Djelovanje citokina na ćelije vrši se putem. Citokini. Molekularni i ćelijski mehanizmi antivirusnog imuniteta, obrasci razvoja i imunopatoza

Donedavno je rak stadijuma 4 bio smrtna kazna za pacijenta. Tradicionalne metode liječenja bile su od male pomoći; sva terapija bila je ograničena na ublažavanje simptoma. Međutim, prije nekoliko desetljeća počeli su aktivno razvijati imuno -onkologiju, a posebno terapiju citokinima - metodu liječenja lijekovima na bazi tjelesnih proteina, koja je, prema recenzijama, vrlo učinkovita. Klinika za onkoimunologiju i terapiju citokina u Moskvi smatra se jednom od najboljih u svijetu po svojim pozitivnim pokazateljima.

Šta je citokinoterapija?

Ova metoda liječenja razvijena je na bazi imuno-onkologije - odjela onkologije koji proučava funkcionisanje imunološkog sistema kod raka. Metoda se temelji na liječenju raka i drugih bolesti lijekovima na bazi proteina (citokina) ljudskog tijela. Pod određenim uslovima mogu uništiti razne patogene: strane ćelije, viruse, antigene, endotoksine itd. Kako citokini djeluju:

aktiviranje imunološkog odgovora tijela na napad patogena;
kontrola rada imunološkog sistema, ćelija ubica (elemenata koji se direktno bore protiv bolesti);
izazivanje obnavljanja ćelijske mase do zdrave;
normalizacija tjelesnih sistema.

Pozitivna akcija

Dodavanje rada sa citokinima u kompleksnom liječenju onkologije pomaže u postizanju apsolutno pozitivne terapije kod 10-30% pacijenata, a djelomični uspjeh dostiže 90%. Možda se čini da to nije dovoljno, ali za teške kancerogene tumore u posljednjim fazama ovo je veliko postignuće. Štoviše, tehnika se može i treba kombinirati s tradicionalnim metodama (lijekovi, kemoterapija).

Citokinska terapija djeluje efikasno i precizno protiv tumora, metastaza i pritom nema toksično djelovanje na organizam. Odvojeno, vrijedi napomenuti pozitivan porast kvalitete kemoterapije. Tehnika je već dokazala svoju učinkovitost u kliničkim ispitivanjima (u Ruskoj Federaciji je više od 50 patologija različitih tipova dozvoljeno za liječenje ovom tehnikom). Osim onkoloških bolesti, terapija citokinima uspješno se bori i protiv drugih patologija:

onkologija do stadijuma 4;
virusni hepatitis B, C;
melanom;
Kaposijev sarkom na pozadini HIV-a;
AIDS i HIV;
SARS, gripa, bakterijske crijevne i rotavirusne infekcije;
tuberkuloza;
šindre;
shizofrenija;
multipla skleroza.

Onkoimunologija i citokinoterapija

Zapravo, svi maligni tumori s teškim tokom nastaju u pozadini potisnutog imuniteta. Onkoimunolozi (specijalisti za imuno-onkologiju) razvijaju, na pozadini kliničkih studija, nove metode i lekove za lečenje raka, zasnovane na delovanju imunog sistema. Metoda citokinske terapije zasniva se na upotrebi citokina, specijalnih proteina, a sama tehnika se pojavila 80-ih godina 20. veka. Glavni problem je bila visoka toksičnost lijekova. Moderni lijekovi na bazi citokina imaju 100 puta manju toksičnost.

Funkcije citokina u tijelu

U ljudskom tijelu postoji ogromna količina citokina, svi oni obavljaju različite funkcije. Citokinska terapija koristi ovu raznolikost za liječenje širokog spektra bolesti i za aktiviranje unutrašnjih procesa u tijelu. Dokazano je da se u stvari ljudski sistemi mogu boriti sa bilo kojim problemom. Glavna stvar je pokrenuti potrebne procese. Funkcije citokina u tijelu:

kontrola trajanja i kvaliteta imunološkog odgovora;
protuupalni citokini kontroliraju upalu;
stimuliranje razvoja autoimunih reakcija (protuupalni i proinflamatorni citokini);
učešće u mehanici alergije;
smanjenje tumora ili njegovo uništenje;
stimulacija ili supresija rasta stanica;
usporavanje razvoja onkologije;
koordinacija imunološkog, endokrinog i nervnog sistema;
prevencija recidiva tumora;
održavanje homeostaze (zdrave postojanosti) organizma.

Broj proučavanih proteina citokina već je premašio 200 naziva. Interakcije citokina su složene s različitim funkcijama. U početku se dijele prema vrsti djelatnosti. Pojednostavljena klasifikacija pretpostavlja podjelu prema biološkom efektu: regulatori upale (protuupalni i proinflamatorni citokini), regulacija ćelijskog imuniteta i podjela humoralne imunosti. Preciznija sistematizacija razlaže proteine prema prirodi njihovog djelovanja. Vrste citokina:

regulatori imunološke aktivnosti (interleukini i njihove biološke funkcije osiguravaju ispravnu interakciju imuniteta sa drugim sistemima tijela);
antivirusni regulatori - interferoni;
TNF (faktori tumorske nekroze) - regulatorni ili toksični efekti na ćelije;
hemokini - kontrola kretanja svih vrsta leukocita, drugih ćelija;
faktori rasta - kontrola rasta ćelija;
faktori koji stimulišu kolonije - stimulišu razvoj hematopoetskih ćelija.

Citokini kao lijekovi

Ingaron je citokinsko terapeutsko sredstvo za pojačavanje efekta kemoterapije, a istovremeno štiti organizam od toksičnih efekata. Osim toga, smanjuje moguću pojavu metastaza i tumora. Lijek Ingaron izaziva razvoj imuniteta, koji nakon kemoterapije neće dopustiti razvoj zaraznih bolesti, smanjit će potrebu za antibakterijskim lijekovima. Alat ima minimalnu toksičnost u usporedbi sa zapadnim kolegama.

Lijek Refnot je usmjeren na ograničavanje razvoja neoplazmi zbog TNF citokina u sastavu. Sredstvo također ima kvalitativno smanjenu toksičnost, što mu omogućuje potkožno ili intravenozno davanje, stimulira uništavanje malignih tumora bez utjecaja na prateća tkiva. Za određivanje dinamike liječenja potrebna su 1-2 kursa. Za postizanje maksimalnog učinka oba lijeka se koriste u kombinaciji za aktiviranje potrebnih citokina u onkologiji.

Nuspojave

Liječenje citokinima može izazvati negativne efekte ovisno o morfologiji bolesti, općem stanju bolesnika i kombinaciji lijekova. U većini slučajeva nuspojave ne predstavljaju opasnost za pacijenta, već ukazuju na reakciju tumora na lijek. Kada se pojave sekundarne reakcije, tijek terapije se obustavlja ili se prilagođava režim liječenja. Moguće negativne manifestacije na tijelu:

povećanje tjelesne temperature za 2-3 stepena 4-6 sati nakon uvođenja citokina;
bol i crvenilo na mjestu uboda;
trovanje tijela proizvodima raspadanja tumora (u slučaju velike formacije).

Za koga metoda citokinske terapije nije prikladna

Lijekovi na bazi citokina praktički nemaju kontraindikacije i mogu se koristiti za svakog pacijenta. Međutim, kao i kod drugih lijekova, postoji određeni broj pacijenata kojima se ne preporučuje korištenje ove metode liječenja. Ne koristiti citokinsku terapiju za trudnice, tokom dojenja, u prisustvu autoimunih bolesti, rijetke lične alergije organizma na lijekove.

Cijena citokinske terapije

Učinkovita upotreba citokinskih lijekova postiže se u specijaliziranim centrima (na primjer, Centar za onkoimunologiju i terapiju citokinima u Moskvi najbolja je klinika po mišljenju spašenih pacijenata). Cijena ove vrste liječenja uvelike varira ovisno o vrsti lijeka koji se koristi i specifičnoj bolesti. Približne cijene nekih citokinskih lijekova u Moskvi.

Ovo poglavlje će razmotriti integrisani pristup procjeni citokinskog sistema korištenjem prethodno opisanih savremenih istraživačkih metoda.

Prvo, izlažemo osnovne koncepte citokinskog sistema.

Citokini se trenutno smatraju proteinsko-peptidnim molekulima koje proizvode različite ćelije tijela i provode međućelijske i međusistemske interakcije. Citokini su univerzalni regulatori životnog ciklusa ćelija, kontrolišu procese diferencijacije, proliferacije, funkcionalne aktivacije i apoptoze potonjih.

Citokini koje proizvode ćelije imunog sistema nazivaju se imunocitokini; oni su klasa rastvorljivih peptidnih medijatora imunog sistema neophodnih za njegov razvoj, funkcionisanje i interakciju sa drugim sistemima tela (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kao regulatorni molekuli, citokini igraju važnu ulogu u reakcijama urođenog i adaptivnog imuniteta, osiguravaju njihovu međusobnu povezanost, kontroliraju hematopoezu, upalu, zacjeljivanje rana, stvaranje novih krvnih žila (angiogeneza) i mnoge druge vitalne procese.

Trenutno postoji nekoliko različitih klasifikacija citokina, uzimajući u obzir njihovu strukturu, funkcionalnu aktivnost, porijeklo, vrstu citokinskih receptora. Tradicionalno, u skladu s biološkim učincima, uobičajeno je razlikovati sljedeće skupine citokina.

1. Interleukini(IL-1-IL-33) su sekretorni regulatorni proteini imunološkog sistema koji pružaju posredničke interakcije u imunološkom sistemu i njegovu vezu sa drugim sistemima u tijelu. Interleukini se prema svojoj funkcionalnoj aktivnosti dijele na pro- i protuupalne citokine, faktore rasta limfocita, regulatorne citokine itd.

3. Faktori tumorske nekroze (TNF)- citokini sa citotoksičnim i regulatornim djelovanjem: TNFa i limfotoksini (LT).

4. Faktori rasta hematopoetskih ćelija- faktor rasta matičnih ćelija (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetin, trobopoetin, faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga - GM-CSF, granulocitni CSF - G-CSF, makrofag -

ny KSF - M-KSF).

5. Hemokini- S, CC, SHS (IL-8), SH3S - regulatori hemotakse različitih tipova ćelija.

6. Faktori rasta nelimfoidnih ćelija- regulatori rasta, diferencijacije i funkcionalne aktivnosti ćelija različitog tkiva (faktor rasta fibroblasta - FGF, faktor rasta endotelnih ćelija, faktor rasta epiderme - EGF epidermisa) i transformacioni faktori rasta (TGFβ, TGFα).

Između ostalog, posljednjih godina, aktivno se proučava faktor koji inhibira migraciju makrofaga (migration inhibiting factor - MIF), koji se smatra neurohormonom s citokinskom i enzimskom aktivnošću (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Citokini se razlikuju po strukturi, biološkoj aktivnosti i drugim svojstvima. Međutim, uz razlike, citokini imaju opšta svojstva, karakteristično za ovu klasu bioregulatornih molekula.

1. Citokini su, po pravilu, glikozilovani polipeptidi srednje molekularne težine (manje od 30 kD).

2. Citokine proizvode ćelije imunološkog sistema i druge ćelije (na primjer, endotel, fibroblasti, itd.) kao odgovor na aktivirajući stimulus (molekularne strukture povezane s patogenom, antigeni, citokini, itd.) i učestvuju u reakcijama. urođenog i adaptivnog imuniteta, regulišući njihovu snagu i trajanje. Neki citokini se sintetiziraju konstitutivno.

3. Lučenje citokina je kratkotrajan proces. Citokini se ne pohranjuju kao prethodno formirani molekuli, već kao njihovi

sinteza uvijek počinje transkripcijom gena. Ćelije proizvode citokine u niskim koncentracijama (pikogrami po mililitru).

4. U većini slučajeva, citokini se proizvode i djeluju na ciljne ćelije u neposrednoj blizini (djelovanje kratkog dometa). Glavno mjesto djelovanja citokina je međustanična sinapsa.

5. Redundantnost Sistem citokina se manifestuje u činjenici da je svaka vrsta ćelije sposobna da proizvede nekoliko citokina, a svaki citokin mogu lučiti različite ćelije.

6. Sve citokine karakteriše pleiotropija, ili polifunkcionalnost radnje. Dakle, manifestacija znakova upale je posljedica utjecaja IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Dupliranje funkcija osigurava pouzdanost citokinskog sistema.

7. Djelovanje citokina na ciljne stanice je posredovano visoko specifičnim membranskim receptorima visokog afiniteta, koji su transmembranski glikoproteini, koji se obično sastoje od više od jedne podjedinice. Ekstracelularni dio receptora odgovoran je za vezivanje citokina. Postoje receptori koji eliminiraju višak citokina u patološkom žarištu. To su takozvani trap receptori. Topljivi receptori su ekstracelularni domen membranskog receptora, odvojen enzimom. Topljivi receptori mogu neutralizirati citokine, sudjelovati u njihovom transportu do žarišta upale i njihovom izlučivanju iz tijela.

8. Citokini rade na principu mreže. Oni mogu djelovati zajedno. Čini se da su mnoge funkcije koje se u početku pripisuju jednom citokinu posredovane usklađenim djelovanjem nekoliko citokina. (sinergija akcije). Primjeri sinergističkih interakcija citokina su stimulacija upalnih reakcija (IL-1, IL-6 i TNF-a), kao i sinteza IgE

(IL-4, IL-5 i IL-13).

Neki citokini induciraju sintezu drugih citokina (kaskada). Kaskadno djelovanje citokina neophodno je za razvoj upalnih i imunoloških odgovora. Sposobnost nekih citokina da pojačaju ili oslabe proizvodnju drugih određuje važne pozitivne i negativne regulatorne mehanizme.

Poznato je antagonističko djelovanje citokina, na primjer, proizvodnja IL-6 kao odgovor na povećanje koncentracije TNFα može biti

negativan regulatorni mehanizam za kontrolu proizvodnje ovog medijatora tijekom upale.

Citokinska regulacija funkcija ciljnih stanica provodi se pomoću autokrinih, parakrinih ili endokrinih mehanizama. Neki citokini (IL-1, IL-6, TNFα, itd.) su u stanju da učestvuju u implementaciji svih navedenih mehanizama.

Odgovor ćelije na uticaj citokina zavisi od nekoliko faktora:

Od vrste ćelija i njihove početne funkcionalne aktivnosti;

Od lokalne koncentracije citokina;

Od prisustva drugih molekula posrednika.

Dakle, ćelije proizvođači, citokini i njihovi specifični receptori na ciljnim ćelijama formiraju jedinstvenu mrežu medijatora. To je skup regulatornih peptida, a ne pojedinačnih citokina, koji određuju konačni odgovor ćelije. Trenutno se citokinski sistem smatra univerzalnim sistemom regulacije na nivou cijelog organizma, koji osigurava razvoj zaštitnih reakcija (na primjer, tokom infekcije).

Posljednjih godina pojavila se ideja o citokinskom sistemu koji kombinira:

1) ćelije proizvođača;

2) rastvorljivi citokini i njihovi antagonisti;

3) ciljne ćelije i njihovi receptori (slika 7.1).

Poremećaji različitih komponenti citokinskog sistema dovode do razvoja brojnih patoloških procesa, pa je identifikacija nedostataka u ovom regulatornom sistemu važna za ispravnu dijagnozu i određivanje adekvatne terapije.

Prvo ćemo razmotriti glavne komponente citokinskog sistema.

Ćelije koje proizvode citokine

I. Glavna grupa ćelija koje proizvode citokine u adaptivnom imunološkom odgovoru su limfociti. Ćelije u mirovanju ne luče citokine. Uz prepoznavanje antigena i uz sudjelovanje receptorskih interakcija (CD28-CD80 / 86 za T-limfocite i CD40-CD40L za B-limfocite), dolazi do aktivacije stanica, što dovodi do transkripcije gena citokina, translacije i sekrecije glikoziliranih peptida u međustanične svemir.

Rice. 7.1. Citokinski sistem

CD4 T-pomagači su predstavljeni subpopulacijama: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, koje se razlikuju po spektru izlučenih citokina kao odgovor na različite antigene.

Th0 proizvodi širok spektar citokina u vrlo niskim koncentracijama.

Smjer diferencijacije Th0 određuje razvoj dva oblika imunog odgovora sa prevlašću humoralnih ili ćelijskih mehanizama.

Priroda antigena, njegova koncentracija, lokalizacija u ćeliji, tip ćelija koje predstavljaju antigen i određeni skup citokina regulišu pravac diferencijacije Th0.

Nakon hvatanja i obrade antigena, dendritične ćelije predstavljaju antigene peptide Th0 ćelijama i proizvode citokine koji regulišu pravac njihove diferencijacije u efektorske ćelije. Uloga pojedinačnih citokina u ovom procesu prikazana je na Sl. 7.2. IL-12 indukuje sintezu IFNγ od strane T-limfocita i] HGC. IFNu osigurava diferencijaciju Th1, koji počinju lučiti citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, limfotoksini), koji reguliraju razvoj reakcija na unutarstanične patogene

(preosjetljivost odgođenog tipa (HRT) i različite vrste stanične citotoksičnosti).

IL-4 osigurava diferencijaciju Th0 u Th2. Aktivirani Th2 proizvodi citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, itd.), koji određuju proliferaciju B-limfocita, njihovu dalju diferencijaciju u plazma ćelije i razvoj odgovora antitijela, uglavnom na ekstracelularni patogeni.

IFNu negativno reguliše funkciju Th2 ćelija i, obrnuto, IL-4, IL-10 koje luči Th2 inhibiraju Th1 funkciju (slika 7.3). Molekularni mehanizam ove regulacije povezan je sa faktorima transkripcije. Ekspresija T-bet i STAT4, određena IFNy, usmjerava diferencijaciju T ćelija duž Th1 puta i potiskuje razvoj Th2. IL-4 indukuje ekspresiju GATA-3 i STAT6, koji, respektivno, osiguravaju konverziju naivnih THO u Th2 ćelije (slika 7.2).

Poslednjih godina opisana je posebna subpopulacija pomoćnih T ćelija (Th17) koje proizvode IL-17. Članovi porodice IL-17 mogu biti eksprimirani aktiviranim memorijskim ćelijama (CD4CD45RO), y5T ćelijama, NKT ćelijama, neutrofilima, monocitima pod uticajem IL-23, IL-6, TGFβ koje proizvode makrofagi i dendritske ćelije. Glavni faktor diferencijacije kod ljudi je ROR-C, kod miševa - ROR-γ l Pokazana je kardinalna uloga IL-17 u razvoju kronične upale i autoimune patologije (vidi sliku 7.2).

Osim toga, T-limfociti u timusu mogu se diferencirati u prirodne regulatorne ćelije (Treg) koje eksprimiraju površinske markere CD4 + CD25 + i transkripcijski faktor FOXP3. Ove ćelije mogu potisnuti imunološki odgovor posredovane Th1 i Th2 stanicama direktnim međućelijskim kontaktom i sintezom TGFβ i IL-10.

Šeme diferencijacije za Th0 klonove i citokine koje oni luče prikazane su na Sl. 7.2 i 7.3 (vidi i umetak u boji).

T-citotoksične ćelije (CD8+), prirodne ćelije ubice su slabi proizvođači citokina kao što su interferoni, TNF-a i limfotoksini.

Prekomjerna aktivacija jedne od Th subpopulacija može odrediti razvoj jedne od varijanti imunološkog odgovora. Hronični disbalans aktivacije Th može dovesti do formiranja imunopatoloških stanja povezanih sa ispoljavanjem

alergije, autoimuna patologija, kronični upalni procesi itd.

Rice. 7.2. Različite subpopulacije T-limfocita koji proizvode citokine

II. U sistemu urođenog imuniteta, glavni proizvođači citokina su mijeloične ćelije. Uz pomoć Toll-like receptora (TLR) prepoznaju slične molekularne strukture različitih patogena, takozvane molekularne obrasce povezane s patogenom (RAMP), na primjer, lipopolisaharid (LPS) gram-negativnih bakterija, lipoteihoične kiseline, peptidoglikani gram-pozitivnih mikroorganizama, flagelin, DNK bogata G ponavljanjima, itd. Kao rezultat

Ova interakcija sa TLR-om pokreće kaskadu intracelularne signalne transdukcije koja vodi do ekspresije gena dve glavne grupe citokina: proinflamatornih i IFN tipa 1 (slika 7.4, vidi i umetnutu boju). Uglavnom, ovi citokini (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, hemokini, itd.) izazivaju razvoj upale i učestvuju u zaštiti organizma od bakterijskih i virusnih infekcija.

Rice. 7.3. Spektar citokina koje luče TH1 i TH2 ćelije

III. Ćelije koje ne pripadaju imunološkom sistemu (ćelije vezivnog tkiva, epitela, endotela) konstitutivno luče autokrine faktore rasta (FGF, EGF, TGFR, itd.). i citokini koji podržavaju proliferaciju hematopoetskih ćelija.

Citokini i njihovi antagonisti su detaljno opisani u brojnim monografijama (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Rice. 7.4. TLR posredovana indukcija proizvodnje citokina od strane urođenih imunoloških stanica

Prekomjerna ekspresija citokina je nesigurna za tijelo i može dovesti do razvoja pretjeranog inflamatornog odgovora, odgovora akutne faze. Razni inhibitori su uključeni u regulaciju proizvodnje proinflamatornih citokina. Tako je opisan niz supstanci koje nespecifično vezuju citokin IL-1 i sprečavaju ispoljavanje njegovog biološkog delovanja (a2-makroglobulin, C3-komponenta komplementa, uromodulin). Specifični inhibitori IL-1 uključuju rastvorljive receptore za mamce, antitela i antagonist IL-1 receptora (IL-1RA). S razvojem upale dolazi do povećanja ekspresije gena IL-1RA. Ali čak i normalno, ovaj antagonist je prisutan u krvi u visokoj koncentraciji (do 1 ng/ml ili više), blokirajući djelovanje endogenog IL-1.

Ciljane ćelije

Djelovanje citokina na ciljne stanice posredovano je specifičnim receptorima koji vežu citokine s vrlo visokim afinitetom, a pojedini citokini mogu koristiti

zajedničke receptorske podjedinice. Svaki citokin se vezuje za svoj specifični receptor.

Citokinski receptori su transmembranski proteini i podijeljeni su u 5 glavnih tipova. Najčešći je takozvani hematopoetinski tip receptora, koji ima dva izvanstanična domena, od kojih jedan sadrži zajednički niz aminokiselinskih ostataka dva ponavljanja triptofana i serina, odvojenih bilo kojom aminokiselinom (WSXWS motiv). Drugi tip receptora može imati dva ekstracelularna domena sa velikim brojem konzerviranih cisteina. To su receptori iz porodice IL-10 i IFN. Treći tip predstavljaju citokinski receptori koji pripadaju TNF grupi. Četvrti tip receptora citokina pripada natporodici receptora imunoglobulina, koji imaju izvanstanične domene koje su strukturno slične domenama molekula imunoglobulina. Peti tip receptora koji vezuje molekule iz porodice hemokina predstavljaju transmembranski proteini koji prelaze ćelijsku membranu na 7 mesta. Citokinski receptori mogu postojati u rastvorljivom obliku, zadržavajući sposobnost vezivanja liganada (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokini su u stanju da utiču na proliferaciju, diferencijaciju, funkcionalnu aktivnost i apoptozu ciljnih ćelija (videti sliku 7.1). Manifestacija biološke aktivnosti citokina u ciljnim ćelijama zavisi od učešća različitih intracelularnih sistema u prenosu signala sa receptora, što je povezano sa karakteristikama ciljnih ćelija. Signal za apoptozu se, između ostalog, sprovodi uz pomoć specifičnog regiona porodice TNF receptora, takozvanog domena “smrti” (slika 7.5, vidi umetak u boji). Diferencijacijski i aktivirajući signali se prenose kroz intracelularne Jak-STAT proteine - pretvarače signala i aktivatore transkripcije (slika 7.6, vidi umetak u boji). G-proteini su uključeni u signalizaciju hemokina, što dovodi do povećane migracije i adhezije ćelija.

Sveobuhvatna analiza citokinskog sistema uključuje sljedeće.

I. Procjena ćelija proizvođača.

1. Određivanje izraza:

Receptori koji prepoznaju patogen ili antigen TCR, TLR) na nivou gena i proteinskih molekula (PCR, protočna citometrija);

Adapterski molekuli koji provode signal koji pokreće transkripciju citokinskih gena (PCR, itd.);

Rice. 7.5. Prijenos signala sa TNF receptora

Rice. 7.6. Jak -STAT - signalni put od receptora citokina tipa 1

Citokinski geni (PCR); proteinski molekuli citokina (procjena funkcije sintetiziranja citokina u ljudskim mononuklearnim stanicama).

2. Kvantifikacija subpopulacija ćelija koje sadrže određene citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda intracelularnog bojenja citokina); određivanje broja ćelija koje luče određene citokine (ELISPOT metoda, vidi poglavlje 4).

II. Evaluacija citokina i njihovih antagonista u biološkim medijima tijela.

1. Testiranje biološke aktivnosti citokina.

2. Kvantifikacija citokina pomoću ELISA -e.

3. Imunohistohemijsko bojenje citokina u tkivima.

4. Određivanje omjera suprotstavljenih citokina (pro- i antiinflamatornih), citokina i antagonista citokinskih receptora.

III. Evaluacija ciljnih ćelija.

1. Određivanje ekspresije citokinskih receptora na nivou gena i proteinskih molekula (PCR, protočna citometrija).

2. Određivanje signalnih molekula u intracelularnom sadržaju.

3. Određivanje funkcionalne aktivnosti ciljnih ćelija.

Trenutno su razvijene brojne metode za procjenu citokinskog sistema koje pružaju različite informacije. Među njima se razlikuju:

1) molekularne biološke metode;

2) metode za kvantitativno određivanje citokina imunotestom;

3) ispitivanje biološke aktivnosti citokina;

4) intracelularno bojenje citokina;

5) ELISPOT metoda, koja omogućava detekciju citokina oko jedne ćelije koja proizvodi citokine;

6) imunofluorescencija.

Evo kratkog opisa ovih metoda.

Korišćenjem molekularne biološke metode moguće je proučavati ekspresiju gena citokina, njihovih receptora, signalnih molekula, proučavati polimorfizam ovih gena. Posljednjih godina proveden je veliki broj studija koje su otkrile povezanost između varijanti alela gena molekula citokinskog sistema i predispozicije.

na niz bolesti. Proučavanje alelnih varijanti citokinskih gena može pružiti informacije o genetski programiranoj proizvodnji određenog citokina. Najosjetljivija je lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu - RT-PCR (vidi Poglavlje 6). Metoda hibridizacije in situ omogućava da se razjasni tkivna i ćelijska lokalizacija ekspresije gena citokina.

Kvantitativno određivanje citokina u biološkim tečnostima i u kulturama mononuklearnih ćelija periferne krvi pomoću ELISA može se okarakterisati na sledeći način. Budući da su citokini lokalni medijatori, prikladnije je mjeriti njihov nivo u odgovarajućim tkivima nakon ekstrakcije tkivnih proteina ili u prirodnim tečnostima, na primjer, u suzama, ispiranju iz šupljina, urinu, amnionskoj tekućini, cerebrospinalnoj tekućini itd. Nivoi citokina u serumu ili drugim tjelesnim tečnostima odražavaju trenutno stanje imunog sistema, tj. sinteza citokina u ćelijama tijela in vivo.

Određivanje nivoa proizvodnje citokina mononuklearnim ćelijama periferne krvi (MNC) pokazuje funkcionalno stanje ćelija. Spontana proizvodnja MNC citokina u kulturi ukazuje na to da su ćelije već aktivirane in vivo. Sinteza citokina inducirana (različitim stimulansima, mitogenima) odražava potencijalnu rezervnu sposobnost stanica da odgovore na antigenski podražaj (posebno na djelovanje lijekova). Smanjena indukovana proizvodnja citokina može poslužiti kao jedan od znakova stanja imunodeficijencije. Citokini nisu specifični za određeni antigen. Stoga je nemoguća specifična dijagnoza infektivnih, autoimunih i alergijskih bolesti određivanjem nivoa određenih citokina. Istovremeno, procjena nivoa citokina omogućava dobijanje podataka o težini upalnog procesa, njegovom prelasku na sistemski nivo i prognozi, funkcionalnoj aktivnosti ćelija imunog sistema, odnosu Th1 i Th2 ćelija, koji vrlo je važan u diferencijalnoj dijagnozi niza infektivnih i imunopatoloških procesa.

U biološkim medijima, citokini se mogu kvantificirati korištenjem raznih metode imunotestiranja, korištenjem poliklonskih i monoklonskih antitijela (vidi Poglavlje 4). ELISA vam omogućava da saznate koje su točne koncentracije citokina u bio-

logičke telesne tečnosti. Enzimski imunosorbentni test citokina ima niz prednosti u odnosu na druge metode (visoka osetljivost, specifičnost, nezavisnost od prisustva antagonista, mogućnost preciznog automatizovanog obračuna, standardizacija računovodstva). Međutim, ova metoda ima i svoja ograničenja: ELISA ne karakterizira biološku aktivnost citokina, može dati lažne rezultate zbog unakrsne reakcije epitopa.

Biološka ispitivanja provodi se na osnovu poznavanja osnovnih svojstava citokina, njihovog djelovanja na ciljne stanice. Proučavanje bioloških efekata citokina omogućilo je razvoj četiri tipa testiranja citokina:

1) indukcijom proliferacije ciljnih ćelija;

2) citotoksičnim dejstvom;

3) indukcijom diferencijacije progenitora koštane srži;

4) za antivirusno djelovanje.

IL-1 je određen stimulirajućim djelovanjem na proliferaciju mišjih timocita aktiviranih mitogenom in vitro; IL-2 - sposobnošću da stimuliše proliferativnu aktivnost limfoblasta; TNFα i limfotoksini su testirani na citotoksično djelovanje na fibroblaste miša (L929). Faktori koji stimulišu kolonije se procenjuju zbog njihove sposobnosti da podrže rast progenitora koštane srži u obliku kolonija u agaru. Antivirusna aktivnost IFN-a je otkrivena inhibicijom citopatskog djelovanja virusa u kulturi humanih diploidnih fibroblasta i tumorske linije fibroblasta miševa L-929.

Stvorene su ćelijske linije čiji rast zavisi od prisustva određenih citokina. Table 7.1 je lista ćelijskih linija koje se koriste za testiranje citokina. Prema sposobnosti induciranja proliferacije osjetljivih ciljnih stanica, vrši se biotestiranje IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 itd. Međutim, ove metode ispitivanja karakteriziraju nedovoljna osjetljivost i sadržaj informacija. Molekuli inhibitora i antagonista mogu prikriti biološku aktivnost citokina. Nekoliko citokina pokazuje opću biološku aktivnost. Ipak, ove metode su idealne za ispitivanje specifične aktivnosti rekombinantnih citokina.

Tabela 7.1.Ćelijske linije koje se koriste za testiranje biološke aktivnosti citokina

Kraj stola. 7.1

Lab 7-1

Određivanje biološke aktivnosti IL-1 komitogenim učinkom na proliferaciju timocita miša

Metoda biološkog testiranja IL-1 zasniva se na sposobnosti citokina da stimuliše proliferaciju mišjih timocita.

IL-1 se može odrediti u kulturi monocita stimuliranih LPS-om, kao i u bilo kojoj biološkoj tekućini u tijelu. Potrebno je obratiti pažnju na niz detalja.

1. Za testiranje se koriste timociti C3H/HeJ miševa stimuliranih na proliferaciju mitogenima (konkanavalin A - ConA i fitohemaglutinin - PHA). Timociti C3H/HeJ nisu slučajno odabrani: miševi ove inbred linije ne reaguju na LPS, koji može biti prisutan u test materijalu i uzrokovati proizvodnju IL-1.

2. Timociti reaguju na IL-2 i mitogene, stoga, prisustvo IL-2 i mitogena takođe treba utvrditi u preparatima testiranim na IL-1.

Operativni postupak

1. Dobiti suspenziju timocita u koncentraciji 12 × 10 6 / ml medijuma RPMI 1640 koji sadrži 10% seruma embriona krava i 2-merkaptoetanol (5 × 10 -5 M).

2. Pripremite seriju uzastopnih dvostrukih razblaženja eksperimentalnih (bioloških telesnih tečnosti) i kontrolnih uzoraka. Biološke tečnosti koje sadrže IL-1 ili uzorci dobijeni inkubacijom mononuklearnih ćelija bez LPS-a i laboratorijski standardni preparati koji sadrže IL-1 koriste se kao kontrole. U pločama sa okruglim dnom sa 96 jažica, 50 μl se prenosi iz svakog razblaživanja u 6 jažica.

3. U tri jažice svakog razblaženja dodati 50 μl prečišćenog PHA (Welcome) rastvorenog u kompletnoj podlozi u koncentraciji od 3 μg/ml, au ostale 3 jažice - 50 μl medijuma.

4. Dodajte 50 μl suspenzije timocita u svaku jažicu i inkubirajte 48 sati na 37 °C.

6. Pre kraja kultivacije, 50 μl rastvora (1 μCi / ml) ["3 H]-timidina se dodaje u jažice i inkubira još 20 sati.

7. Da bi se odredio nivo radioaktivnosti, ćelije kulture se prenose na filter papir pomoću automatskog sakupljača ćelija, filteri se suše, a uključivanje etikete se određuje tečnim scintilacionim brojačem.

8. Rezultati se izražavaju kao faktor stimulacije.

gdje je m cp prosječan broj impulsa u 3 rupe.

Ako timociti reaguju na stimulaciju sa standardnim IL-1, onda indeks stimulacije testnog uzorka koji prelazi 3 pouzdano ukazuje na aktivnost IL-1.

Biotest je jedina metoda za procjenu funkcije citokina, ali ova metoda mora biti dopunjena različitim tipovima odgovarajuće kontrole za specifičnost korištenjem monoklonskih antitijela. Dodavanje određenih monoklonskih antitijela citokinu u kulturu blokira biološku aktivnost citokina, što dokazuje da otkriveni citokin služi kao signal za proliferaciju ćelijske linije.

Korištenje biotesta za otkrivanje interferona. Princip procene biološke aktivnosti IFN-a zasniva se na njegovom antivirusnom efektu, koji je određen stepenom inhibicije umnožavanja test virusa u ćelijskoj kulturi.

U radu se mogu koristiti ćelije osetljive na dejstvo IFN-a: prvenstveno tripsinizovane ćelije fibroblasta pilećih i ljudskih embriona, transplantirane ćelije humanih diploidnih fibroblasta i kultura ćelija miša (L929).

Prilikom procjene antivirusnog učinka IFN-a, preporučljivo je koristiti viruse s kratkim ciklusom reprodukcije, visokom osjetljivošću na djelovanje IFN-a: virus mišjeg encefalomijelitisa, mišji vezikularni stomatitis itd.

Lab 7-2

Određivanje aktivnosti interferona

1. Suspenzija diploidnih fibroblasta ljudskog fetusa na mediju sa 10% seruma goveđih embrija (koncentracija ćelija - 15-20 × 10 6 / ml) se sipa u sterilne ploče ravnog dna sa 96 jažica, 100 μl po jažici i stavljen u CO 2 inkubator na temperaturi od 37°C.

2. Nakon formiranja potpunog monosloja, medij za rast se uklanja iz jažica i u svaku jažicu se dodaje 100 µl podloge.

3. Titracija aktivnosti IFN-a u ispitnim uzorcima provodi se metodom dvostrukog razrjeđenja na monosloju fibroblasta.

Istovremeno s uzorcima, virus encefalomijelitisa miša (VEM) unosi se u jažice u dozi koja uzrokuje 100% oštećenje stanica 48 sati nakon infekcije.

4. Za kontrolu koristite jažice sa intaktnim (netretiranim) ćelijama inficiranim virusom.

U svakoj studiji, referentni uzorci IFN sa poznatom aktivnošću se koriste kao referentni lijekovi.

5. Ploče sa razblaženim uzorkom inkubiraju se 24 h na 37°C u atmosferi sa 5% CO2.

6. Nivo aktivnosti IFN-a je određen recipročnom vrijednosti maksimalnog razrjeđenja test uzorka, koji inhibira citopatsko djelovanje virusa za 50%, a izražava se u jedinicama aktivnosti po ml.

7. Da bi se odredio tip IFN, u sistem se dodaje antiserum protiv IFNα, IFNβ ili IFNγ. Antiserum poništava djelovanje odgovarajućeg citokina, što omogućava identifikaciju tipa IFN-a.

Određivanje biološke aktivnosti migracije inhibicionog faktora. Trenutno su se formirale potpuno nove ideje o prirodi i svojstvima MITA, koji je otkriven 60 -ih godina prošlog stoljeća kao posrednik staničnog imuniteta i dugi niz godina ostao je bez dužne pažnje (Bloom BR, Bennet B., 1966 David JR, 1966.). Tek u posljednjih 10-15 godina postalo je jasno: MIT je jedan od najvažnijih bioloških medijatora u tijelu sa širokim spektrom bioloških funkcija citokina, hormona i enzima. Djelovanje MITA na ciljne stanice ostvaruje se putem receptora CD74 ili neklasičnim putem endocitoze.

MIT se smatra važnim medijatorom upale, aktiviranjem funkcije makrofaga (proizvodnja citokina, fagocitoza, citotoksičnost, itd.), kao i endogenim imunoregulatornim hormonom koji modulira aktivnost glukokortikoida.

Akumulira se sve više informacija o ulozi MIF-a u patogenezi mnogih upalnih bolesti, uključujući sepsu, reumatoidni artritis (RA), glomerulonefritis itd. Kod RA je koncentracija MIF-a u tekućini zahvaćenih zglobova značajno povećana, što je u korelaciji sa težinom bolesti. Pod uticajem MIT-a povećava se proizvodnja proinflamatornih citokina od strane makrofaga i sinovijalnih ćelija.

Poznate su različite metode za ispitivanje aktivnosti MIF-a, kada se migrirajuće ćelije (ciljne ćelije za MIF) stavljaju u staklenu kapilaru (kapilarni test), u kap agaroze ili u agaroznu jažicu.

Predstavljamo relativno jednostavnu metodu skrininga koja se temelji na formiranju staničnih mikrokultura (leukocita ili makrofaga) standardnih po površini i broju stanica na dnu jažica ploče sa 96 dna s ravnim dnom, nakon čega slijedi njihovo uzgoj u hranjivom mediju i utvrđivanje promjene područja ovih mikrokultura pod djelovanjem MIF-a (Suslov A.P., 1989).

Laboratorija 7-3

Definicija aktivnosti MIT-a

Određivanje biološke aktivnosti MIF vrši se pomoću uređaja za formiranje ćelijskih mikrokultura (slika 7.7) - MIGROSKRIN (Istraživački institut za epidemiologiju i mikrobiologiju NF Gamaleya RAMS).

1. U jažice ploče sa 96 jažica (Flow, UK ili slično) dodajte 100 μl uzorka razrijeđenog u mediju kulture, u kojem je određena aktivnost MYTH (svako razrjeđivanje u 4 paralele, eksperimentalni uzorci). Medij za kulturu sadrži RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 5% fetalnog goveđeg seruma, 40 μg / ml gentamicina.

2. Dodajte medijum za kulturu (u 4 paralele) u kontrolne jažice, po 100 µl.

3. Pripremite ćelijsku suspenziju peritonealnih makrofaga, za koju se 2 hibridna miša (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitonealno ubrizgava 10 ml Hanks rastvora sa heparinom (10 U / ml), lagano masirajte stomak 2-3 minuta. Zatim se životinja zakolje dekapitacijom, trbušni zid se pažljivo probuši u području prepona i eksudat se isiše kroz iglu štrcaljkom. Ćelije peritonealnog eksudata se dva puta isperu Hanksovim rastvorom, centrifugiraju 10-15 minuta na 200 g. Zatim se priprema ćelijska suspenzija sa koncentracijom od 10 ± 1 milion/ml medijuma RPMI 1640. Brojanje se vrši u komori Goryaev.

4. Sastavite MIGROSKRIN sistem, koji je stalak za usmjerenu i standardnu fiksaciju vrhova sa ćelijskim kulturama u strogo vertikalnom položaju na zadatoj visini iznad središta jažice ploče za kulturu sa 96 jažica, a uključuje i 92 vrha za automatska pipeta iz Costara, SAD (slika 7.7).

Umetnite noge stativa u uglove ploče. Suspenzija ćelija se uzima automatskom pipetom u vrhove - po 5 μl, ispere se od viška ćelija jednim potapanjem u medijum i ubacuje se vertikalno u utičnice sistemskog stalka. Napunjeni stalak sa vrhovima drži se na sobnoj temperaturi 1 sat na strogo horizontalnoj površini. Za to vrijeme, ćelije suspenzije se talože na dno jažica, gdje se formiraju standardne ćelijske mikrokulture.

5. Stalak za vrh se pažljivo uklanja sa ploče. Ploča sa mikrokulturom ćelija stavlja se u striktno horizontalan položaj u CO 2 inkubator, gde se kultiviše 20 sati.U toku kultivacije ćelije migriraju po dnu bunara.

6. Kvantitativno obračunavanje rezultata nakon inkubacije vrši se na binokularnom povećalu, vizualno procjenjujući veličinu kolonije na skali unutar okulara. Mikrokulture su kružne. Istraživači zatim određuju prosječni prečnik kolonije iz mjerenja kolonija u 4 testna ili kontrolna bunara. Greška mjerenja je ± 1 mm.

Indeks migracije (MI) izračunava se po formuli:

Uzorak ima MYTH-aktivnost ako su MI vrijednosti jednake

Za konvencionalnu jedinicu (U) MITSKE aktivnosti uzima se recipročna vrijednost jednaka vrijednosti najvećeg razrjeđenja uzorka (uzorka), pri čemu je indeks migracije 0,6 ± 0,2.

Biološka aktivnost FEOα se procjenjuje prema njegovom citotoksičnom djelovanju na liniju transformiranih fibroblasta L-929. Kao pozitivna kontrola korišćen je rekombinantni TNFα, a kao negativna kontrola korišćene su ćelije u medijumu kulture.

Izračunajte citotoksični indeks (CI):

gdje a- broj živih ćelija u kontroli; b- broj živih ćelija u eksperimentu.

Rice. 7.7. Shema MIGROSKRIN - Uređaji za kvantificiranje migracije staničnih kultura

Ćelije su obojene bojom (metilen plavo), koja je ugrađena samo u mrtve ćelije.

Vrijednost recipročnog razblaženja uzorka potrebnog za postizanje 50% ćelijske citotoksičnosti uzima se kao konvencionalna jedinica aktivnosti TNF-a. Specifična aktivnost uzorka - omjer aktivnosti u proizvoljnim jedinicama po 1 ml prema koncentraciji proteina sadržanog u uzorku.

Intracelularno bojenje citokina. Promjena omjera stanica koje proizvode različite citokine može odražavati patogenezu bolesti i služiti kao kriterij za prognozu bolesti i procjenu terapije.

Metodom intracelularnog bojenja određuje se ekspresija citokina na nivou jedne ćelije. Protočna citometrija vam omogućava da izbrojite broj ćelija koje eksprimiraju određeni citokin.

Nabrojimo glavne faze u određivanju intracelularnih citokina.

Nestimulirane stanice proizvode male količine citokina, koji se u pravilu ne talože, stoga je važna faza u procjeni intracelularnih citokina stimulacija limfocita i blokada oslobađanja ovih produkata iz stanica.

Najčešće korišćeni induktor citokina je aktivator protein kinaze C, forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) u kombinaciji sa jonomicinom kalcijum jonofora (IN). Upotreba takve kombinacije uzrokuje sintezu širokog spektra citokina: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Nedostatak upotrebe PMA-IN je problem detekcije CD4 molekula na površini limfocita nakon takve aktivacije. Takođe, proizvodnju citokina T-limfocitima induciraju mitogeni (PHA). B ćelije i monociti stimulišu

Mononuklearne ćelije inkubiraju se u prisutnosti induktora proizvodnje citokina i blokatora njihovog unutarstaničnog transporta, brefeldina A ili monensina 2-6 sati.

Ćelije se zatim resuspendiraju u puferiranoj fiziološkoj otopini. Za fiksaciju dodajte 2% formaldehida, inkubirajte 10-15 minuta na sobnoj temperaturi.

Zatim se ćelije tretiraju saponinom, koji povećava propusnost ćelijske membrane, i boje se monoklonskim antitijelima specifičnim za otkrivene citokine. Prethodno bojenje površinskih markera (CD4, CD8) povećava količinu dobijenih informacija o ćeliji i omogućava vam da preciznije odredite njen populacijski identitet.

Postoje neka ograničenja u primjeni gore opisanih metoda. Dakle, uz njihovu pomoć, nemoguće je analizirati sintezu citokina u jednoj ćeliji, nemoguće je odrediti broj ćelija koje proizvode citokine u subpopulaciji, nemoguće je utvrditi da li ćelije koje proizvode citokine izražavaju jedinstvene markere, da li različite citokine sintetiziraju različite stanice ili iste. Odgovor na ova pitanja dobija se drugim istraživačkim metodama. Za određivanje učestalosti ćelija koje proizvode citokine u populaciji, koristi se metoda ograničavanja razrjeđenja i varijanta ELISPOT enzimskog imunosorbentnog testa (vidi Poglavlje 4).

Metoda hibridizacije in situ. Metoda uključuje:

2) fiksacija paraformaldehidom;

3) detekcija mRNA korištenjem označene cDNK. U nekim slučajevima, mRNA citokina se određuje na rezovima korištenjem radioizotopa PCR.

Imunofluorescencija. Metoda uključuje:

1) zamrzavanje organa i priprema kriostatskih rezova;

2) fiksacija;

3) obrada preseka anti-citokinskim antitelima obeleženim fluoresceinom;

4) vizuelno posmatranje fluorescencije.

Ove tehnike (hibridizacija in situ i imunofluorescencija) su brzi i ne zavise od graničnih koncentracija izlučenog proizvoda. Međutim, oni ne određuju količinu izlučenih citokina i mogu biti tehnički složeni. Potreban je niz pažljivog praćenja nespecifičnih reakcija.

Koristeći predstavljene metode za procjenu citokina, identifikovani su patološki procesi povezani sa poremećajima u citokinskom sistemu na različitim nivoima.

Stoga je procjena citokinskog sistema izuzetno važna za karakterizaciju stanja imunološkog sistema organizma. Proučavanje različitih nivoa citokinskog sistema daje informacije o funkcionalnoj aktivnosti različitih tipova imunokompetentnih ćelija, o težini upalnog procesa, o njegovom prelasku na sistemski nivo io prognozi bolesti.

Pitanja i zadaci

1. Navedite opšta svojstva citokina.

2. Navedite klasifikaciju citokina.

3. Navedite glavne komponente citokinskog sistema.

4. Navedite ćelije koje proizvode citokine.

5. Opišite porodice citokinskih receptora.

6. Koji su mehanizmi funkcionisanja mreže citokina?

7. Recite nam nešto o proizvodnji citokina u urođenom imunološkom sistemu.

8. Koji su glavni pristupi sveobuhvatnoj procjeni citokinskog sistema?

9. Koje su metode za ispitivanje citokina u tjelesnim tečnostima?

10. Koji su defekti citokinskog sistema kod raznih patologija?

11. Koje su glavne metode biološkog ispitivanja IL-1, IFN, MIF, TNFa u biološkim tekućinama?

12. Opišite proces određivanja intracelularnog sadržaja citokina.

13. Opišite postupak određivanja citokina koje luči jedna ćelija.

14. Opišite redoslijed metoda koje se koriste za otkrivanje defekta na nivou citokinskog receptora.

15. Opišite redoslijed metoda koje se koriste za otkrivanje defekta na nivou ćelija koje proizvode citokine.

16. Koje informacije se mogu dobiti ispitivanjem proizvodnje citokina u kulturi mononuklearnih ćelija, u krvnom serumu?

Proinflamatorni citokini se sintetiziraju, luče i preko receptora djeluju na ciljne stanice u ranoj fazi upale, sudjelujući u pokretanju specifičnog imunološkog odgovora, kao i u njegovoj efektorskoj fazi. U nastavku dajemo kratak opis glavnih proinflamatornih citokina.

IL-1 -spoj koji tokom antigenske stimulacije luče monociti, makrofagi, Langerhansove ćelije, dendritične ćelije, keratinociti, cerebralni astrociti i mikroglija, endotelne, epitelne, mezotelne ćelije, fibroblasti, NK-limfociti, neutrofili, B-ćelijski limfociti, C ćelije i dr. Otprilike 10% bazofila i mastocita također proizvodi IL-1. Ove činjenice ukazuju da se IL-1 može izlučiti izravno u krv, tkivnu tekućinu i limfu. Sve stanice u kojima nastaje ovaj citokin su nesposobne za spontanu sintezu IL-1 i odgovaraju njegovom proizvodnjom i izlučivanjem kao odgovor na djelovanje infektivnih i upalnih agenasa, mikrobnih toksina, raznih citokina, aktivnih fragmenata komplementa, nekih aktivnih faktora zgrušavanja krvi, i drugi. U figurativnom izrazu A. Bellaua, IL-1 je porodica molekula za sve prilike. IL-1 je podijeljen na 2 frakcije - a i b, koje su produkti različitih gena, ali imaju slična biološka svojstva. Oba ova oblika nastaju od odgovarajućih molekula prekursora iste molekulske težine - 31 kDa. Kao rezultat biohemijskih transformacija, na kraju nastaju jednolančani biološki aktivni polipeptidi molekulske težine 17,5 kDa. Gotovo sav IL-1a ostaje unutar ćelije ili se veže za membranu. Za razliku od IL-1a, IL-1b aktivno izlučuju ćelije i glavni je sekretorni oblik IL-1 kod ljudi. U isto vrijeme, oba interleukina imaju isti spektar biološke aktivnosti i takmiče se za vezivanje za isti receptor. Međutim, treba imati na umu da je IL-1a uglavnom posrednik lokalnih odbrambenih reakcija, dok IL-1b djeluje i na lokalnom i na sistemskom nivou. Eksperimenti sa rekombinantnim IL-1 pokazali su da ovaj citokin ima najmanje 50 različitih funkcija, a meta su ćelije gotovo svih organa i tkiva. Utjecaj IL-1 uglavnom je usmjeren na Th1, iako je u stanju da stimulira Th2 i B-limfocite. U koštanoj srži se pod njegovim uticajem povećava broj hematopoetskih ćelija koje su u fazi mitoze. IL-1 može djelovati na neutrofile, pojačavajući njihovu lokomotornu aktivnost i na taj način promovirajući fagocitozu. Ovaj citokin je uključen u regulaciju funkcija endotela i sistema koagulacije krvi, izazivajući prokoagulantnu aktivnost, sintezu proinflamatornih citokina i ekspresiju na površini endotela adhezivnih molekula koji obezbeđuju valjanje i vezivanje neutrofila i limfocita, zbog čega se u vaskularnom krevetu razvijaju leukopenija i neutropenija. Djelujući na ćelije jetre, stimulira stvaranje proteina akutne faze. Utvrđeno je da je IL-1 glavni posrednik u razvoju lokalne upale i odgovora akutne faze na nivou tijela. Osim toga, ubrzava rast krvnih žila nakon oštećenja. Pod uticajem IL-1 u krvi, koncentracija gvožđa i cinka se smanjuje, a izlučivanje natrijuma povećava. Konačno, nedavno je otkriveno da je IL-1 sposoban povećati količinu cirkulirajućeg dušikovog oksida. Poznato je da potonji igra izuzetno važnu ulogu u regulaciji krvnog tlaka, potiče dezagregaciju trombocita i pojačava fibrinolizu. Valja napomenuti da se pod utjecajem IL-1 pojačava stvaranje rozeta neutrofila i limfocita s trombocitima, što igra važnu ulogu u implementaciji nespecifične rezistencije, imuniteta i hemostaze (Yu.A. Vitkovsky). Sve ovo sugerira da IL-1 potiče razvoj cijelog kompleksa zaštitnih reakcija tijela usmjerenih na ograničavanje širenja infekcije, uklanjanje invazivnih mikroorganizama i vraćanje integriteta oštećenog tkiva. IL-1 utiče na hondrocite, osteoklaste, fibroblaste i b-ćelije pankreasa. Pod njegovim uticajem povećava se lučenje insulina, ACTH i kortizola. Dodavanje IL-1b ili TNFa primarnoj kulturi stanica hipofize smanjuje lučenje tireostimulirajućeg hormona.

IL-1 se proizvodi u centralnom nervnom sistemu, gdje može djelovati kao transmiter. Pod utjecajem IL-1 dolazi do sna, praćenog prisustvom a-ritma (sporotalasni san). Takođe podstiče sintezu i lučenje faktora rasta nerava od strane astrocita. Pokazalo se da se sadržaj IL-1 povećava tokom rada mišića. Pod utjecajem IL-1, pojačava se sama proizvodnja IL-1, kao i IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 i TNFa. Potonji, osim toga, inducira sintezu IL-1, IL-6 i IL-8.

Mnogi proinflamatorni efekti IL-1 se provode u kombinaciji sa TNFa i IL-6: izazivanje groznice, anoreksija, uticaj na hematopoezu, učešće u nespecifičnoj antiinfektivnoj zaštiti, lučenje proteina akutne faze i drugo (AS Simbirtsev) .

IL-6- monomer molekulske težine 19-34 kDa. Proizvode ga stimulisani monociti, makrofagi, endoteliociti, Th2, fibroblasti, hepatociti, Sertolijeve ćelije, ćelije nervnog sistema, tireociti, ćelije Langerhansovih ostrva itd. Zajedno sa IL-4 i IL-10 obezbeđuje rast i diferencijacija B-limfocita, olakšavajući prijelaz posljednjih u antitijela. Osim toga, on, poput IL-1, stimulira hepatocite, što dovodi do stvaranja proteina akutne faze. IL-6 djeluje na hematopoetske progenitorne stanice i posebno stimulira megakariocitopoezu. Ovo jedinjenje ima antivirusnu aktivnost. Postoje citokini koji pripadaju porodici IL-6-onkostatin M (OnM), faktor koji inhibira leukemiju, cilijarni neurotropni faktor, kardiotropin-1. Njihov uticaj ne utiče na imuni sistem. Porodica IL-6 djeluje na embrionalne matične stanice, uzrokuje hipertrofiju miokarda, sintezu CWA, održavanje proliferacije ćelija mijeloma i hematopoetskih progenitora, diferencijaciju makrofaga, osteoklasta, nervnih ćelija, povećanu trombocitopoezu itd.

Treba napomenuti da miševi sa ciljanom inaktivacijom (nokautom) gena koji kodira zajedničku komponentu receptora za citokine porodice IL-6 razvijaju brojne abnormalnosti u različitim sistemima tijela koje su nekompatibilne sa životom. Zajedno s poremećajem kardiogeneze u embrionima takvih miševa, dolazi do naglog smanjenja broja progenitornih stanica različitih hematopoetskih redova, kao i oštrog smanjenja veličine timusa. Ove činjenice ukazuju na izuzetan značaj IL-6 u regulaciji fizioloških funkcija (A.A. Yarilin).

Postoji vrlo složen uzajamno regulatorni odnos između proinflamatornih citokina, koji djeluju kao sinergisti. Dakle, IL-6 inhibira proizvodnju IL-1 i TNFa, iako su oba ova citokina induktori sinteze IL-6. Osim toga, IL-6, djelujući na hipotalamus-hipofizni sistem, dovodi do povećanja proizvodnje kortizola, koji inhibira ekspresiju IL-6 gena, kao i gena drugih proinflamatornih citokina.

Porodica IL-6 takođe uključuje onkostatin M (OnM), poseduju izuzetno širok spektar delovanja. Njegova molekularna težina je 28 kDa. Utvrđeno je da je OnM inhibiran rast brojnih tumora. Stimulira stvaranje IL-6, aktivatora plazminogena, vazoaktivnih intestinalnih peptida i CWA. Iz navedenog proizilazi da bi OnM trebao igrati važnu ulogu u regulaciji imunološkog odgovora, koagulaciji krvi i fibrinolizi.

IL-8 pripada takozvanoj porodici hemokina koji stimulišu hemotaksiju i hemokinezu i broje do 60 pojedinačnih supstanci sa sopstvenim strukturnim i biološkim svojstvima. Zreli IL-8 postoji u nekoliko oblika, koji se razlikuju po dužini polipeptidnog lanca. Formiranje jednog ili drugog oblika ovisi o specifičnim proteazama koje djeluju na N-terminus neglikoziliranog prekursorskog molekula. Ovisno o tome koje stanice sintetiziraju IL-8, on sadrži različit broj aminokiselina. Najveću biološku aktivnost ima oblik IL-8, koji se sastoji od 72 aminokiseline (A.S. Simbirtsev).

IL-8 oslobađaju polimorfonuklearni leukociti, monociti, makrofagi, megakariociti, neutrofili, T-limfociti (Tx), fibroblasti, hondrociti, keratinociti, endotelne i epitelne ćelije, hepatociti i mikroglija.

IL-8 nastaje kao odgovor na djelovanje biološki aktivnih spojeva, uključujući proinflamatorne citokine, kao i IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, različite mitogene, lipopolisaharide, lektine i proizvode virusnog raspada, dok protuupalni citokini (IL-4, IL-10) smanjuju proizvodnju IL-8. Do njegovog aktiviranja i oslobađanja dolazi i pod uticajem trombina, aktivatora plazminogena, streptokinaze i tripsina, što ukazuje na blisku vezu između funkcije ovog citokina i hemostatskog sistema.

Sinteza IL-8 provodi se djelovanjem raznih endogenih ili egzogenih podražaja koji nastaju u žarištu upale tijekom razvoja lokalne obrambene reakcije na uvođenje patogenog agensa. U tom pogledu, proizvodnja IL-8 ima mnogo sličnosti s drugim proupalnim citokinima. U isto vrijeme sintezu IL-8 potiskuju steroidni hormoni, IL-4, IL-10, Ifa i Ifg.

IL-8 stimulira hemotaksiju i hemokinezu neutrofila, bazofila, T-limfocita (u manjoj mjeri) i keratinocita, uzrokujući degranulaciju ovih stanica. Kod intravaskularne injekcije IL-8 dolazi do brze i oštre granulocitopenije, praćene porastom nivoa neutrofila u perifernoj krvi. U tom slučaju neutrofili migriraju u jetru, slezenu, pluća, ali ne i u oštećena tkiva. Štaviše, eksperiment je pokazao da intravenska primjena IL-8 blokira migraciju neutrofila u intradermalna područja upale.

Kod nestimulisanih neutrofila, IL-8 uzrokuje oslobađanje proteina povezanog s vitaminom B12 iz specifičnih granula i želatinaze iz sekretornih vezikula. Degranulacija azurofilnih granula u neutrofilima nastaje tek nakon njihove stimulacije citohalasinom-B. Istovremeno se oslobađaju elastaza, mijeloperoksidaza, b-glukuronidaza i druge elastaze i dolazi do ekspresije adhezivnih molekula na membrani leukocita, čime se osigurava interakcija neutrofila s endotelom. Treba napomenuti da IL-8 nije sposoban da izazove respiratorni udar, ali može pojačati učinak drugih hemokina na ovaj proces.

IL-8 je u stanju da stimuliše angiogenezu aktiviranjem proliferativnih procesa u endotelnim ćelijama i ćelijama glatkih mišića, što igra važnu ulogu u obnavljanju tkiva. Osim toga, može inhibirati sintezu IgE induciranu IL-4.

Očigledno, IL-8 igra važnu ulogu u lokalnom imunitetu sluzokože. Kod zdravih ljudi nalazi se u sekretima pljuvačnih, suznih, znojnih žlezda, u kolostrumu. Utvrđeno je da ćelije glatkih mišića u traheji ljudi mogu proizvesti zanemarljive količine IL-8. Pod uticajem bradikinina, proizvodnja IL-8 se povećava 50 puta. Blokatori sinteze proteina inhibiraju sintezu IL-8. Postoje svi razlozi za vjerovanje da lokalno IL-8 osigurava tok zaštitnih reakcija kada je izložen patogenoj flori u gornjim dišnim putevima.

IL-12 otkriven prije više od deset godina, ali su njegove osobine proučavane tek posljednjih godina. Proizvode ga makrofagi, monociti, neutrofili, dendritske ćelije i aktivirani B-limfociti. U znatno manjoj mjeri, IL-12 je sposoban izlučivati keratinocite, Langerhansove ćelije i B-limfocite u mirovanju. Osim toga, proizvode ga mikroglijalne ćelije i astrociti, što zahtijeva njihovu suradnju. IL-12 je heterodimer koji se sastoji od dva kovalentno povezana polipeptidna lanca: teškog (45 kDa) i laganog (35 kDa). Biološka aktivnost je inherentna samo dimeru; svaki od pojedinačnih lanaca ne posjeduje slična svojstva.

Ipak, NK, T-limfociti (CD4+ i CD8+) i, u manjoj mjeri, B-limfociti ostaju glavne ciljne ćelije za IL-12. Može se smatrati da služi kao veza između makrofaga i monocita, doprinoseći povećanju aktivnosti Th1 i citotoksičnih stanica. Dakle, ovaj citokin daje značajan doprinos pružanju antivirusne i antitumorske zaštite. Induktori sinteze IL-12 su mikrobne komponente i proinflamatorni citokini.

IL-12 pripada citokinima koji se vezuju za heparin, što ukazuje na njegovo učešće u procesu hemostaze.

Posljednjih godina pokazalo se da je IL-12 ključni citokin za jačanje imunološkog odgovora posredovanog ćelijama i efikasnu antiinfektivnu zaštitu od virusa, bakterija, gljivica i protozoa. Zaštitni efekti IL-12 u infekcijama posredovani su mehanizmima zavisnim od Ifg, povećanom proizvodnjom dušikovog oksida i infiltracijom T-ćelija. Međutim, njegov glavni učinak je sinteza Ifg. Potonji, dok se akumulira u tijelu, potiče sintezu IL-12 od strane makrofaga. Najvažnija funkcija IL-12 je smjer diferencijacije Tx0 prema Tx1. U ovom procesu, IL-12 je sinergist za Ifg. U međuvremenu, nakon diferencijacije, Th1 prestaje da treba IL-12 kao kostimulacijski molekul. Priroda imunološkog odgovora u velikoj mjeri ovisi o IL-12: da li će se razviti prema ćelijskom ili humoralnom imunitetu.

Jedna od najvažnijih funkcija IL-12 je naglo povećanje diferencijacije B-limfocita u stanice koje proizvode antitijela. Ovaj citokin se koristi za liječenje pacijenata s alergijama i bronhijalnom astmom.

IL-12 ima inhibitorni efekat na proizvodnju IL-4 od strane T-limfocita memorije, posredovano preko APC. Zauzvrat, IL-4 potiskuje proizvodnju i lučenje IL-12.

IL-12 sinergisti su IL-2 i IL-7, iako oba ova citokina često djeluju na različite ciljne stanice. Fiziološki antagonist i inhibitor IL-12 je IL-10, tipičan protuupalni citokin koji inhibira Th1 funkciju.

IL-16- luče ga T-limfociti, uglavnom stimulirani CD4+, CD8+, eozinofilima i epitelnim stanicama bronha. Povećano lučenje IL-16 nađeno je kada su T ćelije tretirane histaminom. Po hemijskoj prirodi je homotetramer molekulske težine 56000-80000 D. Imunomodulatorni je i proinflamatorni citokin, jer je hemotaktički faktor za monocite i eozinofile, kao i T-limfocite (CD4+), poboljšanju njihove adhezije.

Treba napomenuti da predtretman CD4 + rekombinantnim IL-16 potiskuje aktivnost promotora HIV-1 za približno 60%. Na osnovu navedenih činjenica, postavljena je hipoteza prema kojoj se efekat IL-16 na replikaciju HIV-1 posmatra na nivou virusne ekspresije.

IL-17 formirani od makrofaga. Trenutno je dobijen rekombinantni IL-17 i njegova svojstva su proučavana. Pokazalo se da pod uticajem IL-17 humani makrofagi intenzivno sintetišu i luče proinflamatorne citokine - IL-1b i TNFa, što je u direktnoj proporciji sa dozom ispitivanog citokina. Maksimalni efekat se primećuje otprilike 9 sati nakon početka inkubacije makrofaga sa rekombinantnim IL-17. Pored toga, IL-17 stimuliše sintezu i lučenje IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1 antagonista i stromalizina. Protuupalni citokini - IL-4 i IL-10 - potpuno poništavaju oslobađanje IL-1b izazvano IL-17, dok GTFb 2 i IL-13 samo djelomično blokiraju ovaj efekat. IL-10 potiskuje indukovano oslobađanje TNFa, dok IL-4, IL-13 i GTFb 2 suzbijaju lučenje ovog citokina u manjoj mjeri. Iznesene činjenice snažno upućuju na to da bi IL-17 trebao igrati važnu ulogu u pokretanju i održavanju upalnog procesa.

IL-18 u smislu bioloških efekata, on je funkcionalni udvostruč i sinergist IL-12. Glavni proizvođači IL-18 su makrofagi i monociti. Njegova struktura je izuzetno slična IL-1. IL-18 se sintetizira u obliku neaktivnog molekula prekursora, što zahtijeva sudjelovanje enzima koji pretvara IL-1b da bi se pretvorio u aktivni oblik.

Pod uticajem IL-18 povećava se antimikrobna rezistencija organizma. Kod bakterijske infekcije, IL-18, zajedno sa IL-12 ili Ifa/b, reguliše proizvodnju Ifg od strane Tx i NK ćelija i pojačava ekspresiju Fas liganda na NK i T limfocitima. Nedavno je otkriveno da je IL-18 CTL aktivator. Pod njegovim uticajem povećava se aktivnost CD8+ ćelija u odnosu na ćelije malignih tumora.

Kao IL-12, IL-18 promovira preferencijalnu diferencijaciju Th0 u Th1. Osim toga, IL-18 dovodi do stvaranja GM-CSF i time pojačava leukopoezu i inhibira stvaranje osteoklasta.

IL-23 sastoji se od 2 podjedinice (p19 i p40), koje su dio IL-12. Zasebno, svaka od navedenih podjedinica nema biološku aktivnost, ali zajedno, kao i IL-12, pojačavaju proliferativnu aktivnost T-limfoblasta i sekreciju Ifg. IL-23 je manje moćan od IL-12.

TNF je polipeptid molekulske težine od oko 17 kDa (sastoji se od 157 aminokiselina) i podijeljen je na 2 frakcije - a i b. Obje frakcije imaju približno ista biološka svojstva i djeluju na iste ćelijske receptore. TNFa luče monociti i makrofagi, Th1, endotelne i glatke mišićne ćelije, keratinociti, NK limfociti, neutrofili, astrociti, osteoblasti, itd. U manjoj mjeri TNFa proizvode neke tumorske ćelije. Glavni induktor sinteze TNFa je bakterijski lipopolisaharid, kao i druge komponente bakterijskog porijekla. Osim toga, sintezu i lučenje TNFa stimuliraju citokini: IL-1, IL-2, Ifa i b, GM-CSF, itd. Epstein-Barr virus, Ifa/b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb, itd.

Glavna manifestacija biološke aktivnosti TNFa je dejstvo na neke tumorske ćelije. U tom slučaju TNFa dovodi do razvoja hemoragijske nekroze i tromboze dovodnih krvnih žila. Istovremeno, pod uticajem TNFa, povećava se prirodna citotoksičnost monocita, makrofaga i NK ćelija. Regresija tumorskih ćelija se posebno intenzivno javlja kombinovanim delovanjem TNFa i Ifg.

Pod uticajem TNFa inhibira se sinteza lipoprotein kinaze, jednog od glavnih enzima koji regulišu lipogenezu.

TNFa, kao posrednik citotoksičnosti, može inhibirati proliferaciju, diferencijaciju i funkcionalnu aktivnost mnogih stanica.

TNFa je direktno uključen u imunološki odgovor. Ima izuzetno važnu ulogu u ranim trenucima nastanka upalne reakcije, jer aktivira endotel i potiče ekspresiju adhezivnih molekula, što dovodi do prianjanja granulocita na unutrašnju površinu krvnog suda. Pod uticajem TNFa dolazi do transendotelne migracije leukocita u žarište upale. Ovaj citokin aktivira granulocite, monocite i limfocite i inducira proizvodnju drugih proinflamatornih citokina - IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, koji su TNFa sinergisti.

Nastao lokalno, TNFa u žarištu upale ili infektivnog procesa naglo povećava fagocitnu aktivnost monocita i neutrofila i, pojačavajući procese peroksidacije, doprinosi razvoju potpune fagocitoze. Zajedno sa IL-2, TNFa značajno povećava proizvodnju Ifg od strane T limfocita.

TNFa je također uključen u procese destrukcije i popravke, jer uzrokuje rast fibroblasta i stimulira angiogenezu.

Poslednjih godina ustanovljeno je da je TNF važan regulator hematopoeze. Direktno ili u sprezi sa drugim citokinima, TNF utiče na sve vrste hematopoetskih ćelija.

Pod njegovim utjecajem poboljšava se funkcija hipotalamus-hipofiza-nadbubrežne žlijezde, kao i nekih endokrinih žlijezda-štitnjače, testisa, jajnika, gušterače i drugih (A.F. Vozianov).

Interferoni formiraju gotovo sve stanice ljudskog tijela, ali njihovu proizvodnju uglavnom provode stanice krvi i koštane srži. Sinteza interferona odvija se pod utjecajem antigenske stimulacije, iako se vrlo mala koncentracija ovih spojeva može normalno naći u koštanoj srži, bronhima, različitim organima gastrointestinalnog trakta, koži i dr. Nivo sinteze interferona uvijek je viši u ćelijama koje se ne dijele nego u stanicama koje se brzo dijele.

Uvod.

1. Opće karakteristike i klasifikacija citokina.

1.1 Mehanizmi djelovanja.

1.2 Osobine citokina.

1.3 Uloga citokina u regulaciji fizioloških funkcija tijela.

2.Specijalne studije citokina.

2.1 Uloga citokina u patogenezi upalnih bolesti debelog crijeva kod djece.

2.2. Uloga dušikovog oksida i citokina u razvoju sindroma akutne ozljede pluća.

3. Metode za određivanje citokina

3.1. Određivanje biološke aktivnosti citokina

3.2 Kvantifikacija citokina korištenjem antitijela

3.3 Određivanje citokina enzimskim imunotestom.

3.3.1 Faktor nekroze tumora-alfa.

3.3.2 Gama interferon.

3.3.3 Interleukin-4

3.3.4 Interleukin-8

3.3.5 Antagonist receptora interleukin-1.

3.3.6 Alfa-interferon.

3.3.7 Antitijela na alfa-IFN.

4. Imunotropni lijekovi na bazi citokina.

Spisak korišćene literature.

Zaključak.

Uvod.

Nije prošlo mnogo vremena od opisa prvih citokina. Međutim, njihova istraživanja dovela su do izdvajanja opsežnog dijela znanja - citokinologije, koja je sastavni dio različitih područja znanja i, prije svega, imunologije, što je dalo snažan poticaj proučavanju ovih medijatora. Citokineologija prožima sve kliničke discipline, od etiologije i patogeneze bolesti do prevencije i liječenja različitih patoloških stanja. Shodno tome, naučni istraživači i kliničari moraju da se kreću kroz raznolikost regulatornih molekula i da imaju jasno razumevanje uloge svakog od citokina u procesima koji se proučavaju. Sve stanice imunološkog sistema imaju određene funkcije i rade u jasno koordiniranoj interakciji koju osiguravaju posebne biološki aktivne tvari - citokini - regulatori imunoloških reakcija. Citokini su specifični proteini uz pomoć kojih različite ćelije imunološkog sistema mogu međusobno razmjenjivati informacije i koordinirati djelovanje. Skup i količina citokina koji djeluju na receptore ćelijske površine - "citokinsko okruženje" - predstavljaju matricu interakcijskih i često mijenjanih signala. Ovi signali su složeni zbog širokog spektra citokinskih receptora i zbog činjenice da svaki od citokina može aktivirati ili potisnuti nekoliko procesa, uključujući vlastitu sintezu i sintezu drugih citokina, kao i stvaranje i pojavu citokinskih receptora. na površini ćelije. Cilj našeg rada je proučavanje citakina, njihove funkcije i svojstva, kao i moguću primjenu u medicini. Citokini su mali proteini (molekulske težine od 8 do 80 kDa) koji djeluju autokrino (tj. na ćeliju koja ih proizvodi) ili parakrino (na stanice koje se nalaze u blizini). Formiranje i oslobađanje ovih visoko aktivnih molekula je kratkotrajno i strogo je regulirano.

Pregled literature.

Opšte karakteristike i klasifikacija citokina.

Citokini su grupa polipeptidnih medijatora međućelijske interakcije, koji su uglavnom uključeni u formiranje i regulaciju odbrambenih reakcija organizma prilikom unošenja patogena i narušavanja integriteta tkiva, kao i u regulaciji niza normalnih fizioloških funkcija. Citokini se mogu izolirati u novi nezavisni regulatorni sistem koji postoji zajedno sa nervnim i endokrinim sistemom za održavanje homeostaze, a sva tri sistema su usko povezana i međusobno zavisna. U protekle dvije decenije klonirani su geni većine citokina i dobijeni su rekombinantni analozi koji u potpunosti ponavljaju biološka svojstva prirodnih molekula. Sada je poznato više od 200 pojedinačnih supstanci koje pripadaju porodici citokina. Istorija proučavanja citokina započela je 40 -ih godina 20. Tada su opisani prvi efekti kahektina, faktora prisutnog u krvnom serumu i sposobnog da izazove kaheksiju ili gubitak težine. Nakon toga, ovaj medijator je izolovan i pokazao se da je identičan faktoru tumorske nekroze (TNF). U to vrijeme proučavanje citokina odvijalo se na principu detekcije bilo kojeg biološkog efekta, što je poslužilo kao polazna tačka za naziv odgovarajućeg medijatora. Tako je 50-ih godina interferon (IFN) nazvan zbog njegove sposobnosti da interferira ili poveća otpornost tokom ponovljene virusne infekcije. Interleukin-1 (IL-1) se također prvobitno nazivao endogenim pirogenom za razliku od bakterijskih lipopolisaharida, koji su se smatrali egzogenim pirogenima. Sljedeća faza u proučavanju citokina, koja datira od 60-70 godina, povezana je s pročišćavanjem prirodnih molekula i sveobuhvatnom karakterizacijom njihovog biološkog djelovanja. U to vrijeme pripada otkriće faktora rasta T-ćelija, danas poznatog kao IL-2, i niza drugih molekula koji stimuliraju rast i funkcionalnu aktivnost T-, B-limfocita i drugih vrsta leukocita. Godine 1979. za njihovo označavanje i sistematizaciju predložen je termin "interleukini", odnosno medijatori koji komuniciraju između leukocita. Međutim, ubrzo je postalo jasno da se biološki efekti citokina protežu daleko izvan imunološkog sistema, pa je stoga ranije predloženi termin "citokini", koji je opstao do danas, postao prihvatljiviji. Revolucionarni zaokret u proučavanju citokina dogodio se početkom 1980-ih nakon kloniranja gena za interferon miša i čovjeka i proizvodnje rekombinantnih molekula koji su u potpunosti ponovili biološka svojstva prirodnih citokina. Nakon toga, bilo je moguće klonirati gene drugih medijatora iz ove porodice. Važna prekretnica u istoriji citokina bila je klinička upotreba rekombinantnih interferona, a posebno rekombinantnog IL-2, za lečenje raka. Devedesete su obilježene otkrićem podjedinične strukture citokinskih receptora i formiranjem koncepta "citokinske mreže", a početak XXI vijeka - otkrićem mnogih novih citokina putem genetske analize. Citokini uključuju interferone, faktore stimulacije kolonija (CSF), hemokine koji transformišu faktore rasta; faktor tumorske nekroze; interleukini s utvrđenim povijesno serijskim brojevima i neki drugi endogeni posrednici. Interleukini sa serijskim brojevima koji počinju od 1 ne pripadaju istoj podgrupi citokina povezanih zajedničkim funkcijama. Oni se, pak, mogu podijeliti na proinflamatorne citokine, faktore rasta i diferencijacije limfocita i pojedinačne regulatorne citokine. Naziv "interleukin" se dodeljuje novootkrivenom posredniku ako su ispunjeni sledeći kriterijumi koje je razvio komitet za nomenklaturu Međunarodne unije imunoloških društava: molekularno kloniranje i ekspresija gena faktora koji se proučava, prisustvo jedinstvenog nukleotida i odgovarajuću sekvencu aminokiselina, čime se dobijaju neutralizirajuća monoklonska antitijela. Osim toga, novi molekul moraju proizvoditi ćelije imunološkog sistema (limfociti, monociti ili druge vrste leukocita), imati važnu biološku funkciju u regulaciji imunološkog odgovora, kao i dodatne funkcije, zbog čega ne može dobiti funkcionalno ime. Konačno, navedena svojstva novog interleukina bi trebala biti objavljena u recenziranom naučnom časopisu. Klasifikacija citokina može se izvršiti prema njihovim biohemijskim i biološkim svojstvima, kao i prema tipovima receptora preko kojih citokini obavljaju svoje biološke funkcije. Klasifikacija citokina prema strukturi (Tabela 1) uzima u obzir ne samo aminokiselinsku sekvencu, već prije svega tercijarnu strukturu proteina, koja preciznije odražava evolucijsko podrijetlo molekula.

Tabela 1. Klasifikacija citokina po strukturi.

Kloniranje gena i analiza strukture citokinskih receptora su pokazali da se, kao i sami citokini, ovi molekuli mogu podijeliti u nekoliko tipova prema sličnosti aminokiselinskih sekvenci i osobenostima organizacije ekstracelularnih domena (Tabela 2). Jedna od najvećih familija citokinskih receptora naziva se porodica hematopoetinskih receptora ili porodica citokinskih receptora tipa I. Strukturna karakteristika ove grupe receptora je prisustvo u molekulu 4 cisteina i aminokiselinske sekvence Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), koja se nalazi na maloj udaljenosti od ćelijske membrane. Citokinski receptori klase II stupaju u interakciju sa interferonima i IL-10. Oba prva tipa receptora imaju homologiju jedan s drugim. Sledeće grupe receptora posreduju u interakciji sa citokinima familije faktora tumorske nekroze i porodice IL-1. Trenutno je poznato da više od 20 različitih hemokinskih receptora stupaju u interakciju s različitim stupnjevima afiniteta sa jednim ili više liganda iz porodice hemokina. Hemokinski receptori pripadaju superfamiliji receptora rodopsina, imaju 7 transmembranskih domena i provode signal uz učešće G-proteina.

Tabela 2. Klasifikacija citokinskih receptora.

Mnogi receptori citokina sastavljeni su od 2-3 podjedinice kodirane različitim genima i izražene nezavisno. U ovom slučaju, formiranje receptora visokog afiniteta zahtijeva istovremenu interakciju svih podjedinica. Primjer takve organizacije citokinskih receptora je struktura IL-2 receptorskog kompleksa. Iznenađujuće je bilo otkriće činjenice da su pojedinačne podjedinice IL-2 receptorskog kompleksa zajedničke IL-2 i nekim drugim citokinima. Dakle, β-lanac je istovremeno komponenta receptora za IL-15, a γ-lanac služi kao zajednička podjedinica receptora za IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 i IL-21. To znači da svi pomenuti citokini, čiji se receptori takođe sastoje od 2-3 pojedinačna polipeptida, koriste γ-lanac kao komponentu svojih receptora, štaviše, komponentu odgovornu za prenos signala. U svim slučajevima, specifičnost interakcije za svaki citokin osiguravaju druge podjedinice koje se razlikuju po strukturi. Među citokinskim receptorima, postoje još 2 uobičajene podjedinice receptora koje provode signal nakon interakcije s različitim citokinima. To je uobičajena podjedinica receptora βc (gp140) za IL-3, IL-5 i GM-CSF receptore, kao i podjedinica receptora gp130, zajednička članovima porodice IL-6. Prisutnost zajedničke signalne podjedinice u citokinskim receptorima služi kao jedan od pristupa njihovoj klasifikaciji, jer omogućuje pronalaženje zajedničkog i u strukturi liganda i u biološkim efektima.

U tabeli 3 prikazana je kombinovana strukturna i funkcionalna klasifikacija, gde su svi citokini podeljeni u grupe, prvenstveno uzimajući u obzir njihovu biološku aktivnost, kao i navedene strukturne karakteristike molekula citokina i njihovih receptora.

Tabela 3. Strukturna i funkcionalna klasifikacija citokina.

Porodice citokina	Podgrupe i ligandi	Osnovne biološke funkcije
Interferoni tipa I.	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Antivirusno djelovanje, antiproliferativno, imunomodulatorno djelovanje
Faktori rasta hematopoetskih ćelija	Faktor matičnih ćelija (kit-ligand, faktor čelika), Flt-3 ligand, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandi: IL-3, IL-5, GM-KSF	Stimulacija proliferacije i diferencijacije različitih tipova progenitornih ćelija u koštanoj srži, aktivacija hematopoeze Eritropoetin, trombopoetin
Superfamilija interleukina-1 i FRF	FRF porodica: Kiseli FRF, osnovni FRF, FRF3 - FRF23 Porodica IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, antagonist IL-1 receptora, IL-18, IL-33, itd.	Aktivacija proliferacije fibroblasta i epitelnih ćelija Proupalno djelovanje, aktivacija specifičnog imuniteta
Familija faktora tumorske nekroze	TNF, limfotoksini α i β, Fas ligand, itd.	Proupalno djelovanje, regulacija apoptoze i međustanične interakcije imunokompetentnih stanica
Porodica interleukina-6	Gp130 ligandi: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Kardiotropin-1, Inhibicijski faktor leukemije, Cilijarni neurotrofni faktor	Proinflamatorni i imunoregulatorni efekti
Hemokini	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Regulacija kemotakse različitih vrsta leukocita
Porodica interleukina-10	IL-10,19,20,22,24,26	Imunosupresivno djelovanje
Porodica Interleukin-12		Regulacija diferencijacije pomoćnih T-limfocita
Citokini T-pomoćnih klonova i regulatorne funkcije limfocita	T-pomagači tip 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-pomagači tip 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Ligandi γ-lanca receptora IL-2: IL-7 TSLP	Aktivacija ćelijskog imuniteta Aktivacija humoralnog imuniteta, imunomodulatorno djelovanje Stimulacija diferencijacije, proliferacije i funkcionalnih svojstava različitih tipova limfocita, DC, NK ćelija, makrofaga itd.
Interleukin 17 porodica	IL-17A, B, C, D, E, F	Aktivacija sinteze proupalnih citokina
Superfamilija faktora rasta živaca, faktora rasta trombocita i transformirajućih faktora rasta	Familija faktora rasta nerava: NGF, neurotrofni faktor mozga Faktori rasta izvedeni iz trombocita (PDGF), angiogeni faktori rasta (VEGF) TRF porodica: TPPb, aktivini, inhibini, Nodal, koštani morfogeni proteini, Mullerova inhibitorna supstanca	Regulacija upale, angiogeneze, neuronske funkcije, embrionalnog razvoja i regeneracije tkiva
Familija epidermalnog faktora rasta	ERF, TRFα, itd.
Porodica faktora rasta sličnih insulinu	IRF-I, IRF-II	Stimulacija proliferacije različitih tipova stanica

Prva grupa uključuje interferone tipa I i najjednostavnija je u organizaciji, budući da svi molekuli koji su u njoj uključeni imaju sličnu strukturu i u mnogim aspektima iste funkcije povezane s antivirusnom zaštitom. U drugu grupu spadaju faktori rasta i diferencijacije hematopoetskih ćelija, koji stimulišu razvoj hematopoetskih progenitorskih ćelija, počevši od matične ćelije. U ovu grupu spadaju citokini koji su usko specifični za pojedine linije diferencijacije hematopoetskih ćelija (eritropoetin, trombopoetin i IL-7, koji deluje na prekursore TB limfocita), kao i citokini sa širim spektrom biološke aktivnosti, kao npr. IL-3, IL-11, faktori stimulacije kolonija. Unutar ove grupe citokina izolovani su gp140 ligandi, koji imaju zajedničku podjedinicu receptora, kao i trombopoetin i eritropoetin zbog sličnosti strukturne organizacije molekula. Citokini superfamilija FGF i IL-1 imaju visok stepen homologije i sličnu strukturu proteina, što potvrđuje zajedničko porijeklo. Ipak, u pogledu manifestacija biološke aktivnosti, FGF se u mnogo čemu razlikuje od agonista porodice IL-1. Porodica IL-1 molekula trenutno, pored funkcionalnih naziva, ima i oznake F1-F11, gdje F1 odgovara IL-1α, F2 IL-1β, F3 antagonistu receptora IL-1, F4 IL- 18. Ostali članovi porodice otkriveni su kao rezultat genetske analize i imaju prilično visoku homologiju sa IL-1 molekulima, međutim, njihove biološke funkcije nisu u potpunosti razjašnjene. Dalje grupe citokina uključuju porodice IL-6 (ligandi zajedničke receptorske podjedinice gp130), faktor nekroze tumora i hemokine, koji su predstavljeni najvećim brojem pojedinačnih liganada i navedeni su u potpunosti u odgovarajućim poglavljima. Familija faktora tumorske nekroze formirana je uglavnom na osnovu sličnosti u strukturi liganada i njihovih receptora, a sastoji se od tri nekovalentno povezane identične podjedinice koje formiraju biološki aktivne molekule. Istovremeno, u pogledu bioloških svojstava, ova porodica uključuje citokine sa prilično različitim aktivnostima. Na primjer, TNF je jedan od najupečatljivijih proinflamatornih citokina, Fas ligand inducira apoptozu ciljnih stanica, a CD40 ligand daje stimulativni signal tokom međućelijske interakcije T i B limfocita. Takve razlike u biološkoj aktivnosti strukturno sličnih molekula prvenstveno su određene osobinama ekspresije i strukture njihovih receptora, na primjer, prisustvom ili odsustvom unutarćelijske domene "smrti" koja određuje apoptozu ćelije. Posljednjih godina porodice IL-10 i IL-12 također su popunjene novim članovima koji su dobili serijske brojeve interleukina. Nakon toga slijedi vrlo složena skupina citokina, koji su posrednici funkcionalne aktivnosti T-pomoćnih limfocita. Uključivanje u ovu grupu temelji se na dva osnovna principa: 1) pripadaju citokinima sintetiziranim pomoću Th1 ili Th2, što određuje razvoj pretežno humoralnog ili staničnog tipa imunoloških reakcija, 2) prisutnost zajedničke receptorske podjedinice - gama lanca kompleksa IL-2 receptora. Među ligandima gama lanca dodatno je izolovan IL-4, koji takođe ima zajedničke receptorske podjedinice sa IL-13, što u velikoj meri određuje delimično preklapajuću biološku aktivnost ovih citokina. IL-7, koji ima zajedničku strukturu receptora sa TSLP, izolovan je na sličan način. Prednosti gornje klasifikacije povezane su sa simultanim razmatranjem bioloških i biohemijskih svojstava citokina. Izvodljivost ovog pristupa trenutno je potvrđena otkrićem novih citokina genetskom analizom genoma i potragom za strukturno sličnim genima. Zahvaljujući ovoj metodi, porodica interferona tipa I, IL-1, IL-10, IL-12, značajno se proširila, pojavila se nova porodica citokina analognih IL-17, koja se već sastoji od 6 članova. Očigledno će se u bliskoj budućnosti pojavljivanje novih citokina odvijati mnogo sporije, budući da je analiza ljudskog genoma gotovo gotova. Promjene su najvjerovatnije moguće zbog pojašnjenja varijanti interakcija ligand-receptor i bioloških svojstava, što će omogućiti da klasifikacija citokina dobije konačan oblik.

Mehanizmi djelovanja.

B. Receptori citokina. Citokini su hidrofilne signalne tvari čije djelovanje posreduju specifični receptori s vanjske strane plazma membrane. Vezivanje citokina za receptor (1) vodi kroz brojne međufaze (2-5) do aktivacije transkripcije određenih gena (6). Sami citokinski receptori nemaju aktivnost tirozin kinaze (uz nekoliko izuzetaka) . Nakon vezivanja za citokin (1), molekuli receptora se udružuju i formiraju homodimere. Osim toga, mogu formirati heterodimere povezivanjem s proteinima za prijenos signala (STP) ili stimulirati dimerizaciju samih BPS (2). Citokinski receptori klase I mogu se agregirati sa tri tipa BPS-a: proteini GP130, βc ili γc. Ovi pomoćni proteini sami po sebi nisu u stanju da vežu citokine, ali vrše transdukciju signala na tirozin kinaze (3).Isti spektri biološke aktivnosti mnogih citokina objašnjavaju se činjenicom da različiti citokin-receptorski kompleksi mogu aktivirati isti BPS.

Kao primjer transdukcije signala iz citokina, dijagram pokazuje kako IL-6 (IL-6) receptor, nakon vezivanja za ligand (1), stimuliše dimerizaciju GP130 (2). Dimer membranskog proteina GP130 veže i aktivira citoplazmatsku tirozin kinazu iz porodice YK (Janus kinaze s dva aktivna mjesta) (3). Janus kinaze fosforilišu citokinske receptore, BPS i različite citoplazmatske proteine, koji provode dalju transdukciju signala; oni takođe fosforiliraju transkripcione faktore - pretvarače signala i aktivatore transkripcije [PSAT (STAT, od engleskog signal transducers and activators of transkripcije)]. Ovi proteini pripadaju porodici BPS, koji u svojoj strukturi imaju SH3-domen koji prepoznaje ostatke fosfotirozina (vidi str. 372). Stoga, oni imaju svojstvo povezivanja sa fosforilisanim citokinskim receptorom. Ako tada dođe do fosforilacije PSAT molekula (4), faktor se transformiše u aktivni oblik i formira dimer (5). Nakon translokacije u jezgro, dimer se, kao transkripcijski faktor, vezuje za promotor (vidi str. 240) iniciranog gena i indukuje njegovu transkripciju (6). Neki receptori citokina mogu izgubiti domen za vanćelijski ligand zbog proteolize. (nije prikazano na dijagramu). Domen ulazi u krv, gdje se natječe za vezivanje s citokinom, što smanjuje koncentraciju citokina u krvi. Zajedno, citokini tvore regulatornu mrežu (citokinska kaskada) s multifunkcionalnim učinkom. Preklapanje između citokina dovodi do činjenice da se u djelovanju mnogih od njih uočava sinergizam, a neki citokini su antagonisti. Cijela kaskada citokina sa složenom povratnom spregom se često može uočiti u tijelu.

Osobine citokina.

Opšta svojstva citokina, zbog kojih se ovi medijatori mogu kombinovati u nezavisan regulatorni sistem.

1. Citokini su polipeptidi ili proteini, često glikozilirani, većina njih ima MW od 5 do 50 kDa. Biološki aktivni molekuli citokina mogu se sastojati od jedne, dvije, tri ili više identičnih ili različitih podjedinica.

2. Citokini nemaju antigensku specifičnost biološkog djelovanja. Utječu na funkcionalnu aktivnost stanica uključenih u reakcije urođenog i stečenog imuniteta. Ipak, djelovanjem na T- i B-limfocite, citokini su u stanju stimulirati antigenom inducirane procese u imunološkom sistemu.

3. Za gene citokina postoje tri varijante ekspresije: a) ekspresija specifična za određenu fazu embrionalnog razvoja, b) konstitutivna ekspresija za regulaciju niza normalnih fizioloških funkcija, c) inducibilni tip ekspresije karakterističan za većinu citokini. Zaista, većinu citokina izvan upalnog odgovora i imunološkog odgovora ne sintetiziraju stanice. Ekspresija gena citokina počinje kao odgovor na prodiranje patogena u tijelo, antigensku iritaciju ili oštećenje tkiva. Molekularne strukture povezane s patogenom su među najjačim induktorima sinteze proinflamatornih citokina. Da bi se pokrenula sinteza citokina T-ćelija, potrebna je aktivacija ćelija specifičnim antigenom uz učešće receptora antigena T-ćelija.

4. Citokini se sintetišu kao odgovor na stimulaciju u kratkom vremenskom periodu. Sinteza se prekida zbog niza autoregulatornih mehanizama, uključujući povećanu nestabilnost RNK, i zbog postojanja negativnih povratnih informacija posredovanih prostaglandinima, kortikosteroidnim hormonima i drugim faktorima.

5. Jedan te isti citokin mogu proizvesti različite vrste ćelija u tijelu u različitim organima histogenetskog porijekla.

6. Citokini se mogu povezati sa membranama ćelija koje ih sintetišu, posedujući u obliku membranskog oblika puni spektar biološke aktivnosti i ispoljavaju svoje biološko dejstvo tokom međućelijskog kontakta.

7. Biološki efekti citokina su posredovani kroz specifične komplekse ćelijskih receptora koji vezuju citokine sa vrlo visokim afinitetom, a pojedinačni citokini mogu koristiti zajedničke podjedinice receptora. Citokinski receptori mogu postojati u rastvorljivom obliku, zadržavajući sposobnost da vežu ligande.

8. Citokini imaju pleiotropno biološko djelovanje. Isti citokin može djelovati na mnoge tipove stanica, uzrokujući različite efekte ovisno o vrsti ciljnih stanica (slika 1). Pleiotropno djelovanje citokina je osigurano ekspresijom citokinskih receptora na tipovima stanica različitog porijekla i funkcija i provođenjem signala korištenjem nekoliko različitih intracelularnih glasnika i faktora transkripcije.

9. Citokine karakteriše zamenljivost biološkog delovanja. Nekoliko različitih citokina može uzrokovati isti biološki učinak ili imati slične aktivnosti. Citokini induciraju ili potiskuju sintezu sebe, drugih citokina i njihovih receptora.

10. Kao odgovor na aktivacijski signal, ćelije istovremeno sintetiziraju nekoliko citokina koji učestvuju u formiranju mreže citokina. Biološki učinci u tkivima i na razini tijela ovise o prisutnosti i koncentraciji drugih citokina sa sinergističkim, aditivnim ili suprotnim učincima.

11. Citokini mogu uticati na proliferaciju, diferencijaciju i funkcionalnu aktivnost ciljnih ćelija.

12. Citokini djeluju na ćelije na različite načine: autokrini - na ćeliju koja sintetiše i luči ovaj citokin; parakrini - na stanicama koje se nalaze u blizini stanice proizvođača, na primjer, u žarištu upale ili u limfnom organu; endokrini - udaljeno do ćelija bilo kojeg organa i tkiva nakon ulaska u cirkulaciju. U potonjem slučaju, djelovanje citokina liči na djelovanje hormona (slika 2).

Rice. 1. Jedan te isti citokin mogu proizvoditi različite vrste ćelija u tijelu u različitim organima histogenetskog porijekla i djelovati na više tipova stanica, uzrokujući različite efekte ovisno o vrsti ciljnih stanica.

Rice. 2. Tri varijante ispoljavanja biološkog djelovanja citokina.

Očigledno, formiranje sistema regulacije citokina evolucijski se odvijalo uporedo s razvojem višećelijskih organizama i nastalo je zbog potrebe za stvaranjem medijatora međustanične interakcije, koji mogu uključivati hormone, neuropeptide, adhezione molekule i neke druge. U tom smislu, citokini su najsvestraniji regulatorni sistem, jer su u stanju da ispolje biološku aktivnost i na daljinu nakon sekrecije od strane ćelije koja proizvodi (lokalno i sistemski), i tokom međućelijskog kontakta, budući da su biološki aktivni u obliku membrane. Po tome se citokinski sistem razlikuje od adhezivnih molekula, koji obavljaju uže funkcije samo kada su ćelije u direktnom dodiru. Istodobno, citokinski sustav razlikuje se od hormona, koje uglavnom sintetiziraju specijalizirani organi i djeluju nakon ulaska u cirkulacijski sustav.

Uloga citokina u regulaciji fizioloških funkcija organizma.

Uloga citokina u regulaciji fizioloških funkcija tijela može se podijeliti u 4 glavne komponente:

1. Regulacija embriogeneze, uspostavljanja i razvoja organa, uklj. organa imunog sistema.

2. Regulacija određenih normalnih fizioloških funkcija.

3. Regulacija odbrambenih reakcija organizma na lokalnom i sistemskom nivou.

4. Regulacija procesa regeneracije tkiva.

Ekspresija gena pojedinačnih citokina javlja se specifično u određenim fazama embrionalnog razvoja. Faktor matičnih ćelija, transformišući faktori rasta, citokini porodice TNF i hemokini regulišu diferencijaciju i migraciju različitih ćelija i uspostavljanje organa imunog sistema. Nakon toga se sinteza nekih citokina možda neće nastaviti, dok drugi nastavljaju regulirati normalne fiziološke procese ili sudjelovati u razvoju zaštitnih reakcija.

Unatoč činjenici da je većina citokina tipični inducibilni medijatori i da ih u postnatalnom razdoblju ne sintetiziraju stanice izvan upalnog odgovora i imunološkog odgovora, neki citokini ne potpadaju pod ovo pravilo. Kao rezultat konstitutivne ekspresije gena, neki od njih se stalno sintetiziraju i u dovoljno velikim količinama su u cirkulaciji, regulirajući proliferaciju i diferencijaciju određenih tipova stanica tijekom života. Primjeri ove vrste fiziološke regulacije funkcija citokinima mogu biti konstantno visok nivo eritropoetina i nekih likvora koji osiguravaju hematopoezu. Regulacija odbrambenih reakcija organizma citokinima se odvija ne samo unutar imunološkog sistema, već i organizovanjem odbrambenih reakcija na nivou cijelog organizma reguliranjem gotovo svih aspekata razvoja upale i imunološkog odgovora. Ova funkcija, koja je najvažnija za ceo citokinski sistem, povezana je sa dva glavna pravca biološkog delovanja citokina – zaštitom od infektivnih agenasa i obnavljanjem oštećenih tkiva. Citokini prvenstveno regulišu razvoj lokalnih odbrambenih reakcija u tkivima uz učešće različitih vrsta krvnih zrnaca, endotela, vezivnog tkiva i epitela. Zaštita na lokalnom nivou razvija se formiranjem tipične upalne reakcije sa svojim klasičnim manifestacijama: hiperemijom, razvojem edema, pojavom boli i disfunkcije. Sinteza citokina počinje kada patogeni uđu u tkiva ili se naruši njihov integritet, što se obično odvija paralelno. Proizvodnja citokina je sastavni dio ćelijskog odgovora povezanog s prepoznavanjem ćelija mijelomonocitnog niza sličnih strukturnih komponenti različitih patogena, nazvanih molekularni obrasci povezani s patogenom. Primjeri takvih struktura patogena su lipopolisaharidi gram-negativnih bakterija, peptidoglikani gram-pozitivnih mikroorganizama, flagelin ili DNK bogata CpolyG sekvencama, što je tipično za DNK svih vrsta bakterija. Leukociti eksprimiraju odgovarajuće receptore za prepoznavanje uzoraka, koji se nazivaju i Toll-like receptori (TLR) i specifični za određene strukturne obrasce mikroorganizama. Nakon interakcije mikroorganizama ili njihovih komponenti sa TLR-om, pokreće se intracelularna kaskada transdukcije signala, što dovodi do povećanja funkcionalne aktivnosti leukocita i ekspresije citokinskih gena.

Aktivacija TLR dovodi do sinteze dvije glavne grupe citokina: proinflamatornih citokina i interferona tipa I, uglavnom IFNα/β.razvija upalne reakcije i pruža lepezastu ekspanziju aktivacije različitih tipova ćelija uključenih u održavanje i regulacija upale, uključujući sve vrste leukocita, dendritičnih ćelija, T i B-limfocita, NK ćelija, endotelnih i epitelnih ćelija, fibroblasta i dr. Ovo osigurava dosljedne faze u razvoju upalnog odgovora, koji je glavni mehanizam za implementaciju urođenog imuniteta. Osim toga, dendritične stanice počinju sintetizirati citokine iz porodice IL-12, stimulirajući diferencijaciju pomoćnih T-limfocita, što služi kao svojevrsni most do početka razvoja specifičnih imunoloških reakcija povezanih s prepoznavanjem specifičnih antigenskih struktura. mikroorganizama.

Drugi ne manje važan mehanizam povezan sa sintezom IFN-a omogućava implementaciju antivirusne zaštite. Interferoni tipa I pokazuju 4 glavna biološka svojstva:

1. Direktno antivirusno djelovanje blokiranjem transkripcije.

2. Suzbijanje proliferacije ćelija, neophodno za blokiranje širenja virusa.

3. Aktivacija funkcija NK ćelija koje imaju sposobnost da liziraju virusom inficirane tjelesne ćelije.

4. Pojačana ekspresija molekula kompleksa glavne histokompatibilnosti klase I potrebnih za povećanje efikasnosti prezentacije virusnih antigena od strane inficiranih ćelija citotoksičnim T-limfocitima. To dovodi do aktivacije specifičnog prepoznavanja virusom inficiranih stanica od strane T-limfocita - prva faza lize virusom inficiranih ciljnih stanica.

Kao rezultat toga, pored direktnog antivirusnog djelovanja, aktiviraju se i mehanizmi urođenog (NK ćelije) i stečenog (T-limfociti) imuniteta. Ovo je primjer kako je jedna mala molekula citokina s MM 10 puta manjim od MM molekula antitijela sposobna aktivirati potpuno različite mehanizme odbrambenih reakcija zbog pleiotropnog tipa biološkog djelovanja, usmjerenog na ispunjenje jednog cilja - uklanjanja virusa koji je ušao u telo.

Na nivou tkiva, citokini su odgovorni za razvoj upale, a zatim i regeneraciju tkiva. Sa razvojem sistemskog inflamatornog odgovora (odgovor akutne faze), citokini utiču na skoro sve organe i sisteme tela uključene u regulaciju homeostaze. Djelovanje proinflamatornih citokina na centralni nervni sistem dovodi do smanjenja apetita i promjene u cjelokupnom kompleksu bihevioralnih reakcija. Privremeno zaustavljanje potrage za hranom i smanjenje seksualne aktivnosti korisno je u smislu uštede energije za jedan zadatak – borbu protiv invazivnog patogena. Ovaj signal daju citokini, jer njihov ulazak u cirkulaciju svakako znači da se lokalna obrana nije nosila s patogenom, pa je potrebna aktivacija sistemske upalne reakcije. Jedna od prvih manifestacija sistemske upalne reakcije povezane s djelovanjem citokina na termoregulacijski centar hipotalamusa je povećanje tjelesne temperature. Povećanje temperature je efikasna zaštitna reakcija, jer se na povišenim temperaturama smanjuje sposobnost brojnih bakterija da se razmnožavaju, ali se, naprotiv, povećava proliferacija limfocita.

U jetri se pod utjecajem citokina povećava sinteza proteina akutne faze i komponenti komplementnog sistema neophodnih za borbu protiv patogena, ali se istovremeno smanjuje sinteza albumina. Drugi primjer selektivnog djelovanja citokina je promjena jonskog sastava krvne plazme tokom razvoja sistemske upalne reakcije. U ovom slučaju dolazi do smanjenja nivoa jona gvožđa, ali povećanja nivoa jona cinka, a poznato je da lišavanje bakterijske ćelije iona gvožđa znači smanjenje njenog proliferativnog potencijala (zasnovano je delovanje laktoferina). na ovom). S druge strane, povećanje nivoa cinka neophodno je za normalno funkcionisanje imunog sistema, a posebno je neophodno za stvaranje biološki aktivnog serumskog timusnog faktora - jednog od glavnih hormona timusa koji obezbeđuje diferencijaciju limfocita. Efekat citokina na hematopoetski sistem povezan je sa značajnom aktivacijom hematopoeze. Povećanje broja leukocita potrebno je kako bi se nadoknadio gubitak i povećao broj stanica, uglavnom neutrofilnih granulocita, u žarištu gnojne upale. Djelovanje na sistem zgrušavanja krvi usmjereno je na poboljšanje koagulabilnosti, što je neophodno za zaustavljanje krvarenja i direktno blokiranje patogena.

Dakle, s razvojem sistemske upale, citokini pokazuju veliki raspon bioloških aktivnosti i ometaju rad gotovo svih tjelesnih sistema. Međutim, nijedna od promjena nije slučajne prirode: sve su ili potrebne za direktnu aktivaciju odbrambenih reakcija ili su korisne u smislu prebacivanja energetskih tokova za samo jedan zadatak – borbu protiv invazivnog patogena. U vidu regulacije ekspresije pojedinih gena, hormonskih pomaka i promjena u reakcijama ponašanja, citokini osiguravaju aktivaciju i maksimalnu efikasnost rada onih tjelesnih sistema koji su u datom trenutku potrebni za razvoj zaštitnih reakcija. Na nivou cijelog organizma, citokini komuniciraju između imunološkog, nervnog, endokrinog, hematopoetskog i drugih sistema i služe da ih uključe u organizaciju i regulaciju jedne odbrambene reakcije. Citokini služe kao organizacioni sistem koji formira i reguliše čitav kompleks odbrambenih reakcija organizma tokom unošenja patogena. Po svemu sudeći, takav regulatorni sistem je formiran evolucijski i nosi bezuslovne koristi za najoptimalniji zaštitni odgovor makroorganizma. Stoga je, očigledno, nemoguće ograničiti koncept odbrambenih reakcija samo na učešće nespecifičnih mehanizama rezistencije i specifičnog imunološkog odgovora. Cijelo tijelo i svi sistemi koji na prvi pogled nisu vezani za održavanje imuniteta učestvuju u jednoj zaštitnoj reakciji.

Posebna istraživanja citokina.

Značaj citokina u patogenezi upalnih bolesti debelog crijeva kod djece.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mikhailova. Ruski državni medicinski univerzitet, Državni istraživački centar za koloproktologiju u Moskvi i Državni istraživački institut visoko čiste biologije iz Sankt Peterburga rade na proučavanju važnosti citokina u patogenezi upalnih bolesti debelog crijeva kod djece. Hronične upalne bolesti gastrointestinalnog trakta trenutno zauzimaju jedno od vodećih mjesta u patologiji probavnog sustava kod djece. Poseban značaj pridaje se inflamatornim bolestima debelog crijeva (IBD), čija je incidencija u stalnom porastu u cijelom svijetu. Dug tijek s čestim, au nekim slučajevima i fatalnim recidivima, razvojem lokalnih i sistemskih komplikacija - sve to podstiče na temeljito proučavanje patogeneze bolesti u potrazi za novim pristupima liječenju IBD-a. Posljednjih decenija učestalost ulceroznog kolitisa (UC) iznosila je 510 slučajeva godišnje na 100 hiljada stanovnika, sa Crohnovom bolešću (CD) 16 slučajeva godišnje na 100 hiljada stanovnika. Stope prevalencije u Rusiji, u moskovskoj regiji odgovaraju prosječnim evropskim podacima, ali znatno niže nego u skandinavskim zemljama, Americi, Izraelu i Engleskoj. Za NUC, prevalencija je 19,3 na 100 hiljada, incidencija je 1,2 na 100 hiljada ljudi godišnje. Za CD, prevalencija je 3,0 na 100 hiljada, incidencija je 0,2 na 100 hiljada ljudi godišnje. Činjenica da je najveća učestalost zabilježena u visokorazvijenim zemljama nije samo zbog društvenih i ekonomskih faktora, već i zbog genetskih i imunoloških karakteristika pacijenata, koje određuju predispoziciju za IBD. Ovi faktori su fundamentalni u imunopatogenetskoj teoriji nastanka IBD. Virusne i/ili bakterijske teorije objašnjavaju samo akutni početak bolesti, a kronizacija procesa je zbog genetske predispozicije i karakteristika imunološkog odgovora, koje su također genetski određene. Treba napomenuti da je IBTC trenutno klasifikovan kao bolest sa genetski heterogenom kompleksnom predispozicijom. Identificirano je više od 15 potencijalnih gena kandidata iz 2 grupe (imunospecifične i imunoregulatorne), koji uzrokuju nasljednu predispoziciju. Najvjerojatnije, predispoziciju određuje nekoliko gena koji određuju prirodu imunoloških i upalnih reakcija. Na osnovu rezultata brojnih studija može se zaključiti da su najvjerovatnija lokalizacija gena povezanih s razvojem IBT hromozoma 3, 7, 12 i 16. Trenutno se velika pažnja poklanja proučavanju karakteristika funkcije T i B limfocita, kao i citokina medijatora upale. Aktivno se proučava uloga interleukina (IL), interferona (IFN), faktora tumorske nekroze-a (TNF-a), makrofaga i autoantitijela na proteine sluzokože debelog crijeva i automikrofloru. Otkrivene su karakteristike njihovih poremećaja kod KK i UC, ali je još uvijek nejasno da li se te promjene javljaju primarno ili sekundarno. Za razumijevanje mnogih aspekata patogeneze, studije provedene u pretkliničkoj fazi IBD-a, kao i kod prvostepenih srodnika, bile bi veoma važne. Među medijatorima upale posebnu ulogu imaju citokini, koji su grupa polipeptidnih molekula mase od 5 do 50 kDa, koji učestvuju u formiranju i regulaciji odbrambenih reakcija organizma. Na nivou tijela, citokini komuniciraju između imunološkog, nervnog, endokrinog, hematopoetskog i drugih sistema i služe za njihovo uključivanje u organizaciju i regulaciju odbrambenih reakcija. Klasifikacija citokina je prikazana u Tabeli 2. Većinu citokina ne sintetiziraju ćelije izvan inflamatornog odgovora i imunološkog odgovora. Ekspresija gena citokina počinje kao odgovor na prodiranje patogena u tijelo, antigensku iritaciju ili oštećenje tkiva. Jedan od najmoćnijih induktora sinteze citokina su komponente bakterijskih ćelijskih zidova: LPS, peptidoglikani i muramildipeptidi. Proizvođači proinflamatornih citokina su uglavnom monociti, makrofagi, T-ćelije itd. Ovisno o dejstvu na upalni proces, citokini se dijele u dvije grupe: proinflamatorne (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g ) i protuupalno (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukin-1 (IL-1) je imunoregulatorni medijator koji se oslobađa tokom upalnih reakcija, oštećenja tkiva i infekcija (proinflamatorni citokin). IL-1 igra važnu ulogu u aktivaciji T ćelija kada su u interakciji sa antigenom. Postoje 2 tipa IL-1: IL-1a i IL-1b, proizvodi dva različita genska lokusa koji se nalaze na ljudskom hromozomu 2. IL-1a ostaje unutar ćelije ili može biti u obliku membrane i pojavljuje se u malim količinama u ekstracelularnom prostoru. Uloga membranskog oblika IL-1a je prijenos aktivirajućih signala od makrofaga do T-limfocita i drugih stanica tokom međućelijskog kontakta. IL-1a je glavni posrednik kratkog dometa. Za razliku od IL-1a, IL-1b aktivno izlučuju ćelije, djelujući sistemski i lokalno. Danas je poznato da je IL-1 jedan od glavnih medijatora upalnih reakcija, stimuliše proliferaciju T-ćelija, povećava ekspresiju IL-2 receptora na T-ćelijama i njihovu proizvodnju IL-2. IL-2 zajedno sa antigenom inducira aktivaciju i adheziju neutrofila, stimuliše stvaranje drugih citokina (IL-2, IL-3, IL-6, itd.) aktiviranim T-ćelijama i fibroblastima, stimuliše proliferaciju fibroblasta i endotelnih ćelija. Sistemski, IL-1 djeluje sinergijski s TNF-a i IL-6. Sa povećanjem koncentracije u krvi, IL-1 utiče na ćelije hipotalamusa i izaziva povećanje telesne temperature, groznicu, pospanost, smanjen apetit, a takođe stimuliše ćelije jetre da proizvode proteine akutne faze (CRP, amiloid A, a-2 makroglobulin i fibrinogen). IL4 (hromozom 5). Inhibira aktivaciju makrofaga i blokira mnoge efekte koje stimulira IFNg, kao što je proizvodnja IL1, dušikovog oksida i prostaglandina, igra važnu ulogu u protuupalnim reakcijama, ima imunosupresivno djelovanje. IL6 (hromozom 7), jedan od glavnih proinflamatornih citokina, glavni je induktor završne faze diferencijacije B ćelija i makrofaga, snažan stimulator proizvodnje proteina akutne faze ćelijama jetre. Jedna od glavnih funkcija IL6 je stimulacija proizvodnje antitijela in vivo i in vitro. IL8 (hromozom 4). Odnosi se na hemokinske posrednike koji uzrokuju usmjerenu migraciju (hemotaksu) leukocita u žarište upale. Glavna funkcija IL10 je inhibicija proizvodnje citokina od strane Thelpera tipa I (TNFb, IFNg) i aktiviranih makrofaga (TNF-a, IL1, IL12). Danas je poznato da su tipovi imunog odgovora povezani sa jednom od varijanti aktivacije limfocita sa dominantnim učešćem klonova T limfocitnih pomagača prvog tipa (TH2) ili drugog tipa (TH3). Proizvodi TH2 i TH3 negativno utiču na aktivaciju suprotnih klonova. Prekomjerna aktivacija bilo kojeg od tipova Th klonova može usmjeriti imunološki odgovor prema jednoj od razvojnih opcija. Hronična neravnoteža u aktivaciji Th klonova dovodi do razvoja imunopatoloških stanja. Promjene citokina kod IBTD-a mogu se proučavati na različite načine određivanjem njihovog nivoa u krvi ili in situ. Nivo IL1 je povišen kod svih upalnih bolesti crijeva. Razlike između NNC i CD su u povećanoj ekspresiji IL2. Ako se u NUC nađe snižen ili normalan nivo IL2, onda se u CD-u otkriva njegov povišeni nivo. Sadržaj IL4 raste u NUC, dok u CD ostaje normalan ili se čak smanjuje. Nivo IL6, koji posreduje u reakcijama akutne faze, također je povećan kod svih oblika upale. Dobijeni podaci o profilu citokina su omogućili da se sugeriše da se dva glavna oblika hronične IBD karakterišu različitom aktivacijom i ekspresijom citokina. Rezultati studija pokazuju da je profil citokina uočen kod pacijenata sa UC konzistentniji sa TH3 profilom, dok se profil TH2 treba smatrati karakterističnijim za pacijente sa CD. Atraktivnost ove hipoteze o ulozi TH2 i TH3 profila je i to što upotreba citokina može promijeniti imunološki odgovor u jednom ili drugom smjeru i dovesti do remisije uz uspostavljanje ravnoteže citokina. To se može potvrditi, posebno, upotrebom IL10. Dalja istraživanja bi trebala pokazati da li je odgovor citokina sekundarni fenomen kao odgovor na stimulaciju ili, naprotiv, ekspresija odgovarajućih citokina određuje reaktivnost organizma s razvojem naknadnih kliničkih manifestacija. Proučavanje nivoa citokina kod IBD kod djece još nije provedeno. Ovaj rad je prvi dio naučne studije posvećene proučavanju statusa citokina u IBD -u kod djece. Cilj ovog rada bio je proučavanje humoralne aktivnosti makrofaga uz određivanje nivoa (IL1a, IL8) u krvi dece sa NUC i CD, kao i njihovu dinamiku tokom terapije. Od 2000. do 2002. godine, 34 djece sa NUC -om i 19 djece sa CD -om u dobi od 4 do 16 godina pregledano je na odjelu gastroenterologije Ruske dječje kliničke bolnice. Dijagnoza je verificirana anamnestički, endoskopski i morfološki. Proučavanje nivoa proinflamatornih citokina IL1a, IL8 sprovedeno je metodom enzimski imunosorbentnog testa (ELISA). Za određivanje koncentracije IL1a, IL8 koristili smo testne sisteme proizvođača OOO Cytokin (Sankt Peterburg, Rusija). Analiza je obavljena u laboratoriji za imunofarmakologiju Državnog naučnog centra Istraživačkog instituta za visoko čiste biopreparacije (rukovodilac laboratorije, dr. med., prof. AS Simbirtsev). Rezultati dobijeni tokom istraživanja pokazali su značajno povećanje nivoa IL1a, IL8 tokom perioda egzacerbacije, izraženije kod dece sa NUC nego kod dece sa CD. Bez egzacerbacije, nivoi proinflamatornih citokina se smanjuju, ali ne dostižu normu. U UC-u, nivoi IL-1a, IL-8 su povećani u periodu pogoršanja kod 76,2% i kod 90% djece, au periodu remisije-za 69,2% i 92,3%, respektivno. Kod CD-a, nivoi IL-1a, IL-8 su povećani u periodu egzacerbacije kod 73,3% i 86,6% dece, au periodu remisije - kod 50% i 75%, respektivno.

U zavisnosti od težine bolesti, djeca su primala terapiju aminosalicilatima ili glukokortikoidima. Priroda terapije značajno je uticala na dinamiku nivoa citokina. Tokom terapije aminosalicilatima, nivoi proinflamatornih citokina u grupi dece sa NUC i CD bili su značajno viši od onih u kontrolnoj grupi. U isto vrijeme, veće stope zabilježene su u grupi djece sa UK. U NUC na pozadini terapije aminosalicilatom, IL1a, IL8 su povećani kod 82,4%, odnosno 100% djece, dok su tokom terapije glukokortikoidima kod 60% djece za oba citokina. Kod CD-a, IL1a, IL8 su povišeni tokom terapije aminosalicilatima kod sve dece, a tokom terapije glukokortikoidima kod 55,5% i 77,7% dece, respektivno. Dakle, rezultati ove studije ukazuju na značajnu uključenost makrofagne veze imunog sistema u patogenetski proces kod većine dece sa UC i CD. Podaci dobijeni u ovoj studiji se suštinski ne razlikuju od podataka dobijenih tokom pregleda odraslih pacijenata. Razlike u nivoima IL1a i IL8 kod pacijenata sa UC i CD su kvantitativne, ali ne i kvalitativne, što ukazuje na nespecifičnost ovih promena usled toka hroničnog upalnog procesa. Stoga ovi pokazatelji nemaju dijagnostičku vrijednost. Rezultati dinamičkog istraživanja nivoa IL1a i IL8 potvrđuju veću efikasnost terapije glukokortikoidnim lijekovima u odnosu na terapiju aminosalicilima. Prikazani podaci su rezultat prve faze proučavanja citokinskog statusa djece sa IBT. Potrebno je dalje proučavanje problema, uzimajući u obzir indikatore drugih proupalnih i antiinflamatornih citokina.

Uloga dušikovog oksida i citokina u razvoju sindroma akutne ozljede pluća.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya proučavaju ovaj problem: Katedra za anesteziologiju i reanimatologiju Državnog medicinskog univerziteta Vladivostok. Sindrom akutne ozljede pluća (odrasli respiratorni distres sindrom, ARDS) je jedan od najtežih oblika akutne respiratorne insuficijencije koji se javlja kod pacijenata u pozadini teške traume, sepse, peritonitisa, pankreatitisa, obilnog gubitka krvi, aspiracije, nakon opsežnih hirurških intervencija. a u 50 60% slučajeva su fatalne. Podaci istraživanja o patogenezi ARDS-a, razvoju kriterija za ranu dijagnozu i prognozu sindroma su mali, prilično kontradiktorni, što ne dozvoljava razvoj koherentnog dijagnostičkog i terapijskog koncepta. Utvrđeno je da se ARDS zasniva na oštećenju endotela plućnih kapilara i alveolarnog epitela, kršenju reoloških svojstava krvi, što dovodi do edema intersticijalnog i alveolarnog tkiva, upale, atelektaze, plućne hipertenzije. U literaturi posljednjih godina ima dovoljno podataka o univerzalnom regulatoru staničnog i tkivnog metabolizma - dušičnom oksidu. Interes za dušikov oksid (NO) prvenstveno je posljedica činjenice da je uključen u regulaciju mnogih funkcija, uključujući vaskularni tonus, kontraktilnost srca, agregaciju trombocita, neurotransmisiju, sintezu ATP-a i proteina i imunološku odbranu. Osim toga, ovisno o izboru molekularne mete i karakteristikama interakcije s njom, NO ima i štetno djelovanje. Vjeruje se da je pokretački mehanizam aktivacije stanica neuravnotežena citokinemija. Citokini su rastvorljivi peptidi koji deluju kao posrednici imunog sistema i obezbeđuju ćelijsku saradnju, pozitivnu i negativnu imunoregulaciju. Pokušali smo da sistematizujemo informacije dostupne u literaturi o ulozi NO i citokina u nastanku sindroma akutnog oštećenja pluća. NO je gas rastvorljiv u vodi i mastima. Njegova molekula je nestabilan slobodni radikal, lako difundira u tkivo, apsorbira se i uništava tako brzo da može djelovati samo na stanice u neposrednom okruženju. Molekula NO ima sva svojstva svojstvena klasičnim glasnicima: brzo se proizvodi, djeluje u vrlo niskim koncentracijama, nakon prestanka vanjskog signala brzo se pretvara u druga jedinjenja, oksidirajući u stabilne anorganske okside dušika: nitrite i nitrate. Životni vek NO u tkivu je, prema različitim izvorima, od 5 do 30 sekundi. Glavne molekularne mete NO su enzimi i proteini koji sadrže željezo: rastvorljiva gvanilat ciklaza, sama nitrooksid sintaza (NOS), hemoglobin, mitohondrijski enzimi, enzimi Krebsovog ciklusa, sinteza proteina i sinteza DNK. Do sinteze NO u tijelu dolazi putem enzimskih transformacija dijela aminokiseline L-arginina koji sadrži dušik pod utjecajem specifičnog enzima NOS, a posreduje se interakcijom kalcijevih iona s kalmodulinom. Enzim se inaktivira pri niskim koncentracijama i maksimalno je aktivan pri 1 μM slobodnog kalcija. Identificirane su dvije izoforme NOS: konstitutivni (cNOS) i inducirani (iNOS), koji su produkti različitih gena. CNOS ovisan o kalcijum-kalmodulinu je stalno prisutan u ćeliji i potiče oslobađanje malih količina NO kao odgovor na receptor i fizičku stimulaciju. NO, nastao pod uticajem ove izoforme, deluje kao nosilac u nizu fizioloških odgovora. INOS nezavisan od kalcijuma i kalmodulina stvara se u različitim tipovima ćelija kao odgovor na proupalne citokine, endotoksine i oksidante. Ovu izoformu NOS transkribuju specifični geni na hromozomu 17 i podstiče sintezu velikih količina NO. Enzim je takođe klasifikovan u tri tipa: NOS-I (neuronski), NOS-II (makrofagi), NOS-III (endotelni). Porodica enzima koji sintetiziraju NO nalazi se u raznim plućnim stanicama: u epitelnim stanicama bronha, u alveolocitima, u alveolarnim makrofagima, u mastocitima, u endotelnim stanicama bronhijalnih arterija i vena, u glatkim miocitima bronha i krvnih sudova, kod neadrenergičkih nekolinergičkih neurona. Konstitutivna sposobnost epitelnih ćelija bronha i alveola ljudi i sisara da luče NO potvrđena je u brojnim studijama. Utvrđeno je da su gornji dijelovi ljudskih disajnih puteva, kao i donji, uključeni u stvaranje NO. Istraživanja provedena kod pacijenata sa traheostomom pokazala su da je količina plina u zraku koji se izdiše kroz traheostomu znatno manja nego u nosnoj i usnoj šupljini. Sinteza endogenog NO kod pacijenata na mehaničkoj ventilaciji značajno trpi. Istraživanja potvrđuju da do oslobađanja NO dolazi u vrijeme bronhodilatacije i da ga kontrolira vagusni nervni sistem. Dobijeni su podaci da se formiranje NO u epitelu respiratornog trakta ljudi povećava kod upalnih bolesti respiratornog sistema. Sinteza plinova je povećana zbog aktivacije induciranog NOS pod utjecajem citokina, kao i endotoksina i lipopolisaharida.

Trenutno je poznato više od stotinu citokina, koji se tradicionalno dijele u nekoliko grupa.

1. Interleukini (IL-1 - IL18) - sekretorni regulatorni proteini koji obezbeđuju interakcije medijatora u imunom sistemu i njegovu vezu sa drugim sistemima tela.

2. Interferoni (IFN-alfa, beta, gama) - antivirusni citokini sa izraženim imunoregulatornim efektom.

3. Faktori tumorske nekroze (TNF alfa, beta) su citokini sa citotoksičnim i regulatornim efektima.

4. Faktori koji stimulišu kolonije (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - stimulatori rasta i diferencijacije hematopoetskih ćelija, regulišu hematopoezu.

5. Hemokini (IL-8, IL-16)-hemoatraktanti za leukocite.

6. Faktori rasta - regulatori rasta, diferencijacije i funkcionalne aktivnosti ćelija različite pripadnosti tkiva (faktor rasta fibroblasta, faktor rasta endotelnih ćelija, epidermalni faktor rasta) i transformirajući faktori rasta (TGF beta).

Ovi bioregulatorni molekuli određuju vrstu i trajanje upalnog i imunološkog odgovora, kontroliraju proliferaciju stanica, hematopoezu, angiogenezu, zacjeljivanje rana i mnoge druge procese. Svi istraživači naglašavaju da citokini nemaju specifičnost za antigene. Eksperimenti sa uzgojenim plućnim makrofagima i mastocitima pokazali su stvaranje iNOS-a kao odgovor na interferon gama, interleukin-1, faktor nekroze tumora i lipopolisaharide. Ekspresija iNOS i cNOS za proinflamatorne citokine pronađena je u životinjskim i ljudskim alveolocitima. Dodavanjem epidermalnog faktora rasta, regulatora funkcije epitelnih stanica u kulturu, smanjena je aktivnost samo induciranog enzima. Poznato je da, u zavisnosti od prirode, citokini deluju autokrino - na same ćelije koje proizvode, parakrino - na druge ciljne ćelije ili endokrino - na različite ćelije van mesta njihove proizvodnje. U isto vrijeme, oni mogu međusobno komunicirati prema agonističkom ili antagonističkom principu, mijenjajući funkcionalno stanje ciljnih stanica i formirajući mrežu citokina. Dakle, citokini nisu izolovani peptidi, već integralni sistem, čije su glavne komponente ćelije proizvođači, sam protein je citokin, njegov receptor i ciljna ćelija. Utvrđeno je da se razvojem akutne povrede pluća povećava nivo proinflamatornih citokina: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Njihov učinak povezan je s vazodilatacijom, povećanjem njihove propusnosti i nakupljanjem tekućine u plućnom tkivu. Osim toga, studije su pokazale sposobnost IFN gama i TNF alfa da indukuju ekspresiju molekula adhezije - ICAM -1 na ljudskim endoteliocitima. Adhezione molekule, prianjajući za leukocite, trombocite i endotelne ćelije, formiraju "kotrljajuće" neutrofile i potiču agregaciju čestica fibrina. Ovi procesi doprinose kršenju kapilarnog krvotoka, povećavaju propusnost kapilara i izazivaju lokalni edem tkiva. Usporavanje kapilarnog protoka krvi pospješuje aktivacija NO, što uzrokuje dilataciju arteriola. Daljnju migraciju leukocita u žarište upale kontroliraju posebni citokini - hemokini, koje proizvode i luče ne samo aktivirani makrofagi, već i endotelne stanice, fibroblasti, glatki miociti. Njihova glavna funkcija je da opskrbe neutrofile žarištu upale i aktiviraju njihovu funkcionalnu aktivnost. Glavni hemokin za neutrofile je Il-8. Njegovi najmoćniji induktori su bakterijski lipopolisaharidi, IL-1 i TNFalfa. R. Bahra i dr. vjeruju da je svaki korak transendotelne migracije neutrofila reguliran stimulirajućim koncentracijama TNF alfa. S razvojem akutne ozljede pluća aktiviraju se vaskularni endoteliociti, epitelne stanice bronha i alveolarni makrofagi koji su uključeni u fazne interakcije. Kao rezultat, s jedne strane dolazi do njihove mobilizacije i jačanja zaštitnih svojstava, a s druge strane moguće je oštećenje samih stanica i okolnih tkiva. Brojna istraživanja su pokazala da se proizvod djelomične redukcije kisika, superoksid, može akumulirati u žarištu upale, što inaktivira vazoaktivni učinak NO. NO i superoksidni anion brzo reaguju i formiraju peroksinitrit koji oštećuje ćelije. Ova reakcija potiče uklanjanje NO iz vaskularnih i bronhijalnih zidova, kao i sa površine alveolocita. Studije koje pokazuju da se tradicionalno smatra posrednikom toksičnosti NO, peroksinitrit može imati fiziološki učinak i izazvati vaskularnu relaksaciju putem NO-posredovanog povećanja cGMP-a u vaskularnom endotelu. Zauzvrat, peroksinitrit je moćan oksidans koji može oštetiti alveolarni epitel i plućni surfaktant. Izaziva uništavanje membranskih proteina i lipida, oštećuje endotel, povećava agregaciju trombocita i učestvuje u endotoksemiji. Njegovo povećano stvaranje zabilježeno je kod sindroma akutne ozljede pluća. Istraživači vjeruju da je NO proizveden kao rezultat aktivacije induciranog enzima namijenjen nespecifičnoj zaštiti organizma od širokog spektra patogenih agenasa, inhibira agregaciju trombocita i poboljšava lokalnu cirkulaciju krvi. Utvrđeno je da prekomjerna količina NO potiskuje aktivnost cNOS u stanicama zbog interakcije sa superoksidom i, moguće, kao rezultat desenzibilizacije gvanilat ciklaze, što dovodi do smanjenja cGMP u ćeliji i povećanja intracelularnog kalcija. . Brett et al. i Kooy et al., analizirajući važnost nitrooksidergijskih mehanizama u patogenezi ARDS-a, sugeriraju da iNOS, peroksinitrit i nitrotirozin, glavni proizvod učinka peroksinitrita na protein, mogu igrati ključnu ulogu u razvoju sindroma. Cuthbertson et al. vjeruju da je osnova akutne ozljede pluća djelovanje NO i peroksinitrita na elastazu i interleukin-8. Kobayashi i dr. također je zabilježen porast sadržaja iNOS, interleukina-1, interleukina-6, interleukina-8 u bronhoalveolarnoj tekućini kod pacijenata sa sindromom akutnog oštećenja pluća. Meldrum et al. pokazalo smanjenje proizvodnje upalnih citokina od strane plućnih makrofaga kod ARDS-a pod utjecajem supstrata lokalne proizvodnje NO - L-arginina. Utvrđeno je da u nastanku sindroma akutne ozljede pluća značajnu ulogu ima oštećenje vaskularne permeabilnosti uzrokovano djelovanjem citokina - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monoklonskih antitijela na CD3 limfocite na vaskularne endotelne stanice pluća i imunocita. Brzo i snažno povećanje permeabilnosti plućnih žila dovodi do migracije neutrofila u plućno tkivo i otpuštanja citotoksičnih medijatora od njih, što vodi u razvoju patološke plućne alteracije. Tijekom razvoja akutne ozljede pluća, TNF alfa povećava adheziju neutrofila na vaskularnu stijenku, pojačava njihovu migraciju u tkiva, potiče strukturne i metaboličke promjene u endoteliocitima, narušava propusnost staničnih membrana, aktivira stvaranje drugih citokina i eikozanoida, te izaziva apoptozu i nekrozu epitelnih stanica pluća. Dobijeni podaci ukazuju da je apoptoza makrofaga izazvana uvođenjem LPS-a u velikoj meri povezana sa IFN gama i redukovana je delovanjem IL-4, IL-10, TGF beta. Međutim, Kobayashi et al. dobijeni podaci koji ukazuju da IFN gama može biti uključen u popravku epitela sluznice respiratornog trakta. Hagimotova istraživanja sadrže informacije da epitelne stanice bronha i alveola kao odgovor na TNF alfa ili Fas ligand oslobađaju IL-8, IL-12. Ovaj proces je povezan sa aktivacijom nuklearnog faktora Carr-B od strane Fas liganda.

Vjeruje se da je IL-8 jedan od najvažnijih citokina u patofiziologiji akutne plućne ozljede. Miller et al. u ispitivanju bronho-alveolarne tekućine kod pacijenata s ARDS-om na pozadini seze, pronađeno je značajno povećanje razine IL-8 u usporedbi s pacijentima s kardiogenim plućnim edemom. Sugerirano je da su primarni izvor Il-8 pluća, a ovaj kriterij se može koristiti u diferencijalnoj dijagnozi sindroma. Grau et al. smatraju da su endotelne ćelije plućnih kapilara važan izvor citokina - IL-6, IL-8 u nastanku akutnog oštećenja pluća. Goodman et al. Prilikom proučavanja dinamike nivoa citokina u tečnosti bronho-alveolarnog ispiranja kod pacijenata sa ARDS-om, značajno povećanje IL-1beta, IL-8, monocitnog hemotaktičkog peptida-1, epitelnog ćelijskog neutrofilnog aktivatora, inflamatornog peptida makrofaga -1 alfa je pronađena. U isto vrijeme, autori vjeruju da povećanje sadržaja IL-1 beta može poslužiti kao marker nepovoljnog ishoda sindroma. Bauer et al. pokazalo se da se kontrola sadržaja IL-8 u bronhoalveolarnoj tečnosti kod pacijenata sa ARDS-om može koristiti za praćenje, smanjenje nivoa IL-8 ukazuje na nepovoljan tok procesa. Brojna istraživanja sadrže i informacije da nivo proizvodnje citokina vaskularnim endotelom pluća utiče na razvoj akutne plućne povrede i čija se kontrola može koristiti u kliničkoj praksi za ranu dijagnozu. O mogućim negativnim posljedicama povećanja nivoa proinflamatornih citokina kod pacijenata sa ARDS-om svjedoče studije Martina i sar., Warnera i dr. Aktivirani citokinima i bakterijskim endotoksinima, alveolarni makrofagi povećavaju sintezu NO. Povećava se i nivo proizvodnje NO od strane bronhijalnih i alveolarnih epitelnih ćelija, neutrofila, mastocita, endotelnih ćelija i glatkih miocita plućnih sudova, verovatno kroz aktivaciju nuklearnog faktora Carr-B. Autori smatraju da je dušikov oksid nastao kao rezultat aktivacije induciranog NOS -a namijenjen prvenstveno nespecifičnoj obrani organizma. Oslobođen iz makrofaga, NO brzo prodire u bakterije i gljivice, gdje inhibira tri vitalne grupe enzima: transport H-elektrona, Krebsov ciklus i sintezu DNK. NO je uključen u odbranu tijela u posljednjim fazama imunološkog odgovora i figurativno se smatra "mačem za kažnjavanje" imunog sistema. Međutim, akumulirajući se u ćeliji u neadekvatno velikim količinama, NO ima i štetno djelovanje. Dakle, razvojem sindroma akutne ozljede pluća, citokini i NO pokreću uzastopni lanac reakcija izraženih u poremećenoj mikrocirkulaciji, hipoksiji tkiva, alveolarnom i intersticijskom edemu, te oštećenju metaboličke funkcije pluća. Stoga se može reći da je proučavanje fizioloških i patofizioloških mehanizama djelovanja citokina i NO obećavajuće područje za istraživanje i da će u budućnosti omogućiti ne samo proširenje razumijevanja patogeneze ARDS-a, već i utvrđivanje dijagnostičke i prognostičke markere sindroma, da se razviju opcije za patogenetski baziranu terapiju koja ima za cilj smanjenje smrtnosti.

Metode za određivanje citokina.

Pregled je posvećen glavnim metodama za proučavanje citokina koji se trenutno koriste. Ukratko su opisane mogućnosti i svrha metoda. Prikazane su prednosti i nedostaci različitih pristupa analizi ekspresije gena citokina na nivou nukleinskih kiselina i na nivou proizvodnje proteina. (Citokini i upala. 2005. T. 4, br. 1. S. 22-27.)

Citokini su regulatorni proteini koji formiraju univerzalnu mrežu medijatora, karakterističnu i za imuni sistem i za ćelije drugih organa i tkiva. Svi ćelijski događaji se odvijaju pod kontrolom ove klase regulatornih proteina: proliferacija, diferencijacija, apoptoza i specijalizovana funkcionalna aktivnost ćelija. Efekti svakog citokina na stanice su pleiotropni, spektar djelovanja različitih medijatora se preklapa i, općenito, konačno funkcionalno stanje stanice ovisi o utjecaju nekoliko citokina koji djeluju sinergistički. Dakle, citokinski sistem je univerzalna, polimorfna regulatorna mreža medijatora dizajnirana da kontroliše procese proliferacije, diferencijacije, apoptoze i funkcionalne aktivnosti ćelijskih elemenata u hematopoetskom, imunološkom i drugim homeostatskim sistemima organizma. Metode za određivanje citokina doživjele su vrlo brzu evoluciju tokom 20 godina intenzivnog proučavanja i danas predstavljaju čitavo područje naučnog znanja. Istraživači citokineologije na početku svog rada suočeni su s pitanjem izbora metode. I tu istraživač mora tačno znati koje informacije treba da dobije da bi postigao postavljeni cilj. Trenutno je razvijeno na stotine različitih metoda za procjenu citokinskog sistema, koje pružaju različite informacije o ovom sistemu. Procjena citokina u različitim biološkim medijima može se zasnivati na specifičnoj biološkoj aktivnosti. Mogu se kvantificirati korištenjem različitih metoda imunotestiranja korištenjem poli- i monoklonskih antitijela. Osim proučavanja sekretornih oblika citokina, moguće je proučavati njihov intracelularni sadržaj i proizvodnju u tkivima protočnom citometrijom, Western blottingom i in situ imunohistohemijom. Veoma važne informacije mogu se dobiti proučavanjem ekspresije mRNA citokina, stabilnosti mRNA, prisustva izoformi mRNA citokina, prirodnih antisens nukleotidnih sekvenci. Proučavanje alelnih varijanti citokinskih gena može pružiti važne informacije o genetski programiranoj visokoj ili niskoj proizvodnji jednog ili drugog medijatora. Svaka metoda ima svoje nedostatke i prednosti, svoju rezoluciju i tačnost određivanja. Neznanje i nerazumijevanje istraživača ovih nijansi može ga dovesti do lažnih zaključaka.

Određivanje biološke aktivnosti citokina.

Istorija otkrića i prvi koraci u proučavanju citokina bili su usko povezani sa uzgojem imunokompetentnih ćelija i ćelijskih linija. Zatim su prikazani regulatorni efekti (biološka aktivnost) niza rastvorljivih faktora proteinske prirode na proliferativnu aktivnost limfocita, na sintezu imunoglobulina, na razvoj imunoloških odgovora u in vitro modelima. Jedna od prvih metoda za određivanje biološke aktivnosti medijatora je određivanje faktora migracije humanih limfocita i faktora njegove inhibicije. Kako su proučavani biološki efekti citokina, pojavile su se različite metode za procjenu njihove biološke aktivnosti. Tako je IL-1 određen procjenom proliferacije mišjih timocita in vitro, IL-2 - sposobnošću da stimulira proliferativnu aktivnost limfoblasta, IL-3 - rastom hematopoetskih kolonija in vitro, IL-4 - pomoću komitogeno dejstvo, povećanom ekspresijom Ia-proteina, indukcijom stvaranja IgG1 i IgE itd. Lista ovih metoda se može nastaviti, stalno se ažurira kako se otkrivaju nove biološke aktivnosti rastvorljivih faktora. Njihov glavni nedostatak su nestandardne metode, nemogućnost njihovog ujedinjenja. Dalji razvoj metoda za određivanje biološke aktivnosti citokina doveo je do stvaranja velikog broja ćelijskih linija osjetljivih na jedan ili drugi citokin, odnosno multisenzitivnih linija. Većina ovih ćelija osjetljivih na citokine sada se može naći na komercijalnim listama ćelijskih linija. Na primjer, za testiranje IL-1a i b, koristi se D10S ćelijska linija, za IL-2 i IL-15-ćelijska linija CTLL-2, za IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL-13, GM-CSF - ćelijska linija TF-1, za IL-6 - ćelijska linija B9, za IL-7 - ćelijska linija 2E8, za TNFa i TNFb - ćelijska linija L929, za IFNg - ćelijska linija WiDr, za IL-18 - ćelijska linija KG-1. Međutim, ovaj pristup proučavanju imunoaktivnih proteina, zajedno sa dobro poznatim prednostima kao što su merenje stvarne biološke aktivnosti zrelih i aktivnih proteina, visoka reproduktivnost u standardizovanim uslovima, ima i svoje nedostatke. To uključuje, prije svega, osjetljivost staničnih linija ne na jedan citokin, već na nekoliko srodnih citokina, čiji se biološki efekti preklapaju. Osim toga, ne može se isključiti mogućnost indukcije proizvodnje drugih citokina od strane ciljnih stanica, što može poremetiti ispitivani parametar (po pravilu, proliferaciju, citotoksičnost, kemotaksu). Još ne znamo sve citokine i ne sve njihove efekte, stoga ne procjenjujemo sam citokin, već ukupnu specifičnu biološku aktivnost. Stoga je procjena biološke aktivnosti kao ukupne aktivnosti različitih medijatora (nedostatak specifičnosti) jedan od nedostataka ove metode. Osim toga, korištenjem linija osjetljivih na citokine, nemoguće je identificirati inaktivirane molekule i povezane proteine. To znači da takve metode ne odražavaju stvarnu proizvodnju za brojne citokine. Drugi važan nedostatak korištenja staničnih linija je potreba za laboratorijom za staničnu kulturu. Osim toga, svi postupci za uzgoj stanica, inkubaciju s proteinima i medijima koji se proučavaju oduzimaju puno vremena. Također treba napomenuti da dugotrajna upotreba ćelijskih linija zahtijeva obnavljanje ili recertifikaciju, jer kao rezultat uzgoja mogu mutirati i modificirati, što može dovesti do promjene njihove osjetljivosti na medijatore i smanjenja tačnosti određivanje biološke aktivnosti. Međutim, ova metoda je idealna za ispitivanje specifične biološke aktivnosti rekombinantnih medijatora.

Kvantifikacija citokina korištenjem antitijela.

Citokini koje proizvode imunokompetentne i druge vrste ćelija oslobađaju se u ekstracelularni prostor za sprovođenje parakrinih i autokrinih signalnih interakcija. Po koncentraciji ovih proteina u krvnom serumu ili u kondicioniranoj sredini može se suditi o prirodi patološkog procesa i o višku ili nedostatku određenih ćelijskih funkcija kod pacijenta. Metode za određivanje citokina upotrebom specifičnih antitela su danas najčešći sistemi za detekciju ovih proteina. Ove metode su prošle kroz čitav niz modifikacija koristeći različite oznake (radioizotopske, fluorescentne, elektrohemiluminiscentne, enzimske, itd.). Ako radioizotopske metode imaju brojne nedostatke povezane s upotrebom radioaktivne oznake i ograničenu vremensku mogućnost korištenja označenih reagensa (vrijeme poluraspada), tada su imunosorbentne metode povezane s enzimima našle najširu upotrebu. Oni se zasnivaju na vizualizaciji netopivih produkata enzimske reakcije, apsorbirajući svjetlost poznate talasne dužine, u količinama ekvivalentnim koncentraciji analita. Za vezivanje tvari koje se mjere koriste se antitijela nanesena na čvrstu polimernu bazu, a za vizualizaciju se koriste antitijela konjugirana s enzimima, obično alkalnom fosfatazom ili peroksidazom hrena. Prednosti metode su očigledne: visoka tačnost određivanja u standardizovanim uslovima skladištenja za reagense i procedure, kvantitativna analiza i reproduktivnost. Nedostaci uključuju ograničen raspon utvrđenih koncentracija, zbog čega se sve koncentracije koje prelaze određeni prag smatraju jednakim njemu. Treba napomenuti da vrijeme potrebno za završetak metode varira ovisno o preporukama proizvođača. Međutim, u svakom slučaju, riječ je o nekoliko sati potrebnih za inkubaciju i ispiranje reagensa. Osim toga, određuju se latentni i vezani oblici citokina, koji u svojoj koncentraciji mogu značajno premašiti slobodne oblike, uglavnom odgovorne za biološku aktivnost medijatora. Stoga je poželjno koristiti ovu metodu zajedno sa metodama za procjenu biološke aktivnosti medijatora. Druga modifikacija metode imunotestiranja, koja je našla široku primjenu, je elektrohemiluminiscencijska metoda (ECL) za određivanje proteina s antitijelima označenim rutenijumom i biotinom. Ova metoda ima sljedeće prednosti u odnosu na radioizotopske i enzimske imunotestove: jednostavnost implementacije, kratko vrijeme izvođenja metode, bez procedura ispiranja, mali volumen uzorka, širok raspon utvrđenih koncentracija citokina u serumu i u kondicioniranoj sredini, visoka osjetljivost metoda i njena ponovljivost. Metoda koja se razmatra je prihvatljiva za upotrebu u naučnim istraživanjima i kliničkim studijama. Sljedeća metoda za procjenu citokina u biološkim medijima razvijena je na temelju tehnologije protočne fluorimetrije. Omogućava vam da istovremeno procijenite do stotine proteina u uzorku. Trenutno su kreirani komercijalni kompleti za određivanje do 17 citokina. Međutim, prednosti ove metode određuju i njene nedostatke. Prvo, ovo je mukotrpnost izbora optimalnih uvjeta za određivanje nekoliko proteina, i drugo, proizvodnja citokina kaskadno raste s vrhovima proizvodnje u različito vrijeme. Stoga određivanje velikog broja proteina odjednom nije uvijek informativno. Opšti zahtjevi za metode imunotestiranja korištenjem tzv. "sendvič", pažljiv je odabir para antitijela koji omogućuje određivanje slobodnog ili vezanog oblika analiziranog proteina, što nameće ograničenja ovoj metodi i koje se uvijek mora uzeti u obzir pri tumačenju dobivenih podataka. Ove metode određuju ukupnu proizvodnju citokina od strane različitih ćelija, a istovremeno je o antigen-specifičnoj proizvodnji citokina od strane imunokompetentnih ćelija moguće suditi samo hipotetički. Trenutno je razvijen ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) sistem, koji u velikoj meri eliminiše ove nedostatke. Metoda omogućava polukvantitativnu procjenu proizvodnje citokina na nivou pojedinačnih ćelija. Visoka rezolucija ove metode omogućava da se proceni antigenom stimulisana proizvodnja citokina, što je veoma važno za procenu specifičnog imunološkog odgovora. Sljedeća metoda koja se široko koristi u naučne svrhe je intracelularno određivanje citokina protočnom citometrijom. Njegove prednosti su očigledne. Možemo fenotipski okarakterizirati populaciju stanica koje proizvode citokine i/ili odrediti spektar citokina koje proizvode pojedinačne stanice, uz mogućnost relativne kvantitativne karakterizacije ove proizvodnje. U isto vrijeme, opisana metoda je prilično komplicirana i zahtijeva skupu opremu. Sljedeća serija metoda, koje se uglavnom koriste u naučne svrhe, su imunohistokemijske metode pomoću označenih monoklonskih antitijela. Prednosti su očigledne - određivanje proizvodnje citokina direktno u tkivima (in situ), gdje se odvijaju različite imunološke reakcije. Međutim, razmatrane metode su veoma naporne i ne daju tačne kvantitativne podatke.

Određivanje citokina enzimskim imunotestom.

CJSC Vector-Best pod vodstvom T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov aktivno radi na određivanju citokina. Citokini su grupa polipeptidnih medijatora, često glikozilovanih, sa molekularnom težinom u rasponu od 8 do 80 kDa. Citokini su uključeni u formiranje i regulaciju odbrambenih reakcija tijela i homeostazu. Oni su uključeni u sve karike humoralnog i ćelijskog imunog odgovora, uključujući diferencijaciju imunokompetentnih progenitornih ćelija, prezentaciju antigena, ćelijsku aktivaciju i proliferaciju, ekspresiju molekula adhezije i odgovor akutne faze. Neki od njih su sposobni da ispolje mnoge biološke efekte u odnosu na različite ciljne ćelije. Djelovanje citokina na stanice vrši se na sljedeće načine: autokrino - na ćeliju koja sintetiše i luči ovaj citokin; parakrini - na stanicama koje se nalaze u blizini stanice proizvođača, na primjer, u žarištu upale ili u limfnom organu; endokrino -daljinski - na stanicama bilo kojih organa i tkiva nakon što citokin uđe u cirkulaciju krvi. Stvaranje i oslobađanje citokina obično je kratkotrajno i strogo regulirano. Citokini djeluju na ćeliju tako što se vezuju za specifične receptore na citoplazmatskoj membrani, uzrokujući na taj način kaskadu reakcija koje dovode do indukcije, pojačanja ili supresije aktivnosti brojnih gena koje oni reguliraju. Citokine karakterizira složena mrežna priroda funkcioniranja, u kojoj proizvodnja jednog od njih utječe na formiranje ili ispoljavanje aktivnosti niza drugih. Citokini su lokalni posrednici; stoga je preporučljivo mjeriti njihove razine u odgovarajućim tkivima nakon ekstrakcije proteina tkiva iz biopsije odgovarajućih organa ili u prirodnim tekućinama: urin, suzna tekućina, tekućina iz gingivalnog džepa, bronhoalveolarno ispiranje, vaginalni sekret, ejakulat , ispiranja iz šupljina, kičmene moždine ili sinovijalne tečnosti, itd. Dodatne informacije o stanju imunološkog sistema organizma mogu se dobiti proučavanjem sposobnosti krvnih ćelija da proizvode citokine in vitro. Nivoi citokina u plazmi odražavaju trenutno stanje imunog sistema i razvoj odbrambenih odgovora in vivo. Spontana proizvodnja citokina kulturom mononuklearnih ćelija periferne krvi omogućava procjenu stanja odgovarajućih stanica. Povećana spontana proizvodnja citokina ukazuje da su ćelije već aktivirane antigenom in vivo. Indukovana proizvodnja citokina omogućava procjenu potencijalne sposobnosti odgovarajućih stanica da odgovore na antigensku stimulaciju. Smanjena indukcija citokina in vitro, na primjer, može poslužiti kao jedan od znakova stanja imunodeficijencije. Stoga su obje mogućnosti za proučavanje nivoa citokina u cirkulirajućoj krvi i tijekom njihove proizvodnje u staničnim kulturama važne sa stajališta karakterizacije imunoreaktivnosti cijelog organizma i funkcije pojedinih karika imunološkog sistema. Donedavno se u Rusiji nekoliko grupa istraživača bavilo proučavanjem citokina, budući da biološke metode istraživanja oduzimaju puno vremena, a uvezeni imunokemijski setovi su vrlo skupi. Sa pojavom dostupnih domaćih kompleta imunosorbenta vezanih za enzime, liječnici pokazuju sve veći interes za proučavanje profila citokina. U ovom trenutku dijagnostički značaj procjene nivoa citokina je konstatovati samu činjenicu povećanja ili smanjenja njihove koncentracije kod određenog pacijenta sa specifičnom bolešću. Štoviše, za procjenu težine i predviđanje tijeka bolesti, preporučljivo je odrediti koncentraciju i protuupalnih i protuupalnih citokina u dinamici razvoja patologije. Na primjer, sadržaj citokina u perifernoj krvi određen je vremenom egzacerbacije, odražava dinamiku patološkog procesa kod peptičke ulkusne bolesti i drugih bolesti gastrointestinalnog trakta. U najranijim fazama egzacerbacije prevladava povećanje sadržaja interleukina-1beta (IL-1beta), interleukina-8 (IL-8), zatim koncentracije interleukina-6 (IL-6), gama-interferona (gama -INF), faktor tumorske nekroze povećava -alfa (alfa-TNF). Koncentracija interleukin-12 (IL-12), gama-INF, alfa-TNF dostigla je svoj maksimum na vrhuncu bolesti, dok se sadržaj markera akutne faze u tom periodu približio normalnim vrijednostima. Na vrhuncu egzacerbacije, nivo alfa-TNF je značajno premašio sadržaj interleukina-4 (IL-4) kako u krvnom serumu tako i direktno u zahvaćenom tkivu periulkusne zone, nakon čega je počeo postepeno da se smanjuje. smanjiti. Kako su se fenomeni akutne faze smanjivali i procesi popravljanja intenzivirali, koncentracija IL-4 se povećavala. Po promeni profila citokina može se suditi o efikasnosti i izvodljivosti hemoterapije. Prilikom provođenja terapije citokinima, na primjer, za vrijeme terapije alfa-interferonom (alfa-IFN), potrebno je kontrolirati i nivo njegovog sadržaja u cirkulirajućoj krvi i proizvodnju antitijela na alfa-IFN. Poznato je da kada se proizvede velika količina ovih antitijela, terapija interferonom ne samo da prestaje biti efikasna, već može dovesti i do autoimunih bolesti. Nedavno su razvijeni i uvedeni u praksu novi lijekovi koji na ovaj ili onaj način mijenjaju citokinski status organizma. Na primjer, za liječenje reumatoidnog artritisa predlaže se lijek na bazi antitijela na alfa-TNF, dizajniran za uklanjanje alfa-TNF-a, koji je uključen u uništavanje vezivnog tkiva. Međutim, i prema našim podacima i prema literaturi, nemaju svi bolesnici s kroničnim reumatoidnim artritisom povišen nivo TNF-alfa, pa za ovu grupu pacijenata smanjenje nivoa TNF-alfa može dodatno pogoršati neravnotežu imuni sistem. Dakle, ispravna citokinska terapija pretpostavlja kontrolu citokinskog statusa organizma tokom tretmana. Zaštitna uloga proinflamatornih citokina očituje se lokalno, u žarištu upale, ali njihova sistemska proizvodnja ne dovodi do razvoja antiinfektivnog imuniteta i ne sprječava razvoj bakterijsko-toksičnog šoka, koji je uzrok ranog mortaliteta kod hirurških pacijenata sa gnojno-septičkim komplikacijama. Osnova patogeneze hirurških infekcija je pokretanje kaskade citokina, koja uključuje, s jedne strane, proinflamatorne, as druge, antiinflamatorne citokine. Ravnoteža između ove dvije suprotstavljene grupe uvelike određuje prirodu tijeka i ishod gnojno-septičkih bolesti. Međutim, određivanje koncentracije u krvi za jedan citokin iz ovih grupa (na primjer, alfa-TNF ili IL-4) neće adekvatno odražavati stanje cjelokupne ravnoteže citokina. Stoga je neophodna jednostepena procjena nivoa nekoliko medijatora (najmanje 2-3 suprotne podgrupe). Trenutno je CJSC "Vector-Best" razvio i serijski proizvodio komplete reagensa za kvantitativno određivanje: faktora tumorske nekroze-alfa (osjetljivost - 2 pg/ml, 0-250 pg/ml); gama interferon (osjetljivost - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukin -4 (osjetljivost - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); interleukin-8 (osjetljivost-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); antagonist receptora interleukina-1 (IL-1RA) (osjetljivost - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa interferon (osetljivost - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimuna antitijela na alfa-interferon (osjetljivost - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Svi kompleti su dizajnirani da odrede koncentraciju ovih citokina u ljudskim biološkim tečnostima, u supernatantima kulture prilikom proučavanja sposobnosti ljudskih ćelijskih kultura da proizvode citokine in vitro. Princip analize je "sendvič" varijanta čvrstofaznog trofaznog (vrijeme inkubacije - 4 h) ili dvofaznog (vrijeme inkubacije - 3,5 h) enzimskog imunosorbentnog testa na pločama. Za analizu je potrebno 100 µl biološke tekućine ili supernatanta kulture po jažici. Obračun rezultata - spektrofotometrijski na talasnoj dužini od 450 nm. U svim kompletima, hromogen je tetrametilbenzidin. Rok trajanja naših kompleta je produžen na 18 mjeseci od datuma izdavanja i 1 mjesec nakon početka upotrebe. Analiza literaturnih podataka pokazala je da sadržaj citokina u krvnoj plazmi zdravih ljudi zavisi kako od kompleta koji se koriste za njihovo određivanje, tako i od regije u kojoj ti ljudi žive. Stoga smo, da bismo saznali vrijednosti normalnih koncentracija citokina kod stanovnika našeg kraja, analizirali nasumične uzorke plazme (od 80 do 400 uzoraka) praktički zdravih davalaca krvi, predstavnika različitih društvenih grupa starosti od 18 do 60 godina bez kliničke manifestacije grube somatske patologije i odsustvo HBsAg antitijela na HIV, hepatitis B i C viruse.

Faktor tumorske nekroze-alfa.

TNF-alfa je pleiotropni proinflamatorni citokin koji se sastoji od dva izdužena b-lanca molekulske težine 17 kDa i koji obavlja regulatorne i efektorske funkcije u imunološkom odgovoru i upali. Glavni proizvođači alfa-TNF-a su monociti i makrofagi. Ovaj citokin također luče krvni limfociti i granulociti, prirodne ćelije ubice i T-limfocitne ćelijske linije. Glavni induktori alfa-TNF-a su virusi, mikroorganizmi i njihovi metabolički produkti, uključujući bakterijski lipopolisaharid. Osim toga, neki citokini, kao što su IL-1, IL-2, faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga, alfa i beta-INF, također mogu igrati ulogu induktora. Glavni pravci biološke aktivnosti alfa-TNF: ispoljava selektivnu citotoksičnost u odnosu na neke tumorske ćelije; aktivira granulocite, makrofage, endotelne ćelije, hepatocite (proizvodnja proteina akutne faze), osteoklaste i hondrocite (resorpcija koštanog i hrskavičnog tkiva), sintezu drugih proinflamatornih citokina; stimuliše proliferaciju i diferencijaciju: neutrofila, fibroblasta, endotelnih ćelija (angiogeneza), hematopoetskih ćelija, T- i B-limfocita; pojačava protok neutrofila iz koštane srži u krv; ima antitumorsko i antivirusno djelovanje in vivo i in vitro; sudjeluje ne samo u odbrambenim reakcijama, već iu procesima destrukcije i popravljanja prateće upale; služi kao jedan od medijatora uništavanja tkiva, što je uobičajeno kod dugotrajne, kronične upale.

Rice. 1. Distribucija nivoa alfa-TNF

u plazmi zdravih donora.

Uočeno je povećanje nivoa alfa-TNF u krvnom serumu tokom posttraumatskog stanja, s plućnim disfunkcijama, kršenjem normalnog tijeka trudnoće, rakom, bronhijalnom astmom. Nivo alfa-TNF-a je 5-10 puta veći od norme tokom egzacerbacije hroničnog oblika virusnog hepatitisa C. Tokom perioda pogoršanja bolesti gastrointestinalnog trakta, koncentracija alfa-TNF-a u serumu prelazi normu u prosjeku 10 puta, a kod nekih pacijenata - 75-80 puta. Visoke koncentracije alfa-TNF nalaze se u likvoru kod pacijenata sa multiplom sklerozom i cerebrospinalnim meningitisom, a kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom - u sinovijalnoj tečnosti. Ovo ukazuje na učešće TNF alfa u patogenezi niza autoimunih bolesti. Učestalost otkrivanja alfa-TNF u krvnom serumu, čak i kod teške upale, ne prelazi 50%, s induciranom i spontanom proizvodnjom - do 100%. Raspon koncentracija alfa-TNF-a bio je 0-6 pg/ml, prosjek - 1,5 pg/ml (slika 1).

Gama interferon.

Rice. 2. Distribucija nivoa IFN-gama

u plazmi zdravih donora.

Interleukin-4

IL-4 je glikoprotein molekulske težine 18-20 kDa, prirodni inhibitor upale. Uz IFN-gama, IL-4 je ključni citokin koji proizvode T ćelije (uglavnom TH-2 limfociti). Podržava TH-1 / TH-2 balans. Glavni pravci biološke aktivnosti IL-4: pojačava eozinofiliju, nakupljanje mastocita, lučenje IgG4, TH-2 posredovan humoralni imuni odgovor; posjeduje lokalno antitumorsko djelovanje, stimulirajući populaciju citotoksičnih T-limfocita i infiltraciju tumora eozinofilima; inhibira oslobađanje upalnih citokina (alfa-TNF, IL-1, IL-8) i prostaglandina iz aktiviranih monocita, proizvodnju citokina od strane TH-1-limfocita (IL-2, gama-INF, itd.).

Rice. 3. Distribucija nivoa IL-4 u plazmi

zdravi donori.

Povećani nivo IL-4 i u serumu i u stimulisanim limfocitima može se uočiti kod alergijskih bolesti (posebno u vreme egzacerbacije), kao što su bronhijalna astma, alergijski rinitis, peludna groznica, atopijski dermatitis, kod bolesti gastrointestinalnog trakta. Nivo IL-4 je takođe značajno povećan kod pacijenata sa hroničnim hepatitisom C (CHC). Tokom perioda egzacerbacije CHC-a, njegova količina se povećava gotovo 3 puta u odnosu na normu, a tokom remisije CHC-a nivo IL-4 se smanjuje, posebno u pozadini liječenja rekombinantnim IL-2. Raspon koncentracija IL-4 bio je 0–162 pg/ml, prosjek je bio 6,9 pg/ml, normalan raspon je bio 0–20 pg/ml (slika 3).

Interleukin-8

IL-8 pripada hemokinima, to je protein molekulske težine 8 kDa. IL-8 proizvode mononuklearni fagociti, polimorfonuklearni leukociti, endotelne stanice i druge vrste stanica kao odgovor na različite podražaje, uključujući bakterije i viruse i njihove metaboličke produkte, uključujući proinflamatorne citokine (na primjer, IL-1, TNF alfa). Glavna uloga interleukina-8 je da pojača kemotaksu leukocita. Ima važnu ulogu i kod akutnih i kroničnih upala. Povećana razina IL-8 opaža se kod pacijenata s bakterijskim infekcijama, kroničnim plućnim bolestima i bolestima gastrointestinalnog trakta. Nivoi IL-8 u plazmi su povišeni kod pacijenata sa sepsom, a visoke koncentracije su povezane sa povećanim mortalitetom. Rezultati mjerenja sadržaja IL-8 mogu se koristiti za praćenje toka liječenja i predviđanje ishoda bolesti. Tako je kod svih pacijenata sa povoljnim tokom ulkusa rožnjače u suznoj tečnosti utvrđen povećan sadržaj IL-8. Kod svih pacijenata sa komplikovanim tokom ulkusa rožnice koncentracija IL-8 bila je 8 puta veća nego kod pacijenata sa povoljnim tokom bolesti. Dakle, sadržaj proinflamatornih citokina (posebno IL-8) u suznoj tečnosti kod ulkusa rožnjače može se koristiti kao prognostički kriterijum za tok ove bolesti.

Rice. 4. Distribucija nivoa IL-8 u

plazma zdravih donora (Novosibirsk).

Prema našim i objavljenim podacima, kod zdravih ljudi IL-8 se izuzetno rijetko otkriva u krvnom serumu; spontana proizvodnja IL-8 od strane mononuklearnih ćelija krvi uočena je u 62%, a indukovana proizvodnja kod 100% zdravih donora. Raspon koncentracija IL-8 bio je 0–34 pg/ml, prosjek je bio 2 pg/ml, normalan raspon je bio 0–10 pg/ml (slika 4).

Rice. 5. Distribucija nivoa IL-8 u plazmi

zdravi donatori (Rubcovsk).

Antagonist receptora interleukina-1.

IL-1RA je citokin i oligopeptid s molekulskom težinom od 18-22 kDa. IL-1RA je endogeni inhibitor IL-1, koji proizvode makrofagi, monociti, neutrofili, fibroblasti i epitelne ćelije. IL-1RA inhibira biološku aktivnost interleukina IL-1alfa i IL-1beta, natječući se s njima u vezivanju za ćelijski receptor.

Rice. 6. Distribucija nivoa IL-1RA

u plazmi zdravih donora

Proizvodnju IL-1RA stimuliraju mnogi citokini, virusni produkti i proteini akutne faze. IL-1RA se može aktivno eksprimirati u žarištima upale kod mnogih kroničnih bolesti: reumatoidnog i juvenilnog kroničnog artritisa, sistemskog eritematoznog lupusa, ishemijskih lezija mozga, upalnih bolesti crijeva, bronhijalne astme, pijelonefritisa, psorijaze i dr. Kod sepse se bilježi najveći porast IL-1RA - do 55 ng/ml u nekim slučajevima, a utvrđeno je da povećane koncentracije IL-1RA koreliraju s povoljnom prognozom. Visoki nivoi IL-1RA primećeni su kod veoma gojaznih žena, a ovaj nivo se značajno smanjuje u roku od 6 meseci nakon liposukcije. Raspon koncentracija IL-1RA bio je 0–3070 pg/ml, prosjek je bio 316 pg/ml. Normalni raspon je 50–1000 pg/ml (slika 6).

Alfa interferon.

Alfa-IFN je monomerni neglikozilirani protein sa molekulskom težinom od 18 kDa, koji se sintetizira uglavnom u leukocitima (B-limfociti, monociti). Ovaj citokin također može proizvesti gotovo bilo koji tip stanica kao odgovor na odgovarajuću stimulaciju, a intracelularne virusne infekcije mogu biti snažni stimulatori sinteze IFN-alfa. Induktori alfa-IFN-a uključuju: viruse i njihove proizvode, među kojima vodeće mjesto zauzimaju dvolančane RNA proizvedene tijekom replikacije virusa, kao i bakterije, mikoplazme i protozoe, citokini i faktori rasta (poput IL-1, IL- 2, alfa -FNO, faktori koji stimulišu kolonije, itd.). Početna odbrambena reakcija nespecifičnog antibakterijskog imunološkog odgovora tijela uključuje indukciju alfa i beta IFN. U ovom slučaju proizvode ga stanice koje predstavljaju antigen (makrofagi) koje su napale bakterije. Interferoni (uključujući alfa-IFN) igraju važnu ulogu u nespecifičnoj vezi antivirusnog imunološkog odgovora. Pojačavaju antivirusnu rezistenciju inducirajući u stanicama sintezu enzima koji potiskuju stvaranje nukleinskih kiselina i proteina virusa. Osim toga, imaju imunomodulacijski učinak, pojačavaju ekspresiju antigena glavnog kompleksa histokompatibilnosti u stanicama. Kod hepatitisa i ciroze jetre virusne etiologije otkrivena je promjena u sadržaju alfa-IFN. U vrijeme egzacerbacije virusnih infekcija koncentracija ovog citokina kod većine pacijenata značajno raste, a u periodu rekonvalescencije pada na normalan nivo. Pokazana je veza između nivoa alfa-INF u serumu i težine i trajanja infekcije gripom.

Rice. 7. Distribucija nivoa alfa-IFN

u plazmi zdravih donora.

Uočeno je povećanje koncentracije alfa-IFN u serumu većine pacijenata koji boluju od autoimunih bolesti, kao što su poliartritis, reumatoidni artritis, spondiloza, psorijatični artritis, reumatska polimijalgija i skleroderma, sistemski eritematozni lupus i sistemski vaskulitis. Visok nivo ovog interferona je takođe primećen kod nekih pacijenata tokom egzacerbacije peptičkog ulkusa i holelitijaze. Raspon koncentracija alfa-INF-a bio je 0–93 pg/ml, prosjek je bio 20 pg/ml. Normalni raspon je do 45 pg/ml (slika 7).

Antitijela na alfa-IFN.

Antitijela na alfa-IFN mogu se otkriti u serumu pacijenata sa somatskim eritematoznim lupusom. Spontana indukcija antitijela na alfa-IFN također je uočena u serumima pacijenata sa različitim oblicima karcinoma. U nekim slučajevima, antitijela na alfa-IFN nađena su u serumima pacijenata zaraženih HIV-om, kao i u cerebrospinalnoj tekućini i serumima pacijenata s meningitisom u akutnoj fazi, u serumima pacijenata s kroničnim poliartritisom.

Rice. 8. Distribucija nivoa antitela na alfa-IFN

u plazmi zdravih donora.

Alfa-IFN je jedan od efikasnih antivirusnih i antitumorskih terapijskih lijekova, ali njegova dugotrajna upotreba može dovesti do stvaranja specifičnih antitijela na alfa-IFN. To smanjuje učinkovitost liječenja, a u nekim slučajevima uzrokuje različite nuspojave: od gripe do razvoja autoimunih bolesti. S obzirom na to, tokom INF-terapije važno je kontrolisati nivo antitela na alfa-INF u telu pacijenta. Njihovo formiranje ovisi o vrsti lijeka koji se koristi u terapiji, trajanju liječenja i vrsti bolesti. Raspon koncentracija antitijela na alfa-IFN bio je 0-126 ng/ml, prosjek je bio 6,2 ng/ml. Normalni raspon je do 15 ng/ml (slika 8). Procjena nivoa citokina pomoću kompleta reagensa koji su komercijalno dostupni u CJSC "Vector-Best" omogućava novi pristup proučavanju stanja imunološkog sistema tijela u kliničkoj praksi.

Imunotropni lijekovi na bazi citokina.

Zanimljiv rad S. Simbirtseva, Državni istraživački institut za visoko čiste biološke proizvode, Ministarstvo zdravlja Rusije, Sankt Peterburg). Citokini se mogu izolovati u novi nezavisni sistem regulacije glavnih funkcija organizma, koji postoji zajedno sa nervnim i endokrinim regulacije i prvenstveno je povezan sa održavanjem homeostaze tokom unošenja patogena i narušavanjem integriteta tkiva. Ovu novu klasu regulatornih molekula stvorila je priroda tokom miliona godina evolucije i ima neograničen potencijal za upotrebu kao lijek. Unutar imunog sistema, citokini posreduju u odnosu između nespecifičnih odbrambenih odgovora i specifičnog imuniteta, djelujući u oba smjera. Na nivou tijela, citokini komuniciraju između imunološkog, nervnog, endokrinog, hematopoetskog i drugih sistema i služe za njihovo uključivanje u organizaciju i regulaciju odbrambenih reakcija. Pokretačka snaga intenzivnog proučavanja citokina oduvijek je bila obećavajuća mogućnost njihove kliničke upotrebe za liječenje široko rasprostranjenih bolesti, uključujući rak, zarazne bolesti i bolesti imunodeficijencije. U Rusiji je registrirano nekoliko citokinskih pripravaka, uključujući interferone, faktore koji stimuliraju kolonije, interleukine i njihove antagoniste te faktor nekroze tumora. Svi preparati citokina mogu se podijeliti na prirodne i rekombinantne. Prirodni preparati su preparati različitog stepena prečišćavanja, dobijeni iz medijuma kulture stimulisanih eukariotskih ćelija, uglavnom ljudskih ćelija. Glavni nedostaci su nizak stepen prečišćavanja, nemogućnost standardizacije zbog velikog broja komponenti, te upotreba komponenti krvi u proizvodnji. Očigledno, budućnost citokinske terapije povezana je s genetski modificiranim lijekovima dobivenim korištenjem najnovijih dostignuća u biotehnologiji. U protekle dvije decenije klonirani su geni većine citokina i dobijeni su rekombinantni analozi koji u potpunosti ponavljaju biološka svojstva prirodnih molekula. U kliničkoj praksi postoje tri glavna područja upotrebe citokina:

1) citokinoterapija za aktiviranje odbrambenih reakcija organizma, imunomodulaciju ili nadoknadu nedostatka endogenih citokina,

2) imunosupresivna terapija protiv citokina čiji je cilj blokiranje biološkog djelovanja citokina i njihovih receptora,

3) genska terapija citokina za jačanje antitumorskog imuniteta ili ispravljanje genetskih defekata u sistemu citokina.

Brojni citokini mogu se klinički koristiti za sistemsku i lokalnu upotrebu. Sistemska primjena je opravdana u slučajevima kada je potrebno osigurati djelovanje citokina u više organa radi efikasnije aktivacije imuniteta, odnosno aktivirati ciljne ćelije koje se nalaze u različitim dijelovima tijela. U drugim slučajevima, lokalna primjena ima niz prednosti, jer omogućava postizanje visoke lokalne koncentracije aktivnog principa, ciljnog organa i izbjegavanja neželjenih sistemskih manifestacija. Trenutno se citokini smatraju jednim od lijekova koji najviše obećavaju za upotrebu u kliničkoj praksi.

Zaključak.

Dakle, trenutno nema sumnje da su citokini najvažniji faktori u imunopatogenezi. Proučavanje nivoa citokina omogućava da se dobiju informacije o funkcionalnoj aktivnosti različitih tipova imunokompetentnih ćelija, o odnosu procesa aktivacije T-pomagača tipa I i II, što je veoma važno u diferencijalnoj dijagnozi brojnih infektivnih i imunopatoloških procesa. Citokini su specifični proteini koje ćelije imunog sistema mogu koristiti za razmjenu informacija i međusobnu interakciju. Danas je otkriveno više od stotinu različitih citokina koji se konvencionalno dijele na proinflamatorne (provociraju upalu) i protuupalne (sprečavaju razvoj upale). Dakle, različite biološke funkcije citokina dijele se u tri grupe: kontroliraju razvoj i homeostazu imunološkog sistema, kontroliraju rast i diferencijaciju krvnih stanica (hematopoetski sistem) i učestvuju u nespecifičnim odbrambenim reakcijama organizma, utičući na upalne procese. procesi, koagulacija krvi, krvni pritisak.

Spisak korišćene literature.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Ščigoleva, T.L. Mikhailova. / Ruski državni medicinski univerzitet, Državni naučni centar za koloproktologiju, Moskva i Državni istraživački institut visoko čistih biopreparacija, Sankt Peterburg.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Časopis "Citokini i inflamacije", 2005, br. 1 T. 4, br. 1. P.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov, materijali rada JSC "Vector-Best".

A.S.Simbirtsev, Državni istraživački institut za visoko čiste biološke supstance, Ministarstvo zdravlja Rusije, Sankt Peterburg.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Državni istraživački institut za visoko čiste biopreparacije, St. Petersburg.

T.A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Dry-warm. Katedra za anesteziologiju i reanimatologiju Državnog medicinskog univerziteta Vladivostok.

U radu su korišteni materijali sa stranice http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

određenih uzročnika zaraznih bolesti. Dakle, norsulfazol...

Molekularni i ćelijski mehanizmi antivirusnog imuniteta, obrasci razvoja i imunopatoza
Sažetak >> Medicina, zdravlje
... "stranica" se odnosi na određenu lokaciju izvesno polipeptid (antigen) sa kojim ... njegove rane faze. Citokini i hemokini. Ostalo citokini, pored interferona, ... koje oni proizvode u jedinici vremena citokini određuje intenzitet proliferacije i ...
Proučavanje uzroka fibroze koštane srži kod mijeloproliferativnih bolesti analizom djelovanja trombocitnih faktora na mezenhimalne matične stanice
Domaći zadatak >> Medicina, zdravlje
Različite koncentracije; - kvantitativno definicija proteina u eksperimentalnim sistemima ... dovode do produženog djelovanja citokin, koji pospješuje proces fibroze ... trombocita. Takođe povećan sadržaj citokin nađen u urinu ...
Patogeneza tuberkuloze kod ljudi
Sažetak >> Medicina, zdravlje
Ali moguća je i ishrana. Određeni igra ulogu u aerogenoj infekciji ... igra, luče makrofagi i monociti citokin- faktor tumorske nekroze (TNF). ... jona, svaka ćelija poseduje izvesno sistem koji osigurava transport supstanci ...

Citokini su ključni humoralni faktori upale neophodni za realizaciju zaštitnih funkcija urođenog imuniteta. Tri grupe citokina su uključene u nastanak upale - inflamatorni ili proinflamatorni citokini, hemokini, faktori koji stimulišu kolonije, kao i funkcionalno povezani faktori IL-12 i IFNy. Citokini također igraju važnu ulogu u suzbijanju i kontroli upalnog odgovora. Protuupalni citokini uključuju transformacijski faktor rasta β (TGFp), IL-10; često ulogu protuupalnog faktora igra IL-4.
Postoje 3 glavna predstavnika grupe proinflamatornih citokina - TNFa, IL-1 i IL-6; relativno nedavno, IL-17 i IL-18 su im dodani. Ove citokine proizvode uglavnom aktivirani monociti i makrofagi, pretežno na mjestu upale. Proinflamatorne citokine mogu proizvoditi i neutrofili, dendritske ćelije, aktivirani B-, NK- i T-limfociti. U fokusu prodiranja patogena, citokini su prvi koji sintetiziraju nekoliko lokalnih upalnih makrofaga. Zatim se u procesu emigracije leukocita iz krvotoka povećava broj stanica proizvođača i širi se njihov spektar. Konkretno, epitelne, endotelne, sinovijalne, glijalne ćelije i fibroblasti stimulirani produktima mikroorganizama i čimbenicima upale povezani su sa sintezom proupalnih citokina. Geni citokina klasificirani su kao inducibilni. Prirodni induktori njihove ekspresije su patogeni i njihovi produkti, koji djeluju preko TLR-a i drugih receptora koji prepoznaju patogene. Klasični induktor je bakterijski LPS. U isto vrijeme, neki proinflamatorni citokini (IL-1, TNFa) su i sami sposobni da induciraju sintezu proinflamatornih citokina.
Proinflamatorni citokini se prilično brzo sintetiziraju i izlučuju, iako kinetika sinteze različitih citokina ove grupe nije ista. U tipičnim slučajevima (brza opcija), ekspresija njihove mRNA je zabilježena 15-30 minuta nakon indukcije, pojava proteinskog proizvoda u citoplazmi - nakon 30-60 minuta, njegov sadržaj u ekstracelularnoj sredini dostiže maksimum za 3- 4 sata kratko - obično nešto više od jednog dana. Ne izlučuje se sav sintetizirani materijal. Određena količina citokina izražena je na površini ćelije ili sadržana u citoplazmatskim granulama. Oslobađanje granula može izazvati iste aktivirajuće signale kao i proizvodnja citokina. Ovo obezbeđuje brz (u roku od 20 minuta) protok citokina u žarište lezije.
Proupalni citokini imaju mnoge funkcije. Njihova glavna uloga je "organizacija" upalnog odgovora (slika 2.55). Jedan od najvažnijih i najranijih efekata proinflamatornih citokina je povećanje ekspresije adhezivnih molekula na endotelnim ćelijama, kao i na samim leukocitima, što dovodi do migracije leukocita iz krvotoka u žarište upale (videti deo 2.3.3. ). Osim toga, citokini induciraju povećanje metabolizma kisika u stanicama, njihovu ekspresiju receptora za citokine i druge inflamatorne faktore, stimulaciju proizvodnje citokina, baktericidnih peptida itd. Proinflamatorni citokini imaju pretežno lokalni učinak. Unošenje u cirkulaciju prekomjerno izlučenih proinflamatornih citokina doprinosi ispoljavanju sistemskih efekata upale, a takođe stimuliše proizvodnju citokina ćelijama udaljenim od žarišta upale. Na sistemskom nivou, proinflamatorni citokini stimulišu proizvodnju proteina akutne faze, izazivaju povećanje telesne temperature i deluju na

Rice. 2.55. Intracelularna signalizacija potaknuta proinflamatornim citokinima i mehanizmima aktivacije proupalnih gena

endokrinog i nervnog sistema, a u visokim dozama dovode do razvoja patoloških efekata (od mesa do šoka, slično septičkom).
IL-1 je skupna oznaka za porodicu proteina od više od 11 molekula. Funkcija većine njih je nepoznata, međutim 5 molekula - IL-1a (prema modernoj klasifikaciji - IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) i IL-33 (IL-1F11) su aktivni citokini.
IL-1a i IL-1P se tradicionalno nazivaju IL-1 jer su u interakciji sa istim receptorom i njihovi efekti se ne mogu razlikovati. Geni za ove citokine nalaze se na dugom kraku ljudskog hromozoma 2. Homologija između njih na nivou nukleotida je 45%, na nivou aminokiselina - 26%. Obje molekule imaju p-presavijenu strukturu: sadrže 6 parova antiparalelnih p-slojeva i imaju oblik trolista. Ćelije sintetiziraju prekursorski molekul s molekulskom težinom od oko 30 kDa, lišen signalnih peptida, što ukazuje na neobičan način obrade molekula IL-1. Molekulska težina zrelih proteina je oko 18 kDa.
IL-1a postoji u tri oblika - intracelularnom (topivi molekul je prisutan u citosolu i obavlja regulatorne funkcije), membranskom (molekul se isporučuje na površinu ćelije kroz mehanizam sličan reciklaži receptora i usidren je u membrani) i sekrecijski (molekul se luči u svom izvornom obliku, ali se podvrgava procesuiranju - cijepanju ekstracelularnim proteazama uz formiranje aktivnog citokina težine 18 kDa). Glavna varijanta molekula IL-1a kod ljudi je membranska varijanta. U ovom obliku, učinak citokina je izraženiji, ali se manifestira samo lokalno.
Procesiranje IL-1P odvija se unutar ćelije uz učešće specijalizovanog enzima, IL-1 konvertaze (kapaze 1), koji se nalazi u lizosomima.
Ovaj enzim se aktivira kao dio upale pluća - privremene supramolekularne strukture koja osim neaktivne kaspaze 1 uključuje i unutarćelijske receptore porodice NLR (vidjeti dio 2.2.3) - NOD1, NOD2, IPAF itd. Koji uzrokuju razvoj signala za aktiviranje. To rezultira stvaranjem transkripcionog faktora NF-kB i indukcijom proinflamatornih gena, kao i aktivacijom inflammosoma i kaspaze 1 koja se u njemu nalazi. Aktivirani enzim cijepa molekulu prekursora IL-1P, a rezultirajući zreli citokin s molekulskom težinom od 18 kDa luči ćelija.
IL-1a, IL-1P i receptorski antagonist IL-1 dijele zajedničke receptore koji se spontano eksprimiraju na mnogim tipovima ćelija. Kada se ćelije aktiviraju, na njima se povećava broj membranskih receptora za IL-1. Glavni, IL-1RI, sadrži 3 domena slična imunoglobulinu u ekstracelularnom dijelu. Njegov intracelularni dio je TIR domen, koji je strukturno sličan analognim TLR domenima i pokreće iste signalne puteve (vidi odjeljak 2.2.1). Broj ovih receptora je mali (200-300 po ćeliji), ali imaju visok afinitet za IL-1 (Kd je 10-11 M). Drugi receptor, IL-1RII, nema signalnu komponentu u citoplazmatskom dijelu, ne prenosi signal i služi kao receptor za varanje. Transdukcija signala iz IL-1RI uključuje iste faktore kao i za TLR (na primjer, MyD88, IRAK i TRAF6), što dovodi do sličnih rezultata - formiranja transkripcijskih faktora NF-kB i AP-1, koji uzrokuju ekspresiju isti skup gena (vidi sliku 2.12). Ovi geni su odgovorni za sintezu proinflamatornih citokina, hemokina, adhezionih molekula, enzima koji obezbeđuju baktericidno delovanje fagocita i drugih gena čiji su produkti uključeni u razvoj upalnog odgovora. Sam IL-1 spada u proizvode čije lučenje indukuje IL-1, tj. u ovom slučaju se pokreće pozitivna povratna sprega.
Bilo koje stanice u tijelu mogu potencijalno biti meta IL-1. Njegovo djelovanje u najvećoj mjeri utiče na endotelne ćelije, sve vrste leukocita, ćelije hrskavice i koštanog tkiva, sinovijalne i epitelne ćelije, mnoge vrste nervnih ćelija. Pod uticajem IL-1 indukuje se ekspresija više od 100 gena; uz njegovo učešće ostvaruje se više od 50 različitih bioloških reakcija. Glavni efekti IL-1 su emigracija leukocita i aktivacija njihove fagocitne i baktericidne aktivnosti. Oni također utiču na koagulacijski sistem i vaskularni tonus, određujući karakteristike hemodinamike u žarištu upale. IL-1 ima višestruki učinak na ćelije ne samo urođenog, već i adaptivnog imuniteta, obično stimulirajući manifestacije oba.
IL-1 ima mnogo sistemskih efekata. Stimuliše proizvodnju proteina akutne faze od strane hepatocita, kada deluje na centar termoregulacije hipotalamusa, izaziva razvoj groznice, učestvuje u razvoju sistemskih manifestacija upalnog procesa (npr. malaksalost, smanjen apetit, pospanost, adinamija), koja je povezana s djelovanjem IL-1 na centralni nervni sistem. Pojačavajući ekspresiju receptora za faktore stimulacije kolonija, IL-1 pojačava hematopoezu, što je povezano sa njegovim radioprotektivnim efektom. IL-1 stimuliše oslobađanje leukocita iz koštane srži, prvenstveno neutrofila, uključujući i nezrele, što dovodi do pojave leukocitoze tokom upale i pomeranja leukocitne formule ulevo (akumulacija nezrelih ćelijskih oblika). Efekti IL-1 utiču na autonomne funkcije i čak višu nervnu aktivnost (promjene u ponašajnim reakcijama, itd.). Kondrociti i osteociti takođe mogu biti mete IL-1, što je povezano sa sposobnošću IL-1 da izazove destrukciju hrskavice i kosti kada su uključeni u upalni proces, i obrnuto, hiperplaziju patoloških tkiva (panus kod reumatoidnih artritis). Štetno djelovanje IL-1 očituje se iu septičkom šoku, oštećenju zglobova kod reumatoidnog artritisa i nizu drugih patoloških procesa.
Dupliranje IL-1 učinaka bakterijskih produkata povezano je s potrebom višestruke reprodukcije aktivirajućeg efekta patogena bez njihove diseminacije. Mikroorganizmi stimulišu samo ćelije u neposrednoj blizini mesta ulaska, prvenstveno lokalne makrofage. Zatim se isti efekat mnogo puta reprodukuje od strane IL-1p molekula. Ispunjavanje ove funkcije od strane IL-1 je olakšano ekspresijom njihovih receptora u gotovo svim ćelijama tijela nakon aktivacije (javlja se prvenstveno u žarištu upale).
Antagonist IL-1 receptora (IL-1RA) je homologan sa IL-1a i IL-1P (homologija je 26% odnosno 19%). On stupa u interakciju sa IL-1 receptorima, ali nije u stanju prenijeti signal ćeliji. Kao rezultat toga, IL-1RA djeluje kao specifični antagonist IL-1. IL-1RA luče iste ćelije kao i IL-1, ovaj proces ne zahtijeva sudjelovanje kaspaze 1. Proizvodnju IL-1RA induciraju isti čimbenici kao i sinteza IL-1, ali neki od njih su spontano proizveden od strane makrofaga i hepatocita. Kao rezultat toga, ovaj faktor je stalno prisutan u krvnom serumu. Ovo je vjerovatno neophodno kako bi se spriječile negativne posljedice sistemskog djelovanja IL-1, koji se proizvodi u značajnim količinama kod akutne upale. Rekombinantni IL-1RA se trenutno testira kao lijek u liječenju kroničnih upalnih bolesti (reumatoidni artritis, itd.)
IL-18 je proinflamatorni citokin povezan sa IL-f: takođe se sintetiše kao prekursor konvertovan kaspazom 1; stupa u interakciju s receptorom, čiji citoplazmatski dio sadrži TIR domenu i prenosi signal koji dovodi do aktivacije NF-kB. Kao rezultat, dolazi do aktivacije svih proinflamatornih gena, ali je manje izražena nego kod djelovanja IL-1. Posebno svojstvo IL-18 je indukcija (posebno u kombinaciji s IL-12) sinteze IFNy u stanicama. U nedostatku IL-12, IL-18 indukuje sintezu antagonista IFNy, IL-4, i potiče razvoj alergijskih reakcija. Djelovanje IL-18 ograničeno je rastvorljivim antagonistom koji ga vezuje u tečnoj fazi.
IL-33 je strukturno vrlo sličan IL-18. Procesiranje IL-33 se odvija i uz učešće kaspaze 1. Međutim, ovaj citokin se razlikuje od ostalih članova porodice IL-1 po funkcijama koje obavlja. Jedinstvenost djelovanja IL-33 u velikoj mjeri je posljedica činjenice da se njegov receptor selektivno eksprimira na Ig2 ćelijama. U tom smislu, IL-33 podstiče lučenje ^2-citokina IL-4, IL-5, IL-13 i razvoj alergijskih procesa. Nema značajnog proinflamatornog dejstva.
Faktor nekroze tumora a (TNFa ili TNFa) je član druge porodice imunološki značajnih proteina. To je proinflamatorni citokin sa širokim spektrom aktivnosti. TNFa ima b-fold strukturu. Sintetiziran je kao funkcionalno aktivni membranski molekul pro-TNFa s molekulskom težinom od 27 kDa, koji je transmembranski protein tipa II (tj. Njegov N-terminalni dio je usmjeren u stanicu). Kao rezultat proteolize, u ekstracelularnoj domeni nastaje rastvorljivi monomer molekulske težine 17 kDa. Monomeri TNFa spontano tvore trimer od 52 kDa koji predstavlja glavni oblik ovog citokina. Trimer ima oblik zvona, a podjedinice su povezane svojim C-krajevima, od kojih svaka sadrži 3 mjesta vezivanja sa receptorom, dok N-krajevi nisu međusobno povezani i ne učestvuju u interakciji sa receptorima (i , dakle, u obavljanju svojih funkcija pomoću citokina). Pri kiselim pH vrijednostima, TNFa poprima a-heličnu strukturu, što uzrokuje promjenu nekih njegovih funkcija, posebno povećanu citotoksičnost. TNF je prototipni član velike porodice molekula superporodice TNF (Tabela 2.31). Uključuje limfotoksine a i b (samo prvi postoji u rastvorljivom obliku), kao i mnoge molekule membrane uključene u međustanične interakcije (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), koje će biti spomenute u nastavku u različitim kontekstima. Prema savremenoj nomenklaturi, ime članova natporodice sastoji se od skraćenice TNFSF i serijskog broja (za TNFa - TNFSF2, za limfotoksin a - TNFSF1).
Tabela 2.31. Glavni predstavnici familije faktora tumorske nekroze i njegovih receptora

Faktor (ligand)	Chro mosoma	Molekularna težina, kDa	Receptor
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimer - 52; glikozilovani oblik - 25.6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Limfotoksin (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Limfotoksin B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
FasL (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
STAZA (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
APRIL (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
SVJETLO (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Glavni proizvođači TNFa, poput IL-1, su monociti i makrofagi. Također ga luče neutrofili, endotelne i epitelne ćelije, eozinofili, mastociti, B- i T-limfociti kada su uključeni u upalni proces. TNFa se otkriva u krvotoku ranije od ostalih proinflamatornih citokina - već 20-30 minuta nakon izazivanja upale, što je povezano s "ispuštanjem" membranskog oblika molekule u stanice, a moguće i s oslobađanjem TNFa u sadržaju granula.
Postoje 2 tipa TNF receptora, zajednički za TNFa i limfotoksin a - TNFRI (od receptora faktora tumorske nekroze I) i TNFRII sa molekularnom težinom od 55 i 75 kDa, respektivno. TNFRI je prisutan u gotovo svim stanicama tijela, osim u eritrocitima, a TNFRII je prisutan uglavnom u stanicama imunološkog sistema. TNFR čine veliku porodicu koja uključuje molekule uključene u ćelijsku interakciju i indukciju ćelijske smrti – apoptozu. Afinitet TNFa za TNFRI je manji nego za TNFRII (oko 5x10-10 M i 55x10-11 M, respektivno). Kada se TNFa-trimer veže, dolazi do trimerizacije njegovih receptora, neophodnih za prenos signala.
Osobine prijenosa signala sa ovih receptora u velikoj mjeri su određene strukturom njihovog unutarćelijskog dijela. Citoplazmatski dio TNFRI je predstavljen takozvanim domenom smrti, iz kojeg se primaju signali koji dovode do aktivacije mehanizma apoptoze; TNFRII nema domen smrti. Signalizacija iz TNFRI se odvija uz učešće adapterskih proteina TRADD (TNFR-associated death domain) i FADD (Fas-associated death domain), koji takođe sadrže domene smrti. Pored puta koji vodi do razvoja apoptoze (kroz aktivaciju kaspaze 8 ili sintezu ceramida), razlikuje se nekoliko signalnih puteva koji se aktiviraju uz učešće faktora TRAF2/5 i RIP-1. Prvi od ovih faktora prenosi signal duž puta koji vodi do aktivacije NF-kB faktora, tj. klasičnim putem indukcije proinflamatornih gena (vidi sliku 2.55). Signalni put aktiviran faktorom RIP-1 dovodi do aktivacije MAP kaskade sa konačnim proizvodom, faktorom transkripcije AP-1. Ovaj faktor uključuje gene koji osiguravaju aktivaciju stanica i sprječavaju razvoj apoptoze. Dakle, ćelijska sudbina je određena ravnotežom pro- i anti-apoptotičkih mehanizama koji se pokreću kada se TNFa veže za TNFRI.
Implementacija funkcija TNFa uglavnom je povezana s djelovanjem putem TNFRI - isključivanje odgovarajućeg gena dovodi do razvoja teške imunodeficijencije, dok su posljedice inaktivacije TNFRII gena beznačajne. Na vrhuncu upalnog odgovora, TNFa receptori se mogu "ispustiti" iz membrane i otpustiti u međustanični prostor, gdje vežu TNFa, djelujući protuupalno. S tim u vezi, topljivi oblici TNFR -a koriste se u liječenju kroničnih upalnih bolesti. Pokazalo se da se lijek na bazi rastvorljivog TNFRII pokazao klinički najefikasnijim.
Kao i IL-1, TNFa pojačava ekspresiju adhezivnih molekula, sintezu proinflamatornih citokina i hemokina, proteina akutne faze, enzima fagocitnih ćelija itd. Uz IL-1, TNFa je uključen u formiranje svih glavnih lokalnih, kao i nekih sistemskih manifestacija upale. Aktivira endotelne ćelije, stimuliše angiogenezu, pojačava migraciju i aktivira leukocite. TNFa utječe na aktivaciju i proliferaciju limfocita u većoj mjeri nego IL-1. U kombinaciji sa IFNy, TNFa indukuje aktivnost NO sintaze u fagocitima, što značajno povećava njihov baktericidni potencijal. TNFa stimulira proliferaciju fibroblasta, pospješujući zacjeljivanje rana. Uz povećanu lokalnu proizvodnju TNFa, prevladavaju procesi oštećenja tkiva, koji se manifestiraju razvojem hemoragijske nekroze. Osim toga, TNFa inhibira aktivnost lipoprotein lipaze, što slabi lipogenezu i dovodi do razvoja kaheksije (jedan od originalnih naziva za TNFa je kaheksin). Povećano oslobađanje TNFa i njegovo nakupljanje u cirkulaciji, na primjer, pod djelovanjem visokih doza bakterijskih superantigena, uzrokuje razvoj teške patologije - septičkog šoka. Dakle, djelovanje TNFa, usmjereno na obavljanje zaštitne funkcije i održavanje homeostaze, može biti praćeno teškim toksičnim efektima (lokalnim i sistemskim), često uzrokujući smrt.
IL-6 je proinflamatorni citokin širokog spektra. Također služi kao prototipni faktor u porodici citokina, koja osim samog IL-6 uključuje onkostatin M (OSM), inhibitorni faktor leukemije (LIF), cilijarni neurotrofični faktor (CNTF), kardiotropin-1 (CT-1) ), te IL-11 i IL-31. Molekularna težina IL-6 je 21 kDa. IL-6 proizvode monociti i makrofagi, endotelne, epitelne, glijalne, glatke mišićne ćelije, fibroblasti, T-limfociti tipa Th2, kao i mnoge tumorske ćelije. Proizvodnja IL-6 u mijeloidnim ćelijama indukovana je interakcijom njihovih TLR-a sa mikroorganizmima i njihovim proizvodima, kao i uticajem IL-1 i TNFa. Istovremeno, u roku od 2 sata, sadržaj IL-6 u krvnoj plazmi raste 1000 puta.
Receptori za sve faktore porodice IL-6 sadrže zajedničku komponentu - lanac gp130, koji je prisutan u gotovo svim ćelijama tijela. Druga komponenta receptora je individualna za svaki citokin. Specifični lanac receptora IL-6 (gp80) odgovoran je za vezivanje ovog citokina, dok je gp130 uključen u transdukciju signala, jer je povezan s tirozin kinazama Jak1 i Jak2. Kada IL-6 stupi u interakciju s receptorom, pokreće se sljedeći slijed događaja: IL-6 monomer stupa u interakciju sa gp80 lancem, dolazi do dimerizacije kompleksa (2 molekula citokina - 2 lanca gp80), nakon čega se 2 gp130 lanca vezuju za kompleksa, što dovodi do fosforilacije Jakkinaze. Potonji fosforilišu faktore STAT1 i STAT3, koji dimeriziraju, kreću se u jezgro i vezuju promotore ciljnih gena. Lanac gp80 lako se ispire sa ćelije; u slobodnom obliku stupa u interakciju sa citokinom, inaktivirajući ga, tj. djeluje kao specifični inhibitor IL-6.
IL-6 je uključen u indukciju gotovo čitavog kompleksa lokalnih manifestacija upale. Utječe na migraciju fagocita, povećavajući proizvodnju CC-hemokina koji privlače monocite i limfocite, i slabeći proizvodnju CX-hemokina koji privlače neutrofile. Proinflamatorni efekti IL-6 su slabiji od IL-1 i TNFa, za razliku od kojih se ne povećava, već inhibira proizvodnju proupalnih citokina (IL-1, TNFa i IL-6) i hemokina od strane uključenih ćelija. u zapaljenom procesu. Dakle, IL-6 kombinuje svojstva pro- i anti-inflamatornih citokina i učestvuje ne samo u razvoju, već iu ograničavanju upalnog odgovora.
IL-6 je glavni faktor koji inducira ekspresiju gena proteina akutne faze u hepatocitima. IL-6 utiče na različite faze hematopoeze, uključujući proliferaciju i diferencijaciju matičnih ćelija. Služi kao faktor rasta za nezrele plazma ćelije, značajno pojačavajući humoralni imuni odgovor. IL-6 takođe utiče na T limfocite, povećavajući aktivnost citotoksičnih T ćelija.
IL-17 i srodni citokini. Grupa citokina, uključujući vrstu IL-17, privukla je široku pažnju u vezi s otkrićem posebne vrste T-pomagača - Th17, koji je uključen u razvoj nekih štetnih oblika upalnih reakcija, posebno u autoimuni procesi (videti odeljak 3.4.3.2). Uloga ovih citokina u odgovorima adaptivnog imunološkog odgovora će biti razmotrena u nastavku. Ovdje ćemo dati samo opći opis citokina i ukratko razmotriti njihovu ulogu u reakcijama urođenog imuniteta.
Porodica IL-17 uključuje 6 proteina, označenih slovima od A do F. Svojstva proinflamatornih citokina od njih su IL-17A i IL-17F. Oni su homodimeri vezani disulfidom; njihova molekularna težina je 17,5 kDa. Ove citokine proizvodi pomenuti Th17, kao i CD8 + T ćelije, eozinofili, neutrofili. IL-23 stimuliše razvoj ćelija TH7 i proizvodnju IL-17.
Receptore za IL-17 eksprimiraju mnoge ćelije - epitelne ćelije, fibroblasti, ćelije imunog sistema, posebno neutrofili. Glavni rezultat interakcije IL-17 sa receptorom je, kao i kod djelovanja drugih proinflamatornih citokina, indukcija NF-kB faktora i ekspresija brojnih NF-KB zavisnih gena upale.
Jedan od važnih bioloških efekata IL-17 (zajedno sa IL-23) je održavanje homeostaze neutrofila. Ovi citokini pojačavaju proizvodnju neutrofila stimulirajući proizvodnju G-CSF. U isto vrijeme, povećanje ili smanjenje proizvodnje IL-17 i IL-23 regulirano je brojem neutrofila u perifernim tkivima: smanjenje broja ovih stanica kao posljedica apoptoze dovodi do povećanja proizvodnja citokina.
Proinflamatorni efekat IL-17 se uglavnom ostvaruje povećanjem proizvodnje drugih citokina (IL-8, IL-6, y-CSF, broj hemokina) i ekspresijom adhezivnih molekula. Kod miševa transgenih za IL-17 ili IL-23 razvija se sistemska kronična upala intersticijske prirode s infiltracijom neutrofilima, eozinofilima, makrofagima i limfocitima različitih organa. Ovi citokini su prepoznati kao vodeća uloga u razvoju kroničnih autoimunih bolesti.
IL-12 porodica
IL-12 je identificiran zbog svoje sposobnosti da aktivira NK ćelije, inducira proliferaciju T limfocita i inducira sintezu IFNy. IL-12 zauzima posebno mjesto među citokinima koje proizvode ćelije urođenog imunološkog sistema, budući da (kao i njegovi glavni proizvođači, dendritičke ćelije) služi kao veza između urođenog i adaptivnog imuniteta. S druge strane, IL-12 je dio tandema IL-12-IFNy, koji igra ključnu ulogu u imunološkoj odbrani od intracelularnih patogena.
IL-12 je dimer sastavljen od p40 i p35 podjedinica. Njegova ukupna molekularna težina je 75 kDa. Funkcionalna aktivnost IL-12 povezana je sa njegovom p40 podjedinicom. IL-12 "punog opsega" luče aktivirani monociti, makrofagi, mijeloidne dendritske ćelije, neutrofili i epitelne ćelije barijernog tkiva (proizvode i Ig-12p35 i IL-12p40 citokinske podjedinice). Većina tjelesnih stanica sintetizira samo funkcionalno neaktivnu podjedinicu ^ -12p35. Količina IL-12 heterodimera koji luče ćelija ograničena je p35 podjedinicom. IL-12p40 se sintetizira u suvišku i može se dimerizirati da formira homodimer koji djeluje kao antagonist IL-12, kao i kao hemoatraktant. Induktori proizvodnje IL-12 su prvenstveno patogeni koje prepoznaju TLR i drugi receptori za prepoznavanje obrazaca. Proizvodnja IL-12 je pojačana IL-1, IFNy, kao i međućelijskim interakcijama posredovanim CD40-CD154 i drugim parovima molekula iz familije TNFR.
IL-12 receptor je najjače izražen na NK ćelijama, aktiviranim TH ćelijama i citotoksičnim T limfocitima, a u manjoj meri na dendritičnim ćelijama. Ekspresija receptora IL-12 aktiviranim T ćelijama pojačava se pod uticajem IL-12, IFNy, IFNa, TNFa i nakon kostimulacije putem receptora CD28. Receptor za IL-12 je dimer formiran od podjedinica IL-12RP1 (100 kDa) i IL-12RP2 (130 kDa, CD212), s kojima je povezan protein od 85 kDa. I Pj i p2 lanci su uključeni u vezivanje IL-12, dok je IL-12RP2 podjedinica pretežno uključena u transdukciju signala. Intracelularni domen Pj lanca je povezan sa JAK2 kinazom, intracelularni domen P2 lanca povezan je sa Tyk2 kinazom. Kinaze fosforilišu faktore transkripcije STAT1, STAT3, STAT4 i STAT5.
Glavna funkcija IL-12, zbog njegove sposobnosti da stimulira citotoksične limfocite (NK i T) i inducira diferencijaciju Thl ćelija (vidjeti dio 3.4.3.1), je da pokrene ćelijske odbrambene mehanizme protiv intracelularnih patogena. IL-12 djeluje na NK i NKT stanice već u ranim fazama imunoloških procesa, pojačavajući proliferaciju i citotoksičnu aktivnost NK stanica, a kasnije i na citotoksične T limfocite i sintezu IFNy od strane svih ovih stanica. Nešto kasnije, IL-12 indukuje diferencijaciju Thl ćelija, koje takođe proizvode IFNy. Uslov za indukciju Thl ćelija je preliminarna ekspresija podjedinice IL-12RP2 receptora aktiviranim CD4 + T ćelijama. Nakon toga ćelije stiču sposobnost vezivanja IL-12, što dovodi do aktivacije faktora STAT4, koji reguliše ekspresiju gena karakterističnih za Thl ćelije (za ekspresiju IFNG gena, dejstvo transkripcionog faktora T -Oklada je važnija). Istovremeno, IL-12 potiskuje diferencijaciju ^2 ćelija i slabi proizvodnju ćelija
B-serija antitijela IgE i IgA klase. Djelujući na dendritičke i druge APC-e, IL-12 inducira ekspresiju kostimulatornih molekula (CD80 / 86, itd.), Kao i MHC-II APC proizvoda. Dakle, IL-12 igra vezu između urođenog i adaptivnog imuniteta i pojačava imunološke mehanizme odgovorne za zaštitu od intracelularnih patogena i tumora.
Porodica IL-12 uključuje IL-23, IL-27 i IL-35. Ovi citokini su heterodimeri: IL-23 formiraju dvije podjedinice - I-23p19 i IL-12p40 (identične odgovarajućoj podjedinici IL-12), IL-27 - od podjedinica Ebi3 i IL-27p28, IL-35 - od podjedinice Ebi3 i IL-12p35. Ove citokine proizvode prvenstveno dendritske ćelije. Proizvodnju citokina iz porodice IL-12 pokreću PAMP i citokini prisutni na patogenima, posebno GM-CSF.
Prijem IL-23 obavljaju dvije različite strukture: podjedinicu IL-12p40 prepoznaje p-lanac receptora za IL-12, a podjedinicu R-23p19 prepoznaje poseban receptor, IL-23R. STAT4 igra glavnu ulogu u prenosu signala sa IL-23. Receptor za IL-27 aktivira molekule WSX-1 (homolog p2 podjedinice IL-12R) i gp130 (polipeptidni lanac koji je dio receptora za citokine porodice IL-6).
Poput IL-12, IL-23 i IL-27 djeluju pretežno na CD4 + T ćelije, promovišući njihovu diferencijaciju duž Th1 puta. Karakteristike IL-23 - preovlađujući učinak na memorijske T-ćelije, kao i sposobnost podrške razvoju T-pomoćnika tipa Th17. IL-27 se razlikuje od druga dva citokina iz porodice po svojoj sposobnosti da indukuje proliferaciju ne samo aktiviranih, već i mirnih CD4 + T ćelija. Nedavno je pokazano da IL-27 i IL-35 mogu djelovati kao regulatorni (supresorski) faktori, budući da je njihova podjedinica Ebi3 meta ključnog faktora regulatornih T ćelija FOXP3.
Faktori stimulacije kolonija (CSF) (Tabela 2.32) ili hematopoetini su predstavljeni sa tri citokina - GM-CSF, G-CSF i M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) je funkcionalno blizak njima. Ovi faktori se nazivaju faktori koji stimulišu kolonije, jer su prvi identifikovani po njihovoj sposobnosti da podrže rast in vitro kolonija hematopoetskih ćelija odgovarajućeg sastava. IL-3 ima najširi spektar djelovanja, jer podržava rast bilo koje kolonije hematopoetskih ćelija, osim limfoidnih ćelija. GM-CSF podržava rast mješovitih kolonija granulocita i monocita i odvojeno kolonija granulocita i monocita/makrofaga. G-CSF i M-CSF specijalizirani su za održavanje rasta i diferencijacije svojih kolonija. Ovi faktori ne samo da osiguravaju preživljavanje i proliferaciju hematopoetskih ćelija ovih tipova, već su u stanju i da aktiviraju već zrele diferencirane ćelije (M-CSF - makrofagi, G-CSF - neutrofili). M-CSF je uključen u diferencijaciju monocita u makrofage i inhibira diferencijaciju monocita u dendritične ćelije. G-CSF, osim što djeluje na granulocitnu granu hematopoeze, uzrokuje mobilizaciju hematopoetskih matičnih stanica iz koštane srži u krvotok.
Tabela 2.32. Karakterizacija faktora koji stimulišu kolonije

Ime nie	Chromo som	Molekularna težina, kDa	Ćelije proizvođači	Ćelije cilj	Recept tori
GM-CSF	5q	22	Makrofagi, T ćelije, NK ćelije, stromalne ćelije, epitelne ćelije	Makrofagi, neutrofili, eozinofili, T ćelije, dendritske ćelije, hematopoetske ćelije	GM- CSFR a / p
G-CSF	17q	18-22		Neutrofili, eozinofili, T ćelije, hematopoetske ćelije	G-CSFR (1 lanac)
M-CSF	5q	45/70 (dimer)	Makrofagi, stromalne ćelije, epitelne ćelije	Makrofagi, hematopoetski ćelije	c-Fms
Faktor matičnih ćelija	12q	32	Stromal ćelije	Hematopoetske ćelije, B ćelije, mastociti	c-Kit
Flt-3- ligand	19q	26,4	Stromal ćelije	Hematopoetske ćelije, mastociti	Flt-3

G-CSF, GM-CSF i IL-3 su strukturno okarakterisani kao hematopoetini koji sadrže 4 a-helikalna domena. Njihovi receptori sadrže 2 polipeptidna lanca, pripadaju porodici hematopoetinskih receptora. M-CSF se razlikuje od ostalih CSF. To je dimerna molekula i postoji u rastvorljivom i membranski vezanom obliku. Njegov receptor ima vanćelijske domene slične Ig i intracelularni domen sa aktivnošću tirozin kinaze (naziv ove protoonkogene kinaze - c-Fms - ponekad se prenosi na ceo receptor). Kada se M-CSF veže za receptore, dolazi do njihove dimerizacije i aktivacije kinaze.
Faktore koji stimulišu kolonije proizvode endotelne ćelije i fibroblasti, kao i monociti/makrofagi. GM-CSF i IL-3 se također sintetiziraju od strane T limfocita. Pod utjecajem bakterijskih produkata (putem receptora za prepoznavanje uzorka) i proupalnih citokina, sinteza i lučenje čimbenika koji stimuliraju kolonije značajno se povećava, što dovodi do povećanja mijelopoeze. Posebno je snažno stimulirana granulocitopoeza, koja je praćena ubrzanom emigracijom stanica, uključujući i nezrele, na periferiju. Ovo stvara sliku neutrofilne leukocitoze sa pomakom formule udesno, što je vrlo karakteristično za upalu. Preparati na bazi GM- i G-CSF koriste se u kliničkoj praksi za stimulaciju granulocitopoeze oslabljene citotoksičnim efektima (zračenje, kemoterapija za liječenje tumorskih bolesti i dr.). G-CSF se koristi za mobilizaciju hematopoetskih matičnih stanica, nakon čega slijedi korištenje inducirane leukomase za obnavljanje poremećene hematopoeze.
Faktor matičnih ćelija (SCF - faktor matičnih ćelija, c-kit ligand) luče stromalne ćelije koštane srži (fibroblasti, endotelne ćelije), kao i različite vrste ćelija tokom embrionalnog razvoja. SCF postoji kao transmembranski i topljivi molekul (potonji nastaje kao rezultat proteolitičkog cijepanja ekstracelularnog dijela). SCF se otkriva u krvnoj plazmi. Njegov molekul ima dvije disulfidne veze. SCF receptor, c-Kk, ima aktivnost tirozin kinaze i strukturno je sličan Flt-3 i c-Fms (M-CSF receptor). Kada se SCF veže, receptori se dimeriziraju i fosforiliraju. Prijenos signala se odvija uz učešće PI3K i MAP kaskade.
Mutacije u SCF genu i njegovom receptoru su dugo opisane (mutacije čelika); kod miševa se očituju promjenom boje dlake i kršenjem hematopoeze. Mutacije koje narušavaju sintezu membranskog oblika faktora uzrokuju ozbiljne defekte u razvoju embrija. Zajedno sa drugim faktorima, SCF je uključen u održavanje vitalnosti hematopoetskih matičnih ćelija, osigurava njihovu proliferaciju i podržava rane faze hematopoeze. SCF je posebno važan za eritropoezu i razvoj mastocita, a služi i kao faktor rasta za timocite u fazama DN1 i DN2.
U pogledu strukture i biološke aktivnosti, Flt-3L-faktor (Fms-like thyrosinkinase 3-ligand) posjeduje svojstva slična SCF-u; u kombinaciji sa drugim faktorima, podržava rane faze mijelopoeze i razvoj B-limfocita. SCF igra ulogu faktora rasta leukemijskih mijeloblasta.
Hemokini, koji su važan humoralni faktor u inflamaciji i urođenom imunitetu, razmatrani su gore u opisu hemotakse leukocita (vidjeti dio 2.3.2).

Šta je citokinoterapija?

Pozitivna akcija

Onkoimunologija i citokinoterapija

Funkcije citokina u tijelu

Citokini kao lijekovi

Nuspojave

Za koga metoda citokinske terapije nije prikladna

Cijena citokinske terapije

Molekularni i ćelijski mehanizmi antivirusnog imuniteta, obrasci razvoja i imunopatoza

Proučavanje uzroka fibroze koštane srži kod mijeloproliferativnih bolesti analizom djelovanja trombocitnih faktora na mezenhimalne matične stanice

Patogeneza tuberkuloze kod ljudi