Действието на цитокините върху клетките се осъществява чрез. Цитокини. Молекулярни и клетъчни механизми на антивирусен имунитет, модели на развитие и имунопато

Доскоро ракът на 4 етап всъщност беше смъртна присъда за пациента. Традиционните методи на лечение не помогнаха много, цялата терапия беше ограничена до облекчаване на симптомите. Въпреки това, преди няколко десетилетия, те започнаха активно да развиват имуноонкология и по -специално цитокинова терапия - метод за лечение с лекарства на базата на телесни протеини, който според прегледите е много ефективен. Клиниката по онкоимунология и цитокинова терапия в Москва се счита за една от най -добрите в света заради своите положителни показатели.

Какво е цитокинова терапия

Този метод на лечение е разработен въз основа на имуно-онкологията, клон на онкологията, който изучава функционирането на имунната система при рак. Методът се основава на лечението на рак и други заболявания с лекарства на базата на протеини (цитокини) на човешкото тяло. При определени условия те могат да унищожат различни патогени: чужди клетки, вируси, антигени, ендотоксини и т.н. Как действат цитокините:

• активиране на имунологичния отговор на организма към атаката на патогени;
• контрол на работата на имунната система, клетки -убийци (елементи, които се борят директно с болестта);
• провокиране на обновяването на клетъчната маса до здрава;
• нормализиране на системите на организма.

Положително действие

Добавянето на работа с цитокини в комплексното лечение на онкологията спомага за постигане на абсолютна положителна терапия при 10-30% от пациентите, а частичен успех достига до 90%. Може да изглежда, че това не е достатъчно, но за тежки ракови тумори от последните етапи това е огромно постижение. Освен това техниката може и трябва да се комбинира с традиционни методи (медикаменти, химиотерапия).

Цитокиновата терапия работи качествено и насочено срещу тумори, метастази и в същото време няма токсичен ефект върху организма. Отделно, заслужава да се отбележи положително повишаване на качеството на химиотерапията. Техниката вече е доказала своята ефективност в клинични изпитвания (в Руската федерация е разрешено да се лекуват повече от 50 патологии от различни видове с тази техника). В допълнение към онкологичните заболявания, цитокиновата терапия успешно се бори с други патологии:

• онкология до етап 4;
• вирусен хепатит В, С;
• меланом;
• Саркома на Капоши на фона на ХИВ;
• СПИН и ХИВ;
• ТОРС, грип, бактериални чревни и ротавирусни инфекции;
• туберкулоза;
• херпес зостер;
• шизофрения;
• множествена склероза.

Онкоимунология и цитокинова терапия

Практически всички злокачествени тумори с тежко протичане протичат на фона на потиснат имунитет. Онкоимунолозите (специалисти по имуноонкология) разработват на фона на клиничните проучвания нови методи и лекарства за лечение на рак, основани на действията на имунната система. Методът на цитокиновата терапия се основава на използването на цитокини, специални протеини, а самата техника се появява през 80 -те години на 20 век. Основният проблем беше високата токсичност на лекарствата. Съвременните лекарства на базата на цитокини имат токсичност 100 пъти по -ниска.

Функции на цитокините в организма

В човешкото тяло има огромно количество цитокини, всички те изпълняват различни функции. Цитокиновата терапия използва това разнообразие за лечение на широк спектър от заболявания и за активиране на вътрешните процеси в организма. Доказано е, че всъщност човешките системи могат да се борят с всеки проблем. Основното е да стартирате необходимите процеси. Функциите на цитокините в организма:

• контрол върху продължителността и качеството на имунния отговор;
• противовъзпалителните цитокини контролират възпалението;
• стимулиране развитието на автоимунни реакции (противовъзпалителни и провъзпалителни цитокини);
• участие в механиката на алергията;
• намаляване на тумора или неговото унищожаване;
• стимулиране или потискане на клетъчния растеж;
• забавяне развитието на онкологията;
• координация на имунната, ендокринната и нервната система;
• предотвратяване на туморен рецидив;
• поддържане на хомеостазата (здравословно постоянство) на тялото.

Броят на изследваните цитокинови протеини вече е надхвърлил 200 имена. Взаимодействието на цитокините е сложен комплекс с различни функции. Първоначално те се разделят според вида дейност. Опростената класификация предполага разделение според биологичните ефекти: регулатори на възпалението (противовъзпалителни и провъзпалителни цитокини), регулиращи клетъчния имунитет и хуморалното имунно деление. По -прецизната систематизация разгражда протеините според естеството им на действие. Видове цитокини:

• регулатори на имунната активност (интерлевкините и техните биологични функции осигуряват правилното взаимодействие на имунитета с други системи на тялото);
• антивирусни регулатори - интерферони;
• TNF (фактори на туморна некроза) - регулаторни или токсични ефекти върху клетките;
• хемокини - контрол на движението на всички видове левкоцити, други клетки;
• растежни фактори - контрол на клетъчния растеж;
• колони -стимулиращи фактори - стимулиращи развитието на хемопоетични клетки.

Цитокините като лекарства

Ingaron е цитокиново терапевтично средство за засилване на ефекта от химиотерапията, като същевременно предпазва организма от токсични ефекти. Освен това намалява възможната поява на метастази и тумори. Лекарството Ingaron провокира развитието на имунитет, което след химиотерапия няма да позволи развитието на инфекциозни заболявания, ще намали нуждата от антибактериални лекарства. Инструментът има минимална токсичност в сравнение със западните аналози.

Лекарството Refnot е насочено към ограничаване на развитието на неоплазми поради TNF цитокина в състава. Агентът също има качествено намалена токсичност, което позволява подкожно или интравенозно приложение, стимулира унищожаването на злокачествени тумори, без да засяга придружаващите тъкани. За да се определи динамиката на лечението, са необходими 1-2 курса. За да се постигне максимален ефект, и двете лекарства се използват в комбинация за активиране на необходимите цитокини в онкологията.

Странични ефекти

Лечението с цитокини може да предизвика отрицателни ефекти в зависимост от морфологията на заболяването, общото състояние на пациента и комбинацията от лекарства. В по -голямата си част страничните ефекти не представляват опасност за пациента, но показват реакция на тумора към лекарството. Когато се появят вторични реакции, курсът на терапията се спира или се коригира схемата на лечение. Възможни негативни прояви на тялото:

• повишаване на телесната температура с 2-3 градуса 4-6 часа след въвеждането на цитокини;
• болезненост и зачервяване на мястото на инжектиране;
• отравяне на тялото с продукти на туморен разпад (в случай на голямо образувание).

За кого методът на цитокинова терапия не е подходящ

Лекарствата на базата на цитокини практически нямат противопоказания и могат да се използват за всеки пациент. Както и при другите лекарства, има редица пациенти, които не се препоръчват да използват този метод на лечение. Не използвайте цитокинова терапия за бременни жени, по време на кърмене, при наличие на автоимунни заболявания, рядка лична алергия на организма към лекарства.

Цената на цитокиновата терапия

Ефективното използване на цитокинови лекарства се постига в специализирани центрове (например Центърът за онкоимунология и цитокинова терапия в Москва е най -добрата клиника според мнението на спасените пациенти). Цената на този вид лечение варира значително в зависимост от вида на използваното лекарство и конкретното заболяване. Приблизителни цени за някои цитокинови лекарства в Москва.

Тази глава ще разгледа интегриран подход за оценка на цитокиновата система, използвайки описаните по -рано съвременни методи за изследване.

Първо, очертаваме основните понятия за цитокиновата система.

Понастоящем цитокините се считат за молекули протеин-пептид, произвеждани от различни клетки на тялото и осъществяващи междуклетъчни и междусистемни взаимодействия. Цитокините са универсални регулатори на жизнения цикъл на клетките, те контролират процесите на диференциация, пролиферация, функционално активиране и апоптоза на последните.

Цитокините, произвеждани от клетките на имунната система, се наричат ​​имуноцитокини; те са клас разтворими пептидни медиатори на имунната система, необходими за нейното развитие, функциониране и взаимодействие с други системи на тялото (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Като регулаторни молекули, цитокините играят важна роля в реакциите на вродения и адаптивния имунитет, осигуряват тяхната взаимовръзка, контролират хематопоезата, възпалението, зарастването на рани, образуването на нови кръвоносни съдове (ангиогенеза) и много други жизненоважни процеси.

В момента има няколко различни класификации на цитокини, като се отчита тяхната структура, функционална активност, произход, тип цитокинови рецептори. Традиционно, в съответствие с биологичните ефекти, е обичайно да се разграничават следните групи цитокини.

1. Интерлейкини(IL-1-IL-33) са секреторни регулаторни протеини на имунната система, които осигуряват медиаторни взаимодействия в имунната система и нейната връзка с други системи на тялото. Интерлейкините се класифицират според тяхната функционална активност на про- и противовъзпалителни цитокини, лимфоцитни растежни фактори, регулаторни цитокини и др.

3. Фактори на туморна некроза (TNF)- цитокини с цитотоксични и регулаторни действия: TNFa и лимфотоксини (LT).

4. Фактори на растеж на хематопоетични клетки-растежен фактор на стволови клетки (Kit-лиганд), IL-3, IL-7, IL-11, еритропоетин, тробопоетин, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор-GM-CSF, гранулоцитен CSF-G-CSF, макрофаг-

ny KSF - M -KSF).

5. Хемокини- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - регулатори на хемотаксиса на различни видове клетки.

6. Нелимфоидни клетъчни растежни фактори- регулатори на растежа, диференциация и функционална активност на клетки от различни тъканни принадлежности (растежен фактор на фибробласти - FGF, растежен фактор на ендотелните клетки, епидермален растежен фактор - EGF на епидермиса) и трансформиращи растежни фактори (TGFβ, TGFα).

Наред с други, през последните години активно се изследва фактор, който инхибира миграцията на макрофаги (инхибиращ миграцията фактор - MIF), който се счита за неврохормон с цитокин и ензимна активност (Суслов А.П., 2003; Ковалчук ​​Л.В. и др. ,

Цитокините се различават по структура, биологична активност и други свойства. Въпреки това, наред с разликите, цитокините имат общи свойства,характерни за този клас биорегулаторни молекули.

1. Цитокините обикновено са гликозилирани полипептиди със средно молекулно тегло (по -малко от 30 kD).

2. Цитокините се произвеждат от клетки на имунната система и други клетки (например ендотел, фибробласти и др.) В отговор на активиращ стимул (свързани с патоген молекулярни структури, антигени, цитокини и т.н.) и участват в реакциите на вроден и адаптивен имунитет, регулиращ тяхната сила и продължителност. Някои цитокини се синтезират конститутивно.

3. Секрецията на цитокини е краткотраен процес. Цитокините не се съхраняват като предварително формирани молекули, а техните

синтезът винаги започва с генна транскрипция. Клетките произвеждат цитокини в ниски концентрации (пикограми на милилитър).

4. В повечето случаи цитокините се произвеждат и действат върху прицелните клетки в непосредствена близост (кратко действие). Основното място на цитокиновото действие е междуклетъчният синапс.

5. СъкращаванеСистемата на цитокините се проявява във факта, че всеки тип клетка е способна да произвежда няколко цитокини и всеки цитокин може да бъде секретиран от различни клетки.

6. Всички цитокини се характеризират с плейотропия,или полифункционалността на действието. По този начин проявата на признаци на възпаление се дължи на влиянието на IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Дублирането на функции гарантира надеждността на цитокиновата система.

7. Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира от силно специфични мембранни рецептори с висок афинитет, които са трансмембранни гликопротеини, обикновено състоящи се от повече от една субединица. Извънклетъчната част на рецепторите е отговорна за свързването на цитокини. Има рецептори, които елиминират излишните цитокини в патологичния фокус. Това са така наречените трап рецептори. Разтворимите рецептори са извънклетъчният домен на мембранния рецептор, разделени от ензим. Разтворимите рецептори са в състояние да неутрализират цитокините, да участват в транспортирането им до огнището на възпалението и в екскрецията им от тялото.

8. Цитокини работи на принципа на мрежа.Те могат да действат заедно. Много функции, първоначално приписвани на един цитокин, изглежда се медиират от съгласуваното действие на няколко цитокина. (синергиядействия). Примери за синергични взаимодействия на цитокини са стимулиране на възпалителни реакции (IL-1, IL-6 и TNF-a), както и синтез на IgE

(IL-4, IL-5 и IL-13).

Някои цитокини индуцират синтеза на други цитокини (каскада).Каскадното действие на цитокините е необходимо за развитието на възпалителни и имунни отговори. Способността на някои цитокини да засилват или отслабват производството на други определя важни положителни и отрицателни регулаторни механизми.

Антагонистичният ефект на цитокините е известен, например, производството на IL-6 в отговор на повишаване на концентрацията на TNFα може да бъде

отрицателен регулаторен механизъм за контролиране на производството на този медиатор по време на възпаление.

Цитокиновата регулация на целевите клетъчни функции се извършва с помощта на автокринни, паракринни или ендокринни механизми. Някои цитокини (IL-1, IL-6, TNFα и др.) Са в състояние да участват в изпълнението на всички горепосочени механизми.

Отговорът на клетката върху влиянието на цитокин зависи от няколко фактора:

От вида на клетките и тяхната начална функционална активност;

От локалната концентрация на цитокина;

От наличието на други молекули -медиатори.

По този начин продуцентските клетки, цитокините и техните специфични рецептори върху прицелните клетки образуват единна медиаторна мрежа. Това е набор от регулаторни пептиди, а не отделни цитокини, които определят крайния клетъчен отговор. Понастоящем цитокиновата система се разглежда като универсална система за регулиране на нивото на целия организъм, която осигурява развитието на защитни реакции (например по време на инфекция).

През последните години идеята за цитокинова система, която съчетава:

1) клетки продуценти;

2) разтворими цитокини и техните антагонисти;

3) клетки -мишени и техните рецептори (фиг. 7.1).

Нарушенията на различни компоненти на цитокиновата система водят до развитие на множество патологични процеси и затова идентифицирането на дефекти в тази регулаторна система е важно за правилната диагноза и назначаване на адекватна терапия.

Нека първо разгледаме основните компоненти на цитокиновата система.

Клетки, продуциращи цитокин

I. Основната група цитокини-продуциращи клетки в адаптивния имунен отговор са лимфоцитите. Покойните клетки не отделят цитокини. С разпознаване на антиген и с участието на рецепторни взаимодействия (CD28-CD80 / 86 за Т-лимфоцити и CD40-CD40L за В-лимфоцити), се случва клетъчно активиране, което води до транскрипция на цитокинови гени, транслация и секреция на гликозилирани пептиди в междуклетъчните пространство.

Ориз. 7.1.Цитокинова система

CD4 Т-помощниците са представени от субпопулации: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, които се различават по спектъра на секретираните цитокини в отговор на различни антигени.

Th0 произвеждат широк спектър от цитокини при много ниски концентрации.

Посока на диференциация Th0определя развитието на две форми на имунен отговор с преобладаване на хуморални или клетъчни механизми.

Естеството на антигена, неговата концентрация, локализацията в клетката, видът на антиген-представящите клетки и определен набор от цитокини регулират посоката на диференциация на Th0.

След улавяне и обработка на антиген, дендритните клетки представят антигенни пептиди на Th0 клетките и произвеждат цитокини, които регулират посоката на тяхната диференциация в ефекторни клетки. Ролята на отделните цитокини в този процес е показана на фиг. 7.2. IL-12 индуцира синтеза на IFNγ от Т-лимфоцити и] HGC. IFNu осигурява диференциация на Th1, които започват да отделят цитокини (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, лимфотоксини), които регулират развитието на реакции към вътреклетъчни патогени

(свръхчувствителност от забавен тип (ХЗТ) и различни видове клетъчна цитотоксичност).

IL-4 осигурява диференциация на Th0 в Th2. Активираният Th2 продуцира цитокини (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и др.), Които определят пролиферацията на В-лимфоцитите, тяхната по-нататъшна диференциация в плазмени клетки и развитието на реакции на антитела, главно към извънклетъчни патогени.

IFNu регулира отрицателно функцията на Th2 клетките и обратно, IL-4, IL-10, секретиран от Th2, инхибират Th1 функцията (Фиг. 7.3). Молекулярният механизъм на тази регулация е свързан с транскрипционни фактори. Експресията на T-bet и STAT4, определена от IFNy, насочва диференциацията на Т-клетките по пътя на Th1 и потиска развитието на Th2. IL-4 индуцира експресията на GATA-3 и STAT6, което съответно осигурява превръщането на наивен THO в Th2 клетки (Фиг. 7.2).

През последните години е описана специална субпопулация от Т-помощни клетки (Th17), продуцираща IL-17. Членовете на семейството на IL-17 могат да бъдат експресирани чрез активирани клетки с памет (CD4CD45RO), y5T клетки, NKT клетки, неутрофили, моноцити под въздействието на IL-23, IL-6, TGFβ, продуцирани от макрофаги и дендритни клетки. Основният диференциращ фактор при хората е ROR-C, при мишки-ROR-γ лПоказана е основната роля на IL-17 в развитието на хронично възпаление и автоимунна патология (виж фиг. 7.2).

В допълнение, Т-лимфоцитите в тимуса могат да се диференцират в естествени регулаторни клетки (Treg), експресиращи повърхностни маркери CD4 + CD25 + и транскрипционен фактор FOXP3. Тези клетки са в състояние да потиснат имунния отговор, медииран от Th1 и Th2 клетките чрез директен междуклетъчен контакт и синтеза на TGFβ и IL-10.

Схемите за диференциация за Th0 клонинги и цитокини, секретирани от тях, са показани на фиг. 7.2 и 7.3 (вижте също цветна вложка).

Т-цитотоксичните клетки (CD8 +), естествените клетки убийци са слаби продуценти на цитокини като интерферони, TNF-a и лимфотоксини.

Прекомерното активиране на една от Th субпопулациите може да определи развитието на един от вариантите на имунния отговор. Хроничният дисбаланс на активирането на Th може да доведе до образуване на имунопатологични състояния, свързани с проявата на

алергии, автоимунна патология, хронични възпалителни процеси и др.

Ориз. 7.2.Различни субпопулации на Т-лимфоцити, продуциращи цитокини

II. В вродената имунна система основните производители на цитокини са миелоидни клетки. С помощта на Toll-подобни рецептори (TLRs) те разпознават сходни молекулярни структури на различни патогени, така наречените молекулярни модели, свързани с патогени (RAMP), например липополизахарид (LPS) на грам-отрицателни бактерии, липотейхоеви киселини, пептидогликани на грам-положителни микроорганизми, флагелин, ДНК, богата на G повторения и др. В резултат на това

Това взаимодействие с TLR задейства каскада на вътреклетъчна трансдукция на сигнал, което води до експресия на гени на две основни групи цитокини: провъзпалителни и IFN тип 1 (фиг. 7.4, вижте също вмъкване на цвят). Най -вече тези цитокини (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, хемокини и др.) Индуцират развитието на възпаление и участват в защитата на организма от бактериални и вирусни инфекции.

Ориз. 7.3.Спектърът на цитокини, секретирани от TH1 и TH2 клетки

III. Клетките, които не принадлежат към имунната система (клетки от съединителна тъкан, епител, ендотел) конститутивно секретират автокринни растежни фактори (FGF, EGF, TGFR и др.). и цитокини, които поддържат пролиферацията на хематопоетични клетки.

Цитокини и техните антагонистиса описани подробно в редица монографии (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ориз. 7.4. TLR-медиирана индукция на производството на цитокини от вродени имунни клетки

Свръхекспресията на цитокини е опасна за организма и може да доведе до развитие на прекомерен възпалителен отговор, реакция на остра фаза. Различни инхибитори участват в регулирането на производството на провъзпалителни цитокини. Така са описани редица вещества, които неспецифично свързват цитокина IL-1 и предотвратяват проявата на неговото биологично действие (а2-макроглобулин, С3-компонент на комплемента, уромодулин). Специфичните инхибитори на IL-1 включват разтворими рецептори за примамки, антитела и IL-1 рецепторен антагонист (IL-1RA). С развитието на възпаление се наблюдава увеличаване на експресията на гена IL-1RA. Но дори нормално, този антагонист присъства в кръвта във високи концентрации (до 1 ng / ml или повече), блокирайки действието на ендогенния IL-1.

Целеви клетки

Действието на цитокините върху прицелните клетки се медиира чрез специфични рецептори, които свързват цитокините с много висок афинитет и отделните цитокини могат да използват

общи рецепторни субединици. Всеки цитокин се свързва със своя специфичен рецептор.

Цитокиновите рецептори са трансмембранни протеини и са разделени на 5 основни типа. Най-често срещаният е така нареченият хематопоетинов тип рецептор, който има два извънклетъчни домена, единият от които съдържа обща последователност от аминокиселинни остатъци от две повторения на триптофан и серин, разделени от всяка аминокиселина (WSXWS мотив). Вторият тип рецептор може да има два извънклетъчни домена с голям брой запазени цистеини. Това са рецептори от семейството на IL-10 и IFN. Третият тип е представен от цитокинови рецептори, принадлежащи към групата на TNF. Четвъртият тип цитокинови рецептори принадлежи към суперсемейството на имуноглобулинови рецептори с извънклетъчни домени, наподобяващи по структура домейните на имуноглобулиновите молекули. Петият тип рецептор, който свързва молекули от семейството на хемокините, е представен от трансмембранни протеини, които преминават през клетъчната мембрана на 7 места. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Цитокините са в състояние да повлияят на пролиферацията, диференциацията, функционалната активност и апоптозата на прицелните клетки (виж Фиг. 7.1). Проявлението на биологичната активност на цитокините в клетките -мишени зависи от участието на различни вътреклетъчни системи в предаването на сигнал от рецептора, което е свързано с характеристиките на клетките -мишени. Сигналът за апоптоза се осъществява, наред с други неща, с помощта на специфичен регион от семейството на рецепторите на TNF, така нареченият „смъртен“ домен (фиг. 7.5, вижте вмъкване на цвят). Диференциращите и активиращите сигнали се предават чрез вътреклетъчните протеини Jak -STAT - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция (фиг. 7.6, вижте вмъкване на цвят). G-протеините участват в сигнализирането от хемокини, което води до повишена миграция и клетъчна адхезия.

Цялостен анализ на цитокиновата система включва следното.

I. Оценка на клетки продуценти.

1. Определяне на изразяването:

Рецептори, които разпознават патоген или антиген TCR, TLR) на ниво гени и протеинови молекули (PCR, поточна цитометрия);

Адапторни молекули, които провеждат сигнал, който задейства транскрипцията на цитокинови гени (PCR и др.);

Ориз. 7.5.Предаване на сигнал от TNF рецептора

Ориз. 7.6. Jak -STAT - сигнален път от цитокинови рецептори тип 1

Цитокинови гени (PCR); протеинови молекули на цитокини (оценка на цитокиновата синтезираща функция на човешките мононуклеарни клетки).

2. Количествено определяне на субпопулации от клетки, съдържащи определени цитокини: Th1, Th2 Th17 (метод за вътреклетъчно оцветяване на цитокини); определяне на броя на клетките, секретиращи определени цитокини (метод ELISPOT, виж гл. 4).

II. Оценка на цитокини и техните антагонисти в биологични среди на тялото.

1. Тестване на биологичната активност на цитокините.

2. Количествено определяне на цитокини с помощта на ELISA.

3. Имунохистохимично оцветяване на цитокини в тъканите.

4. Определяне на съотношението на противоположните цитокини (про- и противовъзпалителни), цитокини и антагонисти на цитокиновите рецептори.

III. Оценка на целевите клетки.

1. Определяне на експресията на цитокинови рецептори на ниво гени и протеинови молекули (PCR, метод на поточна цитометрия).

2. Определяне на сигнални молекули във вътреклетъчното съдържание.

3. Определяне на функционалната активност на целевите клетки.

В момента са разработени множество методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация. Сред тях се отличават:

1) молекулярно -биологични методи;

2) методи за количествено определяне на цитокини с помощта на имуноанализ;

3) тестване на биологичната активност на цитокините;

4) вътреклетъчно оцветяване на цитокини;

5) метод ELISPOT, който позволява откриване на цитокини около една клетка, продуцираща цитокин;

6) имунофлуоресценция.

Ето кратко описание на тези методи.

Като се използва молекулярно -биологични методивъзможно е да се изследва експресията на гени на цитокини, техните рецептори, сигнални молекули, да се изследва полиморфизмът на тези гени. През последните години бяха проведени голям брой проучвания, които разкриха връзки между варианти на алели на гени на молекули на цитокиновата система и предразположение

към редица заболявания. Изследването на алелни варианти на цитокинови гени може да предостави информация за генетично програмираното производство на определен цитокин. Най-чувствителна е полимеразната верижна реакция в реално време-RT-PCR (виж глава 6). Метод на хибридизация на мястопозволява да се изясни тъканната и клетъчната локализация на експресията на цитокинови гени.

Количественото определяне на цитокини в биологични течности и в култури от мононуклеарни клетки от периферна кръв чрез ELISA може да се характеризира, както следва. Тъй като цитокините са местни медиатори, е по -подходящо да се измерват техните нива в съответните тъкани след извличане на тъканни протеини или в естествени течности, например при сълзи, промиване от кухини, урина, околоплодни води, цереброспинална течност и др. Нивата на цитокини в серума или други телесни течности отразяват настоящото състояние на имунната система, т.е. синтез на цитокини от клетки на тялото in vivo.

Определянето на нивата на производство на цитокини от мононуклеарни клетки от периферна кръв (МНК) показва функционалното състояние на клетките. Спонтанното производство на MNC цитокини в културата показва, че клетките вече са активирани in vivo.Индуцираният синтез на цитокини (от различни стимуланти, митогени) отразява потенциалната резервна способност на клетките да реагират на антигенен стимул (по -специално на действието на лекарства). Намаленото индуцирано производство на цитокини може да служи като един от признаците на състояние на имунодефицит. Цитокините не са специфични за определен антиген. Следователно специфична диагноза на инфекциозни, автоимунни и алергични заболявания чрез определяне на нивото на определени цитокини е невъзможна. В същото време оценката на нивата на цитокини позволява да се получат данни за тежестта на възпалителния процес, прехода му към системно ниво и прогноза, функционалната активност на клетките на имунната система, съотношението на Th1 и Th2 клетките, което е много важен при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси.

В биологичните среди цитокините могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи на имуноанализ,използване на поликлонални и моноклонални антитела (виж глава 4). ELISA ви позволява да разберете какви са точните концентрации на цитокини в био-

логични телесни течности. Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ на цитокини има редица предимства пред другите методи (висока чувствителност, специфичност, независимост от наличието на антагонисти, възможност за точно автоматизирано счетоводство, счетоводна стандартизация). Този метод обаче има и своите ограничения: ELISA не характеризира биологичната активност на цитокините, той може да даде фалшиви резултати поради кръстосано реагиращи епитопи.

Биологични тестовеосъществява се въз основа на познаване на основните свойства на цитокините, тяхното действие върху клетките -мишени. Изследването на биологичните ефекти на цитокините позволи разработването на четири вида цитокинови тестове:

1) чрез индуциране на пролиферация на целеви клетки;

2) чрез цитотоксичен ефект;

3) чрез индуциране на диференциация на предшественици на костен мозък;

4) за антивирусно действие.

IL-1 се определя от стимулиращия ефект върху пролиферацията на миши тимоцити, активирани от митоген инвитро; IL -2 - чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите; TNFa и лимфотоксините се тестват за цитотоксично действие върху миши фибробласти (L929). Колони-стимулиращите фактори се оценяват за тяхната способност да поддържат растежа на предшествениците на костния мозък под формата на колонии в агар. Антивирусната активност на IFN се открива чрез инхибиране на цитопатичното действие на вирусите в културата на човешки диплоидни фибробласти и туморната линия на фибробласти на мишки L-929.

Създадени са клетъчни линии, чийто растеж зависи от наличието на определени цитокини. Таблица 7.1 е списък на клетъчни линии, използвани за изследване на цитокини. Според способността да се индуцира пролиферацията на чувствителни целеви клетки, се провежда биотестване на IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 и др. Тези методи за изпитване обаче се извършват не са достатъчно чувствителни и информативни. Молекулите инхибитори и антагонисти могат да маскират биологичната активност на цитокините. Няколко цитокини проявяват обща биологична активност. Независимо от това, тези методи са идеални за тестване на специфичната активност на рекомбинантните цитокини.

Таблица 7.1.Клетъчни линии, използвани за тестване на биологичната активност на цитокините

Краят на масата. 7.1

Лаборатория 7-1

Определяне на биологичната активност на IL-1 чрез комитогенен ефект върху пролиферацията на миши тимоцити

Методът за биологично тестване на IL-1 се основава на способността на цитокин да стимулира пролиферацията на миши тимоцити.

IL-1 може да бъде определен в културата на моноцити, стимулирани с LPS, както и във всяка биологична течност на тялото.Необходимо е да се обърне внимание на редица подробности.

1. За тестване се използват тимоцити на C3H / HeJ мишки, стимулирани към пролиферация от митогени (конканавалин А - ConA и фитохемаглутинин - PHA). Тимоцитите C3H / HeJ не са избрани случайно: мишки от тази инбредна линия не реагират на LPS, който може да присъства в тествания материал и да причини производството на IL-1.

2. Тимоцитите реагират на IL-2 и митогени, следователно присъствието на IL-2 и митогени също трябва да се определи в препарати, тествани за IL-1.

Оперативна процедура

1. Вземете суспензия от тимоцити в концентрация 12 × 10 6 / ml среда RPMI 1640, съдържаща 10% серум от ембриони от крави и 2 -меркаптоетанол (5 × 10 -5 М).

2. Подгответе серия от последователни двукратни разреждания на експериментални (биологични телесни течности) и контролни проби. Като контроли се използват биологични течности, съдържащи IL-1, или проби, получени чрез инкубиране на моноядрени клетки без LPS и лабораторен стандартен препарат, съдържащ IL-1. В 96-ямкови плаки с кръгло дъно, 50 μl се прехвърлят от всяко разреждане в 6 ямки.

3. В три ямки от всяко разреждане се добавят 50 μl пречистен PHA (Wellcome), разтворен в пълна среда в концентрация 3 μg / ml, а в останалите 3 ямки - 50 μl среда.

4. Добавете 50 μl тимоцитна суспензия към всяка ямка и инкубирайте 48 часа при 37 ° С.

6. Преди края на култивирането, 50 μl разтвор (1 μCi / ml) от ["3Н] -тимидин се добавя към ямките и се инкубира за още 20 часа.

7. За да се определи нивото на радиоактивност, културните клетки се прехвърлят във филтърна хартия с помощта на автоматичен клетъчен комбайн, филтрите се изсушават и включването на етикета се определя чрез течен сцинтилационен брояч.

8. Резултатите се изразяват като стимулиращ фактор.

където m cp е средният брой импулси в 3 дупки.

Ако тимоцитите реагират на стимулация със стандартен IL-1, тогава индексът на стимулация на изпитваната проба над 3 надеждно показва активността на IL-1.

Биоанализът е единственият метод за оценка на цитокиновата функция, но този метод трябва да бъде допълнен от различни видове подходящ контрол за специфичност, използвайки моноклонални антитела. Добавянето на определени моноклонални антитела към цитокина в културата блокира биологичната активност на цитокина, което доказва, че откритият цитокин служи като сигнал за пролиферация на клетъчна линия.

Използването на биоанализ за откриване на интерферон.Принципът за оценка на биологичната активност на IFN се основава на неговия антивирусен ефект, който се определя от степента на инхибиране на размножаването на тествания вирус в клетъчната култура.

В тази работа могат да се използват клетки, чувствителни към действието на IFN: предимно трипсинизирани фибробластни клетки от пилешки и човешки ембриони, трансплантирани клетки от човешки диплоидни фибробласти и клетъчна култура на мишка (L929).

При оценката на антивирусния ефект на IFN е препоръчително да се използват вируси с кратък репродуктивен цикъл, висока чувствителност към действието на IFN: вирус на миши енцефаломиелит, миши везикуларен стоматит и др.

Лаборатория 7-2

Определяне на активността на интерферон

1. Суспензия от диплоидни фибробласти на човешки плод върху среда с 10% серум от говежди ембриони (клетъчна концентрация-15-20 × 10 6 / ml) се излива в стерилни 96-ямкови плочи с плоско дъно, 100 μl на ямка и се поставят в CO 2 инкубатор при температура 37 ° С.

2. След образуването на пълен монослой, растежната среда се отстранява от гнездата и към всяка ямка се добавят 100 ul подложка.

3. Титруването на активността на IFN в тестовите проби се извършва по метода на двукратни разреждания върху монослой от фибробласти.

Едновременно с пробите, вирусът на миши енцефаломиелит (VEM) се въвежда в ямките в доза, която причинява 100% клетъчно увреждане 48 часа след заразяването.

4. За контрол използвайте ямки с интактни (необработени) клетки, заразени с вируса.

Във всяко проучване референтните проби на IFN с известна активност се използват като референтни лекарства.

5. Плочите с разредени проби се инкубират за 24 часа при 37 ° С в атмосфера с 5% CO 2.

6. Нивото на активност на IFN се определя от реципрочното на максималното разреждане на изпитваната проба, което инхибира цитопатичния ефект на вируса с 50%и се изразява в единици активност на ml.

7. За да се определи вида на IFN, към системата се добавя антисерум срещу IFNα, IFNβ или IFNγ. Антисерумът отменя действието на съответния цитокин, което прави възможно идентифицирането на типа IFN.

Определяне на биологичната активност на миграцията на инхибиращия фактор.Понастоящем се формират напълно нови представи за природата и свойствата на МИТА, който е открит през 60 -те години на миналия век като посредник на клетъчния имунитет и дълги години остава без подобаващо внимание (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; David JR, 1966). Едва през последните 10-15 години стана ясно: МИТЪТ е един от най-важните биологични медиатори в организма с широк спектър от биологични функции на цитокин, хормон и ензим. Действието на MIF върху прицелните клетки се осъществява чрез CD74 - рецептора или чрез некласическия път на ендоцитоза.

МИТЪТ се счита за важен медиатор на възпалението, активиращ функцията на макрофагите (производство на цитокини, фагоцитоза, цитотоксичност и т.н.), както и ендогенен имунорегулаторен хормон, който модулира глюкокортикоидната активност.

Все повече информация се натрупва за ролята на MIF в патогенезата на много възпалителни заболявания, включително сепсис, ревматоиден артрит (RA), гломерулонефрит и др. При РА концентрацията на MIF в течността на засегнатите стави е значително увеличена, което корелира с тежестта на заболяването. Под влияние на МИТА се увеличава производството на провъзпалителни цитокини както от макрофагите, така и от синовиалните клетки.

Известни са различни методи за тестване на активността на MIF, когато мигриращите клетки (целеви клетки за MIF) се поставят в стъклена капиляра (капилярен тест), в капка агароза или в агарозна ямка.

Представяме сравнително прост метод за скрининг, основан на образуването на клетъчни микрокултури (левкоцити или макрофаги), стандартни по площ и брой клетки в дъното на ямките на плочка с 96-ямково плоско дъно, последвано от тяхното култивиране в хранителна среда и определяне на промяната в площта на тези микрокултури под действието на МИФ (Суслов А.П., 1989).

Лаборатория 7-3

Определение на МИТ дейност

Определянето на биологичната активност на MIF се извършва с помощта на устройство за образуване на клетъчни микрокултури (фиг. 7.7) - MIGROSKRIN (Изследователски институт по епидемиология и микробиология на името на NF Gamaleya RAMS).

1. В ямките на 96-ямкова плака (Flow, UK или подобна) добавете 100 μl от проба, разредена в културна среда, в която се определя МИТНАТА активност (всяко разреждане в 4 паралела, експериментални проби). Културната среда съдържа RPMI 1640, 2 тМ L-глутамин, 5% фетален говежди серум, 40 μg / ml гентамицин.

2. Добавете културална среда (в 4 паралела) към контролните ямки, по 100 µl всяка.

3. Пригответе клетъчна суспензия от перитонеални макрофаги, за които 2 хибридни мишки (CBAxC57B1 / 6) F1 се инжектират интраперитонеално с 10 ml разтвор на Ханкс с хепарин (10 U / ml), като масажирате леко корема за 2-3 минути. След това животното се избива чрез обезглавяване, коремната стена се пробива внимателно в областта на слабините и ексудатът се изсмуква през игла със спринцовка. Клетките на перитонеалния ексудат се промиват два пъти с разтвор на Ханкс, центрофугират се в продължение на 10-15 минути при 200 g. След това се приготвя клетъчна суспензия с концентрация 10 ± 1 млн. / Ml среда RPMI 1640. Преброяването се извършва в камера Горяев.

4. Сглобете системата MIGROSKRIN, която е стелаж за насочено и стандартно фиксиране на върховете с клетъчни култури в строго вертикално положение на определена височина над центъра на ямка на 96-ямкова културна плоча и включва също 92 накрайника за автоматична пипета от Costar, САЩ (фиг. 7.7).

Поставете краката на триножника в ъглови кладенци на плочата. Клетъчната суспензия се улавя с автоматична пипета на върхове - по 5 μl във всяка, изплаква се от излишните клетки чрез еднократно спускане в средата и се вкарва вертикално в гнездата на системната стойка. Напълненият багажник с накрайници се държи при стайна температура за 1 час върху строго хоризонтална повърхност. През това време клетките на суспензията се утаяват на дъното на ямките, където се образуват стандартни клетъчни микрокултури.

5. Поставката за върха се отстранява внимателно от плочата. Плоча с микрокултура от клетки се поставя в строго хоризонтално положение в CO 2 инкубатор, където се култивира в продължение на 20 ч. По време на култивирането клетките мигрират по дъното на ямката.

6. Количествено записване на резултатите след инкубация се извършва на бинокулярна лупа, визуално оценявайки размера на колонията по скалата вътре в окуляра. Микрокултурите са кръгли. След това изследователите определят средния диаметър на колонията от измерванията на колониите в 4 тестови или контролни ямки. Грешката при измерване е ± 1 mm.

Индексът на миграция (MI) се изчислява по формулата:

Пробата има MYTH-активност, ако стойностите на MI са равни

За конвенционална единица (U) на МИТОВА активност се взема реципрочната стойност, равна на стойността на най -голямото разреждане на пробата (проба), при която индексът на миграция е 0,6 ± 0,2.

Биологична активност на FEOα се оценява чрез неговото цитотоксично действие върху линията на трансформирани фибробласти L-929. Рекомбинантният TNFa се използва като положителна контрола, а клетките в културална среда се използват като отрицателна контрола.

Изчислете цитотоксичния индекс (CI):

където а- броя на живите клетки в контролата; б- броя на живите клетки в експеримента.

Ориз. 7.7.Схема MIGROSKRIN - Устройства за количествено определяне на миграцията на клетъчни култури

Клетките се оцветяват с багрило (метиленово синьо), което се включва само в мъртвите клетки.

Стойността на реципрочното разреждане на пробата, необходима за получаване на 50% клетъчна цитотоксичност, се приема като конвенционална единица за активност на TNF. Специфична активност на пробата - съотношението на активност в произволни единици на 1 ml към концентрацията на протеин, съдържащ се в пробата.

Оцветяване с вътреклетъчни цитокини.Промяната в съотношението на клетки, произвеждащи различни цитокини, може да отразява патогенезата на заболяването и да служи като критерий за прогнозата на заболяването и оценката на терапията.

По метода на вътреклетъчно оцветяване се определя експресията на цитокин на нивото на една клетка. Поточната цитометрия ви позволява да преброите броя на клетките, експресиращи определен цитокин.

Нека изброим основните стъпки при определянето на вътреклетъчните цитокини.

Нестимулираните клетки произвеждат малки количества цитокини, които по правило не се отлагат; следователно важен етап от оценката на вътреклетъчните цитокини е стимулирането на лимфоцитите и блокирането на освобождаването на тези продукти от клетките.

Най-често използваният индуктор на цитокини е активаторът на протеин киназа С форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) в комбинация с калциев йонофор йономицин (IN). Използването на такава комбинация предизвиква синтеза на широк спектър от цитокини: IFNu, IL-4, IL-2, TNFa. Недостатъкът на използването на PMA-IN е проблемът с откриването на CD4 молекули на повърхността на лимфоцитите след такова активиране. Също така, производството на цитокини от Т-лимфоцитите се индуцира от митогени (PHA). В клетките и моноцитите стимулират

Моноядрените клетки се инкубират в присъствието на индуктори на производството на цитокини и блокер на техния вътреклетъчен транспорт, брефелдин А или монензин, в продължение на 2-6 часа.

След това клетките се ресуспендират в буфериран физиологичен разтвор. За фиксиране се добавя 2% формалдехид, инкубирано за 10-15 минути при стайна температура.

След това клетките се третират със сапонин, който увеличава пропускливостта на клетъчната мембрана, и се оцветяват с моноклонални антитела, специфични за откритите цитокини. Предварителното оцветяване на повърхностни маркери (CD4, CD8) увеличава количеството информация, получена за клетката и ви позволява да определите по-точно нейната популационна идентичност.

Има някои ограничения при прилагането на описаните по -горе методи. Така че с тяхна помощ е невъзможно да се анализира синтеза на цитокини от една клетка, невъзможно е да се определи броя на цитокинопродуциращите клетки в подпопулация, невъзможно е да се определи дали цитокинопродуциращите клетки експресират уникални маркери, дали различни цитокини се синтезират от различни клетки или от едни и същи. Отговорът на тези въпроси се получава с помощта на други методи на изследване. За да се определи честотата на продуциращи цитокин клетки в популация, се използва методът за ограничаване на разрежданията и вариант на ELISPOT ензимно-свързан имуносорбентен анализ (вж. Глава 4).

Метод на хибридизация in situ.Методът включва:

2) фиксиране с параформалдехид;

3) откриване на иРНК с помощта на белязана сДНК. В някои случаи цитокиновата иРНК се определя на срезове с помощта на радиоизотопна PCR.

Имунофлуоресценция.Методът включва:

1) замразяване на органа и подготовка на секции от криостат;

2) фиксиране;

3) обработка на срезовете с анти-цитокинови антитела, маркирани с флуоресцеин;

4) визуално наблюдение на флуоресценцията.

Тези техники (хибридизация на мястои имунофлуоресценция) са бързи и не зависят от праговите концентрации на секретирания продукт. Те обаче не определят количествено количеството секретиран цитокин и могат да бъдат технически сложни. Необходимо е разнообразие от внимателно наблюдение за неспецифични реакции.

Използвайки представените методи за оценка на цитокините, бяха идентифицирани патологични процеси, свързани с нарушения в цитокиновата система на различни нива.

По този начин оценката на цитокиновата система е изключително важна за характеризиране на състоянието на имунната система на организма. Изследването на различни нива на цитокиновата система дава информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, за тежестта на възпалителния процес, за преминаването му към системно ниво и за прогнозата на заболяването.

Въпроси и задачи

1. Избройте общите свойства на цитокините.

2. Дайте класификация на цитокините.

3. Избройте основните компоненти на цитокиновата система.

4. Избройте клетките, продуциращи цитокин.

5. Опишете семействата на цитокинови рецептори.

6. Какви са механизмите на функциониране на цитокиновата мрежа?

7. Разкажете ни за производството на цитокини в вродената имунна система.

8. Какви са основните подходи за цялостна оценка на цитокиновата система?

9. Какви са методите за тестване на цитокини в телесните течности?

10. Какви са дефектите в цитокиновата система при различни патологии?

11. Какви са основните методи за биологично изпитване на IL-1, IFN, MIF, TNFa в биологични течности?

12. Опишете процеса на определяне на вътреклетъчното съдържание на цитокини.

13. Опишете процеса на определяне на цитокините, секретирани от една клетка.

14. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на нивото на цитокиновия рецептор.

15. Опишете последователността от методи, използвани за откриване на дефект на нивото на клетки, продуциращи цитокин.

16. Каква информация може да бъде получена чрез изследване на производството на цитокини в културата на моноядрени клетки, в кръвния серум?

Провъзпалителните цитокини се синтезират, секретират и действат чрез техните рецептори върху прицелните клетки в ранен стадий на възпаление, участвайки в задействането на специфичен имунен отговор, както и в неговата ефекторна фаза. По -долу предоставяме кратко описание на основните провъзпалителни цитокини.

IL-1 -съединение, секретирано по време на антигенна стимулация от моноцити, макрофаги, клетки на Лангерханс, дендритни клетки, кератиноцити, церебрални астроцити и микроглии, ендотелни, епителни, мезотелиални клетки, фибробласти, NK-лимфоцити, неутрофили, В-клетъчни лимфоцити, С клетки и др. Приблизително 10% от базофилите и мастоцитите също произвеждат IL-1. Тези факти показват, че IL-1 може да се секретира директно в кръвта, тъканната течност и лимфата. Всички клетки, в които се образува този цитокин, са неспособни за спонтанен синтез на IL-1 и реагират с неговото производство и секреция в отговор на действието на инфекциозни и възпалителни агенти, микробни токсини, различни цитокини, активни комплементни фрагменти, някои активни фактори на кръвосъсирването , и други. В образния израз на А. Белау, IL-1 е семейство молекули за всички случаи. IL -1 е разделен на 2 фракции - a и b, които са продукти на различни гени, но имат сходни биологични свойства. И двете форми се образуват от съответните молекули предшественици със същото молекулно тегло - 31 kDa. В резултат на биохимични трансформации в крайна сметка се образуват едноверижни биологично активни полипептиди с молекулно тегло 17,5 kDa. Почти целият IL-1a остава вътре в клетката или се свързва с мембраната. За разлика от IL-1a, IL-1b се секретира активно от клетките и е основната секреторна форма на IL-1 при хората. В същото време и двата интерлевкина имат същия спектър на биологична активност и се конкурират за свързване към един и същ рецептор. Трябва обаче да се има предвид, че IL-1a е предимно медиатор на локалните защитни реакции, докато IL-1b действа както на локално, така и на системно ниво. Експериментите с рекомбинантен IL-1 показват, че този цитокин има най-малко 50 различни функции, а мишените са клетки на почти всички органи и тъкани. Ефектът на IL-1 е насочен главно към Th1, въпреки че е в състояние да стимулира Th2 и В-лимфоцитите. В костния мозък под негово влияние се увеличава броят на хематопоетичните клетки, които са в етап на митоза. IL-1 може да действа върху неутрофилите, като повишава тяхната двигателна активност и по този начин насърчава фагоцитозата. Този цитокин участва в регулирането на функциите на ендотела и системата за коагулация на кръвта, предизвиквайки прокоагулантна активност, синтеза на провъзпалителни цитокини и експресията на повърхността на ендотела на адхезивни молекули, които осигуряват търкаляне и прикрепване на неутрофили и лимфоцити, в резултат на което в съдовото легло се развиват левкопения и неутропения. Действайки върху чернодробните клетки, той стимулира образуването на протеини в остра фаза. Установено е, че IL-1 е основният медиатор за развитието на локално възпаление и остра фазова реакция на нивото на тялото. Освен това ускорява растежа на кръвоносните съдове след увреждане. Под влияние на IL-1 в кръвта концентрацията на желязо и цинк намалява и екскрецията на натрий се увеличава. И накрая, наскоро беше установено, че IL-1 е способен да увеличи количеството на циркулиращия азотен оксид. Последното е известно, че играе изключително важна роля в регулирането на кръвното налягане, насърчава дезагрегацията на тромбоцитите и подобрява фибринолизата. Трябва да се отбележи, че под въздействието на IL-1 се засилва образуването на розетки от неутрофили и лимфоцити с тромбоцити, което играе важна роля за осъществяването на неспецифична резистентност, имунитет и хемостаза (Ю. А. Витковски). Всичко това предполага, че IL-1 стимулира развитието на цял комплекс от защитни реакции на тялото, насочени към ограничаване на разпространението на инфекцията, премахване на нахлуващите микроорганизми и възстановяване целостта на увредените тъкани. IL-1 засяга хондроцитите, остеокластите, фибробластите и В-клетките на панкреаса. Под негово влияние се увеличава секрецията на инсулин, ACTH и кортизол. Добавянето на IL-1b или TNFa към първичната култура на клетките на хипофизата намалява секрецията на тироид-стимулиращ хормон.

IL-1 се произвежда в централната нервна система, където може да действа като предавател. Под влияние на IL-1 настъпва сън, придружен от наличието на а-ритъм (сън с бавни вълни). Той също така насърчава синтеза и секрецията на нервен растежен фактор от астроцитите. Доказано е, че съдържанието на IL-1 се увеличава с мускулната работа. Под влияние на IL-1, производството на самия IL-1, както и IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 и TNFa, се засилва. Последното, в допълнение, индуцира синтеза на IL-1, IL-6 и IL-8.

Много провъзпалителни ефекти на IL-1 се осъществяват в комбинация с TNFa и IL-6: индуциране на треска, анорексия, влияние върху хематопоезата, участие в неспецифична антиинфекциозна защита, секреция на протеини от остра фаза и други (AS Simbirtsev ).

IL-6- мономер с молекулно тегло 19-34 kDa. Той се произвежда от стимулирани моноцити, макрофаги, ендотелиоцити, Th2, фибробласти, хепатоцити, клетки на Sertoli, клетки на нервната система, тироцити, клетки на островчетата на Лангерханс и др. Заедно с IL-4 и IL-10, той осигурява растеж и диференциация на В-лимфоцити, улеснявайки прехода на последните в антитела. В допълнение, той, подобно на IL-1, стимулира хепатоцитите, което води до образуването на протеини в остра фаза. IL-6 действа върху хематопоетични клетки-предшественици и по-специално стимулира мегакариоцитопоезата. Това съединение има антивирусно действие. Има цитокини, принадлежащи към семейството на IL-6-онкостатин М (OnM), фактор, който инхибира левкемията, цилиарен невротропен фактор, кардиотропин-1. Тяхното влияние не засяга имунната система. Семейството IL-6 има ефект върху ембрионалните стволови клетки, причинява миокардна хипертрофия, синтез на CWA, поддържане на пролиферацията на миеломни клетки и хематопоетични предшественици, диференциация на макрофаги, остеокласти, нервни клетки, повишена тромбоцитопоеза и др.

Трябва да се отбележи, че мишките с целенасочено инактивиране (нокаут) на гена, кодиращ общ рецепторен компонент за цитокините от семейството на IL-6, развиват множество аномалии в различни телесни системи, които са несъвместими с живота. Заедно с нарушаването на кардиогенезата в ембрионите на такива мишки се наблюдава рязко намаляване на броя на предшествениците на клетки от различни кръвотворни редици, както и рязко намаляване на размера на тимуса. Тези факти показват изключителното значение на IL-6 за регулирането на физиологичните функции (А. А. Ярилин).

Съществува много сложна взаиморегулираща връзка между провъзпалителни цитокини, които действат като синергисти. По този начин, IL-6 инхибира производството на IL-1 и TNFa, въпреки че и двата цитокина са индуктори на синтеза на IL-6. В допълнение, IL-6, действащ върху хипоталамо-хипофизната система, води до увеличаване на производството на кортизол, който инхибира експресията на IL-6 гена, както и гени на други провъзпалителни цитокини.

Семейството IL-6 включва също онкостатин М (OnM),притежава изключително широк спектър на действие. Молекулното му тегло е 28 kDa. Установено е, че OnM е в състояние да инхибира растежа на редица тумори. Той стимулира образуването на IL-6, активатор на плазминоген, вазоактивни чревни пептиди и CWA. От горното следва, че OnM трябва да играе важна роля в регулирането на имунния отговор, коагулацията на кръвта и фибринолизата.

IL-8принадлежи към т. нар. семейство хемокини, които стимулират хемотаксиса и хемокинезата и наброяват до 60 отделни вещества със собствени структурни и биологични свойства. Зрелият IL-8 съществува в няколко форми, различаващи се по дължината на полипептидната верига. Образуването на една или друга форма зависи от специфични протеази, действащи върху N-края на негликозилираната молекула прекурсор. В зависимост от това кои клетки синтезират IL-8, той съдържа различен брой аминокиселини. Най-голяма биологична активност има формата на IL-8, състояща се от 72 аминокиселини (А. С. Симбирцев).

IL-8 се освобождава от полиморфонуклеарни левкоцити, моноцити, макрофаги, мегакариоцити, неутрофили, Т-лимфоцити (Тх), фибробласти, хондроцити, кератиноцити, ендотелни и епителни клетки, хепатоцити и микроглии.

Производството на IL-8 се извършва в отговор на действието на биологично активни съединения, включително провъзпалителни цитокини, както и IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, различни митогени, липополизахариди, лектини и продукти на вирусен разпад, докато противовъзпалителните цитокини (IL-4, IL-10) намаляват производството на IL-8. Неговото активиране и освобождаване също се случва под въздействието на тромбин, активатор на плазминоген, стрептокиназа и трипсин, което показва тясна връзка между функцията на този цитокин и хемостатичната система.

Синтезът на IL-8 се осъществява върху действието на различни ендогенни или екзогенни стимули, които възникват във фокуса на възпалението по време на развитието на локална защитна реакция при въвеждането на патогенен агент. В това отношение производството на IL-8 има много сходства с други провъзпалителни цитокини. В същото време синтезът на IL-8 се потиска от стероидни хормони, IL-4, IL-10, Ifa и Ifg.

IL-8 стимулира хемотаксиса и хемокинезата на неутрофили, базофили, Т-лимфоцити (в по-малка степен) и кератиноцити, причинявайки дегранулация на тези клетки. При интраваскуларно инжектиране на IL-8 се наблюдава бърза и остра гранулоцитопения, последвана от повишаване на нивото на неутрофилите в периферната кръв. В този случай неутрофилите мигрират към черния дроб, далака, белите дробове, но не и към увредените тъкани. Освен това експериментът показа, че интравенозното приложение на IL-8 блокира миграцията на неутрофили във вътрекожните области на възпаление.

При нестимулирани неутрофили IL-8 причинява освобождаването на протеин, свързан с витамин В 12 от специфични гранули и желатиназа от секреторните везикули. Дегранулацията на азурофилни гранули в неутрофилите настъпва само след тяхното стимулиране с цитохалазин-В. Едновременно с това се отделят еластаза, миелопероксидаза, b-глюкоронидаза и други еластази и настъпва експресията на адхезивни молекули върху левкоцитната мембрана, осигурявайки взаимодействието на неутрофила с ендотела. Трябва да се отбележи, че IL-8 не е в състояние да предизвика дихателен взрив, но може да засили ефекта на други хемокини върху този процес.

IL-8 е в състояние да стимулира ангиогенезата чрез активиране на пролиферативни процеси в ендотелиоцитите и гладкомускулните клетки, което играе важна роля в възстановяването на тъканите. В допълнение, той може да инхибира IL-4-индуцирания синтез на IgE.

Очевидно IL-8 играе важна роля в местния имунитет на лигавиците. При здрави хора се открива в секретите на слюнчените, слъзните, потните жлези, в коластрата. Установено е, че гладкомускулните клетки в трахеята на човека са способни да произвеждат незначителни количества IL-8. Под влияние на брадикинин производството на IL-8 се увеличава 50 пъти. Блокерите на протеиновия синтез инхибират синтеза на IL-8. Има всички основания да се смята, че локално IL-8 осигурява хода на защитни реакции, когато е изложен на патогенна флора в горните дихателни пътища.

IL-12открит преди повече от десет години, но свойствата му са проучени едва през последните години. Произвежда се от макрофаги, моноцити, неутрофили, дендритни клетки и активирани В-лимфоцити. В много по-малка степен IL-12 е способен да секретира кератиноцити, клетки на Лангерханс и В покой В-лимфоцити. В допълнение, той се произвежда от микроглиални клетки и астроцити, което изисква тяхното сътрудничество. IL-12 е хетеродимер, състоящ се от две ковалентно свързани полипептидни вериги: тежка (45 kDa) и лека (35 kDa). Биологичната активност е присъща само на димера; всяка от отделните вериги не притежава подобни свойства.

Независимо от това, NK, Т-лимфоцитите (CD4 + и CD8 +) и в по-малка степен В-лимфоцитите остават основните прицелни клетки за IL-12. Може да се счита, че служи като връзка между макрофаги и моноцити, допринасяйки за увеличаване на активността на Th1 и цитотоксичните клетки. По този начин този цитокин има значителен принос за осигуряването на антивирусна и антитуморна защита. Индукторите на синтеза на IL-12 са микробни компоненти и провъзпалителни цитокини.

IL-12 принадлежи към хепарин-свързващи цитокини, което предполага участието му в процеса на хемостаза.

През последните години беше показано, че IL-12 е ключов цитокин за повишаване на клетъчно-медиирания имунен отговор и ефективна антиинфекциозна защита срещу вируси, бактерии, гъбички и протозои. Защитните ефекти на IL-12 при инфекции се медиират от Ifg-зависими механизми, засилено производство на азотен оксид и Т-клетъчна инфилтрация. Основният му ефект обаче е да синтезира Ifg. Последният, докато се натрупва в организма, насърчава синтеза на IL-12 от макрофагите. Най-важната функция на IL-12 е посоката на диференциация на Tx0 към Tx1. В този процес IL-12 е синергист за Ifg. Междувременно, след диференциация, Th1 престава да се нуждае от IL-12 като съвместно стимулираща молекула. Характерът на имунния отговор до голяма степен зависи от IL-12: дали той ще се развие според клетъчния или хуморалния имунитет.

Една от най-важните функции на IL-12 е рязкото увеличаване на диференциацията на В-лимфоцитите в клетки, произвеждащи антитела. Този цитокин се използва за лечение на пациенти с алергии и бронхиална астма.

IL-12 има инхибиращ ефект върху производството на IL-4 от Т-лимфоцитите на паметта, медииран чрез APC. На свой ред IL-4 потиска производството и секрецията на IL-12.

Синергистите на IL-12 са IL-2 и IL-7, въпреки че и двата цитокина често действат върху различни целеви клетки. Физиологичният антагонист и инхибитор на IL-12 е IL-10, типичен противовъзпалителен цитокин, който инхибира функцията Th1.

IL-16- секретира се от Т-лимфоцити, стимулирани главно от CD4 +, CD8 +, еозинофили и епителни клетки на бронхите. Повишена секреция на IL-16 е установена, когато Т клетките са третирани с хистамин. По химическа природа той е хомотетрамер с молекулно тегло 56000-80000 D. Той е имуномодулиращ и провъзпалителен цитокин, тъй като е хемотаксичен фактор за моноцити и еозинофили, както и Т-лимфоцити (CD4 +), повишаване на адхезията им.

Трябва да се отбележи, че предварителната обработка на CD4 + с рекомбинантен IL-16 потиска активността на HIV-1 промотора с приблизително 60%. Въз основа на горните факти е изложена хипотеза, според която ефектът на IL-16 върху репликацията на HIV-1 се наблюдава на ниво вирусна експресия.

IL-17образувани от макрофаги. В момента е получен рекомбинантен IL-17 и са проучени неговите свойства. Оказа се, че под въздействието на IL-17 човешките макрофаги интензивно синтезират и секретират провъзпалителни цитокини-IL-1b и TNFa, което е правопропорционално на дозата на изследвания цитокин. Максималният ефект се наблюдава приблизително 9 часа след началото на инкубацията на макрофаги с рекомбинантен IL-17. В допълнение, IL-17 стимулира синтеза и освобождаването на IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1 антагонист и стромализин. Противовъзпалителните цитокини-IL-4 и IL-10-напълно анулират индуцираното от IL-17 освобождаване на IL-1b, докато GTFb 2 и IL-13 блокират само частично този ефект. IL-10 потиска индуцираното освобождаване на TNFa, докато IL-4, IL-13 и GTFb 2 потискат секрецията на този цитокин в по-малка степен. Представените факти категорично предполагат, че IL-17 трябва да играе важна роля в инициирането и поддържането на възпалителния процес.

IL-18по отношение на биологичните ефекти, той е функционален удвоител и синергист на IL-12. Основните продуценти на IL-18 са макрофаги и моноцити. Структурата му е изключително подобна на IL-1. IL-18 се синтезира под формата на неактивна молекула-предшественик, което изисква участието на IL-1b-конвертиращ ензим, за да го превърне в активна форма.

Под въздействието на IL-18 антимикробната резистентност на организма се увеличава. При бактериална инфекция IL-18 заедно с IL-12 или Ifa / b регулира производството на Ifg от Tx и NK клетки и засилва експресията на Fas лиганд върху NK и Т лимфоцитите. Наскоро беше установено, че IL-18 е CTL активатор. Под негово влияние се увеличава активността на CD8 + клетки по отношение на клетките на злокачествени тумори.

Подобно на IL-12, IL-18 насърчава преференциалната диференциация на Th0 в Th1. В допълнение, IL-18 води до образуването на GM-CSF и по този начин засилва левкопоезата и инхибира образуването на остеокласти.

IL-23се състои от 2 субединици (р19 и р40), които са част от IL-12. Отделно всяка от изброените субединици няма биологична активност, но заедно те, подобно на IL-12, повишават пролиферативната активност на Т-лимфобластите и секрецията на Ifg. IL-23 е по-малко мощен от IL-12.

TNFе полипептид с молекулно тегло около 17 kDa (състои се от 157 аминокиселини) и е разделен на 2 фракции - а и b. И двете фракции имат приблизително еднакви биологични свойства и действат върху едни и същи клетъчни рецептори. TNFa се секретира от моноцити и макрофаги, Th1, ендотелни и гладкомускулни клетки, кератиноцити, NK лимфоцити, неутрофили, астроцити, остеобласти и др. В по -малка степен TNFa се произвежда от някои туморни клетки. Основният индуктор на синтеза на TNFa е бактериален липополизахарид, както и други компоненти от бактериален произход. В допълнение, синтезът и секрецията на TNFa се стимулират от цитокини: IL-1, IL-2, Ifa и b, GM-CSF и др. Вирус на Epstein-Barr, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb и др.

Основната проява на биологичната активност на TNFa е ефектът върху някои туморни клетки. В този случай TNFa води до развитие на хеморагична некроза и тромбоза на захранващите кръвоносни съдове. В същото време, под въздействието на TNFa, естествената цитотоксичност на моноцитите, макрофагите и NK клетките се увеличава. Регресията на туморните клетки протича особено интензивно с комбинираното действие на TNFa и Ifg.

Под влияние на TNFa се инхибира синтеза на липопротеин киназа, един от основните ензими, които регулират липогенезата.

TNFa, като медиатор на цитотоксичността, е в състояние да инхибира клетъчната пролиферация, диференциация и функционална активност на много клетки.

TNFa участва директно в имунния отговор. Той играе изключително важна роля в ранните моменти от началото на възпалителната реакция, тъй като активира ендотела и насърчава експресията на адхезивни молекули, което води до адхезия на гранулоцитите към вътрешната повърхност на съда. Под въздействието на TNFa възниква трансендотелиална миграция на левкоцити към възпалителния фокус. Този цитокин активира гранулоцити, моноцити и лимфоцити и индуцира производството на други провъзпалителни цитокини-IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, които са синергисти на TNFa.

Образуван локално, TNFa във фокуса на възпаление или инфекциозен процес рязко увеличава фагоцитната активност на моноцитите и неутрофилите и, засилвайки процесите на пероксидиране, допринася за развитието на пълна фагоцитоза. Заедно с IL-2, TNFa значително увеличава производството на Ifg от Т лимфоцити.

TNFa също участва в процесите на разрушаване и възстановяване, тъй като причинява растежа на фибробласти и стимулира ангиогенезата.

През последните години беше установено, че TNF е важен регулатор на хематопоезата. Директно или заедно с други цитокини, TNF засяга всички видове хемопоетични клетки.

Под негово влияние се засилва функцията на системата хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза, както и някои жлези с вътрешна секреция-щитовидната жлеза, тестисите, яйчниците, панкреаса и други (А. Ф. Возянов).

Интерферонисе образуват от почти всички клетки на човешкото тяло, но производството им се осъществява главно от клетки на кръвта и костния мозък. Синтезът на интерферони протича под въздействието на антигенна стимулация, въпреки че много малка концентрация на тези съединения може да се открие нормално в костния мозък, бронхите, различни органи на стомашно -чревния тракт, кожата и други. Нивото на синтез на интерферон винаги е по-високо в неделящите се клетки, отколкото в бързо делящите се клетки.

Въведение.

1. Обща характеристика и класификация на цитокините.

1.1 Механизми на действие.

1.2 Свойства на цитокините.

1.3 Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на организма.

2. Специални изследвания на цитокини.

2.1 Ролята на цитокините в патогенезата на възпалителни заболявания на дебелото черво при деца.

2.2 Ролята на азотен оксид и цитокини в развитието на синдром на остро белодробно увреждане.

3. Методи за определяне на цитокини

3.1 Определяне на биологичната активност на цитокините

3.2 Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела

3.3 Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

3.3.1 Фактор на туморна некроза-алфа.

3.3.2 Гама интерферон.

3.3.3 Интерлевкин-4

3.3.4 Интерлевкин-8

3.3.5 Антагонист на рецептора на интерлевкин-1.

3.3.6 Алфа-интерферон.

3.3.7 Антитела към алфа-IFN.

4. Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Списък на използваната литература.

Заключение.

Въведение.

Не е минало много време от описанието на първите цитокини. Изследванията им обаче доведоха до разпределението на обширен раздел от знания - цитокинология, която е неразделна част от различни области на знанието и на първо място имунология, която даде мощен тласък за изучаването на тези медиатори. Цитокинологията прониква във всички клинични дисциплини, от етиологията и патогенезата на заболяванията до превенцията и лечението на различни патологични състояния. Следователно, научните изследователи и клиницистите трябва да се ориентират в разнообразието от регулаторни молекули и да имат ясно разбиране за ролята на всеки от цитокините в изследваните процеси. Всички клетки на имунната система имат определени функции и работят в ясно координирано взаимодействие, което се осигурява от специални биологично активни вещества - цитокини - регулатори на имунните реакции. Цитокините са специфични протеини, с помощта на които различни клетки на имунната система могат да обменят информация помежду си и да координират действията. Наборът и количеството цитокини, действащи върху рецепторите на клетъчната повърхност - "цитокиновата среда" - представляват матрица от взаимодействащи и често променящи се сигнали. Тези сигнали са сложни поради голямото разнообразие от цитокинови рецептори и поради факта, че всеки от цитокините може да активира или потисне няколко процеса, включително собствения си синтез и синтеза на други цитокини, както и образуването и появата на цитокинови рецептори върху клетъчната повърхност. Целта на нашата работа е да проучим цитакините, техните функции и свойства, както и възможното им приложение в медицината. Цитокините са малки протеини (с молекулно тегло от 8 до 80 kDa), които действат автокринно (т.е. върху клетката, която ги произвежда) или паракринни (върху клетки, разположени наблизо). Образуването и освобождаването на тези високо активни молекули е краткотрайно и строго регулирано.

Литературен преглед.

Обща характеристика и класификация на цитокините.

Цитокините са група полипептидни медиатори на междуклетъчно взаимодействие, които участват главно във формирането и регулирането на защитните реакции на организма по време на въвеждането на патогени и нарушаване на целостта на тъканите, както и в регулирането на редица нормални физиологични функции. Цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима регулаторна система, която съществува заедно с нервната и ендокринната система за поддържане на хомеостазата, и трите системи са тясно взаимосвързани и взаимозависими. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. Понастоящем са известни повече от 200 отделни вещества, принадлежащи към семейството на цитокините. Историята на изследването на цитокините започва през 40 -те години на 20 век. Тогава бяха описани първите ефекти на кахектин, фактор, присъстващ в кръвния серум и способен да причини кахексия или загуба на тегло. Впоследствие този медиатор се изолира и се доказва, че е идентичен с фактора на туморна некроза (TNF). По това време изследването на цитокините се извършва на принципа на откриване на всеки един биологичен ефект, който служи като отправна точка за името на съответния медиатор. Така че през 50 -те години интерферонът (IFN) е бил извикан поради способността му да повлиява или да повишава резистентността по време на повтаряща се вирусна инфекция. Интерлевкин-1 (IL-1) също първоначално се нарича ендогенен пироген, за разлика от бактериалните липополизахариди, които се считат за екзогенни пирогени. Следващият етап от изследването на цитокините, датиращ от 60-70 години, е свързан с пречистването на естествените молекули и цялостна характеристика на тяхното биологично действие. По това време принадлежи откриването на растежния фактор на Т-клетките, сега известен като IL-2, и редица други молекули, които стимулират растежа и функционалната активност на Т-, В-лимфоцити и други видове левкоцити. През 1979 г. терминът "интерлевкини" е предложен за тяхното обозначаване и систематизиране, тоест медиатори, които комуникират между левкоцитите. Много скоро обаче стана ясно, че биологичните ефекти на цитокините се простират далеч отвъд имунната система и затова предложеният по -рано термин „цитокини“, който е оцелял и до днес, стана по -приемлив. Революционен обрат в изследването на цитокините се случи в началото на 80 -те години след клонирането на гени на миши и човешки интерферон и производството на рекомбинантни молекули, които напълно повтаряха биологичните свойства на естествените цитокини. След това беше възможно да се клонират гени на други медиатори от това семейство. Важен етап в историята на цитокините е клиничната употреба на рекомбинантни интерферони и особено рекомбинантни IL-2 за лечение на рак. 90 -те години са белязани с откриването на субединичната структура на цитокиновите рецептори и формирането на концепцията за „цитокинова мрежа“, а началото на XXI век - откриването на много нови цитокини чрез генетичен анализ. Цитокините включват интерферони, колониестимулиращи фактори (CSF), хемокини, които трансформират растежни фактори; фактор на туморна некроза; интерлевкини с установени исторически серийни номера и някои други ендогенни медиатори. Интерлейкините със серийни номера, започващи от 1, не принадлежат към една и съща подгрупа цитокини, свързани с общи функции. Те от своя страна могат да бъдат разделени на провъзпалителни цитокини, фактори на растеж и диференциация на лимфоцитите и отделни регулаторни цитокини. Името "интерлевкин" се приписва на новооткрит медиатор, ако са изпълнени следните критерии, разработени от комитета по номенклатурата на Международния съюз на имунологичните общества: молекулно клониране и експресия на гена на изследвания фактор, наличието на уникален нуклеотид и съответната аминокиселинна последователност, получавайки неутрализиращи моноклонални антитела. Освен това новата молекула трябва да се произвежда от клетки на имунната система (лимфоцити, моноцити или други видове левкоцити), да има важна биологична функция в регулирането на имунния отговор, както и допълнителни функции, поради което тя не може да получи функционално име. И накрая, изброените свойства на новия интерлевкин трябва да бъдат публикувани в рецензирано научно списание. Класификацията на цитокините може да се извърши според техните биохимични и биологични свойства, както и от видовете рецептори, чрез които цитокините изпълняват своите биологични функции. Класификацията на цитокините по структура (Таблица 1) взема предвид не само аминокиселинната последователност, но преди всичко третичната структура на протеина, която по -точно отразява еволюционния произход на молекулите.

Таблица 1. Класификация на цитокините по структура.

Клонирането на гени и анализът на структурата на цитокиновите рецептори показаха, че точно както самите цитокини, тези молекули могат да бъдат разделени на няколко типа според сходството на аминокиселинните последователности и особеностите на организацията на извънклетъчните домейни (Таблица 2). Едно от най -големите семейства цитокинови рецептори се нарича семейство рецептори на хематопоетин или семейство цитокинови рецептори тип I. Структурна характеристика на тази група рецептори е наличието в молекулата на 4 цистеини и аминокиселинната последователност Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), разположена на кратко разстояние от клетъчната мембрана. Рецепторите на цитокин от клас II взаимодействат с интерферони и IL-10. И двата вида рецептори имат хомология помежду си. Следните групи рецептори медиират взаимодействието с цитокини от фамилията на туморната некроза и семейството на IL-1. Понастоящем е известно, че повече от 20 различни хемокинови рецептори взаимодействат с различна степен на афинитет с един или повече лиганди от семейството на хемокините. Хемокиновите рецептори принадлежат към суперсемейството на родопсиновите рецептори, имат 7 трансмембранни домена и провеждат сигнал с участието на G-протеини.

Таблица 2. Класификация на цитокиновите рецептори.

Много цитокинови рецептори са съставени от 2-3 субединици, кодирани от различни гени и експресирани независимо. В този случай образуването на рецептор с висок афинитет изисква едновременното взаимодействие на всички субединици. Пример за такава организация на цитокиновите рецептори е структурата на IL-2 рецепторния комплекс. Изненадващо беше откриването на факта, че отделните субединици на рецепторния комплекс на IL-2 са общи за IL-2 и някои други цитокини. По този начин, β-веригата е едновременно компонент на рецептора за IL-15, а γ-веригата служи като обща субединица на рецепторите за IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 и IL-21. Това означава, че всички гореспоменати цитокини, рецепторите на които също се състоят от 2-3 отделни полипептида, използват γ-веригата като компонент на техните рецептори, освен това компонент, отговорен за трансдукцията на сигнала. Във всички случаи специфичността на взаимодействието за всеки цитокин се осигурява от други субединици, които се различават по структура. Сред цитокиновите рецептори има още 2 общи рецепторни субединици, които провеждат сигнал след взаимодействие с различни цитокини. Това е обща рецепторна субединица βc (gp140) за IL-3, IL-5 и GM-CSF рецептори, както и рецепторната субединица gp130, която е обща за членовете на семейството на IL-6. Наличието на обща сигнализираща субединица в цитокиновите рецептори служи като един от подходите за тяхната класификация, тъй като позволява да се намери общност както в структурата на лигандите, така и в биологичните ефекти.

Таблица 3 показва комбинираната структурна и функционална класификация, където всички цитокини са разделени на групи, като се отчита преди всичко тяхната биологична активност, както и горните структурни характеристики на цитокиновите молекули и техните рецептори.

Таблица 3. Структурна и функционална класификация на цитокините.

	Семейства на цитокини	Подгрупи и лиганди	Основни биологични функции
	Интерферони тип I	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Антивирусна активност, антипролиферативно, имуномодулиращо действие
	Фактори на растеж на хематопоетични клетки	Фактор на стволови клетки (комплект-лиганд, стоманен фактор), Flt-3 лиганд, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 лиганди: IL-3, IL-5, GM-KSF	Стимулиране на пролиферацията и диференциация на различни видове прогениторни клетки в костния мозък, активиране на хематопоезата Еритропоетин, тромбопоетин
	Свръхсемейството на интерлевкин-1 и FRF	Семейство FRF: Кисело FRF, основно FRF, FRF3 - FRF23 Семейство IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, антагонист на рецептора на IL-1, IL-18, IL-33 и др.	Активиране на пролиферацията на фибробласти и епителни клетки Провъзпалително действие, активиране на специфичен имунитет
	Фамилия на фактор на туморна некроза	TNF, лимфотоксини α и β, Fas лиганд и др.	Провъзпалително действие, регулиране на апоптозата и междуклетъчното взаимодействие на имунокомпетентни клетки
	Семейство Interleukin-6	Gp130 лиганди: IL-6, IL-11, IL-31, онкостатин-М, кардиотропин-1, инхибиращ левкемичен фактор, цилиарен невротрофичен фактор	Провъзпалителни и имунорегулаторни ефекти
	Хемокини	SS, SHS (IL-8), SH3S, S	Регулиране на хемотаксиса на различни видове левкоцити
	Семейство Интерлевкин-10	IL-10,19,20,22,24,26	Имуносупресивно действие
	Семейство Interleukin-12		Регулиране на диференциацията на помощни Т-лимфоцити
	Цитокини на Т-хелперни клонове и регулаторни функции на лимфоцитите	Т-помощници тип 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg Т-помощници тип 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Γ-верижни лиганди на IL-2 рецептора: IL-7 TSLP	Активиране на клетъчния имунитет Активиране на хуморален имунитет, имуномодулиращ ефект Стимулиране на диференциацията, пролиферацията и функционалните свойства на различни видове лимфоцити, DC, NK клетки, макрофаги и др.
	Семейство Interleukin 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Активиране на синтеза на провъзпалителни цитокини
	Свръхсемейство на нервен растежен фактор, тромбоцитен растежен фактор и трансформиращи растежни фактори	Семейство на нервни растежни фактори: NGF, мозъчен невротрофичен фактор Тромбоцитни растежни фактори (PDGF), ангиогенни растежни фактори (VEGF) TRF семейство: TPPb, активини, инхибини, Nodal, Костни морфогенни протеини, Мюлерово инхибиращо вещество	Регулиране на възпалението, ангиогенезата, невронната функция, ембрионалното развитие и регенерацията на тъканите
	Семейство на епидермален растежен фактор	ERF, TRFα и др.
	Семейство на инсулиноподобни растежни фактори	IRF-I, IRF-II	Стимулиране на пролиферацията на различни типове клетки

Първата група включва интерферони тип I и е най -простата в организацията, тъй като всички молекули, включени в нея, имат подобна структура и в много отношения същите функции, свързани с антивирусната защита. Втората група включва фактори на растеж и диференциация на хематопоетични клетки, стимулиращи развитието на хематопоетични клетки -предшественици, започвайки от стволовите клетки. Тази група включва цитокини, които са тясно специфични за отделните линии на диференциация на хематопоетични клетки (еритропоетин, тромбопоетин и IL-7, който действа върху прекурсорите на туберкулозните лимфоцити), както и цитокини с по-широк спектър на биологична активност, като напр. IL-3, IL-11, колони-стимулиращи фактори. В рамките на тази група цитокини, лигандите gp140, които имат обща рецепторна субединица, както и тромбопоетин и еритропоетин са изолирани поради сходството на структурната организация на молекулите. Цитокините от суперсемействата FGF и IL-1 имат висока степен на хомология и подобна структура на протеини, което потвърждава общия произход. Независимо от това, по отношение на проявите на биологична активност, FGF се различава в много отношения от агонистите на семейство IL-1. Семейството на молекули IL-1 в момента, в допълнение към функционалните имена, има обозначенията F1-F11, където F1 съответства на IL-1α, F2 на IL-1β, F3 на рецепторния антагонист на IL-1, F4 към IL- 18. Останалите членове на семейството са открити в резултат на генетичен анализ и имат доста висока хомология с молекулите на IL-1, но биологичните им функции не са напълно изяснени. Допълнителни групи цитокини включват семействата IL-6 (лиганди на общата рецепторна субединица gp130), фактор на туморна некроза и хемокини, които са представени с най-голям брой индивидуални лиганди и са изброени изцяло в съответните глави. Фамилията на тумор некротичен фактор се формира главно въз основа на сходства в структурата на лигандите и техните рецептори, състоящи се от три нековалентно свързани еднакви субединици, които образуват биологично активни молекули. В същото време, по отношение на биологичните свойства, това семейство включва цитокини с доста различни активности. Например, TNF е един от най -ярките провъзпалителни цитокини, Fas лигандът индуцира апоптоза на прицелните клетки, а лигандът CD40 осигурява стимулиращ сигнал по време на междуклетъчното взаимодействие на Т и В лимфоцити. Подобни различия в биологичната активност на структурно сходни молекули се определят преди всичко от особеностите на експресията и структурата на техните рецептори, например наличието или отсъствието на вътреклетъчен „смъртен“ домен, който определя клетъчната апоптоза. Семействата IL-10 и IL-12 през последните години също са попълнени с нови членове, които са получили серийни номера на интерлевкини. Следва много сложна група цитокини, които са медиатори на функционалната активност на Т-хелперните лимфоцити. Включването в тази група се основава на два основни принципа: 1) принадлежащи към цитокините, синтезирани от Th1 или Th2, което определя развитието на предимно хуморален или клетъчен тип имунологични реакции, 2) наличието на обща рецепторна субединица - гама веригата на IL-2 рецепторния комплекс. Сред лигандите на гама веригата беше допълнително изолиран IL-4, който също има общи рецепторни субединици с IL-13, което до голяма степен определя частично припокриващата се биологична активност на тези цитокини. IL-7, който има обща структура на рецептори с TSLP, се изолира по подобен начин. Предимствата на горната класификация са свързани с едновременното разглеждане на биологичните и биохимичните свойства на цитокините. Възможността на този подход в момента се потвърждава от откриването на нови цитокини чрез генетичен анализ на генома и търсене на структурно сходни гени. Благодарение на този метод семейството на интерферони от тип I, IL-1, IL-10, IL-12, се разшири значително, появи се ново семейство цитокини аналози на IL-17, което вече се състои от 6 члена. Очевидно в близко бъдеще появата на нови цитокини ще се случи много по -бавно, тъй като анализът на човешкия геном е почти завършен. Промените са най-вероятно възможни поради изясняване на вариантите на лиганд-рецепторните взаимодействия и биологичните свойства, което ще позволи класификацията на цитокините да придобие окончателна форма.

Механизми на действие.

Б. Рецептори на цитокини. Цитокините са хидрофилни сигнални вещества, чието действие се медиира от специфични рецептори от външната страна на плазмената мембрана. Свързването на цитокини към рецептора (1) води до редица междинни етапи (2-5) до активиране на транскрипцията на определени гени (6). Самите цитокинови рецептори не притежават активност на тирозин киназата (с няколко изключения). След свързване с цитокин (1), рецепторните молекули се свързват, за да образуват хомодимери. В допълнение, те могат да образуват хетеродимери чрез свързване с протеини за пренос на сигнал [STPs] или да стимулират димеризацията на самите BPSs (2). Рецепторите на цитокин от клас I могат да се агрегират с три типа BPS: протеини GP130, βc или γc. Тези спомагателни протеини сами по себе си не са в състояние да свързват цитокини, но те осъществяват трансдукция на сигнал към тирозин кинази (3.) Същите спектри на биологична активност на много цитокини се обясняват с факта, че различни цитокин-рецепторни комплекси могат да активират един и същ BPS.

Като пример за трансдукция на сигнал от цитокини, диаграмата показва как IL-6 (IL-6) рецепторът, след свързване с лиганда (1), стимулира димеризацията на GP130 (2). Димер на мембранния протеин GP130 се свързва и активира цитоплазмената тирозин киназа от семейство YK (кинази на Янус с две активни места) (3). Янус кинази фосфорилират цитокинови рецептори, BPS и различни цитоплазмени протеини, които осъществяват допълнителна трансдукция на сигнала; те също фосфорилират транскрипционни фактори - сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция [PSAT (STAT, от английски сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция)]. Тези протеини принадлежат към семейството на BPS, които имат SH3 домейн в структурата си, който разпознава фосфотирозинови остатъци (виж стр. 372). Следователно те имат свойството да се свързват с фосфорилиран цитокинов рецептор. Ако след това настъпи фосфорилиране на PSAT молекулата (4), факторът се трансформира в активна форма и образува димер (5). След транслокация в ядрото, димерът, като транскрипционен фактор, се свързва с промотора (виж стр. 240) на инициирания ген и индуцира неговата транскрипция (6.) Някои цитокинови рецептори могат да загубят извънклетъчния лиганд-свързващ домен поради протеолиза (не е показано на диаграмата). Домейнът навлиза в кръвта, където се конкурира за свързване с цитокин, което намалява концентрацията на цитокини в кръвта.Заедно цитокините образуват регулаторна мрежа (цитокинова каскада) с мултифункционален ефект. Припокриването между цитокините води до факта, че се наблюдава синергизъм при действието на много от тях, а някои цитокини са антагонисти. Цялата цитокинова каскада със сложна обратна връзка често може да се наблюдава в тялото.

Свойства на цитокините.

Общи свойства на цитокините, поради които тези медиатори могат да бъдат комбинирани в независима регулаторна система.

1. Цитокините са полипептиди или протеини, често гликозилирани, повечето от тях имат MW от 5 до 50 kDa. Биологично активните молекули на цитокините могат да се състоят от една, две, три или повече еднакви или различни субединици.

2. Цитокините нямат антигенна специфичност на биологичното действие. Те влияят върху функционалната активност на клетките, участващи в реакциите на вродения и придобития имунитет. Независимо от това, действайки върху Т- и В-лимфоцитите, цитокините са в състояние да стимулират антиген-индуцирани процеси в имунната система.

3. Има три варианта на експресия на цитокинови гени: а) специфична за етапа експресия на определени етапи от ембрионалното развитие, б) конститутивна експресия за регулиране на редица нормални физиологични функции, в) индуцируем тип експресия, характерен за повечето цитокини. Всъщност повечето цитокини извън възпалителния отговор и имунния отговор не се синтезират от клетки. Експресията на цитокинови гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Свързаните с патогени молекулни структури са сред най-мощните индуктори на синтеза на провъзпалителни цитокини. За да се задейства синтеза на Т-клетъчни цитокини, е необходимо активиране на клетките от специфичен антиген с участието на Т-клетъчен антигенен рецептор.

4. Цитокините се синтезират в отговор на стимулация за кратък период от време. Синтезът се прекратява поради различни авторегулаторни механизми, включително повишена нестабилност на РНК, и поради наличието на отрицателни обратни връзки, медиирани от простагландини, кортикостероидни хормони и други фактори.

5. Един и същ цитокин може да се произвежда от различни типове телесни клетки в различни органи по отношение на хистогенетичния произход.

6. Цитокините могат да бъдат свързани с мембраните на клетките, които ги синтезират, притежавайки под формата на мембрана пълен спектър от биологична активност и проявяващи тяхното биологично действие по време на междуклетъчния контакт.

7. Биологичните ефекти на цитокините се медиират чрез специфични клетъчни рецепторни комплекси, които свързват цитокини с много висок афинитет, а отделните цитокини могат да използват общи рецепторни субединици. Цитокиновите рецептори могат да съществуват в разтворима форма, запазвайки способността да свързват лиганди.

8. Цитокините имат плейотропно биологично действие. Същият цитокин може да действа върху много видове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на целевите клетки (фиг. 1). Плейотропното действие на цитокините се осигурява чрез експресията на цитокинови рецептори върху клетъчни типове с различен произход и функции и проводимост на сигнала, използвайки няколко различни вътреклетъчни пратеника и транскрипционни фактори.

9. Цитокините се характеризират с взаимозаменяемост на биологичното действие. Няколко различни цитокини могат да причинят един и същ биологичен ефект или да имат сходни активности. Цитокините индуцират или потискат синтеза на себе си, други цитокини и техните рецептори.

10. В отговор на активиращия сигнал, клетките едновременно синтезират няколко цитокини, участващи в образуването на цитокиновата мрежа. Биологичните ефекти в тъканите и на нивото на тялото зависят от наличието и концентрацията на други цитокини със синергични, адитивни или противоположни ефекти.

11. Цитокините могат да повлияят на пролиферацията, диференциацията и функционалната активност на целевите клетки.

12. Цитокините действат върху клетките по различни начини: автокринни - върху клетката, синтезираща и секретираща този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката продуцент, например, във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринни - отдалечено до клетките на всякакви органи и тъкани след навлизане в кръвообращението. Във втория случай действието на цитокините прилича на това на хормоните (фиг. 2).

Ориз. 1. Същият цитокин може да се произвежда от различни типове клетки в тялото в различни органи с хистогенетичен произход и да действа върху много видове клетки, причинявайки различни ефекти в зависимост от вида на целевите клетки.

Ориз. 2. Три варианта на проявление на биологичното действие на цитокините.

Очевидно образуването на цитокиновата регулаторна система еволюционно е станало заедно с развитието на многоклетъчните организми и се дължи на необходимостта от образуването на медиатори на междуклетъчното взаимодействие, което може да включва хормони, невропептиди, адхезионни молекули и някои други. В това отношение цитокините са най -гъвкавата регулаторна система, тъй като те са в състояние да проявяват биологична активност както отдалечено след секрецията от продуциращата клетка (локално и системно), така и по време на междуклетъчния контакт, като са биологично активни под формата на мембранна форма. По този начин цитокиновата система се различава от адхезионните молекули, които изпълняват по -тесни функции само когато клетките са в пряк контакт. В същото време цитокиновата система се различава от хормоните, които се синтезират главно от специализирани органи и действат след навлизане в кръвоносната система.

Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на организма.

Ролята на цитокините в регулирането на физиологичните функции на тялото може да бъде разделена на 4 основни компонента:

1. Регулиране на ембриогенезата, създаване и развитие на органи, вкл. органи на имунната система.

2. Регулиране на определени нормални физиологични функции.

3. Регулиране на защитните реакции на организма на локално и системно ниво.

4. Регулиране на процесите на регенерация на тъканите.

Експресията на гени на отделни цитокини се случва специфично на етапа на определени етапи от ембрионалното развитие. Факторът на стволови клетки, трансформиращи растежни фактори, цитокини от семейството на TNF и хемокини регулират диференциацията и миграцията на различни клетки и установяването на органи на имунната система. След това синтезът на някои цитокини може да не се възобнови, докато други продължават да регулират нормалните физиологични процеси или участват в развитието на защитни реакции.

Въпреки факта, че повечето цитокини са типични индуцируеми медиатори и в постнаталния период не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор, някои цитокини не попадат под това правило. В резултат на конститутивна експресия на гени, някои от тях постоянно се синтезират и в достатъчно големи количества са в циркулация, регулирайки пролиферацията и диференциацията на определени типове клетки през целия живот. Примери за този тип физиологична регулация на функциите от цитокини могат да бъдат постоянно високо ниво на еритропоетин и някои CSF, за да се осигури хематопоеза. Регулирането на защитните реакции на организма чрез цитокини се случва не само в рамките на имунната система, но и чрез организиране на защитни реакции на нивото на целия организъм чрез регулиране на почти всички аспекти от развитието на възпалението и имунния отговор. Тази функция, най -важна за цялата цитокинова система, е свързана с две основни направления на биологичното действие на цитокините - защита срещу инфекциозни агенти и възстановяване на увредените тъкани. Цитокините регулират предимно развитието на локални защитни реакции в тъканите с участието на различни видове кръвни клетки, ендотел, съединителна тъкан и епител. Защитата на местно ниво се развива чрез формиране на типична възпалителна реакция с нейните класически прояви: хиперемия, развитие на оток, поява на болка и дисфункция. Синтезът на цитокини започва, когато патогените навлизат в тъканите или се нарушава тяхната цялост, което обикновено протича паралелно. Производството на цитокини е неразделна част от клетъчния отговор, свързан с разпознаването от клетките на миеломоноцитната серия на подобни структурни компоненти на различни патогени, наречени молекулярни модели, свързани с патогени. Примери за такива патогенни структури са липополизахариди на грам-отрицателни бактерии, пептидогликани на грам-положителни микроорганизми, флагелин или ДНК, богата на CpolyG последователности, което е типично за ДНК на всички видове бактерии. Левкоцитите експресират съответните рецептори за разпознаване на образи, наричани още Toll-подобни рецептори (TLR) и специфични за определени структурни модели на микроорганизми. След взаимодействието на микроорганизми или техните компоненти с TLR се задейства каскада на вътреклетъчна трансдукция на сигнал, водеща до повишаване на функционалната активност на левкоцитите и експресията на цитокинови гени.

TLR активирането води до синтеза на две основни групи цитокини: провъзпалителни цитокини и интерферони тип I, главно IFNα / β. Развитие на възпалителна реакция и осигуряване на вентилаторно разширяване на активирането на различни видове клетки, участващи в поддържането и регулиране на възпалението, включително всички видове левкоцити, дендритни клетки, Т и В-лимфоцити, NK клетки, ендотелни и епителни клетки, фибробласти и др. Това осигурява последователни етапи в развитието на възпалителния отговор, който е основният механизъм за прилагане на вродения имунитет. В допълнение, дендритните клетки започват да синтезират цитокини от семейството на IL-12, стимулирайки диференциацията на помощните Т-лимфоцити, което служи като своеобразен мост към началото на развитието на специфични имунни реакции, свързани с разпознаването на специфични антигенни структури на микроорганизми.

Вторият не по -малко важен механизъм, свързан със синтеза на IFN, осигурява прилагането на антивирусна защита. Интерфероните тип I проявяват 4 основни биологични свойства:

1. Директно антивирусно действие чрез блокиране на транскрипцията.

2. Потискане на клетъчната пролиферация, необходимо за блокиране на разпространението на вируса.

3. Активиране на функциите на NK клетки, които имат способността да лизират инфектирани с вирус клетки на тялото.

4. Повишена експресия на молекули на комплекс от хистосъвместимост от клас I, необходими за повишаване на ефективността на представяне на вирусни антигени от инфектирани клетки в цитотоксични Т-лимфоцити. Това води до активиране на специфично разпознаване на инфектирани с вирус клетки от Т-лимфоцити-първият етап на лизис на инфектирани с вирус целеви клетки.

В резултат на това в допълнение към директното антивирусно действие се активират механизмите както на вродения (NK клетки), така и на придобития (Т-лимфоцитите) имунитет. Това е пример за това как една малка цитокинова молекула с ММ 10 пъти по -малка от ММ на молекулите на антителата е способна да активира напълно различни механизми на защитни реакции поради плейотропния тип биологично действие, насочено към изпълнение на една цел - премахване на вируса, който има влезе в тялото.

На тъканно ниво цитокините са отговорни за развитието на възпаление и след това за регенерация на тъканите. С развитието на системен възпалителен отговор (остра фазова реакция) цитокините засягат почти всички органи и системи на тялото, участващи в регулирането на хомеостазата. Действието на провъзпалителни цитокини върху централната нервна система води до намаляване на апетита и промяна в целия комплекс от поведенчески реакции. Временното спиране на търсенето на храна и намаляване на сексуалната активност е от полза от гледна точка на спестяване на енергия само за една задача - борба с нахлуващия патоген. Този сигнал се осигурява от цитокини, тъй като навлизането им в циркулацията със сигурност означава, че локалната защита не се е справила с патогена и е необходимо активиране на системен възпалителен отговор. Едно от първите прояви на системна възпалителна реакция, свързана с действието на цитокините върху терморегулаторния център на хипоталамуса, е повишаване на телесната температура. Повишаването на температурата е ефективна защитна реакция, тъй като при повишени температури способността на редица бактерии да се размножават намалява, а напротив, пролиферацията на лимфоцитите се увеличава.

В черния дроб под въздействието на цитокини се увеличава синтезът на протеини в остра фаза и компоненти на комплементната система, необходими за борба с патогена, но в същото време синтезът на албумин намалява. Друг пример за селективното действие на цитокините е промяната в йонния състав на кръвната плазма по време на развитието на системна възпалителна реакция. В същото време се наблюдава намаляване на нивото на железни йони, но увеличаване на нивото на цинкови йони и е добре известно, че лишаването на бактериална клетка от железни йони означава намаляване на нейния пролиферативен потенциал (действието на лактоферина е въз основа на това). От друга страна, повишаването на нивото на цинк е необходимо за нормалното функциониране на имунната система, по -специално е необходимо за образуването на биологично активен серумен фактор на тимуса - един от основните тимусни хормони, които осигуряват диференциация на лимфоцити Ефектът на цитокините върху хематопоетичната система е свързан със значително активиране на хематопоезата. Увеличаването на броя на левкоцитите е необходимо, за да се попълни загубата и да се увеличи броят на клетките, главно неутрофилни гранулоцити, във фокуса на гнойното възпаление. Действието върху системата за кръвосъсирване е насочено към повишаване на коагулацията, което е необходимо за спиране на кървенето и директно блокиране на патогена.

По този начин, с развитието на системно възпаление, цитокините проявяват огромен спектър от биологични активности и пречат на работата на почти всички системи на тялото. Въпреки това, нито една от настъпващите промени не е случайна: всички те са или необходими за директно активиране на защитните реакции, или са полезни по отношение на превключването на енергийните потоци само за една задача - за борба с нахлуващия патоген. Под формата на регулиране на експресията на отделни гени, хормонални промени и промени в поведенческите реакции, цитокините осигуряват активирането и максималната ефективност на работата на онези телесни системи, които са необходими в даден момент за развитието на защитни реакции. На нивото на целия организъм цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за включването им в организирането и регулирането на една единствена защитна реакция. Цитокините са именно организиращата система, която формира и регулира целия комплекс от защитни реакции на организма по време на въвеждането на патогени. Очевидно такава регулаторна система се е формирала еволюционно и носи безусловни ползи за най -оптималната защитна реакция на макроорганизма. Следователно очевидно е невъзможно да се ограничи концепцията за защитни реакции само до участието на неспецифични механизми на резистентност и специфичен имунен отговор. Цялото тяло и всички системи, които на пръв поглед не са свързани с поддържането на имунитета, участват в една единствена защитна реакция.

Специални изследвания на цитокини.

Значението на цитокините в патогенезата на възпалителни заболявания на дебелото черво при деца.

S.V. Белмер, А.С. Симбирцев, О. В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлова. Руският държавен медицински университет, Държавният изследователски център по колопроктология, Москва и Държавният изследователски институт по високо чисти биологични вещества, Санкт Петербург, работят за изследване на значението на цитокините в патогенезата на възпалителни заболявания на дебелото черво при деца. Хроничните възпалителни заболявания на стомашно -чревния тракт в момента заемат едно от водещите места в патологията на храносмилателната система при децата. Особено значение се придава на възпалителните заболявания на дебелото черво (IBD), честотата на които постоянно нараства в целия свят. Дълъг курс с чести, а в някои случаи и фатални рецидиви, развитие на локални и системни усложнения - всичко това води до задълбочено проучване на патогенезата на заболяването в търсене на нови подходи към лечението на IBD. През последните десетилетия честотата на улцерозен колит (UC) е 510 случая годишно на 100 хиляди население, като болестта на Crohn (CD) е 16 случая годишно на 100 хиляди население. Степента на разпространение в Русия, в Московския регион съответства на средните европейски данни, но значително по -ниска, отколкото в скандинавските страни, Америка, Израел и Англия. За NUC разпространението е 19,3 на 100 хиляди, честотата е 1,2 на 100 хиляди души годишно. За CD разпространението е 3,0 на 100 хиляди, честотата е 0,2 на 100 хиляди души годишно. Фактът, че най -високата честота е отбелязана във високо развитите страни, се дължи не само на социални и икономически фактори, но и на генетични и имунологични характеристики на пациентите, които определят предразположеността към IBD. Тези фактори са основни в имунопатогенетичната теория за произхода на IBD. Вирусните и / или бактериалните теории обясняват само острото начало на заболяването, а хронизирането на процеса се дължи както на генетично предразположение, така и на характеристиките на имунния отговор, които също са генетично обусловени. Трябва да се отбележи, че понастоящем IBTC е класифициран като заболяване с генетично хетерогенна комплексна предразположеност. Идентифицирани са повече от 15 предполагаеми кандидат -гени от 2 групи (имуноспецифични и имунорегулаторни), причиняващи наследствена предразположеност. Най -вероятно предразположението се определя от няколко гена, които определят естеството на имунологичните и възпалителни реакции. Въз основа на резултатите от многобройни проучвания може да се заключи, че най -вероятната локализация на гените, свързани с развитието на IBT, са хромозоми 3, 7, 12 и 16. В момента много внимание се обръща на изучаването на особеностите на функцията на Т и В лимфоцитите, както и на цитокините медиатори на възпалението. Ролята на интерлевкини (IL), интерферони (IFN), фактор на туморна некроза-a (TNF-a), макрофаги и автоантитела към протеините на лигавицата на дебелото черво и към автомикрофлората се изследва активно. Характеристиките на техните нарушения при CD и UC бяха разкрити, но все още не е ясно дали тези промени се случват основно или вторично. За да се разберат много аспекти на патогенезата, проучванията, проведени в предклиничния стадий на IBD, както и при роднини от първа степен, биха били много важни. Сред медиаторите на възпалението специална роля принадлежат на цитокините, които са група полипептидни молекули с маса от 5 до 50 kDa, участващи във формирането и регулирането на защитните реакции на организма. На нивото на тялото цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за тяхното включване в организацията и регулирането на защитните реакции. Класификацията на цитокините е показана в Таблица 2. Повечето цитокини не се синтезират от клетки извън възпалителния отговор и имунния отговор. Експресията на цитокинови гени започва в отговор на проникването на патогени в тялото, антигенно дразнене или увреждане на тъканите. Един от най -мощните индуктори на синтеза на цитокини са компонентите на бактериалните клетъчни стени: LPS, пептидогликани и мурамилдипептиди. Продуцентите на провъзпалителни цитокини са предимно моноцити, макрофаги, Т-клетки и др. В зависимост от ефекта върху възпалителния процес цитокините се разделят на две групи: провъзпалителни (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g) и противовъзпалително (IL-4, IL-10, TGF-b). Интерлевкин-1 (IL-1) е имунорегулаторен медиатор, освободен по време на възпалителни реакции, увреждане на тъканите и инфекции (провъзпалителен цитокин). IL-1 играе важна роля в активирането на Т клетките, когато те взаимодействат с антиген. Има 2 вида IL-1: IL-1a и IL-1b, продукти от два различни генни локуса, разположени върху човешка хромозома 2. IL-1a остава вътре в клетката или може да бъде в мембранна форма и се появява в малки количества в извънклетъчното пространство. Ролята на мембранната форма на IL -1a е предаването на активиращи сигнали от макрофага към Т -лимфоцитите и други клетки по време на междуклетъчния контакт. IL-1a е основният посредник на къси разстояния. IL-1b, за разлика от IL-1a, се секретира активно от клетките, действайки както системно, така и локално. Днес е известно, че IL-1 е един от основните медиатори на възпалителни реакции, стимулира пролиферацията на Т-клетките, увеличава експресията на IL-2 рецептора върху Т-клетките и тяхното производство на IL-2. IL-2 заедно с антигена индуцира активирането и адхезията на неутрофилите, стимулира образуването на други цитокини (IL-2, IL-3, IL-6 и др.) От активирани Т-клетки и фибробласти, стимулира пролиферацията на фибробласти и ендотелни клетки. Системно IL-1 действа синергично с TNF-a и IL-6. С увеличаване на концентрацията в кръвта, IL-1 засяга клетките на хипоталамуса и причинява повишаване на телесната температура, треска, сънливост, намален апетит, а също така стимулира чернодробните клетки да произвеждат протеини от остра фаза (CRP, амилоид А, а-2 макроглобулин и фибриноген). IL4 (хромозома 5). Той инхибира активирането на макрофагите и блокира много от ефектите, стимулирани от IFNg, като производството на IL1, азотен оксид и простагландини, играе важна роля в противовъзпалителните реакции, има имуносупресивен ефект. IL6 (хромозома 7), един от основните провъзпалителни цитокини, е основният индуктор на крайния етап на диференциация на В клетки и макрофаги, мощен стимулатор на производството на протеини от остра фаза от чернодробните клетки. Една от основните функции на IL6 е да стимулира производството на антитела in vivo и in vitro. IL8 (хромозома 4). Отнася се за медиатори на хемокини, които причиняват насочена миграция (хемотаксис) на левкоцити към възпалителния фокус. Основната функция на IL10 е инхибирането на производството на цитокини от тип I Thelpers (TNFb, IFNg) и активирани макрофаги (TNF-a, IL1, IL12). Сега е признато, че видовете имунен отговор са свързани с един от вариантите на активиране на лимфоцитите с преобладаващото участие на клонингите на Т -лимфоцитните помощници от първия тип (TH2) или от втория тип (TH3). Продуктите TH2 и TH3 влияят отрицателно върху активирането на противоположни клонинги. Прекомерното активиране на който и да е от типовете Th клонинги може да насочи имунния отговор според една от възможностите за развитие. Хроничният дисбаланс в активирането на Th клоновете води до развитие на имунопатологични състояния. Промените в цитокините при IBTD могат да бъдат изследвани по различни начини с определяне на тяхното ниво в кръвта или in situ. Нивата на IL1 са повишени при всички възпалителни заболявания на червата. Разликите между NNC и CD са в повишената експресия на IL2. Ако в NUC се установи намалено или нормално ниво на IL2, тогава в CD се открива повишеното му ниво. Съдържанието на IL4 се увеличава в NUC, докато при CD то остава нормално или дори намалява. Нивото на IL6, което е медиатор на остра фаза, също се повишава при всички форми на възпаление. Получените данни относно профила на цитокините направиха възможно да се предположи, че двете основни форми на хроничен IBD се характеризират с различно активиране и експресия на цитокини. Резултатите от проучванията показват, че цитокиновият профил, наблюдаван при пациенти с UC, е по -съгласуван с профила на TH3, докато профилът на TH2 трябва да се счита за по -характерен за пациенти с CD. Привлекателността на тази хипотеза за ролята на профилите TH2 и TH3 е също така, че използването на цитокини може да промени имунния отговор в една или друга посока и да доведе до ремисия с възстановяване на цитокиновия баланс. Това може да бъде потвърдено по -специално чрез използването на IL10. По -нататъшни проучвания трябва да покажат дали цитокиновият отговор е вторичен феномен в отговор на стимулация или, напротив, експресията на съответните цитокини определя реактивността на организма с развитието на последващи клинични прояви. Проучването на нивото на цитокини при IBD при деца все още не е проведено. Тази работа е първата част от научно изследване, посветено на изследването на цитокиновия статус при IBD при деца. Целта на тази работа беше да се изследва хуморалната активност на макрофагите с определяне на нива (IL1a, IL8) в кръвта на деца с NUC и CD, както и тяхната динамика по време на терапията. От 2000 г. до 2002 г. в отделението по гастроентерология на Руската детска клинична болница са прегледани 34 деца с NUC и 19 деца с CD на възраст от 4 до 16 години. Диагнозата е потвърдена анамнестично, ендоскопски и морфологично. Изследването на нивата на провъзпалителни цитокини IL1a, IL8 се извършва по метода на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). За да определим концентрацията на IL1a, IL8, използвахме тестови системи, произведени от OOO Cytokin (Санкт Петербург, Русия). Анализът е извършен в лабораторията по имунофармакология на Държавния научен център на Научноизследователския институт за силно чисти биопрепарати (ръководител на лабораторията, д -р, проф. А. С. Симбирцев). Резултатите, получени в хода на изследването, показват значително повишаване на нивата на IL1a, IL8 през периода на обостряне, по -изразено при деца с NUC, отколкото при деца с CD. Без обостряне нивата на провъзпалителни цитокини намаляват, но не достигат нормата. При UC нивата на IL-1a, IL-8 са повишени в периода на обостряне съответно при 76,2% и при 90% от децата, а в периода на ремисия-съответно в 69,2% и 92,3%. При CD нивата на IL-1a, IL-8 се повишават в периода на обостряне при 73,3% и 86,6% от децата, а в периода на ремисия-съответно в 50% и 75%.

В зависимост от тежестта на заболяването децата са получавали терапия с аминосалицилати или глюкокортикоиди. Характерът на терапията влияе значително върху динамиката на нивото на цитокини. По време на терапията с аминосалицилати нивата на провъзпалителни цитокини в групата деца с NUC и CD са значително по -високи от тези в контролната група. В същото време се наблюдават по -високи проценти в групата деца с UC. В NUC на фона на аминосалицилатна терапия, IL1a, IL8 се увеличават съответно при 82.4% и 100% от децата, докато по време на глюкокортикоидната терапия при 60% от децата за двата цитокина. При CD, IL1a, IL8 са повишени по време на терапията с аминосалицилати при всички деца и по време на глюкокортикоидната терапия съответно при 55,5% и 77,7% от децата. По този начин резултатите от това изследване показват значително участие на макрофаговата връзка на имунната система в патогенетичния процес при повечето деца с UC и CD. Данните, получени в това проучване, не се различават коренно от данните, получени по време на прегледа на възрастни пациенти. Разликите в нивата на IL1a и IL8 при пациенти с UC и CD са количествени, но не качествени, което предполага неспецифичен характер на тези промени поради хода на хроничен възпалителен процес. Следователно тези показатели нямат диагностична стойност. Резултатите от динамично изследване на нивата на IL1a и IL8 доказват по -високата ефективност на терапията с глюкокортикоидни лекарства в сравнение с терапията с аминосалицили. Представените данни са резултат от първия етап от изследването на цитокиновия статус на деца с IBT. Необходимо е по-нататъшно проучване на проблема, като се вземат предвид показателите на други провъзпалителни и противовъзпалителни цитокини.

Ролята на азотен оксид и цитокини в развитието на синдром на остро белодробно увреждане.

Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л. Г. Сухотеплая изучават този проблем: Катедра по анестезиология и реаниматология, Владивостокски държавен медицински университет. Синдромът на острото белодробно увреждане (синдром на респираторен дистрес при възрастни, ARDS) е една от най -тежките форми на остра дихателна недостатъчност, която се проявява при пациенти с тежка травма, сепсис, перитонит, панкреатит, обилна загуба на кръв, аспирация, след обширни хирургични интервенции и при 50 60% от случаите са фатални. Данните от изследванията за патогенезата на ARDS, разработването на критерии за ранна диагностика и прогноза на синдрома са малко, доста противоречиви, което не позволява разработването на съгласувана диагностична и терапевтична концепция. Установено е, че ARDS се основава на увреждане на ендотела на белодробните капиляри и алвеоларен епител, нарушение на реологичните свойства на кръвта, което води до оток на интерстициалната и алвеоларна тъкан, възпаление, ателектаза, белодробна хипертония. В литературата от последните години има достатъчно информация за универсалния регулатор на клетъчния и тъканния метаболизъм - азотен оксид. Интересът към азотния оксид (NO) се дължи преди всичко на факта, че той участва в регулирането на много функции, включително съдов тонус, сърдечна контрактилност, агрегация на тромбоцитите, невротрансмисия, синтез на АТФ и протеини и имунна защита. В допълнение, в зависимост от избора на молекулната мишена и характеристиките на взаимодействие с нея, NO също има увреждащ ефект. Смята се, че задействащият механизъм на клетъчно активиране е небалансирана цитокинемия. Цитокините са разтворими пептиди, които действат като медиатори на имунната система и осигуряват клетъчно сътрудничество, положителна и отрицателна имунорегулация. Опитахме се да систематизираме наличната в литературата информация за ролята на NO и цитокините в развитието на синдрома на остро белодробно увреждане. NO е водоразтворим газ. Неговата молекула е нестабилен свободен радикал, лесно се дифундира в тъканта, абсорбира се и се унищожава толкова бързо, че може да засегне само клетките на непосредствената среда. Молекулата NO има всички свойства, присъщи на класическите пратеници: бързо се произвежда, действа в много ниски концентрации, след прекратяване на външния сигнал бързо се превръща в други съединения, окислявайки се до стабилни неорганични азотни оксиди: нитрити и нитрати. Продължителността на живота на NO в тъканите е, според различни източници, от 5 до 30 секунди. Основните молекулни мишени на NO са желязосъдържащи ензими и протеини: разтворима гуанилат циклаза, собствена нитрооксид синтаза (NOS), хемоглобин, митохондриални ензими, ензими от цикъла на Кребс, синтез на протеини и ДНК. Синтезът на NO в организма се осъществява чрез ензимни трансформации на съдържащата азота част от аминокиселината L-аргинин под въздействието на специфичен ензим NOS и се медиира от взаимодействието на калциеви йони с калмодулин. Ензимът се инактивира при ниски концентрации и е максимално активен при 1 μM свободен калций. Идентифицирани са две изоформи на NOS: конститутивна (cNOS) и индуцирана (iNOS), които са продукти на различни гени. Калций-калмодулин-зависимият cNOS постоянно присъства в клетката и насърчава освобождаването на малки количества NO в отговор на рецептор и физическа стимулация. NO, генериран под въздействието на тази изоформа, действа като носител в редица физиологични реакции. Независимият от калций-калмодулин iNOS се образува в различни типове клетки в отговор на провъзпалителни цитокини, ендотоксини и окислители. Тази NOS изоформа се транскрибира от специфични гени на хромозома 17 и насърчава синтеза на големи количества NO. Ензимът също е класифициран в три типа: NOS-I (невронален), NOS-II (макрофаг), NOS-III (ендотелен). Семейството ензими, които синтезират NO, се намира в различни белодробни клетки: в епителни клетки на бронхите, в алвеолоцити, в алвеоларни макрофаги, в мастоцити, в ендотелни клетки на бронхиални артерии и вени, в гладки миоцити на бронхите и кръвоносните съдове, в неадренергични нехолинергични неврони. Конститутивната способност на епителните клетки на бронхите и алвеолите на хора и бозайници да секретират NO е потвърдена в множество проучвания. Установено е, че горните части на дихателните пътища на човека, както и долните части участват в образуването на NO. Проучванията, проведени при пациенти с трахеостомия, показват, че количеството газ във въздуха, издишан чрез трахеостомията, е значително по -малко, отколкото в носната и устната кухина. Синтезът на ендогенен NO при пациенти на механична вентилация страда значително. Изследванията потвърждават, че освобождаването на NO се случва по време на бронходилатацията и се контролира от системата на блуждаещия нерв. Получени са данни, че образуването на NO в епитела на дихателните пътища на човека се увеличава при възпалителни заболявания на дихателната система. Синтезът на газ се увеличава поради активирането на индуциран NOS под въздействието на цитокини, както и ендотоксини и липополизахариди.

В момента са известни повече от сто цитокини, които традиционно са разделени на няколко групи.

1. Интерлевкини (IL -1 - IL18) - секреторни регулаторни протеини, които осигуряват медиаторни взаимодействия в имунната система и нейната връзка с други системи на тялото.

2. Интерферони (IFN -алфа, бета, гама) - антивирусни цитокини с подчертан имунорегулиращ ефект.

3. Факторите на туморна некроза (TNF алфа, бета) са цитокини с цитотоксични и регулаторни ефекти.

4. Колони-стимулиращи фактори (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-стимулатори на растежа и диференциацията на хематопоетичните клетки, регулиращи хематопоезата.

5. Хемокини (IL-8, IL-16)-хемоатрактанти за левкоцити.

6. Фактори на растежа - регулатори на растежа, диференциация и функционална активност на клетки от различни тъкани, принадлежащи (растежен фактор на фибробласти, растежен фактор на ендотелни клетки, епидермален растежен фактор) и трансформиращи растежни фактори (TGF бета).

Тези биорегулаторни молекули определят вида и продължителността на възпалителния и имунен отговор, контролират клетъчната пролиферация, хематопоезата, ангиогенезата, зарастването на рани и много други процеси. Всички изследователи подчертават, че цитокините нямат специфичност за антигените. Експерименти с култивирани белодробни макрофаги и мастоцити показват образуването на iNOS в отговор на интерферон гама, интерлевкин-1, тумор некрозис фактор и липополизахариди. Експресия на iNOS и cNOS за провъзпалителни цитокини е открита в животински и човешки алвеолоцити. Добавянето на епидермален растежен фактор, регулатор на функцията на епителните клетки към културата, намалява активността само на индуцирания ензим. Известно е, че в зависимост от природата цитокините действат автокринно - върху самите продуциращи клетки, паракринните - върху други целеви клетки или ендокринни - върху различни клетки извън мястото на тяхното производство. В същото време те могат да взаимодействат помежду си според агонистичен или антагонистичен принцип, променяйки функционалното състояние на целевите клетки и образувайки цитокинова мрежа. По този начин цитокините не са изолирани пептиди, а интегрална система, чиито основни компоненти са продуцентските клетки, самият протеин е цитокин, неговият рецептор и клетка -мишена. Установено е, че с развитието на остро белодробно увреждане нивото на провъзпалителни цитокини се увеличава: IL-1, 6, 8, 12, TNF алфа, IFN алфа. Техният ефект е свързан с вазодилатация, увеличаване на тяхната пропускливост и натрупване на течност в белодробната тъкан. В допълнение, проучванията показват способността на IFN гама и TNF алфа да индуцират експресията на адхезионни молекули - ICAM -1 върху човешки ендотелиоцити. Адхезионните молекули, прилепнали към левкоцити, тромбоцити и ендотелни клетки, образуват „търкалящи се“ неутрофили и насърчават агрегацията на фибринови частици. Тези процеси допринасят за нарушаване на капилярния кръвен поток, увеличават пропускливостта на капилярите и предизвикват локален оток на тъканите. Забавянето на капилярния кръвен поток се насърчава от активирането на NO, което причинява разширяване на артериолите. По -нататъшната миграция на левкоцити към възпалителния фокус се контролира от специални цитокини - хемокини, които се произвеждат и секретират не само от активирани макрофаги, но и от ендотелни клетки, фибробласти, гладки миоцити. Основната им функция е да доставят неутрофили към възпалителния фокус и да активират тяхната функционална активност. Основният хемокин за неутрофили е Il-8. Най-мощните му индуктори са бактериални липополизахариди, IL-1 и TNFalpha. R. Bahra et al. вярват, че всяка стъпка от трансендотелиалната миграция на неутрофили се регулира чрез стимулиране на концентрациите на TNF алфа. С развитието на остро белодробно увреждане се активират съдови ендотелиоцити, епителни клетки на бронхите и алвеоларни макрофаги, които участват във фазови взаимодействия. В резултат на това, от една страна, настъпва тяхната мобилизация и повишаване на защитните свойства, а от друга страна е възможно увреждане на самите клетки и околните тъкани. Редица проучвания показват, че продуктът на частично намаляване на кислорода, супероксид, може да се натрупа във възпалителния фокус, което инактивира вазоактивния ефект на NO. NO и супероксидният анион реагират бързо, образувайки увреждащ клетките пероксинитрит. Тази реакция насърчава отстраняването на NO от съдовите и бронхиалните стени, както и от повърхността на алвеолоцитите. Изследвания, показващи, че традиционно считан за медиатор на NO токсичност, пероксинитритът може да има физиологичен ефект и да предизвика съдова релаксация чрез NO-медиирано повишаване на cGMP в съдовия ендотел, представлява интерес. На свой ред, пероксинитритът е мощен окислител, способен да увреди алвеоларния епител и белодробното повърхностно активно вещество. Той причинява разрушаване на мембранните протеини и липиди, уврежда ендотела, увеличава агрегацията на тромбоцитите и участва в ендотоксимията. Повишеното му образуване е отбелязано при синдром на остро белодробно увреждане. Изследователите смятат, че NO, произведен в резултат на активирането на индуцирания ензим, е предназначен за неспецифична защита на организма срещу широк спектър от патогенни агенти, инхибира агрегацията на тромбоцитите и подобрява локалното кръвообращение. Установено е, че прекомерното количество NO потиска активността на cNOS в клетките поради взаимодействие със супероксид и евентуално в резултат на десенсибилизация на гуанилат циклаза, което води до намаляване на cGMP в клетката и до увеличаване на вътреклетъчния калций . Brett et al. и Kooy et al., анализирайки значението на нитрооксидергичните механизми в патогенезата на ARDS, предполагат, че iNOS, пероксинитритът и нитротирозинът, основният продукт на ефекта на пероксинитрита върху протеините, могат да играят ключова роля в развитието на синдрома. Cuthbertson et al. смятат, че в основата на острото белодробно увреждане е ефектът на NO и пероксинитрит върху еластаза и интерлевкин-8. Kobayashi et al. също регистрира увеличение на съдържанието на iNOS, интерлевкин-1, интерлевкин-6, интерлевкин-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти със синдром на остро белодробно увреждане. Meldrum et al. показват намаляване на производството на възпалителни цитокини от белодробни макрофаги при ARDS под влияние на субстрата на локално производство на NO - L -аргинин. Установено е, че в генезиса на синдрома на остро белодробно увреждане значителна роля играе нарушението на съдовата пропускливост, причинено от действието на цитокини-TNF алфа, IL-2, GM-CSF, моноклонални антитела към CD3 лимфоцити върху съдови ендотелни клетки на белите дробове и имуноцитите. Бързото и силно увеличаване на пропускливостта на белодробните съдове води до миграция на неутрофили в белодробната тъкан и освобождаване от тях на цитотоксични медиатори, което води до развитието на патологична белодробна промяна. По време на развитието на остро белодробно увреждане, TNF алфа увеличава адхезията на неутрофилите към съдовата стена, засилва тяхната миграция в тъканите, насърчава структурните и метаболитни промени в ендотелиоцитите, нарушава пропускливостта на клетъчните мембрани, активира образуването на други цитокини и ейкозаноиди, и причинява апоптоза и некроза на белодробните епителни клетки. Получените данни показват, че апоптозата на макрофагите, индуцирана от въвеждането на LPS, до голяма степен е свързана с IFN гама и се намалява от действието на IL-4, IL-10, TGF бета. Въпреки това, Kobayashi et al. получени данни, показващи, че IFN гама може да участва в възстановяването на епитела на лигавицата на дихателните пътища. Изследванията на Хагимото съдържат информация, че епителните клетки на бронхите и алвеолите в отговор на TNF алфа или Fas лиганд освобождават IL-8, IL-12. Този процес е свързан с активирането на ядрения фактор Carr-B от лиганда Fas.

Смята се, че IL-8 е един от най-важните цитокини в патофизиологията на острото белодробно увреждане. Miller et al. при изследването на бронхо-алвеоларна течност при пациенти с ARDS на фона на сеза е установено значително повишаване на нивото на IL-8, в сравнение с пациенти с кардиогенен белодробен оток. Предполага се, че основният източник на Il-8 са белите дробове и този критерий може да се използва при диференциалната диагноза на синдрома. Grau et al. смятат, че ендотелните клетки на белодробните капиляри са важен източник на цитокини-IL-6, IL-8 при развитието на остро белодробно увреждане. Goodman et al. При изследване на динамиката на нивото на цитокини в течността на бронхо-алвеоларен лаваж при пациенти с ARDS, значително увеличение на IL-1 бета, IL-8, моноцитен хемотактичен пептид-1, неутрофилен активатор на епителни клетки, възпалителен пептид на макрофаги -1 алфа е намерен. В същото време авторите смятат, че увеличаването на съдържанието на IL-1 бета може да служи като маркер за неблагоприятен изход от синдрома. Bauer et al. беше показано, че контролът върху съдържанието на IL-8 в бронхоалвеоларната течност при пациенти с ARDS може да се използва за наблюдение, намаляването на нивото на IL-8 показва неблагоприятен ход на процеса. Редица проучвания съдържат също информация, че нивото на производство на цитокини от съдовия ендотел на белите дробове влияе върху развитието на остро белодробно увреждане и чийто контрол може да се използва в клиничната практика за ранна диагностика. Възможните отрицателни последици от повишаване на нивото на провъзпалителни цитокини при пациенти с ARDS се доказват от проучванията на Martin et al., Warner et al. Алвеоларните макрофаги, активирани от цитокини и бактериални ендотоксини, повишават синтеза на NO. Нивото на производство на NO от бронхиални и алвеоларни епителни клетки, неутрофили, мастоцити, ендотелни клетки и гладки миоцити на белодробните съдове също се увеличава, вероятно чрез активиране на ядрения фактор Carr-B. Авторите смятат, че азотният оксид, получен в резултат на активирането на индуцирания NOS, е предназначен предимно за неспецифична защита на организма. Освободен от макрофагите, NO бързо прониква в бактериите и гъбите, където инхибира три жизненоважни групи ензими: Н-електронен транспорт, цикъл на Кребс и синтез на ДНК. NO участва в защитата на организма в последните етапи на имунния отговор и образно се разглежда като „наказателен меч“ на имунната система. Въпреки това, натрупвайки се в клетката в неадекватно големи количества, NO също има увреждащ ефект. По този начин, с развитието на синдрома на остро белодробно увреждане, цитокините и NO предизвикват последователна верига от реакции, изразени в нарушена микроциркулация, тъканна хипоксия, алвеоларен и интерстициален оток и увреждане на метаболитната функция на белите дробове. Следователно може да се констатира, че изследването на физиологичните и патофизиологичните механизми на действието на цитокините и NO е обещаваща област за изследване и ще позволи в бъдеще не само да разшири разбирането за патогенезата на ARDS, но и да определи диагностични и прогностични маркери на синдрома, за разработване на възможности за патогенетично базирана терапия, насочена към намаляване на смъртността.

Методи за определяне на цитокини.

Прегледът е посветен на основните методи за изследване на цитокините, използвани в момента. Възможностите и предназначението на методите са описани накратко. Представени са предимствата и недостатъците на различните подходи за анализ на експресията на цитокинови гени на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини. (Цитокини и възпаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Цитокините са регулаторни протеини, които образуват универсална мрежа от медиатори, характерни както за имунната система, така и за клетките на други органи и тъкани. Всички клетъчни събития се провеждат под контрола на този клас регулаторни протеини: пролиферация, диференциация, апоптоза и специализирана функционална активност на клетките. Ефектите на всеки цитокин върху клетките са плейотропни, спектърът от ефекти на различни медиатори се припокрива и като цяло крайното функционално състояние на клетката зависи от влиянието на няколко цитокина, действащи синергично. По този начин цитокиновата система е универсална, полиморфна регулаторна мрежа от медиатори, предназначена да контролира процесите на пролиферация, диференциация, апоптоза и функционална активност на клетъчните елементи в хематопоетичната, имунната и други хомеостатични системи на тялото. Методите за определяне на цитокините са претърпели много бърза еволюция за 20 години от тяхното интензивно изследване и днес представляват цяла област на научните познания. Изследователите в цитокинологията в началото на своята работа са изправени пред въпроса за избор на метод. И тук изследователят трябва да знае точно каква информация трябва да получи, за да постигне поставената цел. В момента са разработени стотици различни методи за оценка на цитокиновата система, които предоставят разнообразна информация за тази система. Оценката на цитокините в различни биологични среди може да се основава на специфична биологична активност. Те могат да бъдат количествено определени с помощта на различни методи на имуноанализ, използващи поли- и моноклонални антитела. В допълнение към изучаването на секреторните форми на цитокините, е възможно да се изследва тяхното вътреклетъчно съдържание и производство в тъканите чрез поточна цитометрия, Western blotting и in situ имунохистохимия. Много важна информация може да бъде получена чрез изучаване на експресията на цитокинова иРНК, стабилност на тРНК, наличието на изоформи на цитокинова иРНК, естествени антисмислени нуклеотидни последователности. Изследването на алелни варианти на цитокинови гени може да предостави важна информация за генетично програмирана висока или ниска продукция на един или друг медиатор. Всеки метод има своите недостатъци и предимства, собствена разделителна способност и точност на определяне. Незнанието и неразбирането на изследователя от тези нюанси могат да го доведат до фалшиви заключения.

Определяне на биологичната активност на цитокините.

Историята на откритието и първите стъпки в изучаването на цитокини е тясно свързана с култивирането на имунокомпетентни клетки и клетъчни линии. След това бяха показани регулаторните ефекти (биологична активност) на редица разтворими фактори с протеинова природа върху пролиферативната активност на лимфоцитите, върху синтеза на имуноглобулини, върху развитието на имунни отговори в in vitro модели. Един от първите методи за определяне на биологичната активност на медиаторите е определянето на фактора на миграция на човешки лимфоцити и фактора на неговото инхибиране. Тъй като биологичните ефекти на цитокините са изследвани, се появяват различни методи за оценка на тяхната биологична активност. Така IL-1 се определя чрез оценка на пролиферацията на миши тимоцити in vitro, IL-2-чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3-чрез растежа на хемопоетични колонии in vitro, IL-4-чрез комитогенният ефект, чрез повишена експресия на Ia-протеини, чрез индуциране на образуването на IgG1 и IgE и др. Списъкът с тези методи може да бъде продължен, той постоянно се актуализира с откриването на нови биологични активности на разтворими фактори. Основният им недостатък са нестандартните методи, невъзможността за тяхното унифициране. По-нататъшното развитие на методи за определяне на биологичната активност на цитокините доведе до създаването на голям брой клетъчни линии, чувствителни към един или друг цитокин, или мулти-чувствителни линии. Повечето от тези чувствителни към цитокин клетки сега могат да бъдат намерени в списъци с търговски клетъчни линии. Например, за тестване на IL-1a и b, се използва клетъчната линия D10S, за IL-2 и IL-15-клетъчната линия CTLL-2, за IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL -13, GM -CSF - клетъчна линия TF -1, за IL -6 - клетъчна линия B9, за IL -7 - клетъчна линия 2E8, за TNFa и TNFb - клетъчна линия L929, за IFNg - клетъчна линия WiDr, за IL-18-клетъчна линия линия KG-1. Този подход към изследването на имуноактивни протеини, заедно с добре известни предимства като измерване на реалната биологична активност на зрели и активни протеини, висока възпроизводимост при стандартизирани условия, има своите недостатъци. Те включват преди всичко чувствителността на клетъчните линии не към един цитокин, а към няколко сродни цитокини, чиито биологични ефекти се припокриват. В допълнение, не може да се изключи възможността за индуциране на производството на други цитокини от клетки -мишени, които могат да изкривят тествания параметър (като правило, пролиферация, цитотоксичност, хемотаксис). Все още не знаем всички цитокини и не всичките им ефекти, затова оценяваме не самия цитокин, а общата специфична биологична активност. По този начин оценката на биологичната активност като обща активност на различните медиатори (липса на специфичност) е един от недостатъците на този метод. В допълнение, използвайки чувствителни към цитокин линии, е невъзможно да се идентифицират инактивирани молекули и свързани протеини. Това означава, че такива методи не отразяват действителното производство на редица цитокини. Друг важен недостатък на използването на клетъчни линии е необходимостта от лаборатория за клетъчна култура. Освен това всички процедури за отглеждане на клетки, инкубирането им с изследваните протеини и среда отнемат много време. Трябва също така да се отбележи, че дългосрочната употреба на клетъчни линии изисква подновяване или повторно сертифициране, тъй като в резултат на култивирането те могат да мутират и модифицират, което може да доведе до промяна в тяхната чувствителност към медиатори и намаляване на точността на определяне на биологичната активност. Този метод обаче е идеален за тестване на специфичната биологична активност на рекомбинантни медиатори.

Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела.

Цитокините, произведени от имунокомпетентни и други видове клетки, се освобождават в извънклетъчното пространство за осъществяване на паракринни и автокринни сигнални взаимодействия. По концентрацията на тези протеини в кръвния серум или в кондиционирана среда може да се прецени естеството на патологичния процес и излишъкът или липсата на определени клетъчни функции при пациента. Методите за определяне на цитокини с помощта на специфични антитела днес са най -често срещаните системи за откриване на тези протеини. Тези методи са преминали през цяла поредица от модификации, използвайки различни етикети (радиоизотопни, флуоресцентни, електрохимилуминесцентни, ензимни и др.). Ако радиоизотопните методи имат редица недостатъци, свързани с използването на радиоактивен етикет и ограничената времева възможност за използване на белязани реагенти (период на полуразпад), тогава ензимно-свързаните имуносорбентни методи са намерили най-широко приложение. Те се основават на визуализацията на неразтворими продукти от ензимна реакция, поглъщащи светлина с известна дължина на вълната, в количества, еквивалентни на концентрацията на аналита. Антитела, приложени към твърда полимерна основа, се използват за свързване на измерваните вещества, а антителата, конюгирани с ензими, обикновено алкална фосфатаза или хрян пероксидаза, се използват за изобразяване. Предимствата на метода са очевидни: висока точност на определяне при стандартизирани условия за съхранение на реактиви и процедури, количествен анализ и възпроизводимост. Недостатъците включват ограничен диапазон от определени концентрации, в резултат на което всички концентрации, надвишаващи определен праг, се считат за равни на него. Трябва да се отбележи, че времето, необходимо за завършване на метода, варира в зависимост от препоръките на производителя. Във всеки случай обаче говорим за няколко часа, необходими за инкубации и промиване с реагенти. Освен това се определят латентни и свързани форми на цитокини, които по своята концентрация могат значително да надвишават свободните форми, отговорни главно за биологичната активност на медиатора. Ето защо е желателно този метод да се използва заедно с методи за оценка на биологичната активност на медиатора. Друга модификация на метода на имуноанализа, която намери широко приложение, е електрохимилуминесцентният метод (ECL) за определяне на протеини с антитела, белязани с рутений и биотин. Този метод има следните предимства пред радиоизотопните и ензимните имуноанализи: лекота на изпълнение, кратко време на изпълнение на метода, без процедури за промиване, малък обем на пробата, широк диапазон от определени концентрации на цитокини в серума и в кондиционирана среда, висока чувствителност на метод и неговата възпроизводимост. Разглежданият метод е приемлив за използване както в научни изследвания, така и в клинични проучвания. Следващият метод за оценка на цитокините в биологични среди е разработен въз основа на технологията на поточна флуориметрия. Тя ви позволява едновременно да оцените до стотици протеини в проба. Понастоящем са създадени търговски комплекти за определяне на до 17 цитокини. Въпреки това, предимствата на този метод определят и неговите недостатъци. Първо, това е трудоемкостта при избора на оптимални условия за определяне на няколко протеина, и второ, производството на цитокини е от каскаден характер с пикове на производство по различно време. Следователно определянето на голям брой протеини наведнъж не винаги е информативно. Общото изискване за методите на имуноанализ, използващи т.нар. "сандвич", е внимателен подбор на двойка антитела, позволяващ да се определи или свободната, или свързаната форма на анализирания протеин, което налага ограничения на този метод и което винаги трябва да се взема предвид при интерпретирането на получените данни. Тези методи определят общото производство на цитокини от различни клетки, като в същото време е възможно да се прецени за антиген-специфичното производство на цитокини от имунокомпетентни клетки само хипотетично. В момента е разработена системата ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), която до голяма степен елиминира тези недостатъци. Методът дава възможност за полуколичествено оценяване на производството на цитокини на ниво отделни клетки. Високата разделителна способност на този метод позволява да се оцени стимулираното от антиген производство на цитокини, което е много важно за оценка на специфичен имунен отговор. Следващият, широко използван за научни цели метод е вътреклетъчното определяне на цитокини чрез поточна цитометрия. Предимствата му са очевидни. Можем фенотипно да характеризираме популацията на клетки, продуциращи цитокин, и / или да определим спектъра на цитокини, произведени от отделни клетки, с възможност за относително количествено характеризиране на това производство. В същото време описаният метод е доста сложен и изисква скъпо оборудване. Следващата серия от методи, които се използват главно за научни цели, са имунохистохимични методи, използващи белязани моноклонални антитела. Предимствата са очевидни - определяне на производството на цитокини директно в тъканите (in situ), където протичат различни имунологични реакции. Разглежданите методи обаче са много трудоемки и не дават точни количествени данни.

Определяне на цитокини чрез ензимен имуноанализ.

CJSC Vector-Best под ръководството на T.G. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М. Ю. Rukavishnikov активно работят за определяне на цитокини. Цитокините са група полипептидни медиатори, често гликозилирани, с молекулно тегло от 8 до 80 kDa. Цитокините участват във формирането и регулирането на защитните реакции на организма и хомеостазата. Те участват във всички връзки на хуморалния и клетъчния имунен отговор, включително диференциация на имунокомпетентни прогениторни клетки, представяне на антигена, клетъчно активиране и пролиферация, експресия на адхезионни молекули и остра фазова реакция. Някои от тях са способни да проявяват много биологични ефекти по отношение на различни целеви клетки. Действието на цитокините върху клетките се осъществява по следните начини: автокринно - върху клетка, синтезираща и секретираща този цитокин; паракрин - върху клетки, разположени в близост до клетката продуцент, например, във фокуса на възпалението или в лимфоидния орган; ендокринно -дистанционно - върху клетки от всякакви органи и тъкани, след като цитокинът влезе в кръвообращението. Образуването и освобождаването на цитокини обикновено е краткотрайно и строго регулирано. Цитокините действат върху клетката, като се свързват със специфични рецептори на цитоплазмената мембрана, като по този начин предизвикват каскада от реакции, водещи до индуциране, усилване или потискане на активността на редица гени, регулирани от тях. Цитокините се характеризират със сложен мрежов характер на функциониране, при който производството на един от тях влияе върху формирането или проявлението на дейността на редица други. Цитокините са местни медиатори, поради което е препоръчително да се измерват техните нива в съответните тъкани след извличане на тъканни протеини от биопсии на съответните органи или в естествени течности: урина, слъзна течност, течност от венеца в джоба, бронхоалвеоларен лаваж, вагинален секрет, еякулат , измивания от кухините, гръбначния мозък или синовиалните течности и др. Допълнителна информация за състоянието на имунната система на организма може да бъде получена чрез изследване на способността на кръвните клетки да произвеждат цитокини in vitro. Нивата на плазмените цитокини отразяват настоящото състояние на имунната система и развитието на защитни реакции in vivo. Спонтанното производство на цитокини от култура от мононуклеарни клетки от периферна кръв дава възможност да се оцени състоянието на съответните клетки. Повишеното спонтанно производство на цитокини показва, че клетките вече се активират от антигена in vivo. Индуцираното производство на цитокини дава възможност да се оцени потенциалната способност на съответните клетки да реагират на антигенна стимулация. Намалената индукция на цитокини in vitro например може да служи като един от признаците на състояние на имунодефицит. Следователно и двата варианта за изследване на нивата на цитокини както в циркулиращата кръв, така и по време на тяхното производство от клетъчни култури са важни от гледна точка на характеристиките на имунореактивността на целия организъм и функцията на отделните връзки на имунната система. Доскоро в Русия няколко групи изследователи се занимаваха с изучаване на цитокини, тъй като биологичните методи за изследване отнемат много време, а внесените имунохимични комплекти са много скъпи. С появата на наличните вътрешни комплекти имуносорбенти, свързани с ензими, практикуващите лекари проявяват все по-голям интерес към изучаването на профила на цитокините. В момента диагностичното значение на оценката на нивото на цитокините е да се посочи самият факт на повишаване или намаляване на тяхната концентрация при даден пациент със специфично заболяване. Освен това, за да се оцени тежестта и да се предскаже хода на заболяването, е препоръчително да се определи концентрацията както на противо-, така и на възпалителни цитокини в динамиката на развитието на патологията. Например, съдържанието на цитокини в периферната кръв се определя от времето на обостряне, отразява динамиката на патологичния процес при пептична язва и други заболявания на стомашно -чревния тракт. В най-ранните етапи на обостряне преобладава увеличаването на съдържанието на интерлевкин-1 бета (IL-1 бета), интерлевкин-8 (IL-8), след това концентрацията на интерлевкин-6 (IL-6), гама-интерферон (гама -INF), факторът на туморна некроза се увеличава -алфа (алфа -TNF). Концентрацията на интерлевкин-12 (IL-12), гама-INF, алфа-TNF достига своя максимум в разгара на заболяването, докато съдържанието на маркери на острата фаза през този период се доближава до нормалните стойности. В пика на обострянето нивото на алфа-TNF значително надвишава съдържанието на интерлевкин-4 (IL-4) както в кръвния серум, така и директно в засегнатата тъкан на пери-язвената зона, след което започва постепенно намаление. Тъй като явленията на острата фаза отшумяват и процесите на възстановяване се засилват, концентрацията на IL-4 се увеличава. По промяната в цитокиновия профил може да се прецени ефективността и осъществимостта на химиотерапията. При провеждане на цитокинова терапия, например, по време на терапия с алфа-интерферон (алфа-IFN), е необходимо да се контролира както нивото на съдържанието му в циркулиращата кръв, така и производството на антитела към алфа-IFN. Известно е, че когато се произвежда голямо количество от тези антитела, терапията с интерферон не само престава да бъде ефективна, но може да доведе и до автоимунни заболявания. Напоследък бяха разработени и въведени на практика нови лекарства, които по един или друг начин променят цитокиновия статус на организма. Например, за лечение на ревматоиден артрит се предлага лекарство на базата на антитела към алфа-TNF, предназначено да премахне алфа-TNF, което участва в разрушаването на съединителната тъкан. Въпреки това, както според нашите данни, така и от литературата, не всички пациенти с хроничен ревматоиден артрит имат повишено ниво на TNF-алфа, поради което за тази група пациенти намаляването на нивото на TNF-алфа може допълнително да влоши дисбаланса на имунната система. По този начин правилната цитокинова терапия предполага контрол на цитокиновия статус на организма по време на лечението. Защитната роля на провъзпалителните цитокини се проявява локално, във фокуса на възпалението, но системното им производство не води до развитие на противоинфекциозен имунитет и не предотвратява развитието на бактериално-токсичен шок, който е причина за ранна смъртност при хирургични пациенти с гнойно-септични усложнения. Основата на патогенезата на хирургичните инфекции е инициирането на цитокиновата каскада, която включва, от една страна, провъзпалителни, а от друга-противовъзпалителни цитокини. Балансът между тези две противоположни групи до голяма степен определя естеството на протичането и резултата от гнойно-септични заболявания. Определянето на концентрацията в кръвта за един цитокин от тези групи (например TNF алфа или IL-4) няма да отразява адекватно състоянието на целия цитокинов баланс. Следователно е необходима едноетапна оценка на нивото на няколко медиатори (поне 2-3 от противоположните подгрупи). В момента CJSC "Vector-Best" е разработил и серийно произвежда комплекти реактиви за количествено определяне на: тумор некрозисфактор-алфа (чувствителност-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); гама интерферон (чувствителност - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); интерлевкин -4 (чувствителност - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); интерлевкин-8 (чувствителност-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); рецепторен антагонист на интерлевкин-1 (IL-1RA) (чувствителност-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); алфа интерферон (чувствителност - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); автоимунни антитела към алфа-интерферон (чувствителност-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Всички комплекти са предназначени да определят концентрацията на тези цитокини в човешки биологични течности, в супернатанти на културата, когато се изследва способността на човешките клетъчни култури да произвеждат цитокини in vitro. Принципът на анализа е "сандвич" вариант на твърдофазен тристепенен (време на инкубация-4 часа) или двустепенен (време на инкубация-3,5 часа) ензимно-свързан имуносорбентен анализ върху плаки. Анализът изисква 100 ul биологична течност или супернатант на култура на ямка. Отчитане на резултатите - спектрофотометрично при дължина на вълната 450 nm. Във всички комплекти хромогенът е тетраметилбензидин. Срокът на годност на нашите комплекти е удължен до 18 месеца от датата на издаване и 1 месец след началото на употреба. Анализът на литературните данни показа, че съдържанието на цитокини в кръвната плазма на здрави хора зависи както от комплектите, използвани за определянето им, така и от региона, където тези хора живеят. Следователно, за да разберем стойностите на нормалните концентрации на цитокини при жителите на нашия регион, ние анализирахме случайни проби от плазма (от 80 до 400 проби) на практически здрави кръводарители, представители на различни социални групи на възраст от 18 до 60 години без клинични данни прояви на груба соматична патология и отсъствие на HBsAg. антитела срещу HIV, вируси на хепатит В и С.

Фактор на туморна некроза-алфа.

TNF-алфа е плейотропен провъзпалителен цитокин, състоящ се от две удължени b-вериги с молекулно тегло 17 kDa и изпълняващи регулаторни и ефекторни функции в имунния отговор и възпалението. Основните производители на алфа-TNF са моноцити и макрофаги. Този цитокин се секретира и от кръвни лимфоцити и гранулоцити, клетки естествени убийци и Т-лимфоцитни клетъчни линии. Основните индуктори на алфа-TNF са вируси, микроорганизми и продукти от техния метаболизъм, включително бактериален липополизахарид. В допълнение, някои цитокини, като IL-1, IL-2, гранулоцитно-макрофагов колониестимулиращ фактор, алфа и бета-INF, също могат да играят ролята на индуктори. Основните направления на биологичната активност на алфа-TNF: проявява селективна цитотоксичност по отношение на някои туморни клетки; активира гранулоцити, макрофаги, ендотелни клетки, хепатоцити (производство на протеини в остра фаза), остеокласти и хондроцити (резорбция на костна и хрущялна тъкан), синтез на други провоспалителни цитокини; стимулира пролиферацията и диференциацията: неутрофили, фибробласти, ендотелни клетки (ангиогенеза), хематопоетични клетки, Т- и В-лимфоцити; засилва притока на неутрофили от костния мозък в кръвта; има антитуморна и антивирусна активност in vivo и in vitro; участва не само в защитните реакции, но и в процесите на унищожаване и възстановяване, придружаващи възпалението; служи като един от медиаторите на разрушаване на тъканите, което е често срещано при продължително, хронично възпаление.

Ориз. 1. Разпределение на нивото на алфа-TNF

в плазмата на здрави донори.

Повишено ниво на алфа-TNF се наблюдава в кръвния серум по време на посттравматично състояние, с белодробни дисфункции, нарушения на нормалното протичане на бременността, онкологични заболявания, бронхиална астма. Нивото на алфа-TNF е 5-10 пъти по-високо от нормата при обостряне на хроничната форма на вирусен хепатит С. През периода на обостряне на заболявания на стомашно-чревния тракт концентрацията на алфа-TNF в серума надвишава нормата средно 10 пъти, а при някои пациенти - 75-80 пъти. Високи концентрации на алфа -TNF се откриват в цереброспиналната течност при пациенти с множествена склероза и цереброспинален менингит, а при пациенти с ревматоиден артрит - в синовиалната течност. Това предполага участието на TNF алфа в патогенезата на редица автоимунни заболявания. Честотата на откриване на алфа -TNF в кръвния серум, дори при тежко възпаление, не надвишава 50%, с индуцирано и спонтанно производство - до 100%. Обхватът на концентрациите на алфа-TNF е 0-6 pg / ml, средният-1.5 pg / ml (фиг. 1).

Гама интерферон.

Ориз. 2. Разпределение на нивата на IFN-гама

в плазмата на здрави донори.

Интерлевкин-4

IL-4 е гликопротеин с молекулно тегло 18–20 kDa, естествен инхибитор на възпалението. Заедно с IFN-гама, IL-4 е ключов цитокин, произвеждан от Т клетки (главно TH-2 лимфоцити). Той поддържа баланс TH-1 / TH-2. Основните направления на биологичната активност на IL-4: усилва еозинофилията, натрупване на мастоцити, секреция на IgG4, TH-2-медииран хуморален имунен отговор; има локална антитуморна активност, стимулираща популацията от цитотоксични Т-лимфоцити и туморната инфилтрация с еозинофили; инхибира освобождаването на възпалителни цитокини (алфа-TNF, IL-1, IL-8) и простагландини от активирани моноцити, производството на цитокини от TH-1-лимфоцити (IL-2, гама-INF и др.).

Ориз. 3. Разпределение на нивото на IL-4 в плазмата

здрави донори.

Повишено ниво на IL-4 както в серумните, така и в стимулираните лимфоцити може да се наблюдава при алергични заболявания (особено по време на обостряне), като бронхиална астма, алергичен ринит, сенна хрема, атопичен дерматит, при заболявания на стомашно-чревния тракт. Нивото на IL-4 също е значително повишено при пациенти с хроничен хепатит С (CHC). По време на периоди на обостряне на CHC, неговото количество се увеличава почти 3 пъти в сравнение с нормата, а по време на ремисия на CHC, нивото на IL-4 намалява, особено на фона на лечение с рекомбинантен IL-2. Обхватът на концентрациите на IL-4 е 0–162 pg / ml, средният е 6,9 pg / ml, нормалният диапазон е 0–20 pg / ml (Фиг. 3).

Интерлевкин-8

IL-8 принадлежи към хемокините, това е протеин с молекулно тегло 8 kDa. IL-8 се произвежда от моноядрени фагоцити, полиморфноядрени левкоцити, ендотелни клетки и други видове клетки в отговор на различни стимули, включително бактерии и вируси и техните метаболитни продукти, включително провъзпалителни цитокини (например IL-1, TNF алфа ). Основната роля на интерлевкин-8 е да подобри хемотаксиса на левкоцитите. Той играе важна роля както при остро, така и при хронично възпаление. Повишено ниво на IL-8 се наблюдава при пациенти с бактериални инфекции, хронични белодробни заболявания, заболявания на стомашно-чревния тракт. Плазмените нива на IL-8 са повишени при пациенти със сепсис, а високите концентрации са свързани с повишена смъртност. Резултатите от измерването на съдържанието на IL-8 могат да се използват за проследяване на хода на лечението и прогнозиране на резултата от заболяването. По този начин е установено повишено съдържание на IL-8 в слъзната течност при всички пациенти с благоприятен ход на язви на роговицата. При всички пациенти със сложен ход на язва на роговицата концентрацията на IL-8 е 8 пъти по-висока, отколкото при пациенти с благоприятен ход на заболяването. По този начин съдържанието на провъзпалителни цитокини (особено IL-8) в слъзната течност при язви на роговицата може да се използва като прогностичен критерий за хода на това заболяване.

Ориз. 4. Разпределение на нивото на IL-8 в

плазма на здрави донори (Новосибирск).

Според нашите и публикувани данни, при здрави хора IL-8 се открива изключително рядко в кръвния серум; спонтанно производство на IL-8 от мононуклеарни клетки в кръвта се наблюдава при 62%, а индуцирано производство при 100% от здрави донори. Обхватът на концентрациите на IL-8 е 0–34 pg / ml, средният е 2 pg / ml, нормалният диапазон е 0-10 pg / ml (Фиг. 4).

Ориз. 5. Разпределение на нивото на IL-8 в плазмата

здрави донори (Рубцовск).

Антагонист на рецептора на интерлевкин-1.

IL-1RA принадлежи към цитокините, е олигопептид с молекулно тегло 18-22 kDa. IL-1RA е ендогенен инхибитор на IL-1, произвеждан от макрофаги, моноцити, неутрофили, фибробласти и епителни клетки. IL-1RA инхибира биологичната активност на интерлевкините IL-1a и IL-1 бета, конкурирайки се с тях за свързване с клетъчния рецептор.

Ориз. 6. Разпределение на нивото на IL-1RA

в плазмата на здрави донори

Производството на IL-1RA се стимулира от много цитокини, вирусни продукти и протеини в остра фаза. IL-1RA може активно да се експресира във възпалителни огнища при много хронични заболявания: ревматоиден и ювенилен хроничен артрит, системен лупус еритематозус, исхемични мозъчни лезии, възпалителни заболявания на червата, бронхиална астма, пиелонефрит, псориазис и други. При сепсис се отбелязва най-голямото увеличение на IL-1RA-до 55 ng / ml в някои случаи и е установено, че повишените концентрации на IL-1RA корелират с благоприятна прогноза. Високи нива на IL-1RA се наблюдават при жени със силно затлъстяване и това ниво намалява значително в рамките на 6 месеца след липосукцията. Диапазонът на концентрациите на IL-1RA е 0-3070 pg / ml, средната стойност е 316 pg / ml. Нормалният диапазон е 50–1000 pg / ml (Фиг. 6).

Алфа интерферон.

Алфа-IFN е мономерен негликозилиран протеин с молекулно тегло 18 kDa, който се синтезира главно от левкоцити (В-лимфоцити, моноцити). Този цитокин може също да бъде произведен от почти всеки клетъчен тип в отговор на подходяща стимулация, а вътреклетъчните вирусни инфекции могат да бъдат мощни стимулатори на синтеза на IFN-алфа. Индукторите на алфа-IFN включват: вируси и техни продукти, сред които водещо място заемат двуверижните РНК, произведени по време на вирусна репликация, както и бактерии, микоплазми и протозои, цитокини и растежни фактори (като IL-1, IL- 2, алфа -FNO, колони -стимулиращи фактори и др.). Първоначалната защитна реакция на неспецифичния антибактериален имунен отговор на организма включва индуцирането на алфа и бета IFN. В този случай той се произвежда от антиген-представящи клетки (макрофаги), които са нахлули в бактерии. Интерфероните (включително алфа-IFN) играят важна роля в неспецифичната връзка на антивирусния имунен отговор. Те повишават антивирусната резистентност, като индуцират в клетките синтеза на ензими, които потискат образуването на нуклеинови киселини и протеини на вируси. В допълнение, те имат имуномодулиращ ефект, засилват експресията на антигени на основния комплекс за хистосъвместимост в клетките. Промяна в съдържанието на алфа-IFN е открита при хепатит и цироза на черния дроб с вирусна етиология. По време на обостряне на вирусни инфекции концентрацията на този цитокин се увеличава значително при повечето пациенти, а през периода на реконвалесценция спада до нормално ниво. Доказана е връзка между серумните нива на алфа-INF и тежестта и продължителността на грипната инфекция.

Ориз. 7. Разпределение на нивото на алфа-IFN

в плазмата на здрави донори.

Увеличение на концентрацията на алфа-IFN се отбелязва в серума на повечето пациенти, страдащи от автоимунни заболявания, като полиартрит, ревматоиден артрит, спондилоза, псориатичен артрит, ревматична полимиалгия и склеродермия, системен лупус еритематозус и системен васкулит. Високо ниво на този интерферон се наблюдава и при някои пациенти по време на обостряне на пептична язва и холелитиаза. Диапазонът на концентрациите на алфа-INF е 0–93 pg / ml, средната стойност е 20 pg / ml. Нормалният диапазон е до 45 pg / ml (фиг. 7).

Антитела към алфа-IFN.

Антитела към алфа-IFN могат да бъдат открити в серумите на пациенти със соматичен еритематозен лупус. Спонтанно индуциране на антитела към алфа-IFN се наблюдава и в серумите на пациенти с различни форми на рак. В някои случаи антитела към алфа-IFN са открити в серумите на HIV-инфектирани пациенти, както и в цереброспиналната течност и серумите на пациенти с менингит по време на острата фаза, в серумите на пациенти с хроничен полиартрит.

Ориз. 8. Разпределение на нивото на антитела към алфа-IFN

в плазмата на здрави донори.

Алфа-IFN е едно от ефективните антивирусни и противотуморни терапевтични лекарства, но продължителната му употреба може да доведе до производство на специфични антитела към алфа-IFN. Това намалява ефективността на лечението, а в някои случаи причинява различни странични ефекти: от грипоподобни до развитие на автоимунни заболявания. Предвид това, по време на INF-терапията е важно да се контролира нивото на антитела към алфа-INF в тялото на пациента. Образуването им зависи от вида на лекарството, използвано в терапията, продължителността на лечението и вида на заболяването. Обхватът на концентрациите на антитела към алфа-IFN е 0–126 ng / ml, средната стойност е 6,2 ng / ml. Нормалният диапазон е до 15 ng / ml (фиг. 8). Оценката на нивото на цитокини с помощта на комплекти реагенти, предлагани в търговската мрежа в ЗАО "Vector-Best", позволява нов подход към изследването на състоянието на имунната система на организма в клиничната практика.

Имунотропни лекарства на базата на цитокини.

Интересна работа С. Симбирцева, Държавен изследователски институт за високо чисти биологични продукти, Министерство на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург) .Цитокините могат да бъдат изолирани в нова независима система за регулиране на основните функции на тялото, която съществува заедно с нервната и ендокринната регулация и е свързана предимно с поддържане на хомеостазата по време на въвеждането на патогени и нарушаване целостта на тъканите. Този нов клас регулаторни молекули е създаден от природата в продължение на милиони години еволюция и има неограничен потенциал за употреба като лекарства. В рамките на имунната система цитокините медиират връзката между неспецифичните защитни реакции и специфичния имунитет, действайки в двете посоки. На нивото на тялото цитокините комуникират между имунната, нервната, ендокринната, хематопоетичната и други системи и служат за тяхното включване в организацията и регулирането на защитните реакции. Движещата сила зад интензивното изследване на цитокините винаги е била обещаващата перспектива за тяхното клинично приложение при лечението на широко разпространени заболявания, включително рак, инфекциозни и имунодефицитни заболявания. В Русия са регистрирани няколко цитокинови лекарства, включително интерферони, стимулиращи колониите фактори, интерлевкини и техните антагонисти, фактор на некроза на тумора. Всички цитокинови препарати могат да бъдат разделени на естествени и рекомбинантни. Естествените препарати са препарати с различна степен на пречистване, получени от културалната среда на стимулирани еукариотни клетки, главно човешки клетки. Основните недостатъци са ниската степен на пречистване, невъзможността за стандартизация поради големия брой компоненти и използването на кръвни компоненти в производството. Очевидно бъдещето на цитокиновата терапия е свързано с генетично модифицирани лекарства, получени с помощта на най -новите постижения в биотехнологиите. През последните две десетилетия гените на повечето цитокини са клонирани и са получени рекомбинантни аналози, които напълно повтарят биологичните свойства на естествените молекули. В клиничната практика има три основни области на използване на цитокини:

1) цитокинова терапия за активиране на защитните реакции на организма, имуномодулация или запълване на липсата на ендогенни цитокини,

2) имуносупресивна терапия срещу цитокини, насочена към блокиране на биологичното действие на цитокините и техните рецептори,

3) цитокинова генна терапия с цел повишаване на антитуморния имунитет или коригиране на генетични дефекти в цитокиновата система.

Редица цитокини могат да се използват клинично за системна и локална употреба. Системното приложение е оправдано в случаите, когато е необходимо да се осигури действието на цитокините в няколко органа за по -ефективно активиране на имунитета или за активиране на целеви клетки, разположени в различни части на тялото. В други случаи локалното приложение има редица предимства, тъй като ви позволява да постигнете висока локална концентрация на активното начало, целевия орган-мишена и да избегнете нежелани системни прояви. Понастоящем цитокините се считат за едно от най -обещаващите лекарства за употреба в клиничната практика.

Заключение.

По този начин понастоящем няма съмнение, че цитокините са най -важните фактори в имунопатогенезата. Изследването на нивото на цитокини дава информация за функционалната активност на различни видове имунокомпетентни клетки, съотношението на процесите на активиране на Т-хелпери от тип I и II, което е много важно при диференциалната диагноза на редица инфекциозни и имунопатологични процеси. Цитокините са специфични протеини, които клетките на имунната система могат да използват за обмен на информация и взаимодействие помежду си. Днес са открити повече от сто различни цитокини, които условно са разделени на провъзпалителни (провокиращи възпаление) и противовъзпалителни (предотвратяващи развитието на възпаление). И така, различните биологични функции на цитокините са разделени на три групи: те контролират развитието и хомеостазата на имунната система, контролират растежа и диференциацията на кръвните клетки (хематопоетичната система) и участват в неспецифични защитни реакции на организма, повлиявайки възпалителните процеси процеси, коагулация на кръвта, кръвно налягане.

Списък на използваната литература.

S.V. Белмер, А.С. Симбирцев, О. В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлова. / Руски държавен медицински университет, Държавен научен център по колопроктология, Москва и Държавен научноизследователски институт за високо чисти биологични продукти, Санкт Петербург.

S.V. Сенников, А.Н. Силков // Списание "Цитокини и възпаление", 2005, No 1 Т. 4, No 1. С.22-27.

Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М. Ю. Рукавишников, материали за работа на АД "Вектор-Бест".

А. С. Симбирцев, Държавен изследователски институт по високо чисти биологични вещества, Министерство на здравеопазването на Русия, Санкт Петербург.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Държавен изследователски институт за високо чисти биопрепарати, Санкт Петербург.

Т. А. Шуматова, В. Б. Шуматов, Е. В. Маркелова, Л. Г. Сухо-топло. Катедра по анестезиология и реаниматология, Владивостокски държавен медицински университет.

В работата са използвани материали от сайта http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

някои патогени на инфекциозни заболявания. И така, норсулфазол ...

1. Молекулярни и клетъчни механизми на антивирусен имунитет, модели на развитие и имунопато

   Резюме >> Медицина, здраве

   ... "сайт" се отнася до конкретен сайт сигуренполипептид (антиген), с който ... неговите ранни етапи. Цитокинии хемокини. Други цитокини, в допълнение към интерферони, ... произведени от тях за единица време цитокиниопределя интензивността на разпространението и ...

2. Изследване на причините за развитието на фиброза на костния мозък при миелопролиферативни заболявания чрез анализ на ефекта на тромбоцитните фактори върху мезенхимните стволови клетки

   Домашна работа >> Медицина, здраве

   Различна концентрация; - количествени определениепротеин в експериментални системи ... водят до продължително действие цитокин, който засилва процеса на фиброза ... тромбоцити. Също така повишено съдържание цитокине открит в урината ...

3. Патогенеза на туберкулоза при хора

   Резюме >> Медицина, здраве

   Но е възможно и хранително хранене. Сигурениграе роля в аерогенната инфекция ... играе, секретирана от макрофаги и моноцити цитокин- фактор на туморна некроза (TNF). ... йони, всяка клетка притежава сигуренсистема, която осигурява транспортирането на вещества ...

Цитокините са ключови хуморални фактори на възпалението, необходими за осъществяване на защитните функции на вродения имунитет. Три групи цитокини участват в развитието на възпалението-възпалителни или провъзпалителни цитокини, хемокини, колони-стимулиращи фактори, както и функционално свързани фактори IL-12 и IFNy. Цитокините също играят важна роля за потискане и контролиране на възпалителния отговор. Противовъзпалителните цитокини включват трансформиращ растежен фактор β (TGFp), IL-10; често ролята на противовъзпалителен фактор играе IL-4.
Има 3 основни представители на групата на провъзпалителни цитокини-TNFa, IL-1 и IL-6; сравнително наскоро към тях бяха добавени IL-17 и IL-18. Тези цитокини се произвеждат главно от активирани моноцити и макрофаги, предимно на мястото на възпалението. Провъзпалителните цитокини могат да се произвеждат и от неутрофили, дендритни клетки, активирани В-, NK- и Т-лимфоцити. Във фокуса на проникване на патогени, цитокините са първите, които синтезират няколко локални възпалителни макрофаги. След това, в процеса на емиграция на левкоцити от кръвния поток, броят на продуцентските клетки се увеличава и техният спектър се разширява. По -специално, епителните, ендотелните, синовиалните, глиалните клетки и фибробластите, стимулирани от продуктите на микроорганизми и възпалителни фактори, са свързани със синтеза на провъзпалителни цитокини. Цитокиновите гени са класифицирани като индуцируеми. Естествените индуктори на тяхната експресия са патогени и техните продукти, действащи чрез TLRs и други патогенни рецептори. Класическият индуктор е бактериалният LPS. В същото време някои провъзпалителни цитокини (IL-1, TNFa) сами по себе си са способни да индуцират синтеза на провъзпалителни цитокини.
Провъзпалителните цитокини се синтезират и секретират доста бързо, въпреки че кинетиката на синтеза на различни цитокини от тази група не е еднаква. В типични случаи (бърз вариант), експресията на тяхната иРНК се отбелязва 15-30 минути след индуцирането, появата на протеинов продукт в цитоплазмата-след 30-60 минути съдържанието му в извънклетъчната среда достига максимум за 3- 4 часа. Синтезът на цитокини от специфична клетка продължава доста кратко време - обикновено малко повече от ден. Не се синтезира целият синтезиран материал. Определено количество цитокини се експресира на клетъчната повърхност или се съдържа в цитоплазмени гранули. Освобождаването на гранули може да предизвика същите активиращи сигнали като производството на цитокини. Това осигурява бърз (в рамките на 20 минути) поток на цитокини във фокуса на лезията.
Провъзпалителните цитокини изпълняват много функции. Тяхната основна роля е "организацията" на възпалителния отговор (фиг. 2.55). Един от най -важните и ранни ефекти на провъзпалителните цитокини е увеличаване на експресията на адхезионни молекули върху ендотелните клетки, както и върху самите левкоцити, което води до миграция на левкоцити от кръвния поток към огнището на възпалението (вж. Точка 2.3.3 ). В допълнение, цитокините индуцират повишаване на кислородния метаболизъм на клетките, тяхната експресия на рецептори за цитокини и други възпалителни фактори, стимулиране на производството на цитокини, бактерицидни пептиди и др. Провъзпалителните цитокини имат предимно локален ефект. Поглъщането на прекомерно секретирани провъзпалителни цитокини в кръвообращението допринася за проявата на системни ефекти на възпалението, а също така стимулира производството на цитокини от клетки, отдалечени от огнището на възпалението. На системно ниво провъзпалителните цитокини стимулират производството на протеини в остра фаза, причиняват повишаване на телесната температура и действат върху

Ориз. 2.55. Вътреклетъчно сигнализиране, задействано от провъзпалителни цитокини и механизми за активиране на провъзпалителни гени

ендокринната и нервната система, а във високи дози водят до развитие на патологични ефекти (плът до шок, подобно на септично).
IL-1 е колективното обозначение за протеиново семейство с повече от 11 молекули. Функцията на повечето от тях е неизвестна, но 5 молекули-IL-1a (според съвременната класификация-IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) и IL-33 (IL-1F11) са активни цитокини.
IL-1a и IL-1P традиционно се наричат ​​IL-1, защото взаимодействат със същия рецептор и техните ефекти са неразличими. Гените за тези цитокини се намират в дългата ръка на човешката хромозома 2. Хомологията между тях на ниво нуклеотид е 45%, на ниво аминокиселина - 26%. И двете молекули имат p-сгъната структура: съдържат 6 двойки антипаралелни p-слоя и имат форма на трилистник. Клетките синтезират молекула-предшественик с молекулно тегло около 30 kDa, лишена от сигнални пептиди, което показва необичаен начин за обработка на молекулата IL-1. Молекулното тегло на зрелите протеини е около 18 kDa.
IL -1a съществува в три форми - вътреклетъчна (разтворима молекула присъства в цитозола и изпълнява регулаторни функции), мембрана (молекулата се доставя до клетъчната повърхност чрез механизъм, подобен на рециклирането на рецепторите и е закотвен в мембраната) и секреция (молекулата се секретира в първоначалната си форма, но претърпява обработка - разцепване от извънклетъчни протеази с образуване на активен цитокин с тегло 18 kDa). Основният вариант на молекулата IL-1a при хората е мембранният вариант. В тази форма ефектът на цитокина е по -изразен, но се проявява само локално.
Обработката на IL-1P протича вътре в клетката с участието на специализиран ензим, IL-1 конвертаза (каспаза 1), разположен в лизозоми.
Този ензим се активира като част от инфламозомата - временна супрамолекулярна структура, която включва, в допълнение към неактивната каспаза 1, вътреклетъчни рецептори от семейство NLR (вж. Точка 2.2.3) - NOD1, NOD2, IPAF и др., Което причинява развитието на сигнал за активиране. Това води до образуване на транскрипционен фактор NF-kB и индуциране на провъзпалителни гени, както и активиране на инфламозомата и съдържащата се в нея каспаза 1. Активираният ензим разцепва молекулата на предшественика на IL-1P, а полученият зрял цитокин с молекулно тегло 18 kDa се секретира от клетката.
IL-1a, IL-1P и рецепторният антагонист на IL-1 споделят общи рецептори, които са спонтанно експресирани върху много типове клетки. Когато клетките се активират, броят на мембранните рецептори за IL-1 се увеличава върху тях. Основният, IL-1RI, съдържа 3 имуноглобулиноподобни домена в извънклетъчната част. Неговата вътреклетъчна част е TIR домейнът, който е структурно подобен на аналогичните TLR домени и задейства същите сигнални пътища (виж раздел 2.2.1). Броят на тези рецептори е малък (200-300 на клетка), но те имат висок афинитет към IL-1 (Kd е 10-11 М). Друг рецептор, IL-1RII, няма сигнален компонент в цитоплазмената част, не предава сигнал и служи като примамващ рецептор. Трансдукцията на сигнала от IL-1RI включва същите фактори като за TLRs (например MyD88, IRAK и TRAF6), което води до подобни резултати-образуването на транскрипционни фактори NF-kB и AP-1, които причиняват експресията на същият набор от гени (виж фиг. 2.12). Тези гени са отговорни за синтеза на провъзпалителни цитокини, хемокини, адхезионни молекули, ензими, които осигуряват бактерицидно действие на фагоцитите, и други гени, чиито продукти участват в развитието на възпалителния отговор. Самият IL-1 принадлежи към продуктите, секрецията на които се индуцира от IL-1, т.е. в този случай се задейства цикъл на положителна обратна връзка.
Всички клетки в тялото потенциално могат да бъдат мишени на IL-1. В най -голяма степен действието му засяга ендотелните клетки, всички видове левкоцити, клетки от хрущялна и костна тъкан, синовиални и епителни клетки, много видове нервни клетки. Под влияние на IL-1 се индуцира експресията на повече от 100 гена; с негово участие се реализират над 50 различни биологични реакции. Основните ефекти на IL-1 са емиграцията на левкоцити и активирането на тяхната фагоцитна и бактерицидна активност. Те също влияят върху коагулационната система и съдовия тонус, определяйки характеристиките на хемодинамиката във фокуса на възпалението. IL-1 има многостранен ефект върху клетките не само на вродения, но и на адаптивния имунитет, обикновено стимулирайки проявите и на двете.
IL-1 има много системни ефекти. Той стимулира производството на протеини от остра фаза от хепатоцитите, когато действа върху центъра на терморегулацията на хипоталамуса, причинява развитието на треска, участва в развитието на системни прояви на възпалителния процес (например неразположение, намален апетит, сънливост, адинамия), което е свързано с действието на IL-1 върху централната нервна система. Чрез засилване на експресията на рецептори за колони-стимулиращи фактори, IL-1 усилва хемопоезата, която е свързана с неговия радиозащитен ефект. IL-1 стимулира освобождаването на левкоцити от костния мозък, предимно неутрофили, включително незрели, което води до появата на левкоцитоза по време на възпаление и изместване на левкоцитната формула наляво (натрупване на незрели клетъчни форми). Ефектите на IL-1 засягат автономните функции и дори по-високата нервна дейност (промени в поведенческите реакции и т.н.). Хондроцитите и остеоцитите също могат да бъдат мишени на IL-1, което е свързано със способността на IL-1 да причинява разрушаване на хрущялите и костите, когато са включени във възпалителния процес, и обратно, хиперплазия на патологични тъкани (паннус при ревматоиден артрит). Вредният ефект на IL-1 се проявява и при септичен шок, увреждане на ставите при ревматоиден артрит и редица други патологични процеси.
Дублирането на IL-1 ефектите на бактериални продукти е свързано с необходимостта от многократно възпроизвеждане на активиращия ефект на патогените без тяхното разпространение. Микроорганизмите стимулират само клетки в непосредствена близост до мястото на влизане, предимно локални макрофаги. Тогава същият ефект се възпроизвежда многократно от молекулите IL-1p. Изпълнението на тази функция от IL-1 се улеснява от експресията на техните рецептори от почти всички клетки на тялото при активиране (възниква предимно във фокуса на възпалението).
Антагонистът на IL-1 рецептора (IL-1RA) е хомоложен на IL-1a и IL-1P (хомологията е съответно 26% и 19%). Той взаимодейства с IL-1 рецепторите, но не е в състояние да предаде сигнал към клетката. В резултат на това IL-1RA действа като специфичен антагонист на IL-1. IL-1RA се секретира от същите клетки като IL-1, този процес не изисква участието на каспаза 1. Производството на IL-1RA се индуцира от същите фактори като синтеза на IL-1, но някои от тях са спонтанно се произвежда от макрофаги и хепатоцити. В резултат на това този фактор постоянно присъства в кръвния серум. Това вероятно е необходимо, за да се предотвратят негативните последици от системното действие на IL-1, който се произвежда в значителни количества при остро възпаление. В момента рекомбинантният IL-1RA се тества като лекарство за лечение на хронични възпалителни заболявания (ревматоиден артрит и др.)
IL-18 е провъзпалителен цитокин, свързан с IL-f: той също се синтезира като прекурсор, преобразуван от каспаза 1; взаимодейства с рецептор, чиято цитоплазмена част съдържа TIR домейна и предава сигнал, водещ до активиране на NF-kB. В резултат на това настъпва активиране на всички провъзпалителни гени, но то е по-слабо изразено, отколкото при действието на IL-1. Отделно свойство на IL-18 е индуцирането (особено в комбинация с IL-12) на синтеза на IFNy от клетки. При липса на IL-12, IL-18 индуцира синтеза на антагониста на IFNy, IL-4, и насърчава развитието на алергични реакции. Действието на IL-18 е ограничено от разтворимия антагонист, който го свързва в течната фаза.
IL-33 е структурно много подобен на IL-18. Обработката на IL-33 също се осъществява с участието на каспаза 1. Този цитокин обаче се различава от другите членове на семейството на IL-1 по функциите, които изпълнява. Особеността на действието на IL-33 се дължи до голяма степен на факта, че неговият рецептор се експресира селективно върху Ig2 клетки. В тази връзка IL-33 насърчава секрецията на ^ 2-цитокини IL-4, IL-5, IL-13 и развитието на алергични процеси. Той няма значителен противовъзпалителен ефект.
Факторът на туморна некроза a (TNFa или TNFa) е член на друго семейство имунологично значими протеини. Това е провъзпалителен цитокин с широк спектър на действие. TNFa има b-сгъваема структура. Той се синтезира като функционално активна мембранна молекула pro-TNFa с молекулно тегло 27 kDa, което е трансмембранен протеин тип II (т.е. неговата N-крайна част е насочена в клетката). В резултат на протеолизата, в извънклетъчния домейн се образува разтворим мономер с молекулно тегло 17 kDa. TNFa мономерите спонтанно образуват 52 kDa тример, представляващ основната форма на този цитокин. Тримерът има формата на камбана и субединиците са свързани чрез своите С-краища, всяка от които съдържа 3 места на свързване с рецептора, докато N-краищата не са свързани помежду си и не участват във взаимодействие с рецепторите (и , следователно, при изпълнението на техните функции от цитокина). При киселинни стойности на рН TNFa придобива а-спирална структура, която причинява промяна в някои от нейните функции, по-специално повишена цитотоксичност. TNF е прототип на голямото семейство молекули на суперсемейството TNF (Таблица 2.31). Той включва лимфотоксини a и b (само първият съществува в разтворима форма), както и много мембранни молекули, участващи в междуклетъчните взаимодействия (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), които ще бъдат споменати по-долу в различни контексти. Според съвременната номенклатура името на членовете на суперсемейството се състои от съкращение TNFSF и сериен номер (за TNFa - TNFSF2, за лимфотоксин а - TNFSF1).
Таблица 2.31. Основните представители на фамилиите на тумор некрозис фактор и неговите рецептори

Фактор (лиганд)	Chro мозома	Молекулно тегло, kDa	Рецептор
TNFa (TNFSF2)	6p	17; тример - 52; гликозилирана форма - 25.6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Лимфотоксин (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Лимфотоксин В (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
TRAIL (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
АПРИЛ (TNFSF13)	17стр	27,0	BCMA, TACI
СВЕТЛИНА (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Основните продуценти на TNFa, подобно на IL-1, са моноцити и макрофаги. Той се секретира и от неутрофили, ендотелни и епителни клетки, еозинофили, мастоцити, В- и Т-лимфоцити, когато участват във възпалителния процес. TNFa се открива в кръвообращението по -рано от други провъзпалителни цитокини - вече 20-30 минути след индуцирането на възпаление, което е свързано с "изхвърлянето" на мембранната форма на молекулата от клетките, а вероятно и с освобождаването на TNFa в съдържанието на гранули.
Има 2 вида TNF рецептори, общи за TNFa и лимфотоксин а - TNFRI (от рецептор на тумор некротичен фактор I) и TNFRII с молекулно тегло съответно 55 и 75 kDa. TNFRI присъства в почти всички клетки на тялото, с изключение на еритроцитите, а TNFRII присъства главно в клетките на имунната система. TNFR образуват голямо семейство, което включва молекули, участващи в клетъчното взаимодействие и индуцирането на клетъчна смърт - апоптоза. Афинитетът на TNFa към TNFRI е по-нисък, отколкото към TNFRII (съответно около 5x10-10 M и 55x10-11 M). Когато TNFa-тримерът се свързва, настъпва тримеризация на неговите рецептори, необходими за предаване на сигнал.
Характеристиките на предаване на сигнал от тези рецептори до голяма степен се определят от структурата на тяхната вътреклетъчна част. Цитоплазмената част на TNFRI е представена от така наречения смъртен домен, от който се приемат сигнали, които водят до активиране на механизма на апоптоза; TNFRII няма домейн на смъртта. Сигнализирането от TNFRI се осъществява с участието на адапторни протеини TRADD (свързан с TNFR домейн на смъртта) и FADD (свързан с Fas домейн на смърт), които също съдържат домейни на смърт. В допълнение към пътя, водещ до развитието на апоптоза (чрез активиране на каспаза 8 или синтеза на керамид), се разграничават няколко сигнални пътя, които се активират с участието на факторите TRAF2 / 5 и RIP-1. Първият от тези фактори предава сигнал по пътя, водещ до активиране на NF-kB фактора, т.е. по класическия път на индуциране на провъзпалителни гени (виж фиг. 2.55). Сигналният път, активиран от фактор RIP-1, води до активиране на MAP каскадата с крайния продукт, транскрипционния фактор AP-1. Този фактор включва гени, които осигуряват активиране на клетките и предотвратяват развитието на апоптоза. По този начин съдбата на клетките се определя от баланса на про- и анти-апоптотични механизми, задействани, когато TNFa се свързва с TNFRI.
Изпълнението на функциите на TNFa е свързано главно с действието чрез TNFRI - изключването на съответния ген води до развитие на тежък имунодефицит, докато последиците от инактивирането на TNFRII гена са незначителни. В пика на възпалителния отговор, рецепторите на TNFa могат да бъдат „изхвърлени“ от мембраната и освободени в междуклетъчното пространство, където се свързват с TNFa, оказвайки противовъзпалителен ефект. В тази връзка, разтворимите форми на TNFR се използват при лечението на хронични възпалителни заболявания. Оказа се, че лекарството на базата на разтворим TNFRII се оказа най -ефективното клинично.
Подобно на IL-1, TNFa подобрява експресията на адхезионни молекули, синтеза на провъзпалителни цитокини и хемокини, протеини от остра фаза, ензими на фагоцитни клетки и др. Заедно с IL-1, TNFa участва в образуването на всички основни локални, както и някои системни прояви на възпаление. Той активира ендотелните клетки, стимулира ангиогенезата, засилва миграцията и активира левкоцитите. TNFa влияе върху активирането и пролиферацията на лимфоцитите в по-голяма степен от IL-1. В комбинация с IFNy, TNFa индуцира активността на NO синтаза във фагоцитите, което значително повишава техния бактерициден потенциал. TNFa стимулира пролиферацията на фибробласти, насърчавайки зарастването на рани. При повишено локално производство на TNFa преобладават процесите на увреждане на тъканите, проявяващи се с развитието на хеморагична некроза. В допълнение, TNFa инхибира активността на липопротеин липазата, което отслабва липогенезата и води до развитие на кахексия (едно от оригиналните имена на TNFa е кахексин). Повишеното освобождаване на TNFa и натрупването му в кръвообращението, например, под действието на високи дози бактериални суперантигени, причинява развитието на тежка патология - септичен шок. По този начин действието на TNFa, насочено към изпълнение на защитна функция и поддържане на хомеостазата, може да бъде придружено от тежки токсични ефекти (локални и системни), често причиняващи смърт.
IL-6 е широкоспектърен провъзпалителен цитокин. Той също така служи като прототипен фактор в семейството на цитокините, който включва, в допълнение към самия IL-6, онкостатин М (OSM), инхибиращ фактор на левкемия (LIF), цилиарен невротрофичен фактор (CNTF), кардиотропин-1 (CT-1 ), и IL-11 и IL-31. Молекулното тегло на IL-6 е 21 kDa. IL-6 се произвежда от моноцити и макрофаги, ендотелни, епителни, глиални, гладкомускулни клетки, фибробласти, Т-лимфоцити от типа Th2, както и много туморни клетки. Производството на IL-6 от миелоидни клетки се индуцира, когато техният TLR взаимодейства с микроорганизми и техните продукти, както и под въздействието на IL-1 и TNFa. В този случай в рамките на 2 часа съдържанието на IL-6 в кръвната плазма се увеличава 1000 пъти.
Рецепторите за всички фактори от семейството на IL -6 съдържат общ компонент - веригата gp130, която присъства в почти всички клетки на тялото. Вторият компонент на рецептора е индивидуален за всеки цитокин. Специфичната верига на IL-6 рецептора (gp80) е отговорна за свързването на този цитокин, докато gp130 участва в сигналната трансдукция, тъй като е свързана с тирозин киназите Jak1 и Jak2. Когато IL-6 взаимодейства с рецептора, се задейства следната последователност от събития: IL-6 мономерът взаимодейства с gp80 веригата, настъпва димеризация на комплексите (2 цитокинови молекули-2 gp80 вериги), след което 2 gp130 вериги са прикрепени към комплекса, който води до фосфорилиране на Jak-киназа. Последните фосфорилират факторите STAT1 и STAT3, които димеризират, преминават в ядрото и свързват промоторите на целевите гени. Веригата gp80 лесно се измива от клетката; в свободна форма, той взаимодейства с цитокина, инактивирайки го, т.е. действа като специфичен инхибитор на IL-6.
IL-6 участва в индуцирането на почти целия комплекс от локални прояви на възпаление. Той влияе върху миграцията на фагоцитите, увеличавайки производството на CC-хемокини, които привличат моноцити и лимфоцити, и отслабва производството на CX-хемокини, които привличат неутрофили. Провъзпалителните ефекти на IL-6 са по-слаби от тези на IL-1 и TNFa, за разлика от които той не се увеличава, но инхибира производството на провъзпалителни цитокини (IL-1, TNFa и IL-6) и хемокини от участващите клетки в възпалителния процес. По този начин IL-6 съчетава свойствата на про- и противовъзпалителни цитокини и участва не само в развитието, но и в ограничаването на възпалителния отговор.
IL-6 е основният фактор, предизвикващ експресия на протеинови гени в остра фаза в хепатоцитите. IL-6 влияе върху различни етапи на хематопоезата, включително пролиферация и диференциация на стволови клетки. Той служи като растежен фактор за незрели плазмени клетки, като значително засилва хуморалния имунен отговор. IL-6 също засяга Т лимфоцитите, повишавайки активността на цитотоксичните Т клетки.
IL-17 и сродни цитокини. Група цитокини, включително вида IL-17, привлече широко внимание във връзка с откриването на специален вид Т-помощници-Th17, който участва в развитието на някои увреждащи форми на възпалителни реакции, по-специално при автоимунни процеси (вж. точка 3.4.3.2). Ролята на тези цитокини в отговорите на адаптивния имунен отговор ще бъде разгледана по -долу. Тук даваме само общо описание на цитокините и накратко разглеждаме тяхната роля в реакциите на вродения имунитет.
Семейството IL-17 включва 6 протеина, обозначени с буквите от А до F. Свойствата на провъзпалителните цитокини от тях са IL-17A и IL-17F. Те са хомодимери, свързани с дисулфид; молекулното им тегло е 17,5 kDa. Тези цитокини се произвеждат от споменатия Th17, както и от CD8 + Т клетки, еозинофили и неутрофили. IL-23 стимулира развитието на TH7 клетки и производството на IL-17.
Рецепторите за IL -17 се експресират от много клетки - епителни клетки, фибробласти, клетки на имунната система, по -специално неутрофили. Основният резултат от взаимодействието на IL-17 с рецептора е, както при действието на други провъзпалителни цитокини, в индуцирането на NF-kB фактора и експресията на множество NF-KB-зависими възпалителни гени.
Един от важните биологични ефекти на IL-17 (заедно с IL-23) е поддържането на хомеостазата на неутрофилите. Тези цитокини подобряват производството на неутрофили, като стимулират производството на G-CSF. В същото време увеличаването или намаляването на производството на IL-17 и IL-23 се регулира от броя на неутрофилите в периферните тъкани: намаляването на броя на тези клетки в резултат на апоптоза води до увеличаване на производство на цитокини.
Провъзпалителният ефект на IL-17 се реализира главно чрез увеличаване на производството на други цитокини (IL-8, IL-6, y-CSF, редица хемокини) и експресията на адхезионни молекули. При мишки, трансгенни за IL-17 или IL-23, се развива системно хронично възпаление с интерстициална природа, с инфилтрация от неутрофили, еозинофили, макрофаги и лимфоцити на различни органи. Тези цитокини са признати за водеща роля в развитието на хронични автоимунни заболявания.
Семейство IL-12
IL-12 е идентифициран за способността му да активира NK клетки, да индуцира пролиферация на Т лимфоцити и да индуцира синтеза на IFNy. IL-12 заема специално място сред цитокините, произвеждани от клетките на вродената имунна система, тъй като той (подобно на основните му продуценти, дендритни клетки) служи като връзка между вродения и адаптивния имунитет. От друга страна, IL-12 е част от тандема IL-12-IFNy, който играе ключова роля в имунната защита срещу вътреклетъчни патогени.
IL-12 е димер, съставен от субединици р40 и р35. Общото му молекулно тегло е 75 kDa. Функционалната активност на IL-12 е свързана с неговата р40 субединица. "Пълномащабният" IL-12 се секретира от активирани моноцити, макрофаги, миелоидни дендритни клетки, неутрофили и епителни клетки на бариерни тъкани (те произвеждат както Ig-12p35, така и IL-12p40 цитокинови субединици). По -голямата част от телесните клетки синтезират само функционално неактивната субединица ^ -12p35. Количеството IL-12 хетеродимер, секретирано от клетката, е ограничено от субединицата р35. IL-12p40 се синтезира в излишък и може да се димеризира, за да образува хомодимер, който действа като антагонист на IL-12, както и като хемоатрактант. Индукторите на производство на IL-12 са предимно патогени, разпознати от TLRs и други рецептори за разпознаване на образи. Производството на IL-12 се засилва от IL-1, IFNy, както и междуклетъчните взаимодействия, медиирани от CD40-CD154 и други двойки молекули от семействата TNFR.
Рецепторът на IL-12 е най-силно експресиран върху NK клетки, активирани TH клетки и цитотоксични Т лимфоцити и в по-малка степен върху дендритни клетки. Експресията на IL-12 рецептора от активирани Т клетки се усилва под въздействието на IL-12, IFNy, IFNa, TNFa и при костимулация чрез CD28 рецептора. Рецепторът за IL-12 е димер, образуван от субединици на IL-12RP1 (100 kDa) и IL-12RP2 (130 kDa, CD212), с който е свързан протеин от 85 kDa. Както Pj, така и р2 веригите участват в свързването на IL-12, докато субединицата IL-12RP2 участва предимно в сигналната трансдукция. Вътреклетъчният домен на Pj веригата е свързан с JAK2 киназата, вътреклетъчният домен на P2 веригата е свързан с Tyk2 киназата. Киназите фосфорилират транскрипционните фактори STAT1, STAT3, STAT4 и STAT5.
Основната функция на IL-12, поради способността му да стимулира цитотоксичните лимфоцити (NK и Т) и да индуцира диференциация на Thl клетки (вж. Точка 3.4.3.1), е да задейства клетъчните защитни механизми срещу вътреклетъчните патогени. IL-12 действа върху NK и NKT клетките още в ранните етапи на имунните процеси, засилвайки пролиферацията и цитотоксичната активност на NK клетките, а по-късно върху цитотоксичните Т лимфоцити и синтеза на IFNy от всички тези клетки. Малко по-късно IL-12 индуцира диференциацията на Thl клетки, които също произвеждат IFNy. Условието за индуциране на Thl клетки е предварителната експресия на рецепторната субединица на IL-12RP2 от активирани CD4 + Т клетки. След това клетките придобиват способността да се свързват с IL-12, което води до активиране на фактора STAT4, който регулира експресията на гени, характерни за Thl клетките (за експресията на гена IFNG, действието на транскрипционния фактор Т -залогът е по -важен). В същото време IL-12 потиска диференциацията на ^ 2 клетки и отслабва производството на клетки
В-серия антитела от класове IgE и IgA. Действайки върху дендритни и други APCs, IL-12 индуцира експресията на костимулиращи молекули (CD80 / 86 и др.), Както и продукти на APC на MHC-II. По този начин IL-12 играе свързваща роля между вродения и адаптивния имунитет и засилва имунните механизми, отговорни за защитата срещу вътреклетъчни патогени и тумори.
Семейството IL-12 включва IL-23, IL-27 и IL-35. Тези цитокини са хетеродимери: IL-23 се образува от две субединици-I-23p19 и IL-12p40 (идентични със съответната субединица на IL-12), IL-27-от субединици Ebi3 и IL-27p28, IL-35-от субединици Ebi3 и IL-12p35. Тези цитокини се произвеждат предимно от дендритни клетки. Производството на цитокини от семейството на IL-12 се задейства от PAMP и цитокини, присъстващи върху патогени, по-специално GM-CSF.
Приемането на IL-23 се осъществява от две различни структури: субединицата IL-12p40 се разпознава от р-веригата на рецептора за IL-12, а субединицата R-23p19 се разпознава от специален рецептор, IL-23R. STAT4 играе важна роля в предаването на сигнал от IL-23. Рецепторът за IL-27 активира молекулите WSX-1 (хомолог на р2 субединицата на IL-12R) и gp130 (полипептидна верига, която е част от рецепторите за цитокини от семейството на IL-6).
Подобно на IL-12, IL-23 и IL-27 действат предимно върху CD4 + Т клетки, насърчавайки тяхната диференциация по пътя на Th1. Характеристики на IL-23-преобладаващ ефект върху Т-клетките на паметта, както и способността да се поддържа развитието на Т-помощници от типа Th17. IL-27 се различава от другите два цитокина от семейството по способността си да индуцира пролиферацията не само на активирани, но и на почиващи CD4 + Т клетки. Наскоро беше показано, че IL-27 и IL-35 могат да действат като регулаторни (потискащи) фактори, тъй като тяхната субединица Ebi3 е мишена на ключовия фактор на регулаторните Т клетки на FOXP3.
Колонистимулиращите фактори (CSF) (Таблица 2.32) или хематопоетините са представени от три цитокина-GM-CSF, G-CSF и M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) е функционално близо до тях. Тези фактори се наричат ​​колони-стимулиращи фактори, тъй като за първи път са идентифицирани чрез способността им да поддържат растежа in vitro на хемопоетични клетъчни колонии със съответния състав. IL-3 има най-широк спектър на действие, тъй като поддържа растежа на всяка хемопоетична клетъчна колония, с изключение на лимфоидни клетки. GM-CSF подпомага растежа както на смесени гранулоцитно-моноцитни колонии, така и на отделно гранулоцитни и моноцитни / макрофажни колонии. G-CSF и M-CSF са специализирани в поддържането на растежа и диференциацията на съответните им колонии. Тези фактори не само осигуряват оцеляването и пролиферацията на хематопоетични клетки от този тип, но също така са в състояние да активират вече зрели диференцирани клетки (М -CSF - макрофаги, G -CSF - неутрофили). M-CSF участва в диференциацията на моноцитите в макрофаги и инхибира диференциацията на моноцитите в дендритни клетки. G-CSF, освен че действа върху гранулоцитния клон на хематопоезата, причинява мобилизирането на хематопоетични стволови клетки от костния мозък в кръвния поток.
Таблица 2.32. Характеризиране на стимулиращи колонии фактори

Име не	Chromo сом	Молекулно тегло, kDa	Клетки производители	Клетки цел	Рецепта тори
GM-CSF	5q	22	Макрофаги, Т клетки, NK клетки, стромални клетки, епителни клетки	Макрофаги, неутрофили, еозинофили, Т клетки, дендритни клетки, хематопоетични клетки	GM- CSFR a / R
G-CSF	17q	18-22		Неутрофили, еозинофили, Т клетки, хематопоетични клетки	G-CSFR (1 верига)
M-CSF	5q	45/70 (димер)	Макрофаги, стромални клетки, епителни клетки	Макрофаги, хематопоетичен клетки	c-Fms
Фактор на стволови клетки	12q	32	Стромален клетки	Хематопоетични клетки, В клетки, мастоцити	c-Kit
Flt-3- лиганд	19q	26,4	Стромален клетки	Хемопоетични клетки, мастоцити	Flt-3

G-CSF, GM-CSF и IL-3 са структурно характеризирани като хематопоетини, съдържащи 4 а-спирални домена. Техните рецептори съдържат 2 полипептидни вериги, те принадлежат към семейството на хематопоетиновите рецептори. M-CSF е различен от другите CSF. Това е димерна молекула и съществува както в разтворими, така и в мембранно-свързани форми. Неговият рецептор има извънклетъчни Ig-подобни домени и вътреклетъчен домен с активност на тирозин киназата (името на тази прото-онкоген киназа-c-Fms-понякога се пренася към целия рецептор). Когато M-CSF се свързва с рецепторите, настъпва тяхната димеризация и активиране на киназа.
Колони стимулиращите фактори се произвеждат от ендотелни клетки и фибробласти, както и от моноцити / макрофаги. GM-CSF и IL-3 също се синтезират от Т лимфоцити. Под въздействието на бактериални продукти (чрез разпознаващи образци рецептори) и провъзпалителни цитокини синтезът и секрецията на колони-стимулиращи фактори се увеличава значително, което води до увеличаване на миелопоезата. Особено силно се стимулира гранулоцитопоезата, която е придружена от ускорена емиграция на клетки, включително незрели, към периферията. Това създава картина на неутрофилна левкоцитоза с изместване на формулата надясно, което е много характерно за възпалението. Препаратите на базата на GM- и G-CSF се използват в клиничната практика за стимулиране на гранулоцитопоезата, отслабена от цитотоксичните ефекти (радиация, химиотерапия за лечение на туморни заболявания и др.). G-CSF се използва за мобилизиране на хемопоетични стволови клетки, последвано от използване на индуцирана левкомаса за възстановяване на нарушена хематопоеза.
Факторът на стволови клетки (SCF - фактор на стволови клетки, c -kit лиганд) се секретира от стромални клетки от костен мозък (фибробласти, ендотелни клетки), както и от различни видове клетки по време на ембрионалното развитие. SCF съществува като трансмембранна и разтворима молекула (последната се образува в резултат на протеолитично разцепване на извънклетъчната част). SCF се открива в кръвната плазма. Неговата молекула има две дисулфидни връзки. SCF рецепторът, c-Kk, има тирозин киназна активност и е структурно подобен на Flt-3 и c-Fms (M-CSF рецептор). Когато SCF се свързва, рецепторите се димеризират и фосфорилират. Предаването на сигнал става с участието на PI3K и MAP каскадата.
Мутациите в SCF гена и неговия рецептор са описани отдавна (стоманени мутации); при мишки те се проявяват с промяна в цвета на козината и нарушение на хематопоезата. Мутациите, които нарушават синтеза на мембранната форма на фактора, причиняват груби дефекти в развитието на ембриона. Заедно с други фактори, SCF участва в поддържането на жизнеспособността на хематопоетичните стволови клетки, осигурява тяхната пролиферация и подпомага ранните етапи на хематопоезата. SCF е особено важен за еритропоезата и развитието на мастоцитите, а също така служи като растежен фактор за тимоцитите на етапите DN1 и DN2.
По отношение на структурата и биологичната активност, Flt-3L- факторът (Fms-подобен тирозинкиназен 3-лиганд) има свойства, подобни на SCF, в комбинация с други фактори, подпомагащи ранните етапи на миелопоезата и развитието на В-лимфоцити. SCF играе ролята на растежен фактор за левкемични миелобласти.
Хемокините, които са важен хуморален фактор при възпалението и вродения имунитет, се обсъждат по -горе в описанието на хемотаксиса на левкоцитите (вж. Точка 2.3.2).