Reaksi berantai polimerase (PCR)

Inti dari metode PCR. DNA polimerase

Reaksi berantai polimerase adalah metode eksperimental biologi molekuler yang memungkinkan peningkatan yang signifikan dalam konsentrasi kecil fragmen asam nukleat tertentu dalam bahan biologis. Proses penambahan jumlah salinan DNA ini disebut amplifikasi... Penyalinan DNA selama PCR dilakukan oleh enzim khusus - polimerase. DNA polimerase (Gbr. 3) adalah enzim yang terlibat dalam replikasi DNA (amplifikasi DNA pada organisme hidup). Enzim dari kelas ini mengkatalisis polimerisasi deoksiribonukleotida di sepanjang rantai nukleotida DNA, yang "dibaca" oleh enzim dan digunakan sebagai cetakan. Jenis nukleotida baru ditentukan menurut prinsip komplementaritas dengan cetakan dari mana nukleotida tersebut dibaca.

DNA polimerase menambahkan nukleotida bebas ke ujung 3 "dari untai yang dirakit. Hal ini menyebabkan pemanjangan untai dalam arah 5" -3 ". Tidak ada polimerase DNA yang diketahui dapat membuat untai dari awal: mereka hanya dapat menambahkan nukleotida gugus 3 "-hidroksil yang sudah ada. Untuk alasan ini, DNA polimerase membutuhkan primer- urutan nukleotida pendek (biasanya 20-25), melengkapi ujung gen yang diteliti - yang dapat ditambahkan nukleotida pertama. Primer selalu terdiri dari basa DNA dan RNA, sedangkan dua basa pertama selalu merupakan basa RNA. Primer disintesis oleh enzim lain - primazoy... Enzim lain - helikase- diperlukan untuk melepaskan heliks ganda DNA dengan pembentukan struktur untai tunggal, yang memastikan replikasi kedua untai sesuai dengan model replikasi DNA semi-konservasi.

Beberapa DNA polimerase juga memiliki kemampuan untuk mengoreksi kesalahan pada untai DNA yang baru dirakit. Jika pasangan nukleotida yang salah terdeteksi, DNA polimerase digulung mundur satu langkah, mengeluarkan nukleotida yang salah dari rantai, kemudian memasukkan nukleotida yang benar di tempatnya, setelah itu replikasi berlanjut seperti biasa.

Melaksanakan PCR

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode amplifikasi DNA, dengan bantuan yang, dalam beberapa jam, urutan DNA tertentu dapat diisolasi dan dikalikan miliaran kali. Kemungkinan memperoleh salinan dalam jumlah besar dari satu wilayah genom yang ditentukan secara ketat sangat menyederhanakan studi sampel DNA yang tersedia.

Untuk melakukan reaksi berantai polimerase, sejumlah kondisi harus dipenuhi. Untuk melakukan PCR dalam kasus yang paling sederhana, komponen berikut diperlukan:

Template DNA yang berisi daerah DNA yang akan diamplifikasi.

Dua primer melengkapi ujung fragmen yang diinginkan. (Sepasang oligonukleotida yang disintesis secara artifisial, biasanya berukuran 15 sampai 30 bp, identik dengan daerah yang sesuai dari DNA target. Mereka memainkan peran kunci dalam pembentukan produk reaksi amplifikasi. Primer yang dipilih dengan benar memberikan spesifisitas dan sensitivitas sistem pengujian.)

DNA polimerase termostabil. Polimerase yang digunakan dalam PCR harus tetap aktif pada suhu tinggi untuk waktu yang lama, oleh karena itu digunakan enzim yang diisolasi dari termofil - Thermus aquaticus (Taq polimerase) dan lain-lain.

Trifosfat deoksinukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ion Mg2+ diperlukan agar polimerase dapat bekerja.

Larutan penyangga menyediakan kondisi reaksi yang diperlukan - pH, kekuatan ionik larutan. Mengandung garam, serum albumin.

Untuk menghindari penguapan campuran reaksi, minyak dengan titik didih tinggi, misalnya vaselin, ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Jika Anda menggunakan alat dengan penutup berpemanas, hal ini tidak perlu dilakukan.

Penambahan pyrophosphatase dapat meningkatkan hasil reaksi PCR. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis pirofosfat, produk sampingan dari penambahan nukleotida trifosfat ke rantai DNA yang sedang tumbuh, menjadi ortofosfat. Pirofosfat dapat menghambat reaksi PCR.

Untuk memperbanyak jumlah salinan DNA asli, diperlukan reaksi siklik. Biasanya, setiap siklus PCR yang berulang secara berurutan terdiri dari tiga tahap:

1... Denaturasi, atau "pelelehan" DNA. Template DNA untai ganda dipanaskan hingga 94 - 96 ° C (atau hingga 98 ° C, jika polimerase termostabil digunakan) selama 0,5 - 2 menit untuk memungkinkan untai DNA terpisah. Tahap ini disebut denaturasi, karena ikatan hidrogen antara dua untai DNA dihancurkan. Kadang-kadang, sebelum siklus pertama (sebelum menambahkan polimerase), campuran reaksi dipanaskan terlebih dahulu selama 2 - 5 menit untuk mendenaturasi template dan primer sepenuhnya. Teknik ini disebut awal yang panas, memungkinkan untuk mengurangi jumlah produk reaksi non-spesifik.

2. Annealing - pengikatan primer ke DNA template... Ketika rantai telah menyimpang, suhu diturunkan secara perlahan sehingga parimer dapat mengikat matriks beruntai tunggal. Suhu anil tergantung pada komposisi primer dan biasanya dipilih 50-65 ° C. Waktu panggung - 20 - 60 detik. Pilihan suhu anil yang salah menyebabkan pengikatan primer yang buruk ke templat (pada suhu tinggi), atau pengikatan di tempat yang salah dan munculnya produk nonspesifik (pada suhu rendah).

3. Perpaduan (perpanjangan rantai). DNA polimerase mereplikasi untai cetakan menggunakan primer sebagai "benih". Polimerase memulai sintesis untai kedua dari ujung 3' primer, yang mengikat template dan bergerak sepanjang template. Temperatur perpanjangan tergantung pada polimerase. Polimerase Taq dan Pfu yang sering digunakan paling aktif pada 72 ° C. Waktu sintesis tergantung pada jenis DNA polimerase dan panjang fragmen yang akan diamplifikasi Biasanya, waktu pemanjangan diambil sama dengan satu menit untuk setiap seribu pasangan basa. Setelah akhir semua siklus, langkah tambahan sering dilakukan dilakukan perpanjangan akhir untuk menyelesaikan semua fragmen beruntai tunggal. Tahap ini berlangsung 7 sampai 10 menit.

Selanjutnya tahapan denaturasi, annealing dan elongasi diulang berkali-kali (30 kali atau lebih). Pada setiap siklus, jumlah salinan fragmen DNA yang disintesis menjadi dua kali lipat.

Semua reaksi dilakukan dalam tabung reaksi yang direndam dalam termostat. Rezim suhu diubah dan dipertahankan secara otomatis.

Untuk memahami dengan tepat bagaimana amplifikasi segmen DNA tertentu terjadi selama PCR, perlu untuk membayangkan dengan jelas posisi semua primer dan sekuens komplementernya dalam untai yang diamplifikasi di setiap putaran. Pada putaran pertama, masing-masing untai yang baru disintesis jauh lebih panjang daripada jarak dari gugus 3'-hidroksil primernya ke nukleotida terminal dari urutan yang melengkapi primer kedua. Untaian seperti itu disebut "templat panjang", mereka akan digunakan untuk sintesis lebih lanjut.

Pada putaran kedua, DNA untai ganda yang terdiri dari untaian yang serupa dan baru disintesis (templat panjang) didenaturasi kembali dan kemudian dianil dengan primer. Selama sintesis di babak ini, "templat panjang" disintesis lagi, serta sejumlah untaian dengan primer di satu ujung dan dengan urutan yang melengkapi primer kedua di ujung lainnya ("templat pendek"). Selama putaran ketiga, semua heterodupleks yang terbentuk sebelumnya secara bersamaan didenaturasi dan dianil dengan primer, dan kemudian direplikasi. Pada putaran berikutnya, jumlah "matriks pendek" menjadi semakin banyak, dan pada putaran ke-30 jumlahnya sudah melebihi jumlah rantai asli atau "matriks panjang" sebanyak 106 kali.

Jumlah produk reaksi spesifik (dibatasi oleh primer) secara teoritis meningkat sebanding dengan 2 n, di mana n adalah jumlah siklus reaksi. Faktanya, efisiensi setiap siklus mungkin kurang dari 100%, jadi pada kenyataannya:

di mana P adalah jumlah produk, E adalah efisiensi rata-rata siklus.

Jumlah salinan DNA "panjang" juga bertambah, tetapi secara linier; oleh karena itu, sebuah fragmen tertentu mendominasi dalam produk reaksi. Pertumbuhan produk yang dibutuhkan secara eksponensial dibatasi oleh jumlah reagen, adanya inhibitor, dan pembentukan produk sampingan.

PCR adalah metode yang sangat sensitif, oleh karena itu, jika ada sejumlah kecil DNA dalam sampel uji, yang secara tidak sengaja berpindah dari satu campuran reaksi ke campuran reaksi lainnya, hasil positif palsu dapat diperoleh. Ini membuatnya perlu untuk memantau semua larutan dan peralatan yang digunakan untuk PCR dengan hati-hati.

Prinsip dasar seleksi primer.

Saat membuat sistem pengujian PCR, salah satu tugas utama adalah pemilihan primer yang benar, yang harus memenuhi sejumlah kriteria:

1. Primer harus spesifik. Perhatian khusus diberikan pada ujung 3 'primer, karena dari merekalah untai DNA komplementer Taq polimerase mulai terbentuk. Jika spesifisitasnya tidak mencukupi, maka kemungkinan proses yang tidak diinginkan akan terjadi dalam tabung reaksi dengan campuran reaksi, yaitu sintesis DNA nonspesifik (fragmen pendek atau panjang). Terlihat pada elektroforesis dalam bentuk pita tambahan berat atau ringan. Hal ini mengganggu evaluasi hasil reaksi, karena mudah membingungkan suatu produk amplifikasi spesifik dengan DNA asing yang disintesis, hingga kehilangan sensitivitas yang signifikan.

2. Primer tidak boleh membentuk dimer dan loop; tidak ada rantai ganda yang stabil harus terbentuk sebagai hasil dari anil primer ke diri mereka sendiri atau satu sama lain.

Yang memungkinkan Anda mendeteksi dalam bahan biologis sejumlah kecil fragmen tertentu dengan lebih tepat, dan melipatgandakannya berkali-kali. Mereka kemudian diidentifikasi secara visual dengan elektroforesis gel. Reaksi ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh K. Mullis dan termasuk dalam daftar penemuan luar biasa beberapa tahun terakhir.

Bagaimana mekanisme PCR?

Seluruh teknik didasarkan pada kemampuan asam nukleat untuk mereplikasi secara independen, yang dalam hal ini dilakukan secara artifisial di laboratorium. Reproduksi DNA dapat dimulai tidak di wilayah molekul mana pun, tetapi hanya di wilayah dengan urutan nukleotida tertentu - fragmen awal. Agar reaksi berantai polimerase dapat dimulai, primer (atau probe DNA) diperlukan. Ini adalah fragmen pendek dari rantai DNA dengan urutan nukleotida tertentu. Mereka saling melengkapi (yaitu, sesuai) dengan situs awal

Tentu saja, untuk membuat primer, para ilmuwan harus mempelajari urutan nukleotida dari yang terlibat dalam teknik tersebut. Probe DNA inilah yang memberikan kekhususan reaksi dan inisiasinya. tidak akan bekerja jika sampel tidak mengandung setidaknya satu molekul DNA yang diinginkan. Secara umum, reaksi membutuhkan primer di atas, satu set nukleotida, dan DNA polimerase tahan panas. Yang terakhir adalah enzim - katalis untuk sintesis molekul asam nukleat baru berdasarkan sampel. Semua zat ini, termasuk bahan biologis yang diperlukan untuk mengidentifikasi DNA, digabungkan menjadi campuran reaksi (larutan). Itu ditempatkan di termostat khusus yang memanaskan dan mendinginkan dengan sangat cepat dalam waktu tertentu - sebuah siklus. Biasanya ada 30-50 dari mereka.

Bagaimana reaksi ini berlangsung?

Esensinya adalah bahwa selama satu siklus, primer melekat pada bagian DNA yang diinginkan, setelah itu digandakan di bawah aksi enzim. Berdasarkan untaian DNA yang dihasilkan, fragmen identik baru dan baru dari molekul disintesis dalam siklus berikutnya.

Reaksi berantai polimerase berlangsung secara berurutan, tahapan berikut dibedakan. Yang pertama ditandai dengan penggandaan jumlah produk selama setiap siklus pemanasan dan pendinginan. Pada tahap kedua, reaksi melambat, karena enzim rusak dan juga kehilangan aktivitas. Selain itu, cadangan nukleotida dan primer semakin menipis. Pada tahap terakhir - dataran tinggi - produk tidak lagi menumpuk, karena reagen sudah habis.

Di mana itu digunakan?

Tidak diragukan lagi, aplikasi terluas dari reaksi berantai polimerase adalah dalam kedokteran dan sains. Ini digunakan dalam biologi umum dan swasta, kedokteran hewan, farmasi dan bahkan ekologi. Selain itu, pada yang terakhir, ini dilakukan untuk melacak kualitas makanan dan benda-benda di lingkungan eksternal. Reaksi berantai polimerase secara aktif digunakan dalam praktik forensik untuk mengkonfirmasi ayah dan mengidentifikasi kepribadian seseorang. Dalam pemeriksaan medis forensik, serta dalam paleontologi, teknik ini seringkali merupakan satu-satunya jalan keluar, karena biasanya sejumlah kecil DNA tersedia untuk penelitian. Tentu saja, metode ini telah menemukan aplikasi yang sangat luas dalam pengobatan praktis. Ini diperlukan di bidang-bidang seperti genetika, penyakit menular dan onkologis.

Namun, pada saat itu ide ini tetap tidak diklaim. Reaksi berantai polimerase ditemukan kembali pada tahun 1983 oleh Carey Mallis. Tujuannya adalah untuk menciptakan sebuah metode yang akan memungkinkan amplifikasi DNA dalam rangka duplikasi sekuensial dari molekul DNA asli menggunakan enzim DNA polimerase. 7 tahun setelah publikasi ide ini, pada tahun 1993, Mullis menerima Hadiah Nobel untuk itu.

Pada awal penggunaan metode, setelah setiap siklus pemanasan - pendinginan, perlu untuk menambahkan DNA polimerase ke dalam campuran reaksi, karena dengan cepat dinonaktifkan pada suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan untaian heliks DNA. Prosedur ini sangat tidak efektif dan membutuhkan banyak waktu dan enzim. Pada tahun 1986, itu meningkat secara signifikan. Diusulkan untuk menggunakan DNA polimerase dari bakteri termofilik. Enzim-enzim ini ditemukan stabil secara termal dan mampu menahan beberapa siklus reaksi. Penggunaannya memungkinkan untuk menyederhanakan dan mengotomatisasi PCR. Salah satu polimerase DNA termostabil pertama diisolasi dari bakteri termus akuatikus dan bernama Taq-polimerase. Kerugian dari polimerase ini adalah bahwa kemungkinan memasukkan nukleotida yang salah cukup tinggi, karena enzim ini tidak memiliki mekanisme koreksi kesalahan (3 "→ 5" aktivitas eksonuklease). polimerase Pfu dan Pwo diisolasi dari archaea memiliki mekanisme seperti itu, penggunaannya secara signifikan mengurangi jumlah mutasi pada DNA, tetapi kecepatan kerjanya (prosesivitas) lebih rendah daripada Taq... Campuran sekarang digunakan Taq dan Pfu untuk mencapai kecepatan polimerisasi tinggi dan akurasi salinan tinggi.

Pada saat penemuan metode ini, Mallis bekerja untuk Cetus Corporation, yang mematenkan metode PCR. Pada tahun 1992, Cetus menjual hak atas metode dan paten untuk digunakan Taq-polymerase dari perusahaan Hoffmann-La Roche seharga $ 300 juta. Namun, ternyata Taq-polymerase dicirikan oleh ahli biokimia Rusia Alexei Kaledin pada tahun 1980, sehubungan dengan itu perusahaan Promega (Promega) mencoba memaksa Roche di pengadilan untuk melepaskan hak eksklusif atas enzim ini. Paten AS untuk metode PCR berakhir pada Maret 2005.

Melaksanakan PCR

Metode ini didasarkan pada penyalinan selektif beberapa wilayah DNA tertentu menggunakan enzim dalam kondisi buatan ( in vitro). Dalam hal ini, hanya bagian yang memenuhi kondisi tertentu yang disalin, dan hanya jika ada dalam sampel yang diteliti. Tidak seperti amplifikasi DNA pada organisme hidup, (replikasi), bagian DNA yang relatif pendek diamplifikasi menggunakan PCR. Dalam proses PCR konvensional, panjang daerah DNA yang disalin tidak lebih dari 3000 pasangan basa (3 kbp). Menggunakan campuran berbagai polimerase, menggunakan aditif dan dalam kondisi tertentu, panjang fragmen PCR dapat mencapai 20-40 ribu pasangan basa. Ini masih jauh lebih kecil dari panjang DNA kromosom sel eukariotik. Misalnya, genom manusia terdiri dari sekitar 3 miliar pasangan basa.

komponen reaksi

Untuk melakukan PCR dalam kasus yang paling sederhana, komponen berikut diperlukan:

matriks DNA berisi bagian DNA yang ingin Anda amplifikasi.
Dua primer komplementer ke ujung yang berlawanan dari untaian yang berbeda dari fragmen DNA yang diinginkan.
Tahan panas DNA polimerase- enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi DNA. Polimerase untuk digunakan dalam PCR harus mempertahankan aktivitas pada suhu tinggi untuk waktu yang lama, oleh karena itu, enzim yang diisolasi dari termofil digunakan - termus akuatikus(Taq polimerase), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerase), Pyrococcus woesei(Pwo-polimerase) dan lain-lain.
Deoksinukleosida trifosfat(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ion Mg2+ diperlukan agar polimerase dapat bekerja.
Solusi penyangga menyediakan kondisi reaksi yang diperlukan - pH, kekuatan ionik larutan. Mengandung garam, albumin serum sapi.

Untuk menghindari penguapan campuran reaksi, minyak dengan titik didih tinggi, misalnya vaselin, ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Ini tidak diperlukan jika pengendara sepeda termal dengan tutup berpemanas digunakan.

Primer

Spesifisitas PCR didasarkan pada pembentukan kompleks komplementer antara template dan primer, oligonukleotida sintetik pendek dengan panjang 18-30 basa. Masing-masing primer melengkapi salah satu untaian template untai ganda dan membatasi awal dan akhir daerah yang diperkuat.

Setelah hibridisasi template dengan primer (annealing), yang terakhir berfungsi sebagai primer untuk DNA polimerase dalam sintesis untai komplementer template (lihat).

Karakteristik yang paling penting dari primer adalah suhu leleh (T m) dari kompleks primer-templat. Tm adalah suhu di mana setengah dari cetakan DNA membentuk kompleks dengan primer oligonukleotida. Titik leleh dapat ditentukan secara kasar dengan rumus, di mana n X adalah jumlah nukleotida X dalam primer. Dalam kasus pilihan yang salah dari panjang dan komposisi nukleotida primer atau suhu anil, pembentukan kompleks komplementer sebagian dengan daerah lain dari DNA templat dimungkinkan, yang dapat menyebabkan munculnya produk nonspesifik. Batas atas titik leleh dibatasi oleh suhu optimal aksi polimerase, yang aktivitasnya menurun pada suhu di atas 80 ° C.

Saat memilih primer, disarankan untuk mematuhi kriteria berikut:

penguat

Beras. 1: Penguat untuk PCR

PCR dilakukan dalam amplifier - perangkat yang menyediakan pendinginan dan pemanasan tabung secara berkala, biasanya dengan akurasi setidaknya 0,1 ° C. Amplifier modern memungkinkan Anda untuk mengatur program yang kompleks, termasuk dengan kemungkinan "hot start", Touchdown PCR (lihat di bawah) dan penyimpanan selanjutnya dari molekul yang diperkuat pada 4 ° C. Untuk PCR real-time, perangkat yang dilengkapi dengan detektor fluoresen diproduksi. Ada juga instrumen dengan tutup otomatis dan kompartemen pelat mikro untuk integrasi ke dalam sistem otomatis.

Kemajuan reaksi

Foto gel yang mengandung DNA penanda (1) dan produk reaksi PCR (2,3). Angka-angka menunjukkan panjang fragmen DNA dalam pasangan nukleotida

Biasanya, saat melakukan PCR, dilakukan 20-35 siklus, yang masing-masing terdiri dari tiga tahap (Gbr. 2).

Denaturasi

Template DNA untai ganda dipanaskan hingga 94-96 ° C (atau 98 ° C jika polimerase termostabil digunakan) selama 0,5-2 menit untuk memungkinkan untai DNA terpisah. Tahap ini disebut denaturasi, karena ikatan hidrogen antara dua untai DNA dihancurkan. Kadang-kadang, sebelum siklus pertama (sebelum menambahkan polimerase), campuran reaksi dipanaskan selama 2-5 menit. untuk denaturasi lengkap dari template dan primer. Teknik ini disebut awal yang panas, memungkinkan untuk mengurangi jumlah produk reaksi non-spesifik.

anil

Ketika untaian telah menyebar, suhu diturunkan sehingga primer dapat mengikat template untai tunggal. Tahap ini disebut anil... Suhu anil tergantung pada komposisi primer dan biasanya dipilih 4-5 ° C di bawah titik lelehnya. Waktu panggung - 0,5-2 menit. Pilihan suhu anil yang salah menyebabkan pengikatan primer yang buruk ke templat (pada suhu tinggi), atau pengikatan di tempat yang salah dan munculnya produk nonspesifik (pada suhu rendah).

Pemanjangan

Varietas PCR

"Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - digunakan untuk mengurangi jumlah produk sampingan dari reaksi. Dua pasang primer digunakan dan dua reaksi berurutan dilakukan. Sepasang primer kedua mengamplifikasi untaian DNA di dalam produk reaksi pertama.
"Inverse" PCR (Inverse PCR (eng.)) - digunakan jika hanya area kecil dalam urutan yang diinginkan yang diketahui. Metode ini sangat berguna ketika diperlukan untuk menentukan urutan yang berdekatan setelah memasukkan DNA ke dalam genom. Untuk melakukan PCR terbalik, dilakukan serangkaian pemotongan DNA dengan endonuklease restriksi, diikuti dengan penyambungan fragmen (ligasi). Akibatnya, fragmen yang diketahui muncul di kedua ujung wilayah yang tidak diketahui, setelah itu PCR dapat dilakukan seperti biasa.
Reverse Transcription PCR (RT-PCR) digunakan untuk memperkuat, mengisolasi atau mengidentifikasi urutan yang diketahui dari perpustakaan RNA. Sebelum PCR konvensional, molekul DNA untai tunggal disintesis pada template mRNA menggunakan reverse transcriptase dan cDNA untai tunggal diperoleh, yang digunakan sebagai template untuk PCR. Metode ini sering digunakan untuk menentukan di mana dan kapan gen ini diekspresikan.
PCR asimetris (rus. PCR asimetris) - dilakukan bila perlu untuk mengamplifikasi terutama salah satu untai DNA asli. Digunakan dalam beberapa teknik analisis sekuensing dan hibridisasi. PCR dilakukan seperti biasa, kecuali salah satu primer diambil secara berlebihan.
PCR kuantitatif (Q-PCR) digunakan untuk mengukur dengan cepat jumlah DNA, cDNA, atau RNA tertentu dalam sampel.
PCR waktu-nyata kuantitatif - Metode ini menggunakan reagen berlabel fluoresen untuk mengukur secara akurat jumlah produk reaksi saat terakumulasi.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - dengan metode ini, efek pengikatan primer nonspesifik pada pembentukan produk berkurang. Siklus pertama dilakukan pada temperatur di atas temperatur annealing, kemudian temperatur diturunkan setiap beberapa siklus. Pada suhu tertentu, sistem akan melewati pita spesifisitas optimal primer untuk DNA.
Metode Koloni Molekuler (Gel PCR) Poloni - Koloni PCR) - gel akrilamida dipolimerisasi dengan semua komponen PCR di permukaan dan PCR dilakukan. Pada titik-titik yang mengandung DNA yang dianalisis, amplifikasi terjadi dengan pembentukan koloni molekuler.
PCR dengan amplifikasi cepat ujung cDNA (rus. Amplifikasi cepat ujung cDNA, RACE-PCR )
PCR Fragmen Panjang (rus. PCR jarak jauh) - modifikasi PCR untuk amplifikasi daerah DNA yang diperluas (10 ribu basa dan lebih banyak lagi). Dua polimerase digunakan, salah satunya adalah Taq polimerase dengan proses yang tinggi (yaitu mampu mensintesis rantai DNA yang panjang dalam satu lintasan), dan yang kedua adalah DNA polimerase dengan aktivitas endonuklease 3 "-5". Polimerase kedua diperlukan untuk memperbaiki kesalahan yang diperkenalkan oleh yang pertama.
PCR RAPD (eng. Amplifikasi Acak PCR DNA Polimorfik , PCR dengan amplifikasi acak DNA polimorfik - digunakan ketika perlu untuk membedakan organisme yang dekat dalam urutan genetik, misalnya, berbagai varietas tanaman budidaya, ras anjing atau mikroorganisme yang terkait erat. Metode ini biasanya menggunakan satu primer kecil (20-25 bp). Primer ini sebagian akan melengkapi daerah DNA acak dari organisme yang dipelajari. Dengan memilih kondisi (panjang primer, komposisi, suhu, dll.), dimungkinkan untuk mencapai perbedaan yang memuaskan dalam pola PCR untuk dua organisme.

Jika urutan nukleotida template sebagian atau tidak diketahui sama sekali, Anda dapat menggunakan primer yang merosot, urutan yang berisi posisi merosot di mana setiap basis dapat ditemukan. Misalnya, urutan primer mungkin: ... ATH ..., di mana H adalah A, T, atau C.

aplikasi PCR

PCR digunakan di banyak bidang untuk analisis dan eksperimen ilmiah.

Forensik

PCR digunakan untuk membandingkan apa yang disebut "sidik jari genetik". Sampel materi genetik dari TKP diperlukan - darah, air liur, air mani, rambut, dll. Ini dibandingkan dengan materi genetik tersangka. Jumlah DNA yang sangat kecil sudah cukup, secara teoritis - satu salinan. DNA dibelah menjadi fragmen-fragmen, kemudian diamplifikasi dengan PCR. Fragmen dipisahkan menggunakan elektroforesis DNA. Gambar yang dihasilkan dari lokasi pita DNA disebut sidik jari genetik(eng. sidik jari genetik).

Membangun paternitas

Beras. 3: Hasil elektroforesis fragmen DNA yang diamplifikasi dengan PCR. (1) Ayah. (2) Anak. (3) Ibu. Anak itu mewarisi beberapa karakteristik dari jejak genetik kedua orang tuanya, yang memberikan jejak baru yang unik.

Meskipun "sidik jari genetik" adalah unik (kecuali dalam kasus kembar identik), ikatan keluarga masih dapat dibangun dengan membuat beberapa sidik jari seperti itu (Gbr. 3). Metode yang sama dapat diterapkan, sedikit dimodifikasi, untuk membangun kekerabatan evolusioner di antara organisme.

Diagnostik medis

PCR memungkinkan untuk secara signifikan mempercepat dan memfasilitasi diagnosis penyakit keturunan dan virus. Gen yang diinginkan diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang sesuai dan kemudian diurutkan untuk mendeteksi mutasi. Infeksi virus dapat dideteksi segera setelah infeksi, berminggu-minggu atau berbulan-bulan sebelum gejala penyakit muncul.

Obat yang dipersonalisasi

Diketahui bahwa sebagian besar obat tidak bekerja pada semua pasien yang dituju, tetapi hanya pada 30-70% dari jumlah mereka. Selain itu, banyak obat yang bersifat toksik atau alergi pada beberapa pasien. Alasan untuk ini sebagian karena perbedaan individu dalam kerentanan dan metabolisme obat dan turunannya. Perbedaan ini ditentukan pada tingkat genetik. Misalnya, pada satu pasien, sitokrom tertentu (protein hati yang bertanggung jawab untuk metabolisme zat asing) mungkin lebih aktif, di lain kurang. Untuk menentukan jenis sitokrom yang dimiliki pasien tertentu, diusulkan untuk melakukan analisis PCR sebelum menggunakan obat. Analisis ini disebut genotipe awal (eng. genotipe prospektif).

Kloning gen

Kloning gen (jangan dikelirukan dengan kloning organisme) adalah proses mengisolasi gen dan, sebagai hasil manipulasi rekayasa genetika, memperoleh sejumlah besar produk dari gen tertentu. PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen, yang kemudian dimasukkan ke dalam vektor- fragmen DNA yang mentransfer gen asing ke organisme yang sama atau yang lain, nyaman untuk tumbuh. Sebagai vektor yang digunakan, misalnya, plasmid atau DNA virus. Penyisipan gen ke dalam organisme asing biasanya digunakan untuk mendapatkan produk dari gen ini - RNA atau, lebih sering, protein. Dengan demikian, banyak protein diperoleh dalam jumlah industri untuk digunakan dalam pertanian, obat-obatan, dll.

Beras. 4: Mengkloning gen menggunakan plasmid. ...
(1) DNA kromosom organisme A. (2) PCR. (3) Banyak salinan gen organisme A. (4) Penyisipan gen ke dalam plasmid. (5) Plasmid dengan gen organisme A. (6) Introduksi plasmid ke organisme B. (7) Perkalian jumlah salinan gen organisme A pada organisme B.

pengurutan DNA

Dalam metode sekuensing menggunakan dideoksinukleotida berlabel fluoresen atau isotop radioaktif, PCR merupakan bagian integral, karena selama polimerisasi turunan nukleotida yang diberi label dengan label fluoresen atau radioaktif dimasukkan ke dalam rantai DNA. Ini menghentikan reaksi, memungkinkan posisi nukleotida spesifik ditentukan setelah pemisahan untaian yang disintesis dalam gel.

Mutagenesis

Saat ini, PCR telah menjadi metode utama untuk melakukan mutagenesis. Penggunaan PCR memungkinkan untuk menyederhanakan dan mempercepat prosedur untuk melakukan mutagenesis, serta membuatnya lebih andal dan dapat direproduksi.

1. Reaksi berantai polimerase (PCR)

2. Prinsip metode reaksi berantai polimerase

2.1 Kehadiran sejumlah komponen dalam campuran reaksi

2.2 Kondisi suhu siklik

2.3 Prinsip dasar pemilihan primer

2.4 Efek "dataran tinggi"

3. Tahapan produksi PCR

3.2 Amplifikasi

3.4.1 Kontrol positif

3.4.2 Kontrol internal

4.1 Analisis kualitatif

4.1.2 Deteksi molekul RNA

3.1 Persiapan sampel bahan biologis

Untuk ekstraksi DNA, berbagai teknik digunakan, tergantung pada tugasnya. Esensinya terletak pada ekstraksi (ekstraksi) DNA dari produk biologis dan penghilangan atau netralisasi pengotor untuk mendapatkan preparasi DNA dengan kemurnian yang sesuai untuk PCR.

Metode untuk mendapatkan preparasi DNA murni yang dijelaskan oleh Marmur dianggap standar dan telah menjadi klasik. Ini termasuk proteolisis enzimatik diikuti oleh deproteinisasi dan pengendapan kembali DNA dengan alkohol. Metode ini memungkinkan Anda untuk mendapatkan preparasi DNA murni. Namun, ini cukup melelahkan dan melibatkan bekerja dengan zat agresif dan tajam seperti fenol dan kloroform.

Salah satu metode yang sedang populer saat ini adalah metode ekstraksi DNA yang diusulkan oleh Boom et al. Metode ini didasarkan pada penggunaan agen chaotropic yang kuat, guanidin tiosianat (GuSCN), untuk lisis sel, dan selanjutnya penyerapan DNA pada pembawa (manik-manik kaca, tanah diatom, kaca "susu", dll.). Setelah dicuci, DNA tetap berada dalam sampel, teradsorpsi pada pembawa, dari mana DNA dapat dengan mudah dihilangkan menggunakan buffer elusi. Metode ini nyaman, berteknologi dan cocok untuk menyiapkan sampel untuk amplifikasi. Namun, kehilangan DNA dimungkinkan karena penyerapan ireversibel pada pembawa, serta dalam proses banyak pencucian. Ini sangat penting ketika bekerja dengan sejumlah kecil DNA dalam sampel. Selain itu, bahkan jumlah jejak GuSCN dapat menghambat PCR. Karena itu, ketika menggunakan metode ini, pilihan sorben yang tepat dan memperhatikan nuansa teknologi sangat penting.

Kelompok lain dari metode persiapan sampel didasarkan pada penggunaan penukar ion tipe Chilex, yang, tidak seperti kaca, tidak menyerap DNA, tetapi, sebaliknya, pengotor yang mengganggu reaksi. Sebagai aturan, teknologi ini mencakup dua tahap: perebusan sampel dan penyerapan pengotor pada penukar ion. Metode ini sangat menarik karena kesederhanaan pelaksanaannya. Dalam kebanyakan kasus, sangat cocok untuk bekerja dengan bahan klinis. Sayangnya, terkadang ada sampel dengan pengotor seperti itu yang tidak dapat dihilangkan menggunakan penukar ion. Selain itu, beberapa mikroorganisme tidak dapat dihancurkan dengan perebusan sederhana. Dalam kasus ini, perlu untuk memperkenalkan tahap tambahan pemrosesan sampel.

Dengan demikian, pilihan metode preparasi sampel harus dipertimbangkan dengan pemahaman tentang tujuan analisis yang dimaksud.

3.2 Amplifikasi

Untuk melakukan reaksi amplifikasi, perlu menyiapkan campuran reaksi dan menambahkan sampel DNA yang dianalisis ke dalamnya. Dalam hal ini, penting untuk mempertimbangkan beberapa fitur anil primer. Faktanya adalah bahwa, sebagai aturan, sampel biologis yang dianalisis mengandung berbagai molekul DNA, di mana primer yang digunakan dalam reaksi memiliki homologi parsial, dan dalam beberapa kasus signifikan. Selain itu, primer dapat saling anil untuk membentuk dimer primer. Keduanya menyebabkan konsumsi primer yang signifikan untuk sintesis produk sampingan (nonspesifik) produk reaksi dan, sebagai akibatnya, secara signifikan mengurangi sensitivitas sistem. Hal ini membuat sulit atau tidak mungkin untuk membaca hasil reaksi selama elektroforesis.

3.3 Penilaian hasil reaksi

Untuk penilaian hasil PCR yang benar, penting untuk dipahami bahwa metode ini tidak kuantitatif. Secara teoritis, produk amplifikasi molekul DNA target tunggal dapat dideteksi dengan elektroforesis setelah 30-35 siklus. Namun, dalam praktiknya, ini hanya dilakukan dalam kasus-kasus di mana reaksi berlangsung dalam kondisi yang mendekati ideal, yang tidak sering ditemui dalam kehidupan. Tingkat kemurnian preparasi DNA memiliki pengaruh yang sangat besar pada efisiensi amplifikasi, yaitu kehadiran inhibitor tertentu dalam campuran reaksi, yang dalam beberapa kasus bisa sangat sulit untuk dihilangkan. Kadang-kadang, karena kehadirannya, tidak mungkin untuk mengamplifikasi bahkan puluhan ribu molekul DNA target. Jadi, seringkali tidak ada hubungan langsung antara jumlah awal DNA target dan jumlah akhir produk amplifikasi.

3.3.1 Metode elektroforesis horizontal

Berbagai metode digunakan untuk memvisualisasikan hasil amplifikasi. Metode yang paling umum saat ini adalah elektroforesis, berdasarkan pemisahan molekul DNA berdasarkan ukuran. Untuk melakukan ini, siapkan sepiring gel agarosa, yang dibekukan setelah meleleh dalam buffer elektroforesis agarosa pada konsentrasi 1,5-2,5% dengan penambahan pewarna DNA khusus, misalnya, etidium bromida. Agarosa beku membentuk kisi spasial. Saat mengisi dengan sisir, sumur khusus terbentuk dalam gel, di mana produk amplifikasi selanjutnya diperkenalkan. Pelat gel ditempatkan dalam peralatan elektroforesis gel horizontal dan sumber tegangan konstan dihubungkan. DNA bermuatan negatif mulai bergerak dari minus ke plus dalam gel. Dalam hal ini, molekul DNA yang lebih pendek bergerak lebih cepat daripada yang panjang. Kecepatan pergerakan DNA dalam gel dipengaruhi oleh konsentrasi agarosa, kekuatan medan listrik, suhu, komposisi buffer elektroforesis dan, pada tingkat lebih rendah, komposisi GC DNA. Semua molekul dengan ukuran yang sama bergerak dengan kecepatan yang sama. Pewarna tertanam (diselingi) dalam kelompok planar menjadi molekul DNA. Setelah akhir elektroforesis, yang berlangsung dari 10 menit hingga 1 jam, gel ditempatkan pada filter transiluminator yang memancarkan cahaya dalam kisaran ultraviolet (254 - 310 nm). Energi UV yang diserap oleh DNA di wilayah 260 nm ditransfer ke pewarna, menyebabkannya berfluoresensi di wilayah oranye-merah dari spektrum yang terlihat (590 nm).

Kecerahan pita produk amplifikasi bisa berbeda. Namun, ini tidak dapat dikaitkan dengan jumlah awal DNA target dalam sampel.

3.3.2 Metode elektroforesis vertikal

Metode elektroforesis vertikal pada dasarnya mirip dengan elektroforesis horizontal. Perbedaannya terletak pada kenyataan bahwa dalam hal ini gel poliakrilamida digunakan sebagai pengganti agarosa. Itu dilakukan di ruang khusus untuk elektroforesis vertikal. Elektroforesis gel poliakrilamida memiliki resolusi yang lebih tinggi dibandingkan dengan elektroforesis agarosa dan memungkinkan untuk membedakan molekul DNA dengan ukuran berbeda dengan akurasi satu nukleotida. Persiapan gel poliakrilamida agak lebih rumit daripada gel agarosa. Selain itu, akrilamida adalah zat beracun. Karena kebutuhan untuk menentukan ukuran produk amplifikasi dengan akurasi 1 nukleotida jarang muncul, metode elektroforesis horizontal digunakan dalam pekerjaan rutin.

3.4 Kontrol atas jalannya reaksi amplifikasi

3.4.1 Kontrol positif

Persiapan DNA dari mikroorganisme yang diinginkan digunakan sebagai "kontrol positif". Amplikon nonspesifik berbeda dalam ukuran dari amplikon yang dihasilkan oleh amplifikasi dengan preparasi DNA kontrol. Ukuran produk nonspesifik dapat lebih besar atau lebih kecil dari kontrol positif. Dalam kasus terburuk, dimensi ini mungkin bertepatan dan dibaca sebagai positif dalam elektroforesis.

Untuk mengontrol spesifisitas produk amplifikasi yang dihasilkan, Anda dapat menggunakan probe hibridisasi (daerah DNA yang terletak di dalam urutan yang diperkuat) yang diberi label dengan label enzim atau isotop radioaktif dan berinteraksi dengan DNA sesuai dengan prinsip yang sama seperti primer. Ini secara signifikan memperumit dan memperpanjang analisis, dan biayanya meningkat secara signifikan.

3.4.2 Kontrol internal

Hal ini diperlukan untuk mengontrol jalannya amplifikasi di setiap tabung dengan campuran reaksi. Untuk tujuan ini, tambahan, yang disebut "pengendalian internal" digunakan. Ini adalah setiap persiapan DNA yang tidak seperti DNA dari mikroorganisme target. Jika kontrol internal ditambahkan ke campuran reaksi, itu akan menjadi target yang sama untuk anil primer sebagai DNA kromosom dari agen infeksi yang diinginkan. Ukuran produk amplifikasi dari pengendalian internal dipilih sehingga 2 kali atau lebih lebih besar dari amplikon yang terbentuk dari amplifikasi DNA mikroorganisme yang diinginkan. Akibatnya, jika DNA kontrol internal ditambahkan ke dalam campuran reaksi bersama dengan sampel uji, maka terlepas dari keberadaan mikroorganisme dalam sampel biologis, kontrol internal akan menyebabkan pembentukan amplikon spesifik, tetapi lebih lama (berat ) daripada amplikon mikroorganisme. Kehadiran amplikon berat dalam campuran reaksi akan menunjukkan kemajuan normal dari reaksi amplifikasi dan tidak adanya inhibitor. Jika amplikon dengan ukuran yang diperlukan belum terbentuk, tetapi amplikon pengendalian internal juga belum terbentuk, dapat disimpulkan bahwa ada pengotor yang tidak diinginkan dalam sampel yang dianalisis, yang harus dihilangkan, tetapi bukan tentang tidak adanya DNA yang diinginkan. .

Sayangnya, terlepas dari semua daya tarik pendekatan ini, pendekatan ini memiliki kelemahan yang signifikan. Jika DNA yang diperlukan ada dalam campuran reaksi, maka efisiensi amplifikasinya berkurang tajam karena persaingan dengan kontrol internal untuk primer. Ini sangat penting pada konsentrasi DNA yang rendah dalam sampel uji, yang dapat menyebabkan hasil negatif palsu.

Namun demikian, jika masalah persaingan untuk primer diselesaikan, metode pengendalian efisiensi amplifikasi ini tentu akan sangat berguna.

4. Metode berdasarkan reaksi berantai polimerase

4.1 Analisis kualitatif

Metode klasik melakukan PCR, prinsip-prinsip yang diuraikan di atas, menemukan perkembangannya dalam beberapa modifikasi yang bertujuan untuk mengatasi keterbatasan PCR dan meningkatkan efisiensi reaksi.

4.1.1 Metode pengaturan PCR menggunakan "hot start"

Untuk mengurangi risiko pembentukan produk nonspesifik dari reaksi amplifikasi, pendekatan yang disebut "start panas" ("Hot-start") digunakan.

Faktanya adalah, tergantung pada komposisi dan ukuran GC, primer memiliki titik leleh (Tm) tertentu. Jika suhu sistem melebihi Tm, primer tidak dapat menempel pada untai DNA dan mengalami denaturasi. Dalam kondisi optimal, yaitu suhu anil mendekati suhu leleh, primer membentuk molekul beruntai ganda hanya di bawah kondisi komplementaritas lengkap dan, dengan demikian, memastikan spesifisitas reaksi.

Ada berbagai opsi untuk menerapkan hot start:

Pengenalan Taq-polimerase ke dalam campuran reaksi selama siklus pertama setelah pemanasan tabung ke suhu denaturasi.

Pemisahan bahan campuran reaksi dengan lapisan parafin menjadi lapisan (di bagian bawah - primer, di bagian atas - Taq-polimerase dan target DNA), yang dicampur ketika parafin dicairkan (~ 65-75 0 ).

Penggunaan antibodi monoklonal untuk Taq polimerase. Enzim yang terikat oleh antibodi monoklonal menjadi aktif hanya setelah tahap denaturasi pertama, ketika antibodi monoklonal terdenaturasi secara ireversibel dan melepaskan situs aktif Taq polimerase.

Dalam semua kasus ini, bahkan jika anil nonspesifik terjadi sebelum permulaan siklus suhu, pemanjangan tidak terjadi, dan pada pemanasan, kompleks primer-DNA terdenaturasi, oleh karena itu produk nonspesifik tidak terbentuk. Selanjutnya, suhu dalam tabung reaksi tidak turun di bawah suhu leleh, yang memastikan pembentukan produk amplifikasi tertentu.

4.1.2 Deteksi molekul RNA

Kemungkinan menggunakan RNA sebagai target PCR secara signifikan memperluas jangkauan aplikasi metode ini. Misalnya, genom banyak virus (hepatitis C, virus influenza, picornavirus, dll.) diwakili oleh RNA. Pada saat yang sama, tidak ada fase peralihan menjadi DNA dalam siklus hidup mereka. Untuk mendeteksi RNA, pertama-tama perlu mengubahnya menjadi bentuk DNA. Untuk ini, transkriptase terbalik digunakan, yang diisolasi dari dua virus berbeda: virus avian myeloblastosis dan virus leukemia murine Moloney. Penggunaan enzim ini dikaitkan dengan beberapa kesulitan. Pertama-tama, mereka termolabil dan oleh karena itu dapat digunakan pada suhu tidak lebih tinggi dari 42 ° C. Karena pada suhu ini molekul RNA dengan mudah membentuk struktur sekunder, efisiensi reaksi berkurang secara nyata dan, menurut berbagai perkiraan, sekitar 5%. Upaya sedang dilakukan untuk menghindari kelemahan ini menggunakan polimerase termostabil yang diperoleh dari mikroorganisme termofilik Thermus Thermophilus, yang menunjukkan aktivitas transkriptase dengan adanya Mn2+, sebagai transkriptase terbalik. Ini adalah satu-satunya enzim yang diketahui mampu menunjukkan aktivitas polimerase dan transkriptase.

Untuk melakukan reaksi transkripsi balik dalam campuran reaksi, serta dalam PCR, primer harus ada sebagai primer dan campuran 4 dNTP sebagai bahan bangunan.

Setelah reaksi transkripsi terbalik, molekul cDNA yang dihasilkan dapat berfungsi sebagai target PCR.

5. Organisasi proses teknologi pementasan PCR

Sensitivitas yang berpotensi tinggi dari reaksi berantai polimerase membuat desain laboratorium PCR yang menyeluruh sangat penting. Ini karena masalah metode yang paling akut - kontaminasi.

Kontaminasi adalah masuknya molekul DNA spesifik dari lingkungan luar ke dalam campuran reaksi yang dapat berfungsi sebagai target dalam reaksi amplifikasi dan memberikan hasil positif palsu.

Ada beberapa cara untuk menghadapi fenomena yang tidak menyenangkan ini. Salah satunya adalah penggunaan enzim N-urasil-glikosilase (UG). Metode ini didasarkan pada kemampuan UG untuk membelah molekul DNA dengan urasil tertanam. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan campuran dNTP, di mana dTTP digantikan oleh urasil, dan setelah siklus termal, semua amplikon yang terbentuk dalam tabung reaksi akan mengandung urasil. Jika UG ditambahkan ke dalam campuran reaksi sebelum amplifikasi, maka amplikon dalam campuran reaksi akan hancur, sedangkan DNA asli akan tetap utuh dan selanjutnya akan berfungsi sebagai target amplifikasi.

Dengan demikian, metode ini hanya sampai batas tertentu menghilangkan sumber kontaminasi dan tidak menjamin hasil positif palsu.

Cara lain untuk menangani hasil kontaminasi adalah dengan mengurangi jumlah siklus reaksi secara signifikan (hingga 25-30 siklus). Tetapi bahkan dengan pendekatan ini, risiko memperoleh hasil positif palsu tinggi, karena dalam kasus ini, tanpa adanya inhibitor, mudah untuk mendapatkan produk amplifikasi karena kontaminasi.

Jadi, terlepas dari manfaat tindakan preamplifikasi yang ditujukan untuk menonaktifkan molekul DNA yang menyebabkan hasil positif palsu, cara yang paling radikal adalah pengorganisasian laboratorium yang dipikirkan dengan matang.

Kesimpulan

Metode PCR yang paling luas saat ini diterima sebagai metode untuk mendiagnosis berbagai penyakit menular. PCR memungkinkan Anda untuk mengidentifikasi etiologi infeksi, bahkan jika sampel yang diambil untuk analisis hanya mengandung beberapa molekul DNA patogen. PCR banyak digunakan dalam diagnosis dini infeksi HIV, hepatitis virus, dll. Saat ini, hampir tidak ada agen infeksi yang tidak dapat dideteksi menggunakan PCR.

Belum lama ini, metode yang andal, sangat sensitif, dan cepat untuk mendiagnosis berbagai penyakit menular pada manusia dikembangkan. Metode ini disebut "analisis PCR". Apa itu, apa esensinya, mikroorganisme apa yang dapat dideteksi dan bagaimana cara mengambilnya dengan benar, kami akan memberi tahu Anda di artikel kami.

Sejarah penemuan

Juga, metode PCR digunakan dalam diagnosis kanker.

Keuntungan metode

Diagnostik PCR memiliki sejumlah keunggulan:

Sensitivitas tinggi. Bahkan dengan hanya beberapa molekul DNA mikroorganisme, analisis PCR menentukan adanya infeksi. Metode ini akan membantu dengan penyakit kronis dan laten. Seringkali dalam kasus seperti itu, mikroorganisme tidak dibudidayakan dengan cara lain.
Bahan apa pun cocok untuk penelitian, misalnya, air liur, darah, sekresi genital, rambut, sel epitel. Yang paling umum adalah tes darah dan apusan urogenital untuk PCR.
Budidaya tanaman jangka panjang tidak diperlukan. Proses diagnostik otomatis memungkinkan Anda untuk mendapatkan hasil penelitian setelah 4-5 jam.
Metode ini hampir 100% dapat diandalkan. Hanya beberapa kasus hasil negatif palsu yang tercatat.
Kemampuan untuk mengidentifikasi beberapa jenis patogen dari satu sampel bahan. Ini tidak hanya mempercepat proses diagnosis penyakit, tetapi juga secara signifikan mengurangi biaya material. Seringkali dokter meresepkan analisis PCR yang komprehensif. Biaya pemeriksaan, yang terdiri dari mengidentifikasi enam patogen, adalah sekitar 1.500 rubel.

Agar hasil dapat diandalkan saat melakukan studi PCR, perlu untuk lulus analisis, mengamati rekomendasi untuk persiapan awal diagnosis:

Sebelum mendonorkan air liur, sebaiknya menahan diri dari makan dan minum obat selama 4 jam sebelum mengambil bahan. Segera sebelum prosedur, bilas mulut Anda dengan air matang.
Aturan di atas harus diikuti saat mengambil sampel dari permukaan bagian dalam pipi. Setelah dibilas, disarankan untuk melakukan pijatan ringan pada kulit untuk melepaskan sekresi kelenjar.
Urine biasanya dikumpulkan di rumah. Untuk melakukan ini, Anda perlu melakukan toilet alat kelamin secara menyeluruh. Kumpulkan 50-60 ml urin dalam wadah plastik steril. Untuk menjaga kemurnian bahan, dianjurkan bagi wanita untuk memasukkan tampon ke dalam vagina, dan bagi pria untuk menarik lipatan kulit sebanyak mungkin. Anda tidak dapat menyumbangkan materi selama periode aliran menstruasi.
Untuk mendonorkan sperma, Anda harus menahan diri dari hubungan seksual selama 3 hari sebelum mengambil bahan tersebut. Juga, dokter menyarankan untuk berhenti mengunjungi sauna dan mandi air panas, minum alkohol dan makanan pedas. Selama 3 jam sebelum analisis, Anda harus menahan diri untuk tidak buang air kecil.
Untuk persalinan misalnya jika dilakukan analisis chlamydia PCR, baik wanita maupun pria dianjurkan untuk melakukan istirahat seksual selama 3 hari. Obat antibakteri tidak boleh diminum 2 minggu sebelum analisis. Selama seminggu, Anda harus berhenti menggunakan gel intim, salep, supositoria vagina, douching. Selama 3 jam sebelum penelitian, Anda harus menahan diri dari buang air kecil. Selama menstruasi, bahan tidak diambil, hanya 3 hari setelah penghentian keluarnya darah, Anda dapat mengambil apusan urogenital.

PCR selama kehamilan

Saat menunggu bayi, banyak infeksi menular seksual yang sangat berbahaya bagi perkembangan normal janin. PMS dapat memicu keterbelakangan pertumbuhan intrauterin, keguguran atau kelahiran prematur, malformasi kongenital anak. Oleh karena itu, sangat penting untuk menjalani pemeriksaan PCR pada tahap awal kehamilan. Penting untuk lulus analisis saat pendaftaran - hingga 12 minggu.

Bahannya diambil dari saluran serviks menggunakan sikat khusus. Prosedur ini tidak menimbulkan rasa sakit dan tidak menimbulkan bahaya bagi bayi. Biasanya, selama kehamilan, analisis dilakukan untuk klamidia dengan metode PCR, serta untuk ureaplasmosis, mikoplasmosis, cytomegalovirus, herpes, papillomavirus. Kompleks pemeriksaan seperti itu disebut PCR-6.

PCR untuk diagnosis HIV

Karena fakta bahwa metode ini sangat sensitif terhadap perubahan tubuh dan kondisi diagnosis, banyak faktor yang dapat mempengaruhi hasilnya. Oleh karena itu, analisis PCR untuk infeksi HIV bukanlah metode yang dapat diandalkan, efisiensinya adalah 96-98%. Dalam sisa 2-4% kasus, tes memberikan hasil positif palsu.

Tetapi dalam beberapa situasi, diagnosa PCR HIV sangat diperlukan. Biasanya diberikan kepada orang dengan tes ELISA negatif palsu. Indikator tersebut menunjukkan bahwa seseorang belum mengembangkan antibodi terhadap virus dan mereka tidak dapat dideteksi tanpa peningkatan jumlah yang berlipat ganda. Inilah yang dapat dicapai dengan tes darah PCR.

Diagnostik semacam itu juga diperlukan untuk anak-anak di tahun pertama kehidupan yang lahir dari ibu HIV-positif. Metode ini adalah satu-satunya cara untuk menentukan status anak secara andal.

PCR untuk diagnosis hepatitis

Metode reaksi berantai polimerase memungkinkan pendeteksian DNA virus hepatitis A, B, C jauh sebelum pembentukan antibodi terhadap infeksi atau munculnya gejala penyakit. Analisis PCR untuk hepatitis C sangat efektif, karena pada 85% kasus, penyakit seperti itu tidak menunjukkan gejala dan tanpa pengobatan tepat waktu masuk ke tahap kronis.

Deteksi patogen tepat waktu akan membantu menghindari komplikasi dan pengobatan jangka panjang.

Pemeriksaan PCR yang komprehensif

Analisis PCR komprehensif: pemeriksaan dengan reaksi berantai polimesar, yang meliputi penentuan beberapa jenis infeksi sekaligus: mycoplasma genitalia, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomegalovirus, jenis herpes 1 dan 2, gonore, papillomavirus. Harga diagnosis semacam itu berkisar antara 2.000 hingga 3.500 rubel. tergantung pada klinik, bahan dan peralatan yang digunakan, serta jenis analisis: kualitatif atau kuantitatif. Apa yang dibutuhkan dalam kasus Anda - dokter akan memutuskan. Dalam beberapa kasus, cukup hanya untuk menentukan keberadaan patogen, pada kasus lain, misalnya, dengan infeksi HIV, titer kuantitatif memainkan peran penting. Saat mendiagnosis semua patogen di atas, pemeriksaannya disebut "analisis PCR-12".

Interpretasi hasil analisis

Decoding analisis PCR tidak sulit. Hanya ada 2 skala indikator - "hasil positif" dan "hasil negatif". Ketika patogen terdeteksi, dokter dapat mengkonfirmasi keberadaan penyakit dengan kepastian 99% dan mulai merawat pasien. Dengan metode kuantitatif untuk menentukan infeksi, indikator numerik dari bakteri yang terdeteksi akan ditunjukkan pada kolom yang sesuai. Hanya dokter yang dapat menentukan tingkat penyakit dan meresepkan perawatan yang diperlukan.

Dalam beberapa kasus, misalnya, ketika menentukan infeksi HIV dengan PCR, jika hasilnya negatif, perlu dilakukan pemeriksaan tambahan untuk mengkonfirmasi indikator yang diperoleh.

Di mana harus diuji?

Di mana mengambil analisis PCR: di klinik negara atau di laboratorium swasta? Sayangnya, di institusi medis kota, peralatan dan metode sering ketinggalan zaman. Oleh karena itu, lebih baik memberikan preferensi ke laboratorium swasta dengan peralatan modern dan personel yang berkualifikasi tinggi. Selain itu, di klinik swasta, Anda akan mendapatkan hasil yang jauh lebih cepat.

Di Moskow, banyak laboratorium swasta menawarkan analisis PCR untuk berbagai infeksi. Misalnya, di klinik seperti "Vita", "Klinik Kompleks", "Keluarga Bahagia", "Uro-Pro", analisis PCR dilakukan. Biaya pemeriksaan adalah dari 200 rubel. untuk mengidentifikasi satu patogen.

Dapat disimpulkan bahwa diagnosis penyakit menular dengan PCR dalam banyak kasus adalah cara yang cepat dan andal untuk mendeteksi patogen dalam tubuh pada tahap awal infeksi. Namun tetap saja, dalam kasus tertentu, ada baiknya memilih metode diagnostik lain. Hanya seorang spesialis yang dapat menentukan perlunya studi semacam itu. Decoding analisis PCR juga membutuhkan pendekatan profesional. Ikuti rekomendasi dokter dan jangan melakukan tes sendiri yang tidak perlu.