'ADN aléatoires des organismes à l'étude. En sélectionnant les conditions (longueur d'amorce, composition d'amorce, température, etc.), il est possible d'obtenir une différence satisfaisante dans le modèle de PCR pour deux organismes.

Si la séquence nucléotidique de la matrice est partiellement connue ou pas connue du tout, on peut utiliser amorces dégénérées, dont la séquence contient des positions dégénérées, qui peuvent contenir n'importe quelles bases. Par exemple, la séquence d'amorces pourrait être : ...ATH... où H est A, T ou C.

Application de la PCR

La PCR est utilisée dans de nombreux domaines pour l'analyse et dans les expériences scientifiques.

Criminalistique

La PCR est utilisée pour comparer les soi-disant "empreintes génétiques". Un échantillon de matériel génétique provenant de la scène du crime est nécessaire - sang, salive, sperme, cheveux, etc. Il est comparé au matériel génétique du suspect. Une très petite quantité d'ADN suffit, théoriquement - une copie. L'ADN est coupé en fragments, puis amplifié par PCR. Les fragments sont séparés par électrophorèse d'ADN. L'image résultante de l'arrangement des bandes d'ADN est appelée empreinte génétique(Anglais) empreinte génétique).

Etablir la paternité

Riz. 3: Résultats d'électrophorèse de fragments d'ADN amplifiés par PCR. (1) Père. (2) Enfant. (3) Mère. L'enfant a hérité de certaines caractéristiques de l'empreinte génétique des deux parents, ce qui a donné une nouvelle empreinte unique.

Bien que les "empreintes génétiques" soient uniques (sauf dans le cas de vrais jumeaux), les liens familiaux peuvent toujours être établis en faisant plusieurs de ces empreintes (Fig. 3). La même méthode peut être appliquée, avec de légères modifications, pour établir des relations évolutives entre les organismes.

Diagnostic médical

La PCR permet d'accélérer et de faciliter considérablement le diagnostic des maladies héréditaires et virales. Le gène souhaité est amplifié par PCR à l'aide d'amorces appropriées, puis séquencé pour déterminer les mutations. Les infections virales peuvent être détectées immédiatement après l'infection, des semaines ou des mois avant l'apparition des symptômes de la maladie.

Médecine personnalisée

On sait que la plupart des médicaments ne fonctionnent pas sur tous les patients auxquels ils sont destinés, mais seulement sur 30 à 70 % d'entre eux. De plus, de nombreux médicaments sont toxiques ou allergènes pour certains patients. Cela s'explique en partie par des différences individuelles dans la sensibilité et le métabolisme des médicaments et de leurs dérivés. Ces différences sont déterminées au niveau génétique. Par exemple, chez un patient, un certain cytochrome (une protéine hépatique responsable du métabolisme des substances étrangères) peut être plus actif, chez un autre - moins. Afin de déterminer le type de cytochrome d'un patient donné, il est proposé d'effectuer une analyse PCR avant d'utiliser le médicament. Cette analyse est appelée génotypage préliminaire. génotypage prospectif).

Clonage de gènes

Le clonage de gènes (à ne pas confondre avec le clonage d'organismes) est le processus d'isolement de gènes et, à la suite de manipulations génétiques, d'obtention d'une grande quantité du produit d'un gène donné. La PCR est utilisée pour amplifier le gène, qui est ensuite inséré dans vecteur- un fragment d'ADN qui transfère un gène étranger dans le même organisme ou dans un autre organisme propice à la culture. Comme vecteurs, par exemple, des plasmides ou de l'ADN viral sont utilisés. L'insertion de gènes dans un organisme étranger est généralement utilisée pour obtenir un produit de ce gène - ARN ou, le plus souvent, une protéine. De cette manière, de nombreuses protéines sont obtenues en quantités industrielles pour une utilisation en agriculture, en médecine, etc.

Riz. 4: Clonage de gène à l'aide d'un plasmide. .
(1) ADN chromosomique de l'organisme A. (2) PCR. (3) Copies multiples du gène de l'organisme A. (4) Insertion du gène dans un plasmide. (5) Plasmide avec le gène de l'organisme A. (6) Introduction du plasmide dans l'organisme B. (7) Multiplication du nombre de copies du gène de l'organisme A dans l'organisme B.

séquençage ADN

Dans la méthode de séquençage à l'aide d'un marqueur fluorescent ou d'un isotope radioactif des didésoxynucléotides, la PCR fait partie intégrante, puisque c'est lors de la polymérisation que des dérivés de nucléotides marqués avec un marqueur fluorescent ou radioactif sont insérés dans la chaîne d'ADN. Cela arrête la réaction, permettant de déterminer les positions de nucléotides spécifiques après séparation des brins synthétisés dans le gel.

Mutagenèse

Actuellement, la PCR est devenue la principale méthode de mutagenèse. L'utilisation de la PCR a permis de simplifier et d'accélérer la procédure de mutagenèse, ainsi que de la rendre plus fiable et reproductible.

1. Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

2. Principe de la méthode de réaction en chaîne par polymérase

2.1 Présence de plusieurs composants dans le mélange réactionnel

2.2 Cycle de température

2.3 Principes de base de la sélection des amorces

2.4 Effet plateau

3. Étapes de réglage de la PCR

3.2 Amplification

3.4.1 Contrôles positifs

3.4.2 Contrôles internes

4.1 Analyse qualitative

4.1.2 Détection des molécules d'ARN

3.1 Préparation des échantillons de matériel biologique

Différentes techniques sont utilisées pour l'extraction de l'ADN, selon les tâches. Leur essence réside dans l'extraction (extraction) de l'ADN d'un produit biologique et l'élimination ou la neutralisation des impuretés étrangères pour obtenir une préparation d'ADN d'une pureté adaptée à la PCR.

La méthode d'obtention d'une préparation d'ADN pur, décrite par Marmur, est considérée comme standard et est déjà devenue classique. Il comprend une protéolyse enzymatique suivie d'une déprotéinisation et d'une reprécipitation de l'ADN avec de l'alcool. Cette méthode permet d'obtenir une préparation d'ADN pur. Cependant, il est assez laborieux et implique de travailler avec des substances aussi agressives et piquantes que le phénol et le chloroforme.

L'une des méthodes actuellement populaires est la méthode d'extraction d'ADN proposée par Boom et al. Cette méthode est basée sur l'utilisation d'un agent chaotropique fort, le thiocyanate de guanidine (GuSCN), pour la lyse cellulaire, et la sorption ultérieure de l'ADN sur un support (billes de verre, terre de diatomées, lait de verre, etc.). Après les lavages, l'ADN reste dans l'échantillon adsorbé sur le support, d'où il peut être facilement éliminé à l'aide d'un tampon d'élution. La méthode est pratique, technologiquement avancée et adaptée à la préparation d'échantillons pour l'amplification. Cependant, des pertes d'ADN sont possibles du fait de la sorption irréversible sur le support, ainsi que lors de nombreux lavages. Ceci est particulièrement important lorsque vous travaillez avec de petites quantités d'ADN dans l'échantillon. De plus, même des traces de GuSCN peuvent inhiber la PCR. Par conséquent, lors de l'utilisation de cette méthode, le choix correct du sorbant et le respect attentif des nuances technologiques sont très importants.

Un autre groupe de méthodes de préparation d'échantillons repose sur l'utilisation d'échangeurs d'ions de type Chilex qui, contrairement au verre, n'adsorbent pas l'ADN, mais inversement, les impuretés qui interfèrent avec la réaction. En règle générale, cette technologie comprend deux étapes : l'ébullition de l'échantillon et l'adsorption des impuretés sur un échangeur d'ions. La méthode est extrêmement attrayante en raison de sa simplicité d'exécution. Dans la plupart des cas, il convient au travail avec du matériel clinique. Malheureusement, il arrive parfois que des échantillons contiennent des impuretés qui ne peuvent pas être éliminées à l'aide d'échangeurs d'ions. De plus, certains micro-organismes ne peuvent pas être détruits par simple ébullition. Dans ces cas, il est nécessaire d'introduire des étapes supplémentaires de traitement des échantillons.

Ainsi, le choix de la méthode de préparation de l'échantillon doit être traité avec une compréhension des objectifs des analyses prévues.

3.2 Amplification

Pour réaliser la réaction d'amplification, il est nécessaire de préparer le mélange réactionnel et d'y ajouter l'échantillon d'ADN analysé. Dans ce cas, il est important de prendre en compte certaines caractéristiques du recuit d'amorce. Le fait est qu'en règle générale, dans l'échantillon biologique analysé, il existe diverses molécules d'ADN, avec lesquelles les amorces utilisées dans la réaction ont une homologie partielle et, dans certains cas, significative. De plus, les amorces peuvent s'hybrider les unes aux autres pour former des dimères d'amorces. Les deux conduisent à une consommation importante d'amorces pour la synthèse de produits de réaction secondaires (non spécifiques) et, par conséquent, réduisent considérablement la sensibilité du système. Cela rend difficile ou impossible la lecture des résultats de la réaction pendant l'électrophorèse.

3.3 Évaluation des résultats de réaction

Afin d'évaluer correctement les résultats de la PCR, il est important de comprendre que cette méthode n'est pas quantitative. Théoriquement, les produits d'amplification de molécules d'ADN cibles uniques peuvent être détectés par électrophorèse déjà après 30 à 35 cycles. Cependant, en pratique, cela ne se fait que dans les cas où la réaction a lieu dans des conditions proches de l'idéal, ce qui n'est pas souvent rencontré dans la vie. Le degré de pureté de la préparation d'ADN a une influence particulièrement grande sur l'efficacité de l'amplification ; la présence de certains inhibiteurs dans le mélange réactionnel, qui dans certains cas peuvent être extrêmement difficiles à éliminer. Parfois, en raison de leur présence, il n'est pas possible d'amplifier même des dizaines de milliers de molécules d'ADN cibles. Ainsi, il n'y a souvent pas de relation directe entre la quantité initiale d'ADN cible et la quantité finale de produits d'amplification.

3.3.1 Méthode d'électrophorèse horizontale

Diverses méthodes sont utilisées pour visualiser les résultats de l'amplification. La plus courante aujourd'hui est la méthode d'électrophorèse, basée sur la séparation des molécules d'ADN par taille. Pour ce faire, une plaque de gel d'agarose est préparée, qui est de l'agarose congelé après fusion dans un tampon d'électrophorèse à une concentration de 1,5 à 2,5% avec l'ajout d'un colorant ADN spécial, par exemple le bromure d'éthidium. L'agarose congelé forme un réseau spatial. Lors du versement à l'aide de peignes, des puits spéciaux sont formés dans le gel, dans lesquels des produits d'amplification sont ensuite ajoutés. La plaque de gel est placée dans un appareil d'électrophorèse sur gel horizontal et une source de tension constante est connectée. L'ADN chargé négativement commence à se déplacer dans le gel du moins au plus. Dans le même temps, les molécules d'ADN plus courtes se déplacent plus rapidement que les longues. La vitesse de déplacement de l'ADN dans le gel est affectée par la concentration d'agarose, l'intensité du champ électrique, la température, la composition du tampon d'électrophorèse et, dans une moindre mesure, la composition GC de l'ADN. Toutes les molécules de même taille se déplacent à la même vitesse. Le colorant est intégré (intercalé) dans des groupes plans dans des molécules d'ADN. Après la fin de l'électrophorèse, qui dure de 10 minutes à 1 heure, le gel est placé sur le filtre d'un transilluminateur émettant de la lumière dans l'ultraviolet (254 - 310 nm). L'énergie UV absorbée par l'ADN à 260 nm est transférée au colorant, provoquant sa fluorescence dans la région rouge-orange du spectre visible (590 nm).

La brillance des bandes des produits d'amplification peut être différente. Cependant, cela ne peut pas être lié à la quantité initiale d'ADN cible dans l'échantillon.

3.3.2 Méthode d'électrophorèse verticale

La méthode d'électrophorèse verticale est fondamentalement similaire à l'électrophorèse horizontale. Leur différence réside dans le fait que dans ce cas, des gels de polyacrylamide sont utilisés à la place de l'agarose. Elle est réalisée dans une chambre spéciale pour l'électrophorèse verticale. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide a une résolution plus élevée que l'électrophorèse sur agarose et permet de distinguer des molécules d'ADN de différentes tailles avec une précision d'un nucléotide. La préparation du gel de polyacrylamide est un peu plus compliquée que celle de l'agarose. De plus, l'acrylamide est une substance toxique. Comme il est rarement nécessaire de déterminer la taille du produit d'amplification avec une précision de 1 nucléotide, la méthode d'électrophorèse horizontale est utilisée dans les travaux de routine.

3.4 Suivi de l'avancement de la réaction d'amplification

3.4.1 Contrôles positifs

Comme "contrôle positif", utilisez la préparation d'ADN du micro-organisme souhaité. Les amplicons non spécifiques diffèrent en taille des amplicons générés par amplification avec une préparation d'ADN témoin. La taille des produits non spécifiques peut être plus grande ou plus petite que le contrôle positif. Dans le pire des cas, ces dimensions peuvent coïncider et sont lues en électrophorèse comme positives.

Pour contrôler la spécificité du produit d'amplification résultant, des sondes d'hybridation (régions d'ADN situées dans la séquence amplifiable) marquées avec des marqueurs enzymatiques ou des isotopes radioactifs et interagissant avec l'ADN selon les mêmes principes que les amorces peuvent être utilisées. Cela complique et allonge considérablement l'analyse, et son coût augmente considérablement.

3.4.2 Contrôles internes

Il est nécessaire de contrôler la progression de l'amplification dans chaque tube avec le mélange réactionnel. A cet effet, un "contrôle interne" supplémentaire est utilisé. Il s'agit de toute préparation d'ADN qui n'est pas similaire à l'ADN du micro-organisme recherché. Si le contrôle interne est ajouté au mélange réactionnel, il deviendra alors la même cible pour l'annelage de l'amorce que l'ADN chromosomique de l'agent infectieux souhaité. La taille du produit d'amplification de contrôle interne est choisie de sorte qu'elle soit 2 fois ou plus plus grande que les amplicons générés à partir de l'amplification de l'ADN cible du micro-organisme. En conséquence, si l'ADN du contrôle interne est introduit dans le mélange réactionnel avec l'échantillon à tester, alors quelle que soit la présence d'un micro-organisme dans l'échantillon biologique, le contrôle interne provoquera la formation d'amplicons spécifiques, mais beaucoup plus longtemps (plus lourds) que l'amplicon du micro-organisme. La présence d'amplicons lourds dans le mélange réactionnel indiquera le déroulement normal de la réaction d'amplification et l'absence d'inhibiteurs. Si les amplicons de la taille requise ne se sont pas formés, mais que les amplicons de contrôle interne ne se sont pas non plus formés, on peut en conclure que l'échantillon analysé contient des impuretés indésirables qui doivent être éliminées, mais pas l'absence de l'ADN souhaité.

Malheureusement, malgré tout l'attrait de cette approche, elle présente un défaut important. Si l'ADN requis est présent dans le mélange réactionnel, l'efficacité de son amplification diminue fortement en raison de la compétition avec le contrôle interne pour les amorces. Ceci est particulièrement important à de faibles concentrations d'ADN dans l'échantillon de test, ce qui peut conduire à des résultats faussement négatifs.

Néanmoins, à condition que le problème de compétition pour les amorces soit résolu, cette méthode de contrôle de l'efficacité de l'amplification sera certainement très utile.

4. Méthodes basées sur la réaction en chaîne par polymérase

4.1 Analyse qualitative

La méthode classique de mise en place de la PCR, dont les principes ont été exposés ci-dessus, a été développée dans certaines modifications visant à surmonter les limitations de la PCR et à augmenter l'efficacité de la réaction.

4.1.1 Comment configurer la PCR à l'aide du "démarrage à chaud"

Pour réduire le risque de formation de produits non spécifiques de la réaction d'amplification, une approche appelée "démarrage à chaud" est utilisée. Son essence est d'empêcher la possibilité de démarrer la réaction jusqu'à ce que les conditions dans le tube soient atteintes pour assurer un recuit spécifique du amorces.

Le fait est que, selon la composition et la taille des HC, les amorces ont une certaine température de fusion (Tm). Si la température du système dépasse Tm, l'amorce est incapable d'adhérer au brin d'ADN et se dénature. Dans des conditions optimales, c'est-à-dire température de recuit proche de la température de fusion, l'amorce ne forme une molécule double brin que si elle est parfaitement complémentaire et assure ainsi la spécificité de la réaction.

Il existe différentes options pour mettre en œuvre un "démarrage à chaud":

Introduire la Taq polymérase dans le mélange réactionnel lors du premier cycle après avoir chauffé le tube à la température de dénaturation.

Séparation des ingrédients du mélange réactionnel par une couche de paraffine en couches (amorces dans la partie inférieure, polymérase Taq et ADN cible dans la partie supérieure), qui sont mélangées lorsque la paraffine est fondue (~ 65-75 0 С).

Utilisation d'anticorps monoclonaux contre la polymérase Taq. L'enzyme liée par les anticorps monoclonaux ne devient active qu'après la première étape de dénaturation, lorsque les anticorps monoclonaux dénaturent de manière irréversible et libèrent les sites actifs de la Taq polymérase.

Dans tous ces cas, même si un recuit non spécifique s'est produit avant le début du cyclage thermique, l'allongement ne se produit pas et les complexes amorce-ADN sont dénaturés lors du chauffage, de sorte qu'aucun produit non spécifique n'est formé. Par la suite, la température dans le tube ne descend pas en dessous du point de fusion, ce qui assure la formation d'un produit d'amplification spécifique.

4.1.2 Détection des molécules d'ARN

La possibilité d'utiliser l'ARN comme cible pour la PCR élargit considérablement la gamme d'applications de cette méthode. Par exemple, les génomes de nombreux virus (hépatite C, virus de la grippe, picornavirus, etc.) sont représentés par de l'ARN. Dans le même temps, il n'y a pas de phase intermédiaire de transformation en ADN dans leur cycle de vie. Pour détecter l'ARN, il doit d'abord être converti sous forme d'ADN. Pour cela, on utilise la transcriptase inverse, qui est isolée à partir de deux virus différents : le virus de la myéloblastose aviaire et le virus de la leucémie murine de Moloney. L'utilisation de ces enzymes est associée à certaines difficultés. Tout d'abord, ils sont thermolabiles et peuvent donc être utilisés à une température ne dépassant pas 42 ° C. Puisqu'à cette température les molécules d'ARN forment facilement des structures secondaires, l'efficacité de la réaction diminue nettement et, selon diverses estimations, est d'environ 5%. On cherche à contourner cet inconvénient en utilisant comme reverse transcriptase une polymérase thermostable obtenue à partir du microorganisme thermophile Thermus Thermophilus, qui présente une activité transcriptase en présence de Mn 2+ . C'est la seule enzyme connue capable de présenter à la fois une activité polymérase et transcriptase.

Pour effectuer la réaction de transcription inverse, le mélange réactionnel, ainsi que dans la PCR, doit contenir des amorces comme graine et un mélange de 4 dNTP comme matériau de construction.

Après la réaction de transcription inverse, les molécules d'ADNc résultantes peuvent servir de cible pour la PCR.

5. Organisation du processus technologique de mise en PCR

La sensibilité potentiellement élevée de la réaction en chaîne par polymérase rend absolument nécessaire une conception particulièrement soignée du laboratoire PCR. Cela est dû au problème le plus aigu de la méthode - la contamination.

Contamination - pénétration de l'environnement externe dans le mélange réactionnel de molécules d'ADN spécifiques qui peuvent servir de cibles dans la réaction d'amplification et donner des résultats faussement positifs.

Il existe plusieurs façons de faire face à ce phénomène désagréable. L'un d'eux est l'utilisation de l'enzyme N-uracile glycosylase (UG). Cette méthode est basée sur la capacité de l'UG à cliver les molécules d'ADN avec de l'uracile intégré. La réaction d'amplification est réalisée à l'aide d'un mélange de dNTP dans lequel le dTTP est remplacé par de l'uracile, et après cyclage thermique, tous les amplicons formés dans le tube contiendront de l'uracile. Si HC est ajouté au mélange réactionnel avant l'amplification, les amplicons qui pénètrent dans le mélange réactionnel seront détruits, tandis que l'ADN natif restera intact et servira ensuite de cible pour l'amplification.

Ainsi, cette méthode n'élimine que dans une certaine mesure la source de contamination et ne garantit pas contre les résultats faussement positifs.

Une autre façon de traiter les résultats de la contamination est une réduction significative du nombre de cycles de réaction (jusqu'à 25-30 cycles). Mais même avec cette approche, le risque d'obtenir des résultats faussement positifs est élevé, car dans ce cas, en l'absence d'inhibiteurs, il est facile d'obtenir un produit d'amplification dû à une contamination.

Ainsi, malgré les bénéfices des mesures de pré-amplification visant à inactiver les molécules d'ADN qui provoquent des résultats faussement positifs, le remède le plus radical est une organisation bien pensée du laboratoire.

Conclusion

La méthode PCR est actuellement la plus largement utilisée comme méthode de diagnostic de diverses maladies infectieuses. La PCR vous permet d'identifier l'étiologie de l'infection, même si l'échantillon prélevé pour analyse ne contient que quelques molécules d'ADN de l'agent pathogène. La PCR est largement utilisée dans le diagnostic précoce des infections à VIH, des hépatites virales, etc. A ce jour, il n'existe pratiquement aucun agent infectieux qui ne puisse être détecté par PCR.

Récemment, une méthode fiable, hautement sensible et rapide pour diagnostiquer diverses maladies infectieuses humaines a été développée. Cette méthode est appelée "analyse PCR". Qu'est-ce que c'est, quelle est son essence, quels micro-organismes il peut révéler et comment le prendre correctement, nous le dirons dans notre article.

Historique de la découverte

En outre, les méthodes PCR sont utilisées dans le diagnostic du cancer.

Avantages de la méthode

Le diagnostic PCR présente plusieurs avantages :

Haute sensibilité. Même en présence de seulement quelques molécules d'ADN de micro-organisme, l'analyse par PCR détermine la présence d'une infection. La méthode aidera avec les maladies chroniques et latentes. Souvent, dans de tels cas, le micro-organisme est autrement non cultivé.
Tout matériau convient à la recherche, par exemple la salive, le sang, les sécrétions génitales, les cheveux, les cellules épithéliales. Le plus courant est un test sanguin et un frottis urogénital pour PCR.
La culture à long terme des cultures n'est pas nécessaire. Le processus de diagnostic automatisé vous permet d'obtenir les résultats de l'étude après 4 à 5 heures.
La méthode est fiable à presque 100 %. Seuls des cas isolés de résultats faux négatifs ont été enregistrés.
Possibilité d'identifier plusieurs types d'agents pathogènes à partir d'un échantillon de matériau. Cela accélère non seulement le processus de diagnostic de la maladie, mais réduit également considérablement les coûts matériels. Souvent, le médecin prescrit une analyse PCR complète. Le prix de l'examen, consistant en la détermination de six agents pathogènes, est d'environ 1 500 roubles.

Pour que les résultats soient fiables lors de l'étude PCR, il est nécessaire de réussir l'analyse en suivant les recommandations de préparation préalable au diagnostic:

Avant de faire un don de salive, vous devez vous abstenir de manger et de prendre des médicaments 4 heures avant de prendre le matériel. Immédiatement avant la procédure, rincez-vous la bouche avec de l'eau bouillie.
Les règles ci-dessus doivent également être suivies lors du prélèvement d'un échantillon de la surface interne de la joue. Après rinçage, il est recommandé d'effectuer un léger massage de la peau pour mettre en valeur le secret de la glande.
L'urine est généralement collectée à domicile. Pour ce faire, vous devez procéder à une toilette approfondie des organes génitaux. Recueillir 50 à 60 ml d'urine dans un récipient en plastique stérile. Pour garantir la pureté du matériau, il est recommandé aux femmes d'insérer un tampon dans le vagin et aux hommes de tirer le pli cutané le plus loin possible. Vous ne pouvez pas prendre le matériel pendant le flux menstruel.
Pour faire un don de sperme, vous devez vous abstenir de tout rapport sexuel pendant 3 jours avant de prélever le matériel. Les médecins déconseillent également de se rendre au sauna et de prendre un bain chaud, de boire de l'alcool et des aliments épicés. 3 heures avant l'analyse, vous devez vous abstenir d'uriner.
Pour l'accouchement, par exemple, si un test PCR est effectué pour la chlamydia, il est recommandé aux femmes et aux hommes d'avoir un repos sexuel pendant 3 jours. Les médicaments antibactériens ne doivent pas être pris 2 semaines avant l'analyse. Pendant une semaine, vous devez arrêter d'utiliser des gels intimes, des pommades, des suppositoires vaginaux, des douches vaginales. 3 heures avant l'examen, vous devez vous abstenir d'uriner. Pendant la menstruation, le prélèvement de matériel n'est pas effectué, seulement 3 jours après l'arrêt de l'écoulement sanguin, vous pouvez faire un frottis urogénital.

PCR pendant la grossesse

En attendant un bébé, de nombreuses infections sexuellement transmissibles sont extrêmement dangereuses pour le développement normal du fœtus. Les MST peuvent provoquer un retard de croissance intra-utérin, une fausse couche ou un accouchement prématuré, des malformations congénitales de l'enfant. Par conséquent, il est extrêmement important de subir un examen PCR en début de grossesse. Il est nécessaire de réussir l'analyse lors de l'inscription - jusqu'à 12 semaines.

Le matériau est prélevé du canal cervical à l'aide d'une brosse spéciale. La procédure est indolore et ne présente aucun danger pour le bébé. Habituellement pendant la grossesse, une analyse est effectuée pour la chlamydia par la méthode PCR, ainsi que pour l'uréeplasmose, la mycoplasmose, le cytomégalovirus, l'herpès, le papillomavirus. Un tel complexe d'examens est appelé PCR-6.

PCR pour le diagnostic du VIH

En raison du fait que la méthode est très sensible aux changements dans le corps et aux conditions du diagnostic, de nombreux facteurs peuvent affecter le résultat. Par conséquent, l'analyse PCR pour l'infection par le VIH n'est pas une méthode fiable, son efficacité est de 96 à 98 %. Dans les 2 à 4 % de cas restants, le test donne des résultats faussement positifs.

Mais dans certaines situations, on ne peut pas se passer du diagnostic PCR du VIH. Il est généralement administré aux personnes dont le résultat ELISA est faux négatif. De tels indicateurs indiquent qu'une personne n'a pas encore développé d'anticorps contre le virus et qu'ils ne peuvent pas être détectés sans une augmentation multiple du nombre. C'est exactement ce que l'on peut obtenir en effectuant un test sanguin à l'aide de la méthode PCR.

Un tel diagnostic est également nécessaire pour les enfants de la première année de vie nés d'une mère séropositive. La méthode est le seul moyen de déterminer de manière fiable le statut d'un enfant.

PCR pour le diagnostic de l'hépatite

La méthode de réaction en chaîne par polymérase permet de détecter l'ADN du virus de l'hépatite A, B, C bien avant la formation d'anticorps contre l'infection ou l'apparition des symptômes de la maladie. L'analyse de la PCR pour l'hépatite C est particulièrement efficace, car dans 85% des cas, cette maladie est asymptomatique et, sans traitement rapide, passe au stade chronique.

La détection rapide de l'agent pathogène aidera à éviter les complications et le traitement à long terme.

Examen PCR complet

Analyse PCR complète : examen par la méthode de réaction en chaîne polymérique, qui comprend la détermination simultanée de plusieurs types d'infections : mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomégalovirus, herpès types 1 et 2, gonorrhée, papillomavirus. Le prix de ces diagnostics varie de 2000 à 3500 roubles. en fonction de la clinique, des matériels et équipements utilisés, ainsi que du type d'analyse : qualitative ou quantitative. Ce qui est nécessaire dans votre cas - le médecin décidera. Dans certains cas, il suffit de déterminer la présence de l'agent pathogène, dans d'autres, par exemple, avec l'infection par le VIH, un titre quantitatif joue un rôle important. Lors du diagnostic de tous les agents pathogènes ci-dessus, l'examen est appelé "analyse PCR-12".

Déchiffrer les résultats de l'analyse

Déchiffrer l'analyse PCR n'est pas difficile. Il n'y a que 2 échelles de l'indicateur - "résultat positif" et "résultat négatif". Lorsqu'un agent pathogène est détecté, les médecins peuvent confirmer la présence de la maladie avec une certitude de 99 % et commencer à traiter le patient. Avec une méthode quantitative de détermination de l'infection, la colonne correspondante indiquera l'indicateur numérique des bactéries détectées. Seul un médecin peut déterminer le degré de la maladie et prescrire le traitement nécessaire.

Dans certains cas, par exemple, lors de la détermination de l'infection par le VIH par PCR, avec un résultat négatif, il devient nécessaire de procéder à des examens supplémentaires pour confirmer les indicateurs obtenus.

Où faire l'analyse ?

Où faire une analyse PCR : dans une clinique publique ou dans un laboratoire privé ? Malheureusement, dans les établissements médicaux municipaux, le matériel et les méthodes sont souvent dépassés. Par conséquent, il est préférable de privilégier les laboratoires privés dotés d'équipements modernes et d'un personnel hautement qualifié. De plus, dans une clinique privée, vous obtiendrez des résultats beaucoup plus rapidement.

A Moscou, de nombreux laboratoires privés proposent des analyses PCR pour diverses infections. Par exemple, dans des cliniques telles que Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, une analyse PCR est effectuée. Le prix de l'examen est de 200 roubles. pour l'identification d'un seul agent pathogène.

On peut en conclure que le diagnostic des maladies infectieuses par PCR est dans la plupart des cas un moyen rapide et fiable de détecter l'agent pathogène dans le corps aux premiers stades de l'infection. Mais encore, dans certains cas, il vaut la peine de choisir d'autres méthodes de diagnostic. Seul un spécialiste peut déterminer la nécessité d'une telle étude. Déchiffrer l'analyse PCR nécessite également une approche professionnelle. Suivez les instructions de votre médecin et ne faites pas de tests dont vous n'avez pas besoin.