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Malheureusement, encore aujourd'hui, on peut affirmer que le diagnostic des maladies fongiques est souvent inopportun (zones d'amincissement des cheveux, desquamation sont souvent confondues avec "pellicules", "sécheresse"). Dans le même temps, les sensations subjectives (démangeaisons, douleur, etc.) ne se produisent souvent pas dans les lésions et les patients, de ce fait, ne consultent pas un spécialiste pendant longtemps.
Les modifications des ongles (laides, émiettées, amincies) sont considérées comme une "onychodystrophie" après une blessure, une engelure, etc. Dans le même temps (même des lésions isolées, y compris les ongles) peuvent entraîner la formation d'une restructuration allergique du corps, affecter le sang et les vaisseaux lymphatiques, etc. Les patients atteints de cette maladie restent indéfiniment la source de la propagation de l'infection fongique. Dans le cadre de ce qui précède, des diagnostics de laboratoire opportuns des mycoses, ainsi qu'un éventuel traitement précoce, sont invariablement pertinents.
La variété des variantes cliniques des maladies fongiques, que l'on trouve principalement chez l'homme, ainsi que les particularités de la microbiologie, de la morphostructure, des paramètres immunologiques et autres de divers types (et genres) de champignons, ont conduit à la présence d'un nombre important de méthodes pour diagnostiquer les mycoses; Il convient de noter que les méthodes disponibles sont constamment améliorées et (relativement récemment) ont un biais particulier vers les tests de génétique immunologique et moléculaire.
En revanche, les cultural studies restent « dans la catégorie des standards proches de l'or » et servent à confirmer les résultats douteux d'autres études ; Il existe une opinion selon laquelle la combinaison de méthodes génétiques culturelles et moléculaires pour les formes diagnostiquement "douteuses" de mycoses (en particulier disséminées, dans le contexte d'une immunosuppression de toute genèse, avec des lésions des organes internes, etc.) est l'un des moyens les plus fiables pour enregistrer la nature mycotique du processus.
Cependant, il ne faut pas négliger les "anciennes" techniques, en particulier la bactérioscopie (surtout lors de l'examen initial), d'autant plus que dans la pratique quotidienne, la "vérification" microscopique des mycoses dans de nombreux établissements dermatologiques est la plus utilisée en comparaison avec d'autres tests.
Compte tenu de l'augmentation significative du nombre de manifestations allergiques cutanées (et parfois viscérales) - avec une évolution prolongée, chronique et périodiquement exacerbée de la mycose (peau, ongles, etc.), il est conseillé de procéder à des tests allergologiques pour identifier le degré de sensibilisation du corps, y compris une infection fongique et bactérienne combinée; ce fait peut affecter la spécificité du traitement chez un patient particulier - par exemple, déterminer la nomination rationnelle d'agents antimycotiques et désensibilisants, etc.
Traditionnellement, un diagnostic présomptif d'une maladie fongique est posé sur la base de manifestations cliniques et confirmé par des tests de laboratoire.
Dans cette section du livre, nous présentons brièvement les méthodes de base pour enregistrer les mycoses (quelle que soit leur localisation), en tenant compte du « type de recherche et du matériel prélevé ». Il est à noter que le polymorphisme des manifestations cliniques des mycoses (y compris celles à composante allergique) détermine la diversité du matériel pathologique à étudier. Dans ce cas, le succès de la recherche d'éléments du champignon dépend de la prise correcte de celui-ci.
Ainsi, la zone périphérique des éruptions érythémato-squameuses, souvent frisées, est plus riche en mycélium, spores fongiques ; sur les zones pileuses de la lésion, des cheveux tordus, blanchâtres, décolorés, ternes ou leurs fragments - "chanvre" sont prélevés (il est conseillé de contrôler la prise de cheveux à l'aide d'une lampe à bois). Certaines compétences sont requises par l'échantillonnage du matériel (à l'aide d'une aiguille) de la soi-disant. "Points noirs" - cônes cornés foncés à l'embouchure des follicules.
Dans la pratique quotidienne, les écailles de la peau sont généralement examinées (collectées par grattage, frottis, à l'aide de ruban adhésif), le grattage des ongles modifiés, la zone d'hyperkératose sous-unguéale, ainsi que l'écoulement des muqueuses. Selon les indications, les expectorations, le liquide de lavage, l'urine sont examinés (chez les patients avec vessie non cathétérisée); l'urine des poches d'urine, les vaisseaux du lit ne peuvent pas être prélevés pour examen.
Le sang a également une valeur diagnostique (pour la recherche en culture, ainsi que ELISA, PCR), le liquide céphalo-rachidien et d'autres biofluides du corps (pleural, intra-articulaire, intrapéritonéal - y compris ceux collectés par aspiration ou drainage); dans certains cas (selon le diagnostic topique), la bile, les matières fécales, les ponctuations d'abcès sous-cutanés, l'écoulement de la fistule (en particulier avec les mycoses profondes) sont importants. Même les tests de diagnostic simples nécessitent le strict respect d'un certain nombre de conditions.
Des méthodes sont actuellement utilisées pour diagnostiquer les maladies fongiques :
- microscopie ; basé sur la détection de l'agent pathogène dans le matériel d'essai, incl. dans les tissus humains;
- recherche culturelle suivie d'un examen microscopique de la culture du champignon ;
- examen histologique (G.O. avec mycoses profondes) ;
- méthodes immunitaires et moléculaires.
Diagnostic microscopique
Diagnostic microscopique - est devenu possible à partir de la période d'apparition d'une technologie microscopique optique spéciale et plus tard électronique, qui a permis d'étudier en détail l'ultrastructure des champignons. Dans le même temps, la détection d'éléments fongiques - de fins filaments ramifiés qui forment le mycélium (mycélium), des corps arrondis (spores ; sont l'« organe » reproducteur des champignons) a une valeur diagnostique.Le diagnostic microscopique implique l'étude de préparations non colorées (natives) et colorées. Cette méthode, comme indiqué, est la plus répandue dans la pratique dermatologique en raison de sa simplicité comparative et de son faible coût, mais, d'autre part, elle n'est pas assez sensible, nécessite des tests répétés dans certains cas, une confirmation par d'autres méthodes.
Ainsi, lors de l'étude de préparations non colorées, en plus des éléments fongiques, on peut trouver des cellules épithéliales, des cellules sanguines, divers contaminants de l'environnement extérieur, ce qui rend difficile la recherche de l'agent causal de la mycose, nécessite une "préparation" supplémentaire du matériau - la dite. Son "éclaircissement" (macération), concentration, dilution, etc.
Néanmoins, la microscopie directe des préparations natives vous permet de diagnostiquer rapidement la mycose, de déterminer sur quel milieu nutritif (si nécessaire) le matériel doit être inoculé, il existe un avis selon lequel son résultat positif peut rester la seule confirmation en laboratoire de la mycose avec une réponse négative dans la culture (A.Yu. Sergeev, Yu.V. Sergeev, 2003).
Parmi les différentes options pour « l'éclaircissement » des médicaments, la plus courante est l'ajout de KOH ou de NaOH au matériel d'essai (il est plus souvent utilisé pour détecter les champignons dans les écailles de la peau, les cheveux, ainsi qu'un certain nombre d'agents responsables de mycoses dans les crachats, biopsies).
Pour la macération des broyés et placés sur une lame de verre, une solution d'hydroxyde de sodium (ou de potassium) à 10-20% est réalisée - 1-3 gouttes, pendant 10-20 minutes; le médicament est légèrement pressé avec un couvercle en verre, pour une macération plus rapide - chauffé à la flamme jusqu'à l'apparition de vapeurs. La visualisation s'effectue d'abord sous faible grossissement, puis sous fort grossissement (système sec).
Une préparation correctement préparée, non soumise à des influences mécaniques, thermiques et chimiques grossières, présente une image d'une masse homogène constituée de cellules épithéliales, produits de la décomposition cellulaire d'éléments fongiques - filaments de mycélium et spores.
Les cheveux modifiés sont placés sur une lame de verre avec 10-30% d'alcali et traités de la même manière, mais pendant une période plus longue - de 20 minutes à 3-4 heures.Avec une teneur en pigments abondante, il est recommandé de pré-blanchir les cheveux avec une solution de peroxyde d'hydrogène à 5%. Ils attachent de l'importance à la détection des éléments du champignon, ainsi qu'à leur localisation par rapport au cheveu.
La préparation du matériel à partir d'ongles altérés pathologiquement (de préférence une fine poudre obtenue par grattage de la profondeur du foyer) s'effectue de la même manière, mais en utilisant de la soude caustique à 30%, un chauffage soigneux obligatoire sur une flamme aux vapeurs légères et une exposition pendant environ 1 heure (parfois jusqu'à plusieurs heures). Les préparations traitées aux alcalis ne doivent pas être conservées plus de 1,5 à 2 heures en raison de leur "détérioration" (cristallisation du réactif, diminution de la fiabilité du diagnostic déterminée par l'image microscopique).
Au lieu de KOH ou NOOH, vous pouvez utiliser : a) une solution d'un mélange de KOH avec 15 % de DMSO ; b) un mélange de phénol (2 parties) avec de l'hydrate de chloral (2 parties) et de l'acide lactique (1 partie) ; c) le blanc calcofluorique, qui a une affinité pour l'higi et la cellulose ; pour la recherche, un microscope à fluorescence est nécessaire (une lueur bleue ou verte est observée selon le filtre utilisé). Dans l'étude du liquide céphalo-rachidien (avec suspicion de cryptococcose), la coloration à l'encre était souvent utilisée.
Kulaga V.V., Romanenko I.M., Afonin S.L., Kulaga S.M.
DIAGNOSTIC DE LABORATOIRE DE LA MYCOSE
Prendre du matériel pour la recherche en laboratoire sur les champignons.
1.OST 42-21-2-854 : arrêté n° 222/80 du 27.06.00
2. Matériel : pince à épiler, lames de microscope, ciseaux, cuillère folkman.
4. Indications : maladies fongiques.
5. Complications : non.
Préparation d'une salle de soins :
Changement de solution.
Préparer:
-1% solution de chloramine pour chiffons
-3% solution de chloramine - pour la désinfection des pansements et des pincettes
- solution de lavage (156 ml. peroxyde d'hydrogène + 5 g. détergent en poudre + 839 ml. eau distillée) - pour le traitement des pincettes
- Solution à 6% de peroxyde d'hydrogène - pour le traitement des gants.
Algorithme pour effectuer la manipulation.
Vous devez prendre une pince à épiler, une lame de verre, une cuillère Folkman, des ciseaux;
- inviter le patient au vestiaire ;
- le patient est assis sur une chaise ou un divan ;
- m / s peuplements.
Technique d'exécution :
Prélever des écailles de peau et des poils de la lésion avec une pince à épiler ;
- mettre le matériel prélevé sur une lame de verre et recouvrir d'une autre lame de verre.
- lave tes mains avec du savon et de l'eau;
- envoyer le matériel prélevé au laboratoire.
COLLECTE DE MATÉRIEL
Prenez des ciseaux et des lames de verre ;
- couper un morceau du bord libre de l'ongle avec des ciseaux;
- recouvrir le matériel prélevé avec une autre lame de verre ;
Faire tremper les ciseaux et la pince à épiler dans une solution de formol à 3 %.
La collecte correcte du matériel des ongles affectés est la clé d'une étude microbiologique réussie. Lorsqu'ils ramassent du matériel, ils ne capturent pas toujours les zones de l'ongle qui contiennent des champignons viables. Naturellement, les champignons non viables en culture ne pousseront pas et leur espèce ne pourra pas être établie.
La zone de l'ongle à prendre est déterminée par la forme de l'onychomycose.
Ainsi, avec une forme superficielle d'onychomycose, des raclages doivent être effectués à partir de la surface de la plaque de l'ongle.
Dans la forme sous-unguéale distale la plus courante, les champignons les plus viables sont situés sous la plaque unguéale. Le matériel envoyé pour la recherche doit inclure non seulement une coupe de la plaque à ongles, mais également un grattage du lit de l'ongle, sous la plaque.
De plus, les zones de l'ongle inchangé doivent être capturées, car les champignons les plus actifs sont situés à la frontière entre eux et les zones touchées de l'ongle.
Dans la forme sous-unguéale proximale, le matériel est difficile à prélever. Dans ces cas, parfois, surtout s'ils vont procéder à un examen histologique ou à un diagnostic différentiel, ils font une biopsie de l'ongle, et parfois utilisent une perceuse.
Avec la paronychie, des raclages sont faits à partir du rouleau proximal et sous celui-ci.
Dans tous les cas, pour éviter la contamination bactérienne, l'ongle doit être traité à l'alcool éthylique avant le prélèvement.
ÉTUDE MICROSCOPIQUE
L'examen microscopique du matériel pathologique pour les champignons est effectué dans des préparations indigènes et colorées.
Pour préparer des préparations non colorées, le matériau obtenu est broyé avec un scalpel ou une aiguille à dissection et placé au milieu d'une lame de verre. Pour une identification plus claire des éléments du champignon, la matière est éclairée (macérée). À cette fin, ils ont recours à diverses substances, le plus souvent des alcalis caustiques (KOH, NaOH), qui dissolvent les squames épidermiques, le mucus, le pus, clarifient le pigment des cheveux et rendent ainsi les champignons disponibles pour la recherche.
Sur les écailles ramollies de la peau ou de l'ongle, qui sont placées au milieu de la lame, appliquez 1 à 3 gouttes de solution à 20-30 % de KOH (NaOH). Le matériau d'essai dans les gouttes alcalines est soigneusement chauffé sur la flamme d'une lampe à alcool jusqu'à ce qu'un délicat bord blanc de cristaux alcalins apparaisse le long de la périphérie de la goutte. Ne pas préchauffer à ébullition. Après chauffage, la goutte est recouverte d'un couvercle en verre, évitant la pénétration de bulles d'air.
RA Arabiyskiy et GI Gorshkova (1995) recommandent de laisser les écailles de la peau et les préparations capillaires recouvertes d'un verre de couverture pendant 5 à 10 minutes et les plaques à ongles pendant 30 à 40 minutes avant la microscopie.
L'illumination des médicaments peut être effectuée sans chauffage, pour cela, ils sont laissés dans une solution de KOH à 20% pendant 30 à 60 minutes ou d'autres méthodes d'illumination du matériel pathologique sont utilisées: chlorallactophénol selon Aman; lactophénol; une solution contenant 15 % de diméthylsulfoxyde et du KOH dans l'eau. De bons résultats sont obtenus après l'éclaircissement des plaques à ongles, placées dans une solution à 5 % de KOH pendant 24 heures, aucun chauffage n'est nécessaire dans ce cas.
L'examen microscopique est réalisé sur un microscope de laboratoire classique sans immersion.
Le condenseur du microscope doit être abaissé, le diaphragme rétréci. Au début, le médicament se trouve sur du verre à faible grossissement (40x), l'étude ultérieure est réalisée à un grossissement plus élevé (100x);
la préparation est étudiée en détail à un grossissement de 400x. Il est nécessaire d'étudier plusieurs médicaments afin d'augmenter la fiabilité du dosage et d'éviter des résultats faussement positifs.
Des erreurs dans le diagnostic microscopique des champignons peuvent survenir en raison à la fois de défauts dans la préparation du médicament et du manque d'expérience de l'assistant de laboratoire.
Les défauts de fabrication sont principalement liés à :
avec une surchauffe du médicament, ce qui peut entraîner la perte de cristaux alcalins, la destruction des cheveux et l'apparition d'une désintégration à grain fin dans le matériel pathologique.
L'arrangement linéaire des cristaux allongés, même alcalins, ressemble beaucoup aux filaments du mycélium septique, même sur du verre propre sans matériel pathologique.
Les caractéristiques diagnostiques différentielles sont l'uniformité exceptionnelle des cristaux, leur transparence vitreuse, la polyvalence des bords et l'absence d'un lien inextricable entre un élément et un autre. Dans les cas douteux, il est recommandé d'ajouter à la préparation des gouttelettes d'eau distillée légèrement chauffée, qui dissolvent rapidement les cristaux alcalins.
Les éléments suivants peuvent être confondus avec les éléments du champignon :
- des gouttelettes de graisse,
- des bulles d'air,
- des fils de vêtements en coton
- et le soi-disant "champignon mosaïque".
Les lipides de la peau, la dégradation graisseuse des cellules et des grains de kératohyaline, en particulier ceux de forme correcte, peuvent ressembler à des spores individuelles du champignon. Mais la variété des formes et surtout des tailles, l'absence de structure interne des formations (vacuoles, coquilles) vont à l'encontre de la nature fongique de ces éléments. Les lipides peuvent également pénétrer dans le médicament lors de la prise de matériel pathologique d'une lésion insuffisamment purifiée.
Les bulles d'air peuvent ressembler aux spores de cellules de type levure, mais contrairement à ces dernières, elles sont entourées d'une membrane sombre et dense, et même les plus petites bulles d'air sont toujours plus grosses que les cellules du champignon.
Les fils du tissu des chaussettes, des vêtements, etc. se trouvent généralement séparément du matériel pathologique, ils sont toujours plus gros que les hyphes, plus grossiers et non cloisonnés.
Le "champignon mosaïque" est un artefact qui se produit pendant la cristallisation (peut-être en raison de la dégradation du cholestérol). Il a la forme d'une maille ou de boucles dont les contours correspondent aux limites des écailles cornées, contrairement aux filaments du mycélium, il ne traverse jamais les parois des cellules de l'épiderme.
Dans certains laboratoires, la clarification des préparations pour l'examen microscopique est effectuée avec une solution de 15 à 30 % de KOH, à laquelle sont ajoutés 5 à 10 % d'encre bleu foncé du commerce de Parker (Parker's Superchrome Blue-Black Ink).
Avec cette couleur, les hyphes et les spores deviennent bleus.
La microscopie révèle des hyphes fongiques filamenteux ou des cellules en herbe (Fig. 1).
Ainsi, la microscopie ne donne une conclusion que sur la nature fongique de l'infection, mais pas sur le type d'agent responsable du champignon.
Bien entendu, l'efficacité de l'examen microscopique dépend des qualifications de l'employé du laboratoire.
Riz. 1. Microscopie de raclures d'ongles affectés par T. rubrum. Les hyphes du champignon sont visibles.
RECHERCHE CULTURELLE
Le matériel est ensemencé sur un milieu standard de Sabouraud, souvent avec des antibiotiques. Dans le diagnostic des infections à dermatophytes, il est d'usage d'ajouter du cycloheximide au milieu de Sabouraud, ce qui supprime la croissance des champignons contaminants provenant de l'air. Il existe des milieux commerciaux avec des additifs antibiotiques et cycloheximide. Rappelons que de nombreuses moisissures non dermatophytiques et certaines espèces de Candida ne poussent pas sur milieu avec cycloheximide, il est donc recommandé d'ensemencer sur milieu Sabouraud avec cycloheximide et sur milieu sans cycloheximide. L'identification des espèces est généralement effectuée par examen microscopique de la culture cultivée ou par réensemencement sur des milieux sélectifs (Fig. 2-15).
Riz. 2. Culture du champignon T. rubrum isolé des ongles affectés. Obtenu sur milieu de Sabouraud (gauche) et gélose maïs (droite).
Riz. 3. Culture du champignon T. mentagrophytes var. interdigitale isolée des ongles atteints. Obtenu sur l'environnement de Saburo.
Riz. 4. Culture du champignon Candida albicans. Obtenu sur l'environnement de Saburo.
Riz. 5. Culture du champignon Torulopsis glabrata isolé des ongles atteints. Obtenu sur l'environnement de Saburo.
Riz. 6. Culture du champignon Ulocladium sp., isolé des ongles atteints.
Riz. 7. Micromorphologie d'Acremonium sp isolé des ongles atteints.
Riz. 8. Micromorphologie de Fusarium sp isolé des ongles atteints.
Riz. 9. Micromorphologie de Scopulariopsis sp isolé des ongles atteints.
Riz. 10. Micromorphologie de Candida albicans isolé des ongles atteints.
Riz. 11. Micromorphologie d'Altemaria sp isolée des ongles atteints.
Riz. 12. Micromorphologie d'Aspergillus sp. Isolé des ongles atteints.
Riz. 13. Micromorphologie d'Ulocladium sp isolée des ongles affectés.
Riz. 14. Micromorphologie de Chaetomium sp. Isolé des ongles affectés.
Fig 15. Panel de nutriments nourris pour l'identification des dermatophytes (gauche - culture T rubrum, droite - T mentagrophytes var. Mterdigitale).
De gauche à droite : milieu de Sabouraud, milieu de Baxter, milieu de Christensen, gélose au maïs
Il est à noter que certaines moisissures, dont les dermatophytes, se développent lentement en culture, en 2-3 semaines.
Même si toutes les règles de collecte du matériel sont respectées, avec un bon équipement de laboratoire et de hautes qualifications de son personnel, le nombre de résultats positifs d'une étude de culture est très faible.
Selon la littérature étrangère, le pourcentage d'études positives ne dépasse pas 50.
Le pourcentage de résultats positifs dans les meilleurs laboratoires nationaux atteint à peine 30.
Ainsi, dans 2 cas d'onychomycose sur 3, son étiologie ne peut être établie.
RECHERCHE LUMINESCENTE
En 1925, Margaret et Devze ont découvert que les cheveux affectés par certains dermatophytes dégageaient un éclat caractéristique lorsqu'ils étaient exposés aux rayons ultraviolets passés à travers un filtre Byda. Le verre Byda se compose de sulfate de baryum, contient environ 9% d'oxyde de nickel; il transmet des rayons d'une longueur de 365 nm. Divers dispositifs peuvent être utilisés comme source de rayons ultraviolets. La nature de la lueur n'a pas été précisément établie. Les cheveux continuent à briller après la mort du champignon et après des tentatives d'extraction de la matière fluorescente avec de l'eau chaude ou une solution froide de bromure de sodium. L'intensité et la nature de la lueur dépendent du pH de la solution. On pense que la substance fluorescente apparaît dans le processus d'interaction entre le champignon et les cheveux en croissance.
La lueur aux rayons ultraviolets, passés à travers le filtre de Bois, n'est caractéristique que des cheveux atteints de champignons du genre Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, occasionnellement M. gypseum et M. nanum), ainsi que Trichophyton schonleinii... Les cheveux affectés par les microsporums, en particulier M. canis et M. audouinii, donnent l'éclat le plus brillant ; les poils affectés par T. schonleinii ont une fluorescence verdâtre terne.
L'éclat n'est observé que dans les cheveux complètement affectés par le champignon. Il peut ne pas s'agir de lésions fraîches. Dans ces cas, les cheveux doivent être épilés à partir de la zone de bord la plus active et l'éclat peut être trouvé à la racine des cheveux.
La méthode luminescente peut être utilisée à la fois pour le diagnostic et le suivi de l'efficacité du traitement chez des patients individuels et dans des foyers épidémiologiques. Les unités mobiles compactes sont pratiques pour examiner les personnes de contact dans les écoles, les jardins d'enfants, etc.
L'examen luminescent doit être effectué dans une pièce sombre, les lésions doivent être préalablement nettoyées des croûtes, résidus de pommade, etc. La méthode luminescente peut être utilisée pour diagnostiquer le pityriasis lichen, en particulier lorsque les lésions sont localisées sur le cuir chevelu. Les lésions de cette maladie ont une lueur jaune rougeâtre ou brune. Cette lueur, cependant, n'est pas strictement spécifique, car elle peut être observée en présence de pellicules sur le cuir chevelu et même chez les personnes en bonne santé au niveau de la bouche des follicules pileux sur le visage et le haut du corps. Les poils atteints identifiés par la méthode luminescente doivent être soumis à un examen microscopique.
RECHERCHE IMMUNOLOGIQUE ET BIOLOGIQUE
Des méthodes de recherche immunologiques sont utilisées pour identifier les restructurations spécifiques de l'organisme et le diagnostic sérologique des maladies fongiques. Pour détecter des anticorps spécifiques dans le sérum de l'échantillon, les réactions sérologiques suivantes sont effectuées: agglutination, précipitation, liaison au complément, immunofluorescence avec les antigènes correspondants.
Une affection allergique du corps du patient est détectée à l'aide de tests cutanés allergiques. Les allergènes sont appliqués sur peau scarifiée selon Pirquet ou par friction cutanée selon Moro, par voie intradermique selon Mantoux, mais aussi par injection dans la peau. A l'aide de ces tests, des réactions allergiques de type immédiat et retardé sont détectées, ce qui permet d'évaluer l'état de l'immunité humorale et cellulaire.
Pour identifier la sensibilisation spécifique des lymphocytes, les réactions de dégranulation, d'agglomération et d'altération des basophiles, le test de transformation blastique, l'inhibition de la migration des macrophages, etc. sont utilisés.
La comparaison des résultats des réactions sérologiques et allergiques est utile à la fois pour le diagnostic et le pronostic de l'évolution des mycoses.
Méthode biologique. Il est utilisé pour le diagnostic en laboratoire des mycoses profondes et particulièrement dangereuses. Basé sur l'infection d'animaux avec du matériel pathologique provenant d'un patient ou d'une culture du champignon étudié. Réalisé dans des laboratoires spécialisés.
EXAMEN HISTOLOGIQUE
Histologie des mycoses cutanées dues à des dermatophytes
Les modifications pathomorphologiques des lésions sont causées par l'introduction de champignons dans la couche cornée de l'épiderme, des cheveux et des ongles et par une réponse inflammatoire de la peau, qui peut être aiguë, subaiguë ou chronique. Le diagnostic ne peut être considéré comme établi que si des éléments fongiques sont retrouvés dans les préparations histologiques. Pour cela, différentes colorations histologiques sont utilisées, la plus informative est la réaction acide périodique (PAS), qui permet d'identifier les polysaccharides présents dans la cellulose et la chitine de la paroi cellulaire de la plupart des dermatophytes (coloration de Shifu et ses modifications). Vous pouvez également utiliser des réactions de sulfatation et l'imprégnation des coupes histologiques avec de l'argent [Khmelnitsky OK, 1973; Lewer W. F. et Schaumburg-Lewerl., 1983].
Les champignons de la couche cornée de l'épiderme, même lors de l'utilisation de colorants spéciaux, sont détectés en petites quantités sous forme de filaments de mycélium et de spores. Dans de rares cas, lorsqu'il y a beaucoup de champignons dans les lésions, ils peuvent être trouvés dans des coupes colorées à l'hémotoxyline-éosine, sous la forme de délicates structures basophiles dans la couche cornée.
Les modifications inflammatoires de l'épiderme peuvent être différentes: d'un œdème intra- et extracellulaire mineur des cellules épineuses à une spongiose sévère. La spongiose se développe généralement avec des variantes dyshidrotiques des mycoses des pieds et des mains, cliniquement dans ces cas, des bulles sont notées. Cette réaction est généralement causée par T. mentagrophytes var. interdigital. Parfois, dans l'épiderme, il existe une hyperkératose prononcée, qui est le plus souvent observée dans les mycoses causées par T. rubrum.
Les modifications histologiques du derme sont non spécifiques et correspondent à une inflammation aiguë, subaiguë et chronique.
Dans la mycose de la peau lisse causée par T. rubrum, on trouve parfois des champignons dans le vellus et les follicules pileux. Une réaction inflammatoire se développe autour des follicules qui, en raison de l'entrée de champignons dans le derme, peuvent acquérir un caractère granulomateux. La partie centrale de l'infiltrat dans ces cas peut subir une suppuration et une nécrose, et la partie périphérique est constituée de lymphocytes, d'histocytes, de cellules géantes épithélioïdes et multinucléées, à l'intérieur desquelles se trouvent parfois des spores fongiques. Les tailles des spores atteignent ici 6 microns de diamètre, dans les cheveux elles ne dépassent généralement pas 2 microns.
Avec la forme infiltrante-suppurative des mycoses du cuir chevelu et de la zone de croissance de la barbe et de la moustache, des éléments fongiques se retrouvent dans le follicule pileux, à l'intérieur et autour des cheveux. Dans les cheveux, ils sont déterminés juste au-dessus de la zone de début de kératinisation (environ au niveau de 30 microns). Dans le derme, une réaction inflammatoire d'intensité variable est notée, plus prononcée avec le kérion Celsii. En cas de réaction purulente aiguë, un grand nombre de leucocytes neutrophiles sont notés dans la composition de l'infiltrat, les éléments des champignons dans ce cas peuvent disparaître complètement. Au cours du processus chronique, l'infiltrat peut acquérir un caractère granulomateux, des cellules géantes multinucléées y apparaissent. Pour confirmer le diagnostic en l'absence de champignons dans l'infiltrat, des méthodes de coloration par immunofluorescence peuvent être utilisées. A ces fins, un antisérum marqué à la fluorescéine contre T. mentagrophytes est utilisé, ce qui permet de détecter des antigènes fongiques dans les cheveux et dans l'infiltrat périfolliculaire.
La formation d'une réaction cutanée infiltrante-suppurée dans la mycose du cuir chevelu (kerion Celsii) et la zone de croissance de la barbe et de la moustache causée par les champignons M. canis, T. tonsurans et T. verrucosum est une manifestation d'un réaction. Ceci est attesté par :
1. La tendance des lésions à la résolution spontanée.
2. Absence d'éléments fongiques avec une réaction inflammatoire très prononcée de la peau avec mycose causée par T. verrucosum (faviforme) et T. tonsurans.
3. Une réaction positive constante en réponse à l'administration intradermique de trichophytine dans les formes infiltrantes-suppuratives de mycose causées par des trichophytines zoophiles (par exemple, T. tonsurans) et négative - dans les mycoses superficielles causées par le même T. tonsurans.
Avec favus, un grand nombre de filaments de mycélium et de spores uniques du champignon se trouvent dans la couche cornée de l'épiderme. La scutula est représentée par l'exsudat, les cellules parakératosiques de l'épiderme, les cellules de l'infiltrat inflammatoire, ainsi que les filaments de mycélium et les spores fongiques, qui se trouvent principalement dans la zone périphérique de la scutula. Au stade actif de la maladie, un infiltrat inflammatoire prononcé contenant des cellules géantes et plasmatiques multinucléées est noté dans le derme autour des follicules pileux dégénératifs. Dans les lésions anciennes, les cheveux et les glandes sébacées sont absents, il existe des phénomènes de fibrose.
Histologie des mycoses de la peau et des muqueuses causées par des champignons de type levure
Avec la candidose de la peau et des muqueuses, les champignons du genre Candida se trouvent dans la couche cornée de l'épiderme ou dans les couches superficielles de l'épithélium de la membrane muqueuse. Les éléments fongiques sont généralement peu nombreux, ils sont bien colorés par la réaction PAS ou par Gram ; se présentent sous la forme de filaments de mycélium ramifiés cloisonnés, de 2 à 4 microns de diamètre, ou de spores ovoïdes, de 3 à 5 microns de diamètre. La détection de la forme mycélienne du champignon a une valeur diagnostique.
Dans une étude histologique des candidoses granulomateuses chroniques de la peau et des muqueuses, les éléments fongiques sont également majoritairement retrouvés dans le stratum corneum de l'épiderme ou dans les parties supérieures de l'épithélium de la muqueuse, mais parfois dans la couche épineuse, à l'intérieur de la cheveux et dans le derme. Il existe également une hyperkératose et une papillomatose marquées; dans le derme - un infiltrat inflammatoire dense composé de cellules lymphoïdes, de neutrophiles, de plasma et de cellules géantes multinucléées. L'infiltrat peut se propager dans le tissu adipeux sous-cutané.
Avec le pityriasis versicolor, un grand nombre d'éléments fongiques se trouvent dans la couche cornée de l'épiderme sous la forme de structures basophiles délicates, qui sont clairement visibles même lorsque les préparations sont colorées à l'hémotoxyline-éosine. Les champignons sont représentés à la fois par des filaments et des spores.
Avec la forme folliculaire du lichen pityriasis, il existe une accumulation de masses cornées et de cellules d'un infiltrat inflammatoire dans les bouches dilatées des follicules pileux. Une infiltration inflammatoire est également notée autour des follicules. Dans la réaction PAS, des spores sphériques ou ovales du champignon, de 2 à 4 microns de diamètre, se trouvent à l'intérieur de la bouche des follicules pileux, et parfois dans l'infiltrat périfolliculaire. Le mycélium n'est jamais détecté.
La pigmentation cutanée altérée chez les patients atteints de pityriasis versicolor est due à la capacité du champignon Pityrosporum à produire une substance qui inhibe le processus de pigmentation de l'épiderme. L'examen au microscope électronique de biopsies cutanées de zones hypopigmentées a montré que de très petits mélanosomes se forment dans les mélanocytes, qui ne sont pas capables de pénétrer dans les kératinocytes. En revanche, dans les zones hyperpigmentées de la peau, les mélanosomes sont volumineux et contiennent une grande quantité de mélanine.
La base du diagnostic des maladies fongiques est l'examen microscopique des préparations préparées à partir des zones touchées de la peau et des ongles. Cependant, l'image microscopique dans différents types de mycoses est similaire: dans les écailles de la peau et des ongles, des spores fongiques et un mycélium cloisonné ramifié d'un diamètre de 4 à 7 microns sont visibles. Par conséquent, le genre et l'espèce du champignon dans la plupart des cas ne peuvent pas être déterminés par l'image microscopique des écailles de la peau ou du grattage de l'ongle. Pour identifier le pathogène, des inoculations sont réalisées sur milieux nutritifs, le plus souvent sur milieu de Sabouraud.
Epidermophytose. La couche cornée de la peau, le plus souvent les pieds, et les ongles des membres inférieurs sont touchés. Les cheveux ne sont jamais affectés. Des taches ou des rayures jaunes apparaissent sur les ongles, puis une hyperkératose (épaississement des ongles) se développe, leur déformation et leur destruction. Desquamation lamellaire de la plante des pieds et des plis interdigitaux, des rougeurs apparaissent sur la peau des pieds. Parfois, des bulles, des érythèmes fessiers, des fissures se forment. La maladie s'accompagne de démangeaisons, de brûlures, de douleurs.
L'examen microscopique des raclures, des écailles, des bouchons vésicaux révèle des filaments de mycélium peu septiques d'un diamètre de 3 à 5 mm, certains des filaments se décomposent en spores rondes et rectangulaires.
Trichophytose. C'est une maladie fongique de la peau et de ses annexes avec une tendance particulière à affecter les cheveux [lat. trichos cheveux + phyton champignon]. De nombreuses lésions d'un diamètre d'environ 1,5 cm apparaissent sur le cuir chevelu. La peau sur eux est œdémateuse, hyperémique, couverte d'écailles. Les poils des lésions se cassent à 2-3 mm au-dessus de la surface de la peau, d'où le nom de "teigne".
L'examen microscopique révèle une caractéristique des champignons Trichophyton - la disposition de leurs spores en chaînes. Selon les propriétés des champignons, il y a :
Endothrix (agent causal de la trichophytose superficielle). Les champignons poussent à l'intérieur du cheveu, modifiant radicalement sa structure. Les cheveux entiers sont remplis (bourrés) de rangées parallèles de chaînes, constituées de grandes spores arrondies ou carrées;
Ectothrix (agent causal de la trichophytose profonde), dans lequel le poil est enveloppé dans une gaine de petites ou grandes spores disposées le long de l'axe en chaînes.
Favus est une gale. Les cheveux et la peau sont touchés, moins souvent les ongles. Les cheveux deviennent fins, ternes, « poudrés », comme de vieilles perruques, mais ne se cassent pas. Les lésions cutanées se caractérisent par l'apparition de croûtes jaune-gris (écailles) à bords relevés, comme celles des soucoupes.
L'examen microscopique révèle des bulles d'air à l'intérieur des cheveux affectés.
Microsporie. La peau et les cheveux sont touchés. Dans les lésions, les poils se cassent à un niveau de 6 à 8 mm au-dessus de la surface de la peau. Des gaines blanchâtres sont visibles autour des souches restantes.
L'examen microscopique des cheveux affectés révèle des spores qui sont disposées autour et à l'intérieur des cheveux selon un motif en mosaïque (au hasard). Ils sont très petits (1 à 3 mm), d'où le nom de la maladie. La lueur fluorescente caractéristique des cheveux aide à diagnostiquer la microsporie.
L'examen microscopique révèle des cellules bourgeonnantes arrondies, souvent sous la forme d'une grappe de raisin.
Mycoses profondes (moisissure). Ils sont plus fréquents sous forme de maladies professionnelles dans les usines d'antibiotiques, chez les travailleurs agricoles en contact avec des céréales moisies, du foin, du compost, etc. L'agent causal de la pénicilliose (champignon de la brosse) a un mycélium rugueux, large et septique se terminant par une brosse. L'agent causal de la mucorose a un large mycélium non septique se terminant par un sac de spores. L'agent causal de l'aspergillose (moisissure leucémique) se trouve souvent sur les fruits et le pain moisis. Il a un mycélium cloisonné grossier, se terminant par une expansion, à partir de laquelle des fils avec des spores ressemblent à un arrosoir avec des jets d'eau.
Actinomycose. Causée par différents types de champignons radieux. Elle se caractérise par la formation d'infiltrats denses sur la peau, les muqueuses et dans les organes internes, sujets à la suppuration et à l'apparition de fistules. De petits granules jaunes avec un bord rayonnant caractéristique - des druses d'actinomycètes sont visibles dans l'écoulement de la fistule. Les préparations pour la microscopie sont préparées à partir de l'écoulement des fistules et des expectorations.
À faible grossissement, les druses du champignon radiant ont l'apparence de formations jaunâtres et arrondies avec un milieu amorphe clair et une couleur plus foncée sur les bords. À fort grossissement, des filaments de mycélium sont déterminés au centre des drusen et des renflements en forme de flacon le long de la périphérie. Lors de la coloration selon Gram, les filaments du mycélium sont G + et les cônes sont G-.
Diagnostic précis des mycoses invasives pas facile. Ceci s'explique non seulement par les difficultés d'obtention d'une culture de champignons, mais aussi par l'interprétation des résultats de la recherche, puisque les champignons, tant levures que mycéliens, peuvent coloniser les muqueuses et contaminer les échantillons à l'étude. À cet égard, le diagnostic des mycoses invasives repose sur une approche intégrée, qui comprend non seulement les résultats des études mycologiques (culturelles) et sérologiques (détermination de l'antigène fongique), mais également les symptômes cliniques de l'infection fongique, les données des méthodes de recherche auxiliaires. (imagerie par résonance magnétique ou informatique, échographie ).
Groupe coopératif euro-américain pour l'étude des mycoses invasives chez les patients immunodéprimés, des critères de diagnostic des mycoses invasives ont été développés. Ils ont été présentés en 2001 à la Conférence internationale sur les antimicrobiens et la chimiothérapie (ICAAC, Chicago), et en 2002 sous forme imprimée. Les critères de mycose invasive avérée, probable et possible, dont l'utilisation est recommandée dans les études cliniques et épidémiologiques, ont été déterminés.
Mycose invasive prouvée due à des champignons filamenteux: détection de mycélium fongique dans des biopsies ou des prélèvements lors d'un examen histologique ou cytologique ou d'un isolement de culture à partir d'échantillons obtenus dans des conditions aseptiques à partir d'un foyer stérile, qui, selon les résultats des études cliniques et radiologiques, est associé à une infection, à l'exception de études sur les urines et les muqueuses.
Mycose invasive prouvée due à la levure: détection de cellules de levure (les champignons du genre Candida peuvent former du pseudomycélium ou du vrai mycélium) dans des biopsies ou des aspirations, à l'exception des prélèvements de muqueuses, ou isolement de culture à partir de prélèvements obtenus en conditions aseptiques à partir d'un foyer normalement stérile, qui, selon les résultats des études cliniques et radiologiques associées à l'infection, à l'exception des prélèvements d'urine, des sinus et des muqueuses, ou détection par microscopie et coloration spécifique (dans une goutte d'encre, coloration à la mucicarmine) de cellules de levure ou d'antigène positif Cryptococcus spp . dans le liquide céphalo-rachidien.
Fongémie due à des champignons filamenteux: isolement d'hémocultures de champignons, à l'exception d'Aspergillus spp. et Penicillium spp., y compris Penicillium marneffei, en association avec des symptômes cliniques d'un processus infectieux compatible avec l'agent pathogène isolé.
Fongémie due à des champignons de levure: Isolement des hémocultures de Candida ou d'autres champignons de la levure chez les patients présentant des signes cliniques d'infection associés à cet agent pathogène.
Complexe d'études diagnostiques pour les mycoses invasives
| Biomatériau étudié | Indication, média utilisé, valeur |
| Du sang |
Les indications:
fièvre persistante (4-5 jours ou plus) pendant le traitement avec des antibiotiques à large spectre; deuxième "vague" de fièvre sur fond d'antibiothérapie Collecte de sang d'une veine dans des flacons pour les bactéries aérobies * ou en milieu sélectif pour champignons, répété (2-3 fois dans la journée avec un intervalle de 1 heure) Pertinence diagnostique: isolement de levure, interprétation prudente lors de l'isolement de champignons filamenteux, à l'exception de Fusarium spp. |
| Cathéter veineux |
Les indications:
isolement de levure du sang Le cathéter veineux central ou périphérique est retiré dans tous les cas de sécrétion de levure dans le sang Pour l'examen mycologique, on utilise un segment distal du cathéter prélevé aseptiquement de 5 à 6 cm de long.L'étude est réalisée par une méthode semi-quantitative (méthode Maki) ou quantitative sur Sabouraud Pertinence diagnostique:
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| Écoulement des voies respiratoires supérieures, crachats, lavage de la trachée, des bronches, liquide de lavage broncho-alvéolaire |
Les indications:
suspicion de mycoses causées par des champignons filamenteux ou Cryptococcus neoformans ; fièvre prolongée pendant le traitement par antibiotiques à large spectre et neutropénie Microscopie d'échantillons au calcofluor blanc (détection de mycélium ou pseudomycélium) ; semer le mercredi de Saburo; détermination de l'antigène d'Aspergillus dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire en présence de foyers dans les poumons caractéristiques de l'aspergillose invasive Pertinence diagnostique: Isolement de champignons filamenteux ou Cryptococcus neoformans |
| Liquide cérébro-spinal |
Les indications:
symptômes de méningite; détection d'un foyer (foyers) dans le cerveau par imagerie par résonance magnétique ou calculée ; Symptômes "cérébraux" associés à la fièvre et à la neutropénie Microscopie au calcofluor blanc, dans une goutte d'encre ; détermination de l'antigène d'Aspergillus, Cryptococcus ; semis mercredi Saburo Pertinence diagnostique:
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| Biopsies, aspiration, liquide péritonéal, liquide pleural |
Les indications:
signes cliniques et/ou radiologiques de mycose invasive ; fièvre pendant le traitement avec des antibiotiques à large spectre. Microscopie au calcofluor blanc, placage sur milieu de Sabouraud Pertinence diagnostique:
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Mycose invasive probable diagnostiqué avec la combinaison des critères suivants :
un trait de la catégorie des critères microbiologiques ;
un signe de la catégorie « significatif » ou deux du groupe des symptômes cliniques « moins importants » du processus infectieux.
Mycose invasive possible diagnostiqué sur la base d'une combinaison des critères suivants:
la présence d'au moins un facteur de risque induisant le développement d'une mycose invasive ;
un signe de la catégorie des critères microbiologiques ou un signe de la catégorie des symptômes cliniques "significatifs" (deux du groupe des "moins significatifs") du processus infectieux.
Le concept " mycose invasive possible»Non recommandé pour une utilisation dans les essais cliniques étudiant l'efficacité des médicaments antifongiques. Vous pouvez utiliser ce terme dans l'analyse de la thérapie antifongique empirique, les études épidémiologiques, l'étude de la pharmacoéconomie.
À recherche mycologique Les aspirations ou biopsies stériles prennent en compte non seulement l'isolement de la culture fongique, mais aussi la détection de mycélium ou pseudomycélium par microscopie. Dans les préparations histologiques, Aspergillus est difficile à différencier de Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum et d'autres champignons filamenteux. Pour le diagnostic différentiel, une étude immunohistochimique avec des anticorps dirigés contre Aspergillus doit être réalisée.
Isolement des champignons de la levure du sang au moins dans une étude appartient à la catégorie des mycoses invasives « prouvées » et est une indication absolue pour la nomination d'antimycotiques systémiques chez les patients atteints de neutropénie. La fréquence de détection des champignons de levure dans le sang est faible, même avec une candidose disséminée, elle est de 35 à 50%.
Réalisation hémocultures répétées augmente la probabilité d'obtenir des résultats positifs.
Autre interprétation résultats en cas de détection de champignons filamenteux dans le sang. La fréquence élevée d'isolement des champignons filamenteux est caractéristique de Fusarium spp. et est de 40-60%. Aspergillus est rarement trouvé et est considéré comme une contamination dans la plupart des cas, à l'exception d'Aspergillus terreus.
Mise en évidence Aspergillus terreus du sang de patients atteints d'hémoblastose peut indiquer une véritable aspergillinémie, et en présence de symptômes cliniques d'infection, c'est la base de la nomination d'antimycotiques.
Critères de mycose invasive
| Indice | Critères |
| Facteurs induisant l'apparition d'une mycose invasive (macro-organisme) | Neutropénie (< 0,5*109/л в течение 10 дней)
Fièvre persistante pendant plus de 96 heures avec une antibiothérapie à large spectre Température corporelle supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C et l'un des signes prédisposants suivants : neutropénie prolongée (plus de 10 jours) au cours des 60 jours précédents, traitement immunosuppresseur intensif au cours des 30 derniers jours, mycose invasive avérée ou probable au cours des neutropénie menstruelle ou SIDA Symptômes de GVHD, principalement des cas d'évolution sévère (degré II) ou d'évolution étendue de maladie chronique Utilisation à long terme (plus de 3 semaines) de glucocorticoïdes au cours des 60 derniers jours |
| Signes microbiologiques | Isolement d'une culture de champignons filamenteux (y compris Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. Et zygomycètes) et Cryptococcus neqformans à partir d'expectorations ou de liquide de lavage bronchoalvéolaire Résultats positifs de culture ou d'examen cytologique (microscopie directe) pour la détection de champignons filamenteux à partir d'aspirations des sinus paranasaux Détection de champignons filamenteux ou Cryptococcus neoformans par cytologie / microscopie directe à partir d'expectorations ou de liquide de lavage broncho-alvéolaire Antigène d'Aspergillus positif dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide céphalorachidien et les échantillons de sang (au moins deux) Antigène positif de cryptococcus dans des échantillons de sang Détection par examen cytologique ou microscopie directe d'éléments fongiques dans des échantillons de liquide normalement stériles (par exemple, Cryptococcus spp. Dans le liquide céphalo-rachidien) Deux résultats positifs d'études sur la détection d'une culture de levures dans les urines en l'absence de sonde urinaire Cristaux de Candida dans l'urine en l'absence de sonde urinaire Isolement de Candida spp. à partir d'hémocultures |
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Signes cliniques
Voies respiratoires inférieures |
Doit être associé au locus à partir duquel les échantillons sont prélevés pour examen microbiologique L'un des types suivants de nouveaux infiltrats pulmonaires à la TDM : symptôme de halo, symptôme de croissant, cavité avec zones de consolidation * Symptômes d'une infection des voies respiratoires inférieures (toux, douleur thoracique, hémoptysie, dyspnée), souffle de friction pleurale, tout nouvel infiltrat non inclus dans les signes de sévérité élevée ; épanchement pleural |
| Des voies respiratoires supérieures Signes de grande importance Signes de moindre importance |
Signes radiologiques d'infection invasive des sinus (érosion de la paroi ou propagation de l'infection aux structures adjacentes, destruction importante des os du crâne) Nez qui coule, congestion nasale, ulcération de la muqueuse nasale, épistaxis, œdème périorbitaire, douleur de la mâchoire supérieure, ulcération nécrotique noire ou perforation du palais dur |
| système nerveux central Signes de grande importance Signes de moindre importance |
Signes radiographiques d'une infection suspectée du SNC (mastoïdite ou autre foyer paraméningé, empyème extradural, lésions multiples dans le cerveau ou la moelle épinière) Symptômes et signes neurologiques focaux, y compris crises focales, hémiparésie ; troubles de la conscience, symptômes méningés, violations de la composition biochimique du liquide céphalo-rachidien et de sa composition cellulaire (en l'absence d'autres agents pathogènes, selon la culture et la microscopie, en l'absence de cellules tumorales) |
À détection dans le sang ou d'autres biosubstrats stériles de champignons de levure, il est impératif d'identifier l'espèce et de déterminer la sensibilité aux médicaments antifongiques, lors de l'isolement de champignons filamenteux (moisissure) - seule identification à l'espèce, la sensibilité n'est pas déterminée.
En clinique s'entraîner la sensibilité des champignons filamenteux n'est pas étudiée en raison de normes imparfaites pour déterminer la sensibilité de ces champignons aux antimycotiques. De plus, une seule étude a démontré une corrélation entre la sensibilité d'Aspergillus spp. et les résultats du traitement de l'aspergillose invasive chez les patients atteints d'hémoblastose. Aucune des études menées depuis n'a obtenu des résultats similaires.
Récemment, des rapports isolés ont commencé à apparaître sur la formation d'une résistance acquise des champignons A. fumigatus à l'itraconazole, le voriconazole.
Identification des champignons par espèce, en particulier ceux obtenus à partir de loci stériles, est nécessaire, tout d'abord, pour la sélection d'un antimycosique et pour une thérapie antifongique adéquate. Ainsi, les Candida krusei sont résistantes au fluconazole et moins sensibles que d'autres espèces de levures à l'amphotéricine B ; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. résistant à l'amphotéricine B; Les mucorales sont résistantes à l'itraconazole, au voriconazole, Candida glabrata présente une sensibilité dose-dépendante au fluconazole, et lors de l'isolement de ce type de champignon, même des souches sensibles, la dose de fluconazole doit être augmentée (les adultes sont prescrits 800 mg au lieu de 400 mg) ; Candida lusitaniae est résistant à l'amphotéricine B.
Identification des champignons par espèce Il est également important pour effectuer une analyse épidémiologique dans un hôpital - déterminer les agents responsables des épidémies et, si possible, la source de l'infection. Des épidémies d'infection causées par des champignons rares tels que C. lusitaniae, C. krusei, C. lipolytica sont décrites.
Basé identification des espèces de champignons on peut supposer une mycose invasive ou une colonisation fongique des muqueuses. Par exemple, Aspergillus niger est significativement moins susceptible qu'Aspergillus fumigatus de provoquer une aspergillose invasive chez les patients atteints de leucémie aiguë. L'isolement d'Aspergillus niger à partir du liquide de lavage broncho-alvéolaire est le plus souvent considéré comme une colonisation des voies respiratoires et des expectorations - comme une contamination de l'air et nécessite des recherches supplémentaires pour confirmer le diagnostic d'aspergillose invasive.
Basé excrétion de champignons filamenteuxà partir d'expectorations, de liquide broncho-alvéolaire, d'aspiration des sinus paranasaux, on ne peut que supposer une mycose invasive, sans l'inclure dans la catégorie des « prouvées ». Cependant, la détection d'Aspergillus dans les crachats, en particulier Aspergillus fumigatus ou Aspergillus flavus, chez les patients neutropéniques, receveurs de moelle osseuse allogénique, doit toujours être envisagée. Cela nécessite un examen mycologique répété et une tomodensitométrie des poumons. Ainsi, avec la neutropénie, la probabilité de détecter une aspergillose invasive en cas de culture positive d'Aspergillus spp. dans les expectorations est de 80 %.
Mise en évidence Cryptococcus neoformans chez les patients immunodéprimés des voies respiratoires (lavages, lavages) est diagnostiquement significatif. Si l'identification des levures à partir des fluides provenant des voies respiratoires (lavage de la trachée, des bronches, lavage broncho-alvéolaire) des patients immunodéprimés n'est pas obligatoire, alors un dépistage pour la détection de Cryptococcus neoformans à partir de ces échantillons est nécessaire.
Détection de candida dans l'urine chez les patients atteints de neutropénie et de fièvre, elle est généralement considérée comme une manifestation d'une infection à candidose disséminée.
En temps opportun Diagnostique invasive a utilisé avec succès un test commercial pour détecter la circulation de l'antigène spécifique des champignons Aspergillus spp. galactomanna (composant polysaccharidique hydrosoluble de la paroi cellulaire fongique).
Galactomann peut être déterminé par deux méthodes : la méthode d'agglutination au latex (Pastorex Aspergillus, BioRAD) et le test immuno-enzymatique (Platelia Aspergillus, BioRAD).
L'avantage dosage immunoenzymatique est un seuil de sensibilité inférieur pour déterminer le niveau de galactomann dans le sang - 1 ng / ml ou moins, et à l'aide d'une agglutination au latex - 15 ng / ml. La définition de la galactomancie dans le sang (dans au moins 2 prélèvements), le liquide céphalo-rachidien, le lavage broncho-alvéolaire a une valeur diagnostique. La sensibilité du dosage immuno-enzymatique est d'environ 90 %, la spécificité est de 90 à 99 % ; chez les receveurs de moelle osseuse allogénique, ces indicateurs sont inférieurs et égaux à 60 à 70 % et 80 à 90 %, respectivement, en raison de la utilisation prophylactique de médicaments antifongiques (les antimycosiques réduisent le niveau seuil de galactomann).
Dans 40 % des cas, la détection galactomancie dans le sang, il est en avance sur les manifestations de l'aspergillose invasive, déterminée par une étude informatique des poumons, et dans 70 %, il est en avance sur les symptômes cliniques de l'infection.
Valeur diagnostique du test de détection d'antigène Aspergillus a dans le cas où l'étude est réalisée à plusieurs reprises. La détermination de l'antigène d'Aspergillus dans le sang doit être effectuée en cas de fièvre pendant le traitement par antibiotiques à large spectre chez les patients atteints de neutropénie 2 fois par semaine ; avec une pneumonie qui survient ou persiste dans le contexte d'un traitement antibiotique; lors de la détection de foyers dans le tissu pulmonaire (tomodensitométrie).
Les principales méthodes de diagnostic étiologique en laboratoire des mycoses restent à ce jour des méthodes classiques, notamment la microscopie du matériel, l'isolement d'une culture pure de l'agent pathogène avec son identification ultérieure. Les méthodes de diagnostic immunologiques sont d'une importance secondaire. Ils sont utilisés pour identifier les agents pathogènes les plus importants : les champignons dimorphes pathogènes, ainsi que les agents responsables de la cryptococcose, de la candidose et de l'aspergillose. Les méthodes de génoindication (amplification en chaîne par polymérase) ont également une application limitée en raison de leur manque de spécificité, mais sont principalement utilisées dans le diagnostic des mycoses profondes et opportunistes.
Le matériel de recherche pour le diagnostic en laboratoire des mycoses, en fonction de la forme de la maladie, peut être: la peau et ses annexes (cheveux, ongles), écoulement de plaies et de fistules, crachats, sang, liquide céphalo-rachidien et urine, biopsies tissulaires. L'exactitude de la prise de matériel pathologique est largement déterminée par l'efficacité des recherches ultérieures en laboratoire. En cas de lésions cutanées, le matériel est sélectionné le plus souvent par grattage ou à l'aide de ruban adhésif (principalement pour les formes superficielles) avant traitement à partir de foyers frais mais pleinement développés le long de la périphérie, où se trouvent les agents pathogènes les plus viables.
Lors de la détection des champignons dermatophytes, les cheveux sont un matériau extrêmement informatif, car la nature de la lésion capillaire permet d'identifier l'agent pathogène. Dans certains cas, l'utilisation d'une lampe à bois permet de déterminer le foyer de la lésion. Les poils affectés, ainsi que les écailles, sont enlevés avec une pince à épiler. Dans la trichophytose chronique à point noir, les poils sont retirés de la peau avec une aiguille à dissection.
Les ongles sont prélevés le long de toutes les couches, coupés avec un scalpel ou des ciseaux pointus. La sélection à l'aide d'une fraise dentaire est plus efficace. En cas de lésions de candidose, le matériau est sélectionné par grattage du rouleau à ongles. Le matériel sélectionné est livré au laboratoire dans des sacs en papier foncé pour éviter le dessèchement et la contamination par la microflore étrangère. Le matériel contenant du pus est livré dans des empreintes bactériennes stériles ou des boîtes de Pétri. Les crachats sont recueillis dans un récipient stérile. L'examen des crachats doit être effectué au plus tard 2 heures après le prélèvement. Lorsque la période d'étude est prolongée, les échantillons doivent être conservés au réfrigérateur à + 4 ° C, sinon des erreurs de diagnostic liées à l'apparition de formes pseudomycéliennes de cellules de levure peuvent survenir.
Le sang et le liquide céphalo-rachidien sont prélevés de manière aseptique. L'ensemencement du sang s'effectue dans le milieu liquide de Sabouraud. Pour exclure la contamination des échantillons de sang, ils sont réexaminés. Le liquide céphalo-rachidien est centrifugé et le sédiment est utilisé pour la microscopie et l'inoculation.
L'urine est recueillie le matin dans un récipient stérile, alors qu'il faut éviter la contamination du matériel par la microflore de la peau du périnée. La culture d'urine est réalisée en utilisant des méthodes de culture quantitatives.
Dans le diagnostic des mycoses, des préparations sont utilisées à la fois à partir de matériel natif et colorées. Lors de l'examen de préparations non colorées, le matériau dense est préalablement clarifié (macéré) avec une solution de KOH à 10-30 % (des solutions de diméthylsulfoxyde peuvent être utilisées), puis microscopique selon la méthode de la « goutte écrasée ». Pour ajouter du contraste, les préparations sont colorées avec une solution aqueuse de bleu de méthylène.
La coloration des frottis fixés est réalisée de différentes manières: selon Gram, bleu de méthylène, selon Romanovsky - Giemsa. Cette dernière méthode vous permet de voir les petites cellules de levure et les stades de la phagocytose. Pour les cryptocoques, utilisez la coloration à l'encre, la coloration Southgate à la mucicarmine. Champignons contenant de la mélanine (de couleur foncée), par exemple Bandana Cladophialophora, coloré par Mass - Fontana (couleur de la mélanine, qui fait partie de la paroi cellulaire). Les sérums fluorescents sont utilisés dans le diagnostic des agents pathogènes des mycoses profondes, des agents pathogènes de la dermatophytose, des champignons du genre Candidose.
L'isolement d'une culture pure du pathogène permet d'établir l'affiliation générique et espèce du champignon, d'étudier ses propriétés et sa sensibilité aux médicaments antimicrobiens. Pour l'isolement et l'identification des champignons, des milieux de culture denses et liquides de Sabouraud, moût-agar sont utilisés. Ces environnements favorisent la croissance de la plupart des champignons pathogènes et opportunistes. De plus, l'environnement de Sabouraud (Fig. 8.2) stimule les processus de formation de pigments chez les champignons, ce qui est important pour l'identification.
Pour supprimer la croissance des bactéries contaminantes, des antibiotiques sont ajoutés au milieu: chloramphénicol, streptomycine, pénicilline, tétracycline. Pour l'isolement de champignons pathogènes fantaisistes, des milieux enrichis de sang et d'extrait de cœur de cerveau sont utilisés. Des milieux spéciaux sont utilisés pour la culture et l'identification des champignons : milieu de Czapek - pour la formation de conidies dans l'identification des moisissures, gélose pomme de terre (pomme de terre-carotte), gélose au riz - pour l'identification des types de croissance et la production de chlamydospores dans le identification des champignons du genre Candidose, gélose à la carotte (légume) - pour l'obtention de colonies de culture fongique typiques Trichophyton schonleini, Milieu de Kashkin - pour l'isolement des champignons formant des pigments. Des environnements de diagnostic différentiel sont également utilisés, par exemple, pour identifier C. albicans - milieu chromogène ou milieu qui permet de déterminer l'activité phospholipase du champignon.
Le temps d'incubation des champignons varie de plusieurs jours à 1 mois ou plus. Si des champignons dimorphes pathogènes sont suspectés, la culture est effectuée pendant 8 semaines pour donner une réponse négative.
Les inoculations sont réalisées sur des milieux versés dans des éprouvettes, flacons et boîtes de Pétri. L'inoculation du matériel sur les champignons dermatophytes est réalisée simultanément sur plusieurs éprouvettes avec le milieu. Les matériaux suspectés d'avoir des moisissures (crachats) sont ensemencés en 3 points et incubés à 28 et 37°C. Pour résoudre le problème de l'absence de contamination lors du prélèvement du matériel, des cultures d'air de contrôle sont réalisées pour le contenu en moisissures dans les locaux du laboratoire et les services où se trouvent les patients.
Lors de la culture de champignons dans un laboratoire mycologique, des mesures de sécurité sont observées, similaires à celles des laboratoires bactériologiques. Afin d'éviter l'allergisation, le personnel effectue des travaux avec des moisissures et des mycotoxines dans des salles en caisson dans des pansements de gaze ou dans des boîtes de table avec une hotte. Le travail avec des cultures appartenant au groupe II de pathogénicité (champignons dimorphes pathogènes) n'est possible que dans des laboratoires spécialisés.
L'identification des espèces fongiques est effectuée sur la base d'un complexe de caractéristiques culturelles, morphologiques et autres. Les premiers comprennent la morphologie de la colonie, sa couleur et sa taille lorsqu'ils sont cultivés sur des supports spéciaux, la structure du bord et du centre, la nature de la surface, la présence et la nature des organes reproducteurs, le second - les caractéristiques du microscopique structure du mycélium, la structure, la forme et la taille des organes reproducteurs - conidiophores, conidies, chlamydospore, arthrospore, etc.
Les champignons forment divers types de colonies sur des milieux nutritifs solides. Les scientifiques du G. Venter Institute (États-Unis), prenant en compte la capacité des champignons à libérer des substances pigmentaires dans le milieu, ont créé un "arbre de Noël" dans le milieu nutritif (Fig. 8.3).
Riz. 8.3. « Sapin de Noël » de champignons (en haut : Talaromyces stipitatus; bois Aspergillus nidulans; décorations : Penicillium marneffei; souche: Aspergillus terreus)
Les capacités enzymatiques et assimilatrices des cultures sont d'une grande importance dans l'identification des levures (champignons de type levure). Actuellement, des systèmes de test commerciaux sont utilisés pour identifier les champignons courants - agents responsables de maladies humaines et animales : BBL Mycotube, API 20C bio Mérieux, etc.
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