Полимеразна верижна реакция (PCR)

Същността на PCR метода. ДНК полимераза

Полимеразната верижна реакция е експериментален метод на молекулярната биология, който позволява значително увеличаване на малки концентрации на определени фрагменти нуклеинова киселина в биологичния материал. Този процес на увеличаване на броя на копията на ДНК се нарича усилване... Копирането на ДНК по време на PCR се извършва от специален ензим - полимераза.ДНК полимераза (фиг. 3) е ензим, участващ в репликацията на ДНК (амплификация на ДНК в живи организми). Ензимите от този клас катализират полимеризацията на дезоксирибонуклеотиди по ДНК нуклеотидната верига, която ензимът "чете" и използва като матрица. Типът на новия нуклеотид се определя от принципа на взаимно допълване с шаблона, от който се чете.

ДНК полимеразата добавя свободни нуклеотиди към 3 "края на сглобената нишка. Това води до удължаване на нишката в посока 5" -3 ". Нито една от известните ДНК полимерази не може да създаде верига от нулата: те могат само да добавят нуклеотиди към вече съществуваща 3 "-хидроксилна група. Поради тази причина се нуждае от ДНК полимераза грунд- кратка последователност от нуклеотиди (обикновено 20-25), допълваща краищата на изследвания ген - към която тя може да добави първия нуклеотид. Праймерите винаги се състоят от ДНК и РНК бази, докато първите две бази са винаги РНК бази. Праймерите се синтезират от друг ензим - primazoy... Друг ензим - хеликаза-е необходимо за развиване на двойната спирала на ДНК с образуването на едноверижна структура, която осигурява репликацията на двете нишки в съответствие с полуконсервирания модел на репликация на ДНК.

Някои ДНК полимерази също имат способността да коригират грешките в новосглобената ДНК верига. Ако се открие неправилна двойка нуклеотиди, ДНК полимеразата се връща една стъпка назад, изключва неправилния нуклеотид от веригата, след което вмъква правилния нуклеотид на мястото си, след което репликацията продължава както обикновено.

PCR

Полимеразната верижна реакция (PCR) е метод за амплификация на ДНК, с помощта на който в рамките на няколко часа специфична ДНК последователност може да бъде изолирана и умножена милиарди пъти. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За да се извърши полимеразна верижна реакция, трябва да бъдат изпълнени редица условия. За да се извърши PCR в най -простия случай, са необходими следните компоненти:

ДНК шаблон, съдържащ частта от ДНК, която искате да амплифицирате.

Два праймера, допълващи краищата на желания фрагмент. (Двойка изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, обикновено с размер от 15 до 30 bp, са идентични със съответните области на целевата ДНК. Те играят ключова роля при образуването на амплификационни продукти на реакцията. Правилно подбраните праймери осигуряват специфичността и чувствителността на тестова система.)

Термостабилна ДНК полимераза. Използваната в PCR полимераза трябва да остане активна при високи температури дълго време, поради което се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus (Taq полимераза) и други.

Дезоксинуклеотидни трифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ йони, необходими за работата на полимеразата.

Буферен разтвор, осигуряващ необходимите реакционни условия - рН, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя висококипящо масло, например вазелин. Ако използвате уред с нагрят капак, това не е необходимо.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива от PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към нарастващата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

За да се умножи броят на копията на оригиналната ДНК, е необходима циклична реакция. Обикновено всеки от последователно повтарящите се цикли на PCR се състои от три етапа:

1... Денатурация или "топене" на ДНК.Двуверижният ДНК шаблон се нагрява до 94 - 96 ° C (или до 98 ° C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се позволи разделянето на нишките на ДНК. Този етап се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между двете нишки на ДНК се разрушават. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимераза), реакционната смес се загрява предварително за 2 - 5 минути, за да се денатурира напълно шаблона и грундовете. Тази техника се нарича горещ старт, тя ви позволява да намалите количеството на неспецифичните продукти на реакцията.

2. Отгряване - свързване на праймери с матрична ДНК... Когато веригите се разминат, температурата бавно се понижава, така че пармерите да могат да се свържат с едноверижната матрица. Температурата на отгряване зависи от състава на грундовете и обикновено се избира 50-65 ° C. Време на етап - 20 - 60 секунди. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на грундовете с шаблона (при високи температури), или до свързване на грешното място и появата на неспецифични продукти (при ниски температури).

3. Синтез (удължаване на веригата).ДНК полимеразата репликира нишката на шаблона, използвайки праймер като "семена". Полимеразата започва синтеза на втората верига от 3 'края на праймера, който се свързва с шаблона и се движи по шаблона. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните Taq и Pfu полимерази са най -активни при 72 ° В. Времето за синтез зависи от вида на ДНК полимеразата и дължината на фрагмента, който трябва да бъде амплифициран Обикновено времето за удължаване се приема за една минута на всеки хиляда базови двойки. След като всички цикли са завършени, често се извършва допълнителна стъпка навън окончателно удължаванеза завършване на всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 7 до 10 минути.

Впоследствие етапите на денатурация, отгряване и удължаване се повтарят многократно (30 или повече пъти). При всеки цикъл броят на синтезираните копия на ДНК фрагмента се удвоява.

Всички реакции се провеждат в епруветки, потопени в термостат. Температурният режим се променя и поддържа автоматично.

За да се разбере точно как специфичен ДНК сегмент се амплифицира по време на PCR, е необходимо ясно да се представи позицията на всички праймери и техните комплементарни последователности в амплифицираните нишки във всеки кръг. В първия кръг всяка от новосинтезираните нишки е много по-дълга от разстоянието от 3'-хидроксилната група на нейния праймер до крайния нуклеотид на последователността, комплементарна на втория праймер. Такива нишки се наричат "дълги шаблони", те ще се използва за по -нататъшен синтез.

Във втория кръг двуверижната ДНК, състояща се от подобни и новосинтезирани (дълги шаблони) нишки, се денатурира отново и след това се отгрява с праймери. По време на синтеза в този кръг отново се синтезират „дълги шаблони“, както и редица нишки с грунд в единия край и с последователност, допълваща втория грунд в другия („къси шаблони“). По време на третия кръг всички предварително образувани хетеродуплекси се денатурират едновременно и се отгряват с праймери и след това се репликират. В следващите кръгове броят на „късите матрици“ става все повече и към 30 -ия кръг техният брой вече надвишава броя на оригиналните вериги или „дълги матрици“ с 10 6 пъти.

Количеството на специфичен реакционен продукт (ограничен от праймери) теоретично се увеличава пропорционално на 2 n, където n е броят на реакционните цикли. Всъщност ефективността на всеки цикъл може да бъде по -малка от 100%, така че в действителност:

където P е количеството продукт, E е средната ефективност на цикъла.

Броят на "дългите" ДНК копия също нараства, но линейно; следователно, специфичен фрагмент доминира в продуктите на реакцията. Нарастването на необходимия продукт е експоненциално ограничено от количеството реактиви, наличието на инхибитори и образуването на странични продукти.

PCR е високо чувствителен метод, следователно, ако в тестовата проба има дори незначително количество ДНК, което случайно е попаднало от една реакционна смес в друга, могат да се получат фалшиво положителни резултати. Това налага внимателно наблюдение на всички разтвори и прибори, използвани за PCR.

Основни принципи за избор на грунд.

При създаването на система за PCR тест една от основните задачи е правилният подбор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

1. Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 'краищата на праймерите, тъй като именно от тях започва да се натрупва комплементарната ДНК верига Taq-полимераза. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава е вероятно да възникнат нежелани процеси в епруветката с реакционната смес, а именно синтеза на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ленти. Това пречи на оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен амплификационен продукт със синтезирана външна ДНК до значителна загуба на чувствителност.

2. Грундовете не трябва да образуват димери и бримки; не трябва да се образуват стабилни двойни вериги в резултат на отгряване на грундовете към себе си или един към друг.

Което ви позволява да откривате в биологичен материал малки количества по -точно определени фрагменти от него и да ги умножавате многократно. След това те се идентифицират визуално чрез гел електрофореза. Реакцията е разработена през 1983 г. от К. Мулис и е включена в списъка на изключителните открития от последните години.

Какви са механизмите на PCR

Цялата техника се основава на способността на нуклеиновите киселини да се възпроизвеждат независимо, което в този случай се извършва изкуствено в лаборатория. Възпроизвеждането на ДНК може да започне не в която и да е област на молекулата, а само в региони с определена последователност от нуклеотиди - изходни фрагменти. За да започне полимеразната верижна реакция, са необходими праймери (или ДНК сонди). Това са къси фрагменти от ДНК верига с дадена нуклеотидна последователност. Те се допълват (т.е. съответстват) на началните сайтове

Разбира се, за да създадат праймери, учените трябва да изучат нуклеотидната последователност на тази, участваща в техниката. Именно тези ДНК сонди осигуряват специфичността на реакцията и нейното иницииране. няма да работи, ако пробата не съдържа поне една молекула от желаната ДНК. Като цяло, реакцията изисква горните праймери, набор от нуклеотиди и топлоустойчива ДНК полимераза. Последният е ензим - катализатор за синтеза на нови молекули нуклеинова киселина на базата на проба. Всички тези вещества, включително биологичния материал, в който ДНК трябва да бъде открита, се комбинират в реакционна смес (разтвор). Той е поставен в специален термостат, който се загрява и охлажда много бързо за дадено време - цикъл. Обикновено има 30-50 от тях.

Как протича тази реакция?

Същността му е, че по време на един цикъл праймерите се прикрепят към желаните участъци от ДНК, след което тя се дублира под действието на ензим. Въз основа на получените ДНК вериги се синтезират нови и нови идентични фрагменти от молекулата в следващите цикли.

Полимеразната верижна реакция протича последователно, разграничават се следните нейни етапи. Първият се характеризира с удвояване на количеството продукт по време на всеки цикъл на нагряване и охлаждане. Във втория етап реакцията се забавя, тъй като ензимът се уврежда и също губи активност. В допълнение, запасите от нуклеотиди и праймери се изчерпват. На последния етап - плато - продуктите вече не се натрупват, тъй като реагентите са изтекли.

Къде се използва

Несъмнено най -широкото приложение на полимеразната верижна реакция е в медицината и науката. Използва се в общата и частната биология, ветеринарната медицина, фармацията и дори екологията. Освен това в последното това се прави, за да се проследи качеството на храната и предметите във външната среда. Полимеразната верижна реакция се използва активно в съдебната практика за потвърждаване на бащинството и идентифициране на личността на човек. При съдебномедицинската експертиза, както и в палеонтологията, тази техника често е единственият изход, тъй като обикновено изключително малко количество ДНК е на разположение за изследване. Разбира се, методът е намерил много широко приложение в практическата медицина. Той е необходим в области като генетика, инфекциозни и онкологични заболявания.

По това време обаче тази идея остава непотърсена. Полимеразната верижна реакция е преоткрита през 1983 г. от Carey Mallis. Неговата цел беше да създаде метод, който да позволи амплификация на ДНК в хода на множество последователни дублирания на оригиналната молекула на ДНК, използвайки ензима ДНК полимераза. 7 години след публикуването на тази идея, през 1993 г., Мълис получава Нобелова награда за нея.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване - охлаждане, беше необходимо да се добави ДНК полимераза към реакционната смес, тъй като тя бързо се инактивира при високата температура, необходима за разделяне на нишките на ДНК спиралата. Процедурата беше много неефективна и изискваше много време и ензим. През 1986 г. той е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Установено е, че тези ензими са термично стабилни и са в състояние да издържат на множество реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи кръстен Taq-полимераза. Недостатъкът на тази полимераза е, че вероятността от въвеждане на грешен нуклеотид е доста висока, тъй като този ензим няма механизми за корекция на грешки (3 "→ 5" екзонуклеазна активност). Полимераза Пфуи Pwoизолирани от археите притежават подобен механизъм, използването им значително намалява броя на мутациите в ДНК, но скоростта на тяхната работа (обработваемост) е по -ниска от тази на Taq... Сега се използват смеси Taqи Пфуза постигане както на висока скорост на полимеризация, така и на висока точност на копиране.

По време на изобретението на метода, Mallis работи за Cetus Corporation, която патентова PCR метода. През 1992 г. Cetus продава правата върху метода и патента за употреба Taq-полимераза от компанията Hoffmann-La Roche за 300 милиона долара. Оказа се обаче, че Taq-полимеразата се характеризира от руския биохимик Алексей Каледин през 1980 г., във връзка с което компанията Promega (Promega) се опитва да принуди Roche в съда да се откаже от изключителните права върху този ензим. Американският патент за PCR метода изтече през март 2005 г.

PCR

Методът се основава на многократно селективно копиране на специфична ДНК област, използвайки ензими при изкуствени условия ( инвитро). В този случай копирането се извършва само от областта, която отговаря на посочените условия, и само ако тя присъства в изследваната извадка. За разлика от амплификацията на ДНК в живите организми (репликация), относително късите участъци от ДНК се амплифицират с помощта на PCR. При конвенционален PCR процес дължината на копираните ДНК области е не повече от 3000 двойки основи (3 kbp). Използвайки смес от различни полимерази, използвайки добавки и при определени условия, дължината на PCR фрагмента може да достигне 20-40 хиляди базови двойки. Това все още е значително по -малко от дължината на хромозомната ДНК на еукариотна клетка. Например, човешкият геном се състои от приблизително 3 милиарда базови двойки.

Реакционни компоненти

За да се извърши PCR в най -простия случай, са необходими следните компоненти:

ДНК матрицасъдържаща частта от ДНК, която искате да амплифицирате.
Два грундакомплементарни към противоположните краища на различни нишки на желания фрагмент от ДНК.
Термостабилен ДНК полимераза- ензим, който катализира реакцията на полимеризация на ДНК. Полимеразата за използване в PCR трябва да запази активността си при висока температура за дълго време, поради което се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus(Taq полимераза), Pyrococcus furiosus(Pfu полимераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полимераза) и други.
Дезоксинуклеозидни трифосфати(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ йони, необходими за работата на полимеразата.
Буферен разтворосигуряване на необходимите условия на реакция - рН, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, говежди серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя висококипящо масло, например вазелин. Това не е необходимо, ако се използва термичен цикъл с нагрят капак.

Грундове

Специфичността на PCR се основава на образуването на комплементарни комплекси между матрицата и праймерите, къси синтетични олигонуклеотиди с дължина 18-30 основи. Всеки от праймерите е допълващ към една от нишките на двуверижния шаблон и ограничава началото и края на амплифицираната област.

След хибридизация на шаблона с праймера (отгряване), последният служи като праймер за ДНК полимераза при синтеза на комплементарната верига на шаблона (виж).

Най-важната характеристика на грундовете е температурата на топене (T m) на комплекса грунд-шаблон. T m е температурата, при която половината от ДНК шаблоните образуват комплекс с олигонуклеотидния праймер. Точката на топене може грубо да се определи по формулата, където n X е броят на X нуклеотидите в праймера. В случай на неправилен избор на дължината и нуклеотидния състав на праймера или температурата на отгряване е възможно образуването на частично комплементарни комплекси с други области на матричната ДНК, което може да доведе до появата на неспецифични продукти. Горната граница на точката на топене е ограничена от оптималната температура на действието на полимеразата, чиято активност намалява при температури над 80 ° C.

При избора на грундове е препоръчително да се придържате към следните критерии:

Усилвател

Ориз. 1: Усилвател за PCR

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и загряване на тръбите, обикновено с точност най -малко 0,1 ° C. Съвременните усилватели ви позволяват да задавате сложни програми, включително с възможност за "горещ старт", PCR за докосване (вижте по -долу) и последващо съхранение на усилените молекули при 4 ° C. За PCR в реално време се произвеждат устройства, оборудвани с флуоресцентен детектор. Има и инструменти с автоматичен капак и отделение за микроплаки за интегриране в автоматизирани системи.

Напредък на реакцията

Снимка на гел, съдържащ маркерна ДНК (1) и продукти от реакцията на PCR (2,3). Числата показват дължината на ДНК фрагменти в нуклеотидни двойки

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20-35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа (фиг. 2).

Денатурация

Двуверижният ДНК шаблон се нагрява до 94-96 ° C (или 98 ° C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0.5-2 минути, за да се позволи разделянето на нишките на ДНК. Този етап се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между две нишки на ДНК са унищожени. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимераза), реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути. за пълна денатурация на шаблона и грундовете. Тази техника се нарича горещ старт, тя ви позволява да намалите количеството на неспецифичните продукти на реакцията.

Отгряване

Когато нишките се разпръснат, температурата се понижава, така че праймерите да могат да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване... Температурата на отгряване зависи от състава на грундовете и обикновено се избира 4-5 ° C под тяхната точка на топене. Етапно време - 0,5-2 минути. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на грундовете с шаблона (при високи температури), или до свързване на грешното място и появата на неспецифични продукти (при ниски температури).

Удължаване

Разновидности на PCR

"Вложена" PCR (Вложена PCR) - използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използват се две двойки праймери и се провеждат две последователни реакции. Втора двойка праймери усилва участък от ДНК в продукта на първата реакция.
"Обърната" PCR (Inverse PCR (eng.)) - използва се в случай, че е известен само малък участък в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато трябва да определите съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За да се извърши обърната PCR, се извършва серия от ДНК разфасовки с рестрикционни ендонуклеази, последвано от присъединяване на фрагментите (лигиране). В резултат на това в двата края на неизвестния регион се появяват известни фрагменти, след което PCR може да се извърши както обикновено.
PCR с обратна транскрипция (RT-PCR) се използва за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от библиотека на РНК. Преди конвенционалната PCR, едноверижна ДНК молекула се синтезира върху иРНК шаблона, използвайки обратна транскриптаза и се получава едноверижна сДНК, която се използва като матрица за PCR. Този метод често се използва за определяне къде и кога се експресират тези гени.
Асиметрична PCR (rus. Асиметрична PCR) - се извършва, когато е необходимо да се амплифицира главно една от нишките на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за анализ на секвениране и хибридизация. PCR се провежда както обикновено, с изключение на това, че един от праймерите се взема в голям излишък.
Количествен PCR (Q-PCR) се използва за бързо измерване на количеството на специфична ДНК, сДНК или РНК в проба.
Количествена PCR в реално време - Този метод използва флуоресцентно маркирани реактиви за точно измерване на количеството на реакционния продукт при натрупването му.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - използвайки този метод, ефектът от неспецифичното свързване на праймера върху образуването на продукта се намалява. Първите цикли се извършват при температура над температурата на отгряване, след което температурата се намалява на всеки няколко цикъла. При определена температура системата ще премине през лентата на оптималната специфичност на праймерите за ДНК.
Метод на молекулярна колония (гел PCR) Polony - PCR колония) - акриламидният гел се полимеризира с всички PCR компоненти на повърхността и се провежда PCR. В точките, съдържащи анализираната ДНК, се появява амплификация с образуването на молекулни колонии.
PCR с бързо амплифициране на краищата на cDNA (rus. Бързо амплифициране на cDNA краища, RACE-PCR )
PCR с дълги фрагменти (руски PCR с дълъг обхват) - модификация на PCR за амплификация на разширени ДНК области (10 хиляди бази и повече). Използват се две полимерази, едната от които е Taq полимераза с висока процесивност (тоест способна да синтезира дълга ДНК верига в един проход), а втората е ДНК полимераза с 3 "-5" ендонуклеазна активност. Втората полимераза е необходима за коригиране на грешките, въведени от първата.
RAPD PCR (инж. Случайно амплифициране на полиморфна ДНК PCR , PCR със случайно амплифициране на полиморфна ДНК - използва се, когато е необходимо да се разграничат организми, близки по генетична последователност, например, различни сортове култивирани растения, породи кучета или близки сродни микроорганизми. Този метод обикновено използва един малък грунд (20 - 25 bp). Този праймер ще бъде частично допълващ случайни ДНК области на изследваните организми. Чрез избиране на условията (дължина на праймера, неговия състав, температура и т.н.) е възможно да се постигне задоволителна разлика в PCR модела за два организма.

Ако нуклеотидната последователност на шаблона е частично или изобщо не е известна, можете да използвате дегенерирани грундове, чиято последователност съдържа дегенерирани позиции, в които могат да бъдат разположени всякакви бази. Например, последователността на праймера може да бъде: ... ATH ..., където H е A, T или C.

PCR приложение

PCR се използва в много области за анализ и научни експерименти.

Съдебна медицина

PCR се използва за сравняване на така наречените „генетични отпечатъци“. Изисква се проба от генетичния материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, косми и пр. Тя се сравнява с генетичния материал на заподозрения. Теоретично е достатъчно много малко количество ДНК - едно копие. ДНК се разцепва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят с помощта на ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен отпечатък(англ. генетичен отпечатък).

Установяване на бащинство

Ориз. 3: Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. (1) Баща. (2) Дете. (3) Майка. Детето наследи някои от характеристиките на генетичния отпечатък и на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че „генетичните отпечатъци“ са уникални (с изключение на случаите на еднояйчни близнаци), семейните връзки все още могат да бъдат установени, като се направят няколко такива отпечатъка (фиг. 3). Същият метод може да бъде приложен, леко модифициран, за установяване на еволюционно родство между организмите.

Медицинска диагностика

PCR дава възможност значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Желаният ген се амплифицира чрез PCR с помощта на подходящи праймери и след това се секвенира за откриване на мутации. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Известно е, че повечето лекарства не действат върху всички пациенти, за които са предназначени, а само върху 30-70% от техния брой. В допълнение, много лекарства са токсични или алергенни за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент определен цитохром (чернодробен протеин, отговорен за метаболизма на чужди вещества) може да бъде по -активен, при друг по -малко. За да се определи какъв цитохром притежава даден пациент, беше предложено да се извърши PCR анализ преди употреба на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране (англ. бъдещо генотипиране).

Клониране на гени

Клонирането на гени (да не се бърка с клониращи организми) е процесът на изолиране на гени и в резултат на манипулации на генното инженерство получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква в вектор- ДНК фрагмент, който прехвърля чужд ген в същия или друг, удобен за отглеждане организъм. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукта на този ген - РНК или по -често протеин. По този начин много протеини се получават в промишлени количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

Ориз. 4: Клониране на ген с помощта на плазмид. ...
(1) Хромозомна ДНК на организъм А. (2) PCR. (3) Много копия на гена на организъм А. (4) Вмъкване на гена в плазмида. (5) Плазмид с гена на организъм А. (6) Въвеждане на плазмида в организъм В. (7) Умножаване на броя на копията на гена на организъм А в организъм В.

ДНК секвениране

В метода на секвениране, използващ флуоресцентно маркирани или радиоактивни изотопни дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, са включени в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определи положението на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

Мутагенеза

Понастоящем PCR се превърна в основен метод за провеждане на мутагенеза. Използването на PCR направи възможно да се опрости и ускори процедурата за провеждане на мутагенеза, както и да се направи по -надеждна и възпроизводима.

1. Полимеразна верижна реакция (PCR)

2. Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

2.1 Наличието на редица компоненти в реакционната смес

2.2 Циклични температурни условия

2.3 Основни принципи за избор на грунд

2.4 Ефектът "плато"

3. Етапи на производство на PCR

3.2 Усилване

3.4.1 Положителни контроли

3.4.2 Вътрешен контрол

4.1 Качествен анализ

4.1.2 Откриване на молекули на РНК

3.1 Подготовка на проба от биологичен материал

За извличане на ДНК се използват различни техники, в зависимост от задачите. Тяхната същност се крие в екстракцията (екстракцията) на ДНК от биологичен продукт и отстраняването или неутрализирането на примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Тя включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод ви позволява да получите чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за извличане на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомитна пръст, стъклено "мляко" и др.). След измиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носител, от която може лесно да се отстрани с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проба за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и в процеса на много промивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. В допълнение, дори следи от количество GuSCN могат да инхибират PCR. Ето защо, когато използвате този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни.

Друга група методи за приготвяне на проби се основава на използването на йонообменници от тип Chilex, които за разлика от стъклото не адсорбират ДНК, а напротив, примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и сорбция на примеси върху йонообменника. Методът е изключително привлекателен със своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с такива примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез просто кипене. В тези случаи е необходимо да се въведат допълнителни етапи на обработка на пробата.

По този начин изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се разглежда с разбиране на целите на предвидените анализи.

3.2 Усилване

За да се проведе реакцията на амплификация, е необходимо да се приготви реакционна смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. В този случай е важно да се вземат предвид някои от характеристиките на грубото отгряване. Факт е, че по правило анализираната биологична проба съдържа разнообразие от ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна, хомология. В допълнение, грундовете могат да се отгряват помежду си, за да образуват праймери на димери. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) продукти на реакцията и в резултат на това значително намалява чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно отчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

3.3 Оценка на резултатите от реакцията

За правилна оценка на резултатите от PCR е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично, амплификационните продукти на единични прицелни ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича в условия, близки до идеалните, което не се среща често в живота. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията, т.е. наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога поради тяхното присъствие не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

3.3.1 Метод на хоризонтална електрофореза

За визуализиране на резултатите от усилването се използват различни методи. Най -разпространеният метод днес е електрофорезата, основана на разделянето на молекулите на ДНК по размер. За да направите това, пригответе чиния от агарозен гел, който се замразява след топене в буферна електрофорезна агароза в концентрация 1,5-2,5% с добавяне на специално ДНК багрило, например етидиев бромид. Замразената агароза образува пространствена решетка. При пълнене с гребени в гела се образуват специални ямки, в които впоследствие се вкарват продукти за усилване. Гелната плоча се поставя в хоризонтален гел електрофорезен апарат и се свързва източник на постоянно напрежение. Отрицателно заредената ДНК започва да се движи от минус към плюс в гела. В този случай по -късите молекули на ДНК се движат по -бързо от дългите. Скоростта на движение на ДНК в гела се влияе от концентрацията на агароза, силата на електрическото поле, температурата, състава на буфера за електрофореза и в по -малка степен от GC състава на ДНК. Всички молекули с еднакъв размер се движат със същата скорост. Багрилото е вградено (интеркалирано) в равнинни групи в ДНК молекули. След края на електрофорезата, продължила от 10 минути до 1 час, гелът се поставя върху филтъра на трансиллуминатор, излъчващ светлина в ултравиолетовия диапазон (254 - 310 nm). Ултравиолетовата енергия, погълната от ДНК в областта на 260 nm, се прехвърля към багрилото, което го кара да флуоресцира в оранжево-червената област на видимия спектър (590 nm).

Яркостта на лентите на усилвателните продукти може да бъде различна. Това обаче не може да бъде свързано с първоначалното количество целева ДНК в пробата.

3.3.2 Метод на вертикална електрофореза

Методът за вертикална електрофореза е фундаментално подобен на хоризонталната електрофореза. Тяхната разлика се състои в това, че в този случай вместо агароза се използват полиакриламидни гелове. Извършва се в специална камера за вертикална електрофореза. Електрофорезата с полиакриламиден гел има по -висока разделителна способност в сравнение с агарозната електрофореза и прави възможно разграничаването на ДНК молекули с различни размери с точност до един нуклеотид. Приготвянето на полиакриламиден гел е малко по -сложно от агарозния гел. В допълнение, акриламидът е токсично вещество. Тъй като необходимостта от определяне на размера на амплификационния продукт с точност 1 нуклеотид възниква рядко, методът на хоризонталната електрофореза се използва в рутинната работа.

3.4 Контрол върху преминаването на амплификационната реакция

3.4.1 Положителни контроли

ДНК препарат на желания микроорганизъм се използва като "положителна контрола". Неспецифичните ампликони се различават по размер от ампликоните, генерирани чрез амплификация с контролен ДНК препарат. Размерът на неспецифичните продукти може да бъде или по -голям, или по -малък от положителната контрола. В най -лошия случай тези размери могат да съвпадат и се четат като положителни при електрофорезата.

За да се контролира специфичността на генерирания амплификационен продукт, можете да използвате хибридизационни сонди (ДНК области, разположени вътре в амплифицираната последователност), маркирани с ензимни етикети или радиоактивни изотопи и взаимодействащи с ДНК в съответствие със същите принципи като праймерите. Това значително усложнява и удължава анализа, а цената му се увеличава значително.

3.4.2 Вътрешен контрол

Необходимо е да се контролира хода на амплификация във всяка епруветка с реакционната смес. За тази цел се използва допълнителен, така наречен "вътрешен контрол". Това е всеки ДНК препарат, който е различен от ДНК на целевия микроорганизъм. Ако вътрешният контрол се добави към реакционната смес, той ще стане същата цел за отгряване на праймера, като хромозомната ДНК на желания инфекциозен агент. Размерът на амплификационния продукт на вътрешния контрол е избран така, че да е 2 или повече пъти по -голям от ампликоните, образувани от амплификацията на желаната ДНК на микроорганизма. В резултат на това, ако вътрешната контролна ДНК се добави към реакционната смес заедно с изпитваната проба, тогава независимо от присъствието на микроорганизма в биологичната проба, вътрешният контрол ще доведе до образуването на специфични ампликони, но много по -дълги (тежки ) от ампликона на микроорганизма. Наличието на тежки ампликони в реакционната смес ще показва нормалния ход на амплификационната реакция и отсъствието на инхибитори. Ако не са образувани ампликони с необходимия размер, но не са се образували и ампликони на вътрешния контрол, може да се заключи, че в анализираната проба има нежелани примеси, които трябва да бъдат елиминирани, но не и отсъствието на желаната ДНК .

За съжаление, въпреки цялата привлекателност на този подход, той има значителен недостатък. Ако необходимата ДНК е в реакционната смес, тогава ефективността на нейното амплифициране рязко се намалява поради конкуренцията с вътрешния контрол за праймери. Това е особено важно при ниски концентрации на ДНК в тестовата проба, което може да доведе до фалшиво отрицателни резултати.

Въпреки това, ако проблемът с конкуренцията за праймерите бъде решен, този метод за контрол на ефективността на усилването със сигурност ще бъде много полезен.

4. Методи, базирани на полимеразна верижна реакция

4.1 Качествен анализ

Класическият метод за извършване на PCR, принципите на който бяха очертани по -горе, намери своето развитие в някои модификации, насочени към преодоляване на ограниченията на PCR и повишаване на ефективността на реакцията.

4.1.1 Метод за настройка на PCR чрез „горещ старт“

За да се намали рискът от образуване на неспецифични продукти от реакцията на амплификация, се използва подход „горещ старт“, който се състои в предотвратяване на възможността реакцията да започне преди достигане на условията в епруветката, които осигуряват специфично отгряване на праймерите.

Факт е, че в зависимост от състава и размера на GC, грундовете имат определена точка на топене (Tm). Ако температурата на системата надвиши Tm, грундът не може да се придържа към веригата на ДНК и се денатурира. При оптимални условия, т.е. температура на отгряване, близка до температурата на топене, праймерът образува двуверижна молекула само при условие на пълното й допълване и по този начин осигурява специфичността на реакцията.

Има различни опции за внедряване на горещ старт:

Въвеждане на Taq-полимераза в реакционната смес по време на първия цикъл след загряване на тръбата до температурата на денатурация.

Разделяне на съставките на реакционната смес с парафинов слой на слоеве (в долната част - праймери, в горната част - Taq -полимераза и ДНК мишена), които се смесват при разтопяване на парафина (~ 65-75 0 С ).

Използване на моноклонални антитела към Taq полимераза. Ензимът, свързан с моноклонални антитела, става активен едва след първия етап на денатурация, когато моноклоналните антитела необратимо се денатурират и освобождават активните места на Taq полимераза.

Във всички тези случаи, дори ако неспецифичното отгряване е настъпило преди началото на температурния цикъл, удължаване не настъпва и при нагряване комплексите праймер-ДНК се денатурират, поради което не се образуват неспецифични продукти. Освен това температурата в епруветката не пада под температурата на топене, което осигурява образуването на специфичен продукт за усилване.

4.1.2 Откриване на молекули на РНК

Възможността за използване на РНК като мишена за PCR значително разширява обхвата на приложение на този метод. Например геномите на много вируси (хепатит С, грипен вирус, пикорнавируси и др.) Са представени от РНК. В същото време в техния жизнен цикъл няма междинна фаза на трансформация в ДНК. За да се открие РНК, е необходимо преди всичко да се преобразува във форма на ДНК. За тази цел се използва обратна транскриптаза, която е изолирана от два различни вируса: вирус на миелобластоза на птици и вирус на миши левкемия на Moloney. Използването на тези ензими е свързано с някои трудности. На първо място, те са термолабилни и следователно могат да се използват при температури не по -високи от 42 ° С. Тъй като при тази температура молекулите на РНК лесно образуват вторични структури, ефективността на реакцията е забележимо намалена и според различни оценки е приблизително 5%. Правят се опити да се заобиколи този недостатък с помощта на термостабилна полимераза, получена от термофилния микроорганизъм Thermus Thermophilus, който проявява транскриптазна активност в присъствието на Mn 2+, като обратна транскриптаза. Това е единственият известен ензим, способен да проявява както полимеразна, така и транскриптазна активност.

За да се проведе реакцията на обратна транскрипция в реакционната смес, както и в PCR, праймерите трябва да присъстват като праймер и смес от 4 dNTPs като строителен материал.

След реакцията на обратна транскрипция, получените сДНК молекули могат да служат като мишена за PCR.

5. Организация на технологичния процес на поставяне на PCR

Потенциално високата чувствителност на полимеразната верижна реакция прави особено задълбочен PCR лабораторен дизайн от съществено значение. Това се дължи на най -острия проблем на метода - замърсяването.

Замърсяването е проникването на специфични молекули на ДНК от външната среда в реакционната смес, които могат да служат като мишени в реакцията на амплификация и да дадат фалшиво положителни резултати.

Има няколко начина за справяне с това неприятно явление. Едно от тях е използването на ензима N-урацил-гликозилаза (UG). Този метод се основава на способността на UG да разцепва ДНК молекули с вграден урацил. Реакцията на амплификация се провежда с помощта на dNTP смес, в която dTTP се заменя с урацил, а след термично циклиране всички ампликони, образувани в епруветката, ще съдържат урацил. Ако UG се добави към реакционната смес преди амплификацията, тогава ампликоните в реакционната смес ще бъдат унищожени, докато естествената ДНК ще остане непокътната и допълнително ще служи като мишена за амплификация.

По този начин този метод само до известна степен елиминира източника на замърсяване и не гарантира срещу фалшиво положителни резултати.

Друг начин за справяне с резултатите от замърсяването е значително намаляване на броя на реакционните цикли (до 25-30 цикъла). Но дори и при този подход рискът от получаване на фалшиво положителни резултати е висок, тъй като в този случай, при липса на инхибитори, е лесно да се получи продукт за усилване поради замърсяване.

Така, въпреки ползите от мерките за предусилване, насочени към инактивиране на молекулите на ДНК, които причиняват фалшиво положителни резултати, най-радикалното средство е добре обмислената организация на лабораторията.

Заключение

Най -разпространеният метод за PCR в момента се получава като метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко при ранна диагностика на HIV инфекции, вирусен хепатит и др. Днес почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит с помощта на PCR.

Не толкова отдавна беше разработен надежден, високо чувствителен и бърз метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания при хората. Този метод се нарича "PCR анализ". Какво е това, каква е неговата същност, какви микроорганизми може да открие и как да го приема правилно, ще ви разкажем в нашата статия.

История на откритията

Също така, PCR методите се използват за диагностика на рак.

Предимства на метода

PCR диагностиката има редица предимства:

Висока чувствителност. Дори ако има само няколко ДНК молекули на микроорганизъм, PCR анализът открива наличието на инфекция. Методът ще помогне при хронични и латентни заболявания. Често в такива случаи микроорганизмът се декултивира по други начини.
Всеки материал е подходящ за изследване, например слюнка, кръв, генитален секрет, коса, епителни клетки. Най -често срещаният е кръвен тест и урогенитална намазка за PCR.
Не се изисква дългосрочно отглеждане на култури. Автоматизираният диагностичен процес ви позволява да получите резултатите от изследването след 4-5 часа.
Методът е почти сто процента надежден. Записани са само няколко случая на фалшиво отрицателен резултат.
Способността да се идентифицират няколко вида патогени от една проба материал. Това не само ускорява процеса на диагностициране на болестта, но и значително намалява материалните разходи. Често лекарят предписва цялостен PCR анализ. Цената на изследването, което се състои от идентифициране на шест патогена, е около 1500 рубли.

За да бъдат резултатите надеждни при провеждане на PCR изследване, е необходимо да се премине анализът, като се следват препоръките за предварителна подготовка за диагностика:

Преди да дарите слюнка, трябва да се въздържате от ядене и приемане на лекарства 4 часа преди да вземете материала. Непосредствено преди процедурата изплакнете устата си с преварена вода.
Горните правила трябва да се спазват при вземане на проба от вътрешната повърхност на бузата. След изплакване се препоръчва да се извърши лек масаж на кожата, за да се освободи секретът на жлезата.
Урината обикновено се събира у дома. За да направите това, трябва да проведете задълбочена тоалетна на гениталиите. Съберете 50-60 ml урина в стерилен пластмасов контейнер. За да се гарантира чистотата на материала, се препоръчва на жените да поставят тампон във влагалището, а на мъжете да издърпат кожната гънка колкото е възможно повече. Не можете да дарявате материал по време на менструалния поток.
За да дарите сперма, трябва да се въздържате от полов акт в продължение на 3 дни, преди да вземете материала. Също така, лекарите съветват да се откажете от посещението на сауната и да вземете гореща вана, да пиете алкохол и пикантни храни. В продължение на 3 часа преди анализа трябва да се въздържате от уриниране.
При доставка, например, ако се направи анализ за PCR на хламидия, се препоръчва и на жените, и на мъжете да имат полова почивка в продължение на 3 дни. Антибактериални лекарства не трябва да се приемат 2 седмици преди анализа. За една седмица трябва да спрете да използвате интимни гелове, мехлеми, вагинални супозитории, душ. В продължение на 3 часа преди изследването трябва да се въздържате от уриниране. По време на менструация материалът не се взема, само 3 дни след прекратяване на кръвния секрет можете да вземете урогенитална намазка.

PCR по време на бременност

Докато чакат бебето, много инфекции, предавани по полов път, са изключително опасни за нормалното развитие на плода. ППБ могат да провокират вътрематочно забавяне на растежа, спонтанен аборт или преждевременно раждане, вродени малформации на детето. Ето защо е изключително важно да се подложите на PCR преглед в ранните етапи на бременността. Необходимо е анализът да се премине при регистрация - до 12 седмици.

Материалът се взема от цервикалния канал с помощта на специална четка. Процедурата е безболезнена и не представлява опасност за бебето. Обикновено по време на бременност се извършва анализ за хламидия по PCR метода, както и за уреаплазмоза, микоплазмоза, цитомегаловирус, херпес, папиломен вирус. Такъв комплекс от изследвания се нарича PCR-6.

PCR за диагностика на ХИВ

Поради факта, че методът е много чувствителен към промените в тялото и условията за диагностика, много фактори могат да повлияят на резултата. Следователно, анализът на PCR за HIV инфекция не е надежден метод, неговата ефективност е 96-98%. В останалите 2-4% от случаите тестът дава фалшиво положителни резултати.

Но в някои ситуации PCR диагностиката на ХИВ е незаменима. Обикновено се дава на хора с фалшиво отрицателен тест ELISA. Такива показатели показват, че човек все още не е развил антитела срещу вируса и те не могат да бъдат открити без многократно увеличаване на броя. Точно това може да се постигне с PCR кръвен тест.

Подобна диагностика е необходима и за деца от първата година от живота, родени от HIV-позитивна майка. Методът е единственият начин за надеждно определяне на статуса на дете.

PCR за диагностика на хепатит

Методът на полимеразна верижна реакция позволява откриване на ДНК на вируса на хепатит А, В, С много преди образуването на антитела срещу инфекция или появата на симптоми на заболяването. PCR анализът за хепатит С е особено ефективен, тъй като в 85% от случаите такова заболяване протича безсимптомно и без навременно лечение преминава в хроничен стадий.

Навременното откриване на патогена ще помогне да се избегнат усложнения и дългосрочно лечение.

Цялостно PCR изследване

Изчерпателен PCR анализ: изследване по метода на полимезарната верижна реакция, което включва определяне на няколко вида инфекции едновременно: микоплазма гениталий, микоплазма хоминис, гарднерела вагиналис, кандида, трихомонада, цитомегаловирус, херпес 1 и 2 тип, гонорея, папиломен вирус. Цената на такава диагноза варира от 2000 до 3500 рубли. в зависимост от клиниката, използваните материали и оборудване, както и от вида на анализа: качествен или количествен. Какво е необходимо във вашия случай - лекарят ще реши. В някои случаи е достатъчно само да се определи наличието на патогена, в други, например, при HIV инфекция, количественият титър играе важна роля. При диагностициране на всички горепосочени патогени изследването се нарича "PCR-12 анализ".

Тълкуване на резултатите от анализа

Декодирането на PCR анализа не е трудно. Има само 2 скали на индикатора - „положителен резултат“ и „отрицателен резултат“. Когато се открие патоген, лекарите могат да потвърдят наличието на болестта с 99% сигурност и да започнат лечение на пациента. С количествения метод за определяне на инфекцията, числовият индикатор за откритите бактерии ще бъде посочен в съответната колона. Само лекар може да определи степента на заболяването и да предпише необходимото лечение.

В някои случаи, например, при определяне на HIV инфекция чрез PCR, в случай на отрицателен резултат, се налага провеждането на допълнителни изследвания за потвърждаване на получените показатели.

Къде да се тествам?

Къде да се направи PCR анализ: в държавна клиника или в частна лаборатория? За съжаление в общинските лечебни заведения оборудването и методите често са остарели. Затова е по -добре да се даде предимство на частни лаборатории с модерно оборудване и висококвалифициран персонал. Освен това в частна клиника ще получите резултати много по -бързо.

В Москва много частни лаборатории предлагат PCR анализ за различни инфекции. Например в такива клиники като "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro" се извършва PCR анализ. Цената на прегледа е от 200 рубли. за идентифициране на един патоген.

Може да се заключи, че диагностицирането на инфекциозни заболявания чрез PCR в повечето случаи е бърз и надежден начин за откриване на патогена в организма в ранните етапи на инфекцията. Но все пак в определени случаи си струва да изберете други диагностични методи. Само специалист може да определи необходимостта от такова изследване. Декодирането на PCR анализа също изисква професионален подход. Следвайте препоръките на лекаря и не правете сами тестове, които не са необходими.