Полимеразна верижна реакция, нейната същност и приложения. Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение Метод на полимеразна верижна реакция PCR

Не толкова отдавна беше разработен надежден, високо чувствителен и бърз метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания при хората. Този метод се нарича "PCR анализ". Какво е това, каква е неговата същност, какви микроорганизми може да открие и как да го приема правилно, ще ви разкажем в нашата статия.

История на откритията


Също така, PCR методите се използват за диагностика на рак.

Предимства на метода

PCR диагностиката има редица предимства:

  1. Висока чувствителност. Дори само с няколко молекули ДНК на микроорганизъм, PCR анализът определя наличието на инфекция. Методът ще помогне при хронични и латентни заболявания. Често в такива случаи микроорганизмът се декултивира по други начини.
  2. Всеки материал е подходящ за изследване, например слюнка, кръв, генитален секрет, коса, епителни клетки. Най -често срещаният е кръвен тест и урогенитална намазка за PCR.

  3. Не се изисква дългосрочно отглеждане на култури. Автоматизираният диагностичен процес ви позволява да получите резултатите от изследването след 4-5 часа.
  4. Методът е почти 100% надежден. Записани са само няколко случая на фалшиво отрицателен резултат.
  5. Способността да се идентифицират няколко вида патогени от една проба материал. Това не само ускорява процеса на диагностициране на болестта, но и значително намалява материалните разходи. Често лекарят предписва цялостен PCR анализ. Цената на изследването, което се състои от идентифициране на шест патогена, е около 1500 рубли.

    6. За да бъдат резултатите надеждни при провеждане на PCR проучване, е необходимо да се премине анализът, като се спазват препоръките за предварителна подготовка за диагностика:

    1. Преди да дарите слюнка, трябва да се въздържате от приема на храна и лекарства 4 часа преди да вземете материала. Непосредствено преди процедурата изплакнете устата си с преварена вода.
    2. Горните правила трябва да се спазват при вземане на проба от вътрешната повърхност на бузата. След изплакване се препоръчва да се извърши лек масаж на кожата, за да се освободи секретът на жлезата.
    3. Урината обикновено се събира у дома. За да направите това, трябва да проведете задълбочена тоалетна на гениталиите. Съберете 50-60 ml урина в стерилен пластмасов контейнер. За да се гарантира чистотата на материала, се препоръчва на жените да поставят тампон във влагалището, а на мъжете да издърпат кожната гънка колкото е възможно повече. Не можете да дарявате материал по време на менструалния поток.
    4. За да дарите сперма, трябва да се въздържате от полов акт в продължение на 3 дни, преди да вземете материала. Също така, лекарите съветват да се откажете от посещението на сауната и да вземете гореща вана, да пиете алкохол и пикантни храни. В продължение на 3 часа преди анализа трябва да се въздържате от уриниране.
    5. При доставка, например, ако се извърши анализ за PCR на хламидия, се препоръчва и на жените, и на мъжете да имат полова почивка в продължение на 3 дни. Антибактериални лекарства не трябва да се приемат 2 седмици преди анализа. За една седмица трябва да спрете да използвате интимни гелове, мехлеми, вагинални супозитории, душ. В продължение на 3 часа преди изследването трябва да се въздържате от уриниране. По време на менструация материалът не се взема, само 3 дни след прекратяване на кръвния секрет можете да вземете урогенитална намазка.

    PCR по време на бременност

    Докато чакат бебето, много инфекции, предавани по полов път, са изключително опасни за нормалното развитие на плода. ППБ могат да провокират вътрематочно забавяне на растежа, спонтанен аборт или преждевременно раждане, вродени малформации на детето. Ето защо е изключително важно да се подложите на PCR изследване в ранните етапи на бременността. Необходимо е анализът да се премине при регистрация - до 12 седмици.

    Материалът се взема от цервикалния канал с помощта на специална четка. Процедурата е безболезнена и не представлява опасност за бебето. Обикновено по време на бременност се извършва анализ за хламидия по PCR метода, както и за уреаплазмоза, микоплазмоза, цитомегаловирус, херпес, папиломен вирус. Такъв комплекс от изследвания се нарича PCR-6.

    PCR за диагностика на ХИВ

    Поради факта, че методът е много чувствителен към промените в тялото и условията на диагнозата, много фактори могат да повлияят на резултата. Следователно, анализът на PCR за HIV инфекция не е надежден метод, неговата ефективност е 96-98%. В останалите 2-4% от случаите тестът дава фалшиво положителни резултати.

    Но в някои ситуации PCR диагностиката на ХИВ е незаменима. Обикновено се дава на хора с фалшиво отрицателен тест ELISA. Такива показатели показват, че човек все още не е развил антитела срещу вируса и те не могат да бъдат открити без многократно увеличаване на броя. Точно това може да се постигне с PCR кръвен тест.

    Подобна диагностика е необходима и за деца от първата година от живота, родени от HIV-позитивна майка. Методът е единственият начин за надеждно определяне на статуса на дете.

    PCR за диагностика на хепатит

    Методът на полимеразна верижна реакция позволява откриване на ДНК на вируса на хепатит А, В, С много преди образуването на антитела срещу инфекция или появата на симптоми на заболяването. PCR анализът за хепатит С е особено ефективен, тъй като в 85% от случаите такова заболяване протича безсимптомно и без навременно лечение преминава в хроничен стадий.

    Навременното откриване на патогена ще помогне да се избегнат усложнения и дългосрочно лечение.

    Цялостно PCR изследване

    Цялостен PCR анализ: изследване по метода на полимезарната верижна реакция, което включва определяне на няколко вида инфекции едновременно: микоплазма гениталий, микоплазма хоминис, гарднерела вагиналис, кандида, трихомонади, цитомегаловирус, херпес 1 и 2 тип, гонорея, папиломен вирус. Цената на такава диагноза варира от 2000 до 3500 рубли. в зависимост от клиниката, използваните материали и оборудване, както и от вида на анализа: качествен или количествен. Какво е необходимо във вашия случай - лекарят ще реши. В някои случаи е достатъчно само да се определи наличието на патогена, в други, например, при HIV инфекция, количественият титър играе важна роля. При диагностициране на всички горепосочени патогени изследването се нарича "PCR-12 анализ".

    Тълкуване на резултатите от анализа

    Декодирането на PCR анализа не е трудно. Има само 2 скали на индикатора - „положителен резултат“ и „отрицателен резултат“. Когато се открие патоген, лекарите могат да потвърдят наличието на болестта с 99% сигурност и да започнат лечението на пациента. С количествен метод за определяне на инфекцията, числовият индикатор за откритите бактерии ще бъде посочен в съответната колона. Само лекар може да определи степента на заболяването и да предпише необходимото лечение.

    В някои случаи, например, при определяне на HIV инфекция чрез PCR, в случай на отрицателен резултат, се налага провеждането на допълнителни изследвания за потвърждаване на получените показатели.

    Къде да се тествам?

    Къде да се направи PCR анализ: в държавна клиника или в частна лаборатория? За съжаление в общинските лечебни заведения оборудването и методите често са остарели. Затова е по -добре да се даде предимство на частни лаборатории с модерно оборудване и висококвалифициран персонал. Освен това в частна клиника ще получите резултати много по -бързо.

    В Москва много частни лаборатории предлагат PCR анализ за различни инфекции. Например, в такива клиники като "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro" се извършва PCR анализ. Цената на прегледа е от 200 рубли. за идентифициране на един патоген.

    Може да се заключи, че диагностицирането на инфекциозни заболявания чрез PCR в повечето случаи е бърз и надежден начин за откриване на патогена в организма в ранните етапи на инфекцията. Но все пак в определени случаи си струва да изберете други диагностични методи. Само специалист може да определи необходимостта от такова изследване. Декодирането на PCR анализа също изисква професионален подход. Следвайте препоръките на лекаря и не правете сами тестове, които не са необходими.

Често се използва като бърз метод за индикация и идентификация на вируси.

Този метод е разработен за първи път от К. Мулис (САЩ) през 1983 г. Поради високата си чувствителност, специфичност и лекота на изпълнение, той се използва широко в генетиката, съдебната медицина, диагностиката и други области.

Същността на метода е амплификация, тоест увеличаване на броя на копията на строго определени фрагменти от молекула на ДНК in vitro. При този метод матричният механизъм и принципът на взаимно допълване работят. Две единични полинуклеотидни вериги (нуклеинови киселини) са способни да се свързват с водород в една двуверижна, ако нуклеотидните последователности на едната точно съвпадат с нуклеотидната последователност на другата, така че техните азотни основи могат да образуват двойки аденин-тимин и гуанин-цитозин.

PCR се основава на ДНК амплификация с помощта на термостабилна ДНК полимераза, която синтезира взаимно допълващи се нишки на ДНК, започвайки от два праймера. Праймерът е парче ДНК с дължина 20-30 нуклеотида. Тези праймери (праймери) са комплементарни на противоположните нишки на ДНК. По време на синтеза на ДНК праймерите се вмъкват във веригата от ново синтезирани молекули на ДНК.

Обикновено PCR се извършва в 25-40 цикъла. Всеки цикъл включва три етапа: първият е денатурация при 92-95 ° C. В този случай двете ДНК вериги се разминават; второ - отгряване или закрепване на грундове при 50-65 ° C; третият е удължаване или полимеризация при 68-72 ° С, докато ДНК полимеразата допълва нишките на ДНК матрицата, използвайки четири типа нуклеотиди. В резултат на един цикъл необходимият генетичен материал се удвоява. ДНК веригите, образувани в първия цикъл, служат като шаблони за втория цикъл и т.н. След първия цикъл се амплифицира само фрагментът между двата праймера. По този начин има удвояване на броя на копията на амплифицираната област, което прави възможно синтезирането на милиони (2 n) ДНК фрагменти в 25-40 цикъла - количество, достатъчно за тяхното посочване чрез различни методи (по метода на хибридизация сонди, съдържащи определен етикет, електрофореза и др.) ... По -често за тази цел се използва методът на електрофореза с агарозен гел с оцветяване с етидиев бромид.

При PCR се използват праймери от участъци от ДНК на патогена, които имат уникална последователност от нуклеотиди, характерни само за определен патоген.

Техниката на PCR се свежда до следното: ДНК матрицата се изолира от тестовия материал; в епруветка комбинирайте изолираната ДНК със смес за амплификация, която включва ДНК полимераза, всичките 4 вида нуклеотиди, 2 вида праймери, MgCl, буфер, дейонизирана вода и минерално масло. След това лампите се поставят в усилвател и усилването се извършва в автоматичен режим съгласно дадена програма, съответстваща на вида на патогена. Резултатите се записват по-често чрез електрофореза в 1-2% агарозен гел в присъствието на етидиев бромид, който се комбинира с фрагменти от ДНК и се открива под формата на светещи ленти, когато гелът се облъчва с UV лъчи върху трансиллуминатор. Всички PCR процедури отнемат 1-2 работни дни.

За да се повиши специфичността и чувствителността на PCR, се използват различни опции: вложен PCR; PCR с "горещ старт", използвайки парафинов слой или блокада на активни центрове на полимераза с моноклонални антитела. В допълнение, някои компании произвеждат комплекти с лиофилизирани реактиви за амплификация на ДНК, които могат да ускорят процеса на PCR и да намалят възможността за фалшиво положителни резултати.

В момента се въвежда нова технология PCR-PCR в реално време (Real-Time PCR). Основната му характеристика е мониторинг и количествен анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматично регистриране и интерпретиране на получените резултати. Този метод не изисква етап на електрофореза, което дава възможност да се намалят лабораторните изисквания за PCR. PCR в реално време използва флуоресцентно маркирани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК по време на нейното амплифициране. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и теоретично начин за откриване дори на една ДНК или РНК молекула в проба.

Системата за откриване на продукти от полимеразна верижна реакция в реално време (мониторинг на PCR) позволява цикъл след цикъл за наблюдение на натрупването на амплифицирана ДНК. Системата включва също олигонуклеотидна сонда, която е способна да се прикрепи (хибридизира) към вътрешния сегмент на целевата ДНК. В 5 'края сондата е маркирана с флуоресцентно репортерно багрило, а в 3' края с гасително багрило. Тъй като PCR продуктът се натрупва, сондата се хибридизира с него, но не възниква луминесценция поради близостта между репортера и блокера. В резултат на копиране на последователността, полимеразата достига 5 'края на сондата. 5'-3'-екзонуклеазната активност на полимеразата отделя флуоресцентния етикет от 3'-края на пробата, като по този начин освобождава флуоресцентния репортер от връзката му със сигналния блокер, което води до увеличаване на флуоресценцията. Следователно нивото на флуоресценция е пропорционално на количеството на специфичния реакционен продукт. Важно е резултатите от PCR да се записват от наличието на флуоресценция в затворени епруветки и по този начин се решава един от основните проблеми на този метод - проблемът със замърсяването с ампликони.

Предимства на PCR: бърз анализ; висока чувствителност и специфичност; минималното количество изпитван материал; простота в изпълнението и възможност за пълна автоматизация.

Поради факта, че чувствителността на PCR може да достигне до откриването на едно копие на ДНК матрицата, съществува висока степен на риск от получаване на фалшиво положителни резултати. Следователно лабораторията за генетична диагностика, когато настройва PCR, трябва непрекъснато да спазва специалните изисквания за оформлението и режима на работа.

PCR е един от допълващите се методи, съществуващи във вирусологичната диагностика. Тази реакция е много важна за диагностицирането на вирусни инфекции, когато вирусни антигени или вирус-специфични антитела не могат да бъдат открити и когато наличието на вирусна нуклеинова киселина може да бъде единственото доказателство за инфекция, особено при латентни и смесени инфекции.

Ако откриете грешка, моля, изберете част от текста и натиснете Ctrl + Enter.

Получи Нобелова награда.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване и охлаждане, беше необходимо да се добави ДНК полимераза към реакционната смес, тъй като тя беше инактивирана при високата температура, необходима за разделяне на нишките на ДНК спиралата. Реакционната процедура беше сравнително неефективна, изискваше много време и ензим. През 1986 г. методът на полимеразна верижна реакция е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Установено е, че тези ензими са термично стабилни и са в състояние да издържат на множество реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи кръстен Taq-полимераза. Недостатъкът на тази полимераза е, че вероятността от въвеждане на грешен нуклеотид в нея е доста висока, тъй като този ензим няма механизми за корекция на грешки (3 "→ 5" екзонуклеазна активност). Полимераза Пфуи Pwoизолирани от археите притежават такъв механизъм, тяхното използване значително намалява броя на мутациите в ДНК, но скоростта на тяхната работа (обработваемост) е по -ниска от тази на Taq... Сега се използват смеси Taqи Пфуза постигане както на висока скорост на полимеризация, така и на висока точност на копиране.

По време на изобретението на метода Кери Мълис работи като синтетичен химик (синтезира олигонуклеотиди, които след това се използват за откриване на точкови мутации чрез хибридизация с геномна ДНК) в Cetus Corporation, която патентова PCR метода. През 1992 г. Cetus продава правата върху метода и патента за употреба Taq-полимераза от Hoffman-La Roche за 300 милиона долара. Оказа се обаче, че Taq-полимеразата се характеризира от съветските биохимици А. Каледин, А. Слюсаренко и С. Городецки през 1980 г., а също и 4 години преди това съветско издание, тоест през 1976 г., от американските биохимици Алис Чиен, Дейвид Б. Едгар и Джон М. .Трела. В резултат на това Promega се опита да съди Roche, за да се откаже от изключителните си права върху ензима. Американският патент за PCR метода изтече през март 2005 г.

Извършване на PCR

Методът се основава на многократно селективно копиране на специфична ДНК област, използвайки ензими при изкуствени условия ( инвитро). В този случай се копира само секцията, която отговаря на посочените условия, и само ако присъства в извадката, която се изследва. За разлика от амплификацията на ДНК в живите организми (репликация), относително късите участъци от ДНК се амплифицират с помощта на PCR. При конвенционален PCR процес дължината на копираните ДНК области е не повече от 3000 двойки основи (3 kbp). Използвайки смес от различни полимерази, използвайки добавки и при определени условия, дължината на PCR фрагмента може да достигне 20-40 хиляди базови двойки. Това все още е значително по -малко от дължината на хромозомната ДНК на еукариотна клетка. Например, човешкият геном се състои от приблизително 3 милиарда базови двойки.

Реакционни компоненти

За да се извърши PCR в най -простия случай, са необходими следните компоненти:

  • ДНК матрицасъдържаща частта от ДНК, която искате да амплифицирате.
  • Два грундакомплементарни към противоположните краища на различни нишки на желания фрагмент от ДНК.
  • Термостабилен ДНК полимераза- ензим, който катализира реакцията на полимеризация на ДНК. Полимеразата за използване в PCR трябва да запази активността си при висока температура за дълго време, поради което се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus(Taq полимераза), Pyrococcus furiosus(Pfu полимераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полимераза) и други.
  • Дезоксирибонуклеозидни трифосфати(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Mg 2+ йони, необходими за работата на полимеразата.
  • Буферен разтворосигуряване на необходимите условия на реакция - рН, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, говежди серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя висококипящо масло, например вазелин. Това не се изисква, ако се използва термичен цикъл с нагрят капак.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива от PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към нарастващата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

Грундове

Специфичността на PCR се основава на образуването на комплементарни комплекси между матрицата и праймерите, къси синтетични олигонуклеотиди с дължина 18-30 основи. Всеки от праймерите е допълващ една от нишките на двуверижния шаблон и ограничава началото и края на амплифицираната област.

След хибридизация на шаблона с праймера (отгряване), последният служи като праймер за ДНК полимераза в синтеза на комплементарната верига на шаблона (виж).

Най-важната характеристика на грундовете е температурата на топене (T m) на комплекса грунд-шаблон.

T m е температурата, при която половината от ДНК шаблоните образуват комплекс с олигонуклеотидния праймер. Средната формула за изчисляване на Т m за къс олигонуклеотид (и за дълги ДНК фрагменти), като се вземе предвид концентрацията на К + и DMSO йони:

където L е броят на нуклеотидите в праймера, K + е моларната концентрация на калиеви йони, G + C е сумата от всички гуанини и цитозини.

В случай на неправилен избор на дължината и нуклеотидния състав на праймера или температурата на отгряване е възможно образуването на частично комплементарни комплекси с други области на матричната ДНК, което може да доведе до появата на неспецифични продукти. Горната граница на точката на топене е ограничена от оптималната температура на действието на полимеразата, чиято активност намалява при температури над 80 ° C.

При избора на грундове е препоръчително да се придържате към следните критерии:

Усилвател

Ориз. 1: Усилвател за PCR

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и загряване на тръбите, обикновено с точност най -малко 0,1 ° C. Съвременните усилватели ви позволяват да задавате сложни програми, включително с възможност за "горещ старт", PCR за докосване (вижте по -долу) и последващо съхранение на усилените молекули при 4 ° C. За PCR в реално време се произвеждат устройства, оборудвани с флуоресцентен детектор. Има и инструменти с автоматичен капак и отделение за микроплаки за интегриране в автоматизирани системи.

Напредък на реакцията

Снимка на гел, съдържащ маркерна ДНК (първи и последен слот) и PCR продукти

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20-35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа (фиг. 2).

Денатурация

Двуверижният ДНК шаблон се нагрява до 94-96 ° C (или 98 ° C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0.5-2 минути, за да се позволи разделянето на нишките на ДНК. Този етап се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между две нишки на ДНК са унищожени. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимераза), реакционната смес се загрява предварително за 2-3 минути, за да се денатурира напълно шаблона и грундовете. Тази техника се нарича горещ старт, тя ви позволява да намалите количеството на неспецифичните продукти на реакцията.

Отгряване

Когато нишките се разпръснат, температурата се понижава, така че праймерите да могат да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване... Температурата на отгряване зависи от състава на грундовете и обикновено се избира равна на температурата на топене на грундовете. Неправилният избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на грундовете с шаблона (при високи температури), или до свързване на грешното място и появата на неспецифични продукти (при ниски температури). Времето на етапа на отгряване е 30 секунди, като в същото време полимеразата вече успява да синтезира няколкостотин нуклеотида. Поради това се препоръчва да се избират грундове с температура на топене над 60 ° C и да се отгряват и удължават едновременно, при 60-72 ° C.

Удължаване

ДНК полимераза репликира нишката на шаблона, използвайки праймер като семе. Това е сцената удължаване... Полимеразата започва синтеза на втората нишка от 3 "края на праймера, който е свързан с шаблона, и се движи по шаблона, синтезирайки нова нишка в посоката от края на 5" до 3 ". Температурата на удължаване зависи от полимеразата. 72 ° C. Времето за удължаване зависи както от вида на ДНК полимеразата, така и от дължината на амплифицирания фрагмент. Обикновено времето за удължаване се приема равно на една минута на всеки хиляда базови двойки. След края на всички цикли , често се извършва допълнителна стъпка окончателно удължаванеза завършване на всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 7-10 минути.

Ориз. 2: Схематично представяне на първия цикъл на PCR. (1) Денатурация при 94-96 ° C. (2) Отгорен при 68 ° C (например). (3) Удължаване при 72 ° C (P = полимераза). (4) Завърши първия цикъл. Двете получени ДНК вериги служат като шаблон за следващия цикъл, така че количеството на матричната ДНК се удвоява по време на всеки цикъл.

Количеството на специфичен реакционен продукт (ограничен от праймери) теоретично се увеличава пропорционално на 2 n - 2n, където n е броят на реакционните цикли. Всъщност ефективността на всеки цикъл може да бъде по -малка от 100%, следователно в действителност P ~ (1 + E) n, където P е количеството продукт, E е средната ефективност на цикъла.

Броят на „дългите“ ДНК копия също нараства, но линейно, така че специфичен фрагмент доминира в продуктите на реакцията.

Нарастването на необходимия продукт е експоненциално ограничено от количеството реактиви, наличието на инхибитори и образуването на странични продукти. В последните цикли на реакция растежът се забавя, това се нарича "ефект на плато".

Разновидности на PCR

  • Вложен PCR(Вложен PCR) - използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използват се две двойки праймери и се провеждат две последователни реакции. Втора двойка праймери усилва участък от ДНК в продукта на първата реакция.
  • Инвертиран PCR(Обратна PCR (инж.)) - използва се, когато е известен само малък участък в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За да се извърши обърната PCR, се извършва серия от ДНК разфасовки с рестрикционни ензими, последвано от съединяване на фрагменти (лигиране). В резултат на това в двата края на неизвестната област се появяват известни фрагменти, след което PCR може да се извърши както обикновено.
  • PCR с обратна транскрипция(PCR с обратна транскрипция, RT -PCR (eng.)) - използва се за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от библиотека на РНК. Преди конвенционалната PCR, едноверижна ДНК молекула се синтезира върху иРНК шаблона, използвайки обратна транскриптаза и се получава едноверижна сДНК, която се използва като матрица за PCR. Този метод често се използва за определяне къде и кога се експресират тези гени.
  • Асиметрична PCR(англ. Асиметрична PCR) - се извършва, когато е необходимо да се амплифицира главно една от нишките на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за анализ на секвениране и хибридизация. PCR се провежда както обикновено, с изключение на това, че един от праймерите се взема в голям излишък. Модификацията на този метод е на английски език. L в ухо-А след- T той- E xponential-PCR (LATE-PCR), който използва праймери с различни концентрации и праймер с ниска концентрация е съчетан с по-висока (точка на топене) от праймер с висока концентрация. PCR се провежда при висока температура на отгряване, като по този начин се поддържа ефективността на реакцията през всички цикли.
  • Количествена PCR(Количествена PCR, Q-PCR) или PCR в реално време- се използва за директно наблюдение на измерването на количеството на специфичен PCR продукт във всеки цикъл на реакцията. Този метод използва флуоресцентно маркирани праймери или ДНК сонди за точно измерване на количеството на реакционния продукт при натрупването му; или се използва флуоресцентно интеркалиращо багрило Sybr зелен iкойто се свързва с двуверижна ДНК. Sybr зелен iпредоставя проста и рентабилна опция за откриване и количествено определяне на PCR продукти в PCR в реално време без необходимост от специфични флуоресцентни сонди или праймери. По време на усилването, багрилото SYBR Зелено Iе вграден в малкия жлеб на ДНК на PCR продуктите и излъчва флуоресцентен сигнал, който е по -силен от несвързаното багрило, когато се облъчва със син лазер. SYBR Зелено IСъвместим с всички известни в момента PCR устройства в реално време. Максимално усвояване за SYBR Зелено Iе с дължина на вълната 494 nm. В допълнение към основния, спектърът на багрилото съдържа два малки допълнителни максимума на абсорбция - при 290 nm и 380 nm. Максимални емисии за SYBR Зелено Iе на дължина на вълната 521 nm (зелено).
  • Етап PCR(Тъчдаун PCR) - Този подход намалява ефекта от неспецифичното свързване на праймера. Първите цикли се извършват при температура над оптималната температура на отгряване, след което на всеки няколко цикъла температурата на отгряване постепенно се намалява до оптималната. Това се прави така, че грундът да се хибридизира с комплементарната нишка по цялата си дължина; като има предвид, че при оптималната температура на отгряване, грундът частично се хибридизира с комплементарната нишка. Частичната хибридизация на праймер към геномна ДНК води до неспецифична амплификация, ако има достатъчно места за свързване за праймера. В повечето случаи първите десет цикъла на PCR могат да се проведат при температура на отгряване 72-75 ° C и след това незабавно да се намалят до оптималното, например до 60-65 ° C.
  • Метод на молекулярната колония(PCR с гел, инж. Колония - PCR колония) - акриламидният гел се полимеризира с всички PCR компоненти на повърхността и се провежда PCR. В точките, съдържащи анализираната ДНК, се появява амплификация с образуването на молекулни колонии.
  • PCR с бързо амплифициране на краищата на cDNA(англ. Бързо амплифициране на краищата на cDNA, RACE-PCR ).
  • PCR с дълъг фрагмент(англ. PCR с дълъг обхват) - модификация на PCR за амплификация на разширени ДНК области (10 хиляди или повече бази). Използва се смес от две полимерази, едната от които е Taq полимераза с висока обработваемост (тоест способна да синтезира дълга ДНК верига с един проход), а втората е ДНК полимераза с 3 "-5" екзонуклеазна активност, обикновено Pfu полимераза. Втората полимераза е необходима, за да се коригират грешките, въведени от първата, тъй като Taq полимеразата спира синтеза на ДНК, ако е добавен некомплементарен нуклеотид. Този некомплементарен нуклеотид се отстранява чрез Pfu полимераза. Смес от полимерази се взема в съотношение 50: 1 или дори по-малко от 100: 1, където Taq полимеразата се взема 25-100 пъти повече спрямо Pfu полимеразата.
  • RAPD(англ. Случайно усилване на полиморфна ДНК ), PCR със случайно амплифициране на полиморфна ДНК - използва се, когато е необходимо да се разграничат организми, близки по генетична последователност, например, различни сортове култивирани растения, породи кучета или близки сродни микроорганизми. Този метод обикновено използва един малък грунд (около 10 bp). Този праймер ще бъде частично допълващ случайни ДНК области на изследваните организми. Чрез избиране на условията (дължина на праймера, състав, температура и т.н.) е възможно да се постигне задоволителна разлика в PCR модела за два организма.
  • Групово-специфичен PCR(англ. групово-специфичен PCR) - PCR за сродни последователности в рамките на един или между различни видове, като се използват консервативни праймери към тези последователности. Например изборът на универсални праймери за рибозомни 18Sи 26Sгени за амплификация на видово-специфичен интергенен спейсер: генна последователност 18Sи 26Sконсервативни между видовете, поради което PCR между тези гени ще се извършва за всички изследвани видове. Обратното на този метод е - уникална PCR(англ. уникална PCR), в която задачата е да се изберат праймери за амплификация само на определена последователност сред сродни последователности.
  • PCR с горещ старт(англ. PCR с горещ старт) - модификация на PCR с помощта на ДНК полимераза, при която полимеразната активност се блокира при стайна температура от антитела или имитира антитела от малки молекули от типа Affibody, тоест по време на реакцията преди първата денатурация в PCR. Обикновено първата денатурация се извършва при 95 ° C за 10 минути.
  • Виртуална PCR(Английски in silico PCR, цифров PCR, електронен PCR, e-PCR) е математически метод за компютърен анализ на теоретична полимеразна верижна реакция, използващ списък от праймерни последователности (или ДНК сонди) за прогнозиране на потенциална ДНК амплификация на генома, хромозомата , кръгова ДНК или друго парче ДНК.

Ако нуклеотидната последователност на шаблона е частична или изобщо неизвестна, можете да използвате дегенерирани грундове, чиято последователност съдържа дегенерирани позиции, в които могат да бъдат разположени всякакви бази. Например, последователност на грунд може да бъде: ... АТХ ..., където H е A, T или C.

PCR приложение

PCR се използва в много области за анализ и научни експерименти.

Съдебна медицина

PCR се използва за сравняване на така наречените „генетични отпечатъци“. Изисква се проба от генетичния материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, косми и др. Сравнява се с генетичния материал на заподозрения. Много малко количество ДНК е достатъчно, теоретично - едно копие. ДНК се разцепва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят чрез ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен отпечатък(англ. генетичен отпечатък).

Установяване на бащинство

Ориз. 3: Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. (1) Баща. (2) Дете. (3) Майка. Детето наследи някои от чертите на генетичния отпечатък и на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че „генетичните отпечатъци“ са уникални (с изключение на случаите на еднояйчни близнаци), семейните връзки все още могат да бъдат установени, като се направят няколко такива отпечатъка (фиг. 3). Същият метод може да се приложи, с леки изменения, за установяване на еволюционно родство между организмите.

Медицинска диагностика

PCR дава възможност значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Желаният ген се амплифицира чрез PCR с помощта на подходящи праймери и след това се секвенира за откриване на мутации. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Понякога лекарствата са токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент определен цитохром (чернодробен протеин, отговорен за метаболизма на чужди вещества) може да бъде по -активен, при друг по -малко. За да се определи какъв цитохром притежава даден пациент, беше предложено да се извърши PCR анализ преди употреба на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране (англ. бъдещо генотипиране).

Клониране на гени

Клонирането на гени (да не се бърка с клониращи организми) е процесът на изолиране на гени и в резултат на манипулации на генното инженерство получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква в вектор- ДНК фрагмент, който прехвърля чужд ген в същия или друг, удобен за отглеждане организъм. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукта на този ген - РНК или по -често протеин. По този начин много протеини се получават в промишлени количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

Ориз. 4: Клониране на ген с помощта на плазмид.
(1) Хромозомна ДНК на организъм А. (2) PCR. (3) Много копия на гена на организъм А. (4) Вмъкване на гена в плазмида. (5) Плазмид с гена на организъм А. (6) Въвеждане на плазмида в организъм В. (7) Умножаване на броя на копията на гена на организъм А в организъм В.

ДНК секвениране

В метода на секвениране, използващ флуоресцентно маркирани или радиоактивни изотопни дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията нуклеотидните производни, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, са включени в ДНК веригата. Прикрепването на дидезоксинуклеотид към синтезираната верига води до прекратяване на синтеза, което прави възможно определянето на положението на специфични нуклеотиди след разделяне в гела.

Мутагенеза

Понастоящем PCR се превърна в основен метод за провеждане на мутагенеза (извършване на промени в нуклеотидната последователност на ДНК). Използването на PCR направи възможно да се опрости и ускори процедурата за провеждане на мутагенеза, както и да се направи по -надеждна и възпроизводима.

Полимеразната верижна реакция (PCR) е високо прецизен метод за диагностициране на наследствени патологии, инфекции, вирусни заболявания на всеки етап (остър или хроничен), както и - на ранен етап - преди очевидни прояви на заболяването чрез идентифициране на патогени въз основа на тяхната ДНК, РНК, които са генетичен материал, в проби, получени от пациент. И днес ще говорим за същността, диагностичните етапи и принципите на методите на полимеразна верижна реакция (PCR), както и за нейната цена.

Какво е полимеразна верижна реакция

Основата на анализа е амплификация (удвояване) - създаването на много копия от кратко парче ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина), което представлява човешкия генетичен комплекс. Изследването изисква много малко количество физиологично вещество (храчки, изпражнения, изстъргване на епитела, простатен сок, кръв, сперма, околоплодни води, слуз, плацентарна тъкан, урина, слюнка, плеврална течност, цереброспинална течност). В този случай, например, в урогениталния тракт на пациент е възможно да се открие дори един -единствен вреден микроб.

Методът на PCR (полимеразна верижна реакция) е разработен от американския учен К. Мулис, който получава Нобелова награда през 1993 г.

Активно се използва:

  • при ранна диагностика на инфекции, генетични ,;
  • при съдебно -медицинска експертиза при наличие на изключително малко количество ДНК за изследване;
  • във ветеринарната медицина, фармацевтиката, биологията, молекулярната генетика;
  • за идентификация на лице по ДНК, потвърждение на бащинство;
  • в палеонтология, антропология, екология (при наблюдение на качеството на продуктите, фактори на околната среда).

Това видео ще ви разкаже подробно какво е полимеразна верижна реакция:

На кого е възложено?

Полимеразната верижна реакция при диагностицирането на инфекциозни заболявания е един от най -надеждните методи с особена точност и надеждност. Например, надеждността на PCR анализа за хламидия и много други патогени е близо 100% (абсолютна). Най -често процедурата с полимеразна верижна реакция се предписва на пациенти, които при диагностициране имат затруднения при идентифицирането на специфичен патоген.

Използва се лабораторен PCR тест:

  • за откриване на патогени, причиняващи инфекция на пикочните и гениталните органи, които са трудни за идентифициране при използване на култури или методи на имунология;
  • да се диагностицира отново ХИВ в началния етап в случай на положителен, но съмнителен резултат от първоначалния тест (например при новородени от заразени със СПИН родители);
  • за установяване на онкологично заболяване на ранен етап (изследване на мутации на онкогени) и индивидуална корекция на схемата на лечение при конкретен пациент;
  • с цел ранно откриване и потенциално лечение на наследствени патологии.

Така че бъдещите родители правят анализ, за ​​да разберат дали са носители на генетична патология, при децата PCR определя вероятността от податливост към заболяване, което се наследява.

  • за откриване на фетални патологии в ранен гестационен период (отделни клетки на растящ ембрион се изследват за възможни мутации);
  • при пациенти преди органна трансплантация - за "тъканно типизиране" (определяне на тъканна съвместимост);
  • да идентифицира опасни патогенни организми в дарена кръв;
  • при новородени бебета - за откриване на скрити инфекции;
  • за оценка на резултатите от антивирусно и антимикробно лечение.

Защо да минете през такава процедура

Тъй като PCR е високоефективен диагностичен метод, който дава почти 100% от резултата, се използва процедурата:

  • за потвърждаване или изключване на окончателната диагноза;
  • бърза оценка на ефективността на терапията.

В много случаи PCR е единственият възможен тест за откриване на развиващо се заболяване, ако други бактериологични, имунологични и вирусологични диагностични методи са безполезни.

  • Вирусите се откриват чрез PCR веднага след заразяването и преди да се появят признаци на заболяване. Ранното откриване на вируса позволява бързо лечение.
  • Така нареченият "вирусен товар" (или - броят на вирусите в организма) също се определя чрез ДНК анализ по количествен метод.
  • Специфични патогени (напр. Туберкулозен бацил на Кох) са трудни и отнемат твърде много време за култивиране. PCR анализът ви позволява бързо да идентифицирате минималния брой патогени (живи и мъртви) в проби, които са удобни за тестване.

Използва се подробен ДНК анализ на патогена:

  • да се определи неговата чувствителност към специфични видове антибиотици, което ви позволява незабавно да започнете лечението;
  • за контрол на разпространението на епидемии сред домашни, диви животни;
  • за идентифициране и проследяване на нови инфекциозни микробни видове и подтипове патогени, предизвикали предишни епидемии.

Видове диагностика

Стандартен метод

Анализът на полимеразна верижна реакция се извършва въз основа на множествена амплификация (удвояване) на специфичен фрагмент от ДНК и РНК, като се използват специални праймерни ензими. В резултат на копиращата верига се получава достатъчно материал за изследване.

По време на процедурата се копира само желаният фрагмент (съответстващ на посочените специфични условия) и ако той действително присъства в пробата.

Как работи PCR е описано в този подробен видеоклип с полезни диаграми:

Други методи

  • PCR в реално време... В този тип изследвания процесът на идентифициране на даден фрагмент от ДНК започва след преминаване на всеки цикъл, а не след като цялата верига е завършена за 30-40 цикъла. Този тип изследвания ви позволяват да получите информация за количеството на патоген (вирус или микроб) в тялото, тоест да извършите количествен анализ.
  • RT-PCR (режим на обратна транскрипция)... Този анализ се използва за намиране на РНК с една верига за откриване на вируси, чиято генетична основа е именно РНК (например вирус на хепатит С, вирус на имунодефицит). При такова изследване се използва специален ензим - обратна транскриптаза и специфичен праймер, а на базата на РНК се изгражда едноверижна ДНК. След това втората ДНК верига се възстановява от тази верига и се извършва стандартната процедура.

Показания за

Процедурата PCR се използва в клиниката по инфекциозни заболявания, неонатология, акушерство, педиатрия, урология, гинекология, венерология, неврология, нефрология, офталмология.

Показания за целите на анализа:

  • установяване на риска от развитие на генетични аномалии при дете с вероятност от наследствени патологии;
  • диагностика на двамата родители при планиране на бременност или тежкото състояние на майката по време на бременността;
  • трудности при зачеването, идентифициране на причините за безплодие;
  • съмнение за генитални инфекции в острия стадий и със симптоми на преминаването им към хронично;
  • откриване на причините за възпалителни процеси с неизвестен произход;
  • случаен и повтарящ секс без защита;
  • определяне на чувствителността на патогенен микроорганизъм към специфични антибиотици;
  • пациенти със съмнение за латентна инфекция за откриване на патогени преди да се проявят явни симптоми (предклинична диагноза);
  • пациенти за потвърждаване на възстановяването след заболяване (ретроспективна диагноза);

Диагностиката се използва и когато е необходимо точно да се идентифицират следните патогени:

  • вируси на хепатит (A B C G), вируси на човешка имунна недостатъчност, цитомегаловирус;
  • холера вибрион;
  • херпес симплекс вирус, херпетиформен вид;
  • ретро - адено - и риновируси;
  • вируси на рубеола, вируси на Epstein -Barr, варицела (Zoster - вирус);
  • парво - и пикорновируси;
  • бактерията Helicobacter pylori;
  • легионела, патогенни видове коли;
  • Стафилококус ауреус;
  • патоген;
  • клостридии, дифтерия и хемофилус инфлуенца;

Използва се и за идентифициране на инфекции:

  • Инфекциозна мононуклеоза;
  • борелиоза, листериоза, енцефалит, пренасян от кърлежи;
  • кандидоза, причинена от гъбички Candida;
  • генитални инфекции - трихомониаза, уреаплазмоза, бледа трепонема, гарднерелоза, гонорея, микоплазмоза, хламидия;
  • туберкулоза.

Противопоказания за

Тъй като процедурата се провежда не с пациента, без никакъв ефект върху организма, а с биологичния материал, взет за изследване, няма противопоказания за PCR поради липсата на потенциална опасност.

Вземането на проби от биоматериал от цервикалния канал на матката обаче не се извършва след процедурата на колпоскопия. Доставката на цитонамазки, остъргвания за анализ е разрешена само 4-6 дни след края на менструацията и пълното прекратяване на изхвърлянето.

Безопасен ли е методът

Не е невъзможно отрицателно въздействие върху пациента по време на изолирано изследване на неговия биоматериал в лабораторни условия.

Подготовка за процедурата (доставка на биологични вещества за анализ)

Като проба за PCR анализ, в която се открива ДНК на чужд патоген, служат всяка биологична течност, тъкан, секрети от тялото. Вземането на проби от изпитваното вещество се извършва под формата на вземане на кръв от вена, изстъргване от ларинкса, носната кухина, уретрата, плевралната кухина, шийката на матката.

Преди диагностичната процедура лекарят обяснява на пациента какъв материал ще бъде взет:

  1. При изследване за генитални инфекции се взема секрет от гениталиите, урина, намазка от уретрата.
  2. Когато се анализират за херпесни инфекции, цитомегаловирус, мононуклеоза - те вземат урина за анализ, намазка от гърлото, за хепатит, токсоплазмоза - кръв от вена.
  3. За да се диагностицират различни видове, се взема цереброспинална течност.
  4. В пулмологията пробите за анализ са храчки и плеврална течност.
  5. Когато се провежда изследване на възможни вътрематочни инфекции, докато се носи плод, за анализ се използват околоплодни води и плацентарни клетки.

Надеждността и точността на анализа зависи от стерилността на условията при вземане на материала. Тъй като PCR изследването е силно чувствително, всяко замърсяване на изпитваното вещество може да изкриви резултата.

Компетентната подготовка за доставка на биоматериал не създава никакви трудности за пациентите. Има някои препоръки:

  • при анализ за генитални инфекции:
    • изключете интимните контакти 72 часа преди доставката на материала;
    • спрете да използвате вагинални продукти 3 дни предварително;
    • от вечерта на предходния ден не извършвайте хигиена на изследваната зона;
    • изключете уринирането за 3 до 4 часа, когато вземате проба от уретрата;
  • спрете приема на антибиотици един месец преди да се тествате за инфекции;
  • кръвта се дарява сутрин преди ядене и пиене;
  • събирането на първата сутрешна порция урина се извършва в стерилен контейнер след задълбочена интимна тоалетна.

Прочетете за това как диагностиката с помощта на техниката на полимеразна верижна реакция се извършва по -долу.

Как протича процедурата

При извършване на PCR изследване, отново и отново в реактора (усилвател или термичен цикъл), се повтарят определени цикли:

  1. Първата стъпка е денатурация... Слюнка, кръв, биопсия, гинекологични проби, храчки, в които се подозира наличието на ДНК (или РНК) на патогена, се поставят в усилвател, където материалът се нагрява и ДНК се разделя на две отделни нишки.
  2. Втората стъпка е отгряване или леко охлаждане на материалаи добавяне на праймери към него, които са способни да разпознават и да се свързват с желаните области в молекулата на ДНК.
  3. Третата стъпка е удължаването- възниква след прикрепянето на 2 праймера към всяка от нишките на ДНК. По време на процеса се завършва фрагмент от ДНК на патогена и се формира копие.

Тези цикли се повтарят в тип "верижна реакция", като всеки път води до дублиране на копия на специфичен ДНК фрагмент (например сегмент, в който е програмиран определен вирус). В рамките на няколко часа се образуват множество копия на ДНК фрагмента и се открива тяхното присъствие в пробата. След това се извършва анализ и сравнение на резултатите с данните от базата данни за различни видове патогени, за да се определи вида на инфекцията.

Прочетете за интерпретацията на резултатите и заключението въз основа на PCR реакцията по -долу.

Декодиране на резултатите

Крайният резултат от изследването се издава 1 - 2 дни след доставката на биологичния материал. Често - вече в първия ден след анализа.

Качествен анализ

  • Отрицателнорезултатът означава, че в веществото, представено за изследване, не са открити следи от инфекциозни агенти.
  • Положителенрезултатът означава откриване на патогенни вируси или бактерии в биологична проба с много висока степен на точност по време на доставката.

Ако резултатът е положителен, но няма признаци за активиране на инфекцията, това състояние на тялото се нарича асимптоматичен „здрав носител“. Най -често се наблюдава при вземане на биоматериал от определено място (цервикален канал, уретра, устна кухина) при вирусни заболявания. Лечението в този случай не се изисква, но е задължителен постоянен медицински контрол, тъй като има възможност:

  • разпространение на вируса от носители и заразяване на здрави хора;
  • активиране на процеса и преминаване на болестта в хронична форма.

Ако обаче кръвен тест е положителен, това показва, че инфекцията е ударила тялото и това вече не е състояние на носител, а патология, която изисква незабавна специфична терапия.

Количествен анализ

Количественият резултат се определя от специалист специално за определен вид инфекция. Въз основа на това е възможно да се оцени степента на развитие, стадия на заболяването, което прави възможно своевременното предписване на правилното лечение.

средна цена

Цените за провеждане на полимеразна верижна реакция се определят от: вида на изследването, сложността на идентифицирането на патогена, трудността при събирането на биологичен материал, вида на анализа (качествен или количествен), нивото на цените в лабораторията.

От друга страна, при изследването на PCR, няколко патогени могат да бъдат идентифицирани едновременно при вземане на един вид материал за анализ. Това спестява други лабораторни анализи.

Приблизително цената на PCR анализа в рубли:

  • гонокок, гарднерела, Trichomonas vaginalis - от 180
  • chlamydia trachomatis - от 190г
  • папиломен вирус - от 380 до 500
  • биоценоза на урогениталния тракт при жените (количествена и качествена оценка на микрофлората) - от 800.

За още по -полезна информация относно PCR тестването вижте видеото по -долу:

Генетиката на бактериите. Информация за втория урок.

Полимеразна верижна реакция

Полимеразната верижна реакция е метод, който позволява многократно увеличаване (амплифициране) на броя на определени ДНК молекули в анализираната проба (включително биологичен материал или чиста култура).

Основните предимства на PCR като диагностичен метод в микробиологията са неговата много висока чувствителност, която позволява откриването на изключително ниски концентрации на патогени в пробите, както и регулируема специфичност, която позволява откриването или идентифицирането на патогени при генерични, видове или подвидово ниво. Основният недостатък на PCR произтича от изключително високата му чувствителност - изображенията са много лесни за заразяване на ДНК от положителна контрола, друга проба или продукт от PCR, което води до фалшиво положителна реакция. Това налага сериозни ограничения върху условията, при които се извършва смесване на PCR и работа с готови PCR продукти.

Извършване на PCR.Приготвя се реакционна смес, съдържаща следните компоненти:

    Извлечена ДНК от тестовата проба,

    Буферен разтвор,

    Йони Mg2 + (необходими, за да работи ензимът),

    Два праймера са едноверижни къси ДНК молекули (най-често с дължина от 18 до 24 нуклеотида), допълващи краищата на различни нишки от откритата ДНК последователност.

    Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати.

    Топлоустойчива ДНК полимераза (най -често се използва Taq полимераза - полимераза, изолирана от Термус aquaticus).

След това тази реакционна смес се поставя във фурна, която всъщност е програмируем термостат. Термоциклерът извършва 30-40 цикъла на смяна на температурата. Всеки от тези цикли се състои от три етапа (виж фиг. 1):

    Денатурация (температура 94 ° С) - водородните вериги са скъсани, а ДНК веригите се разминават.

    Отгряване на праймери (температурата обикновено е в района на 50-60 ° С) - праймери са прикрепени към краищата на ДНК вериги. Като цяло, с понижаване на температурата, обединяването на оригиналните нишки на ДНК от изследваната проба (ренатурация) е енергийно по -благоприятно; обаче, концентрацията на праймери в реакционната смес е с много порядъци по -висока от концентрацията на ДНК от пробата (поне в началните PCR цикли), следователно реакцията на отгряване на праймера протича по -бързо от ренатурацията. Температурата на отгряване се избира в зависимост от температурите на топене (денатурация) на грундовете.

    Удължаване (температурата обикновено е 72 ° C) - ДНК полимеразата завършва праймери по шаблона на дълги нишки на ДНК. Температурата съответства на оптималната работна температура на използваната ДНК полимераза.

Откриването на резултатите се различава при различните варианти на PCR стадиране и е описано в раздела "PCR сортове".

PCR динамика

В ранните цикли на PCR броят на двуверижните ДНК молекули, чийто размер се определя от разстоянието между местата за кацане на праймера, се удвоява с всеки цикъл. Той също така произвежда малко количество по -дълги молекули на ДНК, които могат да бъдат пренебрегнати (виж Фигура 2).

Така в ранните цикли количеството на PCR продукта се описва с формулата m * 2 n, където m е първоначалното количество на желаната ДНК в пробата, n е броят на циклите. Тогава реакцията достига плато. Това се дължи на натрупването на реакционния продукт, намаляване на концентрацията на праймери и дезоксинуклеотидни трифосфати, а също и на увеличаване на концентрацията на пирофосфат (виж фиг. 3).

Разновидности на PCR

Конвенционална PCR

В този вариант на настройка на PCR реакцията протича за предварително избран брой цикли (30-40), след което се анализира дали е натрупано натрупване на двуверижни ДНК молекули в реакционната смес.

Този вариант на производство на PCR, когато се използва като диагностичен метод, е качествен метод. Положителната реакция показва наличието на поне следи от желаните молекули на ДНК в пробата. Отрицателната реакция показва тяхното отсъствие. Количествена оценка на съдържанието на първоначалните молекули на ДНК в пробата е невъзможна, тъй като реакцията достига плато.

Основният метод за откриване на присъствието на продукт е електрофореза с агарозен или полиакриламиден гел. Продуктите от PCR се разделят в гела под действието на електрическо поле в съответствие с тяхното молекулно тегло. Към гела се добавя интеркалиращо багрило (флуоресцентно в състояние, свързано с двуверижна ДНК - най -често етидиев бромид). По този начин, когато се облъчва с ултравиолетова светлина, ще бъде възможно да се види наличието или отсъствието на лента, съответстваща на ДНК с необходимото молекулно тегло. Когато PCR се извършва за диагностични цели, винаги се поставят положителни и отрицателни контролни реакции, спрямо които се сравняват пробите (виж фиг. 4).

PCR в реално време

В този вариант на PCR настройка, количеството PCR продукт в реакционната смес се записва постоянно по време на реакцията. Това дава възможност да се конструира крива на хода на реакцията (виж фиг. 3) и въз основа на нея да се изчисли броят на необходимите ДНК молекули в пробите.

Един от видовете PCR в реално време е използването на интеркалиращо багрило, което се добавя директно към реакционната смес (най-често се използва SYBRGreen). Друг тип е използването на един от типовете флуоресцентни сонди, които се свързват със сайт вътре в продукта за PCR, което дава възможност да се увеличи специфичността на откриване (виж фиг. 5). Флуоресценцията се открива директно в устройството по време на реакция.

В допълнение към способността за количествено откриване, има и други предимства на PCR в реално време пред конвенционалната PCR. Тази опция за PCR е по -проста, по -бърза и не изисква отваряне на епруветки с PCR продукти, което намалява вероятността от замърсяване на други проби. Основният недостатък е по-високата цена на термоциклера с вградена способност за откриване на флуоресценция в сравнение с конвенционалния.

Цифрова количествена PCR

Нов, скъп и все още необичаен вариант на PCR, който позволява по -точно определяне на количеството ДНК в проба.В този вариант реакционната смес, съдържаща флуоресцентно багрило, се разбива на огромен брой микроскопични обеми (например капчици в емулсия). След като PCR продължи, се анализира в какъв дял от капчиците реакцията се оказа положителна и съответно се наблюдава флуоресценция. Тази пропорция ще бъде пропорционална на броя на желаните ДНК молекули в пробата.

PCR с обратна транскрипция

В този случай се провежда реакция на обратна транскрипция (РНК в ДНК), използваща ензима за обратна транскрипция, преди един или друг вариант на PCR. По този начин този метод позволява качествено или количествено откриване на молекули на РНК. Това може да се използва за откриване на РНК вируси или за определяне на нивото на транскрипция (количество на тРНК) на определен ген.

Снимка 1.Етапи на PCR. Грундовете са маркирани в червено.

Фигура 2.Натрупване на праймер-ограничени двуверижни ДНК молекули по време на PCR.

Фигура 3.Динамиката на PCR реакцията при различни начални концентрации на желаните ДНК молекули в пробата. (а) - най -висока концентрация (б) - междинна концентрация (в) - най -ниска концентрация

Фигура 4.Агарозна електрофореза на PCR продукти. K + - положителна контрола (известно е, че желаната ДНК присъства). 1-7-тестови проби (от които 1-2 са положителни, 3-7 са отрицателни). K- - отрицателна контрола (желаната ДНК очевидно отсъства). В много случаи, в допълнение към целевия продукт, се виждат по-леки неспецифични продукти на реакцията (праймери-димери).

Фигура 5.Методи за откриване, използващи PCR в реално време. а) - интеркалиращо багрило - флуоресцира при свързване с двуверижна ДНК (c) - Sole MolecularBeacon - флуоресценцията възниква по време на хибридизация на сондата с целевия фрагмент поради пространственото разстояние на флуорофора и гасителя (d) - LightCycler сонди - акцепторна флуоресценция възниква по време на хибридизацията на сондите (съдържаща акцептор и донор ) с целевия фрагмент поради резонансен пренос на флуорна енергия (FRET).

Зареждане ...Зареждане ...