стерилност

Хранене

Прозрачност

изотоничност

Таблица 7. Размножаване на бактерии върху хранителни среди.

Таблица 7.1. Класификация на хранителните среди.

Таблица 7.2. Принципи на изолиране на чиста клетъчна култура.

Таблица 7.2.1. Етапи на изолиране на чиста клетъчна култура.

Таблица 7.3. Идентификация на бактерии.

Кой от процесите не е свързан с физиологията на бактериите?

възпроизвеждане

Какви вещества съставляват 40-80% от сухата маса на бактериална клетка?

Въглехидрати

Нуклеинова киселина

Какви класове ензими се синтезират от микроорганизми?

оксидоредуктази

Всички класове

Трансферази

Ензими, чиято концентрация в клетката се повишава рязко в отговор на появата на индукторен субстрат в околната среда?

Изводимо

конституционен

Репресивни

Мултиензимни комплекси

Ензим за патогенност, секретиран от Staphylococcus aureus?

Невраминидаза

Хиалуронидаза

Лецитиназа

фибринолизин

Каква е функцията на протеолитичните ензими?

Разграждане на протеини

Разграждане на мазнини

Разграждането на въглехидратите

Образуване на алкали

Ферментация на ентеробактерии?

млечна киселина

Мравчена киселина

пропионова киселина

Маслена

Какви минерални съединения се използват за свързване на tRNA към рибозомите?

Биологичното окисление е...?

1. възпроизвеждане

2. клетъчна смърт

Кои вещества сами синтезират всички въглерод-съдържащи компоненти на клетката от CO 2 .

Прототрофи

Хетеротрофи

Автотрофи

Сапрофити

Хранителните среди са различни:

Състав

По консистенция

По уговорка

За всичко изброено по-горе

Фазата на размножаване, която се характеризира с баланс между броя на мъртвите, новообразуваните и спящите клетки?

2. Фаза на отрицателно ускорение

   Стационарна фаза

Продължителността на поколението зависи от?

възраст

Популации

Всички от горепосочените

За да се установи видовата принадлежност на бактериите, често се изследва тяхната антигенна структура, тоест се идентифицират, коя?

биологичен

Морфологични

Серологични

Биохимичен

Методът на повърхностно засяване на Дригалски се нарича...?

Механични принципи на изолиране на чиста култура

Биологични принципи за изолиране на чиста култура

Библиография

1. Борисов Л. Б. Медицинска микробиология, вирусология, имунология: учебник за мед. университети. - М .: LLC "Агенция за медицинска информация", 2005.

2. Поздеев О. К. Медицинска микробиология: учебник за мед. университети. – М.: ГЕОТАР-МЕД, 2005.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинска микробиология, имунология и вирусология / учебник за мед. университети. - Санкт Петербург: СпецЛит, 2000.

4. Воробьов A. A., Bykov A. S., Pashkov E. P., Rybakova A. M. Микробиология: учебник. – М.: Медицина, 2003.

5. Медицинска микробиология, вирусология и имунология: учебник / изд. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЕОТар-Медиа, 2014.

6. Ръководство за практически упражнения по медицинска микробиология, вирусология и имунология / Изд. В. В. Тец. – М.: Медицина, 2002.

Въведение 6

Съставът на бактериите по отношение на тяхната физиология. 7

Метаболизъм 14

Хранене (транспорт на хранителни вещества) 25

Дъх 31

Възпроизвеждане 34

Микробни общности 37

ПРИЛОЖЕНИЯ 49

Литература 105

Антигенната структура на микроорганизмите е много разнообразна. В микроорганизмите има общи, или групови, и специфични, или типични, антигени.

Груповите антигени са общи за два или повече вида микроби, принадлежащи към един и същи род, а понякога и принадлежащи към различни родове. И така, антигени от общата група присъстват в някои видове от рода Salmonella; причинителите на коремен тиф имат обща група антигени с патогени на паратиф А и паратиф В (0-1,12).

Специфични антигени присъстват само в даден тип микроб или дори само в определен тип (вариант) или подтип в рамките на даден вид. Определянето на специфични антигени прави възможно диференцирането на микробите в рамките на род, вид, подвид и дори тип (подтип). И така, в рамките на рода Salmonella са диференцирани повече от 2000 вида Salmonella според комбинацията от антигени, а в подвида Shigella Flexner - 5 серотипа (сероварианти).

Според локализацията на антигените в микробната клетка има соматични антигени, свързани с тялото на микробната клетка, капсулно - повърхностни или черупкови антигени и флагеларни антигени, разположени във флагела.

Соматични, О-антигени(от немски ohne Hauch - без дишане), са свързани с тялото на микробна клетка. При грам-отрицателните бактерии О-антигенът е сложен комплекс от липид-полизахарид-протеин. Той е силно токсичен и е ендотоксин на тези бактерии. При патогени на кокови инфекции, Vibrio cholerae, патогени на бруцелоза, туберкулоза и някои анаероби, от тялото на микробните клетки са изолирани полизахаридни антигени, които определят типичната специфичност на бактериите. Като антигени те могат да бъдат активни в чиста форма и в комбинация с липиди.

Жгутици, Н-антигени(от немски Hauch - дъх), са протеинови по природа и се намират във флагелите на подвижните микроби. Флагеларните антигени се разрушават бързо при нагряване и под действието на фенола. Те са добре запазени в присъствието на формалин. Това свойство се използва при производството на убити диагностични сперми за реакцията на аглутинация, когато е необходимо да се запази флагела.

Капсулни, К - антигени, - са разположени на повърхността на микробната клетка и се наричат ​​още повърхностни, или черупки. Най-подробно са изследвани при микробите от чревното семейство, в които се разграничават Vi-, M-, B-, L- и A-антигени. Ви-антигенът е от голямо значение сред тях. За първи път е открит в щамове на тифоидни бактерии с висока вирулентност и е наречен вирулентен антиген. Когато човек е имунизиран с комплекс от O- и Vi- антигени, се наблюдава висока степен на защита срещу коремен тиф. Vi антигенът се разрушава при 60°C и е по-малко токсичен от антигена O. Среща се и в други чревни микроби, като ешерихия коли.

Защитен(от лат. protectio - покровителство, защита), или защитен, антигенът се образува от антраксните микроби в организма на животните и се намира в различни ексудати с антракс. Защитният антиген е част от екзотоксина, секретиран от антраксния микроб и е способен да предизвика имунитет. В отговор на въвеждането на този антиген се образуват комплемент-фиксиращи антитела. Защитен антиген може да се получи чрез отглеждане на антраксния микроб върху сложна синтетична среда. От защитния антиген е приготвена високоефективна химическа ваксина срещу антракс. Защитни защитни антигени са открити и в патогените на чума, бруцелоза, туларемия, магарешка кашлица.

Пълни антигенипредизвикват в организма синтеза на антитела или сенсибилизирането на лимфоцитите и реагират с тях както in vivo, така и in vitro. Пълноценните антигени се характеризират със строга специфичност, тоест предизвикват в тялото производството на само специфични антитела, които реагират само с този антиген. Тези антигени включват протеини от животински, растителен и бактериален произход.

Дефектни антигени (хаптени) са сложни въглехидрати, липиди и други вещества, които не са в състояние да предизвикат образуването на антитела, но влизат в специфична реакция с тях. Хаптените придобиват свойствата на пълноценни антигени само ако се въвеждат в тялото в комбинация с протеин.

Типични представители на хаптените са липидите, полизахаридите, нуклеиновите киселини, както и простите вещества: багрила, амини, йод, бром и др.

Ваксинацията като метод за предотвратяване на инфекциозни заболявания. Историята на развитието на ваксинацията. Ваксини. изисквания към ваксините. Фактори, които определят възможността за създаване на ваксини.

Ваксините са биологично активни лекарства, които предотвратяват развитието на инфекциозни заболявания и други прояви на имунопатология. Принципът на използване на ваксините е да се ускори създаването на имунитет и в резултат на това устойчивост към развитието на болестта. Ваксинацията се отнася до дейности, насочени към изкуствена имунизация на населението чрез въвеждане на ваксини за повишаване на устойчивостта към болестта. Целта на ваксинацията е да създаде имунологична памет срещу специфичен патоген.

Разграничаване на пасивна и активна имунизация. Въвеждането на имуноглобулини, получени от други организми, е пасивна имунизация. Използва се както за терапевтични, така и за профилактични цели. Въвеждането на ваксини е активна имунизация. Основната разлика между активната имунизация и пасивната имунизация е формирането на имунологична памет.

Имунологичната памет осигурява ускорено и по-ефективно отстраняване на чужди агенти, когато те отново се появят в тялото. Основата на имунологичната памет са Т- и В-клетките на паметта.

Първата ваксина получи името си от думата ваксина(ваксиния) е вирусно заболяване на говедата. Английският лекар Едуард Дженър за първи път използва ваксината срещу едра шарка върху момчето Джеймс Фипс, получена от везикулите на ръката на пациент с кравешка шарка, през 1796 г. Едва след почти 100 години (1876-1881) Луис Пастьор формулира основния принцип на ваксинацията - използване на отслабени препарати от микроорганизми за формиране на имунитет срещу вирулентни щамове.

Някои от живите ваксини са създадени от съветски учени, например П. Ф. Здродовски създава ваксина срещу тиф през 1957-59 г. Ваксината срещу грип е създадена от група учени: А. А. Смородинцев, В. Д. Соловьов, В. М. Жданов през 1960 г. П. А. Вершилова през 1947-51 г. създава жива ваксина срещу бруцелоза.

Ваксината трябва да отговаря на следните изисквания:

● активиране на клетките, участващи в обработката и представянето на антигена;
● съдържат епитопи за Т- и Т-клетки, осигуряващи клетъчен и хуморален отговор;
● лесен за обработка с последващо ефективно представяне от антигени за хистосъвместимост;
● индуцират образуването на ефекторни Т-клетки, клетки, продуциращи антитяло, и съответни клетки на паметта;
● предотвратяват развитието на болестта за дълго време;
● да бъде безвреден, тоест да не причинява сериозни заболявания и странични ефекти.

Ефективността на ваксинацията всъщност е процентът на ваксинираните, които са отговорили на ваксинацията с образуването на специфичен имунитет. По този начин, ако ефективността на определена ваксина е 95%, това означава, че от 100 ваксинирани, 95 са надеждно защитени, а 5 все още са изложени на риск от заболяването. Ефективността на ваксинацията се определя от три групи фактори. Фактори, които зависят от приготвянето на ваксината: свойствата на самата ваксина, които определят нейната имуногенност (жива, инактивирана, корпускулярна, субединица, количество имуноген и адюванти и др.); качеството на ваксиналния продукт, т.е. имуногенността не е загубена поради изтичане на срока на годност на ваксината или поради факта, че тя не е била съхранявана или транспортирана правилно. Фактори в зависимост от ваксинираните: генетични фактори, които определят фундаменталната възможност (или невъзможност) за развитие на специфичен имунитет; възраст, тъй като имунният отговор се определя най-тясно от степента на зрялост на имунната система; здравен статус "като цяло" (растеж, развитие и малформации, хранене, остри или хронични заболявания и др.); фоновото състояние на имунната система - преди всичко наличието на вродени или придобити имунодефицити.

Федерална агенция за образование

Бийски технологичен институт (филиал)

държавна образователна институция

по дисциплините "Обща биология и микробиология", "Микробиология" за студенти от специалности 240901 "Биотехнология",
260204 "Технология на ферментационно производство и винопроизводство"
всички форми на обучение

УДК 579.118:579.22

Каменская, микроорганизми: насоки за лабораторна работа в курсовете „Обща биология
и микробиология“, „Микробиология“ за студенти от специалности 240901 „Биотехнология“, 260204 „Технология на ферментационно производство и винопроизводство“ от всички форми на обучение/,
.

Alt. състояние технология un-t, ОТИ. - Бийск:

Издателство Alt. състояние технология ун-та, 2007. - 36 с.

Тези насоки обсъждат основните понятия, правила и принципи за класификация и идентификация на микроорганизми. Представена е лабораторна работа за изследване на различни свойства на бактериите, необходими за описване на бактериален щам и идентифицирането му до нивото на род.

Прегледано и одобрено

на заседание на катедрата

"Биотехнология".

Протокол No 88 от 01.01.2001г

Рецензент:

Доктор на биологичните науки, професор, БПСУ им

© BTI AltSTU, 2007

1 ОСНОВНИ ПОНЯТИЯ И ПРАВИЛА ЗА ИМЕНА

МИКРООРГАНИЗМИ

Описани са няколко хиляди вида микроорганизми, но се смята, че това е по-малко от 1 % от истинските. Изучаването на разнообразието от микроорганизми е предмет на таксономия. Основната му задача е да създаде естествена система, която да отразява филогенетичните взаимоотношения на микроорганизмите. Доскоро таксономията на микроорганизмите се основаваше главно на фенотипни признаци: морфологични, физиологични, биохимични и др., следователно съществуващите системи за класификация са до голяма степен изкуствени. Въпреки това, те улесняват идентифицирането на някои новоизолирани щамове микроорганизми.

Таксономията включва раздели като класификация, номенклатура и Еден сертифициране . Класификация определя реда, в който индивидите с дадена степен на хомогенност се поставят в определени групи (таксони). Номенклатура е набор от правила за наименуване на таксони. Идентификация означава определяне на принадлежността на изследвания организъм към един или друг таксон.

Терминът "таксономия" често се използва като синоним на таксономията, но понякога се разбира като раздел от таксономията, включващ теорията на класификацията, доктрината на системата от таксономични категории, границите и подчинението на таксоните. Основната таксономична категория в микробиологията, както и в другите биологични науки, е изглед- съвкупност от индивиди, характеризиращи се с редица общи морфологични, физиологични, биохимични, молекулярно-генетични особености.

Терминът "щам" означава чиста култура на микроорганизъм, изолиран от специфично местообитание (вода, почва, животински организъм и др.). Различните щамове от един и същи тип микроорганизми могат да се различават по някои начини, например чувствителност към антибиотици, способност да синтезират определени метаболитни продукти и т.н., но тези разлики са по-малки от различията между видовете. Концепцията за "щам" в микробиологията и генетиката е малко по-различна: в микробиологията това понятие е по-широко. Видовете микроорганизми се обединяват в таксономични категории от по-висок порядък: родове, семейства, разреди, класове, подразделения, царства. Тези категории се наричат ​​задължителни. Предлагат се и незадължителни категории: подклас, подразред, подсемейство, племе, подтриба, подрод, подвид. Въпреки това, в таксономията, незадължителните категории се използват рядко.

Номенклатурата на микроорганизмите е предмет на международни правила. Например, има Международния кодекс на номенклатурата за бактерии. За гъбите с мая основното ръководство е Дрождите. A Taxonomic Study", за нишковидни гъби и водорасли - Международен кодекс по ботаническа номенклатура.

За назоваване на обекти в микробиологията, както в зоологията и ботаниката, те използват двоичен или биномен (от лат. бис- два пъти) система от номенклатура, според която всеки вид има име, състоящо се от две латински думи. Първата дума означава род, а втората определя конкретен вид от този род и се нарича специфичен епитет. Общото име винаги се пише с главни букви, а конкретното – с малка буква дори ако конкретният епитет е присвоен в чест на учения, например клостридии пастьорианум. В текста, особено с латински графики, цялата фраза е изписана с курсив. Когато името на микроорганизма се повтаря, общото име може да бъде съкратено до една или повече начални букви, напр. С.пастьорианум. Ако текстът съдържа имената на два микроорганизма, които започват с една и съща буква (напр. клостридии пастьориануми Citrobacterfreundii), тогава съкращенията трябва да са различни (S. пастьориануми Ct. freundii). Ако микроорганизмът се идентифицира само с рода, вместо конкретния епитет се изписва думата sp. (видове- вид), например Pseudomonas sp. В този случай, когато името на микроорганизма се споменава отново в текста, генеричното наименование винаги трябва да бъде изписано изцяло.

За името на подвид се използва фраза, състояща се от името на рода, както и специфичните и подвидови епитети. За да се разграничат тези епитети, между тях се изписва комбинация от букви, която е съкратена дума подвид - „подвид“. или (по-рядко) "ss.". Например, лактобацилус delbrueckii subsp. българикус.

За всеки щам посочете също съкращението на името на колекцията от култури от микроорганизми, в която се съхранява, и номера, под който се появява там. Например, клостридии бутирик ATCC 19398 означава, че щамът се съхранява в American Type Culture Collection (ATCC) под номер 19398. Списък на световноизвестни колекции от микроорганизми е даден в Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 1984–1989), в каталози на култури на микроорганизми и други справочни публикации.

Описанието на всеки нов тип микроорганизми се основава на тип щам, който се съхранява в една от колекциите от микроорганизми и се основава на комбинацията от свойства, които този тип

характеризирани в оригиналната статия или квалификатор. Типовият щам е номенклатурният тип на вида, тъй като му е дадено специфично име. Ако впоследствие се установи, че някои щамове, първоначално включени в същия вид, заслужават да бъдат обособени като отделни видове, те трябва да получат нови имена и старото специфично име да се запази от типа и свързаните щамове. В този случай броят на преименувания щам остава същият. Автентичните сортове са тези, които напълно съвпадат по своите свойства.

За род, носещият име тип е специално обозначен вид вид, който има набор от характеристики, най-характерни за представителите на този таксон. Например в рода бацилвидът вид е V.subtilis.

В някои ръководства и каталози са посочени старите имена на преименуваните микроорганизми, както и имената на авторите, които първи са изолирали този микроорганизъм, и годината на публикуване, в която този организъм е описан за първи път. Например, един от видовете дрожди е посочен в каталога на Всеруската колекция от микроорганизми (VKM) като Кандида магнолии(Lodder et Kreger van Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978, BKM Y-1685. Това означава, че за първи път е описан от Лодер и Крегер ван Ридж в публикация от 1952 г., когато видът е наречен Торулопсис магнолии. През 1978г Торулопсис магнолиие преименуван от такива изследователи като Майер и Яроу, в Кандида магнолиии в момента се съхранява във VKM под VKM номер Y-1685. Буквата Y пред номера на щама означава "Дрождите" - дрожди.

В допълнение към понятието "щам" в микробиологията се използват термините "вариант", "тип", "форма". Те обикновено се използват за обозначаване на щамове на микроорганизми, които се различават по някакъв начин от типовия щам. Щам, който се различава от типичния щам по морфологични характеристики, се нарича морфовар(морфотип), физиологични и биохимични характеристики - биовар(биотип, физиологичен тип), според способността да се синтезират определени химични съединения - хемовар(хемоформа, хемотип), условия на култивиране - сорт,според вида на отговора на въвеждането на бактериофаг - фаговар(фаготип, лизотип), антигенни характеристики - серовар(серотип)
и т.н.

В трудовете по генетиката на микроорганизмите терминът се използва често "клонинг",което означава популация от генетично свързани клетки, получени асексуално от една родителска клетка. В молекулярната биология клонингите са множество

копия на идентични ДНК последователности, получени чрез вмъкването им в клониращи вектори (напр. плазмиди). Терминът "генетично модифицирани" или "рекомбинантни" щамове се отнася до щамове микроорганизми, получени в резултат на манипулации на генното инженерство. Често с помощта на мутагени се получават нови щамове микроорганизми.

Всеки нов щам микроорганизми, изолиран от естествени или създадени от човека източници, трябва да бъде характеризиран, за да се получи пълен набор от данни за свойствата на микроорганизма.
в чиста култура. Тези данни могат да се използват например за съставяне на паспорт на индустриално ценни щамове, както и за идентифицирането им.

Цел на идентификацията – установяват таксономичното положение на изследвания щам на базата на сравнение на неговите свойства с изследвания и приет (официално регистриран) вид. Следователно резултатът от идентификацията обикновено е идентификацията на изследвания микроорганизъм с някакъв вид или назначение
към определен род. Ако изследваният щам или група щамове се различават по своите свойства от представители на известни таксони, тогава те могат да бъдат разделени в нов таксон. За да направите това, дайте описание на новия таксон, включително, например, в случай на бактерии, следното: списък на щамовете, включени в таксона; характеристики на всеки щам; списък на имотите, считани за съществени
в таксон; списък на свойствата, които квалифицират таксона за представяне в следващия по-висок таксон; списък с диагностични характеристики, които отличават предложения таксон от тясно свързани таксони; отделно описание на типа (за вида) щам; снимка на микроорганизъм.

За да бъде официално приет новопредложен таксон, неговото описание трябва да бъде публикувано в съответствие с определени правила. Например, валидна или законна публикация на таксон от бактерии включва публикуване на статия, която го описва в International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Ако публикация се появи в друго реномирано научно списание (ефективна публикация), тогава до IJSEM се изпраща препечатка на статията от това списание. От 1980 г. в IJSEM редовно се публикуват така наречените списъци с легални имена на бактерии. Те изброяват всички имена на бактерии, които са били публикувани в IJSEM (валидна или законна публикация) или са били ефективно публикувани преди това във всеки

други реномирани списания. След като името на бактерия бъде вписано в списъка с легализирани имена на IJSEM, това име се признава за валидно, независимо дали преди това е публикувано в IJSEM или друго списание. Датата на публикуване на името на този таксон в IJSEM или в списъка на легализираните имена на IJSEM е приоритет за таксона.

Културата на тип щам от нов тип микроорганизми се прехвърля за съхранение в една от колекциите от микроорганизми от световно значение. Ако типовият щам бъде загубен, той може да бъде заменен с така наречения неотипен щам. В същото време трябва да се потвърди, че свойствата на новия щам са в добро съответствие с описанието на изгубения. За да се посочи, че таксонът се предлага за първи път, съкращението „fam. нов.", нов род - "ген. нов.", и нов вид - "sp. ноември". Например,
през 2000 г. със съавтори беше предложено ново семейство бактерии - Oscillochloridaceae, фам. ноемв. Изразът "species insertac sedis" означава, че говорим за вид, който временно няма определен таксономичен статус, тъй като не е ясно в кой таксон от по-висок разред - род или семейство - този вид трябва да бъде поставен поради липса на експериментални данни, необходими за това.
данни.

2 ОПИСАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

МИКРООРГАНИЗМИ

Както вече беше отбелязано, принципите на класификация и идентификация на различни групи прокариоти и еукариотни микроорганизми имат значителни разлики. Идентификация на гъби по класове, поръчки
и семействата се основава на характерните особености на структурата и методите на формиране преди всичко на половите структури. Освен това се използват характеристиките на безполовото спорообразуване, структурата и степента на развитие на мицела (рудиментарен, добре развит, септиран или несептиран), културни (колония) и физиологични характеристики. Диференцирането на родовете в семействата и идентифицирането на видовете се извършват с помощта на получените морфологични признаци
с помощта на електронна микроскопия, както и физиологични и културни особености. Няма единична детерминанта за идентифициране на всички гъби, така че първо определете класа или реда на идентифицираната гъбичка и след това използвайте подходящата детерминанта за този клас или ред.

Идентифицирането на дрождевите гъби, които са сред широко използвани обекти на различни микробиологични изследвания, се основава на културни (макроморфологични), цитологични, физиологични и биохимични характеристики, характеристики на жизнените цикли и половия процес, специфични признаци, свързани с екологията, и се извършва се използват специални детерминанти за дрожди.

Систематиката на микроскопичните форми на водораслите се основава на структурата на техните клетки и състава на пигментите. Определянето на системното положение на протозоите се извършва с помощта на морфологични характеристики и жизнени цикли. По този начин идентифицирането на еукариотите се основава главно на характеристиките на тяхната морфология и цикли на развитие.

Идентифицирането на прокариотите, които са морфологично по-малко разнообразни от еукариотите, се основава на използването на широк спектър от фенотипни и в много случаи генотипни черти. Това е нещо повече от еукариотна идентификация, базирана на функционални характеристики, тъй като повечето бактерии могат да бъдат идентифицирани не по външния им вид, а само като се установи какви процеси са способни да извършват.

При описване и идентифициране на бактериите, техните културни свойства, морфология, клетъчна организация, физиологични и биохимични характеристики, химичен състав на клетките, съдържание

гуанин и цитозин (GC) в ДНК, нуклеотидната последователност в гена, кодираща синтеза на 16S rRNA и други фено- и генотипни характеристики. В този случай трябва да се спазват следните правила: работа с чисти култури, прилагане на стандартни методи за изследване, както и използване на клетки, които са в активно физиологично състояние за инокулация.

2.1 Културни ценности

Културните или макроморфологичните свойства включват характерни особености на растежа на микроорганизмите върху твърди и течни хранителни среди.

2.1.1 Растеж върху твърди среди

На повърхността на плътни хранителни среди, в зависимост от сеитбата, микроорганизмите могат да растат под формата на колония, удар или непрекъсната морава. колониянарича се изолирано натрупване на клетки от същия тип, отглеждани в повечето случаи от една клетка. В зависимост от това къде са се развили клетките (на повърхността на плътна хранителна среда, в нейната дебелина или на дъното на съда), те разграничават повърхностен, дълбоки дъноколонии.

Образование надносталгиченколониите са най-значимата характеристика на растежа на много микроорганизми върху плътен субстрат. Тези колонии са много разнообразни. При тяхното описание се вземат предвид следните характеристики:

профил- плоски, изпъкнали, кратеровидни, конусовидни и др. (Фигура 1);

форма- закръглени, амебоидни, неправилни, ризоидни и др. (Фигура 2);

размер (диаметър)- измерва се в милиметри; ако размерът на колонията не надвишава 1 mm, тогава те се наричат ​​пунктирани;

повърхност- гладки, грапави, набраздени, нагънати, набръчкани, с концентрични кръгове или радиално набраздени;

блясъки прозрачност- колонията е лъскава, матова, матова, брашнеста, прозрачна;

цвят- безцветни (мръснобелите колонии се класифицират като безцветни) или пигментирани - бяло, жълто, златисто, оранжево
вай, люляк, червен, черен и др.; подчертайте акцента върху

пигментен субстрат; при описване на колонии от актиномицети се отбелязва пигментацията на въздушния и субстратния мицел, както и освобождаването на пигменти в средата;

ръб, край- равномерни, вълнообразни, назъбени, ресни и др. (Фигура 3);

структура- хомогенна, фино или едрозърнеста, набраздена и др. (Фигура 4); ръбът и структурата на колонията се определят с лупа или при слабо увеличение на микроскопа. За да направите това, паничката на Петри се поставя върху стъпалото на микроскопа с капака надолу;

последователностопределя се чрез докосване на повърхността на колонията с бримка. Колонията може лесно да се отстрани от агара, да бъде гъста, мека или растяща в агара, слузеста (прилепва към примката), вискозна, има вид на филм (отстранява се изцяло), да бъде крехка (се счупва лесно при докосване от цикъл).

1 - извита; 2 - с форма на кратер; 3 - неравен;

4 - врастване в субстрата; 5 - апартамент; 6 - изпъкнала;

7 - с форма на капка; 8 - конична

Фигура 1 - Профил на колонията

дълбока колония,напротив, доста са еднакви. Най-често изглеждат като повече или по-малко сплескана леща,
в проекцията с форма на овали със заострени краища. Само
при няколко бактерии дълбоките колонии приличат на кичури памучна вата
с нишковидни израстъци в хранителна среда. Образуването на дълбоки колонии често е придружено от разкъсване на плътната среда, ако микроорганизмите отделят въглероден диоксид или други газове.

Долни колонииразличните микроорганизми обикновено изглеждат като тънки прозрачни филми, пълзящи по дъното.

Размерът и много други характеристики на колонията могат да се променят с възрастта и да зависят от състава на средата. Следователно при тяхното описание се посочват възрастта на културата, съставът на средата и температурата на култивиране.

1 - кръгъл; 2 – кръгли с изпъкнал ръб; 3 - кръгли с валяк по ръба; 4, 5 - ризоидална; 6 - с ризоиден ръб; 7 - амебоид;
8 - нишковидна; 9 - сгънат; 10 - неправилно;

11 - концентричен; 12 - комплекс

Фигура 2 - Формата на колонията

/ - гладка; 2 - вълнообразна; 3 - назъбени; 4 - острие; 5 - неправилно; 6 - ресничести; 7 - нишковидни; 8 - вилозен; 9 - разклонена

Фигура 3 - Ръбът на колонията

1 - хомогенна; 2 - дребнозърнест; 3 - едрозърнест;

4 - струя; 5 - влакнест

Фигура 4 - Структурата на колонията

При описване на растежа на микроорганизмите чрез инсултобърнете внимание на следните характеристики: оскъдни, умерени или изобилни, непрекъснати
с гладък или вълнообразен ръб, подобни на мъниста, наподобяващи вериги от изолирани колонии, дифузни, перести, дървовидни или ризоидни (Фигура 5). Те характеризират оптичните свойства на плаката, нейния цвят, повърхност и консистенция.

За да се характеризират колониите и растежа на ивици, много микроорганизми често се отглеждат върху говежди агар. Използва се и месо-пептонен желатин. За по-добро виждане на дълбоки колонии се препоръчва да се избистрят агаровата или желатинова среда.

1 - плътен с гладък ръб; 2 - плътен с вълнообразен ръб; 3 - ясно видими; 4 – дифузна; 5 - пернат; 6 - ризоид

Фигура 5 - Растеж на бактерии по протежение на инсулта

2.1.2. Растеж в течни хранителни среди

Растежът на микроорганизмите в течни хранителни среди е по-равномерен и е придружен от помътняване на средата, образуване на филм или утайка. Характеризиране на растежа на микроорганизми в течна среда, бел облачност(слаб, умерен или силен) филмови характеристики(тънък, плътен или хлабав, гладък или сгънат),
и когато се образува утайка, се посочва дали е оскъдна или изобилна, гъста, рохкава, лигава или люспеста.

Често растежът на микроорганизмите е придружен от появата на миризма, пигментация на средата и отделяне на газ. Последното се открива чрез образуване на пяна, мехурчета, а също и с помощта на "поплавъци" - малки тръбички, запечатани в единия край. Поплавъкът е поставен
в епруветката със запечатания край нагоре, преди да стерилизирате средата и се уверете, че е напълно напълнена със средата. Ако се освободи газ, той се натрупва в поплавъка под формата на балон.

За да се опише естеството на растежа на микроорганизмите в течна среда, те се отглеждат на месо-пептонен бульон (MPB) или на друга среда, която осигурява добър растеж.

2.2 Морфологични характеристики

Морфологичните характеристики и организация на бактериалните клетки включват такива характеристики като формата и размера на клетките, тяхната подвижност, наличието на жгутици и вида на бичуване, както и способността за спорообразуване. Може да бъде полезно и за откриване в клетки
характерни мембранни системи (хлорозоми, карбоксизоми, фикобилис, газови вакуоли и др.), присъщи на отделните групи бактерия
rii, както и включвания (параспорални тела, волтинови гранули,
поли-β-хидроксибутират, полизахариди и др.). От първостепенно значение за таксономията на бактериите се отдава на оцветяването по Грам на клетките.
и структурата на техните клетъчни стени.

2.3 Физиологични и биохимични свойства

Изследването на физиологичните и биохимичните свойства включва преди всичко установяване на начина на хранене на изследваната бактерия (фото/химио-, авто/хетеротрофия) и вида на енергийния метаболизъм (способност за ферментация, аеробно или анаеробно дишане или фотосинтеза). Важно е да се определят такива характеристики като съотношението на бактериите към молекулния кислород, температура, pH, соленост, осветеност и други фактори на околната среда. В тази група знаци

включва също списък на субстратите, използвани като източници на въглерод, азот и сяра, необходимостта от витамини и други растежни фактори, образуването на характерни метаболитни продукти, наличието на определени ензими. За това се използват специални тестове.

Много от тестовете, използвани за откриване на тези характеристики (понякога наричани рутинни тестове) са важни за диагнозата и се използват широко в медицинската микробиология. Настройката им изисква значителна инвестиция на време, голям брой сложни среди и реагенти, спазване на стандартните условия и точност на изпълнение. За да се ускори и улесни процеса на идентифициране на някои микроорганизми, които са основно от медицинско значение, са разработени различни тестови системи, например системите Oxi / Ferm Tube, Mycotube и Enterotube II от Hoffmann-La Roche (Швейцария), и т.н. Така системата Enterotube II, предназначена за идентифициране на ентеробактерии, е пластмасова камера с 12 клетки, съдържащи цветни диагностични среди. Засяването на всички среди се извършва чрез транслационно-ротационни движения през камерата на иглата със семената. Инкубирането се извършва в продължение на 24 часа при температура 37 ºС. Положителен или отрицателен резултат от теста се оценява по промяна в цвета на средата, разкъсване на агара (тест за образуване на газ) или след въвеждане на специални реагенти (тест за образуване на индол, реакция на Voges-Proskauer). Всяка характеристика е обозначена с определен номер, така че получените данни могат да бъдат въведени в компютър със съответната програма и да се получи отговор за таксономичното положение на изследвания щам.

Определянето на състава на бактериалните клетки е важно и за тяхната систематика (хемосистематика). Хемотаксономичните методи могат да бъдат важни по-специално за онези групи бактерии, в които морфологичните и физиологичните характеристики варират в широки граници и са недостатъчни за тяхното задоволително идентифициране. Клетъчните стени на различни прокариоти включват няколко класа уникални хетерополимери: муреин (или псевдомуреин), липополизахариди, миколова и тейхоева киселини. Съставът на клетъчната стена също определя серологичните свойства на бактериите. Това е в основата на имунохимичните методи за тяхното идентифициране.

Съставът на липидите и мастните киселини на бактериалните клетки понякога също се използва като хемотаксономичен маркер. Интензивното изследване на мастните киселини стана възможно с разработването на метода за газов хроматографски анализ. Разликите в липидния състав се използват за идентифициране на бактерии на ниво род и дори вид. Този метод обаче има определени ограничения, тъй като съдържанието на мастни киселини в клетките може да зависи от условията на културата и възрастта на културата.

Таксономията на някои бактерии взема предвид състава на хиноните
и други носители на електрони, както и пигменти.

Важна информация за взаимната връзка на бактериите може да се получи чрез изследване на клетъчните протеини, продуктите на генната транслация. Въз основа на изследването на мембранни, рибозомни, тотални клетъчни протеини, както и отделни ензими, се формира ново направление - протеинова таксономия. Спектрите на рибозомните протеини са сред най-стабилните и се използват за идентифициране на бактерии на ниво семейство или ред. Спектрите на мембранните протеини могат да отразяват общи, видови и дори вътрешновидови различия. Въпреки това, характеристиките на химичните съединения на клетката не могат да се използват за идентифициране на бактерии в изолация от други данни, описващи фенотипа, тъй като няма критерий за оценка на значимостта на фенотипните черти.

Понякога се използва метод за идентифициране на бактерии или други микроорганизми, като дрожди. Числова (или Адансонова) таксономия. Той се основава на идеите на френския ботаник М. Адансон, който предлага различните фенотипни черти, които могат да бъдат отчетени, да се считат за еквивалентни, което дава възможност да се определят количествено таксономичните разстояния между организмите като съотношението на броя на положителните черти към общ брой проучени. Сходството между двата изследвани организма се определя чрез количествено определяне на възможно най-много (обикновено най-малко сто) фенотипни черти, които са подбрани така, че техните варианти да са алтернативни и да могат да бъдат обозначени със знаци минус и плюс. Степента на сходство се определя въз основа на броя на съвпадащите характеристики и се изразява като коефициент на съвпадение С:

където а + де сборът от признаците, според които щамовете А и В съвпадат;

а– и двата щама с положителни признаци;

д– и двете с отрицателни;

б- сумата от знаци, за които щамът A е положителен, B е отрицателен;

С- сборът от признаци, за които щам А е отрицателен, щам В е положителен.

Стойността на коефициента на съвпадение може да варира от 0 до 1. Коефициент 1 означава пълна идентичност, 0 - пълно несходство. Оценката на комбинации от знаци се извършва с помощта на компютър. Получените резултати са представени като матрица на сходството и/или като дендрограма. Числена таксономия може да се използва при оценка на сходството между таксони на микроорганизми само от нисък ранг (родове, видове). Той не позволява преки изводи за генетичната връзка на микроорганизмите, но до известна степен отразява техните филогенетични свойства. Така е установено, че фенотипните черти на бактериите, които могат да бъдат изследвани в момента, отразяват от 5 до 20% от свойствата на техния генотип.

2.4 Изследване на генотипа

Изучаването на генотипа на микроорганизмите стана възможно в резултат на успешното развитие на молекулярната биология и доведе до появата на генна систематика. Изследването на генотипа въз основа на анализа на нуклеиновите киселини по принцип прави възможно изграждането на естествена (филогенетична) система от микроорганизми във времето. Оценяват се филогенетичните взаимоотношения на бактериите определяне на моларното съдържание гуанин и цитозин (GC) в ДНК, ДНК методи–ДНК и ДНК–rRNA хибридизация, използвайки ДНК сонди, както и изследване на нуклеотидната последователност в 5С, Дж6 Си
23 С рРНК.

2.4.1 Определяне на моларното съдържание на НС

Определянето на моларното съдържание на НС от общия брой на ДНК бази в прокариотите, както вече беше споменато, варира от 25 до 75%. Всеки бактериален вид има ДНК с характерно средно съдържание на НС. Въпреки това, тъй като генетичният код е дегенериран и генетичното кодиране се основава не само на съдържанието на нуклеотидни бази в кодиращи единици (триплети), но и на взаимното подреждане, тогава същото средно съдържание на GC в ДНК на два бактериални вида могат да бъдат придружени от техния значителен генотип

разделяне. Ако два организма са много близки по нуклеотиден състав, това може да бъде доказателство за тяхната еволюционна връзка само ако имат голям брой общи фенотипни черти или генетично сходство, потвърдено от други методи. В същото време несъответствието (повече от 10...15%) в нуклеотидния състав на ДНК на два бактериални щама с общи фенотипни свойства показва, че те принадлежат поне към различни видове.

2.4.2 ДНК метод –ДНК хибридизация

Този метод е по-важен за оценка на генетичната връзка на бактериите. С внимателно експериментиране може да се получи ценна информация за степента на тяхната генетична хомология. В рамките на един вид бактерии степента на генетична хомология на щамовете достига от 70 до 100%. Въпреки това, ако в резултат на еволюционна дивергенция, нуклеотидните базови последователности на геномите на две бактерии се различават в по-голяма степен, тогава специфичната ДНК-ДНК реасоциация става толкова слаба, че не може да бъде измерена. В този случай хибридизацията ДНК-рРНК дава възможност за значително увеличаване на обхвата от организми, в които може да се определи степента на генетична хомология поради факта, че в относително малък регион на бактериалния геном, кодиращ рибозомна РНК, оригиналната базова последователност се запазва много по-пълно, отколкото в други области на хромозомата. В резултат на това методът за хибридизация на ДНК-рРНК често разкрива доста висока хомология на бактериалните геноми, в която ДНК-ДНК реасоциацията не разкрива забележима хомология.

2.4.3 Метод на ДНК сонда (генни сонди)

Методът на ДНК сондата е вариация на метода за молекулярна хибридизация ДНК-ДНК. В този случай реакцията на хибридизация се провежда не между два препарата от обща ДНК, а между фрагмент от ДНК нуклеотидната последователност (сонда), която включва ген (генетичен маркер), отговорен за специфична функция (например резистентност към някакъв антибиотик) и ДНК изследвана бактерия. Най-често срещаният начин за създаване на генни сонди е да се изолират специфични фрагменти чрез молекулярно клониране. За да направите това, първо създайте генна банка на изследваната бактерия, като разделите нейната ДНК с ендонуклеази.

рестрикция, и след това желаният клон се избира от сумата на ДНК фрагменти чрез електрофореза, последвана от проверка на генетичните свойства на тези фрагменти чрез трансформация. След това избраният ДНК фрагмент се лигира в подходящ плазмид (вектор),
и този комбиниран плазмид се въвежда в удобен за работа щам бактерии (напр. Ешерихия coli). От биомасата на бактерия, носеща ДНК проба, се изолира плазмидна ДНК и се маркира, например, с радиоизотопен етикет. След това ДНК сондата се хибридизира
с бактериална ДНК. Получените хибридни зони се показват чрез авторадиография. Според относителната честота на хибридизация на генетичен маркер с хромозомата на определена бактерия,
заключение за генетичната връзка на тези бактерии с изследвания щам.

2.4.4 Метод за анализ на нуклеотидна последователност

в рибозомната РНК

За идентифицирането на бактериите и създаването на филогенетична система за тяхната класификация, методът за анализ на нуклеотидни последователности в рибозомната РНК е получил най-широко разпространение и значение. Молекулите 5S, 16S и 23S rRNA съдържат региони с най-висока степен на генетична стабилност. Смята се, че те са извън механизма на естествения подбор и се развиват само в резултат на спонтанни мутации, протичащи с постоянна скорост. Натрупването на мутации зависи само от времето, така че информацията за нуклеотидната последователност на тези молекули се счита за най-обективна за определяне на филогенетичната връзка на организмите на ниво от подвид до царство. В случай на анализ
5S rRNA обикновено определя пълната нуклеотидна последователност, която в тази молекула в прокариотите е 120 нуклеотида. При изследване на 16S и 23S rRNA, съдържащи съответно 1500 и 2500 нуклеотида, олигонуклеотидите, получени от тези молекули, често се анализират с помощта на специфични рестрикционни ендонуклеази. Изследването на нуклеотидната последователност в 16S рРНК е станало най-широко разпространено. Изследването на структурата на 16S rRNA на представители на различни микроорганизми доведе до идентифицирането на археалната група сред прокариотите. Стойности на коефициента на сходство SAB, разделяне на I6S rRNA на бактерии и археи лежат в рамките на 0,1, докато стойността SAB, равно на 1.0 съответства на пълната хомология на нуклеотидните последователности, а 0.02 на нивото на случайно съвпадение.

Все по-често се предлагат дендрограми за идентифициране на бактерии, показващи връзката между бактериални родове, видове или щамове въз основа на изследването на последователността на нуклеотидите (или олигонуклеотидите) в рРНК, както и ДНК-ДНК.
и ДНК-рРНК хибридизация. Въпреки това, идентифицирането на бактериите преди раждането само въз основа на генетични методи, без предварително проучване на техните фенотипни характеристики, често е невъзможно изобщо. Следователно, най-добрият подход в работата по таксономията на бактериите е изследването както на генотипните, така и на фенотипните свойства. В случай на несъответствие между филогенетичните и фенотипните данни, временно се дава предимство на последните.

Конкретен проблем е идентифицирането на такива бактерии и археи, особено морски видове, които не могат да растат върху познати лабораторни хранителни среди и за които следователно не може да се получи чиста култура. Доскоро този проблем изглеждаше нерешим. Въпреки това, преди около 15 години бяха разработени методи, които направиха възможно извличането, клонирането, последователността
и сравняват рибозомни РНК директно от околната среда. Това направи възможно точното преброяване и идентифициране на микроорганизмите, обитаващи този биотоп, без да се изолират в чиста култура. Така идентифициран в лабораторията "некултивиран" микроорганизъм може дори да бъде описан, но с добавяне на думата "кандидат" (кандидат). Думата „кандидатус” ще придружава новия вид, докато учените не намерят условията за култивиране на този организъм в лабораторията и получат неговата чиста култура, която ще му позволи да проучи всичките му свойства и да я публикува като легална.

Бактериите обикновено се идентифицират с помощта на Наръчника по детерминативна бактериология на Bergey. Първото издание на това ръководство е публикувано през 1923 г. под ръководството на известния американски бактериолог D. Bergey (DHBergey, 1860–1937). Оттогава редовно се преиздава с участие на водещите световни микробиолози. В последното, девето издание, дефинирайте, всички бактерии са разделени на 35 групи според лесно разпознаваеми фенотипни признаци.
в името на групата. Таксономичното положение на бактериите в групите се определя с помощта на таблици и ключове, съставени на базата на малък брой фенотипни знаци. Диференциационни таблици за диференциране на бактериални видове от определени родове, като рода бацил, не са дадени и читателят се препраща към Ръководството на Бърджи по систематиката на бактериите.

Четиритомното ръководство по систематична бактериология на Берджи, 1984–1989 г. съдържа по-пълна информация за таксономичното положение на бактериите.За всяка група бактерии е дадено описание на родовете, включени в него.
и видове, включително тези с неясен таксономичен статус. В допълнение към подробно фенотипно описание, включително морфология, организация и химичен състав на клетките, антигенни свойства, тип колонии, особености на жизнения цикъл и екология, характеристиките на родовете също предоставят информация за съдържанието на GC в ДНК, резултати от ДНК-ДНК и ДНК-рРНК хибридизация. Ключовете и таблиците позволяват идентифицирането на бактериите не само за рода, но и за вида.

В момента е публикувано второто издание на четиритомното ръководство по систематична бактериология на Bergcy. През 2002 г. е публикуван първият том. Освен това има редица статии и книги, които предлагат оригинални ключове за идентифициране на отделни групи бактерии, например бацили, Pseudomonas, актиномицети, ентеробактерии.

Понастоящем са натрупани много нови данни, включително тези, получени в резултат на анализа на нуклеотидни последователности на рибозомната РНК, за по-рано проучени и новоизолирани бактериални видове. Въз основа на тази информация, видовият състав на определени групи бактерии, например рода бацил, ще бъдат ревизирани: някои видове ще останат в рода бацил, и някои образуват нови родове или ще бъдат причислени към други вече съществуващи родове бактерии. Трябва също да се отбележи, че по правило се изследват повече знаци, за да опишат нови щамове бактерии, отколкото е необходимо за тяхното идентифициране, тъй като ключовете и таблиците не включват всички знаци на идентифицираните бактерии, а само тези, които се различават по различни видове (Таблица 1).

Таблица 1 - Минимален списък с данни, необходими за

описания на нови щамове бактерии (според H. Truper, K. Schleifer, 1992)

Таблица 1 продължава

3 ЛАБОРАТОРНА РАБОТА „ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МИКРООРГАНИЗМИ"

Обективен: запознаване с основните принципи за определяне на микроорганизмите. В процеса на извършване на лабораторна работа всеки студент изучава свойствата на бактериите, необходими за описание на бактериален щам и идентифицирането му на ниво род.

Задачи

1. Определете чистотата на идентифицираната бактерия и проучете морфологията на нейните клетки.

2. Опишете културните ценности.

3. Да се ​​изследват цитологичните свойства на идентифицираните бактерии.

4. Да се ​​изследват физиологичните и биохимичните свойства на идентифицираните бактерии.

5. Определете чувствителността на бактериите към антибиотици.

6. Попълнете таблицата и обобщете.

3.1 Определяне на чистотата на идентифицируема бактерия

и изучаване на морфологията на неговите клетки

За извършване на работа по идентификацията на микроорганизми, всеки ученик получава една култура на бактерии (на наклонена агарна среда в епруветка), която след това се проверява за чистота. Това се извършва по няколко начина: визуално, засяване върху хранителни среди и микроскопия.

модел на растежполучените бактерии се разглеждат чрез щрих върху повърхността на наклонената агарова среда. Ако растежът по протежение на хода е хетерогенен, тогава културата е замърсена. След това културата се пресява в епруветка върху наклонена среда (месен пептонен агар) за използване.
в по-нататъшна работа, а също така направете пресяване на повърхността на твърда среда в паничка на Петри, като използвате метода на изчерпателния щрих, за да проверите чистотата (чрез еднородността на отглежданите колонии). Инокулираните епруветки и чаши се поставят в термостат при температура 30 ºС за период от 2 до 3 дни. Остатъкът от оригиналната култура на бактерии в епруветка се използва за проверка на чистотата чрез микроскопия (според морфологичната хомогенност на популацията), както и за изследване на формата, относителното положение, подвижността на клетките и техните размери. Културата се микроскопира като се използват натрошени капкови препарати и препарат от фиксирани оцветени с магента клетки. Резултатите се вписват в таблица, съставена под формата на таблица 2.

таблица 2 – Свойства на идентифицираната бактерия

3.2 Културни ценности

В следващия урок се разглежда паничка на Петри, инокулирана със суспензия от разпознаваема бактерия. Критерият за чистота на културата е хомогенността на отглежданите колонии. Опишете културните свойства на бактериалните колонии в съответствие с раздела
скрап 2.1 и резултатите се вписват в таблица 2.

3.3 Изследване на цитологични свойства на идентифицираните бактерии

3.3.1 Наличие на ендоспори

Малко количество клетки от твърдата среда се поставят в примка върху предметно стъкло в капка чешмяна вода и се прави намазка. Намазката се изсушава на въздух, фиксира се в пламък на горелка и се нанася върху нея 5% разтвор на хромова киселина. След 5-10 минути се отмива с вода. Препаратът се покрива с лента филтърна хартия и хартията се навлажнява обилно с Ziehl carbol fuchsine. Лекарството се загрява на пламък, докато се появят пари (не до кипене), след което се отстранява и се добавя нова порция от багрилото. Тази процедура се извършва в продължение на 7 минути. Важно е боята да се изпари, но хартията да не изсъхне. След охлаждане се отстранява, препаратът се измива с вода и се попива старателно с филтърна хартия.

Ако всички операции са извършени правилно, цветът е контрастен и яркочервените спори се открояват ясно на синия фон на цитоплазмата.

3.3.2 Оцветяване по грам

3.3.2.1 Върху обезмаслено предметно стъкло се прави тънка намазка в капка вода, така че клетките да са равномерно разпределени по повърхността на стъклото и да не образуват клъстери.

3.3.2.2 Препаратът се суши на въздух, фиксира се над пламък на горелка и се оцветява за 1–2 минути с карболов генциан или кристал виолет.

3.3.2.3 След това боята се отцежда и намазките се третират с разтвор на Лугол за 1 ... 2 минути до почерняване.

3.3.2.4 Отцедете разтвора на Lugol, препаратът се обезцветява за 0,5 ... 1,0 min с 96% етилов алкохол и бързо се промива с вода.

3.3.2.5 Оцветете допълнително за 1...2 минути с воден фуксин.

3.3.2.6 Багрилото се отцежда, препаратът се измива с вода и се изсушава.

3.3.2.7 Микроскопски с имерсионна система.

При правилно оцветяване грам-положителните бактерии са синьо-виолетови, грам-отрицателни – розово-червен цвят.

За да се получат надеждни резултати, е необходимо да се приготвят намазки за оцветяване по Грам от млади, активно растящи (обикновено еднодневни) култури, тъй като клетките от стари култури понякога дават нестабилна реакция по Грам. Грам-отрицателните бактерии могат да се появят като Грам-положителни, ако бактериалният филм (намазка) е твърде дебел и алкохолното обезцветяване не е пълно. Грам-положителните бактерии могат да се появят като Грам-отрицателни, ако намазката е обезцветена с алкохол.

3.3.3 Оцветяване за киселинна устойчивост

Намазка от изследваната бактерия се приготвя върху обезмаслено предметно стъкло в капка вода. Лекарството се изсушава на въздух и се фиксира над пламъка на горелката. Върху намазката се поставя филтърна хартия, препаратът се залива с карболовия фуксин на Ziel и се нагрява 2-3 пъти до появата на пари, като предметното стъкло се държи с пинсета високо над пламъка на горелката. Появата на пари се наблюдава, като се гледа намазката отстрани и когато се появят, веднага се оставят настрана
лекарства настрана. Оставете препарата да изстине, отстранете филтърната хартия, отцедете боята и изплакнете намазката с вода. Тогава
клетките се обезцветяват с 5% разтвор на H киселина https://pandia.ru/text/79/131/images/image009_42.gif "width="11" height="23 src=">. За да направите това, слайдът се потапя 2-3 пъти в чаша сярна киселина,

без да го държи в него. Препаратът отново се измива обилно с вода и се оцветява за 3 до 5 минути с метиленово синьо (по Leffler). Боята се отцежда, препаратът се измива с вода, изсушава се и се изследва с потопяема система. Когато са правилно оцветени, клетките на устойчивите на киселина бактерии са червени, докато клетките на неустойчивите на киселина бактерии са червени. – син.

3.3.4 Определяне на мобилността

Направете засяване на изследваната култура в колона от 0,2 ... 0,5% полутечен агар чрез инжектиране. За да могат особеностите на растежа да се проявят най-ясно, се прави пункция в непосредствена близост до стената на епруветката. Сеитбата се поставя в термостат за 24 часа. Така направената сеитба дава възможност да се идентифицират и отделят подвижни микроорганизми от неподвижни.

Неподвижни форми на бактерии растат по линията на инжектиране, образувайки малки израстъци с цилиндрична или конична форма. Средата остава напълно прозрачна. Подвижните микроби по време на такава инокулация причиняват изразена мътност, която се разпространява повече или по-малко равномерно в цялата дебелина на средата.

3.4 Изследване на физиологични и биохимични свойства

разпознаваеми бактерии

3.4.1 Връзка с молекулния кислород

По отношение на молекулярния кислород, микроорганизмите са разделени на четири групи: задължителни аероби, микроаеробили, факултативни аероби (анаероби) и задължителни анаероби. Да съдя
относно принадлежността на микроорганизмите към определена група, микробната суспензия се засява в епруветки с агаризирана хранителна среда, разтопена и охладена до температура 45 ºС. Засяването може да се извърши и чрез инжектиране. Строги аеробирастат на повърхността на средата и в горния слой, микроаерофили- на известно разстояние от повърхността. Факултативни анаеробиобикновено се развиват по цялата дебелина на средата. Строги анаеробирастат само в дълбочината на средата, в самото дъно на тръбата (Фигура 6).

1 - аероби; 2 – микроаерофили; 3 - факултативни анаероби;

4 – анаероби

Фигура 6 - Растеж на микроорганизми при инокулиране с инжекция ( а) и когато се инокулира в разтопена плътна среда ( б)

3.4.2 Растеж на среда с глюкоза и пептон

Културата се въвежда със стерилен контур в течна среда, съдържаща: 5,0 g/l пептон, 1,0 g/l K2HPO4, 10,0 g/l глюкоза, 2 ml бромтимолово синьо (1,6% алкохолен разтвор), дестилирана вода се излива в епруветки ( 8 ... 10 ml всяка) с плувки. Продължителността на култивирането е 7 дни в термостат при температура 30 °C. Растежът на микроорганизми или неговото отсъствие се определя от мътността на средата, образуването на филм или утайка. Промяната в цвета на индикатора (бромотимол синьо) показва образуването на киселинни (жълт цвят на средата) или алкални (син цвят на средата) метаболитни продукти. Образуването на газ се доказва от натрупването му в поплавъка. Резултатите от наблюденията се сравняват със стерилна среда.

3.4.3 Растеж върху желатинова среда

Активността на извънклетъчните протеолитични ензими в микроорганизмите се определя с помощта на желатин, казеин или други протеини като субстрат. Средата с желатин се състои от месно-пептонен бульон (MPB) и 10-15% желатин (MB). Засяването се извършва чрез инжектиране.

Клетките от микроорганизми се избират стерилно от ставата с бактериологична игла и иглата се вкарва в дебелината на NRM колоната до дъното на епруветката.

Продължителността на култивирането е от 7 до 10 дни при стайна температура. Втечняването на желатина се забелязва визуално. Ако желатинът се втечни, посочете интензитета и формата на втечняване - наслоен, фуниевиден, торбичен, кратеровиден, ряповиден, мехуричен.

3.4.4 Растеж на среда с мляко

Засяването върху "млечен агар" в петриеви блюда се прави, за да се определи способността на бактериите да разлагат млечния казеин. Средата се състои от равни части стерилно обезмаслено мляко и стерилен 3% воден агар-агар. Бактериите се засяват в бримка, начертавайки щрих по диаметъра на чашата или в центъра на сектора, на който е разделена чашата. Продължителността на култивиране на бактериите в термостат при температура 30 °C е 7 дни. Хидролизата на казеин се открива чрез изчистващата зона на средата около колониите или културата на микроорганизми, отглеждани по протежение на хода. Особено ясно се вижда зоната след третиране на средата с пораснали бактерии с разтвор на 5% трихлороцетна киселина. Зоната на хидролиза на казеин се измерва в милиметри от ръба на инсулта или колонията до границата на светлата зона. Колкото по-голям е диаметърът на светлинната зона, толкова по-висока е казеинолитичната активност на бактериите.

3.4.5 Растеж върху нишестена среда

Посяване върху агарова среда с нишесте (в петриеви блюда), съдържаща (g/l): пептон – 10,0; KN2R04 – 5,0; разтворимо нишесте – 2,0; агар – 15,0; рН 6,8 – 7.0, произведен за определяне образуването на амилаза от микроорганизми. Бактериите се засяват в бримка, начертавайки щрих по диаметъра на чашата или в центъра на сектора, на който е разделена чашата. Продължителността на култивирането на бактериите е 7 дни в термостат при температура 30 °C. Хидролиза на нишесте се установява след третиране на средата с порасналите бактерии с разтвор на Лугол. За да направите това, 3 до 5 ml разтвор на Lugol се изсипват върху повърхността на средата. Средата, съдържаща нишесте, става синя, а зоната на хидролиза остава безцветна или придобива червеникаво-кафяв цвят, ако нишестето е хидролизирано до декстрини. Зоната на хидролиза на нишестето се измерва от ръба на щриха (колонията) до границата на светлата зона (mm). Колкото по-голям е диаметърът на светлинната зона, толкова по-висока е амилазната активност.

3.4.6 Каталазен тест

Част от порасналата култура се суспендира с помощта на бактериологична бримка в капка 3% водороден прекис върху предметно стъкло. Наличието на каталаза се доказва от образуването на газови мехурчета, наблюдавано 1-5 минути след въвеждането на бактерии с невъоръжено око или под микроскоп при ниско увеличение. Човек може да нанесе няколко капки водороден прекис директно върху колония или върху култура, отгледана на наклонен агар и да наблюдава освобождаването на молекулен кислород.

3.4.7 Определяне на бактериалната чувствителност
към антибиотици

Удобно е да се определи чувствителността на микроорганизмите към антибиотици с помощта на готови хартиени дискове, импрегнирани с определени антибиотици. Изследваните микроорганизми се отглеждат на подходяща плътна хранителна среда. Гъста суспензия от изследвания микроорганизъм се приготвя в стерилна чешмяна вода чрез промиване на клетките с вода от повърхността на твърда хранителна среда. Работейки близо до пламъка на горелката, добавете 1 ml от получената суспензия
в епруветка с 20 ml агарова среда, разтопена и охладена до температура 50 ºС, например с месо-пептонен агар (MPA). Ако микроорганизмите са отгледани в течна хранителна среда, тогава към агара се добавя подходящият обем култура. Съдържанието на епруветката се смесва бързо и старателно и се излива в стерилна паничка на Петри.

Когато средата се втвърди, върху нейната повърхност се поставя хартия.
дискове на еднакво разстояние един от друг и на разстояние

1,5 ... 2,0 см от ръба на чашата. Петриевите блюда се държат 2 часа при стайна температура за по-добра дифузия на антибиотиците в дебелината на агаровата среда и след това, без да се обръщат, се поставят в термостат за 24 часа при температура 30 ºС. Ден по-късно се отбелязва образуването на зони на инхибиране на растежа на изследваните микроорганизми около дисковете. Ако изследваната бактерия е чувствителна към определени антибиотици, около дисковете се откриват зони без растеж на културата. Диаметърът на зоната на инхибиране на растежа се измерва с милиметрова линийка и резултатите се записват в Таблица 3. Зона по-голяма от 30 mm показва
за високата чувствителност на микроорганизмите към антибиотика и по-малко от 12 mm - за слабата чувствителност.

Когато решенията са на разположение на експериментатора
съдържащи антибиотични вещества или културални течности

антибиотик, използвайте метода, като използвате дупки в дебелината на агара.
В този случай в замразена агарова среда, инокулирана с изпитвания микроорганизъм, се правят дупки със стерилна коркова бормашина (диаметър 6 до 8 mm) на разстояние 1,5–2,0 cm от ръба на съда.
Към ямките се добавят антибиотични разтвори или културална течност. Този метод също така позволява да се разкрие способността за образуване на антибиотични вещества от микроорганизми, отглеждани в течна среда.

Таблица 3 – Ефектът на антибиотиците върху растежа на бактериите

4 КОНТРОЛНИ ВЪПРОСА

1. Дефинирайте следните термини:

- щам; автентичен щам; тип щам;

- колонията;

– културни ценности;

– таксономия;

– класификация;

- номенклатура;

– плазмид;

- Фагово типизиране.

2. Какви раздели включва таксономията на микроорганизмите? Дайте им описание.

3. Защо съществуващите системи за класификация на микроорганизмите са изкуствени?

5. Какви характеристики отличават различните щамове на един и същи вид микроорганизъм?

6. Кои таксономични категории микроорганизми се считат за задължителни и кои са по избор?

7. Избройте основните правила за номенклатурата на микроорганизмите.

8. Каква е основната цел на идентификацията на микроорганизмите?

9. Каква е разликата между принципите на класификация и идентификация на различните групи прокариоти и еукариоти?

10. Какви свойства се изследват при описанието и идентифицирането на бактериите?

11. Какви признаци се вземат предвид при описване на повърхностни, дълбоки и дънни колонии от микроорганизми?

12. Какви особености се отбелязват при описване на растежа на микроорганизмите чрез инсулт?

13. Какво се отбелязва при характеризиране на растежа на микроорганизми в течна хранителна среда?

14. Какви характеристики включват морфологичните характеристики и организацията на бактериалните клетки?

15. Какви физиологични и биохимични свойства се изследват при идентифициране на бактерии?

16. Кога трябва да се използват хемотаксономични методи?

17. Дайте примери за вещества, използвани като химио-таксономични маркери?

18. Какви са особеностите на протеиновата таксономия?

19. Опишете метода на числената таксономия, какви ограничения има?

20. Какви методи се използват за оценка на филогенетичните взаимоотношения на бактериите?

21. Каква е същността на метода на ДНК сондата и разликата му от метода
ДНК-ДНК хибридизация?

22. Какви са особеностите на метода за анализиране на нуклеотидни последователности в рибозомната РНК?

23. Какви признаци формират основата за класификацията на бактериите в „Ключът за бактерии на Бърджи“?

24. Какви свойства и особености се изследват при описване на нови щамове бактерии?

25. Какви методи определят чистотата на идентифицирана бактерия?

26. Кои са основните правила за изпълнение на техниката за оцветяване по Грам?

27. На какви групи се делят микроорганизмите по отношение на молекулярния кислород?

28. Какво се използва като субстрат при определяне на активността на извънклетъчните протолитични ензими в микроорганизмите?

29. Какви методи за определяне на чувствителността на микроорганизмите към антибиотици познавате, дайте техните характеристики.

30. Какъв метод определя образуването на амилаза от микроорганизми?

31. Как засяването дава възможност да се идентифицират и отделят подвижни микроорганизми от неподвижни?

5 РЕЦЕПТИ ОТ БОИ И ХРАНИТЕЛНИ СРЕДИ

5.1 Фуксин основен карбол (фуксин Циля)

- 5% воден разтвор на прясно дестилиран фенол - 100 ml;

- наситен алкохолен разтвор на основен фуксин - 10 ml;

Приготвената смес се филтрира след 48 часа.

5.2 Метиленово синьо (според Loeffler)

- наситен алкохолен разтвор на метиленово синьо - 30 ml;

- дестилирана вода - 100 мл;

- 1% воден разтвор на КОН - 1 мл.

5.3 Месен пептонен бульон (MPB)

500 г кайма без мазнина и сухожилия се изсипват в 1 л чешмяна вода и се екстрахират при стайна температура 12 часа или в термостат при температура 37 ºС - 2 часа, а при температура 50 ºС - един час. След това месото се изстисква през марля и получената запарка се вари 30 минути. Това сгъва протеините. Охладената маса се филтрира през памучен филтър и се долива с вода до първоначалния обем. Освен това към 1 литър месен бульон се добавят от 5 до 10 g пептон и 5 g готварска сол. Средата се загрява, докато пептона се разтвори, като се разбърква непрекъснато. MPB се стерилизира при налягане от 2 атм за 20 минути.

5.4 Месо пептонен агар (MPA)

Към 1 литър MPB добавете 20 g агар. Средата се нагрява до разтваряне на агара, след което се установява слабо алкална реакция на средата

20% NaCO64" височина="52" bgcolor="white" style="vertical-align:top;background: white">