Sissejuhatus.

1. Tsütokiinide üldised omadused ja klassifikatsioon.

1.1 Toimemehhanismid.

1.2 Tsütokiinide omadused.

1.3 Tsütokiinide roll keha füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel.

2. Tsütokiinide eriuuringud.

2.1 Tsütokiinide roll käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis lastel.

2.2 Lämmastikoksiidi ja tsütokiinide roll ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkimisel.

3. Meetodid tsütokiinide määramiseks

3.1 Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramine

3.2 Tsütokiinide kvantifitseerimine antikehade abil

3.3 Tsütokiinide määramine ensüümi immuunanalüüsiga.

3.3.1 Kasvaja nekroosifaktor alfa.

3.3.2 Gamma -interferoon.

3.3.3 Interleukiin-4

3.3.4 Interleukiin-8

3.3.5 Interleukiin-1 retseptori antagonist.

3.3.6 Alfa-interferoon.

3.3.7 alfa-IFN-i antikehad.

4. Tsütokiinidel põhinevad immunotroopsed ravimid.

Kasutatud kirjanduse loetelu.

Järeldus.

Sissejuhatus.

Esimeste tsütokiinide kirjeldamisest pole palju aega möödas. Kuid nende uurimistöö tulemusena eraldati ulatuslik teadmiste osa - tsütokinoloogia, mis on erinevate teadmiste valdkondade ja ennekõike immunoloogia lahutamatu osa, mis andis nende vahendajate uurimisele võimsa tõuke. Tsütokinoloogia läbib kõiki kliinilisi erialasid, alates haiguste etioloogiast ja patogeneesist ning lõpetades erinevate patoloogiliste seisundite ennetamise ja raviga. Sellest tulenevalt peavad teadlased ja arstid navigeerima reguleerivate molekulide mitmekesisuses ja neil peab olema selge arusaam iga tsütokiini rollist uuritavas protsessis. Kõigil immuunsüsteemi rakkudel on teatud funktsioonid ja need toimivad selgelt koordineeritud koostoimes, mida pakuvad spetsiaalsed bioloogiliselt aktiivsed ained - tsütokiinid - immuunreaktsioonide regulaatorid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mille abil saavad immuunsüsteemi erinevad rakud omavahel teavet vahetada ja toiminguid koordineerida. Rakupinna retseptoreid - "tsütokiinikeskkonda" - mõjutavate tsütokiinide komplekt ja kogus esindavad interakteeruvate ja sageli muutuvate signaalide maatriksit. Need signaalid on keerukad, kuna on palju erinevaid tsütokiini retseptoreid ja asjaolu, et iga tsütokiin võib aktiveerida või pärssida mitmeid protsesse, sealhulgas oma sünteesi ja teiste tsütokiinide sünteesi, samuti tsütokiini retseptorite teket ja välimust. raku pinnal. Meie töö eesmärk on uurida tsütakiine, nende funktsioone ja omadusi ning nende võimalikku rakendamist meditsiinis. Tsütokiinid on väikesed valgud (molekulmass 8–80 KDa), mis toimivad autokriinselt (st neid tootval rakul) või parakriinil (läheduses paiknevatel rakkudel). Nende väga aktiivsete molekulide moodustumine ja vabanemine on lühiajaline ja rangelt reguleeritud.

Kirjanduse arvustus.

Tsütokiinide üldised omadused ja klassifikatsioon.

Tsütokiinid on rakkudevahelise interaktsiooni polüpeptiidide vahendajate rühm, mis on peamiselt seotud keha kaitsereaktsioonide moodustamisega ja reguleerimisega patogeenide sissetoomise ja kudede terviklikkuse rikkumise ajal, samuti mitmete normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisega. Tsütokiine saab eraldada uude sõltumatusse reguleerimissüsteemi, mis eksisteerib koos homöostaasi säilitamiseks mõeldud närvi- ja endokriinsüsteemidega ning kõik kolm süsteemi on omavahel tihedalt seotud ja üksteisest sõltuvad. Viimase kahe aastakümne jooksul on enamiku tsütokiinide geene kloonitud ja saadud rekombinantseid analooge, mis kordavad täielikult looduslike molekulide bioloogilisi omadusi. Nüüd on teada rohkem kui 200 tsütokiinide perekonda kuuluvat ainet. Tsütokiinide uurimise ajalugu algas 20. sajandi 40. aastatel. Siis kirjeldati vereseerumis esineva teguri, mis võib põhjustada kahheksiat või kehakaalu langust, esimest mõju. Seejärel isoleeriti see vahendaja ja näidati, et see on identne kasvaja nekroosifaktoriga (TNF). Sel ajal toimus tsütokiinide uurimine ühe bioloogilise toime tuvastamise põhimõttel, mis oli lähtepunktiks vastava vahendaja nimele. Nii kutsuti 50ndatel interferooni (IFN) selle võime tõttu sekkuda või suurendada resistentsust korduva viirusinfektsiooni ajal. Interleukiin-1 (IL-1) nimetati algselt ka endogeenseks pürogeeniks, erinevalt bakteriaalsetest lipopolüsahhariididest, mida peeti eksogeenseteks pürogeenideks. Järgmine tsütokiinide uurimise etapp, mis pärineb 60-70 aastat, on seotud looduslike molekulide puhastamisega ja nende bioloogilise toime igakülgse iseloomustamisega. Selleks ajaks kuulub T-raku kasvufaktori, nüüd tuntud kui IL-2, ja mitmete teiste T-, B-lümfotsüütide ja muud tüüpi leukotsüütide kasvu ja funktsionaalset aktiivsust stimuleerivate molekulide avastamine. Aastal 1979 pakuti nende määramiseks ja süstematiseerimiseks välja termin "interleukiinid", see tähendab vahendajad, kes suhtlevad leukotsüütide vahel. Kuid üsna pea selgus, et tsütokiinide bioloogiline toime ulatub immuunsüsteemist kaugemale ja seetõttu muutus varem välja pakutud mõiste "tsütokiinid", mis on tänaseni säilinud, vastuvõetavamaks. Revolutsiooniline pööre tsütokiinide uurimisel toimus 1980ndate alguses pärast hiire ja inimese interferooni geenide kloonimist ning rekombinantsete molekulide tootmist, mis kordasid täielikult looduslike tsütokiinide bioloogilisi omadusi. Pärast seda oli võimalik kloonida teiste selle perekonna vahendajate geene. Oluline verstapost tsütokiinide ajaloos oli rekombinantsete interferoonide ja eriti rekombinantse IL-2 kliiniline kasutamine vähi ravis. 90ndaid tähistas tsütokiini retseptorite alaühiku struktuuri avastamine ja "tsütokiinivõrgu" kontseptsiooni kujunemine ning XXI sajandi algus - paljude uute tsütokiinide avastamine geneetilise analüüsi abil. Tsütokiinide hulka kuuluvad interferoonid, kolooniaid stimuleerivad faktorid (CSF), kasvufaktoreid muundavad kemokiinid; kasvaja nekroosifaktor; väljakujunenud ajalooliste seerianumbritega interleukiinid ja mõned teised endogeensed vahendajad. Interleukiinid seerianumbritega alates 1 ei kuulu samasse tsütokiinide alarühma, mis on seotud ühiste funktsioonidega. Neid võib omakorda jagada põletikueelseteks tsütokiinideks, lümfotsüütide kasvu- ja diferentseerumisteguriteks ning üksikuteks reguleerivateks tsütokiinideks. Nimi "interleukiin" antakse äsja avastatud vahendajale, kui on täidetud järgmised Rahvusvahelise Immunoloogiaühingute Liidu nomenklatuurikomitee välja töötatud kriteeriumid: molekulaarne kloonimine ja uuritava faktori geeni ekspressioon, ainulaadse nukleotiidi olemasolu ja vastav aminohappejärjestus, saades neutraliseerivad monoklonaalsed antikehad. Lisaks peavad uut molekuli tootma immuunsüsteemi rakud (lümfotsüüdid, monotsüüdid või muud tüüpi leukotsüüdid), neil peab olema oluline bioloogiline funktsioon immuunvastuse reguleerimisel, samuti täiendavad funktsioonid, mistõttu ei saa see antakse funktsionaalne nimi. Lõpuks tuleks uue interleukiini loetletud omadused avaldada eelretsenseeritud teadusajakirjas. Tsütokiinide klassifitseerimine võib toimuda vastavalt nende biokeemilistele ja bioloogilistele omadustele, samuti retseptoritüüpide järgi, mille kaudu tsütokiinid täidavad oma bioloogilisi funktsioone. Tsütokiinide klassifitseerimine struktuuri järgi (tabel 1) võtab arvesse mitte ainult aminohappejärjestust, vaid eelkõige valgu tertsiaarset struktuuri, mis peegeldab täpsemalt molekulide evolutsioonilist päritolu.

Tabel 1. Tsütokiinide klassifikatsioon struktuuri järgi.

Geenide kloonimine ja tsütokiini retseptorite struktuuri analüüs näitas, et sarnaselt tsütokiinidele endile saab ka need molekulid jagada mitmeks tüübiks vastavalt aminohappejärjestuste sarnasusele ja rakuväliste domeenide korraldamise iseärasustele (tabel 2). Üks suurimaid tsütokiini retseptorite perekondi nimetatakse hematopoetiini retseptorite perekonnaks või I tüüpi tsütokiini retseptorite perekonnaks. Selle retseptorite rühma struktuurseks tunnuseks on 4 tsüsteiini ja aminohappejärjestuse Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) olemasolu rakumembraanist lühikese vahemaa tagant. II klassi tsütokiini retseptorid interakteeruvad interferoonide ja IL-10-ga. Mõlemad esimest tüüpi retseptorid on üksteisega homoloogilised. Järgmised retseptorite rühmad vahendavad koostoimet kasvaja nekroosifaktori perekonna ja IL-1 perekonna tsütokiinidega. Praegu on teada, et rohkem kui 20 erinevat kemokiini retseptorit interakteeruvad erineva afiinsusega ühe või mitme kemokiini perekonna ligandiga. Kemokiini retseptorid kuuluvad rodopsiini retseptorite superperekonda, neil on 7 transmembraanset domeeni ja nad juhivad signaali G-valkude osalusel.

Tabel 2. Tsütokiini retseptorite klassifikatsioon.

Paljud tsütokiini retseptorid koosnevad 2-3 alaühikust, mida kodeerivad erinevad geenid ja mida ekspresseeritakse sõltumatult. Sel juhul nõuab kõrge afiinsusega retseptori moodustamine kõigi allüksuste samaaegset interaktsiooni. Sellise tsütokiini retseptorite korralduse näiteks on IL-2 retseptorikompleksi struktuur. Üllatav oli avastus, et IL-2 retseptori kompleksi üksikud alaühikud on IL-2 ja mõnede teiste tsütokiinide jaoks ühised. Seega on β-ahel samaaegselt IL-15 retseptori komponent ja y-ahel toimib IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- retseptorite ühise allüksusena. 15 ja IL-21. See tähendab, et kõik ülalmainitud tsütokiinid, mille retseptorid koosnevad samuti 2-3 üksikust polüpeptiidist, kasutavad oma retseptorite komponendina y-ahelat, pealegi signaali edastamise eest vastutavat komponenti. Kõigil juhtudel tagavad iga tsütokiini interaktsiooni spetsiifilisuse teised struktuuri poolest erinevad allüksused. Tsütokiini retseptorite hulgas on 2 tavalisemat retseptori allüksust, mis juhivad signaali pärast erinevate tsütokiinidega suhtlemist. See on tavaline retseptori subühik βc (gp140) IL-3, IL-5 ja GM-CSF retseptorite jaoks, samuti gp130 retseptori allüksus, mis on ühine IL-6 perekonna liikmetele. Ühise signaaliühiku olemasolu tsütokiini retseptorites on nende klassifitseerimise üheks lähenemisviisiks, kuna see võimaldab leida ühisosa nii ligandide struktuuris kui ka bioloogilistes mõjudes.

Tabelis 3 on näidatud kombineeritud struktuuriline ja funktsionaalne klassifikatsioon, kus kõik tsütokiinid jagatakse rühmadesse, võttes eelkõige arvesse nende bioloogilist aktiivsust, samuti tsütokiinide molekulide ja nende retseptorite ülaltoodud struktuuriomadusi.

Tabel 3. Tsütokiinide struktuuriline ja funktsionaalne klassifikatsioon.

	Tsütokiinide pered	Alagrupid ja ligandid	Bioloogilised põhifunktsioonid
	I tüüpi interferoonid	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Viirusevastane toime, proliferatsioonivastane, immunomoduleeriv toime
	Hematopoeetiliste rakkude kasvufaktorid	Tüvirakkude faktor (kit-ligand, terasfaktor), Flt-3 ligand, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandid: IL-3, IL-5, GM-KSF	Erinevat tüüpi eellasrakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise stimuleerimine luuüdis, vereloome aktiveerimine Erütropoetiin, trombopoetiin
	Interleukiin-1 ja FRF superperekond	FRF perekond: Hapu FRF, põhiline FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) perekond: IL-1α, IL-1β, IL-1 retseptori antagonist, IL-18, IL-33 jne.	Fibroblastide ja epiteelirakkude proliferatsiooni aktiveerimine Põletikku soodustav toime, spetsiifilise immuunsuse aktiveerimine
	Kasvaja nekroosifaktorite perekond	TNF, lümfotoksiinid a ja β, Fas ligand jne.	Põletikku soodustav toime, apoptoosi reguleerimine ja immunokompetentsete rakkude rakkudevaheline interaktsioon
	Perekond Interleukin-6	Gp130 ligandid: IL-6, IL-11, IL-31, Onkostatiin-M, kardiotropiin-1, leukeemia inhibeeriv faktor, tsiliaarne neurotroofne faktor	Põletikku soodustav ja immunoregulatoorne toime
	Kemokiinid	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Erinevat tüüpi leukotsüütide kemotaksise reguleerimine
	Perekond Interleukin-10	IL-10,19,20,22,24,26	Immunosupressiivne toime
	Perekond Interleukin-12		Abistaja T-lümfotsüütide diferentseerumise reguleerimine
	T-abistaja kloonide tsütokiinid ja lümfotsüütide regulatiivsed funktsioonid	T-abistajate tüüp 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-tüüpi abistajad, tüüp 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 retseptori y-ahela ligandid: IL-7 TSLP	Rakulise immuunsuse aktiveerimine Humoraalse immuunsuse aktiveerimine, immunomoduleeriv toime Erinevat tüüpi lümfotsüütide, DC, NK -rakkude, makrofaagide jne diferentseerumise, proliferatsiooni ja funktsionaalsete omaduste stimuleerimine.
	Perekond Interleukin 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Põletikku soodustavate tsütokiinide sünteesi aktiveerimine
	Närvi kasvufaktori, trombotsüütide kasvufaktori ja transformeerivate kasvufaktorite superperekond	Närvi kasvufaktori perekond: NGF, aju neurotroofne tegur Trombotsüütidest pärinevad kasvufaktorid (PDGF), angiogeensed kasvufaktorid (VEGF) TRF perekond: TPPb, aktiviinid, inhibiinid, Nodal, Luu morfogeensed valgud, Mülleri pärssiv aine	Põletiku, angiogeneesi, neuronaalse funktsiooni, embrüonaalse arengu ja kudede taastumise reguleerimine
	Epidermaalse kasvufaktori perekond	ERF, TRFα jne.
	Insuliinitaoliste kasvufaktorite perekond	IRF-I, IRF-II	Erinevate rakutüüpide proliferatsiooni stimuleerimine

Esimesse rühma kuuluvad I tüüpi interferoonid ja see on organisatsiooni poolest lihtsaim, kuna kõik sellesse kuuluvad molekulid on sarnase struktuuriga ja paljuski samade funktsioonidega, mis on seotud viirusevastase kaitsega. Teine rühm hõlmas hematopoeetiliste rakkude kasvu- ja diferentseerumistegureid, stimuleerides vereloome eellasrakkude arengut, alustades tüvirakust. Sellesse rühma kuuluvad tsütokiinid, mis on kitsalt spetsiifilised vereloomerakkude teatud diferentseerumisliinide suhtes (erütropoetiin, trombopoetiin ja IL-7, mis toimib TB-lümfotsüütide eelkäijatele), samuti tsütokiinid, millel on laiem bioloogilise aktiivsuse spekter. IL-3, IL-11, kolooniaid stimuleerivate teguritena. Selles tsütokiinide rühmas on molekulide struktuurilise korralduse sarnasuse tõttu eraldatud gp140 ligandid, millel on ühine retseptori allüksus, samuti trombopoetiin ja erütropoetiin. FGF ja IL-1 superperekondade tsütokiinidel on kõrge homoloogia ja sarnane valkude struktuur, mis kinnitab ühist päritolu. Sellegipoolest erineb FGF bioloogilise aktiivsuse ilmingute poolest paljuski IL-1 perekonna agonistidest. IL-1 molekulide perekonnal on praegu lisaks funktsionaalsetele nimedele tähised F1-F11, kus F1 vastab IL-1α, F2 kuni IL-1β, F3 IL-1 retseptori antagonistile, F4 kuni IL- 18. Ülejäänud pereliikmed on avastatud geneetilise analüüsi tulemusena ja neil on üsna kõrge homoloogia IL-1 molekulidega, kuid nende bioloogilisi funktsioone pole täielikult selgitatud. Teiste tsütokiinide rühmade hulka kuuluvad IL-6 perekonnad (ühise retseptori alaühiku gp130 ligandid), kasvaja nekroosifaktor ja kemokiinid, mida esindab suurim arv üksikuid ligande ja mis on loetletud täielikult vastavates peatükkides. Kasvaja nekroosifaktori perekond moodustub peamiselt ligandide ja nende retseptorite struktuuri sarnasuse alusel, mis koosneb kolmest mittekovalentselt seotud identsest alaühikust, mis moodustavad bioloogiliselt aktiivseid molekule. Samas hõlmab see perekond bioloogiliste omaduste poolest üsna erineva aktiivsusega tsütokiine. Näiteks TNF on üks eredamaid põletikuvastaseid tsütokiine, Fas ligand indutseerib sihtrakkude apoptoosi ja CD40 ligand annab stimuleeriva signaali T- ja B -lümfotsüütide rakkudevahelise interaktsiooni ajal. Sellised erinevused struktuurselt sarnaste molekulide bioloogilises aktiivsuses määravad peamiselt nende retseptorite ekspressiooni ja struktuuri tunnused, näiteks rakusisese „surma” domeeni olemasolu või puudumine, mis määrab raku apoptoosi. Viimastel aastatel on ka perekondi IL-10 ja IL-12 täiendatud uute liikmetega, kes on saanud interleukiinide seerianumbrid. Sellele järgneb väga keeruline tsütokiinide rühm, mis on T-abistaja lümfotsüütide funktsionaalse aktiivsuse vahendajad. Sellesse rühma kaasamine põhineb kahel põhiprintsiibil: 1) kuulumine Th1 või Th2 sünteesitud tsütokiinidesse, mis määrab valdavalt humoraalse või rakulise tüüpi immunoloogiliste reaktsioonide arengu, 2) ühise retseptori allüksuse - gamma -ahela - olemasolu IL-2 retseptori kompleksi. Gamma-ahela ligandide hulgas eraldati täiendavalt IL-4, millel on ka IL-13-ga ühised retseptori allüksused, mis määrab suuresti nende tsütokiinide osaliselt kattuva bioloogilise aktiivsuse. IL-7, millel on TSLP-ga ühine retseptorite struktuur, eraldati sarnasel viisil. Ülaltoodud klassifikatsiooni eelised on seotud tsütokiinide bioloogiliste ja biokeemiliste omaduste samaaegse arvestamisega. Selle lähenemisviisi teostatavust kinnitab praegu uute tsütokiinide avastamine genoomi geneetilise analüüsi abil ja struktuurilt sarnaste geenide otsimine. Tänu sellele meetodile on I tüüpi interferoonide perekond IL-1, IL-10, IL-12 märkimisväärselt laienenud, ilmunud on uus IL-17 analoogtsütokiinide perekond, mis koosneb juba 6 liikmest. Ilmselt toimub lähitulevikus uute tsütokiinide teke palju aeglasemalt, kuna inimese genoomi analüüs on peaaegu lõpetatud. Muutused on suure tõenäosusega võimalikud ligand-retseptori interaktsioonide variantide ja bioloogiliste omaduste selgitamise tõttu, mis võimaldab tsütokiinide klassifitseerimisel omandada lõpliku vormi.

Toimemehhanismid.

B. Tsütokiinide retseptorid. Tsütokiinid on hüdrofiilsed signaaliained, mille toimet vahendavad plasmamembraani välisküljel olevad spetsiifilised retseptorid. Tsütokiinide seondumine retseptoriga (1) viib läbi mitmeid vaheetappe (2-5) teatud geenide transkriptsiooni aktiveerimiseks (6). Tsütokiini retseptoritel endal ei ole türosiinkinaasi aktiivsust (välja arvatud mõned erandid). Pärast tsütokiiniga (1) seondumist seonduvad retseptorimolekulid homodimeeride moodustamiseks. Lisaks võivad nad moodustada heterodimeere signaaliülekande valkudega [STP -d] või stimuleerida BPS -de endi dimeriseerumist (2). I klassi tsütokiini retseptorid võivad agregeeruda kolme tüüpi BPS -iga: valgud GP130, βc või yc. Need abivalgud ise ei suuda tsütokiine siduda, kuid nad viivad läbi signaaliülekande türosiinkinaasidele (3). Paljude tsütokiinide samad bioloogilise aktiivsuse spektrid on seletatavad asjaoluga, et erinevad tsütokiini-retseptori kompleksid võivad aktiveerida sama BPS-i.

Signaaliülekande näitena tsütokiinidest näitab diagramm, kuidas IL-6 (IL-6) retseptor pärast ligandiga (1) seondumist stimuleerib GP130 dimeriseerumist (2). Membraanvalgu dimeer GP130 seob ja aktiveerib YK perekonna tsütoplasmaatilise türosiinkinaasi (kahe aktiivse saidiga Januse kinaasid) (3). Januse kinaasid fosforüülivad tsütokiini retseptoreid, BPS -i ja erinevaid tsütoplasmaatilisi valke, mis viivad edasi signaaliülekande; nad fosforüülivad ka transkriptsioonifaktoreid - signaali muundureid ja transkriptsiooni aktivaatoreid [PSAT (STAT, inglise signaali muunduritest ja transkriptsiooni aktivaatoritest)]. Need valgud kuuluvad BPS perekonda, mille struktuuris on SH3-domeen, mis tunneb ära fosfotürosiini jäägid (vt lk 372). Seetõttu on neil omadus seostuda fosforüülitud tsütokiini retseptoriga. Kui siis toimub PSAT -molekuli (4) fosforüülimine, muundub tegur aktiivsesse vormi ja moodustab dimeeri (5). Pärast tuuma translokatsiooni seondub dimeer transkriptsioonifaktorina algatatud geeni promootoriga (vt lk 240) ja indutseerib selle transkriptsiooni (6). Mõned tsütokiini retseptorid võivad proteolüüsi tõttu kaotada rakuvälise ligandi siduva domeeni (pole joonisel näidatud). Domeen siseneb verre, kus konkureerib sidumise eest tsütokiiniga, mis vähendab tsütokiinide kontsentratsiooni veres.Üheskoos moodustavad tsütokiinid multifunktsionaalse toimega reguleeriva võrgustiku (tsütokiini kaskaad). Tsütokiinide kattumine toob kaasa asjaolu, et paljude nende toimel täheldatakse sünergiat ja mõned tsütokiinid on antagonistid. Kehas võib sageli täheldada kogu keeruka tagasisidega tsütokiini kaskaadi.

Tsütokiinide omadused.

Tsütokiinide üldised omadused, mille tõttu saab need vahendajad ühendada sõltumatuks reguleerimissüsteemiks.

1. Tsütokiinid on polüpeptiidid või valgud, sageli glükosüülitud, enamiku nende MW on 5 kuni 50 kDa. Tsütokiinide bioloogiliselt aktiivsed molekulid võivad koosneda ühest, kahest, kolmest või enamast identsest või erinevast alaühikust.

2. Tsütokiinidel ei ole bioloogilise toime antigeenset spetsiifilisust. Need mõjutavad kaasasündinud ja omandatud immuunsuse reaktsioonides osalevate rakkude funktsionaalset aktiivsust. Sellegipoolest on tsütokiinid T- ja B-lümfotsüütidele toimides võimelised stimuleerima antigeenist indutseeritud protsesse immuunsüsteemis.

3. Tsütokiini geenidel on kolm ekspressioonivõimalust: a) etapispetsiifiline ekspressioon embrüonaalse arengu teatud etappidel, b) konstitutiivne ekspressioon paljude normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimiseks, c) enamikule tsütokiinidele iseloomulik indutseeritav ekspressioonitüüp. Tõepoolest, rakud ei sünteesi enamikku tsütokiine väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust. Tsütokiini geenide ekspressioon algab vastusena patogeenide tungimisele organismi, antigeensele ärritusele või koekahjustusele. Patogeeniga seotud molekulaarstruktuurid on põletikuliste tsütokiinide sünteesi kõige tugevamate indutseerijate hulgas. T-raku tsütokiinide sünteesi käivitamiseks on vajalik rakkude aktiveerimine spetsiifilise antigeeni poolt T-raku antigeeni retseptori osalusel.

4. Tsütokiinid sünteesitakse vastuseks stimulatsioonile lühikese aja jooksul. Süntees lõpetatakse mitmesuguste autoregulatsioonimehhanismide, sealhulgas suurenenud RNA ebastabiilsuse tõttu, ja kuna on olemas negatiivsed tagasiside, mida vahendavad prostaglandiinid, kortikosteroidhormoonid ja muud tegurid.

5. Ühte ja sama tsütokiini võivad histogeneetilise päritolu poolest toota erinevat tüüpi keharakud erinevates organites.

6. Tsütokiine võib seostada neid sünteesivate rakkude membraanidega, millel on membraani kujul täielik bioloogilise aktiivsuse spekter ja mis avaldavad oma bioloogilist toimet rakkudevahelise kontakti ajal.

7. Tsütokiinide bioloogilist toimet vahendavad spetsiifilised rakulised retseptorikompleksid, mis seovad tsütokiine väga suure afiinsusega, ja üksikud tsütokiinid võivad kasutada ühiseid retseptori allüksusi. Tsütokiini retseptorid võivad eksisteerida lahustuval kujul, säilitades võime ligande siduda.

8. Tsütokiinidel on pleiotroopne bioloogiline toime. Sama tsütokiin võib mõjutada mitut tüüpi rakke, põhjustades sõltuvalt sihtrakkude tüübist erinevaid mõjusid (joonis 1). Tsütokiinide pleiotroopse toime tagab tsütokiini retseptorite ekspressioon erineva päritolu ja funktsiooniga rakutüüpidele ning signaali juhtivus, kasutades mitmeid erinevaid rakusiseseid sõnumitoojaid ja transkriptsioonifaktoreid.

9. Tsütokiine iseloomustab bioloogilise toime asendatavus. Mitmed erinevad tsütokiinid võivad põhjustada sama bioloogilist toimet või omada sarnast aktiivsust. Tsütokiinid indutseerivad või pärsivad enda, teiste tsütokiinide ja nende retseptorite sünteesi.

10. Vastuseks aktiveerimissignaalile sünteesivad rakud samaaegselt mitmeid tsütokiine, mis osalevad tsütokiinivõrgu moodustamises. Bioloogilised mõjud kudedes ja keha tasandil sõltuvad teiste sünergistliku, lisanduva või vastupidise toimega tsütokiinide olemasolust ja kontsentratsioonist.

11. Tsütokiinid võivad mõjutada sihtrakkude proliferatsiooni, diferentseerumist ja funktsionaalset aktiivsust.

12. Tsütokiinid toimivad rakkudele erineval viisil: autokriinne - rakku, mis seda tsütokiini sünteesib ja sekreteerib; parakriin - rakkudele, mis asuvad tootjaraku lähedal, näiteks põletiku fookuses või lümfoidorganis; endokriinne - kaugele mis tahes elundite ja kudede rakkudesse pärast vereringesse sisenemist. Viimasel juhul sarnaneb tsütokiinide toime hormoonidega (joonis 2).

Riis. 1. Ühte ja sama tsütokiini võivad toota erinevat tüüpi rakud organismis erinevates histogeneetilise päritoluga organites ja toimida mitut tüüpi rakke, põhjustades erinevaid toimeid sõltuvalt sihtrakkude tüübist.

Riis. 2. Tsütokiinide bioloogilise toime avaldumise kolm varianti.

Ilmselt toimus tsütokiini reguleerimissüsteemi kujunemine evolutsiooniliselt koos mitmerakuliste organismide arenguga ja see oli tingitud vajadusest moodustada rakkudevahelise interaktsiooni vahendajaid, mille hulka võivad kuuluda hormoonid, neuropeptiidid, adhesioonimolekulid ja mõned teised. Sellega seoses on tsütokiinid kõige mitmekülgsem reguleeriv süsteem, kuna nad on võimelised avaldama bioloogilist aktiivsust nii kaugel pärast sekretsiooni tootva raku poolt (lokaalselt ja süsteemselt) kui ka rakkudevahelise kontakti ajal, olles bioloogiliselt aktiivsed membraanivormi kujul. Nii erineb tsütokiinisüsteem adhesioonimolekulidest, mis täidavad kitsamaid funktsioone ainult siis, kui rakud on otseses kontaktis. Samal ajal erineb tsütokiinisüsteem hormoonidest, mida peamiselt sünteesivad spetsiaalsed organid ja mis toimivad pärast vereringesüsteemi sisenemist.

Tsütokiinide roll keha füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel.

Tsütokiinide rolli keha füsioloogiliste funktsioonide reguleerimisel võib jagada neljaks põhikomponendiks:

1. Embrüogeneesi, elundite rajamise ja arengu reguleerimine, sh. immuunsüsteemi organid.

2. Teatud normaalsete füsioloogiliste funktsioonide reguleerimine.

3. Organismi kaitsereaktsioonide reguleerimine kohalikul ja süsteemsel tasandil.

4. Kudede regenereerimisprotsesside reguleerimine.

Üksikute tsütokiinide geenide ekspressioon toimub embrüonaalse arengu teatud etappides etapispetsiifiliselt. Tüvirakkude faktor, transformeerivad kasvufaktorid, TNF perekonna tsütokiinid ja kemokiinid reguleerivad erinevate rakkude diferentseerumist ja migratsiooni ning immuunsüsteemi organite loomist. Pärast seda ei pruugi mõne tsütokiini süntees jätkuda, teised aga jätkavad normaalsete füsioloogiliste protsesside reguleerimist või osalevad kaitsereaktsioonide väljatöötamises.

Hoolimata asjaolust, et enamik tsütokiine on tüüpilised indutseeritavad vahendajad ja sünnijärgsel perioodil ei sünteesita neid rakke väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust, ei kuulu mõned tsütokiinid selle reegli alla. Geenide konstitutiivse ekspressiooni tulemusena sünteesitakse osa neist pidevalt ja on ringluses piisavalt suurtes kogustes, reguleerides teatud rakutüüpide vohamist ja diferentseerumist kogu elu jooksul. Selliste funktsioonide füsioloogilise reguleerimise näideteks tsütokiinide poolt võivad olla pidevalt kõrge erütropoetiini tase ja mõned CSF -id, et tagada vereloome. Keha kaitsereaktsioonide reguleerimine tsütokiinide poolt toimub mitte ainult immuunsüsteemi sees, vaid ka kaitsereaktsioonide korraldamisel kogu organismi tasandil, reguleerides peaaegu kõiki põletiku ja immuunvastuse arengu aspekte. See funktsioon, mis on kogu tsütokiinisüsteemi jaoks kõige olulisem, on seotud tsütokiinide bioloogilise toime kahe peamise suunaga - kaitse nakkusetekitajate eest ja kahjustatud kudede taastamine. Tsütokiinid reguleerivad peamiselt kohalike kaitsereaktsioonide arengut kudedes, kaasates erinevat tüüpi vererakke, endoteeli, sidekoe ja epiteeli. Kaitse kohalikul tasandil areneb tüüpilise põletikulise reaktsiooni moodustumise kaudu koos selle klassikaliste ilmingutega: hüperemia, turse teke, valu ilmnemine ja talitlushäired. Tsütokiinide süntees algab siis, kui patogeenid sisenevad kudedesse või rikutakse nende terviklikkust, mis tavaliselt kulgeb paralleelselt. Tsütokiinide tootmine on rakulise vastuse lahutamatu osa, mis on seotud rakkude poolt erinevate patogeenide sarnaste struktuurikomponentide müelomonotsüütilise seeria äratundmisega, mida nimetatakse patogeeniga seotud molekulaarseteks mustriteks. Selliste patogeenistruktuuride näideteks on gramnegatiivsete bakterite lipopolüsahhariidid, grampositiivsete mikroorganismide peptidoglükaanid, flagelliin või CpolyG järjestustega rikas DNA, mis on tüüpiline igat tüüpi bakterite DNA-le. Leukotsüüdid ekspresseerivad vastavaid mustrituvastavaid retseptoreid, mida nimetatakse ka Toll-like retseptoriteks (TLR) ja mis on spetsiifilised mikroorganismide teatud struktuurimustrite jaoks. Pärast mikroorganismide või nende komponentide interaktsiooni TLR -iga käivitatakse rakusisene signaaliülekande kaskaad, mis viib leukotsüütide funktsionaalse aktiivsuse ja tsütokiini geenide ekspressiooni suurenemiseni.

TLR aktiveerimine toob kaasa kahe peamise tsütokiinirühma sünteesi: põletikueelsed tsütokiinid ja I tüüpi interferoonid, peamiselt IFNα / β. Põletikulise reaktsiooni tekkimine ja ventilaatorilaadse laienemise võimaldamine erinevat tüüpi rakkudes, mis on seotud hooldusega ja põletiku reguleerimine, sealhulgas igat tüüpi leukotsüüdid, dendriitrakud, T- ja B-lümfotsüüdid, NK-rakud, endoteeli- ja epiteelirakud, fibroblastid jt. See tagab põletikulise reaktsiooni arengu järjepidevad etapid, mis on kaasasündinud immuunsuse rakendamise peamine mehhanism. Lisaks hakkavad dendriitrakud sünteesima IL-12 perekonna tsütokiine, stimuleerides abistaja T-lümfotsüütide diferentseerumist, mis on omamoodi sillaks spetsiifiliste antigeensete struktuuride äratundmisega seotud spetsiifiliste immuunsusreaktsioonide arengu algusesse. mikroorganismidest.

Teine mitte vähem oluline IFN -i sünteesiga seotud mehhanism tagab viirusevastase kaitse rakendamise. I tüüpi interferoonidel on neli peamist bioloogilist omadust:

1. Otsene viirusevastane toime, blokeerides transkriptsiooni.

2. Rakkude proliferatsiooni pärssimine, mis on vajalik viiruse leviku tõkestamiseks.

3. NK-rakkude funktsioonide aktiveerimine, millel on võime viirust nakatunud keharakke lüüsida.

4. I klassi peamiste histo-ühilduvuskompleksi molekulide tõhustatud ekspressioon, mis on vajalik viiruse antigeenide nakatunud rakkude tsütotoksilistele T-lümfotsüütidele esitamise efektiivsuse suurendamiseks. See viib viirusega nakatunud rakkude spetsiifilise äratundmise aktiveerumiseni T-lümfotsüütide poolt-viirusega nakatatud sihtrakkude lüüsi esimene etapp.

Selle tulemusena aktiveeritakse lisaks otsesele viirusevastasele toimele nii kaasasündinud (NK-rakud) kui ka omandatud (T-lümfotsüüdid) immuunsuse mehhanismid. See on näide sellest, kuidas üks väike tsütokiinimolekul, mille MM on 10 korda väiksem kui MM antikehamolekul, on pleiotroopse bioloogilise toime tõttu võimeline aktiveerima täiesti erinevaid kaitsereaktsioonide mehhanisme, mille eesmärk on täita üks eesmärk - eemaldada viirus, millel on sisenes kehasse.

Kudede tasandil vastutavad tsütokiinid põletiku tekkimise ja seejärel kudede taastumise eest. Süsteemsete põletikuliste reaktsioonide (ägeda faasi vastus) arenedes mõjutavad tsütokiinid peaaegu kõiki homöostaasi reguleerimisega seotud organeid ja süsteeme. Põletikku soodustavate tsütokiinide toime kesknärvisüsteemile põhjustab söögiisu vähenemist ja muutusi kogu käitumuslike reaktsioonide kompleksis. Toidu otsimise ajutine katkestamine ja seksuaalse aktiivsuse vähendamine on kasulik energia säästmiseks ühe ülesande jaoks - võidelda sissetungiva patogeeniga. Selle signaali annavad tsütokiinid, kuna nende sisenemine vereringesse tähendab kindlasti seda, et kohalik kaitse ei ole patogeeniga toime tulnud ning vajalik on süsteemse põletikulise vastuse aktiveerimine. Üks esimesi süsteemsete põletikuliste reaktsioonide ilminguid, mis on seotud tsütokiinide toimega hüpotalamuse termoregulatsioonikeskusele, on kehatemperatuuri tõus. Temperatuuri tõus on tõhus kaitsereaktsioon, kuna kõrgemal temperatuuril väheneb paljude bakterite paljunemisvõime, kuid vastupidi, lümfotsüütide vohamine suureneb.

Maksas suureneb tsütokiinide mõjul patogeeniga võitlemiseks vajaliku ägeda faasi valkude ja komplemendisüsteemi komponentide süntees, kuid samal ajal väheneb albumiini süntees. Teine näide tsütokiinide selektiivsest toimest on vereplasma ioonse koostise muutus süsteemse põletikulise reaktsiooni tekkimisel. Samal ajal väheneb rauaioonide tase, kuid suureneb tsingiioonide tase ning on hästi teada, et bakteriraku rauaioonide äravõtmine tähendab selle proliferatsioonipotentsiaali vähendamist (laktoferriini toime on selle põhjal). Teisest küljest on tsingi taseme tõus vajalik immuunsüsteemi normaalseks toimimiseks, eriti on see vajalik bioloogiliselt aktiivse seerumi tüümusefaktori - ühe peamise tüümusehormooni - moodustamiseks, mis tagab lümfotsüütide diferentseerumise. Tsütokiinide mõju vereloome süsteemile on seotud hematopoeesi olulise aktiveerimisega. Kaotuse täiendamiseks ja mädase põletiku fookuses olevate rakkude, peamiselt neutrofiilsete granulotsüütide arvu suurendamiseks on vaja leukotsüütide arvu suurendada. Toime vere hüübimissüsteemile on suunatud hüübimise suurendamisele, mis on vajalik verejooksu peatamiseks ja patogeeni otseseks blokeerimiseks.

Seega on süsteemse põletiku arenedes tsütokiinidel tohutu bioloogilise aktiivsuse spekter ja need häirivad peaaegu kõigi kehasüsteemide tööd. Kuid ükski muutustest ei ole juhuslik: kõik need on vajalikud kaitsereaktsioonide otseseks aktiveerimiseks või on kasulikud energiavoogude vahetamisel ainult ühe ülesande täitmiseks - sissetungiva patogeeni vastu võitlemiseks. Üksikute geenide ekspressiooni reguleerimise, hormonaalsete muutuste ja käitumisreaktsioonide muutuste vormis tagavad tsütokiinid nende kehasüsteemide töö aktiveerimise ja maksimaalse efektiivsuse, mis on antud ajahetkel vajalikud kaitsereaktsioonide tekkeks. Kogu organismi tasandil suhtlevad tsütokiinid immuunsüsteemi, närvisüsteemi, endokriinsüsteemi, vereloome ja muude süsteemide vahel ning aitavad neid kaasata ühe kaitsereaktsiooni korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinid on organiseeriv süsteem, mis moodustab ja reguleerib kogu keha kaitsereaktsioonide kompleksi patogeenide sissetoomise ajal. Ilmselt moodustati selline regulatsioonisüsteem evolutsiooniliselt ja see toob tingimusteta kasu makroorganismi optimaalseima kaitsereaktsiooni jaoks. Seetõttu on ilmselt võimatu piirata kaitsereaktsioonide kontseptsiooni ainult mittespetsiifiliste resistentsusmehhanismide ja spetsiifilise immuunvastuse osalemisega. Kogu keha ja kõik süsteemid, mis esmapilgul ei ole seotud immuunsuse säilitamisega, osalevad ühes kaitsereaktsioonis.

Tsütokiinide eriuuringud.

Tsütokiinide tähtsus käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis lastel.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihhailova. Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool, Moskva Riiklik Koloproktoloogia Teaduslik Keskus ja Riiklik Kõrgpuhaste Bioloogiliste Uuringute Instituut Peterburis tegelevad tsütokiinide tähtsuse uurimisega laste käärsoole põletikuliste haiguste patogeneesis. Seedetrakti kroonilised põletikulised haigused hõivavad praegu laste seedesüsteemi patoloogia juhtivaid kohti. Erilist tähtsust omistatakse käärsoole põletikulistele haigustele (IBD), mille esinemissagedus kasvab kogu maailmas pidevalt. Pikk kursus sagedaste ja mõnel juhul surmaga lõppevate ägenemistega, kohalike ja süsteemsete tüsistuste teke - see kõik ajendab põhjalikult uurima haiguse patogeneesi, otsides uusi lähenemisviise IBD ravile. Viimastel aastakümnetel esines haavandilist koliiti (UC) 510 juhtu aastas 100 tuhande elaniku kohta, Crohni tõvega (CD) 16 juhtu aastas 100 tuhande elaniku kohta. Levimuse määr Venemaal, Moskva piirkonnas vastab Euroopa keskmistele andmetele, kuid oluliselt madalam kui Skandinaavia riikides, Ameerikas, Iisraelis ja Inglismaal. NUC puhul on levimus 19,3 100 tuhande kohta, esinemissagedus 1,2 tuhande inimese kohta aastas. CD puhul on levimus 3,0 100 tuhande kohta, esinemissagedus 0,2 100 tuhande inimese kohta aastas. Asjaolu, et kõrgeimat esinemissagedust täheldati kõrgelt arenenud riikides, on tingitud mitte ainult sotsiaalsetest ja majanduslikest teguritest, vaid ka patsientide geneetilistest ja immunoloogilistest omadustest, mis määravad eelsoodumuse IBD -le. Need tegurid on IBD päritolu immunopatogeneetilises teoorias olulised. Viirus- ja / või bakteriteooriad selgitavad ainult haiguse ägedat algust ning protsessi kroniseerumine on tingitud nii geneetilisest eelsoodumusest kui ka immuunvastuse omadustest, mis on samuti geneetiliselt määratud. Tuleb märkida, et IBTC on praegu klassifitseeritud haiguseks, millel on geneetiliselt heterogeenne kompleksne eelsoodumus. On tuvastatud rohkem kui 15 oletatavat kandidaatgeeni kahest rühmast (immunospetsiifiline ja immunoregulatoorne), mis põhjustavad pärilikku eelsoodumust. Tõenäoliselt määravad eelsoodumuse mitmed geenid, mis määravad immunoloogiliste ja põletikuliste reaktsioonide olemuse. Arvukate uuringute tulemuste põhjal võib järeldada, et IBT arenguga seotud geenide kõige tõenäolisem lokaliseerimine on kromosoomid 3, 7, 12 ja 16. Praegu pööratakse suurt tähelepanu T- ja B -lümfotsüütide, samuti põletiku vahendajate tsütokiinide funktsiooni tunnuste uurimisele. Aktiivselt uuritakse interleukiinide (IL), interferoonide (IFN), kasvaja nekroosifaktor-a (TNF-a), makrofaagide ja autoantikehade rolli jämesoole limaskesta valkude ja auto mikrofloora suhtes. Nende häirete tunnused CD ja UC -s paljastati, kuid on endiselt ebaselge, kas need muutused toimuvad peamiselt või sekundaarselt. Patogeneesi paljude aspektide mõistmiseks oleksid IBT prekliinilises staadiumis, samuti esimese astme sugulastel läbi viidud uuringud väga olulised. Põletiku vahendajate hulgas on eriline roll tsütokiinidel, mis on polüpeptiidmolekulide rühm massiga 5 kuni 50 kDa, osalevad keha kaitsereaktsioonide kujunemises ja reguleerimises. Keha tasandil suhtlevad tsütokiinid immuunsüsteemi, närvisüsteemi, endokriinsüsteemi, vereloome ja muude süsteemide vahel ning aitavad neid kaasata kaitsereaktsioonide korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinide klassifikatsioon on toodud tabelis 2. Enamikku tsütokiine ei sünteesi rakud, mis asuvad väljaspool põletikulist vastust ja immuunvastust. Tsütokiini geenide ekspressioon algab vastusena patogeenide tungimisele organismi, antigeensele ärritusele või koekahjustusele. Üks võimsamaid tsütokiini sünteesi indutseerijaid on bakteriraku seinte komponendid: LPS, peptidoglükaanid ja muramüüldipeptiidid. Põletikku soodustavate tsütokiinide tootjad on peamiselt monotsüüdid, makrofaagid, T-rakud jne. Sõltuvalt põletikulisele protsessile avalduvast mõjust jagunevad tsütokiinid kahte rühma: põletikuvastased (IL-1, IL-6, IL-8) , TNF-a, IFN-g) ja põletikuvastased (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukiin-1 (IL-1) on immunoreguleeriv vahendaja, mis vabaneb põletikuliste reaktsioonide, koekahjustuste ja infektsioonide ajal (põletikueelne tsütokiin). IL-1 mängib olulist rolli T-rakkude aktiveerimisel, kui nad interakteeruvad antigeeniga. On kahte tüüpi IL-1: IL-1a ja IL-1b, kahe erineva geeni lookuse produktid, mis asuvad inimese kromosoomil 2. IL-1a jääb raku sisse või võib olla membraani kujul ja esineb väikestes kogustes rakuvälises ruumis. IL-1a membraanivormi roll on aktiveerivate signaalide edastamine makrofaagidest T-lümfotsüütidele ja teistele rakkudele rakkudevahelise kontakti ajal. IL-1a on peamine lähitoime vahendaja. Erinevalt IL-1a-st sekreteerivad IL-1b rakud aktiivselt, toimides nii süsteemselt kui ka lokaalselt. Tänapäeval on teada, et IL-1 on üks peamisi põletikuliste reaktsioonide vahendajaid, stimuleerib T-rakkude proliferatsiooni, suurendab IL-2 retseptori ekspressiooni T-rakkudel ja nende IL-2 tootmist. IL-2 koos antigeeniga indutseerib neutrofiilide aktivatsiooni ja adhesiooni, stimuleerib teiste tsütokiinide (IL-2, IL-3, IL-6 jne) teket aktiveeritud T-rakkude ja fibroblastide poolt, stimuleerib fibroblastide proliferatsiooni ja endoteelirakud. Süsteemselt toimib IL-1 sünergistlikult TNF-a ja IL-6-ga. Vere kontsentratsiooni suurenemisega mõjutab IL-1 hüpotalamuse rakke ja põhjustab kehatemperatuuri tõusu, palavikku, unisust, söögiisu vähenemist ning stimuleerib ka maksarakke tootma ägeda faasi valke (CRP, amüloid A, a-2 makroglobuliin ja fibrinogeen). IL4 (kromosoom 5). See pärsib makrofaagide aktiveerimist ja blokeerib paljusid IFNg poolt stimuleeritud toimeid, nagu IL1, lämmastikoksiidi ja prostaglandiinide tootmine, mängib olulist rolli põletikuvastastes reaktsioonides ja omab immunosupressiivset toimet. IL6 (kromosoom 7), üks peamisi põletikku soodustavaid tsütokiine, on B -rakkude ja makrofaagide diferentseerumise viimase etapi peamine indutseerija, võimas stimulaator ägeda faasi valkude tootmisel maksarakkude poolt. IL6 üks põhifunktsioone on stimuleerida antikehade tootmist in vivo ja in vitro. IL8 (kromosoom 4). Viitab kemokiinide vahendajatele, mis põhjustavad leukotsüütide suunatud migratsiooni (kemotaksist) põletiku fookusesse. IL10 põhiülesanne on tsütokiini tootmise pärssimine I tüüpi Thelpersi (TNFb, IFNg) ja aktiveeritud makrofaagide (TNF-a, IL1, IL12) poolt. Nüüd on teada, et immuunvastuse tüübid on seotud ühe lümfotsüütide aktivatsiooni variandiga, kus osalevad peamiselt esimese (TH2) või teist tüüpi (TH3) T -lümfotsüütide abistajate kloonid. Tooted TH2 ja TH3 mõjutavad negatiivselt vastaskloonide aktiveerimist. Mis tahes tüüpi Th -kloonide liigne aktiveerimine võib suunata immuunvastust vastavalt ühele arenguvõimalusele. Krooniline tasakaalutus Th -kloonide aktiveerimisel viib immunopatoloogiliste seisundite tekkeni. IBTD tsütokiinide muutusi saab uurida mitmel viisil, määrates nende taseme veres või in situ. Kõigi põletikuliste soolehaiguste korral on IL1 tase tõusnud. Erinevused NNC ja CD vahel on IL2 suurenenud ekspressioonis. Kui NUC -s leitakse langenud või normaalne IL2 tase, siis CD -s tuvastatakse selle tõus. IL4 sisaldus suureneb NUC -s, samas kui CD -s jääb see normaalseks või isegi väheneb. Ägeda faasi reaktsioone vahendava IL6 tase tõuseb ka kõigi põletiku vormide korral. Tsütokiini profiili kohta saadud andmed võimaldasid oletada, et kroonilise IBD kahte peamist vormi iseloomustab tsütokiinide erinev aktiveerimine ja ekspressioon. Uuringute tulemused näitavad, et UC -ga patsientidel täheldatud tsütokiiniprofiil on paremini kooskõlas TH3 profiiliga, samas kui TH2 profiili tuleks pidada CD -ga patsientidele iseloomulikumaks. Selle hüpoteesi atraktiivsus TH2 ja TH3 profiilide rolli kohta on ka see, et tsütokiinide kasutamine võib muuta immuunvastust ühes või teises suunas ja viia remissioonini koos tsütokiini tasakaalu taastamisega. Seda saab kinnitada eelkõige IL10 kasutamisega. Edasised uuringud peaksid näitama, kas tsütokiini vastus on sekundaarne nähtus vastuseks stimulatsioonile või vastupidi, vastavate tsütokiinide ekspressioon määrab organismi reaktsioonivõime koos järgnevate kliiniliste ilmingute kujunemisega. Laste IBD tsütokiinide taseme uuringut ei ole veel läbi viidud. See töö on esimene osa teaduslikust uuringust, mis on pühendatud laste IBD tsütokiinide seisundi uurimisele. Selle töö eesmärk oli uurida makrofaagide humoraalset aktiivsust, määrates NUC ja CD -ga laste tasemed (IL1a, IL8) veres, samuti nende dünaamikat ravi ajal. Aastatel 2000–2002 uuriti Venemaa laste kliinilise haigla gastroenteroloogia osakonnas 34 NUC -ga last ja 19 CD -ga last vanuses 4–16 aastat. Diagnoos kinnitati anamnestiliselt, endoskoopiliselt ja morfoloogiliselt. Põletikku soodustavate tsütokiinide IL1a, IL8 taseme uurimine viidi läbi ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) meetodil. IL1a, IL8 kontsentratsiooni määramiseks kasutasime OOO Cytokin (Peterburi, Venemaa) toodetud katsesüsteeme. Analüüs viidi läbi kõrge puhtusastmega biopreparaatide uurimisinstituudi riikliku teaduskeskuse immunofarmakoloogia laboris (labori juhataja, MD, prof AS Simbirtsev). Uuringu käigus saadud tulemused näitasid IL1a, IL8 taseme olulist tõusu ägenemise perioodil, NUC -ga lastel rohkem kui CD -ga lastel. Ilma ägenemiseta väheneb põletikueelsete tsütokiinide tase, kuid ei jõua normini. UC korral tõusis IL-1a, IL-8 tase ägenemise perioodil 76,2% ja 90% lastest ning remissiooni perioodil-vastavalt 69,2% ja 92,3%. CD korral suureneb IL-1a, IL-8 tase ägenemise perioodil 73,3% ja 86,6% lastest ning remissiooni perioodil-vastavalt 50% ja 75%.

Sõltuvalt haiguse tõsidusest said lapsed ravi aminosalitsülaatide või glükokortikoididega. Ravi iseloom mõjutas oluliselt tsütokiini taseme dünaamikat. Ravi ajal aminosalitsülaatidega olid põletikueelsete tsütokiinide tasemed NUC ja CD -ga laste rühmas oluliselt kõrgemad kui kontrollrühmas. Samal ajal täheldati kõrgemat määra UC -ga laste rühmas. NUC korral on aminosalitsülaatravi taustal IL1a, IL8 suurenenud vastavalt 82,4% ja 100% lastest, samas kui glükokortikoidravi ajal 60% lastest mõlema tsütokiini puhul. CD korral suureneb IL1a, IL8 kõigi laste ravi ajal aminosalitsülaatidega ja glükokortikoidravi ajal vastavalt 55,5% ja 77,7% lastest. Seega näitavad selle uuringu tulemused enamiku UC ja CD -ga laste immuunsüsteemi makrofaagide lüli olulist osalemist patogeneetilises protsessis. Selles uuringus saadud andmed ei erine põhimõtteliselt täiskasvanud patsientide uurimisel saadud andmetest. Erinevused IL1a ja IL8 tasemes UC ja CD-ga patsientidel on kvantitatiivsed, kuid mitte kvalitatiivsed, mis viitab nende muutuste mittespetsiifilisele iseloomule kroonilise põletikulise protsessi käigus. Seetõttu pole neil näitajatel diagnostilist väärtust. IL1a ja IL8 taseme dünaamilise uuringu tulemused kinnitavad glükokortikoidravimite ravi suuremat efektiivsust võrreldes aminosalitsüülraviga. Esitatud andmed on IBT -ga laste tsütokiini staatuse uuringu esimese etapi tulemus. Probleemi on vaja täiendavalt uurida, võttes arvesse teiste põletikuvastaste ja põletikuvastaste tsütokiinide näitajaid.

Lämmastikoksiidi ja tsütokiinide roll ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkimisel.

Seda probleemi uurivad T. A. Šumatova, V. B. Šumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya: Vladivostoki Riikliku Meditsiiniülikooli anestesioloogia ja reanimatoloogia osakond. Äge kopsukahjustuse sündroom (täiskasvanute respiratoorse distressi sündroom, ARDS) on üks raskemaid ägeda hingamispuudulikkuse vorme, mis esineb raske trauma, sepsise, peritoniidi, pankreatiidi, rohke verekaotuse, aspiratsiooni, pärast ulatuslikke kirurgilisi sekkumisi ja 50 60% juhtudest on surmavad. ARDS -i patogeneesi, sündroomi varajase diagnoosimise ja prognoosi kriteeriumide väljatöötamise kohta on vähe andmeid, pigem on need vastuolulised, mis ei võimalda välja töötada ühtset diagnostilist ja terapeutilist kontseptsiooni. Leiti, et ARDS põhineb kopsu kapillaaride ja alveolaarse epiteeli endoteeli kahjustusel, vere reoloogiliste omaduste rikkumisel, mis põhjustab interstitsiaalse ja alveolaarse koe turset, põletikku, atelektaasi, pulmonaalset hüpertensiooni. Viimaste aastate kirjanduses on piisavalt teavet rakkude ja kudede ainevahetuse universaalse regulaatori - lämmastikoksiidi kohta. Huvi lämmastikoksiidi (NO) vastu tuleneb eelkõige asjaolust, et see osaleb paljude funktsioonide reguleerimises, sealhulgas veresoonte toon, südame kontraktiilsus, trombotsüütide agregatsioon, neurotransmissioon, ATP ja valkude süntees ning immuunsüsteem. Lisaks, olenevalt molekulaarse sihtmärgi valikust ja koostoime omadustest, on NO -l ka kahjulik mõju. Arvatakse, et rakkude aktiveerimise käivitav mehhanism on tasakaalustamata tsütokineemia. Tsütokiinid on lahustuvad peptiidid, mis toimivad immuunsüsteemi vahendajatena ja pakuvad rakkude koostööd, positiivset ja negatiivset immunoregulatsiooni. Püüdsime süstematiseerida kirjanduses saadaolevat teavet NO ja tsütokiinide rolli kohta ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkimisel. NO on vees ja rasvlahustuv gaas. Selle molekul on ebastabiilne vaba radikaal, hajub kergesti kudedesse, imendub ja hävib nii kiiresti, et see võib mõjutada ainult lähikeskkonna rakke. NO molekulil on kõik klassikalistele sõnumitoojatele omased omadused: see toodetakse kiiresti, toimib väga madalates kontsentratsioonides, pärast välissignaali lakkamist muutub see kiiresti teisteks ühenditeks, oksüdeerudes stabiilseteks anorgaanilisteks lämmastikoksiidideks: nitritiks ja nitraadiks. NO eluiga koes on erinevate allikate kohaselt 5 kuni 30 sekundit. NO peamised molekulaarsed sihtmärgid on rauda sisaldavad ensüümid ja valgud: lahustuv guanülaattsüklaas, nitrooksiidi süntaas (NOS), hemoglobiin, mitokondriaalsed ensüümid, Krebsi tsükli ensüümid, valkude ja DNA süntees. NO süntees organismis toimub aminohappe L-arginiini lämmastikku sisaldava osa ensümaatiliste muundamiste kaudu spetsiifilise ensüümi NOS mõjul ja seda vahendab kaltsiumioonide koostoime kalmoduliiniga. Ensüüm inaktiveeritakse madalatel kontsentratsioonidel ja on maksimaalselt aktiivne 1 μM vaba kaltsiumi korral. On tuvastatud kaks NOS isovormi: konstitutiivne (cNOS) ja indutseeritud (iNOS), mis on erinevate geenide saadused. Kaltsium-kalmoduliinist sõltuv cNOS on rakus pidevalt olemas ja soodustab väikeste NO-koguste vabanemist vastuseks retseptoritele ja füüsilisele stimulatsioonile. Selle isovormi mõjul tekkinud NO toimib paljude füsioloogiliste reaktsioonide kandjana. Kaltsium-kalmoduliinist sõltumatu iNOS moodustub erinevates rakutüüpides vastuseks põletikueelsetele tsütokiinidele, endotoksiinidele ja oksüdeerijatele. Seda NOS -isovormi transkribeerivad spetsiifilised geenid kromosoomis 17 ja see soodustab suures koguses NO sünteesi. Ensüüm liigitatakse ka kolme tüüpi: NOS-I (neuronaalne), NOS-II (makrofaag), NOS-III (endoteel). Ensüüme, mis sünteesivad NO -d, leidub erinevates kopsurakkudes: bronhide epiteelirakkudes, alveolotsüütides, alveolaarsetes makrofaagides, nuumrakkudes, bronhiaalarterite ja -veenide endoteelirakkudes, bronhide ja veresoonte siledates müotsüütides, mitte-adrenergilistes mittekolinergilistes neuronites. Inimeste ja imetajate bronhide ja alveoolide epiteelirakkude konstitutiivne võime eritada NO on kinnitatud paljudes uuringutes. On kindlaks tehtud, et inimese hingamisteede ülemised osad ja alumised osad on seotud NO moodustumisega. Trahheostoomiaga patsientidel läbi viidud uuringud on näidanud, et trahheostoomia kaudu väljahingatavas õhus on gaasikogus oluliselt väiksem kui nina- ja suuõõnes. Endogeense NO süntees mehaanilist ventilatsiooni põdevatel patsientidel kannatab märkimisväärselt. Uuringud kinnitavad, et NO vabanemine toimub bronhide laienemise ajal ja seda kontrollib vaguse närvisüsteem. On saadud andmeid, et NO moodustumine inimese hingamisteede epiteelis suureneb hingamisteede põletikuliste haiguste korral. Gaasi süntees suureneb tänu indutseeritud NOS -i aktiveerimisele tsütokiinide, aga ka endotoksiinide ja lipopolüsahhariidide mõjul.

Praegu on teada rohkem kui sada tsütokiini, mis on traditsiooniliselt jagatud mitmeks rühmaks.

1. Interleukiinid (IL -1 - IL18) - sekretoorsed reguleerivad valgud, mis pakuvad vahendaja interaktsioone immuunsüsteemis ja selle seost teiste kehasüsteemidega.

2. Interferoonid (IFN -alfa, beeta, gamma) - viirusevastased tsütokiinid, millel on väljendunud immunoregulatoorne toime.

3. Kasvaja nekroosifaktorid (alfa -TNF, beeta) on tsütokiinid, millel on tsütotoksiline ja reguleeriv toime.

4. Kolooniaid stimuleerivad tegurid (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-hematopoeetiliste rakkude kasvu ja diferentseerumise stimulaatorid, reguleerides vereloomet.

5. Kemokiinid (IL-8, IL-16)-leukotsüütide kemoatraktandid.

6. Kasvufaktorid - erinevate kudede kuuluvate rakkude (fibroblastide kasvufaktor, endoteelirakkude kasvufaktor, epidermise kasvufaktor) kasvu ja teisendavate kasvufaktorite (TGF beeta) kasvu, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiivsuse regulaatorid.

Need bioregulatoorsed molekulid määravad põletikulise ja immuunvastuse tüübi ja kestuse, kontrollivad rakkude proliferatsiooni, vereloomet, angiogeneesi, haavade paranemist ja paljusid muid protsesse. Kõik teadlased rõhutavad, et tsütokiinidel puudub antigeenide spetsiifilisus. Katsed kultiveeritud kopsumakrofaagide ja nuumrakkudega on näidanud iNOS-i moodustumist vastuseks gamma-interferoonile, interleukiin-1-le, tuumorinekroosifaktorile ja lipopolüsahhariididele. INOS ja cNOS ekspressiooni põletikuliste tsütokiinide suhtes leiti loomade ja inimeste alveolotsüütides. Epiteelirakkude funktsiooni reguleeriva epidermaalse kasvufaktori lisamine kultuurile vähendas ainult indutseeritud ensüümi aktiivsust. On teada, et sõltuvalt olemusest toimivad tsütokiinid autokriinselt - tootvatele rakkudele endile, parakriinid - teistele sihtrakkudele või endokriinsele - erinevatele rakkudele väljaspool nende tootmise kohta. Samal ajal saavad nad üksteisega suhelda vastavalt agonistlikule või antagonistlikule põhimõttele, muutes sihtrakkude funktsionaalset olekut ja moodustades tsütokiinide võrgustiku. Seega ei ole tsütokiinid isoleeritud peptiidid, vaid terviklik süsteem, mille põhikomponendid on tootjarakud, valk ise on tsütokiin, selle retseptor ja sihtrakk. Leiti, et ägeda kopsukahjustuse arenedes suureneb põletikueelsete tsütokiinide tase: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Nende toime on seotud veresoonte laienemisega, nende läbilaskvuse suurenemisega ja vedeliku kogunemisega kopsukoesse. Lisaks on uuringud näidanud gamma IFN ja alfa -TNF võimet indutseerida adhesioonimolekulide - ICAM -1 - ekspressiooni inimese endoteelirakkudel. Leukotsüütidele, trombotsüütidele ja endoteelirakkudele kleepuvad adhesioonimolekulid moodustavad "veerevaid" neutrofiile ja soodustavad fibriiniosakeste agregatsiooni. Need protsessid aitavad kaasa kapillaaride verevoolu rikkumisele, suurendavad kapillaaride läbilaskvust ja põhjustavad kohalikku koeödeemi. Kapillaarverevoolu aeglustumist soodustab NO aktiveerimine, mis põhjustab arterioolide laienemist. Leukotsüütide edasist migratsiooni põletiku fookusesse kontrollivad spetsiaalsed tsütokiinid - kemokiinid, mida toodavad ja sekreteerivad mitte ainult aktiveeritud makrofaagid, vaid ka endoteelirakud, fibroblastid, siledad müotsüüdid. Nende peamine ülesanne on varustada põletikulist fookust neutrofiilidega ja aktiveerida nende funktsionaalne aktiivsus. Neutrofiilide peamine kemokiin on Il-8. Selle kõige tugevamad indutseerijad on bakteriaalsed lipopolüsahhariidid, IL-1 ja TNFalpha. R. Bahra jt. usun, et neutrofiilide transendoteliaalse migratsiooni iga etappi reguleeritakse TNF alfa kontsentratsiooni stimuleerimisega. Ägeda kopsukahjustuse arenedes aktiveeruvad veresoonte endoteelirakud, bronhide epiteelirakud ja alveolaarsed makrofaagid ning need osalevad faasikoostoimingutes. Selle tulemusena tekib ühelt poolt nende mobiliseerimine ja kaitseomaduste tugevnemine ning teiselt poolt on võimalik kahjustada rakke endid ja ümbritsevaid kudesid. Mitmed uuringud on näidanud, et hapniku osalise redutseerimise produkt superoksiid võib koguneda põletiku fookusesse, mis inaktiveerib NO vasoaktiivse toime. NO ja superoksiidi anioon reageerivad kiiresti, moodustades rakke kahjustava peroksünitriidi. See reaktsioon soodustab NO eemaldamist veresoonte ja bronhide seintelt, samuti alveolotsüütide pinnalt. Huvitavad on uuringud, mis näitavad, et traditsiooniliselt NO-toksilisuse vahendajaks peetaval peroksünitriidil võib olla füsioloogiline toime ja indutseerida veresoonte lõdvestumist läbi NO-vahendatud cGMP suurenemise veresoonte endoteelis. Omakorda on peroksünitrit tugev oksüdeerija, mis on võimeline kahjustama alveolaarset epiteeli ja kopsu pindaktiivset ainet. See põhjustab membraanvalkude ja lipiidide hävitamist, kahjustab endoteeli, suurendab trombotsüütide agregatsiooni ja osaleb endotokseemias. Selle suurenenud moodustumist täheldati ägeda kopsukahjustuse sündroomi korral. Teadlased usuvad, et indutseeritud ensüümi aktiveerimise tulemusena tekkiv NO on mõeldud keha mittespetsiifiliseks kaitseks paljude patogeensete ainete eest, pärsib trombotsüütide agregatsiooni ja parandab kohalikku vereringet. Leiti, et ülemäärane kogus NO pärsib cNOS -i aktiivsust rakkudes koostoime tõttu superoksiidiga ja võib -olla guanülaattsüklaasi desensibiliseerimise tagajärjel, põhjustades cGMP vähenemist rakus ja rakusisese kaltsiumi suurenemist . Brett jt. ja Kooy jt, analüüsides nitrooksidergiliste mehhanismide tähtsust ARDS -i patogeneesis, soovitasid, et sündroomi kujunemisel võib olla võtmeroll iNOS -il, peroksünitritil ja nitrotürosiinil, mis on peroksünitriti valgu mõju peamine toode. Cuthbertson jt. usuvad, et ägeda kopsukahjustuse aluseks on NO ja peroksünitriidi mõju elastaasile ja interleukiin-8-le. Kobayashi jt. registreeris ka iNOS, interleukiin-1, interleukiin-6, interleukiin-8 sisalduse suurenemise bronhoalveolaarses vedelikus ägeda kopsukahjustuse sündroomiga patsientidel. Meldrum jt. näitas põletikuliste tsütokiinide tootmise vähenemist kopsu makrofaagide poolt ARDS -is NO -L -arginiini kohaliku tootmise substraadi mõjul. Leiti, et ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkes mängib olulist rolli veresoonte läbilaskvuse kahjustus, mis on põhjustatud tsütokiinide-TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monoklonaalsete antikehade CD3 lümfotsüütide-toimest veresoonte endoteelirakkudel. kopsud ja immunotsüüdid. Kopsuveresoonte läbilaskvuse kiire ja tugev suurenemine toob kaasa neutrofiilide migratsiooni kopsukoesse ja nende poolt tsütotoksiliste vahendajate vabanemise, mis viib patoloogiliste kopsumuutuste tekkeni. Ägeda kopsukahjustuse tekkimisel suurendab TNF alfa neutrofiilide haardumist veresoonte seinaga, suurendab nende migratsiooni kudedesse, soodustab endoteeliotsüütide struktuurseid ja metaboolseid muutusi, häirib rakumembraanide läbilaskvust, aktiveerib teiste tsütokiinide ja eikosanoidide teket, ja põhjustab kopsu epiteelirakkude apoptoosi ja nekroosi. Saadud andmed näitavad, et LPS-i sisseviimisega indutseeritud makrofaagide apoptoos on suuresti seotud IFN-ga ja seda vähendab IL-4, IL-10, TGF-beeta toime. Kuid Kobayashi jt. saadud andmed näitavad, et IFN gamma võib olla seotud hingamisteede limaskesta epiteeli parandamisega. Hagimoto uuringud sisaldavad teavet selle kohta, et bronhide ja alveoolide epiteelirakud vastuseks TNF alfa või Fas ligandile vabastavad IL-8, IL-12. See protsess on seotud tuumafaktori Carr-B aktiveerimisega Fas ligandi poolt.

Arvatakse, et IL-8 on ägeda kopsukahjustuse patofüsioloogias üks tähtsamaid tsütokiine. Miller jt. bronhi-alveolaarvedeliku uuringus ARDS-iga patsientidel sesi taustal leiti IL-8 taseme märkimisväärne tõus võrreldes kardiogeense kopsutursega patsientidega. On oletatud, et Il-8 esmane allikas on kopsud ja seda kriteeriumi saab kasutada sündroomi diferentsiaaldiagnostikas. Grau jt. usuvad, et kopsu kapillaaride endoteelirakud on ägeda kopsukahjustuse tekkimisel oluline tsütokiinide allikas-IL-6, IL-8. Goodman jt. Tsütokiinide taseme dünaamika uurimisel bronhide-alveolaaride pesemise vedelikus ARDS-iga patsientidel täheldati IL-1beeta, IL-8, monotsüütilise kemotaktilise peptiidi-1, epiteelirakkude neutrofiilse aktivaatori, makrofaagide põletikulise peptiidi -1 olulist suurenemist leiti alfa. Samal ajal usuvad autorid, et IL-1 beeta sisalduse suurenemine võib olla sündroomi ebasoodsa tulemuse marker. Bauer jt. näidati, et ARDS-iga patsientide bronhide-alveolaarvedeliku IL-8 sisalduse kontrolli saab kasutada jälgimiseks, IL-8 taseme langus näitab protsessi ebasoodsat kulgu. Mitmed uuringud sisaldavad ka teavet selle kohta, et kopsude vaskulaarse endoteeli tsütokiini tootmise tase mõjutab ägeda kopsukahjustuse tekkimist ja selle kontrolli saab kliinilises praktikas kasutada varajaseks diagnoosimiseks. Põletikku soodustavate tsütokiinide taseme tõusu võimalikest negatiivsetest tagajärgedest ARDS -iga patsientidel tõendavad Martin jt, Warner jt uuringud. Tsütokiinide ja bakteriaalsete endotoksiinide poolt aktiveeritud alveolaarsed makrofaagid suurendavad NO sünteesi. Samuti suureneb bronhide ja alveolaarsete epiteelirakkude, neutrofiilide, nuumrakkude, endoteelirakkude ja kopsuveresoonte siledate müotsüütide NO tootmise tase, tõenäoliselt tuumafaktori Carr-B aktiveerimise kaudu. Autorid usuvad, et indutseeritud NOS -i aktiveerimise tulemusena tekkiv lämmastikoksiid on mõeldud peamiselt keha mittespetsiifiliseks kaitseks. Makrofaagidest vabanenud NO tungib kiiresti bakteritesse ja seentesse, kus pärsib kolme olulist ensüümirühma: H-elektronide transporti, Krebsi tsüklit ja DNA sünteesi. NO osaleb keha kaitses immuunvastuse viimastel etappidel ja teda peetakse piltlikult immuunsüsteemi "karistavaks mõõgaks". Kuid rakku kogunedes ebapiisavalt suurtes kogustes on NO -l ka kahjulik mõju. Seega ägeda kopsukahjustuse sündroomi tekkimisel käivitavad tsütokiinid ja NO järjestikuse reaktsiooniahela, mis väljendub mikrotsirkulatsiooni halvenemises, kudede hüpoksias, alveolaarses ja interstitsiaalses turses ning kopsude metaboolse funktsiooni kahjustamises. Seetõttu võib väita, et tsütokiinide ja NO toime füsioloogiliste ja patofüsioloogiliste mehhanismide uurimine on paljutõotav uurimisvaldkond ja võimaldab tulevikus mitte ainult laiendada arusaamist ARDS -i patogeneesist, vaid ka kindlaks teha sündroomi diagnostilisi ja prognostilisi markereid, et töötada välja patogeneetiliselt põhineva ravi võimalused, mille eesmärk on vähendada surmamist.

Meetodid tsütokiinide määramiseks.

Ülevaade on pühendatud praegu kasutatavate tsütokiinide uurimise põhimeetoditele. Lühidalt kirjeldatakse meetodite võimalusi ja eesmärki. Esitatakse tsütokiini geenide ekspressiooni analüüsimise erinevate lähenemisviiside eelised ja puudused nukleiinhapete ja valgu tootmise tasemel. (Tsütokiinid ja põletik. 2005. T. 4, nr 1. S. 22-27.)

Tsütokiinid on reguleerivad valgud, mis moodustavad universaalse vahendajate võrgustiku, mis on iseloomulikud nii immuunsüsteemile kui ka teiste elundite ja kudede rakkudele. Kõik rakusündmused toimuvad selle reguleerivate valkude klassi kontrolli all: proliferatsioon, diferentseerumine, apoptoos ja rakkude spetsialiseeritud funktsionaalne aktiivsus. Iga tsütokiini mõju rakkudele iseloomustab pleiotroopia, erinevate vahendajate toimete spekter kattub ja üldiselt sõltub raku lõplik funktsionaalne olek mitmete sünergistlikult toimivate tsütokiinide mõjust. Seega on tsütokiinisüsteem universaalne, polümorfne vahendajate võrgustik, mille eesmärk on kontrollida rakuliste elementide vohamist, diferentseerumist, apoptoosi ja funktsionaalset aktiivsust keha vereloome-, immuun- ja muudes homöostaatilistes süsteemides. Tsütokiinide määramise meetodid on nende intensiivse uurimise käigus 20 aasta jooksul väga kiiresti arenenud ja esindavad tänapäeval tervet teaduslike teadmiste valdkonda. Tsütokinoloogia uurijad seisavad oma töö alguses meetodi valimise küsimuse ees. Ja siin peab teadlane täpselt teadma, millist teavet peab ta püstitatud eesmärgi saavutamiseks hankima. Praegu on välja töötatud sadu erinevaid meetodeid tsütokiinisüsteemi hindamiseks, mis annavad selle süsteemi kohta mitmekesist teavet. Tsütokiinide hindamine erinevates bioloogilistes söötmetes võib põhineda spetsiifilisel bioloogilisel aktiivsusel. Neid saab kvantifitseerida, kasutades erinevaid immuunanalüüsi meetodeid, kasutades polü- ja monoklonaalseid antikehi. Lisaks tsütokiinide sekretoorsete vormide uurimisele on võimalik uurida nende rakusisest sisu ja tootmist kudedes voolutsütomeetria, Western blot analüüsi ja in situ immunohistokeemia abil. Väga olulist teavet on võimalik saada, uurides tsütokiini mRNA ekspressiooni, mRNA stabiilsust, tsütokiini mRNA isovormide olemasolu, looduslikke antisenss -nukleotiidjärjestusi. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda olulist teavet ühe või teise vahendaja geneetiliselt programmeeritud kõrge või madala tootmise kohta. Igal meetodil on oma puudused ja eelised, oma eraldusvõime ja määramise täpsus. Teadlase teadmatus ja nende nüansside vääritimõistmine võib viia ta valede järeldusteni.

Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramine.

Avastamise ajalugu ja tsütokiinide uurimise esimesed sammud olid tihedalt seotud immunokompetentsete rakkude ja rakuliinide kasvatamisega. Seejärel näidati mitmete valku sisaldavate lahustuvate tegurite regulatiivset toimet (bioloogilist aktiivsust) lümfotsüütide proliferatiivsele aktiivsusele, immunoglobuliinide sünteesile ja immuunvastuste kujunemisele in vitro mudelites. Üks esimesi meetodeid vahendajate bioloogilise aktiivsuse määramiseks on inimese lümfotsüütide migratsiooniteguri ja selle pärssimise teguri määramine. Kuna tsütokiinide bioloogilist toimet on uuritud, on nende bioloogilise aktiivsuse hindamiseks tekkinud erinevaid meetodeid. Seega määrati IL-1, hinnates hiire tümotsüütide proliferatsiooni in vitro, IL-2-võime järgi stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust, IL-3-hematopoeetiliste kolooniate kasvu in vitro, IL-4- komitogeenne toime, suurendades Ia-valkude ekspressiooni, indutseerides IgG1 ja IgE teket jne. Nende meetodite loetelu saab jätkata, seda ajakohastatakse pidevalt, kui avastatakse lahustuvate tegurite uusi bioloogilisi aktiivsusi. Nende peamine puudus on mittestandardsed meetodid, nende ühendamise võimatus. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramise meetodite edasiarendamine tõi kaasa suure hulga ühe või teise tsütokiini suhtes tundlike rakuliinide või mitmetundlike liinide loomise. Enamikku neist tsütokiinitundlikest rakkudest võib nüüd leida kaubanduslike rakuliinide loenditest. Näiteks IL-1a ja b testimiseks kasutatakse rakuliini D10S, IL-2 ja IL-15 puhul CTLL-2 rakuliini, IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 rakuliini , IL -13, GM -CSF - rakuliin TF -1, IL -6 - rakuliin B9, IL -7 - rakuliin 2E8, TNFa ja TNFb - rakuliin L929, IFNg - rakuliin WiDr, IL-18-rakuliini liin KG-1. Sellel lähenemisviisil immunoaktiivsete valkude uurimisel koos tuntud eelistega, nagu küpsete ja aktiivsete valkude tegeliku bioloogilise aktiivsuse mõõtmine, kõrge reprodutseeritavus standardtingimustes, on aga oma puudused. Nende hulka kuulub esiteks rakuliinide tundlikkus mitte ühe tsütokiini, vaid mitme seotud tsütokiini suhtes, mille bioloogiline toime kattub. Lisaks ei saa välistada võimalust, et sihtrakud indutseerivad teiste tsütokiinide tootmist, mis võivad testitud parameetrit moonutada (reeglina proliferatsioon, tsütotoksilisus, kemotaksis). Me ei tea veel kõiki tsütokiine ja mitte kõiki nende mõjusid, seetõttu hindame mitte tsütokiini ennast, vaid kogu spetsiifilist bioloogilist aktiivsust. Seega on bioloogilise aktiivsuse hindamine erinevate vahendajate kogutegevusena (spetsiifilisuse puudumine) selle meetodi üheks puuduseks. Lisaks on tsütokiinitundlikke jooni kasutades võimatu tuvastada inaktiveeritud molekule ja nendega seotud valke. See tähendab, et sellised meetodid ei kajasta paljude tsütokiinide tegelikku tootmist. Rakuliinide kasutamise teine ​​oluline puudus on vajadus rakukultuuri laboratooriumi järele. Lisaks on kõik protseduurid rakkude kasvatamiseks, nende inkubeerimiseks uuritavate valkude ja söötmega aeganõudvad. Samuti tuleb märkida, et rakuliinide pikaajaline kasutamine nõuab uuendamist või uuesti sertifitseerimist, kuna kasvatamise tulemusena võivad need muteeruda ja muutuda, mis võib muuta nende tundlikkust vahendajate suhtes ja vähendada nende täpsust. bioloogilise aktiivsuse määramine. See meetod sobib aga ideaalselt rekombinantsete vahendajate spetsiifilise bioloogilise aktiivsuse testimiseks.

Tsütokiinide kvantifitseerimine antikehade abil.

Immunokompetentsete ja muud tüüpi rakkude poolt toodetud tsütokiinid vabastatakse rakuvälisesse ruumi parakriinsete ja autokriinsete signaalide interaktsioonide jaoks. Nende valkude kontsentratsiooni järgi vereseerumis või konditsioneeritud keskkonnas saab hinnata patoloogilise protsessi olemust ja teatud rakufunktsioonide liigset või puudumist patsiendil. Tsütokiinide määramise meetodid spetsiifiliste antikehade abil on tänapäeval nende valkude tuvastamiseks kõige levinumad süsteemid. Need meetodid on läbinud terve rea muudatusi, kasutades erinevaid märgistusi (radioisotoop, fluorestseeruv, elektrokeemiluminestsents, ensüüm jne). Kui radioisotoopide meetoditel on mitmeid puudusi, mis on seotud radioaktiivse märgistuse kasutamisega ja piiratud ajaga märgistatud reagentide kasutamise võimalusega (poolväärtusaeg), siis on ensüümidega seotud immunosorbentmeetodid leidnud laialdast kasutamist. Need põhinevad ensümaatilise reaktsiooni lahustumatute saaduste visualiseerimisel, mis neelavad teadaoleva lainepikkusega valgust koguses, mis on samaväärne analüüdi kontsentratsiooniga. Mõõdetavate ainete sidumiseks kasutatakse tahkele polümeerialusele kantud antikehi ja visualiseerimiseks ensüümidega, tavaliselt leeliselise fosfataasi või mädarõika peroksidaasiga, konjugeeritud antikehi. Meetodi eelised on ilmsed: määramise kõrge täpsus reagentide ja protseduuride standardsetel säilitustingimustel, kvantitatiivne analüüs ja reprodutseeritavus. Puuduste hulka kuulub piiratud hulk määratud kontsentratsioone, mille tulemusel loetakse kõik teatud piirmäära ületavad kontsentratsioonid sellega võrdseks. Tuleb märkida, et meetodi lõpuleviimiseks kuluv aeg varieerub sõltuvalt tootja soovitustest. Kuid igal juhul räägime mitmest tunnist, mis kulub inkubeerimiseks ja reaktiivi pesemiseks. Lisaks määratakse kindlaks tsütokiinide varjatud ja seotud vormid, mille kontsentratsioon võib oluliselt ületada vabu vorme, mis vastutavad peamiselt vahendaja bioloogilise aktiivsuse eest. Seetõttu on soovitav kasutada seda meetodit koos vahendaja bioloogilise aktiivsuse hindamise meetoditega. Veel üks laialdast rakendust leidnud immuunanalüüsi meetodi muudatus on elektrokeemiluminestsentsmeetod (ECL) valkude määramiseks ruteeniumi ja biotiiniga märgistatud antikehadega. Sellel meetodil on radioisotoopide ja ensüümide immuunanalüüsi ees järgmised eelised: rakendamise lihtsus, lühike aeg meetodi lõpuleviimiseks, pesemisprotseduuride puudumine, väike proovimaht, suur hulk kindlaksmääratud tsütokiinide kontsentratsioone seerumis ja konditsioneeritud keskkonnas, kõrge tundlikkus meetod ja selle reprodutseeritavus. Vaatlusalune meetod on vastuvõetav kasutamiseks nii teadusuuringutes kui ka kliinilistes uuringutes. Järgmine meetod tsütokiinide hindamiseks bioloogilises söötmes on välja töötatud voolu fluorimeetria tehnoloogial. See võimaldab teil proovis samaaegselt hinnata kuni sadu valke. Praegu on loodud kaubanduslikud komplektid kuni 17 tsütokiini määramiseks. Kuid selle meetodi eelised määravad ka selle puudused. Esiteks on see töömahukas mitme valgu määramiseks optimaalsete tingimuste valimisel ja teiseks on tsütokiinide tootmine kaskaadse iseloomuga, mille tootmistipud on erinevatel aegadel. Seetõttu ei ole suure hulga valkude korraga määramine alati informatiivne. Üldine nõue immuunanalüüsi meetoditele, kasutades nn. "võileib" on antikehade paari hoolikas valik, mis võimaldab määrata analüüsitava valgu vaba või seotud vormi, mis seab sellele meetodile piiranguid ja mida tuleb saadud andmete tõlgendamisel alati arvesse võtta. Need meetodid määravad tsütokiinide kogutoodangu erinevate rakkude poolt, samal ajal saab immuunkompetentsete rakkude tsütokiinide antigeenispetsiifilise tootmise üle otsustada ainult hüpoteetiliselt. Praegu on välja töötatud ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) süsteem, mis kõrvaldab need puudused suuresti. Meetod võimaldab tsütokiinide tootmist poolkvantitatiivselt hinnata üksikute rakkude tasemel. Selle meetodi kõrge eraldusvõime võimaldab hinnata antigeeniga stimuleeritud tsütokiini tootmist, mis on spetsiifilise immuunvastuse hindamiseks väga oluline. Järgmine, laialdaselt teaduslikel eesmärkidel kasutatav meetod on tsütokiinide rakusisene määramine voolutsütomeetria abil. Selle eelised on ilmsed. Me võime fenotüüpiliselt iseloomustada tsütokiine tootvate rakkude populatsiooni ja / või määrata üksikute rakkude poolt toodetud tsütokiinide spektri, võimalusega seda toodangut suhteliselt kvantitatiivselt iseloomustada. Samal ajal on kirjeldatud meetod üsna keeruline ja nõuab kalleid seadmeid. Järgmine meetodite seeria, mida kasutatakse peamiselt teaduslikel eesmärkidel, on immunohistokeemilised meetodid, mis kasutavad märgistatud monoklonaalseid antikehi. Eelised on ilmsed - tsütokiini produktsiooni määramine otse kudedes (in situ), kus toimuvad mitmesugused immunoloogilised reaktsioonid. Vaatlusalused meetodid on aga väga töömahukad ega anna täpseid kvantitatiivseid andmeid.

Tsütokiinide määramine ensüümi immuunanalüüsiga.

Vector-Best CJSC T.G. juhtimisel Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavišnikov töötab aktiivselt tsütokiinide määramise nimel. Tsütokiinid on polüpeptiidide vahendajate rühm, sageli glükosüülitud, molekulmassiga 8 kuni 80 kDa. Tsütokiinid osalevad keha kaitsereaktsioonide ja homöostaasi moodustamises ja reguleerimises. Nad osalevad humoraalse ja rakulise immuunvastuse kõigis osades, sealhulgas immunokompetentsete eellasrakkude diferentseerumises, antigeeni esitamises, rakkude aktiveerimises ja proliferatsioonis, adhesioonimolekulide ekspressioonis ja ägeda faasi reaktsioonis. Mõned neist on võimelised avaldama mitmesuguseid bioloogilisi mõjusid erinevatele sihtrakkudele. Tsütokiinide toime rakkudele toimub järgmistel viisidel: autokriinne - rakku, mis seda tsütokiini sünteesib ja sekreteerib; parakriin - rakkudele, mis asuvad tootjaraku lähedal, näiteks põletiku fookuses või lümfoidorganis; endokriinne kaugjuhtimine - mis tahes elundite ja kudede rakkudele pärast tsütokiini sisenemist vereringesse. Tsütokiinide moodustumine ja vabanemine on tavaliselt lühiajaline ja rangelt reguleeritud. Tsütokiinid mõjutavad rakku, seondudes tsütoplasmaatilise membraani spetsiifiliste retseptoritega, põhjustades seeläbi reaktsioonide kaskaadi, mis viib paljude nende poolt reguleeritud geenide esilekutsumise, võimendamise või pärssimiseni. Tsütokiine iseloomustab funktsioneerimise keeruline võrgustik, mille puhul ühe tootmine mõjutab paljude teiste aktiivsuse kujunemist või avaldumist. Tsütokiinid on kohalikud vahendajad, seetõttu on soovitatav mõõta nende taset vastavates kudedes pärast koeproteiinide ekstraheerimist vastavate elundite biopsiatest või looduslikes vedelikes: uriin, pisaravedelik, igemetasku vedelik, bronhoalveolaarne pesemine, tupe sekretsioon, ejakulaat , peseb õõnsustest, seljaaju- või sünoviaalvedelikest jne. Lisateavet keha immuunsüsteemi seisundi kohta saab, uurides vererakkude võimet toota tsütokiine in vitro. Plasma tsütokiini tase peegeldab immuunsüsteemi hetkeseisu ja kaitsereaktsioonide arengut in vivo. Tsütokiinide spontaanne tootmine perifeerse vere mononukleaarsete rakkude kultuuri abil võimaldab hinnata vastavate rakkude seisundit. Tsütokiinide suurenenud spontaanne tootmine näitab, et antigeen aktiveerib rakke juba in vivo. Tsütokiinide indutseeritud tootmine võimaldab hinnata vastavate rakkude potentsiaalset võimet reageerida antigeensele stimulatsioonile. Näiteks tsütokiinide vähenenud induktsioon in vitro võib olla üks immuunpuudulikkuse seisundi tunnuseid. Seetõttu on mõlemad võimalused tsütokiinide taseme uurimiseks nii tsirkuleerivas veres kui ka nende rakukultuuride tootmisel olulised kogu organismi immunoreaktiivsuse ja immuunsüsteemi üksikute lülide funktsiooni iseloomustamise seisukohast. Kuni viimase ajani tegelesid Venemaal mõned teadlaste rühmad tsütokiinide uurimisega, kuna bioloogilised uurimismeetodid on väga aeganõudvad ja imporditud immunokeemilised komplektid on väga kallid. Olemasolevate kodumaiste ensüümidega seotud immunosorbentide komplektide tulekuga näitavad praktiseerivad arstid üha suuremat huvi tsütokiini profiili uurimise vastu. Praegu on tsütokiinide taseme hindamise diagnostiline tähtsus tõdeda, et konkreetse haigusega patsiendil on nende kontsentratsiooni suurenemine või vähenemine. Veelgi enam, haiguse tõsiduse hindamiseks ja haiguse kulgu ennustamiseks on soovitatav määrata nii põletikuvastaste kui ka põletikuvastaste tsütokiinide kontsentratsioon patoloogia arengu dünaamikas. Näiteks määratakse tsütokiinide sisaldus perifeerses veres ägenemise aja järgi, peegeldab patoloogilise protsessi dünaamikat peptilise haavandtõve ja teiste seedetrakti haiguste korral. Ägenemise varases staadiumis domineerib interleukiin-1-beeta (IL-1-beeta), interleukiin-8 (IL-8) sisalduse suurenemine, seejärel interleukiin-6 (IL-6), gamma-interferooni (gamma) kontsentratsioon -INF), kasvaja nekroosifaktor suurendab alfa (alfa -TNF). Interleukiin-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF kontsentratsioon saavutas maksimumi haiguse kõrghetkel, samal ajal kui ägeda faasi markerite sisaldus sellel perioodil lähenes normaalsetele väärtustele. Ägenemise tipul ületas alfa-TNF tase märkimisväärselt interleukiin-4 (IL-4) sisaldust nii vereseerumis kui ka otseselt haavandite tsooni kahjustatud koes, pärast mida hakkas see järk-järgult vähenemine. Ägeda faasi nähtuste taandumisel ja parandusprotsesside intensiivistumisel suurenes IL-4 kontsentratsioon. Muutusi tsütokiini profiilis saab kasutada keemiaravi efektiivsuse ja teostatavuse hindamiseks. Tsütokiinravi läbiviimisel, näiteks ravi ajal alfa-interferooniga (alfa-IFN), on vaja kontrollida nii selle sisaldust vereringes kui ka alfa-IFN-i vastaste antikehade tootmist. On teada, et suure hulga nende antikehade tootmisel ei lakka interferoonravi mitte ainult tõhusalt, vaid võib põhjustada ka autoimmuunhaigusi. Viimasel ajal on välja töötatud ja praktikasse võetud uusi ravimeid, mis ühel või teisel viisil muudavad organismi tsütokiini staatust. Näiteks reumatoidartriidi raviks pakutakse välja alfa-TNF-i antikehadel põhinev ravim, mille eesmärk on eemaldada sidekoe hävitamises osalev alfa-TNF. Kuid nii meie andmete kui ka kirjanduse kohaselt ei ole kõigil kroonilise reumatoidartriidiga patsientidel TNF-alfa tase suurenenud, seetõttu võib selle patsientide rühma puhul TNF-alfa taseme langus veelgi süvendada tasakaalustamatust. immuunsüsteemi. Seega eeldab õige tsütokiinravi ravi ajal organismi tsütokiinide seisundi kontrolli. Põletikku soodustavate tsütokiinide kaitseroll avaldub lokaalselt, põletiku fookuses, kuid nende süsteemne tootmine ei põhjusta nakkusvastase immuunsuse teket ega takista bakteritoksilise šoki teket, mis on mädaste-septiliste tüsistustega kirurgiliste patsientide varajane suremus. Kirurgiliste infektsioonide patogeneesi aluseks on tsütokiini kaskaadi käivitamine, mis hõlmab ühelt poolt põletikuvastaseid ja teiselt poolt põletikuvastaseid tsütokiine. Nende kahe vastandliku rühma vaheline tasakaal määrab suuresti kursuse olemuse ja mädaste-septiliste haiguste tulemuse. Siiski ei peegelda nende rühmade ühe tsütokiini (näiteks alfa-TNF või IL-4) kontsentratsiooni määramine veres piisavalt kogu tsütokiini tasakaalu. Seetõttu on vaja mitme vahendaja (vähemalt 2-3 vastandunud alarühma) taseme üheastmelist hindamist. Hetkel on CJSC "Vector-Best" välja töötanud ja seeriaviisiliselt toodetud reaktiivikomplektid kvantitatiivseks määramiseks: kasvaja nekroosifaktor-alfa (tundlikkus-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gamma -interferoon (tundlikkus - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukiin -4 (tundlikkus - 2 pg / ml, 0–400 pg / ml); interleukiin-8 (tundlikkus-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interleukiin-1 retseptori antagonist (IL-1RA) (tundlikkus-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa -interferoon (tundlikkus - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimmuunsed antikehad alfa-interferoonile (tundlikkus-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Kõik komplektid on ette nähtud nende tsütokiinide kontsentratsiooni määramiseks inimese bioloogilistes vedelikes, kultuuri supernatantides, uurides inimese rakukultuuride võimet toota tsütokiine in vitro. Analüüsi põhimõte on tahkefaasilise kolmeastmelise (inkubatsiooniaeg-4 h) või kaheastmelise (inkubatsiooniaeg-3,5 h) ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi "võileiva" variant plaatidel. Analüüs nõuab 100 µl bioloogilist vedelikku või kultuuri supernatanti augu kohta. Tulemuste arvestamine - spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 450 nm. Kõigis komplektides on kromogeeniks tetrametüülbensidiin. Meie komplektide säilivusaega on pikendatud 18 kuuni alates väljaandmise kuupäevast ja 1 kuuni pärast kasutamise algust. Kirjandusandmete analüüs näitas, et tsütokiinide sisaldus tervete inimeste vereplasmas sõltub nii nende määramiseks kasutatud komplektidest kui ka nende inimeste elupiirkonnast. Seetõttu analüüsisime meie piirkonna elanike normaalsete tsütokiinide kontsentratsioonide väärtuste väljaselgitamiseks praktiliselt tervete veredoonorite, erinevate sotsiaalsete rühmade esindajate vanuses 18 kuni 60 aastat, juhuslikke plasmaproove (80–400 proovi). raske somaatilise patoloogia ilmingud ja HBsAg antikehade puudumine HIV, B- ja C -hepatiidi viiruste vastu.

Kasvaja nekroosifaktor-alfa.

TNF-alfa on pleiotroopne põletikuvastane tsütokiin, mis koosneb kahest piklikust b-ahelast molekulmassiga 17 kDa ning täidab immuunvastuse ja põletiku reguleerivaid ja efektorfunktsioone. Peamised alfa-TNF tootjad on monotsüüdid ja makrofaagid. Seda tsütokiini sekreteerivad ka vere lümfotsüüdid ja granulotsüüdid, looduslikud tapjarakud ja T-lümfotsüütilised rakuliinid. Peamised alfa-TNF indutseerijad on viirused, mikroorganismid ja nende ainevahetusproduktid, sealhulgas bakteriaalne lipopolüsahhariid. Lisaks võivad mõned tsütokiinid, nagu IL-1, IL-2, granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor, alfa ja beeta-INF, samuti mängida indutseerijate rolli. Alfa-TNF bioloogilise aktiivsuse põhisuunad: avaldab selektiivset tsütotoksilisust mõne kasvajaraku suhtes; aktiveerib granulotsüüte, makrofaage, endoteelirakke, hepatotsüüte (ägeda faasi valkude tootmine), osteoklaste ja kondrotsüüte (luu- ja kõhrekoe resorptsioon), teiste põletikuvastaste tsütokiinide sünteesi; stimuleerib proliferatsiooni ja diferentseerumist: neutrofiilid, fibroblastid, endoteelirakud (angiogenees), vereloomerakud, T- ja B-lümfotsüüdid; suurendab neutrofiilide voolu luuüdist verre; omab kasvaja- ja viirusevastast toimet in vivo ja in vitro; osaleb mitte ainult kaitsereaktsioonides, vaid ka põletikuga kaasnevate hävitamise ja parandamise protsessides; on üks kudede hävitamise vahendajatest, mis on levinud pikaajalise kroonilise põletiku korral.

Riis. 1. Alfa-TNF taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Traumajärgse seisundi ajal täheldatakse vereseerumis alfa-TNF-i kõrgenenud taset, millega kaasnevad kopsufunktsiooni häired, raseduse normaalse kulgemise rikkumine, vähk, bronhiaalastma. Alfa-TNF tase on viirusliku hepatiit C kroonilise vormi ägenemise ajal 5-10 korda kõrgem normist. Seedetrakti haiguste ägenemise perioodil ületab alfa-TNF kontsentratsioon seerumis normi keskmiselt 10 korda ja mõnel patsiendil 75–80 korda. Kõrgeid alfa -TNF kontsentratsioone leitakse tserebrospinaalvedelikus hulgiskleroosi ja tserebrospinaalmeningiidiga patsientidel ning reumatoidartriidiga patsientidel - sünoviaalvedelikus. See viitab alfa -TNF -i kaasamisele paljude autoimmuunhaiguste patogeneesis. Alfa -TNF avastamise sagedus vereseerumis isegi raske põletiku korral ei ületa 50%, indutseeritud ja spontaanse tootmise korral - kuni 100%. Alfa-TNF kontsentratsioonide vahemik oli 0-6 pg / ml, keskmine-1,5 pg / ml (joonis 1).

Gamma -interferoon.

Riis. 2. IFN-gamma taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Interleukiin-4

IL-4 on glükoproteiin molekulmassiga 18–20 kDa, looduslik põletiku inhibiitor. Koos IFN-gammaga on IL-4 võtmetähtsusega tsütokiin, mida toodavad T-rakud (peamiselt TH-2 lümfotsüüdid). See toetab TH-1 / TH-2 tasakaalu. IL-4 bioloogilise aktiivsuse põhisuunad: suurendab eosinofiilia, nuumrakkude kuhjumist, IgG4 sekretsiooni, TH-2-vahendatud humoraalset immuunvastust; omab kohalikku kasvajavastast toimet, stimuleerides tsütotoksiliste T-lümfotsüütide populatsiooni ja kasvaja infiltratsiooni eosinofiilidega; pärsib põletikuliste tsütokiinide (alfa-TNF, IL-1, IL-8) ja prostaglandiinide vabanemist aktiveeritud monotsüütidest, tsütokiinide tootmist TH-1-lümfotsüütide poolt (IL-2, gamma-INF jne).

Riis. 3. IL-4 taseme jaotus plasmas

terved doonorid.

Suurenenud IL-4 taset nii seerumis kui ka stimuleeritud lümfotsüütides võib täheldada allergiliste haiguste korral (eriti ägenemise ajal), nagu bronhiaalastma, allergiline nohu, heinapalavik, atoopiline dermatiit, seedetrakti haigused. Samuti suureneb IL-4 tase märgatavalt kroonilise C-hepatiidiga (CHC) patsientidel. KHK ägenemise perioodidel suureneb selle kogus võrreldes normiga peaaegu 3 korda ja KHK remissiooni ajal väheneb IL-4 tase, eriti rekombinantse IL-2 ravi taustal. IL-4 kontsentratsioonide vahemik oli 0–162 pg / ml, keskmine 6,9 ​​pg / ml, normaalne vahemik 0–20 pg / ml (joonis 3).

Interleukiin-8

IL-8 kuulub kemokiinide hulka, see on valk, mille molekulmass on 8 kDa. IL-8 toodavad mononukleaarsed fagotsüüdid, polümorfonukleaarsed leukotsüüdid, endoteelirakud ja muud tüüpi rakud vastuseks erinevatele stiimulitele, sealhulgas bakteritele ja viirustele ning nende ainevahetusproduktidele, sealhulgas põletikku soodustavatele tsütokiinidele (näiteks IL-1, TNF alfa). ). Interleukiin-8 peamine roll on leukotsüütide kemotaksise suurendamine. See mängib olulist rolli nii ägeda kui ka kroonilise põletiku korral. Suurenenud IL-8 taset täheldatakse patsientidel, kellel on bakteriaalsed infektsioonid, kroonilised kopsuhaigused ja seedetrakti haigused. Sepsisega patsientidel suureneb IL-8 plasmatase ja kõrge kontsentratsioon on seotud suremuse suurenemisega. IL-8 sisalduse mõõtmise tulemusi saab kasutada ravikuuri jälgimiseks ja haiguse tulemuse ennustamiseks. Seega leiti kõikidel sarvkesta haavandite soodsa kuluga patsientidel pisaravedelikus suurenenud IL-8 sisaldus. Kõigil sarvkesta haavandi keerulise kuluga patsientidel oli IL-8 kontsentratsioon 8 korda suurem kui soodsa kuluga patsientidel. Seega võib selle haiguse kulgu prognoosiva kriteeriumina kasutada põletikuvastaste tsütokiinide (eriti IL-8) sisaldust pisaravedelikus sarvkesta haavandite korral.

Riis. 4. IL-8 taseme jaotus aastal

tervete doonorite plasma (Novosibirsk).

Meie ja avaldatud andmete kohaselt tuvastatakse tervetel inimestel IL-8 vereseerumis äärmiselt harva; spontaanset IL-8 tootmist vere mononukleaarsete rakkude poolt täheldatakse 62% ja indutseeritud tootmist 100% tervetel doonoritel. IL-8 kontsentratsioonide vahemik oli 0–34 pg / ml, keskmine 2 pg / ml, normaalne vahemik 0–10 pg / ml (joonis 4).

Riis. 5. IL-8 taseme jaotus plasmas

terved doonorid (Rubtsovsk).

Interleukiin-1 retseptori antagonist.

IL-1RA on tsütokiin ja oligopeptiid, mille molekulmass on 18–22 kDa. IL-1RA on IL-1 endogeenne inhibiitor, mida toodavad makrofaagid, monotsüüdid, neutrofiilid, fibroblastid ja epiteelirakud. IL-1RA inhibeerib interleukiinide IL-1 alfa ja IL-1-beeta bioloogilist aktiivsust, konkureerides nendega raku retseptoriga seondumise pärast.

Riis. 6. IL-1RA taseme jaotus

tervete doonorite plasmas

IL-1RA tootmist stimuleerivad paljud tsütokiinid, viiruslikud saadused ja ägeda faasi valgud. IL-1RA-d saab aktiivselt ekspresseerida põletikulistes fookustes mitmesuguste krooniliste haiguste korral: reumatoidartriit ja juveniilne krooniline artriit, süsteemne erütematoosluupus, isheemilised ajukahjustused, soolepõletikud, bronhiaalastma, püelonefriit, psoriaas jt. Sepsise korral täheldatakse IL-1RA suurimat tõusu-mõnel juhul kuni 55 ng / ml ja leiti, et IL-1RA suurenenud kontsentratsioon korreleerub soodsa prognoosiga. Väga rasvunud naistel täheldatakse IL-1RA kõrget taset ja see tase väheneb märgatavalt 6 kuu jooksul pärast rasvaimu. IL-1RA kontsentratsioonide vahemik oli 0–3070 pg / ml, keskmine 316 pg / ml. Tavaline vahemik on 50–1000 pg / ml (joonis 6).

Alfa -interferoon.

Alfa-IFN on monomeerne glükosüülimata valk molekulmassiga 18 kDa, mida sünteesivad peamiselt leukotsüüdid (B-lümfotsüüdid, monotsüüdid). Seda tsütokiini võivad toota praktiliselt kõik rakutüübid vastuseks sobivale ergutusele ja rakusisesed viirusnakkused võivad olla tugevad IFN-alfa sünteesi stimulaatorid. Alfa-INF indutseerijate hulka kuuluvad: viirused ja nende tooted, mille hulgas on juhtival kohal viiruse replikatsiooni käigus tekkinud kaheahelalised RNA-d, samuti bakterid, mükoplasmad ja algloomad, tsütokiinid ja kasvufaktorid (näiteks IL-1, IL) -2, alfa -FNO, kolooniaid stimuleerivad tegurid jne). Keha mittespetsiifilise antibakteriaalse immuunvastuse esialgne kaitsereaktsioon hõlmab alfa- ja beeta -IFN indutseerimist. Sel juhul toodavad seda bakteritesse tunginud antigeeni esitavad rakud (makrofaagid). Interferoonid (sealhulgas alfa-IFN) mängivad olulist rolli viirusevastase immuunvastuse mittespetsiifilises ühenduses. Nad suurendavad viirusevastast resistentsust, indutseerides rakkudes ensüümide sünteesi, mis pärsivad viiruste nukleiinhapete ja valkude moodustumist. Lisaks on neil immunomoduleeriv toime, mis suurendavad peamise histokompatibilisuse kompleksi antigeenide ekspressiooni rakkudes. Alfa-IFN sisalduse muutus tuvastati viirusliku etioloogiaga hepatiidi ja maksatsirroosi korral. Viirusnakkuste ägenemise hetkel suureneb enamikul patsientidest selle tsütokiini kontsentratsioon märkimisväärselt ja taastumisperioodil langeb see normaalsele tasemele. On näidatud seost alfa-INF seerumi taseme ning gripiinfektsiooni raskusastme ja kestuse vahel.

Riis. 7. Alfa-IFN taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Enamiku autoimmuunhaiguste, nagu polüartriit, reumatoidartriit, spondüloos, psoriaatiline artriit, reumatoidartriit ja skleroderma, süsteemne erütematoosne luupus ja süsteemne vaskuliit, põevad seerumis alfa-IFN kontsentratsiooni suurenemist. Selle interferooni kõrget taset täheldatakse ka mõnedel patsientidel peptilise haavandi ja sapikivitõve ägenemise ajal. Alfa-INF kontsentratsioonide vahemik oli 0–93 pg / ml, keskmine 20 pg / ml. Tavaline vahemik on kuni 45 pg / ml (joonis 7).

Alfa-IFN-i antikehad.

Alfa-IFN-i vastaseid antikehi saab tuvastada somaatilise erütematoosluupusega patsientide seerumites. Alfa-IFN-i vastaste antikehade spontaanset esilekutsumist täheldatakse ka erinevate vähivormidega patsientide seerumites. Mõnel juhul leiti alfa-IFN-i vastaseid antikehi HIV-nakkusega patsientide seerumites, samuti tserebrospinaalvedelikus ja meningiidiga patsientide seerumites ägeda faasi ajal, kroonilise polüartriidiga patsientide seerumites.

Riis. 8. alfa-IFN-i antikehade taseme jaotus

tervete doonorite plasmas.

Alfa-IFN on üks tõhusatest viiruse- ja kasvajavastastest ravimitest, kuid selle pikaajaline kasutamine võib viia alfa-IFN-i spetsiifiliste antikehade tootmiseni. See vähendab ravi efektiivsust ja mõnel juhul põhjustab erinevaid kõrvaltoimeid: gripilaadsest kuni autoimmuunhaiguste tekkeni. Seda silmas pidades on INF-ravi ajal oluline kontrollida alfa-INF-vastaste antikehade taset patsiendi kehas. Nende moodustumine sõltub teraapias kasutatava ravimi tüübist, ravi kestusest ja haiguse tüübist. Alfa-IFN-i vastaste antikehade kontsentratsioonivahemik oli 0–126 ng / ml, keskmine 6,2 ng / ml. Tavaline vahemik on kuni 15 ng / ml (joonis 8). Tsütokiinide taseme hindamine, kasutades CJSC "Vector-Best" kaubanduslikult saadaolevaid reaktiivikomplekte, võimaldab kliinilises praktikas uut lähenemist keha immuunsüsteemi seisundi uurimisele.

Tsütokiinidel põhinevad immunotroopsed ravimid.

Huvitav töö S. Simbirtseva, Venemaa tervishoiuministeeriumi kõrge puhtusastmega bioloogiliste toodete riiklik uurimisinstituut, Peterburi). Tsütokiine saab eraldada uude sõltumatusse organismi põhifunktsioonide reguleerimissüsteemi, mis eksisteerib koos närvi- ja sisesekretsioonisüsteemiga. reguleerimine ja see on peamiselt seotud homöostaasi säilitamisega patogeenide sissetoomise ajal ja kudede terviklikkuse rikkumisega. See uus reguleerivate molekulide klass loodi miljoneid aastaid kestnud evolutsiooni käigus ja sellel on piiramatu potentsiaal ravimina kasutamiseks. Immuunsüsteemis vahendavad tsütokiinid suhet mittespetsiifiliste kaitsereaktsioonide ja spetsiifilise immuunsuse vahel, toimides mõlemas suunas. Keha tasandil suhtlevad tsütokiinid immuunsüsteemi, närvisüsteemi, endokriinsüsteemi, vereloome ja muude süsteemide vahel ning aitavad neid kaasata kaitsereaktsioonide korraldamisse ja reguleerimisse. Tsütokiinide intensiivse uuringu liikumapanev jõud on alati olnud nende kliinilise kasutamise paljulubav väljavaade laialt levinud haiguste, sealhulgas vähi, nakkus- ja immuunpuudulikkuse haiguste ravis. Venemaal on registreeritud mitmeid tsütokiinipreparaate, sealhulgas interferoonid, kolooniaid stimuleerivad tegurid, interleukiinid ja nende antagonistid ning kasvaja nekroosifaktor. Kõik tsütokiinipreparaadid võib jagada looduslikeks ja rekombinantseteks. Looduslikud preparaadid on erineva puhastusastmega preparaadid, mis on saadud stimuleeritud eukarüootsete rakkude, peamiselt inimese rakkude, söötmest. Peamised puudused on madal puhastusaste, komponentide suure hulga tõttu standardimise võimatus ja verekomponentide kasutamine tootmises. Ilmselt on tsütokiinravi tulevik seotud geneetiliselt muundatud ravimitega, mis on saadud biotehnoloogia uusimate edusammude abil. Viimase kahe aastakümne jooksul on enamiku tsütokiinide geene kloonitud ja saadud rekombinantseid analooge, mis kordavad täielikult looduslike molekulide bioloogilisi omadusi. Kliinilises praktikas on tsütokiinide kasutamisel kolm peamist valdkonda:

1) tsütokiinravi keha kaitsereaktsioonide aktiveerimiseks, immunomoduleerimiseks või endogeensete tsütokiinide puuduse korvamiseks,

2) tsütokiinivastane immunosupressiivne ravi, mille eesmärk on tsütokiinide ja nende retseptorite bioloogilise toime blokeerimine,

3) tsütokiini geeniteraapia, mille eesmärk on tugevdada kasvajavastast immuunsust või korrigeerida tsütokiinisüsteemi geneetilisi defekte.

Süsteemseks ja kohalikuks kasutamiseks võib kliiniliselt kasutada mitmeid tsütokiine. Süsteemne manustamine on õigustatud juhtudel, kui immuunsuse tõhusamaks aktiveerimiseks on vaja tagada tsütokiinide toime mitmes elundis või aktiveerida erinevates kehaosades asuvad sihtrakud. Muudel juhtudel on paiksel kasutamisel mitmeid eeliseid, kuna see võimaldab teil saavutada toimeaine kõrge lokaalse kontsentratsiooni, sihtorgani-sihtmärgi ja vältida soovimatuid süsteemseid ilminguid. Praegu peetakse tsütokiine üheks kõige lootustandvamaks ravimiks kliinilises praktikas kasutamiseks.

Järeldus.

Seega pole praegu kahtlust, et tsütokiinid on immunopatogeneesi kõige olulisemad tegurid. Tsütokiinide taseme uurimine annab teavet erinevat tüüpi immuunkompetentsete rakkude funktsionaalse aktiivsuse, I ja II tüüpi T-abistajate aktiveerimisprotsesside suhte kohta, mis on väga oluline paljude nakkuslike ja immunopatoloogilised protsessid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mida immuunsüsteemi rakud saavad kasutada teabe vahetamiseks ja üksteisega suhtlemiseks. Tänaseks on avastatud üle saja erineva tsütokiini, mis on tavapäraselt jagatud põletikuvastasteks (põletikku provotseerivateks) ja põletikuvastasteks (põletiku teket takistavateks). Seega on tsütokiinide erinevad bioloogilised funktsioonid jagatud kolme rühma: need kontrollivad immuunsüsteemi arengut ja homöostaasi, kontrollivad vererakkude (vereloome süsteem) kasvu ja diferentseerumist ning osalevad keha mittespetsiifilistes kaitsereaktsioonides, mõjutades põletikulisi protsesse. protsessid, vere hüübimine, vererõhk.

Kasutatud kirjanduse loetelu.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihhailova. / Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool, Riiklik Koloproktoloogia Teaduslik Keskus, Moskva ja Riiklik Kõrgpuhaste Biopreparaatide Uurimisinstituut, Peterburi.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Ajakiri "Tsütokiinid ja põletik", 2005, nr 1 T. 4, nr 1. Lk.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov, JSC "Vector-Best" töö materjalid.

A. S. Simbirtsev, Venemaa tervishoiuministeeriumi ülipuhaste bioloogiliste toodete riiklik uurimisinstituut, Peterburi.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Riiklik kõrge puhtusastmega biopreparaatide uurimisinstituut, Peterburi.

T. A. Šumatova, V. B. Šumatov, E. V. Markelova, L. G. Kuiv-soe. Vladivostoki Riikliku Meditsiiniülikooli anestesioloogia ja reanimatoloogia osakond.

Töös kasutati materjale saidilt http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

teatud nakkushaiguste patogeenid. Niisiis, norsulfazole ...

1. Viirusevastase immuunsuse molekulaarsed ja rakulised mehhanismid, arengumustrid ja immunopato

   Kokkuvõte >> Meditsiin, tervis

   ... "sait" viitab kindlale saidile teatud polüpeptiid (antigeen), millega ... selle varased staadiumid. Tsütokiinid ja kemokiinid. Muu tsütokiinid, lisaks interferoonidele, ... nende toodetud ajaühiku kohta tsütokiinid määrab proliferatsiooni intensiivsuse ja ...

2. Luuüdi fibroosi põhjuste uurimine müeloproliferatiivsete haiguste korral, analüüsides trombotsüütide tegurite mõju mesenhümaalsetele tüvirakkudele

   Kodutöö >> Meditsiin, tervis

   Erinevad kontsentratsioonid; - kvantitatiivne määratlus valk katsesüsteemides ... viib pikaajalise toimeni tsütokiin, mis suurendab fibroosi protsessi ... trombotsüüte. Samuti suurenenud sisu tsütokiin leiti uriinist ...

3. Tuberkuloosi patogenees inimestel

   Kokkuvõte >> Meditsiin, tervis

   Kuid ka toitumine on võimalik. Teatud mängib rolli aerogeenses infektsioonis ... mängib, sekreteeritakse makrofaagide ja monotsüütide poolt tsütokiin- kasvaja nekroosifaktor (TNF). ... ioonid, igal rakul on teatud süsteem, mis tagab ainete transpordi ...

). Kuna nad aktiveerisid või moduleerisid selle klassi rakkude proliferatiivseid omadusi, nimetati neid immunotsütokiinideks. Pärast seda, kui sai teada, et need ühendid suhtlevad mitte ainult immuunsüsteemi rakkudega, lühendati nende nime tsütokiinideks, mis hõlmavad ka kolooniaid stimuleerivat faktorit (CSF) ja paljusid teisi (vt Vasoaktiivsed ained ja põletik).

Tsütokiinid [kreeka. kytos- anum, siin on rakk ja kineo- liigutav, julgustav] - suur ja mitmekesine rühm väikese suurusega (molekulmass 8–80 kDa) valgu vahendajaid - vahendaja molekule („sidevalgud“), mis osalevad rakkudevahelises signalisatsioonis peamiselt immuunsüsteemis. Tsütokiinide hulka kuuluvad kasvaja nekroosifaktor, interferoonid, mitmed interleukiinid jne. Tsütokiine, mida sünteesivad lümfotsüüdid ning mis on proliferatsiooni ja diferentseerumise regulaatorid, eriti vereloomerakkude ja immuunsüsteemi rakkude puhul, nimetatakse lümfokiinideks. Mõiste "tsütokiinid" pakkusid välja S. Coen jt. aastal 1974

Kõigil immuunsüsteemi rakkudel on teatud funktsioonid ja need toimivad selgelt koordineeritud koostoimes, mida pakuvad spetsiaalsed bioloogiliselt aktiivsed ained - tsütokiinid - immuunreaktsioonide regulaatorid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mille kaudu erinevad immuunsüsteemi rakud saavad omavahel teavet vahetada ja oma tegevust koordineerida. Rakupinna retseptoreid - "tsütokiinikeskkonda" - mõjutavate tsütokiinide komplekt ja kogus esindavad interakteeruvate ja sageli muutuvate signaalide maatriksit. Need signaalid on keerukad, kuna on palju erinevaid tsütokiini retseptoreid ja asjaolu, et iga tsütokiin võib aktiveerida või pärssida mitmeid protsesse, sealhulgas oma sünteesi ja teiste tsütokiinide sünteesi, samuti tsütokiini retseptorite teket ja välimust. raku pinnal. Erinevatel kudedel on oma tervislik "tsütokiinikeskkond". Avastatud on üle saja erineva tsütokiini.

Tsütokiinid on oluline element erinevate lümfotsüütide vastastikmõjus üksteisega ja fagotsüütidega (joonis 4). Tsütokiinide kaudu aitavad T-abistajad koordineerida mitmesuguste immuunvastusega seotud rakkude tööd.

Pärast interleukiinide avastamist 1970ndatel on siiani avastatud üle saja bioloogiliselt aktiivse aine. Erinevad tsütokiinid reguleerivad immunokompetentsete rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumist. Ja kui tsütokiinide mõju nendele protsessidele on üsna hästi uuritud, siis andmed tsütokiinide mõju kohta apoptoosile ilmusid suhteliselt hiljuti. Neid tuleks tsütokiinide kliinilisel kasutamisel ka arvesse võtta.

Rakkudevaheline signaalimine immuunsüsteemis toimub rakkude otsese kokkupuute või rakkudevahelise interaktsiooni vahendajate kaudu. Uurides immuunkompetentsete ja vereloomerakkude diferentseerumist, samuti rakkudevahelise interaktsiooni mehhanisme, mis moodustavad immuunvastuse, on suur ja mitmekesine valkude olemusega lahustuvate vahendajate rühm - rakkudevahelises signalisatsioonis osalevad vahendajamolekulid ("siduvad valgud") - tsütokiinid avastati. Hormoonid jäetakse sellest kategooriast tavaliselt välja nende endokriinsete (mitte parakriinsete või autokriinsete) toimete tõttu. (vt Tsütokiinid: hormonaalse signaali edastamise mehhanismid). Koos hormoonide ja neurotransmitteritega moodustavad need keemilise signaalikeele aluse, mille abil reguleeritakse mitmerakulises organismis morfogeneesi ja kudede uuenemist. Neil on keskne roll immuunvastuse positiivses ja negatiivses reguleerimises. Praeguseks on inimestel avastatud ja uuritud rohkem kui sada tsütokiini ühel või teisel määral, nagu eespool mainitud, ning pidevalt on teateid uute avastamisest. Mõne jaoks on saadud geneetiliselt muundatud analoogid. Tsütokiinid toimivad tsütokiini retseptorite aktiveerimise kaudu.

Üsna sageli ei toimu tsütokiinide jagamine mitmesse perekonda mitte nende funktsioonide, vaid kolmemõõtmelise struktuuri olemuse tõttu, mis peegeldab spetsiifiliste rakuliste tsütokiiniretseptorite konformatsiooni ja aminohappejärjestuse rühmasisest sarnasust (vt " Tsütokiinide retseptorid "). Mõnda neist toodavad T-rakud (vt "T-rakkude poolt toodetud tsütokiinid"). Tsütokiinide peamine bioloogiline aktiivsus on immuunvastuse reguleerimine selle arengu kõigil etappidel, milles neil on keskne roll. Üldiselt pakub kogu see suur endogeensete regulaatorite rühm mitmesuguseid protsesse, näiteks:

Tsütotoksilisuse esilekutsumine makrofaagides,

Paljud tõsised haigused põhjustavad IL-1 ja TNF alfa taseme olulist tõusu. Need tsütokiinid soodustavad fagotsüütide aktiveerimist, nende migratsiooni põletikukohta, samuti põletikuliste vahendajate - lipiididerivaatide ehk prostaglandiin E2, tromboksaanide ja trombotsüütide aktiveeriva faktori - vabanemist. Lisaks põhjustavad nad otseselt või kaudselt arterioolide laienemist, liimivate glükoproteiinide sünteesi ning aktiveerivad T- ja B-lümfotsüüte. IL-1 käivitab IL-8 sünteesi, mis soodustab monotsüütide ja neutrofiilide kemotaksist ning ensüümide vabanemist neutrofiilidest. Maksas väheneb albumiini süntees ja suureneb põletiku ägeda faasi valkude, sealhulgas proteaasi inhibiitorite, komplemendi komponentide, fibrinogeeni, tseruloplasmiini, ferritiini ja haptoglobiini süntees. C-reaktiivse valgu tase, mis seostub kahjustatud ja surnud rakkudega, samuti mõned mikroorganismid, võib tõusta kuni 1000 korda. Võimalik on ka seerumi amüloid A kontsentratsiooni märkimisväärne suurenemine ja selle sadestumine erinevatesse elunditesse, põhjustades sekundaarset amüloidoosi. Põletiku ägeda faasi kõige olulisem vahendaja on IL-6, kuigi IL-1 ja TNF-alfa võivad põhjustada ka kirjeldatud maksafunktsiooni muutusi. IL-1 ja TNF-alfa suurendavad üksteise mõju põletiku lokaalsetele ja üldistele ilmingutele; seetõttu võib nende kahe tsütokiini kombinatsioon isegi väikestes annustes põhjustada mitme organi puudulikkust ja püsivat arteriaalset hüpotensiooni. Nende aktiivsuse pärssimine kõrvaldab selle koostoime ja parandab märgatavalt patsiendi seisundit. IL-1 aktiveerib T- ja B-lümfotsüüte tugevamalt 39 * C juures kui 37 * C juures. IL-1 ja alfa-TNF põhjustavad kehamassi vähenemist ja isu vähenemist, põhjustades kahekordistumist koos pikaajalise palavikuga. Need tsütokiinid sisenevad vereringesse vaid lühikeseks ajaks, kuid sellest piisab IL-6 tootmise käivitamiseks. IL-6 esineb pidevalt veres, seega on selle kontsentratsioon rohkem kooskõlas palaviku ja muude infektsiooni ilmingute tõsidusega. Kuid IL-6, erinevalt IL-1 ja TNF-alfa, ei peeta surmavaks tsütokiiniks.

Kokkuvõte. Tsütokiinid on väikesed valgud, mis toimivad autokriinselt (st neid tootval rakul) või parakriinil (läheduses asuvatel rakkudel). Nende väga aktiivsete molekulide moodustumine ja vabanemine on lühiajaline ja rangelt reguleeritud. Tsütokiine, mida sünteesivad lümfotsüüdid ja mis on proliferatsiooni ja diferentseerumise regulaatorid, eriti vereloomerakkude ja immuunsüsteemi rakkude puhul, nimetatakse ka lümfokiinideks ja

Selles peatükis käsitletakse integreeritud lähenemisviisi tsütokiinisüsteemi hindamiseks, kasutades eelnevalt kirjeldatud kaasaegseid uurimismeetodeid.

Esiteks kirjeldame tsütokiinisüsteemi põhimõisteid.

Tsütokiine peetakse praegu valgu-peptiidmolekulideks, mida toodavad erinevad keharakud ning mis viivad läbi rakkudevahelisi ja süsteemidevahelisi interaktsioone. Tsütokiinid on rakkude elutsükli universaalsed regulaatorid, nad kontrollivad nende diferentseerumise, proliferatsiooni, funktsionaalse aktiveerimise ja apoptoosi protsesse.

Immuunsüsteemi rakkude poolt toodetud tsütokiine nimetatakse immunotsütokiinideks; need on immuunsüsteemi lahustuvate peptiidide vahendajate klass, mis on vajalik selle arenguks, toimimiseks ja koostoimimiseks teiste kehasüsteemidega (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Reguleerivate molekulidena mängivad tsütokiinid olulist rolli kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuse reaktsioonides, tagavad nende omavahelise seotuse, kontrollivad vereloomet, põletikku, haavade paranemist, uute veresoonte teket (angiogenees) ja paljusid teisi elutähtsaid protsesse.

Praegu on olemas mitmeid erinevaid tsütokiinide klassifikatsioone, võttes arvesse nende struktuuri, funktsionaalset aktiivsust, päritolu, tsütokiini retseptorite tüüpi. Traditsiooniliselt on vastavalt bioloogilistele mõjudele tavaks eristada järgmisi tsütokiinide rühmi.

1. Interleukiinid(IL-1-IL-33) on immuunsüsteemi sekretoorsed regulatoorsed valgud, mis pakuvad vahendaja interaktsioone immuunsüsteemis ja selle seost teiste kehasüsteemidega. Interleukiinid klassifitseeritakse nende funktsionaalse aktiivsuse järgi põletikuvastasteks ja põletikuvastasteks tsütokiinideks, lümfotsüütide kasvufaktoriteks, reguleerivateks tsütokiinideks jne.

3. Kasvaja nekroosifaktorid (TNF)- tsütotoksilised ja reguleerivad toimed tsütokiinid: TNFa ja lümfotoksiinid (LT).

4. Hematopoeetiliste rakkude kasvufaktorid-tüvirakkude kasvufaktor (komplekt-ligand), IL-3, IL-7, IL-11, erütropoetiin, trobopoetiin, granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor-GM-CSF, granulotsüütide CSF-G-CSF, makrofaagid-

ny KSF - M -KSF).

5. Kemokiinid- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - erinevat tüüpi rakkude kemotaksise regulaatorid.

6. Mitte-lümfoidsete rakkude kasvufaktorid- erinevate kudede kuuluvate rakkude kasvu, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiivsuse regulaatorid (fibroblastide kasvufaktor - FGF, endoteelirakkude kasvufaktor, epidermise kasvufaktor - epidermise EGF) ja transformeerivad kasvufaktorid (TGFβ, TGFα).

Muu hulgas on viimastel aastatel aktiivselt uuritud makrofaagide migratsiooni pärssivat tegurit (migratsiooni pärssiv tegur - MIF), mida peetakse tsütokiini ja ensümaatilise aktiivsusega neurohormooniks (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Tsütokiinid erinevad struktuuri, bioloogilise aktiivsuse ja muude omaduste poolest. Kuid koos erinevustega on tsütokiinidel üldised omadused, iseloomulik sellele bioregulatoorsete molekulide klassile.

1. Tsütokiinid on reeglina keskmise molekulmassiga (alla 30 kD) glükosüülitud polüpeptiidid.

2. Tsütokiine toodavad immuunsüsteemi rakud ja teised rakud (näiteks endoteel, fibroblastid jne) vastuseks aktiveerivale stiimulile (patogeeniga seotud molekulaarstruktuurid, antigeenid, tsütokiinid jne) ja osalevad reaktsioonides. kaasasündinud ja adaptiivne immuunsus, reguleerides nende tugevust ja kestust. Mõned tsütokiinid sünteesitakse konstitutiivselt.

3. Tsütokiinide sekretsioon on lühiajaline protsess. Tsütokiine ei säilitata eelnevalt vormitud molekulidena, vaid nende

süntees algab alati geeni transkriptsioonist. Rakud toodavad tsütokiine madalas kontsentratsioonis (pikogrammid milliliitri kohta).

4. Enamikul juhtudel toodetakse tsütokiine, mis toimivad sihtrakkudele vahetus läheduses (lähitoime). Tsütokiini peamine toimekoht on rakkudevaheline sünapss.

5. Koondamine tsütokiinide süsteem avaldub selles, et iga rakutüüp on võimeline tootma mitmeid tsütokiine ja iga tsütokiini võivad eritada erinevad rakud.

6. Kõiki tsütokiine iseloomustab pleiotroopia, või tegevuse polüfunktsionaalsus. Seega on põletiku tunnuste avaldumine tingitud IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 mõjust. Funktsioonide dubleerimine tagab tsütokiinisüsteemi töökindluse.

7. Tsütokiinide toimet sihtrakkudele vahendavad väga spetsiifilised kõrge afiinsusega membraaniretseptorid, milleks on transmembraansed glükoproteiinid, mis koosnevad tavaliselt rohkem kui ühest subühikust. Retseptorite rakuväline osa vastutab tsütokiinide sidumise eest. On retseptoreid, mis kõrvaldavad liigse tsütokiini patoloogilises fookuses. Need on nn lõksu retseptorid. Lahustuvad retseptorid on membraaniretseptori rakuväline domeen, mida eraldab ensüüm. Lahustuvad retseptorid on võimelised neutraliseerima tsütokiine, osalema nende transportimisel põletiku fookusesse ja organismist väljutamisel.

8. Tsütokiinid töötada võrgu põhimõttel. Nad võivad tegutseda koos. Tundub, et paljusid funktsioone, mis olid algselt omistatud ühele tsütokiinile, vahendab mitme tsütokiini kooskõlastatud tegevus. (sünergia toimingud). Tsütokiinide sünergistlike koostoimete näideteks on põletikuliste reaktsioonide (IL-1, IL-6 ja TNF-a) stimuleerimine, samuti IgE süntees

(IL-4, IL-5 ja IL-13).

Mõned tsütokiinid indutseerivad teiste tsütokiinide sünteesi (kaskaad). Tsütokiinide kaskaadne toime on vajalik põletikuliste ja immuunvastuste tekkeks. Mõnede tsütokiinide võime teiste tootmist suurendada või nõrgendada määrab olulised positiivsed ja negatiivsed regulatiivsed mehhanismid.

Tsütokiinide antagonistlik toime on teada, näiteks IL-6 produktsioon vastusena TNFa kontsentratsiooni suurenemisele võib olla

negatiivne regulatiivne mehhanism selle vahendaja tootmise kontrollimiseks põletiku ajal.

Sihtrakkude funktsioonide tsütokiinide reguleerimine toimub autokriinsete, parakriinsete või endokriinsete mehhanismide abil. Mõned tsütokiinid (IL-1, IL-6, TNFa jne) on võimelised osalema kõigi ülaltoodud mehhanismide rakendamises.

Raku reaktsioon tsütokiini mõjule sõltub mitmest tegurist:

Rakkude tüübist ja nende esialgsest funktsionaalsest aktiivsusest;

Tsütokiini kohalikust kontsentratsioonist;

Teiste vahendajamolekulide olemasolust.

Seega moodustavad tootjarakud, tsütokiinid ja nende spetsiifilised retseptorid sihtrakkudel ühe vahendajavõrgustiku. Rakkude lõpliku vastuse määravad reguleerivate peptiidide kogum, mitte üksikud tsütokiinid. Praegu peetakse tsütokiinisüsteemi universaalseks reguleerimissüsteemiks kogu organismi tasandil, mis tagab kaitsereaktsioonide arengu (näiteks nakatumise ajal).

Viimastel aastatel on idee tsütokiinisüsteemist, mis ühendab:

1) tootjarakud;

2) lahustuvad tsütokiinid ja nende antagonistid;

3) sihtrakud ja nende retseptorid (joonis 7.1).

Tsütokiinisüsteemi erinevate komponentide rikkumine põhjustab arvukate patoloogiliste protsesside arengut ja seetõttu on selle reguleerimissüsteemi defektide tuvastamine oluline õige diagnoosi määramiseks ja piisava ravi määramiseks.

Esiteks kaalume tsütokiinisüsteemi põhikomponente.

Tsütokiine tootvad rakud

I. Peamine tsütokiine tootvate rakkude rühm adaptiivses immuunvastuses on lümfotsüüdid. Puhkavad rakud ei eralda tsütokiine. Antigeeni äratundmisel ja retseptorite interaktsioonide osalusel (CD28-CD80 / 86 T-lümfotsüütide puhul ja CD40-CD40L B-lümfotsüütide korral) toimub rakkude aktiveerimine, mis viib tsütokiini geenide transkriptsioonini, glükosüülitud peptiidide translatsioonini ja sekretsioonini rakkudevahelisse ruumi.

Riis. 7.1. Tsütokiinisüsteem

CD4 T-abistajaid esindavad alampopulatsioonid: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, mis erinevad vastusena erinevatele antigeenidele sekreteeritud tsütokiinide spektris.

Th0 toodab laias valikus tsütokiine väga madalal kontsentratsioonil.

Diferentseerumise suund Th0 määrab kahe immuunvastuse vormi arengu, kus domineerivad humoraalsed või rakulised mehhanismid.

Antigeeni olemus, selle kontsentratsioon, lokaliseerimine rakus, antigeeni esitlevate rakkude tüüp ja teatud tsütokiinide komplekt reguleerivad Th0 diferentseerumise suunda.

Pärast antigeeni püüdmist ja töötlemist esitavad dendriitrakud Th0 rakkudele antigeenseid peptiide ja toodavad tsütokiine, mis reguleerivad nende diferentseerumise suunda efektorrakkudeks. Üksikute tsütokiinide roll selles protsessis on näidatud joonisel fig. 7.2. IL-12 indutseerib IFNy sünteesi T-lümfotsüütide ja] HGC poolt. IFNu võimaldab diferentseerida Th1, mis hakkavad sekreteerima tsütokiine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, lümfotoksiinid), mis reguleerivad rakusiseste patogeenide reaktsioonide teket

(hilinenud tüüpi ülitundlikkus (HRT) ja erinevat tüüpi rakuline tsütotoksilisus).

IL-4 tagab Th0 diferentseerumise Th2-ks. Aktiveeritud Th2 toodab tsütokiine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 jne), mis määravad B-lümfotsüütide proliferatsiooni, nende edasise diferentseerumise plasmarakkudeks ja antikehareaktsioonide tekkimise, peamiselt rakuväliseid patogeene.

IFNu reguleerib negatiivselt Th2 rakkude funktsiooni ja vastupidi, IL-4, Th2 sekreteeritav IL-10 pärsivad Th1 funktsiooni (joonis 7.3). Selle regulatsiooni molekulaarne mehhanism on seotud transkriptsioonifaktoritega. IFNy poolt määratud T-bet ja STAT4 ekspressioon suunab T-rakkude diferentseerumist mööda Th1 rada ja pärsib Th2 arengut. IL-4 indutseerib GATA-3 ja STAT6 ekspressiooni, mis vastavalt tagab naiivse THO transformatsiooni Th2 rakkudeks (joonis 7.2).

Viimastel aastatel on kirjeldatud IL-17 tootvate abistaja T-rakkude (Th17) spetsiaalset alampopulatsiooni. IL-17 perekonna liikmeid võivad ekspresseerida aktiveeritud mälurakud (CD4 CD45RO), y5T rakud, NKT rakud, neutrofiilid, monotsüüdid IL-23, IL-6, TGFβ mõjul, mida toodavad makrofaagid ja dendriitrakud. Peamine eristav tegur inimestel on ROR-C, hiirtel-ROR-γ l On näidatud IL-17 kardinaalset rolli kroonilise põletiku ja autoimmuunpatoloogia kujunemisel (vt joonis 7.2).

Lisaks võivad tüümuse T-lümfotsüüdid diferentseeruda looduslikeks reguleerivateks rakkudeks (Treg), mis ekspresseerivad pinnamarkereid CD4 + CD25 + ja transkriptsioonifaktorit FOXP3. Need rakud on võimelised pärssima Th1 ja Th2 rakkude vahendatud immuunvastust otsese rakkudevahelise kontakti ning TGFβ ja IL-10 sünteesi kaudu.

Th0 kloonide ja nende sekreteeritud tsütokiinide diferentseerumise skeemid on näidatud joonisel fig. 7.2 ja 7.3 (vt ka värvilist sisestust).

T-tsütotoksilised rakud (CD8 +), looduslikud tapjarakud on nõrgad tsütokiinide, nagu interferoonid, TNF-a ja lümfotoksiinid, tootjad.

Ühe Th alampopulatsiooni liigne aktiveerimine võib määrata ühe immuunvastuse variandi arengu. Th aktivatsiooni krooniline tasakaalustamatus võib põhjustada selle avaldumisega seotud immunopatoloogiliste seisundite teket

allergiad, autoimmuunpatoloogia, kroonilised põletikulised protsessid jne.

Riis. 7.2. Tsütokiine tootvate T-lümfotsüütide erinevad alampopulatsioonid

II. Kaasasündinud immuunsüsteemis on tsütokiinide peamised tootjad müeloidrakud. Tolli-sarnaste retseptorite (TLR) abil tunnevad nad ära erinevate patogeenide sarnased molekulaarstruktuurid, nn patogeenidega seotud molekulaarmustrid (RAMP), näiteks gramnegatiivsete bakterite lipopolüsahhariid (LPS), lipoteikohapped, grampositiivsete mikroorganismide peptidoglükaanid, flagelliin, G-korduste rikas DNA jne. Selle tulemusena

See koostoime TLR -ga käivitab rakusisese signaaliülekande kaskaadi, mis viib kahe peamise tsütokiinirühma geenide ekspressioonini: põletikueelne ja IFN tüüp 1 (joonis 7.4, vt ka värvi sisestus). Peamiselt indutseerivad need tsütokiinid (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, kemokiinid jne) põletiku teket ja on seotud keha kaitsmisega bakteriaalsete ja viirusnakkuste eest.

Riis. 7.3. TH1 ja TH2 rakkude sekreteeritud tsütokiinide spekter

III. Rakud, mis ei kuulu immuunsüsteemi (sidekoe rakud, epiteel, endoteel), eraldavad konstitutiivselt autokriinseid kasvufaktoreid (FGF, EGF, TGFR jne). ja tsütokiinid, mis toetavad vereloomerakkude vohamist.

Tsütokiinid ja nende antagonistid on üksikasjalikult kirjeldatud paljudes monograafiates (Kovalchuk L. V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Riis. 7.4. TLR-vahendatud tsütokiini tootmise indutseerimine kaasasündinud immuunrakkude poolt

Tsütokiinide üleekspressioon on kehale ohtlik ja võib põhjustada ülemäärase põletikulise reaktsiooni, ägeda faasi reaktsiooni. Põletikku soodustavate tsütokiinide tootmise reguleerimises osalevad mitmesugused inhibiitorid. Seega on kirjeldatud mitmeid aineid, mis mittespetsiifiliselt seovad tsütokiini IL-1 ja takistavad selle bioloogilise toime avaldumist (a2-makroglobuliin, komplemendi C3-komponent, uromoduliin). IL-1 spetsiifiliste inhibiitorite hulka kuuluvad lahustuvad peibutusretseptorid, antikehad ja IL-1 retseptori antagonist (IL-1RA). Põletiku arenedes suureneb IL-1RA geeni ekspressioon. Kuid isegi tavaliselt esineb see antagonist veres suurtes kontsentratsioonides (kuni 1 ng / ml või rohkem), blokeerides endogeense IL-1 toimet.

Sihtrakud

Tsütokiinide toime sihtrakkudele on vahendatud spetsiifiliste retseptorite kaudu, mis seovad tsütokiine väga suure afiinsusega, ja üksikud tsütokiinid saavad kasutada

tavalised retseptori allüksused. Iga tsütokiin seondub oma spetsiifilise retseptoriga.

Tsütokiini retseptorid on transmembraansed valgud ja jagunevad 5 peamiseks tüübiks. Kõige tavalisem on nn hematopoetiini tüüpi retseptor, millel on kaks rakuvälist domeeni, millest üks sisaldab trüptofaani ja seriini kahe korduse aminohappejääkide ühist järjestust, mis on eraldatud mis tahes aminohappega (WSXWS motiiv). Teist tüüpi retseptoritel võib olla kaks rakuvälist domeeni, millel on suur hulk konserveerunud tsüsteiine. Need on IL-10 ja IFN perekonna retseptorid. Kolmandat tüüpi esindavad tsütokiini retseptorid, mis kuuluvad TNF -i rühma. Neljas tsütokiini retseptorite tüüp kuulub immunoglobuliini retseptorite superperekonda, mille rakuväliste domeenidega sarnaneb struktuurilt immunoglobuliini molekulide domeenid. Viiendat tüüpi retseptorit, mis seob kemokiinide perekonna molekule, esindavad transmembraansed valgud, mis läbivad rakumembraani 7 kohas. Tsütokiini retseptorid võivad eksisteerida lahustuval kujul, säilitades võime ligande siduda (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Tsütokiinid on võimelised mõjutama sihtrakkude proliferatsiooni, diferentseerumist, funktsionaalset aktiivsust ja apoptoosi (vt joonis 7.1). Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse avaldumine sihtrakkudes sõltub erinevate rakusiseste süsteemide osalemisest signaali edastamisel retseptorist, mis on seotud sihtrakkude omadustega. Signaal apoptoosile viiakse muu hulgas läbi TNF-retseptorite perekonna spetsiifilise piirkonna, nn surma domeeni (joonis 7.5, vt värvi sisestus) abil. Diferentseerumine ja aktiveerivad signaalid edastatakse rakusiseste Jak -STAT valkude kaudu - signaali muundurid ja transkriptsiooni aktivaatorid (joonis 7.6, vt värvi sisestus). G-valgud osalevad kemokiinide signaalimisel, mis suurendab migratsiooni ja rakkude adhesiooni.

Tsütokiinisüsteemi põhjalik analüüs sisaldab järgmist.

I. Tootjarakkude hindamine.

1. Väljenduse määramine:

Retseptorid, mis tunnevad geenide ja valgumolekulide tasemel ära patogeeni või antigeeni TCR, TLR) (PCR, voolutsütomeetria);

Adaptermolekulid, mis juhivad signaali, mis käivitab tsütokiini geenide transkriptsiooni (PCR jne);

Riis. 7.5. Signaali edastamine TNF retseptorilt

Riis. 7.6. Jak -STAT - signaalirada 1. tüüpi tsütokiini retseptoritest

Tsütokiini geenid (PCR); tsütokiinide valgumolekulid (inimese mononukleaarsete rakkude tsütokiini sünteesiva funktsiooni hindamine).

2. Teatud tsütokiine sisaldavate rakkude alampopulatsioonide kvantifitseerimine: Th1, Th2 Th17 (tsütokiinide rakusisese värvimise meetod); teatud tsütokiine sekreteerivate rakkude arvu määramine (ELISPOT -meetod, vt ptk 4).

II. Tsütokiinide ja nende antagonistide hindamine keha bioloogilises keskkonnas.

1. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine.

2. Tsütokiinide kvantitatiivne määramine ELISA abil.

3. Tsütokiinide immunohistokeemiline värvimine kudedes.

4. Vastandlike tsütokiinide (põletikuvastased ja põletikuvastased), tsütokiinide ja tsütokiini retseptorite antagonistide suhte määramine.

III. Sihtrakkude hindamine.

1. Tsütokiini retseptorite ekspressiooni määramine geenide ja valgumolekulide tasemel (PCR, voolutsütomeetria meetod).

2. Signaalmolekulide määramine rakusiseses sisus.

3. Sihtrakkude funktsionaalse aktiivsuse määramine.

Praegu on tsütokiinisüsteemi hindamiseks välja töötatud arvukalt meetodeid, mis annavad mitmekesist teavet. Nende hulgas eristatakse:

1) molekulaarbioloogilised meetodid;

2) tsütokiinide kvantitatiivse määramise meetodid immuunanalüüsi abil;

3) tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine;

4) tsütokiinide rakusisene värvimine;

5) ELISPOT-meetod, mis võimaldab tuvastada tsütokiine ühe tsütokiini tootva raku ümber;

6) immunofluorestsents.

Siin on nende meetodite lühikirjeldus.

Kasutades molekulaarbioloogilised meetodid on võimalik uurida tsütokiinide, nende retseptorite, signaalmolekulide geenide ekspressiooni, uurida nende geenide polümorfismi. Viimastel aastatel on läbi viidud suur hulk uuringuid, mis näitasid seoseid tsütokiinisüsteemi molekulide geenide alleelide variantide ja eelsoodumuse vahel

mitmete haiguste suhtes. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda teavet konkreetse tsütokiini geneetiliselt programmeeritud tootmise kohta. Kõige tundlikum on reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon-RT-PCR (vt 6. peatükk). Hübridisatsiooni meetod kohapeal võimaldab selgitada tsütokiini geeniekspressiooni kudede ja rakkude lokaliseerimist.

Tsütokiinide kvantitatiivset määramist bioloogilistes vedelikes ja perifeerse vere mononukleaarsete rakkude kultuurides ELISA abil saab iseloomustada järgmiselt. Kuna tsütokiinid on kohalikud vahendajad, on sobivam mõõta nende taset vastavates kudedes pärast koeproteiinide ekstraheerimist või looduslikes vedelikes, näiteks pisarates, loputades õõnsustest, uriinist, amnionivedelikust, tserebrospinaalvedelikust jne. Tsütokiini tase seerumis või muudes kehavedelikes peegeldab immuunsüsteemi hetkeseisu, s.t. tsütokiinide süntees keharakkude poolt in vivo.

Tsütokiini tootmise taseme määramine perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (MNC) abil näitab rakkude funktsionaalset seisundit. MNC tsütokiinide spontaanne tootmine kultuuris näitab, et rakud on juba aktiveeritud in vivo.(Erinevate stimulantide, mitogeenide) poolt indutseeritud tsütokiinide süntees peegeldab rakkude võimalikku reservvõimet reageerida antigeensele stiimulile (eriti ravimite toimele). Vähendatud indutseeritud tsütokiinide tootmine võib olla üks immuunpuudulikkuse seisundi tunnuseid. Tsütokiinid ei ole konkreetse antigeeni jaoks spetsiifilised. Seetõttu on nakkus-, autoimmuun- ja allergiliste haiguste spetsiifiline diagnoosimine teatud tsütokiinide taseme määramise tõttu võimatu. Samal ajal võimaldab tsütokiini taseme hindamine saada andmeid põletikulise protsessi tõsiduse, selle ülemineku süsteemsele tasemele ja prognoosi, immuunsüsteemi rakkude funktsionaalse aktiivsuse, Th1 ja Th2 rakkude suhte kohta. on väga oluline paljude nakkuslike ja immunopatoloogiliste protsesside diferentsiaaldiagnostikas.

Bioloogilises söötmes saab tsütokiine kvantifitseerida, kasutades erinevaid immuunanalüüsi meetodid, kasutades polüklonaalseid ja monoklonaalseid antikehi (vt 4. peatükk). ELISA abil saate teada, milline on tsütokiinide täpne kontsentratsioon bioloogilises

loogilised kehavedelikud. Tsütokiinide ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsil on teiste meetoditega võrreldes mitmeid eeliseid (kõrge tundlikkus, spetsiifilisus, sõltumatus antagonistide olemasolust, täpse automatiseeritud arvestuse võimalus, raamatupidamise standardimine). Kuid sellel meetodil on ka oma piirangud: ELISA ei iseloomusta tsütokiinide bioloogilist aktiivsust, see võib ristreageerivate epitoopide tõttu anda vale tulemusi.

Bioloogiline testimine viiakse läbi teadmiste põhjal tsütokiinide põhiomadustest, nende toimest sihtrakkudele. Tsütokiinide bioloogilise toime uurimine on võimaldanud välja töötada nelja tüüpi tsütokiinide testimist:

1) sihtrakkude proliferatsiooni esilekutsumisega;

2) tsütotoksilise toimega;

3) luuüdi eellasrakkude diferentseerumise esilekutsumisega;

4) viirusevastaseks toimeks.

IL-1 määrab mitogeeni poolt aktiveeritud hiire tümotsüütide proliferatsiooni stimuleeriv toime in vitro; IL -2 - võime stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust; TNFα ja lümfotoksiinide tsütotoksilist toimet hiire fibroblastidele testitakse (L929). Kolooniaid stimuleerivaid tegureid hinnatakse nende võime eest toetada luuüdi eellasrakkude kasvu agarides kolooniatena. IFN-i viirusevastane toime tuvastatakse viiruste tsütopaatilise toime pärssimisega inimese diploidsete fibroblastide kultuuris ja hiirte fibroblastide tuumoriliinis L-929.

Loodud on rakuliinid, mille kasv sõltub teatud tsütokiinide olemasolust. Tabel 7.1 on tsütokiinide testimiseks kasutatavate rakuliinide loend. Vastavalt võimele indutseerida tundlike sihtrakkude proliferatsiooni viiakse läbi IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 jne biotestimine. Kuid need katsemeetodid ei ole piisavalt tundlikud ja informatiivsed. Inhibiitorite ja antagonistide molekulid võivad varjata tsütokiinide bioloogilist aktiivsust. Mitmel tsütokiinil on üldine bioloogiline aktiivsus. Sellegipoolest sobivad need meetodid ideaalselt rekombinantsete tsütokiinide spetsiifilise aktiivsuse testimiseks.

Tabel 7.1. Rakuliinid, mida kasutatakse tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimiseks

Tabeli lõpp. 7.1

Lab 7-1

IL-1 bioloogilise aktiivsuse määramine komitogeense toime abil hiire tümotsüütide proliferatsioonile

IL-1 bioloogilise testimise meetod põhineb tsütokiini võimel stimuleerida hiire tümotsüütide proliferatsiooni.

IL-1 saab määrata LPS-iga stimuleeritud monotsüütide kultuuris, samuti mis tahes keha bioloogilises vedelikus. On vaja pöörata tähelepanu mitmele detailile.

1. Testimiseks kasutatakse mitogeenide (konkanavaliin A - ConA ja fütohemaglutiniin - PHA) poolt proliferatsiooniks stimuleeritud C3H / HeJ hiirte tümotsüüte. Tümotsüüdid C3H / HeJ ei valitud juhuslikult: selle sugulusliini hiired ei reageeri LPS-ile, mis võib sisalduda uuritavas materjalis ja põhjustada IL-1 produktsiooni.

2. Tümotsüüdid reageerivad IL-2-le ja mitogeenidele, seetõttu tuleks IL-1 ja mitogeenide olemasolu määrata ka IL-1 suhtes testitud preparaatides.

Toimimisprotseduur

1. Hankige tümotsüütide suspensioon kontsentratsioonis 12 × 106 / ml keskkonda RPMI 1640, mis sisaldab 10% lehmade embrüote seerumit ja 2 -merkaptoetanooli (5 × 10 -5 M).

2. Valmistage ette katseliste (bioloogilised kehavedelikud) ja kontrollproovide järjestikused kahekordsed lahjendused. Kontrollidena kasutatakse IL-1 sisaldavaid bioloogilisi vedelikke või proove, mis on saadud mononukleaarsete rakkude inkubeerimisel ilma LPS-i ja laboratoorselt standardset IL-1 sisaldavat preparaati. 96 süvendiga ümarapõhjalistel plaatidel kantakse 50 μl igast lahjendusest 6 süvendisse.

3. Iga lahjenduse kolme süvendisse lisatakse 50 μl puhastatud PHA -d (Wellcome), mis on lahustatud täielikus söötmes kontsentratsiooniga 3 μg / ml, ja ülejäänud 3 auku - 50 μl söötet.

4. Lisage igasse süvendisse 50 μl tümotsüütide suspensiooni ja inkubeerige 48 tundi temperatuuril 37 ° C.

6. Enne kasvatamise lõppu lisatakse süvenditesse 50 μl ["3H] -tümidiini lahust (1 μCi / ml) ja inkubeeritakse veel 20 tundi.

7. Radioaktiivsuse taseme määramiseks kantakse kultuurirakud automaatse rakukoguja abil filterpaberile, filtrid kuivatatakse ja märgistuse lisamine määratakse vintststsillatsiooniloenduriga.

8. Tulemusi väljendatakse stimuleeriva tegurina.

kus m cp on impulsside keskmine arv 3 augus.

Kui tümotsüüdid reageerivad stimuleerimisele standardse IL-1-ga, näitab testitava proovi stimulatsiooniindeks, mis ületab 3, usaldusväärselt IL-1 aktiivsust.

Biotesti on ainus meetod tsütokiini funktsiooni hindamiseks, kuid seda meetodit tuleb täiendada erinevat tüüpi sobiva spetsiifilisuse kontrolliga, kasutades monoklonaalseid antikehi. Teatud monoklonaalsete antikehade lisamine tsütokiinile kultuuris blokeerib tsütokiini bioloogilise aktiivsuse, mis tõestab, et tuvastatud tsütokiin toimib signaalina rakuliini proliferatsioonile.

Biotesti kasutamine interferooni tuvastamiseks. IFN -i bioloogilise aktiivsuse hindamise põhimõte põhineb selle viirusevastasel toimel, mille määrab testiviiruse paljunemise pärssimise aste rakukultuuris.

Selles töös saab kasutada IFN toimele tundlikke rakke: peamiselt trüpsiinitud kana- ja inimese embrüote fibroblastirakke, siirdatud inimese diploidsete fibroblastide rakke ja hiire rakukultuuri (L929).

IFN -i viirusevastase toime hindamisel on soovitav kasutada lühikese paljunemistsükliga viirusi, millel on kõrge tundlikkus IFN toime suhtes: hiire entsefalomüeliidi viirus, hiire vesikulaarne stomatiit jne.

Lab 7-2

Interferooni aktiivsuse määramine

1. Inimese loote diploidsete fibroblastide suspensioon söötmel, millel on 10% veiste embrüote seerumit (rakkude kontsentratsioon-15-20 × 106 / ml), valatakse steriilsetesse 96-süvendilistesse lamedapõhjalistesse plaatidesse, 100 μl augu kohta. ja asetatakse CO 2 inkubaatorisse temperatuuril 37 ° C.

2. Pärast täieliku ühekihilise kihi moodustumist eemaldatakse kasvukeskkond süvenditest ja lisatakse igasse süvendisse 100 µl tugikeskkonda.

3. IFN aktiivsuse tiitrimine uuritavates proovides viiakse läbi kahekordse lahjendamise meetodil fibroblastide ühekihilisel kihil.

Samaaegselt proovidega sisestatakse süvenditesse hiire entsefalomüeliidi viirus (VEM) annuses, mis põhjustab 100% rakkude kahjustusi 48 tundi pärast nakatumist.

4. Kontrollimiseks kasutage kaevusid, milles on terved (töötlemata) viirusega nakatatud rakud.

Igas uuringus kasutatakse võrdlusravimina teadaoleva aktiivsusega IFN võrdlusproove.

5. Proovilahjendusega plaate inkubeeritakse 24 tundi temperatuuril 37 ° C 5% CO 2 sisaldavas atmosfääris.

6. IFN -i aktiivsuse tase määratakse uuritava proovi maksimaalse lahjenduse vastastikuse väärtusega, mis pärsib viiruse tsütopaatilist toimet 50%, ja seda väljendatakse aktiivsuse ühikutes milliliitri kohta.

7. IFN -i tüübi määramiseks lisatakse süsteemile IFNα, IFNβ või IFNy vastane antiseerum. Antiseerum tühistab vastava tsütokiini toime, mis võimaldab tuvastada IFN -i tüübi.

Inhibeeriva teguri migratsiooni bioloogilise aktiivsuse määramine. Praegu on kujunenud täiesti uued ideed MÜÜTI olemuse ja omaduste kohta, mis avastati eelmise sajandi 60ndatel rakulise immuunsuse vahendajana ja jäi paljude aastate jooksul ilma piisava tähelepanuta (Bloom BR, Bennet B., 1966) ; David JR, 1966). Alles viimase 10-15 aasta jooksul on selgunud: MÜÜT on üks olulisemaid bioloogilisi vahendajaid kehas, millel on lai valik tsütokiini, hormooni ja ensüümi bioloogilisi funktsioone. MIF toime sihtrakkudele avaldub CD74 -retseptori või endokütoosi mitteklassikalise raja kaudu.

MÜÜTI peetakse oluliseks põletiku vahendajaks, mis aktiveerib makrofaagide funktsiooni (tsütokiinide tootmine, fagotsütoos, tsütotoksilisus jne), samuti endogeenset immunoregulatoorset hormooni, mis moduleerib glükokortikoidide aktiivsust.

Üha rohkem teavet koguneb MIF -i rolli kohta paljude põletikuliste haiguste, sealhulgas sepsise, reumatoidartriidi (RA), glomerulonefriidi jne patogeneesis. RA puhul suureneb MIF -i kontsentratsioon kahjustatud liigeste vedelikus märkimisväärselt, mis on korrelatsioonis haiguse tõsidusega. MÜTH-i mõjul suureneb põletikueelsete tsütokiinide tootmine nii makrofaagide kui ka sünoviaalrakkude poolt.

MIF -i aktiivsuse testimiseks on teada erinevaid meetodeid, kui migreeruvad rakud (MIF -i sihtrakud) pannakse klaaskapillaari (kapillaartest), agaroositilka või agaroosikaevu.

Esitame suhteliselt lihtsa sõelumismeetodi, mis põhineb raku mikrokultuuride (leukotsüütide või makrofaagide) standardsel moodustumisel 96-süvendilise lameda põhjaga plaadi aukude põhjas ja rakkude arvus, millele järgneb nende kasvatamine toitainekeskkonnas ja nende mikrokultuuride pindala muutuse määramine mitmepoolse vahendustasu toimel (Suslov A.P., 1989).

Lab 7-3

MÜÜTI aktiivsuse määratlus

MIF -i bioloogilise aktiivsuse määramine toimub rakumikrokultuuride moodustamise seadme abil (joonis 7.7) - MIGROSKRIN (NF Gamaleya RAMS -i nimeline epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut).

1. 96-augulise plaadi (Flow, Suurbritannia vms) süvenditesse lisatakse 100 μl kultuurisöötmes lahjendatud proovi, milles määratakse MYTH aktiivsus (iga lahjendus 4 paralleeli, katseproovid). Sööde sisaldab RPMI 1640, 2 mM L-glutamiini, 5% veise loote seerumit, 40 μg / ml gentamütsiini.

2. Lisage kontrollsüvenditesse (igaüks 100 µl) sööde (4 paralleelselt).

3. Valmistage kõhukelme makrofaagide rakususpensioon, mille puhul 2 hübriidhiirtele (CBAxC57B1 / 6) F1 süstitakse intraperitoneaalselt 10 ml Hanksi lahust koos hepariiniga (10 Ü / ml), masseerige õrnalt kõhtu 2-3 minutit. Seejärel tapetakse loom pea mahavõtmisega, kõhu sein torgatakse hoolikalt kubemepiirkonda ja eritis imetakse süstlaga läbi nõela. Kõhukelme eksudaadi rakke pestakse kaks korda Hanksi lahusega, tsentrifuugitakse 10-15 minutit 200 g juures. Seejärel valmistatakse rakususpensioon RPMI 1640 söötme kontsentratsiooniga 10 ± 1 miljon / ml Loendamine toimub Gorjajevi kambris.

4. Pange kokku MIGROSKRIN-süsteem, mis on raam otste suunamiseks ja standardseks fikseerimiseks rakukultuuridega rangelt vertikaalses asendis etteantud kõrgusel 96-augulise kultiveerimisplaadi süvendi keskkoha kohal ning sisaldab ka 92 otsikut automaatne pipett USAst Costarilt (joonis 7.7).

Sisestage statiivi jalad plaadi nurgaaugudesse. Rakususpensioon võetakse automaatse pipetiga näpunäidetesse - 5 μl kummaski, loputatakse liigsetest rakkudest ühekordse söötmesse langetamisega ja sisestatakse vertikaalselt süsteemiraami pesadesse. Näpunäidetega täidetud riiulit hoitakse toatemperatuuril 1 tund rangelt horisontaalsel pinnal. Selle aja jooksul settivad suspensiooni rakud süvendite põhja, kus moodustuvad standardsed rakkude mikrokultuurid.

5. Otsikuriiul eemaldatakse plaadilt ettevaatlikult. Plaat, kus on rakkude mikrokultuur, asetatakse rangelt horisontaalsesse asendisse CO 2 inkubaatorisse, kus seda kultiveeritakse 20 tundi.Kasvatamise ajal rändavad rakud piki kaevu põhja.

6. Pärast inkubeerimist saadud tulemuste kvantitatiivne registreerimine viiakse läbi binokulaarse suurendusklaasiga, hinnates visuaalselt koloonia suurust okulaari sees oleval skaalal. Mikrokultuurid on ümmargused. Seejärel määravad teadlased kolooniate keskmise läbimõõdu kolooniate mõõtmiste põhjal 4 katse- või kontrollkaevus. Mõõtmisviga on ± 1 mm.

Migratsiooniindeks (MI) arvutatakse järgmise valemi abil:

Proovil on MYTH-aktiivsus, kui MI väärtused on võrdsed

Tavalise MYTH aktiivsuse ühiku (U) puhul võetakse vastastikune väärtus, mis võrdub proovi (proovi) suurima lahjenduse väärtusega, mille juures migratsiooniindeks on 0,6 ± 0,2.

FEO bioloogiline aktiivsusα hinnatakse selle tsütotoksilise toime järgi transformeeritud fibroblastide liinile L-929. Positiivse kontrollina kasutati rekombinantset TNFa -d ja negatiivse kontrollina söötmes olevaid rakke.

Arvutage tsütotoksiline indeks (CI):

kus a- kontrollrakkude elusrakkude arv; b- elusrakkude arv katses.

Riis. 7.7. MIGROSKRINi skeem - rakukultuuride migratsiooni kvantifitseerimise seadmed

Rakud värvitakse värvainega (metüleensinine), mis lisatakse ainult surnud rakkudesse.

Proovi vastastikuse lahjenduse väärtust, mis on vajalik 50% rakulise tsütotoksilisuse saamiseks, peetakse tavapäraseks TNF aktiivsuse ühikuks. Proovi eriaktiivsus - aktiivsuse suhe suvalistes ühikutes 1 ml ja proovis sisalduva valgu kontsentratsiooni vahel.

Rakusisene tsütokiinide värvimine. Erinevaid tsütokiine tootvate rakkude suhte muutus võib peegeldada haiguse patogeneesi ning olla haiguse prognoosi ja ravi hindamise kriteerium.

Rakusisese värvimise meetodil määratakse tsütokiini ekspressioon ühe raku tasemel. Voolutsütomeetria võimaldab teil loendada teatud tsütokiini ekspresseerivate rakkude arvu.

Loetleme rakusiseste tsütokiinide määramise peamised etapid.

Stimuleerimata rakud toodavad väikestes kogustes tsütokiine, mida reeglina ei ladestata; seetõttu on rakusiseste tsütokiinide hindamise oluline etapp lümfotsüütide stimuleerimine ja nende toodete rakkudest vabanemise blokeerimine.

Kõige sagedamini kasutatav tsütokiini indutseerija on proteiinkinaas C aktivaator phorbol-12-myristate-13-atsetaat (PMA) kombinatsioonis kaltsiumionofoorionomütsiiniga (IN). Sellise kombinatsiooni kasutamine põhjustab paljude tsütokiinide sünteesi: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. PMA-IN kasutamise puuduseks on probleem pärast CD4 molekulide tuvastamist lümfotsüütide pinnal pärast sellist aktiveerimist. Samuti indutseerivad mitogeenid (PHA) tsütokiinide tootmist T-lümfotsüütide poolt. B -rakud ja monotsüüdid stimuleerivad

Mononukleaarseid rakke inkubeeritakse 2-6 tundi tsütokiini tootmise indutseerijate ja nende rakusisese transpordi blokeerija, brefeldiin A või monensiini juuresolekul.

Seejärel resuspendeeritakse rakud puhverdatud soolalahuses. Fikseerimiseks lisatakse 2% formaldehüüdi, inkubeeritakse 10-15 minutit toatemperatuuril.

Seejärel töödeldakse rakke saponiiniga, mis suurendab rakumembraani läbilaskvust, ja värvitakse tuvastatud tsütokiinidele spetsiifiliste monoklonaalsete antikehadega. Pinna markerite (CD4, CD8) eelvärvimine suurendab raku kohta saadud teabe hulka ja võimaldab täpsemalt määrata selle populatsiooni identiteeti.

Eespool kirjeldatud meetodite rakendamisel on mõned piirangud. Niisiis on nende abiga võimatu analüüsida tsütokiinide sünteesi ühe raku poolt, on võimatu määrata tsütokiine tootvate rakkude arvu alampopulatsioonis, on võimatu kindlaks teha, kas tsütokiine tootvad rakud ekspresseerivad unikaalseid markereid, kas erinevaid tsütokiine sünteesivad erinevad rakud või samad rakud. Nendele küsimustele saab vastuse teiste uurimismeetodite abil. Tsütokiine tootvate rakkude esinemissageduse määramiseks populatsioonis kasutatakse lahjenduste piiramise meetodit ja ELISPOT ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi varianti (vt 4. peatükk).

In situ hübridisatsiooni meetod. Meetod sisaldab:

2) fikseerimine paraformaldehüüdiga;

3) mRNA tuvastamine märgistatud cDNA abil. Mõnel juhul määratakse tsütokiini mRNA lõikudel, kasutades radioisotoop -PCR -i.

Immunofluorestsents. Meetod sisaldab:

1) elundi külmutamine ja krüostaadi sektsioonide ettevalmistamine;

2) fikseerimine;

3) lõikude töötlemine fluorestseiiniga märgistatud tsütokiinivastaste antikehadega;

4) fluorestsentsi visuaalne vaatlus.

Need meetodid (hübridisatsioon kohapeal ja immunofluorestsents) on kiired ja ei sõltu eritatava toote lävikontsentratsioonidest. Kuid need ei kvantifitseeri sekreteeritud tsütokiini kogust ja võivad olla tehniliselt keerulised. Mittespetsiifiliste reaktsioonide suhtes on vaja mitmesugust hoolikat jälgimist.

Kasutades tsütokiinide hindamiseks esitatud meetodeid, tuvastati tsütokiinisüsteemi häiretega seotud patoloogilised protsessid erinevatel tasanditel.

Seega on tsütokiinisüsteemi hindamine organismi immuunsüsteemi seisundi iseloomustamiseks äärmiselt oluline. Tsütokiinisüsteemi erinevate tasemete uurimine annab teavet erinevat tüüpi immuunkompetentsete rakkude funktsionaalse aktiivsuse, põletikulise protsessi raskusastme, selle ülemineku kohta süsteemsel tasemel ja haiguse prognoosi kohta.

Küsimused ja ülesanded

1. Loetlege tsütokiinide üldised omadused.

2. Andke tsütokiinide klassifikatsioon.

3. Loetlege tsütokiinisüsteemi põhikomponendid.

4. Loetlege tsütokiine tootvad rakud.

5. Kirjeldage tsütokiini retseptorite perekondi.

6. Millised on tsütokiinivõrgu toimimise mehhanismid?

7. Rääkige meile tsütokiinide tootmisest kaasasündinud immuunsüsteemis.

8. Millised on peamised lähenemisviisid tsütokiinide süsteemi terviklikuks hindamiseks?

9. Millised on meetodid tsütokiinide testimiseks kehavedelikes?

10. Millised on tsütokiinisüsteemi defektid erinevate patoloogiate korral?

11. Millised on peamised IL-1, IFN, MIF, TNFa bioloogilise testimise meetodid bioloogilistes vedelikes?

12. Kirjeldage tsütokiinide rakusisese sisalduse määramise protsessi.

13. Kirjeldage ühe raku sekreteeritud tsütokiinide määramise protsessi.

14. Kirjeldage tsütokiini retseptori defekti avastamiseks kasutatud meetodite järjestust.

15. Kirjeldage meetodite järjestust, mida kasutatakse defekti avastamiseks tsütokiini tootvate rakkude tasemel.

16. Millist teavet on võimalik saada, uurides tsütokiinide tootmist mononukleaarsete rakkude kultuuris, vereseerumis?

Sissejuhatus

Üldine informatsioon

Tsütokiini klassifikatsioon

Tsütokiini retseptorid

Tsütokiinid ja immuunvastuse reguleerimine

Järeldus

Kirjandus

Sissejuhatus

Tsütokiinid on immuunsüsteemi üks olulisemaid osi. Immuunsüsteem vajab keharakkudest hoiatussüsteemi, nagu appihüüe. See on võib -olla tsütokiinide parim määratlus. Kui rakku kahjustab või mõjutab patogeenne organism, vabastavad makrofaagid ja kahjustatud rakud tsütokiine. See hõlmab selliseid tegureid nagu interleukiin, interferoon ja kasvaja nekroosifaktor alfa. Viimane tõestab ka, et kasvajakoe hävitamist kontrollib immuunsüsteem. Kui tsütokiinid vabanevad, kutsuvad nad esile spetsiifilisi immuunrakke, näiteks valgeid vereliblesid ning T- ja B -rakke.

Tsütokiinid annavad märku ka konkreetsest eesmärgist, mida need rakud peavad täitma. Tsütokiinid ja antikehad on täiesti erinevad, kuna antikehad on antigeenidega seotud, võimaldavad need immuunsüsteemil tuvastada võõrkehade sissetungi. Seega võib tuua analoogia: tsütokiinid on sissetungijate peamine häiresignaal ja antikehad on skaudid. Tsütokiinide analüüsiprotsessi nimetatakse tsütokiinide tuvastamiseks.

Üldine informatsioon

Tsütokiinid [kreeka. kytos - anum, siin - rakk ja kineo - liiguvad, indutseerivad] - suur ja mitmekesine rühm väikese suurusega (molekulmass 8–80 kDa) valgu vahendajaid - vahendaja molekule („sidevalgud“), mis osalevad rakkudevahelises signalisatsioonis valdavalt immuunsüsteemis.

Tsütokiinide hulka kuuluvad kasvaja nekroosifaktor, interferoonid, mitmed interleukiinid jne. Tsütokiine, mida sünteesivad lümfotsüüdid ning mis on proliferatsiooni ja diferentseerumise regulaatorid, eriti vereloomerakkude ja immuunsüsteemi rakkude puhul, nimetatakse lümfokiinideks.

Kõigil immuunsüsteemi rakkudel on teatud funktsioonid ja need toimivad selgelt koordineeritud koostoimes, mida pakuvad spetsiaalsed bioloogiliselt aktiivsed ained - tsütokiinid - immuunreaktsioonide regulaatorid. Tsütokiinid on spetsiifilised valgud, mille kaudu erinevad immuunsüsteemi rakud saavad omavahel teavet vahetada ja oma tegevust koordineerida.

Rakupinna retseptoreid - "tsütokiinikeskkonda" - mõjutavate tsütokiinide komplekt ja kogus esindavad interakteeruvate ja sageli muutuvate signaalide maatriksit. Need signaalid on keerukad, kuna on palju erinevaid tsütokiini retseptoreid ja asjaolu, et iga tsütokiin võib aktiveerida või pärssida mitmeid protsesse, sealhulgas oma sünteesi ja teiste tsütokiinide sünteesi, samuti tsütokiini retseptorite teket ja välimust. raku pinnal.

Rakkudevaheline signaalimine immuunsüsteemis toimub rakkude otsese kokkupuute või rakkudevahelise interaktsiooni vahendajate kaudu. Uurides immuunkompetentsete ja vereloomerakkude diferentseerumist, samuti rakkudevahelise interaktsiooni mehhanisme, mis moodustavad immuunvastuse, on suur ja mitmekesine valkude olemusega lahustuvate vahendajate rühm - rakkudevahelises signalisatsioonis osalevad vahendajamolekulid ("siduvad valgud") - tsütokiinid avastati.

Hormoonid jäetakse sellest kategooriast tavaliselt välja nende endokriinsete (mitte parakriinsete või autokriinsete) toimete tõttu. (vt Tsütokiinid: hormonaalse signaali edastamise mehhanismid). Koos hormoonide ja neurotransmitteritega moodustavad need keemilise signaalikeele aluse, mille abil reguleeritakse mitmerakulises organismis morfogeneesi ja kudede uuenemist.

Neil on keskne roll immuunvastuse positiivses ja negatiivses reguleerimises. Praeguseks on inimestel avastatud ja uuritud rohkem kui sada tsütokiini ühel või teisel määral, nagu eespool mainitud, ning pidevalt on teateid uute avastamisest. Mõne jaoks on saadud geneetiliselt muundatud analoogid. Tsütokiinid toimivad tsütokiini retseptorite aktiveerimise kaudu.

A. Interferoonid (IFN):

1. Looduslik IFN (1. põlvkond):

2. Rekombinantne IFN (2. põlvkond):

a) lühitoimeline:

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex jt.

(pegüleeritud IFN -id): peginterferoon

B. Interferooni indutseerijad (interferogeenid):

1... Sünteetiline- tsükloferoon, tiloron, dibasool ja jne.

2. Looduslik- ridostin jne.

V. Interleukiinid : rekombinantne interleukiin-2 (ronkoleukiin, aldesleukiin, proleukiin, ) , rekombinantne interleukiin 1-beeta (betaleukiin).

G. Kolooniaid stimuleerivad tegurid (molgramostim jne)

Peptiidipreparaadid

Tüümuse peptiidipreparaadid .

Peptiidühendid, mida toodab harknääre stimuleerida T-lümfotsüütide küpsemist(tümopoetiinid).

Esialgu alandatud väärtuste korral suurendavad tüüpiliste peptiidide preparaadid T-rakkude arvu ja nende funktsionaalset aktiivsust.

Esimese põlvkonna tüümusepreparaatide rajaja Venemaal oli Taktivin, mis on veiste harknäärest ekstraheeritud peptiidide kompleks. Ka tüümuse peptiidide kompleksi sisaldavad preparaadid hõlmavad Timalin, Timoptin ja teised ning tüümuseekstrakte sisaldavad - Timostimulin ja Vilozen.

Veiste tüümuse peptiidipreparaadid tümaliin, tümostimuliin süstitakse intramuskulaarselt ja taktivin, timoptin- naha alla, peamiselt ebapiisava rakulise immuunsusega:

T-immuunpuudulikkusega,

Viiruslikud infektsioonid

Infektsioonide ennetamiseks kasvajate kiiritus- ja keemiaravi ajal.

Esimese põlvkonna tüümusepreparaatide kliiniline efektiivsus on väljaspool kahtlust, kuid neil on üks puudus: need kujutavad endast bioloogiliselt aktiivsete peptiidide jagamatut segu, mida on üsna raske standardiseerida.

Edusammud tüümuse päritolu ravimite valdkonnas läksid teise ja kolmanda põlvkonna ravimite - looduslike tüümusehormoonide sünteetiliste analoogide või nende bioloogilise aktiivsusega fragmentide - loomise suunas.

Kaasaegne ravim Imunofan - immuunpuudulikkuse ja kasvajate korral kasutatakse heksapeptiidi, tümopoetiini aktiivse keskuse sünteetilist analoogi. Ravim stimuleerib immunokompetentsete rakkude poolt IL-2 moodustumist, suurendab lümfoidrakkude tundlikkust selle lümfokiini suhtes, vähendab TNF (tuumorinekroosifaktor) tootmist, omab reguleerivat toimet immuunsuse vahendajate (põletik) ja immunoglobuliinide tootmisele.

Luuüdi peptiidipreparaadid

Müelopiid saadud imetajate luuüdirakkude (vasikad, sead) kultuurist. Ravimi toimemehhanism on seotud B- ja T -rakkude proliferatsiooni ja funktsionaalse aktiivsuse stimuleerimisega.

Kehas peetakse selle ravimi sihtmärki B-lümfotsüüdid. Immuun- või vereloome halvenemise korral põhjustab müelopiidi sissetoomine luuüdi rakkude üldise mitootilise aktiivsuse suurenemist ja nende diferentseerumise suunda küpsete B-lümfotsüütide suunas.

Müelopiidi kasutatakse sekundaarsete immuunpuudulikkuse seisundite kompleksravis koos immuunsuse humoraalse lüli valdava kahjustusega, nakkuslike komplikatsioonide ennetamiseks pärast operatsiooni, traumat, osteomüeliiti, mittespetsiifiliste kopsuhaiguste, kroonilise püoderma korral. Ravimi kõrvaltoimed on pearinglus, nõrkus, iiveldus, hüperemia ja valulikkus süstekohal.

Kõik selle rühma ravimid on rasedatel vastunäidustatud, müelopiid ja imunofaan on vastunäidustatud ema ja loote vahelise Rh-konflikti korral.

Immunoglobuliini preparaadid

Inimese immunoglobuliinid

a) Immunoglobuliinid intramuskulaarseks manustamiseks

Mittespetsiifiline: inimese immunoglobuliin normaalne

Spetsiifiline: inimese immunoglobuliin B-hepatiidi vastu, inimese antistafülokokk-immunoglobuliin, inimese teetanuse immunoglobuliin, inimese immunoglobuliin puukentsefaliidi vastu, inimese immunoglobuliin marutaudiviiruse vastu jne.

b) Immunoglobuliinid intravenoosseks manustamiseks

Mittespetsiifiline: normaalne inimese immunoglobuliin intravenoosseks manustamiseks (gabriglobiin, immunoveniin, intraglobiin, humaglobiin)

Spetsiifiline: immunoglobuliin inimese B-hepatiidi vastu (neohepatect), pentaglobiin (sisaldab antibakteriaalset IgM, IgG, IgA), immunoglobuliin tsütomegaloviiruse vastu (tsütotekt), inimese immunoglobuliin puukentsefaliidi vastu, marutaudivastane IG jne.

c) Immunoglobuliinid suukaudseks manustamiseks: immunoglobuliini kompleksi preparaat (CIP) enteraalseks manustamiseks ägedate sooleinfektsioonide korral; rotaviirusevastane immunoglobuliin suukaudseks manustamiseks.

Heteroloogilised immunoglobuliinid:

marutaudi immunoglobuliin hobuse seerumist, antigangreenne polüvalentne hobuse seerum jne.

Esmase ja sekundaarse immuunpuudulikkuse korral kasutatakse mittespetsiifiliste immunoglobuliinide preparaate, spetsiifiliste immunoglobuliinide preparaate sobivate infektsioonide korral (ravi- või profülaktilistel eesmärkidel).

Tsütokiinid ja nende baasil valmistatud preparaadid

Arenenud immuunvastuse reguleerimist teostavad tsütokiinid - endogeensete immunoregulatoorsete molekulide kompleksne kompleks, mis on aluseks suure hulga looduslike ja rekombinantsete immunomoduleerivate ravimite loomisele.

Interferoonid (IFN):

1. Looduslik IFN (1. põlvkond):

Alfaferoonid: inimese leukotsüütide IFN jne

Betaferoonid: inimese fibroblast IFN ja teised.

2. Rekombinantne IFN (2. põlvkond):

a) lühitoimeline:

IFN a2a: reaferoon, viferon jne

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex jt.

b) pikaajaline toime(pegüleeritud IFN -id): peginterferoon (IFN a2b + polüetüleenglükool) jne.

IFN-ravimite peamine toime suund on T-lümfotsüüdid (looduslikud tapjarakud ja tsütotoksilised T-lümfotsüüdid).

Looduslikud interferoonid saadakse doonorivere leukotsüütide kultuuris (lümfoblastoidi ja teiste rakkude kultuuris) indutseeriva viiruse mõjul.

Rekombinantseid interferoone toodetakse geenitehnoloogia meetodil - kultiveerides bakteritüvesid, mis sisaldavad nende geneetilises aparaadis inimese interferooni geeni manustatud rekombinantset plasmiidi.

Interferoonidel on viirusevastane, kasvajavastane ja immunomoduleeriv toime.

Viirusevastaste ainetena on interferoonipreparaadid kõige tõhusamad herpeetiliste silmahaiguste (lokaalselt tilkade kujul, subkonjunktiivselt), nahal, limaskestadel ja suguelunditel paikneva herpes simplex, vöötohatise (lokaalselt hüdrogeelil põhineva) ravis. salv), äge ja krooniline B- ja C -viirushepatiit (parenteraalselt, rektaalselt suposiitides), gripi ja ägedate hingamisteede viirusnakkuste ravi ja ennetamine (intranasaalselt tilkade kujul). HIV -nakkuse korral normaliseerivad rekombinantsed interferoonipreparaadid immunoloogilisi parameetreid, vähendavad haiguse kulgu raskust enam kui 50% juhtudest ning põhjustavad vireemia taseme ja haiguse seerumimarkerite sisalduse vähenemist. AIDS -i korral viiakse läbi kombineeritud ravi asidotümidiiniga.

Interferoonipreparaatide kasvajavastane toime on seotud proliferatsioonivastase toimega ja looduslike tapjarakkude aktiivsuse stimuleerimisega. Kasvajavastaste ainetena kasutatakse IFN-alfa, IFN-alfa 2a, IFN-alfa-2b, IFN-alfa-n1, IFN-beeta.

IFN-beeta-lb kasutatakse immunomodulaatorina hulgiskleroosi korral.

Interferoonipreparaadid põhjustavad sarnast kõrvalmõjud... Iseloomustab gripilaadset sündroomi; muutused kesknärvisüsteemis: pearinglus, ähmane nägemine, segasus, depressioon, unetus, paresteesia, värin. Seedetraktist: isutus, iiveldus; kardiovaskulaarsüsteemi küljelt on võimalikud südamepuudulikkuse sümptomid; kuseteede süsteemist - proteinuuria; hematopoeetilise süsteemi poolt - mööduv leukopeenia. Samuti võib esineda lööve, sügelus, alopeetsia, ajutine impotentsus, ninaverejooks.

Interferooni indutseerijad (interferogeenid):

1. Sünteetiline - tsükloferoon, tiloron, poludan jne.

2. Looduslik - ridostin jne.

Interferooni indutseerijad on ravimid, mis suurendavad endogeense interferooni sünteesi. Nendel ravimitel on rekombinantsete interferoonide ees mitmeid eeliseid. Neil puudub antigeenne toime. Endogeense interferooni stimuleeritud süntees ei põhjusta hüperinterferoneemiat.

Tiloron(amiksiin) viitab madala molekulmassiga sünteetilistele ühenditele, on interferooni suukaudne indutseerija. Omab laia spektrit viirusevastast toimet DNA ja RNA viiruste vastu. Viirusevastase ja immunomoduleeriva ainena kasutatakse seda gripi, ägedate hingamisteede viirusnakkuste, hepatiit A ennetamiseks ja raviks, viirushepatiidi, herpes simplex (sh urogenitaalne) ja vöötohatise raviks, klamüüdiainfektsioonide kompleksravis, neuroviirus- ja nakkus-allergilised haigused, sekundaarse immuunpuudulikkusega. Ravim on hästi talutav. Võimalikud düspeptilised sümptomid, lühiajalised külmavärinad, suurenenud üldine toon, mis ei nõua ravimi katkestamist.

Poludan on polüadenüül- ja polüuridüülhapete biosünteetiline polüribonukleotiidkompleks (ekvimolaarsetes suhetes). Ravimil on väljendunud pärssiv toime herpes simplex viirustele. Seda kasutatakse silmatilkade ja süstidena konjunktiivi all. Ravim on ette nähtud täiskasvanutele viiruslike silmahaiguste raviks: herpeetiline ja adenoviiruslik konjunktiviit, keratokonjunktiviit, keratiit ja keratoiridotsükliit (keratouveiit), iridotsükliit, korioretiniit, optiline neuriit.

Kõrvalmõjud esinevad harva ja avalduvad allergiliste reaktsioonide tekkega: sügelus ja võõrkeha tunne silmas.

Cycloferon- madala molekulmassiga interferooni indutseerija. Sellel on viirusevastane, immunomoduleeriv ja põletikuvastane toime. Cycloferon on efektiivne puukentsefaliidi viiruste, herpese, tsütomegaloviiruse, HIV jne vastu. Sellel on klamüüdiavastane toime. Tõhus sidekoe süsteemsete haiguste korral. Ravimi radioprotektiivne ja põletikuvastane toime on kindlaks tehtud.

Arbidol on ette nähtud sisemiselt gripi ja teiste ägedate hingamisteede viirusnakkuste, samuti herpeshaiguste ennetamiseks ja raviks.

Interleukiinid:

rekombinantne IL-2 (aldesleukiin, proleukiin, ronkoleukiin ) , rekombinantne IL-1-beeta ( betaleukiin).

Loodusliku päritoluga tsütokiinipreparaate, mis sisaldavad üsna suurt põletiku tsütokiinide komplekti ja immuunvastuse esimest faasi, iseloomustab mitmekülgne mõju inimkehale. Need ravimid toimivad rakkudes, mis on seotud põletiku, regeneratsiooni ja immuunvastusega.

Aldesleukin- IL-2 rekombinantne analoog. Sellel on immunomoduleeriv ja kasvajavastane toime. Aktiveerib rakulise immuunsuse. Suurendab T-lümfotsüütide ja IL-2-sõltuvate rakupopulatsioonide proliferatsiooni. Suurendab kasvajarakke ära tundvate ja hävitavate lümfotsüütide ja tapjarakkude tsütotoksilisust. Parandab gamma-interferooni, TNF, IL-1 tootmist. Seda kasutatakse neeruvähi korral.

Betaleukiin- inimese rekombinantne IL-1 beeta. Stimuleerib leukopoeesi ja immuunsüsteemi kaitset. Seda manustatakse naha alla või intravenoosselt immuunpuudulikkusega mädaste protsesside korral, keemiaravi tagajärjel tekkinud leukopeenia, kasvajate korral.

Roncoleukin- interleukiin-2 rekombinantset preparaati manustatakse intravenoosselt immuunpuudulikkusega sepsise ja neeruvähi korral.

Kolooniaid stimuleerivad tegurid:

Molgramostim(Leukomax) on inimese granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. Stimuleerib leukopoeesi, omab immunotroopset toimet. See suurendab prekursorite proliferatsiooni ja diferentseerumist, suurendab küpsete rakkude sisaldust perifeerses veres, granulotsüütide, monotsüütide, makrofaagide kasvu. Suurendab küpsete neutrofiilide funktsionaalset aktiivsust, suurendab fagotsütoosi ja oksüdatiivset metabolismi, pakkudes fagotsütoosi mehhanisme, suurendab tsütotoksilisust pahaloomuliste rakkude suhtes.

Filgrastim(Neupogen) on inimese granulotsüütide kolooniat stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. Filgrastiim reguleerib neutrofiilide tootmist ja nende sisenemist verre luuüdist.

Lenograstim- inimese granulotsüütide kolooniat stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. See on kõrgelt rafineeritud valk. See on leukopoeesi immunomodulaator ja stimulaator.

Sünteetilised immunostimulaatorid: levamisool, isoprinosiinpolüoksidoonium, galavit.

Levamisool(decaris), imidasooli derivaati, kasutatakse immunostimulaatorina, samuti askariaasi antihelmintikumina. Levamisooli immunostimuleerivad omadused on seotud makrofaagide ja T-lümfotsüütide aktiivsuse suurenemisega.

Levamisooli määratakse suu kaudu korduvate herpesinfektsioonide, kroonilise viirushepatiidi, autoimmuunhaiguste (reumatoidartriit, süsteemne erütematoosne luupus, Crohni tõbi) korral. Ravimit kasutatakse ka jämesoole kasvajate korral pärast kasvajate kirurgilist, kiiritus- või ravimteraapiat.

Isoprinosiin- preparaat, mis sisaldab inosiini. Stimuleerib makrofaagide aktiivsust, interleukiinide tootmist, T-lümfotsüütide proliferatsiooni.

Määrake seest viirusnakkuste, hingamisteede ja kuseteede krooniliste infektsioonide, immuunpuudulikkuse korral.

Polüoksüdoonium- sünteetiline vees lahustuv polümeerühend. Ravimil on immunostimuleeriv ja detoksifitseeriv toime, suurendab organismi immuunsust kohalike ja üldiste infektsioonide vastu. Polüoksidoonium aktiveerib kõik loodusliku resistentsuse tegurid: monotsüütilise-makrofaagisüsteemi rakud, neutrofiilid ja looduslikud tapjarakud, suurendades nende funktsionaalset aktiivsust algselt vähendatud kiirusega.

Galavit- ftalhüdrasiidi derivaat. Selle ravimi eripära seisneb mitte ainult immunomoduleerivate, vaid ka väljendunud põletikuvastaste omaduste olemasolus.

Teiste farmakoloogiliste klasside ravimid, millel on immunostimuleeriv toime

1. Adaptogeenid ja taimsed preparaadid (fütopreparaadid): echinacea (immunal), eleutherococcus, ženšenn, rodiola rosea jne preparaadid.

2. Vitamiinid: askorbiinhape (C -vitamiin), tokoferoolatsetaat (E -vitamiin), retinoolatsetaat (A -vitamiin) (vt lõik "Vitamiinid").

Echinacea preparaadid neil on põletikuvastane ja immunostimuleeriv toime. Suukaudsel manustamisel suurendavad need ravimid makrofaagide ja neutrofiilide fagotsüütilist aktiivsust, stimuleerivad interleukiin-1 tootmist, T-abistajate aktiivsust ja B-lümfotsüütide diferentseerumist.

Echinacea preparaate kasutatakse immuunpuudulikkuse ja krooniliste põletikuliste haiguste korral. Eriti, immuunne on ette nähtud suu kaudu tilkadeks ägedate hingamisteede infektsioonide ennetamiseks ja raviks, samuti koos antibakteriaalsete ainetega naha, hingamisteede ja kuseteede infektsioonide korral.

Immunostimulantide kasutamise üldpõhimõtted sekundaarse immuunpuudulikkusega patsientidel

Immunostimulantide kõige mõistlikum kasutamine tundub olevat immuunpuudulikkuse korral, mis väljendub suurenenud nakkuslikus haigestumuses. Immunostimuleerivate ravimite peamine sihtmärk on jätkuvalt sekundaarsed immuunpuudulikkused, mis avalduvad sagedaste korduvate, raskesti ravitavate nakkuslike ja põletikuliste haiguste all, mis on lokaliseeritud ja mis tahes etioloogiaga. Iga kroonilise nakkusliku ja põletikulise protsessi keskmes on muutused immuunsüsteemis, mis on üks selle protsessi püsimise põhjusi.

· Immunomodulaatoreid määratakse kompleksravis samaaegselt antibiootikumide, seene-, algloomavastaste või viirusevastaste ainetega.

· Immunorehabilitatsioonimeetmete läbiviimisel, eriti puuduliku taastumise korral pärast ägedat nakkushaigust, võib monoteraapiana kasutada immunomodulaatoreid.

· Immunomodulaatoreid on soovitav kasutada immunoloogilise jälgimise taustal, mis tuleks läbi viia sõltumata esialgsete muutuste olemasolust või puudumisest immuunsüsteemis.

· Immuunsuse fagotsüütilisele seosele toimivaid immunomodulaatoreid võib määrata patsientidele, kellel on nii tuvastatud kui ka avastamata immuunsüsteemi seisundi häired, s.t. nende kasutamise aluseks on kliiniline pilt.

Immuunsuse parameetrite vähenemine, mis ilmnes praktiliselt terve inimese immunodiagnostilise uuringu käigus, mitte tingimata on immunomoduleeriva ravi määramise aluseks.

Kontrollküsimused:

1. Mis on immunostimulandid, millised on näidustused immunoteraapiaks, millist tüüpi immuunpuudulikkuse seisundid on jagatud?

2. Immunomodulaatorite klassifitseerimine vastavalt tegevuse eelistatud selektiivsusele?

3. Mikroobse päritoluga immunostimulandid ja nende sünteetilised analoogid, nende farmakoloogilised omadused, kasutusnäidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

4. Endogeensed immunostimulandid ja nende sünteetilised analoogid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused kasutamiseks, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

5. Tüümuse ja luuüdi peptiidide preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, kasutusnäidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

6. Immunoglobuliinide ja interferoonide (IFN) preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, kasutusnäidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

7. Interferooni indutseerijate (interferonogeenide) preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, kasutusnäidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

8. Interleukiinide ja kolooniaid stimuleerivate tegurite preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, kasutamise näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

9. Sünteetilised immunostimulandid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused kasutamiseks, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

10. Teiste farmakoloogiliste klasside ravimid, millel on immunostimuleeriv toime ja immunostimulantide kasutamise üldpõhimõtted sekundaarse immuunpuudulikkusega patsientidel?