Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

PCR -meetodi olemus. DNA polümeraas

Polümeraasi ahelreaktsioon on molekulaarbioloogia eksperimentaalne meetod, mis võimaldab oluliselt suurendada teatud nukleiinhappefragmentide väikseid kontsentratsioone bioloogilises materjalis. Seda DNA koopiate arvu suurendamise protsessi nimetatakse võimendus... DNA kopeerimist PCR ajal teostab spetsiaalne ensüüm - polümeraas. DNA polümeraas (joonis 3) on ensüüm, mis osaleb DNA replikatsioonis (DNA amplifikatsioon elusorganismides). Selle klassi ensüümid katalüüsivad desoksüribonukleotiidide polümerisatsiooni piki DNA nukleotiidiahelat, mida ensüüm "loeb" ja kasutab mallina. Uue nukleotiidi tüüp määratakse vastavalt komplementariteedi põhimõttele malliga, millest see loetakse.

DNA polümeraas lisab kokkupandud ahela 3 "otsa vabad nukleotiidid. See viib ahela pikenemiseni 5" -3 "suunas. Ükski teadaolev DNA polümeraas ei saa ahelat nullist luua: nad saavad lisada ainult nukleotiide juba olemasolev 3 "-hüdroksüülrühm. Sel põhjusel vajab DNA polümeraas praimer- lühike nukleotiidide järjestus (tavaliselt 20–25), mis täiendavad uuritava geeni otsi - millele ta saaks lisada esimese nukleotiidi. Praimerid koosnevad alati DNA ja RNA alustest, kaks esimest alust on alati RNA alused. Praimereid sünteesib teine ensüüm - primazoy... Teine ensüüm - helikaas-on vajalik DNA kahekordse spiraali lahti kerimiseks üheahelalise struktuuri moodustamisega, mis tagab mõlema ahela replikatsiooni vastavalt poolkonserveeritud DNA replikatsioonimudelile.

Mõnel DNA polümeraasil on ka võimalus parandada vigu äsja kokkupandud DNA ahelas. Kui tuvastatakse vale nukleotiidipaar, rullitakse DNA polümeraas ühe sammu võrra tagasi, jäetakse vale nukleotiid ahelast välja, seejärel sisestatakse selle asemele õige nukleotiid, mille järel replikatsioon jätkub nagu tavaliselt.

PCR läbiviimine

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on DNA amplifikatsioonimeetod, mille abil saab mõne tunni jooksul eraldada spetsiifilise DNA järjestuse ja korrutada miljardeid kordi. Võimalus saada tohutul hulgal koopiaid genoomi ühest rangelt määratletud piirkonnast lihtsustab oluliselt olemasoleva DNA proovi uurimist.

Polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks tuleb täita mitmeid tingimusi. PCR -i teostamiseks kõige lihtsamal juhul on vaja järgmisi komponente:

DNA mall, mis sisaldab amplifitseeritavat DNA piirkonda.

Kaks praimerit, mis täiendavad soovitud fragmendi otsi. (Paar kunstlikult sünteesitud oligonukleotiidi, tavaliselt 15 kuni 30 aluspaari suurused, on identsed siht -DNA vastavate piirkondadega. Neil on võtmeroll amplifikatsioonireaktsiooni produktide moodustumisel. Õigesti valitud praimerid tagavad spetsiifilisuse ja tundlikkuse katsesüsteem.)

Termostabiilne DNA polümeraas. PCR -is kasutatav polümeraas peab pikka aega kõrgel temperatuuril aktiivseks jääma, seetõttu kasutatakse termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus aquaticus (Taq polümeraas) jt.

Deoksünukleotiidtrifosfaadid (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polümeraasi toimimiseks on vaja Mg 2+ ioone.

Puhverlahus, mis tagab vajalikud reaktsioonitingimused - pH, lahuse ioontugevus. Sisaldab sooli, seerumi albumiini.

Reaktsioonisegu aurustumise vältimiseks lisatakse katseklaasi kõrge keemistemperatuuriga õli, näiteks vaseliin. Kui kasutate kuumutatud kaanega seadet, pole see vajalik.

Pürofosfataasi lisamine võib suurendada PCR reaktsiooni saagist. See ensüüm katalüüsib pürofosfaadi hüdrolüüsi, mis on kõrvalsaadus nukleotiidtrifosfaatide lisamisel kasvavale DNA ahelale, ortofosfaadiks. Pürofosfaat võib inhibeerida PCR reaktsiooni.

Algse DNA koopiate arvu korrutamiseks on vaja tsüklilist reaktsiooni. Tavaliselt koosneb iga järjestikku korduv PCR tsükkel kolmest etapist:

1... DNA denatureerimine või "sulamine". Kaheahelalist DNA matriiti kuumutatakse temperatuuril 94–96 ° C (või kuni 98 ° C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5–2 minutit, et võimaldada DNA ahelate eraldumist. Seda etappi nimetatakse denatureerimiseks, kuna kahe DNA ahela vesiniksidemed hävitatakse. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) kuumutatakse reaktsioonisegu 2–5 minutit, et matriits ja praimerid täielikult denatureerida. Seda tehnikat nimetatakse kuum algus, see võimaldab vähendada mittespetsiifiliste reaktsioonisaaduste hulka.

2. Lõõmutamine - praimerite sidumine matriitsi DNA -ga... Kui ahelad on lahknenud, alandatakse temperatuuri aeglaselt, et parimad saaksid üheahelalise maatriksiga seonduda. Lõõmutustemperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt 50-65 ° C. Etapi kestus - 20-60 sekundit. Lõõmutustemperatuuri vale valik põhjustab praimerite halva seondumise matriitsiga (kõrgel temperatuuril) või vales kohas seondumise ja mittespetsiifiliste toodete ilmnemise (madalatel temperatuuridel).

3. Süntees (ahela pikenemine). DNA polümeraas kordab matriitsi ahelat, kasutades praimerit "seemnena". Polümeraas alustab teise ahela sünteesi praimeri 3' -otsast, mis seondub matriitsiga ja liigub mööda malli. Pikenemistemperatuur sõltub polümeraasist. Sageli kasutatavad Taq ja Pfu polümeraasid on kõige aktiivsemad temperatuuril 72 ° C. Sünteesiaeg sõltub DNA polümeraasi tüübist ja amplifitseeritava fragmendi pikkusest Tavaliselt arvestatakse pikenemisaega ühe minutiga iga tuhande aluspaari kohta. Pärast kõigi tsüklite lõppu tehakse sageli täiendav samm läbi viidud lõplik pikenemine et lõpetada kõik üheahelalised fragmendid. See etapp kestab 7 kuni 10 minutit.

Seejärel korratakse denatureerimise, lõõmutamise ja pikenemise etappe mitu korda (30 või enam korda). Igas tsüklis kahekordistub DNA fragmendi sünteesitud koopiate arv.

Kõik reaktsioonid viiakse läbi termostaati sukeldatud katseklaasides. Temperatuuri režiimi muudetakse ja hoitakse automaatselt.

Et täpselt mõista, kuidas teatud DNA segmendi amplifikatsioon PCR -i ajal toimub, on vaja selgelt ette kujutada kõigi praimerite ja nende komplementaarsete järjestuste positsiooni amplifitseeritud ahelates igas voorus. Esimeses voorus on iga äsja sünteesitud ahel palju pikem kui selle praimeri 3'-hüdroksüülrühma kaugus teise praimeriga komplementaarse järjestuse terminaalsest nukleotiidist. Selliseid ahelaid nimetatakse "pikkadeks mallideks" kasutatakse edasiseks sünteesiks.

Teises voorus denatureeritakse uuesti kaheahelaline DNA, mis koosneb sarnastest ja äsja sünteesitud (pika matriitsi) ahelatest ning lõõmutatakse seejärel praimeritega. Selle vooru sünteesi käigus sünteesitakse uuesti "pikki malle", samuti mitmeid ahelaid, mille ühes otsas on praimer ja teises järjestusega, mis täiendab teist praimerit ("lühikesed mallid"). Kolmanda vooru ajal denatureeritakse ja lõõmutatakse praimeritega kõik eelnevalt moodustatud heterodupleksid ja seejärel replitseeritakse. Järgnevates voorudes muutub "lühikeste maatriksite" arv üha suuremaks ja 30. vooruks ületab nende arv juba 10 6 korda originaalkettide või "pikkade maatriksite" arvu.

Spetsiifilise reaktsiooniprodukti kogus (piiratud praimeritega) suureneb teoreetiliselt proportsionaalselt 2 n -ga, kus n on reaktsioonitsüklite arv. Tegelikult võib iga tsükli efektiivsus olla alla 100%, nii et tegelikult:

kus P on toote kogus, E on tsükli keskmine efektiivsus.

Ka "pikkade" DNA koopiate arv kasvab, kuid lineaarselt; seetõttu domineerib reaktsioonisaadustes spetsiifiline fragment. Vajaliku toote kasvu piiravad eksponentsiaalselt reaktiivide hulk, inhibiitorite olemasolu ja kõrvalsaaduste teke.

PCR on ülitundlik meetod, seega kui katseproovis on isegi ebaoluline kogus DNA -d, mis sattus kogemata ühest reaktsioonisegust teise, võib saada valepositiivseid tulemusi. Seetõttu on vaja hoolikalt jälgida kõiki PCR -is kasutatavaid lahendusi ja riistu.

Praimeri valiku põhiprintsiibid.

PCR -testisüsteemi loomisel on üheks peamiseks ülesandeks praimerite õige valik, mis peab vastama mitmele kriteeriumile:

1. Praimerid peavad olema spetsiifilised. Erilist tähelepanu pööratakse praimerite 3 'otsale, sest just nendest hakkab kogunema komplementaarset DNA ahelat Taq polümeraas. Kui nende spetsiifilisus on ebapiisav, siis on tõenäoline, et katseklaasis tekivad soovimatud protsessid reaktsioonisegu, nimelt mittespetsiifilise DNA süntees (lühikesed või pikad fragmendid). See on elektroforeesil nähtav raskete või kergete lisaribade kujul. See häirib reaktsiooni tulemuste hindamist, sest seda on lihtne segi ajada spetsiifiline võimendustoode koos sünteesitud kõrvalise DNA -ga, tundlikkuse olulise kadumiseni.

2. Praimerid ei tohiks moodustada dimeere ja silmuseid; praimerite enda või üksteise lõõmutamise tulemusena ei tohiks tekkida stabiilseid topeltkette.

Mis võimaldab teil bioloogilises materjalis tuvastada väikeseid koguseid täpsemalt selle teatud fragmente ja neid mitu korda korrutada. Seejärel tuvastatakse need visuaalselt geelelektroforeesi abil. Reaktsiooni töötas 1983. aastal välja K. Mullis ja see on kantud viimaste aastate silmapaistvate avastuste nimekirja.

Millised on PCR mehhanismid?

Kogu tehnika põhineb nukleiinhapete võimel iseseisvalt kopeerida, mis sel juhul viiakse laboris kunstlikult läbi. DNA paljunemine võib alata mitte üheski molekuli piirkonnas, vaid ainult teatud nukleotiidide järjestusega piirkondades - lähtefragmentides. Polümeraasi ahelreaktsiooni käivitamiseks on vaja praimereid (või DNA sonde). Need on DNA nukleotiidjärjestusega lühikesed fragmendid. Need täiendavad (st vastavad) lähtekohtadele

Loomulikult peavad teadlased praimerite loomiseks uurima tehnikaga seotud nukleotiidjärjestust. Just need DNA sondid annavad reaktsiooni ja selle käivitamise spetsiifilisuse. ei tööta, kui proov ei sisalda vähemalt ühte soovitud DNA molekuli. Üldiselt vajab reaktsioon ülaltoodud praimereid, nukleotiidide komplekti ja kuumuskindlat DNA polümeraasi. Viimane on ensüüm - katalüsaator uute nukleiinhappe molekulide sünteesiks proovi põhjal. Kõik need ained, sealhulgas bioloogiline materjal, milles on vaja DNA tuvastada, ühendatakse reaktsiooniseguks (lahuseks). See asetatakse spetsiaalsesse termostaati, mis kuumeneb ja jahtub väga kiiresti teatud aja jooksul - tsükli jooksul. Tavaliselt on neid 30-50.

Kuidas see reaktsioon kulgeb?

Selle olemus on see, et ühe tsükli jooksul kinnitatakse praimerid soovitud DNA sektsioonide külge, mille järel see kahekordistub ensüümi toimel. Saadud DNA ahelate põhjal sünteesitakse järgmistes tsüklites molekuli uued ja uued identsed fragmendid.

Polümeraasi ahelreaktsioon toimub järjestikku, eristatakse selle järgmisi etappe. Esimest iseloomustab toote koguse kahekordistumine iga kütte- ja jahutustsükli jooksul. Teises etapis reaktsioon aeglustub, kuna ensüüm on kahjustatud ja kaotab ka aktiivsuse. Lisaks on ammendumas nukleotiidide ja praimerite varud. Viimasel etapil - platool - tooted enam ei kogune, kuna reaktiivid on otsa saanud.

Kus seda kasutatakse

Kahtlemata on polümeraasi ahelreaktsiooni kõige laiem rakendus meditsiinis ja teaduses. Seda kasutatakse üld- ja erabioloogias, veterinaarmeditsiinis, farmaatsias ja isegi ökoloogias. Veelgi enam, viimases tehakse seda toidu ja esemete kvaliteedi jälgimiseks väliskeskkonnas. Polümeraasi ahelreaktsiooni kasutatakse kohtuekspertiisi praktikas isaduse kinnitamiseks ja isiku isiksuse tuvastamiseks. Kohtuarstlikul läbivaatusel ja ka paleontoloogias on see meetod sageli ainus väljapääs, sest tavaliselt on uurimiseks saadaval äärmiselt väike kogus DNA -d. Muidugi on meetod leidnud praktilises meditsiinis väga laialdast rakendust. Seda on vaja sellistes valdkondades nagu geneetika, nakkus- ja onkoloogilised haigused.

Siiski jäi see idee toona taotlemata. Polümeraasi ahelreaktsiooni avastas uuesti 1983. aastal Carey Mallis. Tema eesmärk oli luua meetod, mis võimaldaks DNA amplifitseerimist algse DNA molekuli mitme järjestikuse dubleerimise käigus, kasutades DNA polümeraasi ensüümi. Seitse aastat pärast selle idee avaldamist, 1993. aastal, sai Mullis selle eest Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise alguses oli pärast iga kuumutamise -jahutamise tsüklit vaja lisada reaktsioonisegule DNA polümeraasi, kuna see inaktiveeriti kiiresti kõrgel temperatuuril, mis oli vajalik DNA heeliksi ahelate eraldamiseks. Protseduur oli väga ebaefektiivne ning nõudis palju aega ja ensüüme. 1986. aastal parandati seda oluliselt. Tehti ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Leiti, et need ensüümid on termiliselt stabiilsed ja taluvad mitmeid reaktsioonitsükleid. Nende kasutamine võimaldas PCR -i lihtsustada ja automatiseerida. Üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase eraldati bakteritest Thermus aquaticus ja nimega Taq-polümeraas. Selle polümeraasi puuduseks on see, et eksliku nukleotiidi sisestamise tõenäosus on üsna suur, kuna sellel ensüümil puuduvad veaparandusmehhanismid (3 "→ 5" eksonukleaasi aktiivsus). Polümeraas Pfu ja Pwo arheidest eraldatud omavad sellist mehhanismi, vähendab nende kasutamine oluliselt DNA mutatsioonide arvu, kuid nende töö kiirus (protsessiivsus) on madalam kui Taq... Nüüd kasutatakse segusid Taq ja Pfu nii suure polümerisatsioonikiiruse kui ka suure kopeerimistäpsuse saavutamiseks.

Meetodi leiutamise ajal töötas Mallis ettevõttes Cetus Corporation, mis patenteeris PCR -meetodi. 1992. aastal müüs Cetus meetodi ja patendi kasutusõigused Taq-polümeraas ettevõttelt Hoffmann-La Roche 300 miljoni dollari eest. Siiski selgus, et Taq-polümeraasi iseloomustas 1980. aastal vene biokeemik Aleksei Kaledin, millega seoses üritas ettevõte Promega (Promega) sundida Roche'i kohtus selle ensüümi ainuõigustest loobuma. USA patent PCR -meetodile lõppes 2005. aasta märtsis.

PCR läbiviimine

Meetod põhineb konkreetse DNA piirkonna mitmel selektiivsel kopeerimisel, kasutades ensüüme kunstlikes tingimustes ( in vitro). Sel juhul kopeeritakse ainult jaotis, mis vastab kindlaksmääratud tingimustele, ja ainult siis, kui see on uuritavas valimis olemas. Erinevalt DNA amplifikatsioonist elusorganismides (replikatsioon) amplifitseeritakse PCR abil suhteliselt lühikesi DNA osi. Tavalises PCR -protsessis ei kopeeritud DNA piirkondade pikkus üle 3000 aluspaari (3 kbp). Kasutades erinevate polümeraaside segu, lisaaineid ja teatud tingimustel, võib PCR fragmendi pikkus ulatuda 20-40 tuhande aluspaarini. See on ikka oluliselt väiksem kui eukarüootse raku kromosomaalse DNA pikkus. Näiteks koosneb inimese genoom ligikaudu 3 miljardist aluspaarist.

Reaktsiooni komponendid

PCR -i teostamiseks kõige lihtsamal juhul on vaja järgmisi komponente:

DNA maatriks sisaldab seda DNA osa, mida soovite võimendada.
Kaks praimerit komplementaarne soovitud DNA fragmendi erinevate ahelate vastupidiste otstega.
Termostabiilne DNA polümeraas- ensüüm, mis katalüüsib DNA polümerisatsioonireaktsiooni. PCR -is kasutatav polümeraas peab pikka aega säilitama aktiivsuse kõrgel temperatuuril, seetõttu kasutatakse termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus aquaticus(Taq polümeraas), Pyrococcus furiosus(Pfu polümeraas), Pyrococcus woesei(Pwo-polümeraas) jt.
Deoksünukleosiidi trifosfaadid(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Polümeraasi toimimiseks on vaja Mg 2+ ioone.
Puhverlahus vajalike reaktsioonitingimuste tagamine - pH, lahuse ioontugevus. Sisaldab sooli, veise seerumi albumiini.

Reaktsioonisegu aurustumise vältimiseks lisatakse katseklaasi kõrge keemistemperatuuriga õli, näiteks vaseliin. See pole vajalik, kui kasutatakse kuumutatud kaanega termotsüklit.

Praimerid

PCR spetsiifilisus põhineb matriitsi ja praimerite, lühikeste 18-30 aluse sünteetiliste oligonukleotiidide vaheliste komplementaarsete komplekside moodustumisel. Kõik praimerid täiendavad kaheahelalise malli ühte ahelat ja piiravad amplifitseeritud piirkonna algust ja lõppu.

Pärast matriitsi hübridiseerimist praimeriga (lõõmutamine) toimib viimane DNA polümeraasi praimerina matriitsi komplementaarse ahela sünteesis (vt.).

Praimerite kõige olulisem omadus on praimeri-matriitsi kompleksi sulamistemperatuur (T m). T m on temperatuur, mille juures pooled DNA matriitsid moodustavad kompleksi oligonukleotiidpraimeriga. Sulamistemperatuuri saab ligikaudselt määrata valemiga, kus n X on X nukleotiidide arv praimeris. Praimeri pikkuse ja nukleotiidkoostise või lõõmutustemperatuuri vale valiku korral on võimalik osaliselt komplementaarsete komplekside moodustumine teiste DNA malli piirkondadega, mis võib põhjustada mittespetsiifiliste toodete ilmnemist. Sulamistemperatuuri ülempiiri piirab polümeraasi toimimise optimaalne temperatuur, mille aktiivsus väheneb temperatuuril üle 80 ° C.

Praimerite valimisel on soovitatav järgida järgmisi kriteeriume:

Võimendi

Riis. 1: PCR võimendi

PCR viiakse läbi võimendis - seadmes, mis tagab torude perioodilise jahutamise ja kuumutamise, tavaliselt vähemalt 0,1 ° C täpsusega. Kaasaegsed võimendid võimaldavad teil seadistada keerukaid programme, sealhulgas "kuumkäivituse", Touchdown PCR -i (vt allpool) ja võimendatud molekulide järgnevat ladustamist temperatuuril 4 ° C. Reaalajas PCR-i jaoks toodetakse fluorestsentsdetektoriga varustatud seadmeid. Automaatsete süsteemidega integreerimiseks on olemas ka automaatse kaanega ja mikroplaadipesaga instrumendid.

Reaktsiooni edenemine

Foto geelist, mis sisaldab marker -DNA -d (1) ja PCR -reaktsiooniprodukte (2,3). Numbrid näitavad DNA fragmentide pikkust nukleotiidipaarides

Tavaliselt viiakse PCR-i läbiviimisel läbi 20-35 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist (joonis 2).

Denaturatsioon

Kaheahelalist DNA matriiti kuumutatakse temperatuuril 94-96 ° C (või 98 ° C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5-2 minutit, et võimaldada DNA ahelate eraldumist. Seda etappi nimetatakse denatureerimine, kuna kahe DNA ahela vesiniksidemed hävitatakse. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) kuumutatakse reaktsioonisegu 2-5 minutit. malli ja praimerite täielikuks denatureerimiseks. Seda tehnikat nimetatakse kuum algus, see võimaldab vähendada mittespetsiifiliste reaktsioonisaaduste hulka.

Lõõmutamine

Kui kiud on hajutatud, alandatakse temperatuuri nii, et praimerid saaksid üheahelalise matriitsiga seonduda. Seda etappi nimetatakse lõõmutamine... Lõõmutustemperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt 4-5 ° C alla nende sulamistemperatuuri. Etapi kestus - 0,5-2 minutit. Lõõmutustemperatuuri vale valik põhjustab praimerite halva seondumise matriitsiga (kõrgel temperatuuril) või vales kohas seondumise ja mittespetsiifiliste toodete ilmnemise (madalatel temperatuuridel).

Pikenemine

PCR -i sordid

"Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - kasutatakse reaktsiooni kõrvalsaaduste arvu vähendamiseks. Kasutatakse kahte paari praimereid ja viiakse läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine paar praimerit võimendab esimese reaktsiooni produktis olevat DNA lõiku.
"Pöörd" PCR (Inverse PCR (eng.)) - kasutatakse juhul, kui soovitud järjestuses on teada vaid väike ala. See meetod on eriti kasulik, kui pärast DNA genoomi sisestamist on vaja kindlaks teha külgnevad järjestused. Pööratud PCR -i läbiviimiseks tehakse reas restriktsioonendonukleaasidega DNA lõikamine, millele järgneb fragmentide ühendamine (ligeerimine). Selle tulemusena ilmuvad teadaolevad fragmendid tundmatu piirkonna mõlemasse otsa, pärast mida saab PCR -i teha nagu tavaliselt.
Pöördtranskriptsiooni PCR-i (RT-PCR) kasutatakse RNA raamatukogust tuntud järjestuse võimendamiseks, eraldamiseks või identifitseerimiseks. Enne tavapärast PCR-i sünteesitakse mRNA matriitsil pöördtranskriptaasi abil üheahelaline DNA molekul ja saadakse üheahelaline cDNA, mida kasutatakse PCR-i mallina. Seda meetodit kasutatakse sageli nende geenide ekspresseerimise määramiseks.
Asümmeetriline PCR (rus. Asümmeetriline PCR) - teostatakse siis, kui on vaja amplifitseerida peamiselt ühte algse DNA ahelat. Kasutatakse mõnes sekveneerimis- ja hübridisatsioonianalüüsi tehnikas. PCR viiakse läbi nagu tavaliselt, välja arvatud see, et üks praimeritest võetakse suures koguses.
Kvantitatiivset PCR-i (Q-PCR) kasutatakse konkreetse DNA, cDNA või RNA koguse kiireks mõõtmiseks proovis.
Kvantitatiivne reaalajas PCR - see meetod kasutab fluorestsentsmärgistatud reaktiive, et täpselt mõõta reaktsiooniprodukti kogunemist.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - selle meetodiga väheneb mittespetsiifilise praimeri seondumise mõju toote moodustumisele. Esimesed tsüklid viiakse läbi temperatuuril, mis ületab lõõmutamistemperatuuri, seejärel vähendatakse temperatuuri iga paari tsükli järel. Teatud temperatuuril läbib süsteem DNA praimerite optimaalse spetsiifilisuse riba.
Molekulaarse koloonia meetod (geel -PCR) Polony - PCR koloonia) - akrüülamiidgeel polümeriseeritakse kõigi PCR komponentidega pinnal ja viiakse läbi PCR. Analüüsitud DNA -d sisaldavates punktides toimub amplifikatsioon molekulaarsete kolooniate moodustumisega.
PCR koos cDNA otste kiire amplifikatsiooniga (rus. CDNA otste kiire amplifikatsioon, RACE-PCR )
Pika fragmendi PCR (rus. Pikaajaline PCR) - PCR modifitseerimine laiendatud DNA piirkondade amplifitseerimiseks (10 tuhat alust ja rohkem). Kasutatakse kahte polümeraasi, millest üks on suure protsessivõimega Taq polümeraas (see tähendab, et suudab ühe käiguga sünteesida pika DNA ahela) ja teine on 3 "-5" endonukleaasiaktiivsusega DNA polümeraas. Teine polümeraas on vajalik esimese tekitatud vigade parandamiseks.
RAPD PCR (ing. Polümorfse DNA PCR juhuslik võimendamine , PCR koos polümorfse DNA juhusliku amplifikatsiooniga - kasutatakse siis, kui on vaja eristada geneetilises järjestuses lähedasi organisme, näiteks kultuurtaimede erinevaid sorte, koeratõuge või lähedalt seotud mikroorganisme. See meetod kasutab tavaliselt ühte väikest praimerit (20-25 bp). See praimer täiendab osaliselt uuritud organismide juhuslikke DNA piirkondi. Tingimuste (praimeri pikkus, koostis, temperatuur jne) valimisel on võimalik saavutada rahuldav erinevus kahe organismi PCR -mustris.

Kui malli nukleotiidjärjestus on osaliselt või üldse tundmatu, võite kasutada degenereerunud praimerid, mille järjestus sisaldab degenereerunud positsioone, milles võib asuda mis tahes aluseid. Näiteks võib praimeri järjestus olla järgmine: ... ATH ..., kus H on A, T või C.

PCR rakendus

PCR -i kasutatakse paljudes valdkondades analüüsimiseks ja teaduslikeks katseteks.

Kohtuekspertiisi

PCR-i kasutatakse nn geneetiliste sõrmejälgede võrdlemiseks. Vajalik on kuriteopaiga geneetilise materjali proov - veri, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlustatava geneetilise materjaliga. Piisab väga väikesest kogusest DNAst, teoreetiliselt - ühest eksemplarist. DNA lõhustatakse fragmentideks, seejärel amplifitseeritakse PCR abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesi abil. Saadud pilti DNA ribade asukohast nimetatakse geneetiline sõrmejälg(ing. geneetiline sõrmejälg).

Isaduse kehtestamine

Riis. 3: PCR abil amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. (1) Isa. (2) Laps. (3) Ema. Laps päris mõlema vanema geneetilise jälje mõningaid omadusi, mis andis uue, ainulaadse jälje.

Kuigi “geneetilised sõrmejäljed” on ainulaadsed (välja arvatud identsete kaksikute puhul), saab peresidemeid siiski luua mitme sellise sõrmejälje tegemisega (joonis 3). Sama meetodit saab kasutada, veidi muudetud, et luua evolutsiooniline sugulus organismide vahel.

Meditsiiniline diagnostika

PCR võimaldab oluliselt kiirendada ja hõlbustada pärilike ja viirushaiguste diagnoosimist. Soovitud geeni amplifitseeritakse PCR abil, kasutades sobivaid praimereid, ja seejärel sekveneeritakse mutatsioonide tuvastamiseks. Viiruslikke infektsioone saab tuvastada kohe pärast nakatumist, nädalaid või kuid enne haiguse sümptomite ilmnemist.

Isikupärastatud meditsiin

On teada, et enamik ravimeid ei tööta kõigil patsientidel, kellele need on ette nähtud, vaid ainult 30–70% nende arvust. Lisaks on paljud ravimid mõnedele patsientidele mürgised või allergeensed. Selle põhjused on osaliselt ravimite ja nende derivaatide tundlikkuse ja ainevahetuse individuaalsetes erinevustes. Need erinevused määratakse kindlaks geneetilisel tasandil. Näiteks ühel patsiendil võib teatud tsütokroom (maksavalk, mis vastutab võõraste ainete metabolismi eest) olla aktiivsem, teisel vähem. Selleks, et teha kindlaks, milline tsütokroom antud patsiendil on, tehti ettepanek enne ravimi kasutamist läbi viia PCR -analüüs. Seda analüüsi nimetatakse esialgseks genotüpiseerimiseks (eng. tulevane genotüpiseerimine).

Geenide kloonimine

Geenide kloonimine (mitte segi ajada kloonimisorganismidega) on geenide eraldamise protsess ja geenitehnoloogiliste manipulatsioonide tulemusena suure koguse antud geeni produkti saamine. PCR -i kasutatakse geeni võimendamiseks, mis seejärel sisestatakse vektor- DNA fragment, mis kannab võõra geeni samasse või teise, mugavaks kasvamiseks. Vektoritena kasutatakse näiteks plasmiide või viiruse DNA -d. Tavaliselt kasutatakse selle geeni saaduse - RNA või sagedamini valgu - saamiseks geenide sisestamist võõrasse organismi. Seega saadakse palju valke tööstuslikes kogustes kasutamiseks põllumajanduses, meditsiinis jne.

Riis. 4: Geeni kloonimine plasmiidi abil. ...
(1) Organismi A kromosomaalne DNA. (2) PCR. (3) Organismi A geeni paljud koopiad. (4) Geeni sisestamine plasmiidi. (5) Plasmiid organismi A geeniga. (6) Plasmiidi sisestamine organismi B. (7) Organismi A geeni koopiate arvu korrutamine organismis B.

DNA sekveneerimine

Sekveneerimismeetodis, milles kasutatakse fluorestsentsmärgistatud või radioaktiivseid isotoopdideoksünukleotiide, on PCR lahutamatu osa, kuna polümerisatsiooni ajal lülitatakse DNA ahelasse fluorestseeruva või radioaktiivse märgistusega märgistatud nukleotiidderivaadid. See peatab reaktsiooni, võimaldades määrata spetsiifiliste nukleotiidide positsiooni pärast sünteesitud ahelate eraldamist geelis.

Mutagenees

Praegu on PCR -st saanud peamine meetod mutageneesi läbiviimiseks. PCR -i kasutamine võimaldas lihtsustada ja kiirendada mutageneesi läbiviimise menetlust, samuti muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavamaks.

1. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

2. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõte

2.1 Mitmete komponentide olemasolu reaktsioonisegus

2.2 Tsüklilised temperatuuritingimused

2.3 Praimeri valiku põhiprintsiibid

2.4 Platoo efekt

3. PCR -i tootmise etapid

3.2 Võimendus

3.4.1 Positiivsed kontrollid

3.4.2 Sisekontrollid

4.1 Kvalitatiivne analüüs

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

3.1 Bioloogilise materjali proovi ettevalmistamine

DNA ekstraheerimiseks kasutatakse olenevalt ülesannetest erinevaid tehnikaid. Nende olemus seisneb DNA ekstraheerimises (ekstraheerimises) bioloogilisest tootest ja lisandite eemaldamises või neutraliseerimises, et saada PCR -iga sobiva puhtusega DNA preparaat.

Marmuri kirjeldatud meetodit puhta DNA preparaadi saamiseks peetakse standardseks ja see on juba muutunud klassikaliseks. See hõlmab ensümaatilist proteolüüsi, millele järgneb deproteiniseerimine ja DNA uuesti sadestamine alkoholiga. See meetod võimaldab teil saada puhast DNA -preparaati. Kuid see on üsna töömahukas ja hõlmab tööd selliste agressiivsete ja teravate ainetega nagu fenool ja kloroform.

Üks praegu populaarseid meetodeid on DNA ekstraheerimise meetod, mille on välja pakkunud Boom et al. See meetod põhineb tugeva kaotroopse aine, guanidiintiotsüanaadi (GuSCN) kasutamisel rakkude lüüsimisel ja sellele järgneval DNA sorptsioonil kandjal (klaashelmed, kobediatomiit, klaasist "piim" jne). Pärast pesemist jääb proovi DNA, mis on adsorbeeritud kandjale, kust seda saab elueerimispuhvri abil kergesti eemaldada. Meetod on mugav, tehnoloogiline ja sobib proovi võimendamiseks ettevalmistamiseks. DNA kadu on aga võimalik kandja pöördumatu sorptsiooni tõttu, samuti paljude pesemiste käigus. See on eriti oluline, kui proovis töötatakse väikese koguse DNA -ga. Lisaks võivad isegi jäljed GuSCN inhibeerida PCR -i. Seetõttu on selle meetodi kasutamisel väga oluline sorbendi õige valik ja tehnoloogiliste nüansside hoolikas järgimine.

Teine proovide ettevalmistamise meetodite rühm põhineb Chilexi tüüpi ioonivahetite kasutamisel, mis erinevalt klaasist ei adsorbeeri DNA-d, vaid vastupidi, lisandeid, mis segavad reaktsiooni. Reeglina hõlmab see tehnoloogia kahte etappi: proovi keetmine ja lisandite sorptsioon ioonivahetil. Meetod on teostamise lihtsuse tõttu äärmiselt atraktiivne. Enamikul juhtudel sobib see kliinilise materjaliga töötamiseks. Kahjuks on mõnikord selliste lisanditega proove, mida ei saa ioonivahetite abil eemaldada. Lisaks ei saa mõnda mikroorganismi lihtsa keetmisega hävitada. Nendel juhtudel on vaja sisse viia täiendavad proovide töötlemise etapid.

Seega tuleks proovi ettevalmistamise meetodi valikut kaaluda, mõistes kavandatavate analüüside eesmärke.

3.2 Võimendus

Amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks on vaja valmistada reaktsioonisegu ja lisada sellele analüüsitud DNA proov. Sellisel juhul on oluline võtta arvesse praimeri lõõmutamise mõningaid omadusi. Fakt on see, et reeglina sisaldab analüüsitud bioloogiline proov mitmesuguseid DNA molekule, millele reaktsioonis kasutatud praimeritel on osaline ja mõnel juhul märkimisväärne homoloogia. Lisaks võivad praimerid üksteise suhtes lõõmutada, moodustades praimeri dimeere. Mõlemad toovad kaasa praimerite märkimisväärse tarbimise kõrvalsaaduste (mittespetsiifiliste) reaktsioonisaaduste sünteesiks ja vähendavad seetõttu oluliselt süsteemi tundlikkust. See muudab reaktsiooni tulemuste lugemise elektroforeesi ajal raskeks või võimatuks.

3.3 Reaktsiooni tulemuste hindamine

PCR tulemuste õigeks hindamiseks on oluline mõista, et see meetod ei ole kvantitatiivne. Teoreetiliselt saab üksikute sihtmärk-DNA molekulide amplifikatsiooniprodukte tuvastada elektroforeesiga pärast 30-35 tsüklit. Kuid praktikas tehakse seda ainult juhtudel, kui reaktsioon toimub ideaalilähedastes tingimustes, mida elus sageli ei kohta. Eriti suurt mõju amplifikatsiooni efektiivsusele avaldab DNA preparaadi puhtusaste, s.t. teatud inhibiitorite olemasolu reaktsioonisegus, millest mõnel juhul võib olla äärmiselt raske vabaneda. Mõnikord ei ole nende olemasolu tõttu võimalik võimendada isegi kümneid tuhandeid sihtmärk -DNA molekule. Seega ei ole sihtmärk -DNA esialgse koguse ja amplifikatsioonisaaduste lõppkoguse vahel sageli otsest seost.

3.3.1 Horisontaalse elektroforeesi meetod

Võimendustulemuste visualiseerimiseks kasutatakse erinevaid meetodeid. Tänapäeval on kõige levinum meetod elektroforees, mis põhineb DNA molekulide eraldamisel suuruse järgi. Selleks valmistage plaat agaroosgeeli, mis pärast sulamist elektroforeesipuhvri agaroosis kontsentratsioonis 1,5–2,5% sulatatakse, lisades spetsiaalse DNA värvaine, näiteks etiidiumbromiidi. Külmutatud agaroos moodustab ruumilise võre. Kammidega täitmisel moodustuvad geelis spetsiaalsed süvendid, millesse lisatakse seejärel võimendussaadused. Geeliplaat asetatakse horisontaalsesse geelelektroforeesi aparaati ja ühendatakse konstantse pinge allikas. Negatiivselt laetud DNA hakkab geelis liikuma miinuselt plussile. Sel juhul liiguvad lühemad DNA molekulid kiiremini kui pikad. DNA liikumise kiirust geelis mõjutavad agaroosi kontsentratsioon, elektrivälja tugevus, temperatuur, elektroforeesipuhvri koostis ja vähemal määral ka DNA GC koostis. Kõik sama suurusega molekulid liiguvad sama kiirusega. Värvaine on tasapinnalistesse rühmadesse põimitud (interkaleeritud) DNA molekulideks. Pärast elektroforeesi lõppu, mis kestab 10 minutit kuni 1 tund, asetatakse geel ultraviolettkiirgusega (254–310 nm) valgust kiirgava transilluminaatori filtrile. 260 nm piirkonnas DNA poolt neeldunud UV-energia kantakse värvainele, põhjustades selle fluorestseerumist nähtava spektri oranžikaspunases piirkonnas (590 nm).

Võimendustoodete ribade heledus võib olla erinev. Seda ei saa aga seostada sihtmärk -DNA esialgse kogusega proovis.

3.3.2 Vertikaalse elektroforeesi meetod

Vertikaalse elektroforeesi meetod on põhimõtteliselt sarnane horisontaalse elektroforeesiga. Nende erinevus seisneb selles, et sel juhul kasutatakse agaroosi asemel polüakrüülamiidgeele. See viiakse läbi spetsiaalses kambris vertikaalse elektroforeesi jaoks. Polüakrüülamiidi geelelektroforeesil on suurem eraldusvõime kui agaroos -elektroforeesil ja see võimaldab eristada erineva suurusega DNA molekule ühe nukleotiidi täpsusega. Polüakrüülamiidgeeli valmistamine on mõnevõrra keerulisem kui agaroosgeel. Lisaks on akrüülamiid mürgine aine. Kuna vajadus amplifikatsiooniprodukti suuruse määramiseks 1 nukleotiidi täpsusega tekib harva, kasutatakse rutiinsetes töödes horisontaalse elektroforeesi meetodit.

3.4 Amplifikatsioonireaktsiooni kulgemise kontroll

3.4.1 Positiivsed kontrollid

"Positiivse kontrollina" kasutatakse soovitud mikroorganismi DNA preparaati. Mittespetsiifilised amplikonid erinevad suuruselt amplikonidest, mis on saadud kontroll -DNA preparaadiga amplifitseerimisel. Mittespetsiifiliste toodete suurus võib olla suurem või väiksem kui positiivne kontroll. Halvimal juhul võivad need mõõtmed kokku langeda ja lugeda elektroforeesis positiivseks.

Loodud amplifikatsiooniprodukti spetsiifilisuse kontrollimiseks võite kasutada hübridisatsioonisonde (DNA piirkonnad, mis asuvad võimendatud järjestuse sees), mis on märgistatud ensüümimärgiste või radioaktiivsete isotoopidega ja suhtlevad DNA -ga samade põhimõtete kohaselt nagu praimerid. See raskendab ja pikendab analüüsi oluliselt ning selle maksumus suureneb oluliselt.

3.4.2 Sisekontrollid

Reaktsiooniseguga on vaja kontrollida igas torus amplifikatsiooni kulgu. Sel eesmärgil kasutatakse täiendavat, nn "sisekontrolli". See on mis tahes DNA preparaat, mis erineb sihtmärk -mikroorganismi DNA -st. Kui reaktsioonisegule lisatakse sisekontroll, muutub see praimeri lõõmutamiseks samasuguseks sihtmärgiks nagu soovitud nakkusetekitaja kromosomaalne DNA. Sisemise kontrolli amplifikatsiooniprodukti suurus valitakse nii, et see oleks 2 või enam korda suurem kui mikroorganismi soovitud DNA amplifikatsioonist moodustatud amplikonid. Selle tulemusena, kui sisekontrolli DNA lisatakse reaktsioonisegule koos uuritava prooviga, siis olenemata mikroorganismi olemasolust bioloogilises proovis põhjustab sisekontroll spetsiifiliste amplikonide moodustumist, kuid palju kauem (raske ) kui mikroorganismi amplikon. Raskete amplikonide olemasolu reaktsioonisegus näitab amplifikatsioonireaktsiooni normaalset kulgu ja inhibiitorite puudumist. Kui nõutava suurusega amplikone pole moodustatud, kuid ka sisekontrolli amplikone pole, võib järeldada, et analüüsitud proovis on soovimatuid lisandeid, mis tuleks kõrvaldada, kuid mitte soovitud DNA puudumise kohta. .

Kahjuks on sellel lähenemisviisil kogu atraktiivsusest hoolimata märkimisväärne viga. Kui vajalik DNA on reaktsioonisegus, siis selle amplifikatsiooni efektiivsus väheneb järsult, kuna konkureeritakse praimerite sisekontrolliga. See on eriti oluline uuritava proovi madala DNA kontsentratsiooni korral, mis võib põhjustada vale -negatiivseid tulemusi.

Sellegipoolest, kui praimerite konkurentsi probleem lahendatakse, on see võimenduse efektiivsuse kontrollimise meetod kindlasti väga kasulik.

4. Polümeraasi ahelreaktsioonil põhinevad meetodid

4.1 Kvalitatiivne analüüs

Klassikaline meetod PCR läbiviimiseks, mille põhimõtted olid eespool kirjeldatud, leidis oma arengut mõningates modifikatsioonides, mille eesmärk oli PCR -i piirangute ületamine ja reaktsiooni efektiivsuse suurendamine.

4.1.1 PCR -i seadistamise meetod kuumkäivituse abil

Võimendusreaktsiooni mittespetsiifiliste produktide tekkeohu vähendamiseks kasutatakse meetodit, mida nimetatakse kuumkäivituseks (Hot-start).

Fakt on see, et sõltuvalt GC koostisest ja suurusest on praimeritel teatud sulamistemperatuur (Tm). Kui süsteemi temperatuur ületab Tm, ei suuda praimer DNA ahela külge kleepuda ja denatureerub. Optimaalsetes tingimustes, s.t. lõõmutamistemperatuur sulamistemperatuuri lähedal, moodustab praimer kaheahelalise molekuli ainult selle täieliku komplementaarsuse tingimustes ja tagab seega reaktsiooni spetsiifilisuse.

Kuumkäivituse rakendamiseks on mitu võimalust:

Taq-polümeraasi sisestamine reaktsioonisegusse esimese tsükli jooksul pärast katseklaasi soojendamist denatureerimistemperatuurini.

Reaktsioonisegu koostisosade eraldamine parafiinikihiga kihtidesse (alumises osas - praimerid, ülemises osas - Taq -polümeraas ja DNA sihtmärk), mis parafiini sulatamisel segatakse (~ 65-75 0 С ).

Taq polümeraasi vastaste monoklonaalsete antikehade kasutamine. Monoklonaalsete antikehadega seotud ensüüm muutub aktiivseks alles pärast esimest denatureerimisetappi, kui monoklonaalsed antikehad denatureerivad pöördumatult ja vabastavad Taq polümeraasi aktiivsed saidid.

Kõigil neil juhtudel, isegi kui mittespetsiifiline lõõmutamine toimus enne temperatuuritsükli algust, pikenemist ei toimu ja kuumutamisel denimiseeruvad praimer-DNA kompleksid, mistõttu mittespetsiifilisi tooteid ei teki. Lisaks ei lange temperatuur katseklaasis alla sulamistemperatuuri, mis tagab konkreetse amplifikatsiooniprodukti moodustumise.

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

Võimalus kasutada RNA -d PCR -i sihtmärgina laiendab oluliselt selle meetodi rakenduste valikut. Näiteks paljude viiruste (C -hepatiit, gripiviirus, pikornaviirused jne) genoomid on esindatud RNA -ga. Samal ajal ei toimu nende elutsüklites DNA -ks muundamise vahefaasi. RNA tuvastamiseks on vaja see kõigepealt muuta DNA vormiks. Selleks kasutatakse pöördtranskriptaasi, mis on isoleeritud kahest erinevast viirusest: lindude müeloblastoosiviirus ja Moloney hiire leukeemiaviirus. Nende ensüümide kasutamine on seotud teatud raskustega. Esiteks on need termolabiilsed ja seetõttu saab neid kasutada temperatuuridel, mis ei ületa 42 ° C. Kuna sellel temperatuuril moodustavad RNA molekulid kergesti sekundaarseid struktuure, on reaktsiooni efektiivsus märgatavalt vähenenud ja erinevate hinnangute kohaselt ligikaudu 5%. Sellest puudusest püütakse mööda hiilida, kasutades pöördtranskriptaasina termofiilsest mikroorganismist Thermus Thermophilus saadud termostabiilset polümeraasi, millel on transkriptaasi aktiivsus Mn 2+ juuresolekul. See on ainus teadaolev ensüüm, mis on võimeline avaldama nii polümeraasi kui ka transkriptaasi aktiivsust.

Pöördtranskriptsioonireaktsiooni läbiviimiseks reaktsioonisegus ja PCR -is peavad praimerid olema praimerina ja ehitusmaterjalina 4 dNTP segu.

Pärast pöördtranskriptsiooni reaktsiooni võivad saadud cDNA molekulid olla PCR sihtmärgiks.

5. PCR -i etapiviisilise tehnoloogilise protsessi korraldamine

Polümeraasi ahelreaktsiooni potentsiaalselt kõrge tundlikkus muudab eriti põhjaliku PCR -laboratooriumi disaini oluliseks. Selle põhjuseks on meetodi kõige teravam probleem - saastumine.

Saastumine on konkreetsete DNA molekulide sisenemine väliskeskkonnast reaktsioonisegusse, mis võivad olla võimendusreaktsiooni sihtmärkideks ja anda valepositiivseid tulemusi.

Selle ebameeldiva nähtusega toimetulemiseks on mitmeid viise. Üks neist on ensüümi N-uratsiil-glükosülaas (UG) kasutamine. See meetod põhineb UG võimel lõhustada DNA molekule sisseehitatud uratsiiliga. Amplifikatsioonireaktsioon viiakse läbi, kasutades dNTP segu, milles dTTP asendatakse uratsiiliga ja pärast termilist tsüklit sisaldavad kõik katseklaasis moodustatud amplikonid uratsiili. Kui enne amplifikatsiooni lisatakse reaktsioonisegule UG, siis reaktsioonisegus olevad amplikonid hävitatakse, samas kui natiivne DNA jääb puutumata ja toimib edasi amplifikatsiooni sihtmärgina.

Seega kõrvaldab see meetod ainult mingil määral saasteallika ja ei taga valepositiivsete tulemuste tekkimist.

Teine võimalus saastumise tulemustega tegelemiseks on reaktsioonitsüklite arvu märkimisväärne vähendamine (kuni 25–30 tsüklit). Kuid isegi sellise lähenemisviisi korral on valepositiivsete tulemuste saamise oht suur, sest sel juhul on inhibiitorite puudumisel lihtne saastumise tõttu amplifikatsiooniprodukti saada.

Seega, hoolimata eelvõimendusmeetmete eelistest, mille eesmärk on valepositiivseid tulemusi põhjustavate DNA molekulide inaktiveerimine, on kõige radikaalsem vahend labori läbimõeldud korraldus.

Järeldus

Kõige levinumat PCR -meetodit kasutatakse praegu erinevate nakkushaiguste diagnoosimise meetodina. PCR võimaldab teil tuvastada nakkuse etioloogia, isegi kui analüüsiks võetud proov sisaldab ainult mõnda patogeeni DNA molekuli. PCR -i kasutatakse laialdaselt HIV -nakkuste, viirusliku hepatiidi jne varajaseks diagnoosimiseks. Tänapäeval pole peaaegu ühtegi nakkusetekitajat, mida ei saaks PCR abil tuvastada.

Mitte nii kaua aega tagasi töötati välja usaldusväärne, ülitundlik ja kiire meetod erinevate nakkushaiguste diagnoosimiseks inimestel. Seda meetodit nimetatakse "PCR analüüsiks". Mis see on, mis on selle olemus, milliseid mikroorganisme ta suudab tuvastada ja kuidas seda õigesti võtta, ütleme teile meie artiklis.

Avastamise ajalugu

Samuti kasutatakse vähi diagnoosimisel PCR -meetodeid.

Meetodi eelised

PCR -diagnostikal on mitmeid eeliseid:

Kõrge tundlikkus. Isegi kui mikroorganismi DNA -molekule on vähe, tuvastab PCR -analüüs nakkuse olemasolu. Meetod aitab krooniliste ja varjatud haiguste korral. Sageli on sellistel juhtudel mikroorganismi muude vahenditega harimata.
Uurimiseks sobib mis tahes materjal, näiteks sülg, veri, suguelundite eritised, juuksed, epiteelirakud. Kõige tavalisem on vereanalüüs ja urogenitaalne määrimine PCR -i jaoks.
Põllukultuuride pikaajalist kasvatamist ei nõuta. Automatiseeritud diagnostiline protsess võimaldab teil uuringu tulemusi saada 4-5 tunni pärast.
Meetod on peaaegu 100% usaldusväärne. Vale negatiivse tulemuse juhtumeid on registreeritud vaid üksikuid.
Võimalus ühest materjaliproovist tuvastada mitut tüüpi patogeene. See mitte ainult ei kiirenda haiguse diagnoosimise protsessi, vaid vähendab oluliselt ka materjalikulusid. Sageli määrab arst põhjaliku PCR -analüüsi. Uuringu maksumus, mis koosneb kuue patogeeni tuvastamisest, on umbes 1500 rubla.

Selleks, et tulemused oleksid PCR -uuringu läbiviimisel usaldusväärsed, on vaja analüüs läbi viia, järgides diagnoosi esialgse ettevalmistamise soovitusi:

Enne sülje annetamist peaksite 4 tundi enne materjali võtmist hoiduma toidu ja ravimite võtmisest. Vahetult enne protseduuri loputage suud keedetud veega.
Proovi võtmisel põse sisepinnalt tuleks järgida ülaltoodud reegleid. Pärast loputamist on soovitatav teha naha kerge massaaž, et vabastada näärme sekretsioon.
Tavaliselt kogutakse uriini kodus. Selleks peate läbi viima genitaalide põhjaliku tualeti. Koguge steriilsesse plastmahutisse 50–60 ml uriini. Materjali puhtuse tagamiseks on naistel soovitatav tuppe tupsutada ja meestel nahavolt nii palju kui võimalik välja tõmmata. Menstruatsiooni ajal ei saa materjali annetada.
Sperma loovutamiseks peate enne materjali võtmist hoiduma vahekorrast 3 päeva. Samuti soovitavad arstid loobuda sauna külastamisest ja kuuma vanni võtmisest, alkoholi joomisest ja vürtsikatest toitudest. 3 tundi enne analüüsi peate hoiduma urineerimisest.
Näiteks sünnituse korral, kui tehakse klamüüdia PCR analüüs, soovitatakse naistel ja meestel 3 päeva seksuaalset puhkust. 2 nädalat enne analüüsi ei tohi antibakteriaalseid ravimeid võtta. Nädalaks peate lõpetama intiimsete geelide, salvide, vaginaalsete ravimküünalde, dušši kasutamise. 3 tundi enne uuringut peaksite hoiduma urineerimisest. Menstruatsiooni ajal materjali ei võeta, ainult 3 päeva pärast verejooksu lõpetamist võite võtta urogenitaalse määrde.

PCR raseduse ajal

Beebi oodates on paljud sugulisel teel levivad nakkused loote normaalseks arenguks äärmiselt ohtlikud. Suguhaigused võivad provotseerida emakasisest kasvupeetust, raseduse katkemist või enneaegset sünnitust, lapse kaasasündinud väärarenguid. Seetõttu on raseduse varases staadiumis äärmiselt oluline läbida PCR -uuring. Registreerimisel on vaja analüüs läbida - kuni 12 nädalat.

Materjal võetakse emakakaela kanalist spetsiaalse harja abil. Protseduur on valutu ja ei kujuta endast ohtu lapsele. Tavaliselt tehakse raseduse ajal PCR -meetodil klamüüdia, samuti ureaplasmoosi, mükoplasmoosi, tsütomegaloviiruse, herpese, papilloomiviiruse analüüs. Sellist uurimiskompleksi nimetatakse PCR-6.

PCR HIV diagnoosimiseks

Tulenevalt asjaolust, et meetod on väga tundlik keha muutuste ja diagnoositingimuste suhtes, võivad tulemust mõjutada paljud tegurid. Seetõttu ei ole PCR analüüs HIV-nakkuse jaoks usaldusväärne meetod, selle efektiivsus on 96-98%. Ülejäänud 2-4% juhtudest annab test valepositiivseid tulemusi.

Kuid mõnes olukorras on HIV PCR -diagnostika hädavajalik. Tavaliselt antakse seda vale-negatiivse ELISA testiga inimestele. Sellised näitajad näitavad, et inimesel pole veel viiruse antikehi välja kujunenud ja neid ei ole võimalik tuvastada ilma koguse mitmekordse suurendamiseta. Just seda on võimalik saavutada PCR vereanalüüsiga.

Selline diagnostika on vajalik ka HIV-positiivsele emale sündinud esimese eluaasta lastele. See meetod on ainus viis lapse seisundi usaldusväärseks kindlaksmääramiseks.

PCR hepatiidi diagnoosimiseks

Polümeraasi ahelreaktsiooni meetod võimaldab tuvastada A-, B-, C -hepatiidi viiruse DNA -d ammu enne nakkuse antikehade moodustumist või haiguse sümptomite ilmnemist. C -hepatiidi PCR -analüüs on eriti tõhus, kuna 85% juhtudest on selline haigus asümptomaatiline ja ilma õigeaegse ravita läheb kroonilisse staadiumisse.

Patogeeni õigeaegne avastamine aitab vältida tüsistusi ja pikaajalist ravi.

Põhjalik PCR -uuring

Põhjalik PCR -analüüs: uurimine polümeerse ahelreaktsiooni abil, mis hõlmab mitut tüüpi nakkuste samaaegset määramist: mükoplasma suguelundid, mükoplasma hominis, gardnerella vaginalis, kandidoos, Trichomonas, tsütomegaloviirus, 1. ja 2. tüüpi herpes, gonorröa, papilloomiviirus. Sellise diagnoosi hind on vahemikus 2000 kuni 3500 rubla. sõltuvalt kliinikust, kasutatud materjalidest ja seadmetest, samuti analüüsi liigist: kvalitatiivne või kvantitatiivne. Mida on teie puhul vaja - arst otsustab. Mõnel juhul piisab lihtsalt patogeeni olemasolu kindlakstegemisest, teistel, näiteks HIV -nakkusega, mängib olulist rolli kvantitatiivne tiiter. Kõigi ülaltoodud patogeenide diagnoosimisel nimetatakse uuringut "PCR-12 analüüsiks".

Analüüsi tulemuste tõlgendamine

PCR -analüüsi dekodeerimine pole keeruline. Indikaatoril on ainult 2 skaalat - "positiivne tulemus" ja "negatiivne tulemus". Patogeeni avastamisel saavad arstid haiguse esinemist 99% kindlusega kinnitada ja alustada patsiendi ravi. Nakkuse määramise kvantitatiivse meetodi puhul näidatakse vastavas veerus avastatud bakterite arvuline näitaja. Ainult arst saab määrata haiguse astme ja määrata vajaliku ravi.

Mõnel juhul, näiteks HIV -nakkuse määramisel PCR -i abil, muutub negatiivse tulemuse korral vajalikuks täiendavate uuringute läbiviimine saadud näitajate kinnitamiseks.

Kust end testida?

Kust võtta PCR -analüüsi: riigikliinikus või eralaboris? Kahjuks on munitsipaalraviasutustes seadmed ja meetodid sageli vananenud. Seetõttu on parem eelistada eralaboreid, kus on kaasaegsed seadmed ja kõrge kvalifikatsiooniga personal. Lisaks saate erakliinikus tulemusi palju kiiremini.

Moskvas pakuvad paljud eralaborid PCR -analüüsi erinevate nakkuste suhtes. Näiteks sellistes kliinikutes nagu "Vita", "Kompleksne kliinik", "Õnnelik perekond", "Uro-Pro" viiakse läbi PCR-analüüs. Uuringu hind on alates 200 rubla. ühe patogeeni tuvastamiseks.

Võib järeldada, et nakkushaiguste diagnoosimine PCR abil on enamikul juhtudel kiire ja usaldusväärne viis patogeeni tuvastamiseks organismis nakkuse varases staadiumis. Kuid siiski tasub teatud juhtudel valida muid diagnostikameetodeid. Sellise uuringu vajaduse saab kindlaks teha ainult spetsialist. PCR -analüüsi dekodeerimine nõuab ka professionaalset lähenemist. Järgige arsti soovitusi ja ärge tehke ise vajalikke katseid.