Polimeráz láncreakció (PCR)

A PCR módszer lényege. DNS polimeráz

A polimeráz láncreakció a molekuláris biológia kísérleti módszere, amely lehetővé teszi bizonyos nukleinsavfragmensek kis koncentrációjának jelentős növelését a biológiai anyagokban. Ezt a DNS-kópiák számának növelésének folyamatát ún erősítés... A PCR során a DNS-másolást egy speciális enzim végzi - polimeráz. A DNS-polimeráz (3. ábra) a DNS-replikációban (élő szervezetekben a DNS-amplifikációban) részt vevő enzim. Az ebbe az osztályba tartozó enzimek katalizálják a dezoxiribonukleotidok polimerizációját a DNS-nukleotid lánc mentén, amelyet az enzim „beolvas” és templátként használ. Az új nukleotid típusát a kiolvasott templáttal való komplementaritás elve alapján határozzák meg.

A DNS-polimeráz szabad nukleotidokat ad az összeállított szál 3 "végéhez. Ez a szál 5" -3 "irányú megnyúlásához vezet. Az ismert DNS-polimerázok egyike sem képes a semmiből szálat létrehozni: csak nukleotidokat adhat hozzá egy már meglévő 3"-hidroxilcsoporthoz. Emiatt a DNS-polimeráznak szüksége van alapozó- egy rövid nukleotidszekvencia (általában 20-25), amely komplementer a vizsgált gén végeihez - amelyhez hozzáadhatta az első nukleotidot. A primerek mindig DNS- és RNS-bázisokból állnak, míg az első két bázis mindig RNS-bázis. A primereket egy másik enzim szintetizálja - primazoy... Egy másik enzim helicase- szükséges a DNS kettős hélix feltekercseléséhez egyszálú szerkezet kialakításával, amely biztosítja mindkét szál replikációját a félig konzervált DNS replikációs modellnek megfelelően.

Egyes DNS-polimerázok képesek kijavítani az újonnan összeállított DNS-szál hibáit is. Ha nem megfelelő nukleotidpárt észlelünk, a DNS polimerázt egy lépéssel visszagörgetjük, a hibás nukleotidot kizárjuk a láncból, majd a megfelelő nukleotidot illesztjük be a helyére, majd a replikáció a megszokott módon folytatódik.

PCR végrehajtása

A polimeráz láncreakció (PCR) egy DNS-amplifikációs módszer, amely lehetővé teszi, hogy néhány órán belül több milliárdszor izoláljon és szaporítson egy adott DNS-szekvenciát. A genom egy szigorúan meghatározott régiójából hatalmas számú másolat beszerzésének lehetősége nagyban leegyszerűsíti a rendelkezésre álló DNS-minta vizsgálatát.

A polimeráz láncreakció végrehajtásához számos feltételnek kell teljesülnie. A legegyszerűbb esetben a PCR végrehajtásához a következő összetevőkre van szükség:

Az amplifikálandó DNS-régiót tartalmazó DNS-templát.

Két primer komplementer a kívánt fragmens végeihez. (Egy mesterségesen szintetizált, általában 15-30 bp méretű oligonukleotidpár azonos a cél-DNS megfelelő régióival. Kulcsszerepet játszanak az amplifikációs reakciótermékek képződésében. A helyesen kiválasztott primerek biztosítják a sejtek specificitását és érzékenységét. tesztrendszer.)

Hőstabil DNS polimeráz. A PCR-ben használt polimeráznak hosszú ideig aktívnak kell maradnia magas hőmérsékleten, ezért termofilekből izolált enzimeket használnak - Thermus aquaticus (Taq polimeráz) és mások.

Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok.

A szükséges reakciókörülményeket - pH, az oldat ionerőssége - biztosító pufferoldat. Sókat, szérumalbumint tartalmaz.

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ha fűtött tetővel ellátott készüléket használ, ez nem szükséges.

Pirofoszfatáz hozzáadása növelheti a PCR reakció hozamát. Ez az enzim katalizálja a pirofoszfát hidrolízisét, amely a nukleotid-trifoszfátok növekvő DNS-lánchoz való hozzáadásának mellékterméke, az ortofoszfáttá. A pirofoszfát gátolhatja a PCR reakciót.

Az eredeti DNS másolatainak számának megsokszorozásához ciklikus reakcióra van szükség. Jellemzően a szekvenciálisan ismételt PCR-ciklusok mindegyike három szakaszból áll:

1... A DNS denaturációja vagy „olvadása”. A kétszálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük, hogy lehetővé tegyük a DNS-szálak szétválását. Ezt a szakaszt denaturációnak nevezik, mivel a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megsemmisülnek. Néha az első ciklus előtt (a polimeráz hozzáadása előtt) a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik, hogy a templát és a primerek teljesen denaturálódjanak. Ezt a technikát az ún melegindítás, lehetővé teszi a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentését.

2. Annealing – primerek kötődése templát DNS-hez... Amikor a láncok szétváltak, a hőmérsékletet lassan lecsökkentik, hogy a legjobberek kötődhessenek az egyszálú mátrixhoz. A lágyítási hőmérséklet az alapozók összetételétől függ, és általában 50-65°C-ot választanak. Színpadi idő - 20-60 másodperc. Az illesztési hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a templáthoz (magas hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten).

3. Szintézis (lánc megnyúlás). A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, egy primert "magként" használva. A polimeráz a primer 3'-végétől kezdi meg a második szál szintézisét, amely a templáthoz kötődik és a templát mentén mozog. Az elongációs hőmérséklet a polimeráztól függ. A gyakran használt Taq és Pfu polimerázok 72°-on a legaktívabbak C. A szintézis ideje a DNS-polimeráz típusától és az amplifikálandó fragmens hosszától függ. Általában az elongációs időt 1000 bázispáronként egy percnek tekintik. Az összes ciklus befejezése után gyakran egy további lépést is végrehajtanak. ki végső nyúlás hogy elkészüljön az összes egyszálú töredék. Ez a szakasz 7-10 percig tart.

Ezt követően a denaturáció, a lágyítás és a megnyújtás szakaszai sokszor (30 vagy több alkalommal) megismétlődnek. Minden ciklusban megduplázódik a DNS-fragmens szintetizált másolatainak száma.

Minden reakciót termosztátba merített kémcsövekben hajtanak végre. A hőmérsékleti rendszer automatikusan változik és karbantartja.

Ahhoz, hogy pontosan megértsük, hogyan amplifikálódik egy adott DNS-szegmens a PCR során, világosan el kell képzelni az összes primer és azok komplementer szekvenciáinak helyzetét az amplifikált szálakban minden körben. Az első körben az újonnan szintetizált szálak mindegyike sokkal hosszabb, mint a távolság a primer 3'-hidroxilcsoportjától a második primerrel komplementer szekvencia terminális nukleotidjáig. Az ilyen szálakat "hosszú templátoknak" nevezik. további szintézishez fogják használni.

A második körben a hasonló és újonnan szintetizált (hosszú templát) szálakból álló kettős szálú DNS-t ismét denaturálják, majd primerekkel összekapcsolják. A szintézis során ebben a körben ismét "hosszú templátokat" szintetizálnak, valamint számos olyan szálat, amelyek egyik végén egy primer, a másik végén pedig a második primerrel komplementer szekvencia ("rövid templátok"). A harmadik körben az összes korábban képződött heteroduplex egyidejűleg denaturálódik és primerekkel lágyul, majd replikálódik. A következő körökben egyre több a "rövid mátrix", és a 30. fordulóban számuk már 10-6-szor nagyobb, mint az eredeti láncok vagy "hosszú mátrixok".

Egy adott reakciótermék mennyisége (amelyet primerek korlátoznak) elméletileg 2 n arányban nő, ahol n a reakcióciklusok száma. Valójában az egyes ciklusok hatékonysága 100% alatti lehet, tehát a valóságban:

ahol P a termék mennyisége, E a ciklus átlagos hatásfoka.

A „hosszú” DNS-másolatok száma is nő, de lineárisan, ezért a reakciótermékekben egy specifikus fragmentum dominál. A szükséges termék növekedését exponenciálisan korlátozza a reagensek mennyisége, az inhibitorok jelenléte és a melléktermékek képződése.

A PCR rendkívül érzékeny módszer, ezért ha a vizsgált mintában akár csak jelentéktelen mennyiségű DNS is van, amely véletlenül egyik reakcióelegyből a másikba került, téves pozitív eredményt kaphatunk. Ez szükségessé teszi a PCR-hez használt összes oldat és eszköz gondos ellenőrzését.

Az alapozó kiválasztásának alapelvei.

A PCR tesztrendszer létrehozásakor az egyik fő feladat a primerek helyes kiválasztása, amelyeknek számos kritériumnak kell megfelelniük:

1. Az alapozóknak specifikusnak kell lenniük. Különös figyelmet kell fordítani a primerek 3' végére, mert ezekből kezd kiépülni a komplementer DNS szál Taq polimeráz. Ha ezek specificitása nem megfelelő, akkor valószínű, hogy nemkívánatos folyamatok mennek végbe a kémcsőben. a reakcióelegy, azaz a nem specifikus DNS (rövid vagy hosszú fragmentumok) szintézise. Elektroforézis során nehéz vagy könnyű további sávok formájában látható. Ez megzavarja a reakció eredményeinek értékelését, mert könnyen összetéveszthető specifikus amplifikációs termék szintetizált idegen DNS-sel.

2. A primerek nem képezhetnek dimereket és hurkokat; a primerek önmagukhoz vagy egymáshoz való illesztése következtében nem keletkezhetnek stabil kettős láncok.

Ez lehetővé teszi, hogy a biológiai anyagokban kis mennyiségben, pontosabban annak bizonyos töredékeit észlelje, és sokszorosítsa meg. Ezután vizuálisan azonosítják őket gélelektroforézissel. A reakciót 1983-ban fejlesztette ki K. Mullis, és szerepel az elmúlt évek kiemelkedő felfedezéseinek listáján.

Mik a PCR mechanizmusai?

Az egész technika a nukleinsavak önálló replikációs képességén alapul, amelyet ebben az esetben mesterségesen, laboratóriumban hajtanak végre. A DNS-reprodukció nem a molekula bármely régiójában kezdődhet meg, hanem csak bizonyos nukleotid-szekvenciájú régiókban - kiindulási fragmentumok. Ahhoz, hogy a polimeráz láncreakció beinduljon, primerekre (vagy DNS-próbákra) van szükség. Ezek egy adott nukleotidszekvenciával rendelkező DNS-lánc rövid fragmentumai. Kiegészítik (azaz megfelelnek) a kiindulási helyeknek.

Természetesen ahhoz, hogy primereket hozzanak létre, a tudósoknak meg kell vizsgálniuk a technikában résztvevő nukleotidszekvenciáját. Ezek a DNS-próbák biztosítják a reakció specifitását és annak beindítását. nem fog működni, ha a minta nem tartalmazza a kívánt DNS legalább egy molekuláját. Általában a reakcióhoz a fenti primerekre, egy sor nukleotidra és egy hőálló DNS-polimerázra van szükség. Ez utóbbi egy enzim - katalizátor az új nukleinsavmolekulák szintéziséhez minta alapján. Mindezek az anyagok, beleértve a biológiai anyagokat is, amelyekben a DNS-t azonosítani szükséges, reakcióelegyben (oldatban) egyesülnek. Speciális termosztátba kerül, amely adott idő alatt - cikluson belül - nagyon gyorsan felmelegszik és lehűl. Általában 30-50 darab van.

Hogyan zajlik ez a reakció?

Lényege, hogy egy ciklus alatt a primerek a kívánt DNS-régiókhoz kapcsolódnak, majd egy enzim hatására megkettőződnek. A keletkező DNS-szálak alapján a molekula újabb és újabb, azonos fragmentumai szintetizálódnak a következő ciklusokban.

A polimeráz láncreakció szekvenciálisan megy végbe, a következő szakaszokat különböztetjük meg. Az elsőt a termék mennyiségének megduplázódása jellemzi minden egyes fűtési és hűtési ciklus során. A második szakaszban a reakció lelassul, mivel az enzim sérül, és elveszíti aktivitását is. Emellett a nukleotidok és primerek tartalékai is kimerülnek. Az utolsó szakaszban - egy fennsíkon - a termékek már nem halmozódnak fel, mivel a reagensek elfogytak.

Hol használják

Kétségtelen, hogy a polimeráz láncreakciót széles körben használják az orvostudományban és a tudományban. Használják az általános és magánbiológiában, az állatgyógyászatban, a gyógyszerészetben és még az ökológiában is. Sőt, az utóbbiban ez az élelmiszerek és tárgyak minőségének követésére szolgál a külső környezetben. A polimeráz láncreakciót az igazságügyi orvosszakértői gyakorlatban aktívan használják az apaság megerősítésére és a személy személyiségének azonosítására. Az igazságügyi orvosszakértői vizsgálatban, valamint az őslénytanban gyakran ez a technika az egyetlen kiút, hiszen általában rendkívül kis mennyiségű DNS áll rendelkezésre a kutatáshoz. Természetesen a módszer igen széles körű alkalmazásra talált a gyakorlati gyógyászatban. Szükség van rá olyan területeken, mint a genetika, a fertőző és onkológiai betegségek.

Ez az ötlet azonban akkoriban nem érvényesült. A polimeráz láncreakciót 1983-ban fedezte fel újra Carey Mallis. Célja egy olyan módszer kidolgozása volt, amely lehetővé teszi a DNS-amplifikációt az eredeti DNS-molekula többszöri, egymás utáni megkettőzése során a DNS-polimeráz enzim segítségével. 7 évvel az ötlet megjelenése után, 1993-ban Mullis Nobel-díjat kapott érte.

A módszer alkalmazásának kezdetén, minden melegítési-hűtési ciklus után DNS-polimerázt kellett a reakcióelegyhez adni, mivel az gyorsan inaktiválódott a DNS-hélix szálainak elválasztásához szükséges magas hőmérsékleten. Az eljárás nagyon hatástalan volt, sok időt és enzimet igényelt. 1986-ban jelentősen javították. Termofil baktériumokból származó DNS-polimerázok alkalmazását javasolták. Ezek az enzimek termikusan stabilnak bizonyultak, és több reakcióciklust is képesek voltak ellenállni. Használatuk lehetővé tette a PCR egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első hőstabil DNS-polimerázt baktériumokból izolálták Thermus aquaticusés megnevezett Taq-polimeráz. Ennek a polimeráznak az a hátránya, hogy meglehetősen nagy a valószínűsége egy hibás nukleotid bejutásának, mivel ez az enzim nem rendelkezik hibajavító mechanizmusokkal (3 "→ 5" exonukleáz aktivitás). Polimeráz Pfués Pwo archaeából izolált állatok rendelkeznek ilyen mechanizmussal, használatuk jelentősen csökkenti a mutációk számát a DNS-ben, de munkájuk sebessége (proceszivitása) kisebb, mint a Taq... Ma már keverékeket használnak Taqés Pfu nagy polimerizációs sebesség és nagy másolási pontosság elérése érdekében.

A módszer feltalálása idején Mallis a Cetus Corporationnél dolgozott, amely szabadalmaztatta a PCR-módszert. 1992-ben a Cetus eladta a módszer jogait és a felhasználási szabadalmat Taq-polimeráz a Hoffmann-La Roche cégtől 300 millió dollárért. Kiderült azonban, hogy Taq A -polimerázt Alekszej Kaledin orosz biokémikus jellemezte 1980-ban, amivel kapcsolatban a Promega (Promega) cég megpróbálta rákényszeríteni a Roche-t, hogy mondjon le ezen enzim kizárólagos jogairól. A PCR-módszer amerikai szabadalma 2005 márciusában járt le.

PCR végrehajtása

A módszer a DNS egy meghatározott régiójának többszörös szelektív másolására épül, enzimek segítségével mesterséges körülmények között ( in vitro). Ebben az esetben csak a meghatározott feltételeknek megfelelő területről történik másolás, és csak akkor, ha az jelen van a vizsgált mintában. Ellentétben az élő szervezetekben végzett DNS-amplifikációval (replikáció), a DNS viszonylag rövid szakaszait PCR segítségével amplifikálják. Egy hagyományos PCR eljárásban a lemásolt DNS-régiók hossza nem haladja meg a 3000 bázispárt (3 kbp). Különféle polimerázok keverékével, adalékanyagokkal és bizonyos körülmények között a PCR-fragmens hossza elérheti a 20-40 ezer bázispárt. Ez még mindig lényegesen kevesebb, mint egy eukarióta sejt kromoszómális DNS-ének hossza. Például az emberi genom körülbelül 3 milliárd bázispárból áll.

Reakció komponensek

A legegyszerűbb esetben a PCR végrehajtásához a következő összetevőkre van szükség:

DNS-mátrix amely tartalmazza a DNS amplifikálni kívánt részét.
Két alapozó komplementer a kívánt DNS-fragmens különböző szálainak ellentétes végeihez.
Hőálló DNS polimeráz- a DNS polimerizációs reakciót katalizáló enzim. A PCR-ben használt polimeráznak magas hőmérsékleten hosszú ideig aktívnak kell maradnia, ezért termofilekből izolált enzimeket használnak - Thermus aquaticus(Taq polimeráz), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeráz), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeráz) és mások.
Dezoxinukleozid-trifoszfátok(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok.
Pufferelési megoldás a szükséges reakciókörülmények biztosítása - pH, az oldat ionerőssége. Sókat, marhaszérum albumint tartalmaz.

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ez nem szükséges, ha fűtött tetővel ellátott termikus ciklust használnak.

Alapozók

A PCR specificitása a templát és a primerek, rövid, 18-30 bázis hosszú szintetikus oligonukleotidok közötti komplementer komplexek képződésén alapul. A primerek mindegyike komplementer a kétszálú templát egyik szálával, és behatárolja az amplifikált régió elejét és végét.

A templátnak a primerrel való hibridizálása (annealing) után az utóbbi a DNS-polimeráz primerjeként szolgál a templát komplementer szálának szintézisében (lásd).

A primerek legfontosabb jellemzője a primer-templát komplex olvadási hőmérséklete (T m). T m az a hőmérséklet, amelyen a DNS-templátok fele komplexet képez az oligonukleotid primerrel. Az olvadáspont megközelítőleg a következő képlettel határozható meg, ahol n X a primerben lévő X nukleotidok száma. A primer hosszának és nukleotid-összetételének, illetve az annealing hőmérsékletének helytelen megválasztása esetén a templát DNS más régióival részlegesen komplementer komplexek képződése lehetséges, ami nem specifikus termékek megjelenéséhez vezethet. Az olvadáspont felső határát a polimeráz hatásának optimális hőmérséklete korlátozza, amelynek aktivitása 80 ° C feletti hőmérsékleten csökken.

Az alapozók kiválasztásakor tanácsos betartani a következő kritériumokat:

Erősítő

Rizs. egy: Erősítő PCR-hez

A PCR-t egy erősítőben hajtják végre - olyan eszközben, amely rendszerint legalább 0,1 ° C-os pontossággal biztosítja a csövek időszakos hűtését és melegítését. A modern erősítők lehetővé teszik összetett programok beállítását, beleértve a "hot start", a Touchdown PCR (lásd lent) és az amplifikált molekulák ezt követő tárolását 4 ° C-on. A valós idejű PCR-hez fluoreszcens detektorral felszerelt eszközöket gyártanak. Vannak automata fedéllel és mikrolemezes rekesszel rendelkező műszerek is, amelyek automatizált rendszerekbe integrálhatók.

A reakció előrehaladása

Fénykép marker DNS-t (1) és PCR reakciótermékeket (2,3) tartalmazó gélről. A számok a DNS-fragmensek hosszát mutatják nukleotidpárokban

Általában a PCR végrehajtása során 20-35 ciklust hajtanak végre, amelyek mindegyike három szakaszból áll (2. ábra).

Denaturáció

A kétszálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy különösen hőstabil polimeráz használata esetén 98 °C-ra) 0,5-2 percig melegítjük, hogy a DNS-szálak szétválódjanak. Ezt a szakaszt az ún denaturáció, mivel a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megsemmisülnek. Néha az első ciklus előtt (a polimeráz hozzáadása előtt) a reakcióelegyet 2-5 percig előmelegítik. a templát és a primerek teljes denaturálásához. Ezt a technikát az ún melegindítás, lehetővé teszi a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentését.

Lágyítás

Amikor a szálak szétváltak, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy a primerek meg tudjanak kötődni az egyszálú sablonhoz. Ezt a szakaszt az ún izzítás... A lágyítási hőmérséklet az alapozók összetételétől függ, és általában 4-5 °C-kal az olvadáspontjuk alatt van kiválasztva. Színpadi idő - 0,5-2 perc. Az illesztési hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a mátrixhoz (magas hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten).

Megnyúlás

A PCR fajtái

"Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - a reakció melléktermékeinek számának csökkentésére szolgál. Két pár primert használunk, és két egymást követő reakciót hajtunk végre. Egy második primerpár amplifikálja a DNS egy szakaszát az első reakció termékén belül.
"Inverz" PCR (inverz PCR (eng.)) - arra az esetre használatos, ha a kívánt szekvencián belül csak egy kis terület ismert. Ez a módszer különösen akkor hasznos, ha szükséges a szomszédos szekvenciák meghatározása a DNS genomba történő beillesztése után. Az invertált PCR végrehajtásához restrikciós enzimekkel végzett DNS-vágások sorozatát hajtják végre, majd a fragmensek összekapcsolását (ligálás) követik. Ennek eredményeként az ismeretlen régió mindkét végén ismert fragmentumok jelennek meg, amelyek után a szokásos módon elvégezhető a PCR.
A reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) egy ismert szekvencia RNS-könyvtárból történő amplifikálására, izolálására vagy azonosítására szolgál. A hagyományos PCR előtt egyszálú DNS-molekulát szintetizálnak az mRNS-templáton reverz transzkriptáz segítségével, és egy egyszálú cDNS-t kapnak, amelyet templátként használnak a PCR-hez. Ezt a módszert gyakran használják annak meghatározására, hogy hol és mikor fejeződnek ki ezek a gének.
Aszimmetrikus PCR (rus. Aszimmetrikus PCR) - akkor hajtják végre, ha az eredeti DNS főként az egyik szálát kell amplifikálni. Egyes szekvenálási és hibridizációs elemzési technikákban használatos. A PCR-t a szokásos módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az egyik primert nagy feleslegben vettük fel.
A kvantitatív PCR (Q-PCR) segítségével gyorsan megmérhető egy specifikus DNS, cDNS vagy RNS mennyisége a mintában.
Kvantitatív valós idejű PCR – Ez a módszer fluoreszcensen jelölt reagenseket használ a reakciótermék mennyiségének pontos mérésére a felhalmozódás során.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - ezzel a módszerrel a nem specifikus primer kötődés termékképződésre gyakorolt hatása csökken. Az első ciklusokat a lágyítási hőmérséklet feletti hőmérsékleten hajtják végre, majd néhány ciklusonként csökkentik a hőmérsékletet. Egy bizonyos hőmérsékleten a rendszer áthalad a DNS primerek optimális specificitású sávján.
Molekuláris kolónia módszer (gél PCR) Polony - PCR Colony) - az akrilamid gélt polimerizálják minden PCR komponenssel a felületen, és PCR-t hajtanak végre. Az elemzett DNS-t tartalmazó pontokon az amplifikáció molekuláris kolóniák képződésével történik.
PCR a cDNS végek gyors amplifikációjával (rus. A cDNS végek gyors amplifikációja, RACE-PCR )
Long Fragment PCR (rus. Hosszú távú PCR) - a PCR módosítása kiterjesztett DNS-régiók amplifikálására (10 ezer bázis és több). Két polimerázt használnak, amelyek közül az egyik a nagy processzivitással rendelkező Taq polimeráz (azaz egy lépésben képes egy hosszú DNS-láncot szintetizálni), a másik pedig egy 3 "-5" endonukleáz aktivitású DNS polimeráz. A második polimeráz szükséges az első által okozott hibák kijavításához.
RAPD PCR (eng. Polimorf DNS PCR véletlenszerű amplifikációja , PCR a polimorf DNS véletlenszerű amplifikációjával - akkor használatos, ha genetikai szekvenciában közel álló organizmusokat kell megkülönböztetni, például kultúrnövények különböző fajtáit, kutyafajtákat vagy közeli rokon mikroorganizmusokat. Ez a módszer általában egy kis alapozót (20-25 bp) használ. Ez a primer részben komplementer lesz a vizsgált szervezetek véletlenszerű DNS-régióival. A feltételek megválasztásával (primer hossza, összetétele, hőmérséklete stb.) két organizmus PCR mintázatában kielégítő különbséget lehet elérni.

Ha a templát nukleotidszekvenciája részben vagy egyáltalán nem ismert, használhatja degenerált primerek, melynek szekvenciája degenerált pozíciókat tartalmaz, amelyekben bármilyen bázis elhelyezhető. Például a primer szekvencia lehet: ... ATH ..., ahol H jelentése A, T vagy C.

PCR alkalmazás

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekre.

Forensics

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. A tetthelyről származó genetikai anyag mintája szükséges – vér, nyál, sperma, haj stb. Ezt összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg - egy példány. A DNS-t fragmensekre hasítják, majd PCR-rel amplifikálják. A fragmentumokat DNS-elektroforézissel választjuk el. A kapott képet a DNS-sávok elhelyezkedéséről ún genetikai ujjlenyomat(eng. genetikai ujjlenyomat).

Az apaság megállapítása

Rizs. 3: PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek elektroforézisének eredményei. (1) Apa. (2) Gyermek. (3) Anya. A gyermek örökölte mindkét szülő genetikai lenyomatának néhány jellemzőjét, ami új, egyedi lenyomatot adott.

Bár a genetikai ujjlenyomatok egyediek (kivéve az egypetéjű ikrek esetét), mégis több ilyen ujjlenyomat készítésével családi kötelékek hozhatók létre (3. ábra). Ugyanez a módszer kismértékben módosítva is alkalmazható az élőlények közötti evolúciós rokonság megállapítására.

Orvosi diagnosztika

A PCR lehetővé teszi az örökletes és vírusos betegségek diagnosztizálásának jelentős felgyorsítását és megkönnyítését. A kívánt gént PCR-rel amplifikáljuk a megfelelő primerek használatával, majd szekvenáljuk a mutációk kimutatására. A vírusfertőzések közvetlenül a fertőzés után, hetekkel vagy hónapokkal a betegség tüneteinek megjelenése előtt észlelhetők.

Személyre szabott orvoslás

Ismeretes, hogy a legtöbb gyógyszer nem hat minden olyan betegen, akinek szánták, hanem csak a számuk 30-70%-án. Ezenkívül sok gyógyszer mérgező vagy allergén egyes betegek számára. Ennek oka részben a gyógyszerek és származékaik érzékenységének és anyagcseréjének egyéni különbségei. Ezeket a különbségeket genetikai szinten határozzák meg. Például az egyik betegnél egy bizonyos citokróm (az idegen anyagok anyagcseréjéért felelős májfehérje) aktívabb lehet, egy másiknál kevésbé. Annak megállapítására, hogy egy adott beteg milyen citokrómmal rendelkezik, javasolt a gyógyszer alkalmazása előtt PCR analízis elvégzése. Ezt az elemzést előzetes genotipizálásnak nevezik (eng. prospektív genotipizálás).

Gén klónozás

A génklónozás (nem tévesztendő össze a klónozó organizmusokkal) a gének izolálásának és a géntechnológiai manipulációk eredményeként egy adott gén termékének nagy mennyiségének kinyerését jelenti. A PCR-t egy gén amplifikálására használják, amelyet azután inszertálnak vektor- olyan DNS-fragmens, amely idegen gént visz át ugyanabba vagy egy másik, termesztésre alkalmas szervezetbe. Vektorként például plazmidokat vagy virális DNS-t használunk. A gének idegen szervezetbe történő beillesztését általában e gén termékének - RNS-nek vagy gyakrabban fehérjének - előállítására használják. Így sok fehérjét ipari mennyiségben állítanak elő a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

Rizs. 4: Gén klónozása plazmid segítségével. ...
(1) Az A szervezet kromoszómális DNS-e. (2) PCR. (3) Az A szervezet génjének sok másolata. (4) A gén beillesztése a plazmidba. (5) Az A szervezet génjét tartalmazó plazmid. (6) A plazmid bejuttatása a B szervezetbe. (7) Az A szervezet génjének kópiáinak megsokszorozása a B szervezetben.

DNS szekvenálás

A fluoreszcensen jelölt vagy radioaktív izotóp didezoxinukleotidokat alkalmazó szekvenálási eljárásban a PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelzéssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-szálba. Ez leállítja a reakciót, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását a szintetizált szálak elválasztása után a gélben.

Mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis végrehajtásának fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis végrehajtási eljárásának egyszerűsítését és felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tételét.

1. Polimeráz láncreakció (PCR)

2. A polimeráz láncreakciós módszer elve

2.1 Számos komponens jelenléte a reakcióelegyben

2.2 Ciklikus hőmérsékleti viszonyok

2.3 A primer kiválasztásának alapelvei

2.4 A "fennsík" effektus

3. A PCR termelés szakaszai

3.2 Erősítés

3.4.1 Pozitív vezérlők

3.4.2 Belső ellenőrzések

4.1 Kvalitatív elemzés

4.1.2 RNS-molekulák kimutatása

3.1 Biológiai anyagminta készítése

A DNS-kivonáshoz a feladatoktól függően különféle technikákat alkalmaznak. Lényege a DNS extrakciójában (extrakciójában) rejlik egy biológiai termékből, valamint a szennyeződések eltávolításában vagy semlegesítésében, hogy PCR-re alkalmas tisztaságú DNS-készítményt kapjanak.

A tiszta DNS-készítmény előállításának Marmur által leírt módszere standardnak számít, és már klasszikussá vált. Ez magában foglalja az enzimatikus proteolízist, amelyet fehérjementesítés és a DNS alkohollal történő újrakicsapása követ. Ezzel a módszerrel tiszta DNS-készítményt kaphat. Ez azonban meglehetősen munkaigényes, és olyan agresszív és csípős anyagokkal való munkavégzést igényel, mint a fenol és a kloroform.

Az egyik jelenleg népszerű módszer a Boom és munkatársai által javasolt DNS-kivonási módszer. Ez a módszer egy erős kaotróp ágens, a guanidin-tiocianát (GuSCN) alkalmazásán alapul a sejtlízishez, majd a DNS hordozón (üveggyöngyök, kovaföld, üveg "tej" stb.) történő szorpciójához. Mosás után a DNS a mintában marad, a hordozón adszorbeálva, amelyről elúciós pufferrel könnyen eltávolítható. A módszer kényelmes, technológiai és alkalmas minta amplifikációra történő előkészítésére. Azonban DNS-vesztések lehetségesek a hordozón történő visszafordíthatatlan szorpció miatt, valamint számos mosás során. Ez különösen fontos, ha kis mennyiségű DNS-sel dolgozunk a mintában. Ezenkívül a GuSCN nyomokban is gátolhatja a PCR-t. Ezért ennek a módszernek a használatakor nagyon fontos a szorbens helyes megválasztása és a technológiai árnyalatok gondos betartása.

A minta-előkészítési módszerek másik csoportja a Chilex típusú ioncserélők alkalmazásán alapul, amelyek az üveggel ellentétben nem adszorbeálják a DNS-t, hanem éppen ellenkezőleg, a reakciót zavaró szennyeződéseket. Ez a technológia általában két szakaszból áll: a minta felforralását és a szennyeződések szorpcióját az ioncserélőn. A módszer rendkívül vonzó a kivitelezés egyszerűsége miatt. A legtöbb esetben alkalmas klinikai anyagokkal való munkavégzésre. Sajnos néha előfordulnak ilyen szennyeződéseket tartalmazó minták, amelyeket nem lehet ioncserélővel eltávolítani. Ezen túlmenően, néhány mikroorganizmus nem semmisíthető meg egyszerű forralással. Ezekben az esetekben a mintafeldolgozás további szakaszait kell bevezetni.

Így a minta-előkészítési módszer kiválasztását a tervezett elemzések célkitűzéseinek megértése mellett kell mérlegelni.

3.2 Erősítés

Az amplifikációs reakció végrehajtásához reakcióelegyet kell készíteni, és hozzá kell adni az elemzett DNS-mintát. Ebben az esetben fontos figyelembe venni a primer lágyítás néhány jellemzőjét. A tény az, hogy az elemzett biológiai minta általában sokféle DNS-molekulát tartalmaz, amelyekkel a reakcióban használt primerek részleges, esetenként jelentős homológiát mutatnak. Ezenkívül a primerek egymáshoz kapcsolódhatnak primer dimerekké. Mindkettő jelentős primer-felhasználáshoz vezet a melléktermék (nem specifikus) reakciótermékek szintéziséhez, és ennek következtében jelentősen csökkenti a rendszer érzékenységét. Ez megnehezíti vagy lehetetlenné teszi a reakció eredményeinek leolvasását az elektroforézis során.

3.3 A reakció eredményeinek értékelése

A PCR-eredmények helyes értékeléséhez fontos megérteni, hogy ez a módszer nem kvantitatív. Elméletileg az egyedi cél DNS-molekulák amplifikációs termékei elektroforézissel kimutathatók 30-35 ciklus után. A gyakorlatban azonban ez csak olyan esetekben valósul meg, amikor a reakció az ideálishoz közeli körülmények között megy végbe, ami az életben nem gyakran fordul elő. A DNS-preparátum tisztasági foka különösen nagy hatással van az amplifikáció hatékonyságára, pl. bizonyos inhibitorok jelenléte a reakcióelegyben, amelyektől bizonyos esetekben rendkívül nehéz megszabadulni. Előfordul, hogy jelenlétük miatt több tízezer cél-DNS-molekulát sem lehet amplifikálni. Így gyakran nincs közvetlen kapcsolat a cél DNS kezdeti mennyisége és az amplifikációs termékek végső mennyisége között.

3.3.1 Vízszintes elektroforézis módszer

Az amplifikáció eredményeinek megjelenítésére különféle módszereket alkalmaznak. Manapság a legelterjedtebb módszer az elektroforézis, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. Ehhez készítsünk egy lemezt agarózgélből, amelyet 1,5-2,5% koncentrációjú elektroforézis-puffer agarózban történő megolvadás után egy speciális DNS-festék, például etidium-bromid hozzáadásával lefagyasztanak. A fagyasztott agaróz térhálót alkot. Fésűvel való megtöltéskor speciális lyukak keletkeznek a gélben, amelyekbe ezt követően amplifikációs termékeket vezetnek be. A géllemezt vízszintes gélelektroforézis készülékbe helyezzük, és állandó feszültségű forrást csatlakoztatunk. A negatív töltésű DNS mínuszból pluszba kezd mozogni a gélben. Ebben az esetben a rövidebb DNS-molekulák gyorsabban mozognak, mint a hosszúak. A DNS mozgásának sebességét a gélben befolyásolja az agaróz koncentrációja, az elektromos térerősség, a hőmérséklet, az elektroforézis puffer összetétele és kisebb mértékben a DNS GC összetétele. Minden azonos méretű molekula azonos sebességgel mozog. A festéket síkbeli csoportokba ágyazzák (interkalálják) DNS-molekulákba. A 10 perctől 1 óráig tartó elektroforézis befejezése után a gélt egy ultraibolya tartományban (254-310 nm) fényt kibocsátó transzilluminátor szűrőjére helyezzük. A DNS által a 260 nm-es régióban elnyelt UV-energia átkerül a festékre, ami a látható spektrum (590 nm) narancsvörös tartományában fluoreszkál.

Az erősítő termékek sávjainak fényereje eltérő lehet. Ez azonban nem hozható összefüggésbe a mintában lévő cél DNS kezdeti mennyiségével.

3.3.2 Függőleges elektroforézis módszer

A vertikális elektroforézis módszere alapvetően hasonló a horizontális elektroforézishez. Különbségük abban rejlik, hogy ebben az esetben agaróz helyett poliakrilamid géleket használnak. Ezt egy speciális kamrában végzik függőleges elektroforézishez. A poliakrilamid gélelektroforézis nagyobb felbontású, mint az agaróz elektroforézis, és lehetővé teszi a különböző méretű DNS-molekulák megkülönböztetését egy nukleotid pontossággal. A poliakrilamid gél elkészítése valamivel bonyolultabb, mint az agaróz gél. Ezenkívül az akrilamid mérgező anyag. Mivel ritkán merül fel az amplifikációs termék méretének 1 nukleotid pontosságú meghatározásának szükségessége, a rutinmunka során a horizontális elektroforézis módszert alkalmazzák.

3.4 Az amplifikációs reakció áthaladásának ellenőrzése

3.4.1 Pozitív vezérlők

A kívánt mikroorganizmus DNS-preparátumát használjuk „pozitív kontrollként”. A nem specifikus amplikonok méretükben különböznek a kontroll DNS-preparátummal végzett amplifikációval előállított amplikonoktól. A nem specifikus termékek mérete lehet nagyobb vagy kisebb, mint a pozitív kontrollé. A legrosszabb esetben ezek a méretek egybeeshetnek, és az elektroforézis során pozitívnak számítanak.

Az előállított amplifikációs termék specifitásának szabályozására enzimjelölésekkel vagy radioaktív izotópokkal jelölt, DNS-sel kölcsönhatásba lépő hibridizációs próbák (az amplifikált szekvencián belül található DNS-régiók) használhatók a primerekkel azonos elvek szerint. Ez nagymértékben bonyolítja és meghosszabbítja az elemzést, és jelentősen megnő a költsége.

3.4.2 Belső ellenőrzések

A reakciókeverékkel minden csőben ellenőrizni kell az amplifikáció előrehaladását. Erre a célra egy további, úgynevezett „belső ellenőrzést” használnak. Bármilyen DNS-készítmény, amely nem hasonlít a célmikroorganizmus DNS-éhez. Ha a reakcióelegyhez belső kontrollt adunk, akkor az ugyanazon célpont lesz a primer-illesztésnél, mint a kívánt fertőző ágens kromoszómális DNS-e. A belső kontroll amplifikációs termékének méretét úgy választjuk meg, hogy az 2-szer vagy többször nagyobb legyen, mint a mikroorganizmus kívánt DNS-ének amplifikációjából keletkező amplikonok. Ennek eredményeként, ha a belső kontroll DNS-t a vizsgálati mintával együtt adjuk a reakcióelegyhez, akkor függetlenül attól, hogy a mikroorganizmus jelen van a biológiai mintában, a belső kontroll specifikus amplikonok képződését okozza, de sokkal hosszabb ideig (nehéz). ), mint a mikroorganizmus-amplikon. A nehéz amplikonok jelenléte a reakcióelegyben az amplifikációs reakció normális lefolyását és az inhibitorok hiányát jelzi. Ha a kívánt méretű amplikonok nem képződtek, de a belső kontroll amplikonjai sem, akkor megállapítható, hogy a vizsgált mintában nemkívánatos szennyeződések vannak, amelyeket ki kell küszöbölni, de nem a kívánt DNS hiányáról.

Sajnos ennek a megközelítésnek minden vonzereje ellenére van egy jelentős hibája. Ha a szükséges DNS benne van a reakcióelegyben, akkor az amplifikáció hatékonysága jelentősen csökken a primerek belső kontrolljával való versengés miatt. Ez különösen fontos a vizsgálati minta alacsony DNS-koncentrációja esetén, ami hamis negatív eredményekhez vezethet.

Mindazonáltal, ha a primerekért való versengés problémáját megoldjuk, az amplifikációs hatékonyság szabályozásának ez a módszere minden bizonnyal nagyon hasznos lesz.

4. Polimeráz láncreakción alapuló módszerek

4.1 Kvalitatív elemzés

A PCR végrehajtásának klasszikus módszere, melynek alapelveit fentebb vázoltuk, néhány olyan módosításban találta meg a fejlődését, amelyek célja a PCR korlátainak leküzdése és a reakció hatékonyságának növelése volt.

4.1.1 A PCR beállításának módja "hot start" használatával

A nem specifikus amplifikációs reakciótermékek képződésének kockázatának csökkentése érdekében „hot-start” megközelítést alkalmaznak, amely abból áll, hogy megakadályozzák annak lehetőségét, hogy a reakció azelőtt kezdődjön meg, hogy a kémcsőben olyan feltételeket érnének el, amelyek biztosítják a primerek specifikus hőkezelését.

A tény az, hogy a GC összetételétől és méretétől függően a primerek bizonyos olvadásponttal (Tm) rendelkeznek. Ha a rendszer hőmérséklete meghaladja a Tm-t, a primer nem tud a DNS-szálhoz tapadni és denaturálódik. Optimális körülmények között, pl. Az olvadásponthoz közeli hőkezelési hőmérsékleten a primer csak teljes komplementaritása esetén képez kettős szálú molekulát, és így biztosítja a reakció specifitását.

Különféle lehetőségek állnak rendelkezésre a hot start megvalósítására:

Taq-polimeráz bevitele a reakcióelegybe az első ciklus során, miután a csövet felmelegítettük a denaturációs hőmérsékletre.

A reakcióelegy összetevőinek szétválasztása paraffinréteggel rétegekre (alsó részben primerek, felső részben Taq-polimeráz és DNS-célpont), amelyek a paraffin megolvadásakor (~ 65-75 0 С) keverednek. ).

Taq polimeráz elleni monoklonális antitestek alkalmazása. A monoklonális antitestek által megkötött enzim csak az első denaturációs szakasz után válik aktívvá, amikor a monoklonális antitestek irreverzibilisen denaturálják és felszabadítják a Taq polimeráz aktív helyeit.

Mindezekben az esetekben, még ha a hőmérséklet-ciklus kezdete előtt meg is történt a nem specifikus annealing, elongáció nem következik be, melegítés hatására a primer-DNS komplexek denaturálódnak, így nem képződnek nem specifikus termékek. Ezt követően a kémcső hőmérséklete nem csökken az olvadási hőmérséklet alá, ami biztosítja a specifikus amplifikációs termék képződését.

4.1.2 RNS-molekulák kimutatása

Az RNS-nek a PCR célpontjaként való felhasználásának lehetősége jelentősen kibővíti ennek a módszernek az alkalmazási körét. Például számos vírus (hepatitis C, influenza vírus, picornavírusok stb.) genomját RNS képviseli. Ugyanakkor az életciklusukban nincs köztes fázis a DNS-vé való átalakulásnak. Az RNS kimutatásához mindenekelőtt DNS formájúvá kell alakítani. Ehhez reverz transzkriptázt használnak, amelyet két különböző vírusból izolálnak: madár myeloblastosis vírusból és Moloney rágcsáló leukémia vírusból. Ezen enzimek használata bizonyos nehézségekkel jár. Először is, hőlabilisak, ezért legfeljebb 42 °C-on használhatók. Mivel ezen a hőmérsékleten az RNS-molekulák könnyen másodlagos struktúrákat alkotnak, a reakció hatékonysága észrevehetően csökken, és különböző becslések szerint körülbelül 5%. Kísérleteket tesznek ennek a hátránynak a kiküszöbölésére a Thermus Thermophilus termofil mikroorganizmusból nyert hőstabil polimeráz segítségével, amely reverz transzkriptázként Mn2+ jelenlétében transzkriptáz aktivitást mutat. Ez az egyetlen ismert enzim, amely polimeráz és transzkriptáz aktivitást egyaránt képes mutatni.

A reverz transzkripciós reakció végrehajtásához a reakcióelegyben, valamint a PCR-ben a primereknek primerként és 4 dNTP keverékének építőanyagként kell jelen lenniük.

A reverz transzkripciós reakció után a kapott cDNS-molekulák a PCR célpontjaként szolgálhatnak.

5. A PCR felállításának technológiai folyamatának megszervezése

A polimeráz láncreakció potenciálisan nagy érzékenysége elengedhetetlenné teszi a PCR laboratórium különösen alapos tervezését. Ez a módszer legégetőbb problémájának – a szennyeződésnek – köszönhető.

Szennyeződés - a külső környezetből olyan specifikus DNS-molekulák bejutása a reakcióelegybe, amelyek célpontként szolgálhatnak az amplifikációs reakcióban és hamis pozitív eredményeket adnak.

Számos módja van ennek a kellemetlen jelenségnek a kezelésére. Az egyik az N-uracil-glikoziláz (UG) enzim alkalmazása. Ez a módszer az UG azon képességén alapul, hogy beágyazott uracillal DNS-molekulákat hasít. Az amplifikációs reakciót dNTP keverékkel hajtjuk végre, amelyben a dTTP-t uracil helyettesíti, és hőciklus után a kémcsőben keletkező összes amplikon uracilt tartalmaz. Ha az amplifikáció előtt UG-t adunk a reakcióelegyhez, akkor a reakcióelegyben lévő amplikonok elpusztulnak, miközben a natív DNS érintetlen marad, és a továbbiakban az amplifikáció célpontjaként szolgál.

Így ez a módszer csak bizonyos mértékig szünteti meg a szennyeződés forrását, és nem garantálja a hamis pozitív eredményeket.

A szennyeződés következményeinek kezelésének másik módja a reakcióciklusok számának jelentős csökkentése (akár 25-30 ciklus). De még ezzel a megközelítéssel is nagy a hamis pozitív eredmény elérésének kockázata, mivel ebben az esetben inhibitorok hiányában könnyen amplifikációs terméket kaphatunk a szennyeződés miatt.

Így a hamis pozitív eredményt okozó DNS-molekulák inaktiválását célzó előamplifikációs intézkedések előnyei ellenére a legradikálisabb eszköz egy jól átgondolt laboratóriumi szervezet.

Következtetés

A PCR legelterjedtebb módszere jelenleg a különféle fertőző betegségek diagnosztizálásának módszere. A PCR lehetővé teszi a fertőzés etiológiájának azonosítását, még akkor is, ha az elemzésre vett minta csak néhány kórokozó DNS-molekulát tartalmaz. A PCR-t széles körben használják HIV-fertőzések, vírusos hepatitis stb. korai diagnosztizálására. Ma már szinte nincs olyan fertőző ágens, amelyet ne lehetne PCR-rel kimutatni.

Nem is olyan régen egy megbízható, rendkívül érzékeny és gyors módszert fejlesztettek ki az emberek különféle fertőző betegségeinek diagnosztizálására. Ezt a módszert "PCR-analízisnek" nevezik. Mi ez, mi a lényege, milyen mikroorganizmusokat képes kimutatni és hogyan kell helyesen bevenni, cikkünkben elmondjuk.

A felfedezés története

A PCR-módszereket a rák diagnosztizálására is használják.

A módszer előnyei

A PCR diagnosztikának számos előnye van:

Magas érzékenység. Még akkor is, ha egy mikroorganizmusnak csak néhány DNS-molekulája van, a PCR-elemzés meghatározza a fertőzés jelenlétét. A módszer segít a krónikus és látens betegségekben. Gyakran ilyen esetekben a mikroorganizmust más módon nem tenyésztik.
Bármilyen anyag alkalmas kutatásra, például nyál, vér, nemi szervek váladéka, haj, hámsejtek. A leggyakoribb a vérvizsgálat és az urogenitális kenet a PCR-hez.
A növények hosszú távú termesztése nem szükséges. Az automatizált diagnosztikai folyamat lehetővé teszi, hogy 4-5 óra elteltével megkapja a kutatási eredményeket.
A módszer majdnem 100%-ban megbízható. Csak néhány téves negatív eredményt jegyeztek fel.
Egy anyagmintából többféle kórokozó azonosításának képessége. Ez nemcsak felgyorsítja a betegség diagnosztizálásának folyamatát, hanem jelentősen csökkenti az anyagköltségeket is. Gyakran az orvos átfogó PCR-elemzést ír elő. A hat kórokozó azonosításából álló vizsgálat költsége körülbelül 1500 rubel.

Annak érdekében, hogy az eredmények megbízhatóak legyenek a PCR-vizsgálat során, át kell adni az elemzést, figyelembe véve a diagnózis előzetes előkészítésére vonatkozó ajánlásokat:

A nyáladás előtt 4 órával az anyag bevétele előtt tartózkodnia kell az evéstől és a gyógyszerszedéstől. Közvetlenül az eljárás előtt öblítse ki a száját forralt vízzel.
A fenti szabályokat be kell tartani, amikor mintát veszünk az arc belső felületéről. Öblítés után javasolt a bőr enyhe masszírozása a mirigyváladék felszabadítása érdekében.
A vizeletet általában otthon gyűjtik. Ehhez alaposan meg kell mosni a nemi szerveket. Gyűjtsön össze 50-60 ml vizeletet egy steril műanyag edénybe. Az anyag tisztaságának biztosítása érdekében nőknek ajánlott tampont behelyezni a hüvelybe, férfiaknak pedig a bőrredőt lehetőség szerint kihúzni. A menstruációs ciklus ideje alatt nem adományozhat anyagot.
A spermiumok adományozásához az anyag felvétele előtt 3 napig tartózkodnia kell a közösüléstől. Ezenkívül az orvosok azt tanácsolják, hogy hagyjon fel a szauna látogatásával, forró fürdővel, alkohollal és fűszeres ételekkel. Az elemzés előtt 3 órával tartózkodnia kell a vizeléstől.
Szüléshez, például, ha a chlamydia PCR-elemzést végezzük, a nőknek és a férfiaknak egyaránt ajánlott 3 napig szexuális pihenés. Az elemzés előtt 2 héttel nem szabad antibakteriális gyógyszereket bevenni. Egy hétig abba kell hagynia az intim gélek, kenőcsök, hüvelykúpok használatát, az öblítést. A vizsgálat előtt 3 órával tartózkodnia kell a vizeléstől. A menstruáció alatt az anyagot nem veszik be, csak 3 nappal a vérfolyás megszűnése után lehet urogenitális kenetet venni.

PCR terhesség alatt

A babavárás során számos szexuális úton terjedő fertőzés rendkívül veszélyes a magzat normális fejlődésére. Az STD-k méhen belüli növekedési retardációt, vetélést vagy koraszülést, a gyermek veleszületett fejlődési rendellenességeit okozhatják. Ezért rendkívül fontos a PCR vizsgálat elvégzése a terhesség korai szakaszában. Az elemzést regisztrációkor át kell adni - legfeljebb 12 hétig.

Az anyagot a nyaki csatornából speciális kefével veszik ki. Az eljárás fájdalommentes és nem jelent veszélyt a babára. Általában a terhesség alatt a chlamydia elemzését a PCR-módszerrel, valamint az ureaplazmózist, a mikoplazmózist, a citomegalovírust, a herpeszt, a papillomavírust vizsgálják. Az ilyen vizsgálati komplexumot PCR-6-nak nevezik.

PCR a HIV diagnózisához

Tekintettel arra, hogy a módszer nagyon érzékeny a szervezetben bekövetkezett változásokra és a diagnózis feltételeire, számos tényező befolyásolhatja az eredményt. Ezért a PCR elemzése HIV-fertőzésre nem megbízható módszer, hatékonysága 96-98%. Az esetek fennmaradó 2-4%-ában a teszt hamis pozitív eredményt ad.

De bizonyos helyzetekben a HIV PCR-diagnosztikája nélkülözhetetlen. Általában álnegatív ELISA-teszttel rendelkezőknek adják. Az ilyen mutatók azt jelzik, hogy egy személyben még nem alakultak ki antitestek a vírus ellen, és ezek mennyiségének többszöri növekedése nélkül nem mutathatók ki. Pontosan ez érhető el PCR vérvizsgálattal.

Ilyen diagnosztikára van szükség a HIV-pozitív anyától született első életévben született gyermekeknél is. A módszer az egyetlen módja annak, hogy megbízhatóan meghatározzuk a gyermek állapotát.

PCR a hepatitis diagnosztizálására

A polimeráz láncreakciós módszer lehetővé teszi a hepatitis A, B, C vírus DNS-ének kimutatását jóval a fertőzés elleni antitestek képződése vagy a betegség tüneteinek megjelenése előtt. A hepatitis C PCR-analízise különösen hatékony, mivel az esetek 85% -ában az ilyen betegség tünetmentes, és időben történő kezelés nélkül krónikus stádiumba kerül.

A kórokozó időben történő felismerése segít elkerülni a szövődményeket és a hosszú távú kezelést.

Átfogó PCR vizsgálat

Átfogó PCR analízis: polimezar láncreakciós módszerrel végzett vizsgálat, mely magában foglalja többféle fertőzés egyidejű meghatározását: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovírus, herpes 1 és 2 típusú, gonorrhoea, papillomavírus . Az ilyen diagnózis ára 2000 és 3500 rubel között mozog. a klinikától, a felhasznált anyagoktól és berendezésektől, valamint az elemzés típusától függően: kvalitatív vagy kvantitatív. Mi szükséges az Ön esetében - az orvos dönti el. Egyes esetekben elegendő a kórokozó jelenlétének meghatározása, más esetekben, például HIV-fertőzés esetén, a mennyiségi titer fontos szerepet játszik. A fenti kórokozók mindegyikének diagnosztizálása során a vizsgálatot "PCR-12 elemzésnek" nevezik.

Az elemzési eredmények értelmezése

A PCR elemzés dekódolása nem nehéz. A mutatónak csak 2 skálája van - "pozitív eredmény" és "negatív eredmény". A kórokozó észlelésekor az orvosok 99%-os biztonsággal megerősíthetik a betegség jelenlétét, és megkezdhetik a beteg kezelését. A fertőzés meghatározásának kvantitatív módszerével a kimutatott baktériumok számszerű mutatója a megfelelő oszlopban jelenik meg. Csak az orvos tudja meghatározni a betegség mértékét és előírni a szükséges kezelést.

Egyes esetekben, például a HIV-fertőzés PCR-rel történő meghatározásakor, negatív eredmény esetén további vizsgálatokat kell végezni a kapott mutatók megerősítésére.

Hol lehet tesztelni?

Hol lehet PCR-elemzést végezni: állami klinikán vagy magánlaboratóriumban? Sajnos az önkormányzati egészségügyi intézményekben a berendezések és módszerek gyakran elavultak. Ezért jobb, ha előnyben részesítjük a modern berendezésekkel és magasan képzett személyzettel rendelkező magánlaboratóriumokat. Ezenkívül egy magánklinikán sokkal gyorsabban érheti el az eredményeket.

Moszkvában számos magánlaboratórium kínál PCR-elemzést különféle fertőzésekre. Például az olyan klinikákon, mint a "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro", PCR-elemzést végeznek. A vizsgálat költsége 200 rubeltől kezdődik. egy kórokozó azonosítására.

Megállapítható, hogy a fertőző betegségek PCR-sel történő diagnosztizálása a legtöbb esetben gyors és megbízható módszer a kórokozó kimutatására a szervezetben a fertőzés korai szakaszában. Ennek ellenére bizonyos esetekben érdemes más diagnosztikai módszereket választani. Egy ilyen vizsgálat szükségességét csak szakember tudja megállapítani. A PCR elemzés dekódolása is professzionális megközelítést igényel. Kövesse az orvos ajánlásait, és ne végezzen önálló vizsgálatokat, amelyekre nincs szükség.