Citokinų poveikis ląstelėms atliekamas per. Citokinai. Antivirusinis imunitetas molekuliniai ir ląsteliniai mechanizmai, vystymosi modeliai ir imunopato

Dar visai neseniai 4 stadijos vėžys iš tikrųjų buvo mirties nuosprendis pacientui. Tradiciniai gydymo metodai nelabai padėjo, visa terapija apsiribojo simptomų palengvinimu. Tačiau prieš kelis dešimtmečius jie pradėjo aktyviai plėtoti imuninę onkologiją ir ypač citokinų terapiją - gydymo vaistais metodą, pagrįstą kūno baltymais, kuris, remiantis apžvalgomis, yra labai veiksmingas. Maskvoje onkoimmunologijos ir citokinų terapijos klinika yra laikoma viena geriausių pasaulyje dėl savo teigiamų rodiklių.

Kas yra citokinų terapija

Šis gydymo metodas sukurtas remiantis imunine onkologija-onkologijos šaka, tiriančia imuninės sistemos veiklą sergant vėžiu. Metodas pagrįstas vėžio ir kitų ligų gydymu vaistais, kurių pagrindą sudaro žmogaus organizmo baltymai (citokinai). Tam tikromis sąlygomis jie gali sunaikinti įvairius patogenus: svetimas ląsteles, virusus, antigenus, endotoksinus ir kt. Kaip veikia citokinai:

organizmo imunologinio atsako į patogenų ataką aktyvinimas;
imuninės sistemos, žudikų ląstelių (elementų, tiesiogiai kovojančių su liga) darbo kontrolė;
išprovokuoti ląstelių masės atnaujinimą į sveiką;
organizmo sistemų normalizavimas.

Teigiamas veiksmas

Darbo su citokinais įtraukimas į kompleksinį onkologijos gydymą padeda pasiekti absoliučiai teigiamą terapiją 10-30% pacientų, o dalinė sėkmė siekia 90%. Gali atrodyti, kad to nepakanka, tačiau sunkiems paskutinių stadijų vėžiniams navikams tai yra didžiulis pasiekimas. Be to, šią techniką galima ir reikia derinti su tradiciniais metodais (vaistais, chemoterapija).

Citokinų terapija veikia kokybiškai ir tiksliai prieš navikus, metastazes ir tuo pačiu neturi toksinio poveikio organizmui. Atskirai verta paminėti teigiamą chemoterapijos kokybės padidėjimą. Ši technika jau įrodė savo veiksmingumą klinikinių tyrimų metu (Rusijos Federacijoje leidžiama gydyti daugiau nei 50 įvairių tipų patologijų). Be onkologinių ligų, citokinų terapija sėkmingai kovoja su kitomis patologijomis:

onkologija iki 4 stadijos;
virusinis hepatitas B, C;
melanoma;
Kapoši sarkoma ŽIV fone;
AIDS ir ŽIV;
SARS, gripas, bakterinės žarnyno ir rotavirusinės infekcijos;
tuberkuliozė;
juostinė pūslelinė;
šizofrenija;
išsėtinė sklerozė.

Onkoimunologija ir citokinų terapija

Tiesą sakant, visi piktybiniai navikai, turintys sunkią eigą, atsiranda susilpnėjusio imuniteto fone. Klinikinių tyrimų fone onkoimunologai (imuninės onkologijos specialistai), remdamiesi imuninės sistemos veiksmais, kuria naujus vėžio gydymo metodus ir vaistus. Citokinų terapijos metodas pagrįstas citokinų, specialių baltymų naudojimu, o pati technika pasirodė XX amžiaus 80 -aisiais. Pagrindinė problema buvo didelis vaistų toksiškumas. Šiuolaikinių vaistų, pagrįstų citokinais, toksiškumas yra 100 kartų mažesnis.

Citokinų funkcijos organizme

Žmogaus organizme yra didžiulis kiekis citokinų, jie visi atlieka skirtingas funkcijas. Citokinų terapija naudoja šią įvairovę įvairioms ligoms gydyti ir vidiniams organizmo procesams suaktyvinti. Įrodyta, kad iš tikrųjų žmogaus sistemos gali kovoti su bet kokia problema. Svarbiausia yra pradėti reikiamus procesus. Citokinų funkcijos organizme:

imuninio atsako trukmės ir kokybės kontrolė;
priešuždegiminiai citokinai kontroliuoja uždegimą;
skatinti autoimuninių reakcijų (priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų) vystymąsi;
dalyvavimas alergijos mechanikoje;
naviko sumažinimas arba jo sunaikinimas;
ląstelių augimo stimuliavimas arba slopinimas;
lėtinant onkologijos vystymąsi;
imuninės, endokrininės ir nervų sistemų koordinavimas;
naviko pasikartojimo prevencija;
palaikyti kūno homeostazę (sveiką pastovumą).

Ištirtų citokinų baltymų skaičius jau viršijo 200 pavadinimų. Citokinų sąveika yra sudėtinga ir atlieka skirtingas funkcijas. Iš pradžių jie skirstomi pagal veiklos rūšį. Supaprastinta klasifikacija numato suskirstymą pagal biologinį poveikį: uždegimo reguliatorius (priešuždegiminius ir priešuždegiminius citokinus), reguliuojančius ląstelių imunitetą ir humoralinį imuninį padalijimą. Tikslesnė sisteminimas suskaido baltymus pagal jų veikimo pobūdį. Citokinų tipai:

imuninės veiklos reguliatoriai (interleukinai ir jų biologinės funkcijos užtikrina teisingą imuniteto sąveiką su kitomis kūno sistemomis);
antivirusiniai reguliatoriai - interferonai;
TNF (naviko nekrozės faktoriai) - reguliuojantis arba toksinis poveikis ląstelėms;
chemokinai - visų tipų leukocitų, kitų ląstelių judėjimo kontrolė;
augimo faktoriai - ląstelių augimo kontrolė;
kolonijas stimuliuojantys veiksniai - skatina kraujodaros ląstelių vystymąsi.

Citokinai kaip vaistai

Ingaron yra citokinų terapinis agentas, stiprinantis chemoterapijos poveikį, kartu apsaugantis organizmą nuo toksinio poveikio. Be to, jis sumažina galimą metastazių ir navikų atsiradimą. Vaistas „Ingaron“ provokuoja imuniteto vystymąsi, o tai po chemoterapijos neleis vystytis infekcinėms ligoms, sumažins antibakterinių vaistų poreikį. Įrankis turi minimalų toksiškumą, palyginti su Vakarų kolegomis.

Vaistas „Refnot“ skirtas apriboti neoplazmų vystymąsi dėl sudėtyje esančio TNF citokino. Agentas taip pat turi kokybiškai sumažintą toksiškumą, todėl jį galima leisti po oda arba į veną, stimuliuoja piktybinių navikų sunaikinimą, nepažeidžiant kartu esančių audinių. Norint nustatyti gydymo dinamiką, reikia 1-2 kursų. Norint pasiekti maksimalų efektą, abu vaistai yra naudojami kartu, kad aktyvuotų reikiamus citokinus onkologijoje.

Šalutiniai poveikiai

Gydymas citokinais gali sukelti neigiamą poveikį, priklausomai nuo ligos morfologijos, bendros paciento būklės ir vaistų derinio. Dažniausiai šalutinis poveikis nekelia pavojaus pacientui, tačiau rodo naviko reakciją į vaistą. Kai atsiranda antrinių reakcijų, gydymo kursas sustabdomas arba pakoreguojamas gydymo režimas. Galimos neigiamos kūno apraiškos:

kūno temperatūros padidėjimas 2–3 laipsniais praėjus 4–6 valandoms po citokinų įvedimo;
skausmas ir paraudimas injekcijos vietoje;
organizmo apsinuodijimas naviko skilimo produktais (didelio susidarymo atveju).

Kam citokinų terapijos metodas netinka

Citokinų pagrindu pagaminti vaistai praktiškai neturi kontraindikacijų ir gali būti naudojami bet kuriam pacientui. Tačiau, kaip ir vartojant kitus vaistus, yra nemažai pacientų, kuriems nerekomenduojama naudoti šio gydymo metodo. Nenaudokite citokinų terapijos nėščioms moterims žindymo laikotarpiu, esant autoimuninėms ligoms, retai pasireiškiančiai individualiai organizmo alergijai vaistams.

Citokinų terapijos kaina

Efektyvus citokinų vaistų vartojimas pasiekiamas specializuotuose centruose (pavyzdžiui, Maskvos onkoimmunologijos ir citokinų terapijos centras yra geriausia klinika, išgelbėtų pacientų nuomone). Šio tipo gydymo kaina labai skiriasi priklausomai nuo vartojamo vaisto tipo ir konkrečios ligos. Apytikslės kai kurių citokinų vaistų kainos Maskvoje.

Šiame skyriuje bus nagrinėjamas integruotas požiūris į citokinų sistemos vertinimą naudojant anksčiau aprašytus šiuolaikinius tyrimo metodus.

Pirma, mes apibūdiname pagrindines citokinų sistemos sąvokas.

Citokinai šiuo metu laikomi baltymų-peptidų molekulėmis, kurias gamina įvairios kūno ląstelės ir kurios atlieka tarpląstelinę ir tarpsisteminę sąveiką. Citokinai yra universalūs ląstelių gyvavimo ciklo reguliatoriai, jie kontroliuoja pastarųjų diferenciacijos, proliferacijos, funkcinės aktyvacijos ir apoptozės procesus.

Citokinai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės, vadinami imunocitokinais; jie yra tirpių imuninės sistemos peptidų tarpininkų klasė, reikalinga jos vystymuisi, veikimui ir sąveikai su kitomis organizmo sistemomis (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Citokinai, kaip reguliavimo molekulės, atlieka svarbų vaidmenį įgimto ir prisitaikančio imuniteto reakcijose, užtikrina jų tarpusavio ryšį, kontroliuoja kraujodarą, uždegimą, žaizdų gijimą, naujų kraujagyslių susidarymą (angiogenezę) ir daugelį kitų gyvybiškai svarbių procesų.

Šiuo metu yra keletas skirtingų citokinų klasifikacijų, atsižvelgiant į jų struktūrą, funkcinį aktyvumą, kilmę, citokinų receptorių tipą. Tradiciškai, atsižvelgiant į biologinį poveikį, įprasta išskirti šias citokinų grupes.

1. Interleukinai(IL-1-IL-33) yra imuninės sistemos sekreciniai reguliavimo baltymai, užtikrinantys tarpininko sąveiką imuninėje sistemoje ir jos ryšį su kitomis kūno sistemomis. Pagal funkcinį aktyvumą interleukinai skirstomi į priešuždegiminius ir priešuždegiminius citokinus, limfocitų augimo faktorius, reguliuojančius citokinus ir kt.

3. Naviko nekrozės faktoriai (TNF)- citokinai, turintys citotoksinį ir reguliuojantį poveikį: TNFa ir limfotoksinai (LT).

4. Hematopoetinių ląstelių augimo faktoriai-kamieninių ląstelių augimo faktorius (rinkinys-ligandas), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetinas, trobopoetinas, granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius-GM-CSF, granulocitų CSF-G-CSF, makrofagai-

ny KSF - M -KSF).

5. Chemokinai- С, CC, СХС (IL -8), СХ3С - įvairių tipų ląstelių chemotaksės reguliatoriai.

6. Ne limfoidinių ląstelių augimo faktoriai- įvairių audinių ląstelių augimo, diferenciacijos ir funkcinio aktyvumo reguliatoriai (fibroblastų augimo faktorius - FGF, endotelio ląstelių augimo faktorius, epidermio augimo faktorius - epidermio EGF) ir transformuojantys augimo faktoriai (TGFβ, TGFα).

Be kita ko, pastaraisiais metais buvo aktyviai tiriamas makrofagų migraciją slopinantis veiksnys (migraciją slopinantis faktorius - MIF), kuris laikomas neurohormonu, turinčiu citokinų ir fermentinį aktyvumą (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

Citokinai skiriasi struktūra, biologiniu aktyvumu ir kitomis savybėmis. Tačiau kartu su skirtumais citokinai turi bendros savybės, būdingas šiai bioreguliacinių molekulių klasei.

1. Citokinai, kaip taisyklė, yra vidutinės molekulinės masės (mažiau nei 30 kD) glikozilinti polipeptidai.

2. Citokinus gamina imuninės sistemos ląstelės ir kitos ląstelės (pavyzdžiui, endotelis, fibroblastai ir kt.), Reaguodamos į suaktyvinantį stimulą (su patogenu susijusios molekulinės struktūros, antigenai, citokinai ir kt.), Ir dalyvauja reakcijose. įgimto ir prisitaikančio imuniteto, reguliuojančio jų stiprumą ir trukmę. Kai kurie citokinai sintezuojami konstituciškai.

3. Citokinų sekrecija yra trumpalaikis procesas. Citokinai saugomi ne kaip iš anksto suformuotos molekulės, bet jų

sintezė visada prasideda genų transkripcija. Ląstelės gamina citokinus mažomis koncentracijomis (pikogramos mililitre).

4. Daugeliu atvejų citokinai gaminami ir veikia arti esančias tikslines ląsteles (trumpo nuotolio veiksmai). Pagrindinė citokinų veikimo vieta yra tarpląstelinė sinapsė.

5. Atleidimas citokinų sistema pasireiškia tuo, kad kiekvienas ląstelių tipas gali gaminti kelis citokinus, o kiekvieną citokiną gali išskirti skirtingos ląstelės.

6. Visiems citokinams būdinga pleiotropija, arba veiksmo polifunkcionalumas. Taigi uždegimo požymių pasireiškimas atsiranda dėl IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 įtakos. Funkcijų dubliavimasis užtikrina citokinų sistemos patikimumą.

7. Citokinų poveikį tikslinėms ląstelėms lemia labai specifiniai didelio afiniteto membranos receptoriai, kurie yra transmembraniniai glikoproteinai, paprastai susidedantys iš daugiau nei vieno subvieneto. Ekstraląstelinė receptorių dalis yra atsakinga už citokinų surišimą. Yra receptorių, kurie pašalina perteklinį citokinų patologinį židinį. Tai yra vadinamieji gaudyklės receptoriai. Tirpūs receptoriai yra membranos receptorių tarpląstelinis domenas, atskirtas fermentu. Tirpūs receptoriai sugeba neutralizuoti citokinus, dalyvauti jų pernešime į uždegimo židinį ir išskirti iš organizmo.

8. Citokinai dirbti tinklo principu. Jie gali veikti kartu. Atrodo, kad daug funkcijų, iš pradžių priskirtų vienam citokinui, yra suderintos kelių citokinų veiksmų. (sinergija veiksmai). Sinergetinės citokinų sąveikos pavyzdžiai yra uždegiminių reakcijų (IL-1, IL-6 ir TNF-a) stimuliavimas, taip pat IgE sintezė

(IL-4, IL-5 ir IL-13).

Kai kurie citokinai skatina kitų citokinų sintezę (kaskados). Kaskadinis citokinų veikimas yra būtinas uždegiminiams ir imuniniams atsakams vystytis. Kai kurių citokinų gebėjimas sustiprinti ar susilpninti kitų gamybą lemia svarbius teigiamus ir neigiamus reguliavimo mechanizmus.

Yra žinomas antagonistinis citokinų poveikis, pavyzdžiui, IL-6 gamyba, reaguojant į padidėjusią TNFα koncentraciją

neigiamas reguliavimo mechanizmas, skirtas kontroliuoti šio tarpininko gamybą uždegimo metu.

Tikslinių ląstelių funkcijų citokinų reguliavimas atliekamas naudojant autokrininius, parakrininius ar endokrininius mechanizmus. Kai kurie citokinai (IL-1, IL-6, TNFα ir kt.) Gali dalyvauti įgyvendinant visus aukščiau išvardintus mechanizmus.

Ląstelės reakcija į citokino įtaką priklauso nuo kelių veiksnių:

Nuo ląstelių tipo ir jų pradinės funkcinės veiklos;

Nuo vietinės citokino koncentracijos;

Nuo kitų tarpininkų molekulių buvimo.

Taigi gamintojų ląstelės, citokinai ir jų specifiniai receptoriai tikslinėse ląstelėse sudaro vieną tarpininkų tinklą. Galutinį ląstelių atsaką lemia reguliavimo peptidai, o ne atskiri citokinai. Šiuo metu citokinų sistema laikoma universalia viso organizmo lygio reguliavimo sistema, užtikrinančia apsauginių reakcijų vystymąsi (pavyzdžiui, infekcijos metu).

Pastaraisiais metais atsirado citokinų sistemos idėja, apimanti:

1) gamintojo ląstelės;

2) tirpūs citokinai ir jų antagonistai;

3) tikslinės ląstelės ir jų receptoriai (7.1 pav.).

Įvairių citokinų sistemos komponentų pažeidimai sukelia daugybę patologinių procesų, todėl šios reguliavimo sistemos defektų nustatymas yra svarbus norint teisingai diagnozuoti ir paskirti tinkamą gydymą.

Pirma, mes apsvarstysime pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

Citokinus gaminančios ląstelės

I. Pagrindinė adaptacinio imuninio atsako citokinus gaminančių ląstelių grupė yra limfocitai. Poilsio ląstelės neišskiria citokinų. Atpažįstant antigeną ir dalyvaujant receptorių sąveikai (CD28-CD80 / 86 T-limfocitams ir CD40-CD40L B-limfocitams), ląstelės suaktyvėja, o tai lemia citokinų genų transkripciją, glikozilintų peptidų transliaciją ir sekreciją į tarpląstelinį erdvės.

Ryžiai. 7.1. Citokinų sistema

CD4 T-pagalbininkus atstovauja pogrupiai: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, kurie skiriasi sekretuojamų citokinų spektru, reaguojant į įvairius antigenus.

Th0 gamina platų citokinų spektrą labai mažomis koncentracijomis.

Diferenciacijos kryptis Th0 lemia dviejų formų imuninio atsako vystymąsi, vyraujant humoraliniams ar ląsteliniams mechanizmams.

Anti0geno pobūdis, jo koncentracija, lokalizacija ląstelėje, antigeną pateikiančių ląstelių tipas ir tam tikras citokinų rinkinys reguliuoja Th0 diferenciacijos kryptį.

Po antigeno surinkimo ir apdorojimo dendritinės ląstelės pateikia antigeninius peptidus Th0 ląstelėms ir gamina citokinus, kurie reguliuoja jų diferenciacijos į efektorines ląsteles kryptį. Atskirų citokinų vaidmuo šiame procese parodytas fig. 7.2. IL-12 sukelia IFNγ sintezę T-limfocitų ir] HGC. IFNu diferencijuoja Th1, kuris pradeda išskirti citokinus (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, limfotoksinus), kurie reguliuoja reakcijų į tarpląstelinius patogenus vystymąsi.

(uždelsto tipo padidėjęs jautrumas (PHT) ir įvairių tipų ląstelių citotoksiškumas).

IL-4 užtikrina Th0 diferenciaciją į Th2. Suaktyvintas Th2 gamina citokinus (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 ir kt.), Kurie lemia B-limfocitų proliferaciją, tolesnį jų diferenciaciją į plazmos ląsteles ir antikūnų atsako, daugiausia į tarpląsteliniai patogenai.

IFNu neigiamai reguliuoja Th2 ląstelių funkciją ir, atvirkščiai, IL-4, Th2 išskiriamas IL-10 slopina Th1 funkciją (7.3 pav.). Šio reglamento molekulinis mechanizmas yra susijęs su transkripcijos veiksniais. IFNy nustatyta T-bet ir STAT4 išraiška nukreipia T ląstelių diferenciaciją Th1 keliu ir slopina Th2 vystymąsi. IL-4 sukelia GATA-3 ir STAT6 ekspresiją, o tai atitinkamai užtikrina naivaus THO virsmą Th2 ląstelėmis (7.2 pav.).

Pastaraisiais metais buvo aprašyta speciali pagalbinių T ląstelių (Th17), gaminančių IL-17, pogrupis. IL-17 šeimos narius gali išreikšti aktyvuotos atminties ląstelės (CD4 CD45RO), y5T ląstelės, NKT ląstelės, neutrofilai, monocitai, veikiami IL-23, IL-6, TGFβ, kuriuos gamina makrofagai ir dendritinės ląstelės. Pagrindinis diferencijuojantis veiksnys žmonėms yra ROR-C, pelėms-ROR-γ l Buvo parodytas kardinalus IL-17 vaidmuo vystant lėtinį uždegimą ir autoimuninę patologiją (žr. 7.2 pav.).

Be to, užkrūčio liaukos T-limfocitai gali diferencijuotis į natūralias reguliavimo ląsteles (Treg), ekspresuojančias paviršiaus žymenis CD4 + CD25 + ir transkripcijos faktorių FOXP3. Šios ląstelės sugeba slopinti imuninį atsaką, kurį sukelia Th1 ir Th2 ląstelės, tiesioginio tarpląstelinio kontakto ir TGFβ bei IL-10 sintezės būdu.

Th0 klonų ir jų išskiriamų citokinų diferenciacijos schemos parodyta Fig. 7.2 ir 7.3 (taip pat žr. Spalvų intarpą).

T-citotoksinės ląstelės (CD8 +), natūralios žudikės ląstelės yra silpni citokinų, tokių kaip interferonai, TNF-a ir limfotoksinai, gamintojai.

Per didelis vienos iš Th subpopuliacijų aktyvinimas gali lemti vieno iš imuninio atsako variantų vystymąsi. Lėtinis Th aktyvacijos disbalansas gali sukelti imunopatologinių būklių, susijusių su pasireiškimu, susidarymą

alergijos, autoimuninė patologija, lėtiniai uždegiminiai procesai ir kt.

Ryžiai. 7.2. Skirtingos T-limfocitų, gaminančių citokinus, pogrupiai

II. Įgimtos imuninės sistemos pagrindiniai citokinų gamintojai yra mieloidinės ląstelės. Naudodami į Toll panašius receptorius (TLR), jie atpažįsta panašias įvairių patogenų molekulines struktūras, vadinamuosius su patogenais susijusius molekulinius modelius (RAMP), pavyzdžiui, gramneigiamų bakterijų lipopolisacharidą (LPS), lipoteichoines rūgštis, gramteigiamų mikroorganizmų peptidoglikanai, flagellinas, DNR, turinti daug G pakartojimų ir kt.

Ši sąveika su TLR sukelia tarpląstelinio signalo perdavimo kaskadą, dėl kurios atsiranda dviejų pagrindinių citokinų grupių genų ekspresija: priešuždegiminis ir 1 tipo IFN (7.4 pav., Taip pat žr. Spalvos intarpą). Daugiausia šie citokinai (IL -1, -6, -8, -12, TNFa, GM -CSF, IFN, chemokinai ir kt.) Skatina uždegimo vystymąsi ir yra skirti apsaugoti organizmą nuo bakterinių ir virusinių infekcijų.

Ryžiai. 7.3. TH1 ir TH2 ląstelių išskiriamų citokinų spektras

III. Ląstelės, kurios nepriklauso imuninei sistemai (jungiamojo audinio ląstelės, epitelis, endotelis), konstituciškai išskiria autokrininius augimo faktorius (FGF, EGF, TGFR ir kt.). ir citokinai, palaikantys kraujodaros ląstelių dauginimąsi.

Citokinai ir jų antagonistai yra išsamiai aprašytos daugelyje monografijų (Kovalchuk L.V. ir kt., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ryžiai. 7.4. TLR sukelta citokinų gamybos indukcija įgimtų imuninių ląstelių

Pernelyg didelė citokinų ekspresija organizmui yra nesaugi ir gali sukelti per didelį uždegiminį atsaką, ūminės fazės atsaką. Įvairūs inhibitoriai dalyvauja reguliuojant priešuždegiminių citokinų gamybą. Taigi buvo aprašyta nemažai medžiagų, kurios nespecifiškai suriša citokiną IL-1 ir neleidžia pasireikšti jo biologiniam poveikiui (a2-makroglobulinas, C3 komplemento komponentas, uromodulinas). Specifiniai IL-1 inhibitoriai yra tirpūs jauko receptoriai, antikūnai ir IL-1 receptorių antagonistas (IL-1RA). Vystantis uždegimui, padidėja IL-1RA geno ekspresija. Tačiau net ir paprastai šis antagonistas yra kraujyje didelės koncentracijos (iki 1 ng / ml ar daugiau), blokuodamas endogeninio IL-1 veikimą.

Tikslinės ląstelės

Citokinų poveikį tikslinėms ląstelėms lemia specifiniai receptoriai, jungiantys labai dideliu afinitetu citokinus, ir atskiri citokinai gali naudoti

paprasti receptorių subvienetai. Kiekvienas citokinas jungiasi prie savo specifinio receptoriaus.

Citokinų receptoriai yra transmembraniniai baltymai ir yra suskirstyti į 5 pagrindinius tipus. Labiausiai paplitęs yra vadinamasis hematopoetino tipo receptorius, turintis du tarpląstelinius domenus, iš kurių viename yra bendra dviejų pakartotinių triptofano ir serino aminorūgščių liekanų seka, atskirta bet kokia aminorūgštimi (WSXWS motyvas). Antrojo tipo receptoriai gali turėti du tarpląstelinius domenus su daugybe konservuotų cisteinų. Tai yra IL-10 ir IFN šeimos receptoriai. Trečiajam tipui atstovauja citokinų receptoriai, priklausantys TNF grupei. Ketvirtasis citokinų receptorių tipas priklauso imunoglobulino receptorių, turinčių tarpląstelinius domenus, pagal struktūrą panašius į imunoglobulino molekulių domenus, šeimai. Penktąjį receptorių tipą, jungiantį chemokinų šeimos molekules, vaizduoja transmembraniniai baltymai, kertantys ląstelės membraną 7 vietose. Citokinų receptoriai gali egzistuoti tirpia forma, išlaikant galimybę surišti ligandus (Ketlinsky S.A. ir kt., 2008).

Citokinai gali paveikti tikslinių ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, funkcinį aktyvumą ir apoptozę (žr. 7.1 pav.). Citokinų biologinio aktyvumo pasireiškimas tikslinėse ląstelėse priklauso nuo įvairių tarpląstelinių sistemų dalyvavimo perduodant signalą iš receptoriaus, kuris yra susijęs su tikslinių ląstelių savybėmis. Signalas į apoptozę, be kita ko, atliekamas naudojant tam tikrą TNF receptorių šeimos regioną, vadinamąjį „mirties“ domeną (7.5 pav., Žr. Spalvos intarpą). Diferenciacijos ir aktyvinimo signalai perduodami per tarpląstelinius Jak -STAT baltymus - signalų keitiklius ir transkripcijos aktyvatorius (7.6 pav., Žr. Spalvos intarpą). G-baltymai dalyvauja signalizuojant iš chemokinų, o tai padidina migraciją ir ląstelių sukibimą.

Išsami citokinų sistemos analizė apima šiuos dalykus.

I. Gamintojo ląstelių įvertinimas.

1. Išraiškos nustatymas:

Receptoriai, atpažįstantys patogeną ar antigeną TCR, TLR) genų ir baltymų molekulių lygiu (PGR, srauto citometrija);

Adapterio molekulės, atliekančios signalą, kuris sukelia citokinų genų transkripciją (PGR ir kt.);

Ryžiai. 7.5. Signalo perdavimas iš TNF receptorių

Ryžiai. 7.6. Jak -STAT - signalizacijos kelias iš 1 tipo citokinų receptorių

Citokinų genai (PGR); citokinų baltymų molekulės (žmogaus mononuklearinių ląstelių citokinų sintezės funkcijos įvertinimas).

2. Ląstelių, kuriose yra tam tikrų citokinų, pogrupių kiekybinis įvertinimas: Th1, Th2 Th17 (citokinų viduląstelinio dažymo metodas); ląstelių, išskiriančių tam tikrus citokinus, skaičiaus nustatymas (ELISPOT metodas, žr. 4 sk.).

II. Citokinų ir jų antagonistų įvertinimas biologinėse organizmo terpėse.

1. Citokinų biologinio aktyvumo tyrimas.

2. Kiekybinis citokinų nustatymas naudojant ELISA.

3. Imunohistocheminis citokinų dažymas audiniuose.

4. Priešingų citokinų (prieš ir priešuždegiminių), citokinų ir citokinų receptorių antagonistų santykio nustatymas.

III. Tikslinių ląstelių įvertinimas.

1. Citokinų receptorių ekspresijos nustatymas genų ir baltymų molekulių lygiu (PGR, srauto citometrijos metodas).

2. Signalinių molekulių nustatymas ląstelėje.

3. Tikslinių ląstelių funkcinio aktyvumo nustatymas.

Šiuo metu sukurta daug citokinų sistemos įvertinimo metodų, kurie suteikia įvairios informacijos. Tarp jų išskiriami:

1) molekuliniai biologiniai metodai;

2) citokinų kiekybinio nustatymo metodai, naudojant imuninį tyrimą;

3) citokinų biologinio aktyvumo tyrimas;

4) citokinų tarpląstelinis dažymas;

5) ELISPOT metodas, leidžiantis aptikti citokinus aplink vieną citokinus gaminančią ląstelę;

6) imunofluorescencija.

Čia yra trumpas šių metodų aprašymas.

Naudojant molekuliniai biologiniai metodai galima tirti citokinų genų, jų receptorių, signalinių molekulių raišką, tirti šių genų polimorfizmą. Pastaraisiais metais buvo atlikta daugybė tyrimų, kurie atskleidė ryšius tarp citokinų sistemos molekulių genų alelių variantų ir polinkio

daugeliui ligų. Alelinių citokinų genų variantų tyrimas gali suteikti informacijos apie genetiškai užprogramuotą tam tikro citokino gamybą. Jautriausia yra realaus laiko polimerazės grandininė reakcija-RT-PCR (žr. 6 skyrių). Hibridizacijos metodas savo vietoje leidžia išsiaiškinti citokinų geno ekspresijos audinių ir ląstelių lokalizaciją.

Kiekybinį citokinų nustatymą biologiniuose skysčiuose ir periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių kultūrose ELISA būdu galima apibūdinti taip. Kadangi citokinai yra vietiniai tarpininkai, tiksliau išmatuoti jų kiekį atitinkamuose audiniuose po audinių baltymų ekstrahavimo arba natūraliuose skysčiuose, pavyzdžiui, ašarose, plaunant iš ertmių, šlapime, vaisiaus vandenyje, smegenų skystyje ir kt. Citokinų kiekis serume ar kituose kūno skysčiuose atspindi esamą imuninės sistemos būklę, t.y. citokinų sintezė organizmo ląstelėse in vivo.

Citokinų gamybos lygio nustatymas periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (MNC) rodo funkcinę ląstelių būklę. Spontaniška MNC citokinų gamyba kultūroje rodo, kad ląstelės jau yra aktyvuotos in vivo. Citokinų sintezė (įvairių stimuliatorių, mitogenų) atspindi galimą rezervinį ląstelių gebėjimą reaguoti į antigeninį stimulą (ypač į vaistų poveikį). Sumažėjusi indukuota citokinų gamyba gali būti vienas iš imunodeficito būsenos požymių. Citokinai nėra specifiniai tam tikram antigenui. Todėl neįmanoma nustatyti konkrečios infekcinių, autoimuninių ir alerginių ligų diagnozės, nustatant tam tikrų citokinų kiekį. Tuo pačiu metu citokinų lygio įvertinimas leidžia gauti duomenis apie uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygį ir prognozę, imuninės sistemos ląstelių funkcinį aktyvumą, Th1 ir Th2 ląstelių santykį. yra labai svarbi atliekant daugelio infekcinių ir imunopatologinių procesų diferencinę diagnostiką.

Biologinėje terpėje citokinus galima kiekybiškai įvertinti naudojant įvairius imuninės analizės metodai, naudojant polikloninius ir monokloninius antikūnus (žr. 4 skyrių). ELISA leidžia sužinoti, kokia yra tiksli citokinų koncentracija biologiniame

loginiai kūno skysčiai. Su fermentais susijęs citokinų imunosorbentinis tyrimas turi daug privalumų, palyginti su kitais metodais (didelis jautrumas, specifiškumas, nepriklausomumas nuo antagonistų buvimo, tikslios automatizuotos apskaitos galimybė, apskaitos standartizavimas). Tačiau šis metodas taip pat turi savo apribojimų: ELISA neapibūdina citokinų biologinio aktyvumo, jis gali duoti klaidingus rezultatus dėl kryžmiškai reaguojančių epitopų.

Biologiniai tyrimai buvo atliktas remiantis žiniomis apie pagrindines citokinų savybes, jų poveikį tikslinėms ląstelėms. Citokinų biologinio poveikio tyrimas leido sukurti keturių tipų citokinų tyrimus:

1) skatinant tikslinių ląstelių dauginimąsi;

2) dėl citotoksinio poveikio;

3) sukeliant kaulų čiulpų pirmtakų diferenciaciją;

4) dėl antivirusinio poveikio.

IL-1 lemia stimuliuojantis poveikis pelių timocitų proliferacijai, kurį aktyvuoja mitogenas in vitro; IL -2 - gebėjimas skatinti limfoblastų proliferacinį aktyvumą; TNFα ir limfotoksinai tiriami dėl citotoksinio poveikio pelių fibroblastams (L929). Kolonijas stimuliuojantys veiksniai vertinami dėl jų gebėjimo palaikyti kaulų čiulpų pirmtakų augimą kolonijų pavidalu agare. Antivirusinis IFN aktyvumas nustatomas slopinant virusų citopatinį poveikį žmogaus diploidinių fibroblastų kultūroje ir pelių fibroblastų naviko linijoje L-929.

Buvo sukurtos ląstelių linijos, kurių augimas priklauso nuo tam tikrų citokinų buvimo. Lentelė 7.1 yra ląstelių linijų, naudojamų citokinų tyrimams, sąrašas. Atsižvelgiant į gebėjimą paskatinti jautrių tikslinių ląstelių dauginimąsi, atliekamas biotestas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 ir kt. Tačiau šie bandymo metodai nėra pakankamai jautrūs ir informatyvūs. Inhibitorių ir antagonistų molekulės gali užmaskuoti citokinų biologinį aktyvumą. Kai kurie citokinai pasižymi bendru biologiniu aktyvumu. Nepaisant to, šie metodai idealiai tinka specifiniam rekombinantinių citokinų aktyvumui patikrinti.

7.1 lentelė. Ląstelių linijos, naudojamos citokinų biologiniam aktyvumui patikrinti

Lentelės pabaiga. 7.1

7-1 laboratorija

IL-1 biologinio aktyvumo nustatymas pagal komitogeninį poveikį pelių timocitų proliferacijai

IL-1 biologinio tyrimo metodas pagrįstas citokino gebėjimu skatinti pelių timocitų dauginimąsi.

IL-1 galima nustatyti monocitų, stimuliuotų LPS, kultūroje, taip pat bet kuriame biologiniame kūno skystyje. Būtina atkreipti dėmesį į daugybę detalių.

1. Tyrimams naudojami C3H / HeJ pelių timocitai, skatinami daugintis mitogenais (konkanavalinas A - ConA ir fitohemagliutininas - PHA). Timocitai C3H / HeJ nebuvo pasirinkti atsitiktinai: šios inbredinės linijos pelės nereaguoja į LPS, kurios gali būti tiriamoje medžiagoje ir sukelti IL-1 gamybą.

2. Timocitai reaguoja į IL-2 ir mitogenus, todėl IL-1 ir mitogenų buvimas taip pat turėtų būti nustatytas preparatuose, tiriamuose dėl IL-1.

Veikimo procedūra

1. Paimkite timocitų suspensiją, kurios koncentracija yra 12 × 10 6 / ml terpės RPMI 1640, kurioje yra 10% karvių embrionų serumo ir 2 -merkaptoetanolio (5 × 10 -5 M).

2. Paruoškite eilę dviejų kartų eksperimentinių (biologinių kūno skysčių) ir kontrolinių mėginių praskiedimų. Biologiniai skysčiai, kuriuose yra IL-1, arba mėginiai, gauti inkubuojant mononuklearines ląsteles be LPS, ir laboratoriniai standartiniai preparatai, kuriuose yra IL-1, naudojami kaip kontroliniai. 96 šulinėlių apvaliose dugno plokštelėse 50 μl iš kiekvieno praskiedimo perpilama į 6 duobutes.

3. Į tris kiekvieno skiedinio šulinius įpilkite 50 μl išgryninto PHA (Wellcome), ištirpinto pilnoje terpėje, kurio koncentracija yra 3 μg / ml, o į kitus 3 šulinius - 50 μl terpės.

4. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 μl timocitų suspensijos ir 48 valandas inkubuokite 37 ° C temperatūroje.

6. Prieš auginimo pabaigą į šulinėlius įpilama 50 μl [1 3Ci / ml] ["3H] -timidino tirpalo ir inkubuojama dar 20 valandų.

7. Norint nustatyti radioaktyvumo lygį, kultūros ląstelės perkeliamos į filtravimo popierių, naudojant automatinį ląstelių surinkimo įrenginį, filtrai išdžiovinami ir etiketės įtraukimas nustatomas skysčio scintiliacijos skaitikliu.

8. Rezultatai išreiškiami kaip stimuliacijos veiksnys.

kur m cp yra vidutinis impulsų skaičius 3 skylėse.

Jei timocitai reaguoja į stimuliaciją standartiniu IL-1, tada mėginio stimuliacijos indeksas, viršijantis 3, patikimai rodo IL-1 aktyvumą.

Biologinis tyrimas yra vienintelis citokinų funkcijos įvertinimo metodas, tačiau šį metodą turi papildyti įvairių tipų tinkama specifiškumo kontrolė naudojant monokloninius antikūnus. Tam tikrų monokloninių antikūnų į citokiną įtraukimas į kultūrą blokuoja citokino biologinį aktyvumą, o tai įrodo, kad aptiktas citokinas yra ląstelių linijos proliferacijos signalas.

Biologinio tyrimo naudojimas interferonui aptikti. IFN biologinio aktyvumo vertinimo principas grindžiamas jo antivirusiniu poveikiu, kurį lemia tiriamojo viruso dauginimosi ląstelių kultūroje slopinimo laipsnis.

Šiame darbe gali būti naudojamos ląstelės, jautrios IFN veikimui: pirmiausia trippsinuotos vištienos ir žmogaus embrionų fibroblastų ląstelės, persodintos žmogaus diploidinių fibroblastų ląstelės ir pelių ląstelių kultūra (L929).

Vertinant antivirusinį IFN poveikį, patartina naudoti trumpą dauginimosi ciklą turinčius, didelio jautrumo IFN veikimui virusus: pelių encefalomielito virusą, pelių vezikulinį stomatitą ir kt.

7-2 laboratorija

Interferono aktyvumo nustatymas

1. Žmogaus vaisiaus diploidinių fibroblastų suspensija terpėje, kurioje yra 10% galvijų embrionų serumo (ląstelių koncentracija-15-20 × 10 6 / ml), supilama į sterilias 96 šulinėlių plokščio dugno plokšteles, 100 μl kiekvienoje duobutėje ir dedamas į CO 2 inkubatorių 37 ° C temperatūroje.

2. Susiformavus vientisam sluoksniui, auginimo terpė pašalinama iš šulinių ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µl palaikomosios terpės.

3. IFN aktyvumas tiriamuosiuose mėginiuose titruojamas dvigubo praskiedimo metodu vienu sluoksniu fibroblastų.

Kartu su mėginiais į šulinius įvedamas pelės encefalomielito virusas (VEM), kurio dozė sukelia 100% ląstelių pažeidimą praėjus 48 valandoms po užsikrėtimo.

4. Kontrolei naudokite šulinius su nepažeistomis (neapdorotomis) ląstelėmis, užkrėstomis virusu.

Kiekviename tyrime kaip etaloniniai vaistai naudojami etaloniniai IFN mėginiai, kurių aktyvumas žinomas.

5. Plokštelės su mėginių praskiedimais 24 valandas inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 atmosferoje.

6. IFN aktyvumo lygis nustatomas pagal maksimalaus tiriamojo mėginio praskiedimo abipusiškumą, kuris 50%slopina citopatinį viruso poveikį, ir išreiškiamas aktyvumo vienetais ml.

7. Norint nustatyti IFN tipą, į sistemą pridedamas antiserumas prieš IFNα, IFNβ arba IFNγ. Antiserumas panaikina atitinkamo citokino veikimą, todėl galima nustatyti IFN tipą.

Slopinančio faktoriaus migracijos biologinio aktyvumo nustatymas.Šiuo metu susiformavo visiškai naujos idėjos apie MITO prigimtį ir savybes, kurios praėjusio amžiaus 60 -aisiais buvo atrastos kaip ląstelinio imuniteto tarpininkas ir daugelį metų liko be reikiamo dėmesio (Bloom BR, Bennet B., 1966). ; Davidas JR, 1966). Tik per pastaruosius 10–15 metų paaiškėjo: MITAS yra vienas svarbiausių organizmo biologinių tarpininkų, turintis platų citokino, hormono ir fermento biologinių funkcijų spektrą. MIF poveikis tikslinėms ląstelėms realizuojamas per CD74 receptorių arba per neklasikinį endocitozės kelią.

MITAS laikomas svarbiu uždegimo tarpininku, aktyvinančiu makrofagų funkciją (citokinų gamyba, fagocitozė, citotoksiškumas ir kt.), Taip pat endogeniniu imunoreguliaciniu hormonu, kuris moduliuoja gliukokortikoidų aktyvumą.

Vis daugiau informacijos kaupiasi apie MIF vaidmenį daugelio uždegiminių ligų, įskaitant sepsį, reumatoidinį artritą (RA), glomerulonefritą ir kt., Patogenezėje. RA atveju žymiai padidėja MIF koncentracija pažeistų sąnarių skystyje, kuris koreliuoja su ligos sunkumu. Veikiant MYTH, padidėja priešuždegiminių citokinų gamyba tiek makrofagų, tiek sinovijų ląstelių.

Yra žinomi įvairūs MIF aktyvumo tyrimo metodai, kai migruojančios ląstelės (tikslinės MIF ląstelės) dedamos į stiklinį kapiliarą (kapiliarų tyrimas), į agarozės lašą arba į agarozės šulinėlį.

Pateikiame gana paprastą atrankos metodą, pagrįstą ląstelių mikrokultūrų (leukocitų ar makrofagų) standartiniu formavimu pagal plotą ir ląstelių skaičių 96 šulinėlių plokščio dugno plokštelės šulinių apačioje, po to jų auginimas maistinėje terpėje ir nustatant šių mikrokultūrų srities pokytį veikiant MIF (Suslov A.P., 1989).

7-3 laboratorija

MITO veiklos apibrėžimas

MIF biologinio aktyvumo nustatymas atliekamas naudojant ląstelių mikrokultūrų formavimo prietaisą (7.7 pav.) - MIGROSKRIN (Epidemiologijos ir mikrobiologijos tyrimų institutas, pavadintas NF Gamaleya RAMS).

1. Į 96 šulinėlių plokštelės („Flow“, Didžioji Britanija ar pan.) Duobutes įpilama 100 μl mėginio, praskiesto auginimo terpėje, kuriame nustatomas MYTH aktyvumas (kiekvienas skiedimas 4 paralelėmis, eksperimentiniai mėginiai). Auginimo terpėje yra RPMI 1640, 2 mM L-glutamino, 5% galvijų vaisiaus serumo, 40 μg / ml gentamicino.

2. Į kontrolines duobutes įpilkite kultūros terpės (4 paralelėmis), po 100 µl.

3. Paruoškite pilvaplėvės makrofagų ląstelių suspensiją, kuriai 2 hibridinėms pelėms (CBAxC57B1 / 6) F1 į pilvaplėvės ertmę sušvirkščiama 10 ml Hankso tirpalo su heparinu (10 V / ml), švelniai masažuokite pilvą 2-3 minutes. Tada gyvūnas skerdžiamas nukerpant galvą, pilvo sienelė kruopščiai pradurta kirkšnies srityje, o eksudatas išsiurbiamas per adatą švirkštu. Pilvaplėvės eksudato ląstelės du kartus plaunamos Hankso tirpalu, 10-15 minučių centrifuguojamos 200 g greičiu. Tada paruošiama ląstelių suspensija, kurios koncentracija yra 10 ± 1 milijonas / ml RPMI 1640 terpės.Skaičiavimas atliekamas Goryajevo kameroje.

4. Surinkite MIGROSKRIN sistemą, kuri yra stovas, skirtas nukreipti ir standartiškai pritvirtinti antgalius su ląstelių kultūromis griežtai vertikalioje padėtyje tam tikrame aukštyje virš 96 šulinėlių auginimo plokštelės šulinio centro, taip pat yra 92 antgaliai, skirti automatinė pipetė iš Costar, JAV (7.7 pav.).

Įstatykite trikojio kojas į plokštės kampinius šulinius. Ląstelių suspensija automatine pipete imama į antgalius - po 5 μl kiekvienoje, nuplaunama nuo ląstelių pertekliaus vienu nusileidimu į terpę ir vertikaliai įkišama į sistemos stovo lizdus. Užpildytas stovas su antgaliais 1 valandą laikomas kambario temperatūroje ant griežtai horizontalaus paviršiaus. Per tą laiką suspensijos ląstelės nusėda šulinių apačioje, kur susidaro standartinės ląstelių mikrokultūros.

5. Antgalio stovas atsargiai nuimamas nuo plokštelės. Plokštelė su ląstelių mikrokultūra dedama griežtai horizontalioje padėtyje į CO 2 inkubatorių, kur ji kultivuojama 20 valandų. Auginimo metu ląstelės migruoja išilgai šulinio dugno.

6. Kiekybinis rezultatų įrašymas po inkubacijos atliekamas su žiūronu didinamuoju stiklu, vizualiai įvertinant kolonijos dydį skalėje okuliaro viduje. Mikrokultūros yra apskritos. Tada tyrėjai nustato vidutinį kolonijos skersmenį iš kolonijų matavimų 4 bandomuosiuose arba kontroliniuose šuliniuose. Matavimo paklaida yra ± 1 mm.

Migracijos indeksas (MI) apskaičiuojamas pagal formulę:

Mėginys turi MYTH aktyvumą, jei MI vertės yra lygios

Įprastiniam MYTH aktyvumo vienetui (U) imamas abipusis, lygus aukščiausio mėginio (mėginio) praskiedimo vertei, kai migracijos indeksas yra 0,6 ± 0,2.

Biologinis FEO aktyvumasα vertinamas pagal jo citotoksinį poveikį transformuotų fibroblastų linijai L-929. Rekombinantinis TNFα buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, o ląstelės auginimo terpėje buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė.

Apskaičiuokite citotoksinį indeksą (CI):

kur a- gyvų ląstelių skaičius kontrolėje; b- gyvų ląstelių skaičius eksperimente.

Ryžiai. 7.7. MIGROSKRIN schema - prietaisai, skirti kiekybiškai įvertinti ląstelių kultūrų migraciją

Ląstelės yra nudažytos dažais (metileno mėlynais), kurie įterpiami tik į negyvas ląsteles.

Abipusio mėginio praskiedimo vertė, reikalinga 50% ląstelių citotoksiškumui gauti, laikoma įprastu TNF aktyvumo vienetu. Specifinis mėginio aktyvumas - savavališkų vienetų 1 ml aktyvumo santykis su mėginyje esančių baltymų koncentracija.

Intraląstelinis citokinų dažymas. Ląstelių, gaminančių įvairius citokinus, santykio pasikeitimas gali atspindėti ligos patogenezę ir būti ligos prognozės bei gydymo vertinimo kriterijus.

Intraląstelinio dažymo metodu nustatoma citokino ekspresija vienos ląstelės lygyje. Srauto citometrija leidžia suskaičiuoti ląstelių, ekspresuojančių tam tikrą citokiną, skaičių.

Išvardinkime pagrindinius tarpląstelinių citokinų nustatymo etapus.

Nestimuliuojamos ląstelės gamina nedidelį kiekį citokinų, kurie paprastai nėra deponuojami; todėl svarbus tarpląstelinių citokinų vertinimo etapas yra limfocitų stimuliavimas ir šių produktų išsiskyrimo iš ląstelių blokavimas.

Dažniausiai naudojamas citokinų induktorius yra baltymų kinazės C aktyvatorius phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) kartu su kalcio jonoforo jonomicinu (IN). Tokio derinio naudojimas sukelia plataus spektro citokinų sintezę: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. PMA-IN naudojimo trūkumas yra CD4 molekulių aptikimo limfocitų paviršiuje problema po tokio aktyvinimo. Taip pat T-limfocitų citokinų gamybą skatina mitogenai (PHA). Stimuliuoja B ląstelės ir monocitai

Mononuklearinės ląstelės 2–6 valandas inkubuojamos dalyvaujant citokinų gamybos induktoriams ir jų tarpląstelinio pernešimo blokatoriui-brefeldinui A arba monensinui.

Tada ląstelės resuspenduojamos buferiniu tirpalu. Fiksavimui pridedama 2% formaldehido, inkubuojama 10-15 minučių kambario temperatūroje.

Tada ląstelės yra apdorojamos saponinu, kuris padidina ląstelių membranos pralaidumą, ir nudažomos monokloniniais antikūnais, būdingais aptiktiems citokinams. Išankstinis paviršiaus žymenų (CD4, CD8) dažymas padidina gautos informacijos apie ląstelę kiekį ir leidžia tiksliau nustatyti jos populiacijos tapatybę.

Aukščiau aprašytų metodų taikymas turi tam tikrų apribojimų. Taigi su jų pagalba neįmanoma išanalizuoti citokinų sintezės vienoje ląstelėje, neįmanoma nustatyti citokinus gaminančių ląstelių skaičiaus pogrupyje, neįmanoma nustatyti, ar citokinus gaminančios ląstelės išreiškia unikalius žymenis, ar skirtingus citokinus sintezuoja skirtingos ląstelės, ar tos pačios. Atsakymas į šiuos klausimus gaunamas naudojant kitus tyrimo metodus. Norint nustatyti citokinus gaminančių ląstelių dažnį populiacijoje, naudojamas praskiedimų apribojimo metodas ir su ELISPOT fermentu susieto imunosorbentinio tyrimo variantas (žr. 4 skyrių).

In situ hibridizacijos metodas. Metodas apima:

2) fiksavimas paraformaldehidu;

3) mRNR aptikimas naudojant pažymėtą cDNR. Kai kuriais atvejais citokinų mRNR nustatoma sekcijose, naudojant radioizotopo PGR.

Imunofluorescencija. Metodas apima:

1) organo užšaldymas ir kriostato sekcijų paruošimas;

2) fiksavimas;

3) sekcijų apdorojimas fluoresceinu pažymėtais anti-citokinų antikūnais;

4) vizualus fluorescencijos stebėjimas.

Šie metodai (hibridizacija savo vietoje ir imunofluorescencija) yra greiti ir nepriklauso nuo išskiriamo produkto ribinės koncentracijos. Tačiau jie neskaičiuoja išskiriamo citokinų kiekio ir gali būti techniškai sudėtingi. Reikia atidžiai stebėti įvairias nespecifines reakcijas.

Naudojant pateiktus citokinų vertinimo metodus, buvo nustatyti patologiniai procesai, susiję su citokinų sistemos sutrikimais įvairiais lygiais.

Taigi citokinų sistemos įvertinimas yra nepaprastai svarbus apibūdinant organizmo imuninės sistemos būklę. Įvairių citokinų sistemos lygių tyrimas suteikia informacijos apie įvairių tipų imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą, apie uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygį ir apie ligos prognozę.

Klausimai ir užduotys

1. Išvardykite bendras citokinų savybes.

2. Pateikite citokinų klasifikaciją.

3. Išvardykite pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

4. Išvardykite citokinus gaminančias ląsteles.

5. Apibūdinkite citokinų receptorių šeimas.

6. Kokie yra citokinų tinklo veikimo mechanizmai?

7. Papasakokite apie citokinų gamybą įgimtoje imuninėje sistemoje.

8. Kokie yra pagrindiniai visapusiško citokinų sistemos vertinimo metodai?

9. Kokie yra citokinų tyrimo metodai kūno skysčiuose?

10. Kokie yra įvairių patologijų citokinų sistemos defektai?

11. Kokie yra pagrindiniai IL-1, IFN, MIF, TNFa biologinių tyrimų biologiniuose skysčiuose metodai?

12. Apibūdinkite citokinų tarpląstelinio kiekio nustatymo procesą.

13. Apibūdinkite vienos ląstelės išskiriamų citokinų nustatymo procesą.

14. Apibūdinkite metodų, naudojamų aptikti defektą citokinų receptorių lygiu, seką.

15. Apibūdinkite metodų, naudojamų defektui aptikti citokinus gaminančių ląstelių lygiu, seką.

16. Kokios informacijos galima gauti tiriant citokinų gamybą mononuklearinių ląstelių kultūroje, kraujo serume?

Uždegiminiai citokinai sintezuojami, išskiriami ir per receptorius veikia tikslines ląsteles ankstyvoje uždegimo stadijoje, dalyvaujant specifinio imuninio atsako sukėlime, taip pat jo efektoriaus fazėje. Žemiau pateikiame trumpą pagrindinių priešuždegiminių citokinų aprašymą.

IL-1 -junginys, kurį antigeninės stimuliacijos metu išskiria monocitai, makrofagai, Langerhanso ląstelės, dendritinės ląstelės, keratinocitai, smegenų astrocitai ir mikroglijos, endotelio, epitelio, mezotelio ląstelės, fibroblastai, NK-limfocitai, neutrofilai, B ląstelių limfocitai, C ląstelės ir kt. Maždaug 10% bazofilų ir putliųjų ląstelių taip pat gamina IL-1. Šie faktai rodo, kad IL-1 gali būti išskiriamas tiesiai į kraują, audinių skystį ir limfą. Visos ląstelės, kuriose susidaro šis citokinas, negali spontaniškai sintezuoti IL-1 ir reaguoja savo gamyba bei sekrecija, reaguodamos į infekcinių ir uždegiminių agentų, mikrobų toksinų, įvairių citokinų, aktyvaus komplemento fragmentų, kai kurių aktyvių kraujo krešėjimo faktorių poveikį. , ir kiti. Vaizdine A. Bellau išraiška IL-1 yra molekulių šeima visoms progoms. IL -1 yra padalintas į 2 frakcijas - a ir b, kurios yra skirtingų genų produktai, tačiau turi panašias biologines savybes. Abi šios formos yra suformuotos iš atitinkamų pirmtakų molekulių, turinčių tą pačią molekulinę masę - 31 kDa. Dėl biocheminių transformacijų galiausiai susidaro vienos grandinės biologiškai aktyvūs polipeptidai, kurių molekulinė masė yra 17,5 kDa. Beveik visas IL-1a lieka ląstelės viduje arba jungiasi prie membranos. Skirtingai nuo IL-1a, IL-1b aktyviai išskiria ląstelės ir yra pagrindinė žmogaus IL-1 sekrecijos forma. Tuo pačiu metu abu interleukinai turi tą patį biologinio aktyvumo spektrą ir konkuruoja dėl prisijungimo prie to paties receptoriaus. Tačiau reikia nepamiršti, kad IL-1a daugiausia yra vietinių gynybos reakcijų tarpininkas, o IL-1b veikia tiek vietiniu, tiek sisteminiu lygmeniu. Eksperimentai su rekombinantiniu IL-1 parodė, kad šis citokinas turi mažiausiai 50 skirtingų funkcijų, o taikiniai yra beveik visų organų ir audinių ląstelės. IL-1 įtaka daugiausia nukreipta į Th1, nors ji gali stimuliuoti Th2 ir B-limfocitus. Kaulų čiulpuose, jo įtakoje, padidėja mitozės stadijoje esančių kraujodaros ląstelių skaičius. IL-1 gali veikti neutrofilus, stiprindamas jų judėjimo aktyvumą ir taip skatindamas fagocitozę. Šis citokinas dalyvauja reguliuojant endotelio ir kraujo krešėjimo sistemos funkcijas, sukeldamas prokoaguliacinį aktyvumą, priešuždegiminių citokinų sintezę ir lipnių molekulių, užtikrinančių neutrofilų ir limfocitų riedėjimą ir prisitvirtinimą, ekspresiją endotelio paviršiuje, dėl to kraujagyslių lovoje išsivysto leukopenija ir neutropenija. Veikdamas kepenų ląsteles, jis skatina ūminės fazės baltymų susidarymą. Buvo nustatyta, kad IL-1 yra pagrindinis vietinio uždegimo vystymosi ir ūminės fazės atsako tarpininkas kūno lygyje. Be to, jis pagreitina kraujagyslių augimą po pažeidimo. Veikiant IL-1 kraujyje, sumažėja geležies ir cinko koncentracija, padidėja natrio išsiskyrimas. Galiausiai neseniai buvo nustatyta, kad IL-1 gali padidinti cirkuliuojančio azoto oksido kiekį. Žinoma, kad pastarasis vaidina itin svarbų vaidmenį reguliuojant kraujospūdį, skatina trombocitų skaidymąsi ir stiprina fibrinolizę. Reikėtų pažymėti, kad veikiant IL-1, sustiprėja neutrofilų ir limfocitų rozetės su trombocitais, o tai vaidina svarbų vaidmenį įgyvendinant nespecifinį atsparumą, imunitetą ir hemostazę (Yu.A. Vitkovsky). Visa tai rodo, kad IL-1 skatina viso organizmo apsauginių reakcijų komplekso vystymąsi, siekiant apriboti infekcijos plitimą, pašalinti įsibrovusius mikroorganizmus ir atkurti pažeistų audinių vientisumą. IL-1 veikia chondrocitus, osteoklastus, fibroblastus ir kasos b-ląsteles. Jo įtakoje padidėja insulino, AKTH ir kortizolio sekrecija. Pridėjus IL-1b arba TNFa į pirminę hipofizės ląstelių kultūrą, sumažėja skydliaukę stimuliuojančio hormono sekrecija.

IL-1 gaminamas centrinėje nervų sistemoje, kur jis gali veikti kaip siųstuvas. Veikiant IL-1, atsiranda miegas, lydimas a-ritmo (lėto bangos miego). Tai taip pat skatina nervų augimo faktoriaus sintezę ir sekreciją astrocitų. Įrodyta, kad dirbant raumenims IL-1 kiekis padidėja. Veikiant IL-1, sustiprėja pati IL-1, taip pat IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 ir TNFa gamyba. Pastarasis, be to, skatina IL-1, IL-6 ir IL-8 sintezę.

Daugelis priešuždegiminių IL-1 poveikių yra atliekami kartu su TNFa ir IL-6: karščiavimo indukcija, anoreksija, įtaka kraujodarai, dalyvavimas nespecifinėje apsaugos nuo infekcijos srityje, ūminės fazės baltymų sekrecija ir kt. (AS Simbirtsev ).

IL-6- monomeras, kurio molekulinė masė yra 19–34 kDa. Jį gamina stimuliuojami monocitai, makrofagai, endoteliocitai, Th2, fibroblastai, hepatocitai, Sertoli ląstelės, nervų sistemos ląstelės, tirocitai, Langerhanso salelių ląstelės ir kt. Kartu su IL-4 ir IL-10 B-limfocitų augimą ir diferenciaciją, palengvinant pastarųjų perėjimą prie antikūnų. Be to, jis, kaip ir IL-1, stimuliuoja hepatocitus, todėl susidaro ūminės fazės baltymai. IL-6 veikia kraujodaros kamienines ląsteles ir ypač stimuliuoja megakariocitopoezę. Šis junginys turi antivirusinį poveikį. Yra citokinų, priklausančių IL-6 šeimai-onostatinas M (OnM), leukemiją slopinantis veiksnys, ciliarinis neurotropinis faktorius, kardiotropinas-1. Jų įtaka neturi įtakos imuninei sistemai. IL-6 šeima veikia embrionines kamienines ląsteles, sukelia miokardo hipertrofiją, CWA sintezę, palaiko mielomos ląstelių ir kraujodaros progenitorių proliferaciją, makrofagų, osteoklastų, nervų ląstelių diferenciaciją, padidina trombocitopoezę ir kt.

Reikėtų pažymėti, kad pelėms, tikslingai inaktyvuojančioms (išmušantiems) geną, koduojantį bendrą receptorių komponentą IL-6 šeimos citokinams, atsiranda daugybė anomalijų įvairiose kūno sistemose, kurios yra nesuderinamos su gyvybe. Kartu su tokių pelių embrionų kardiogenezės sutrikimu smarkiai sumažėja įvairių kraujodaros eilučių kamieninių ląstelių skaičius, taip pat smarkiai sumažėja užkrūčio liaukos dydis. Šie faktai rodo didžiulę IL-6 svarbą reguliuojant fiziologines funkcijas (A.A. Yarilinas).

Tarp uždegiminių citokinų, kurie veikia kaip sinergetai, yra labai sudėtingas tarpusavyje reguliuojamas ryšys. Taigi IL-6 slopina IL-1 ir TNFa gamybą, nors abu šie citokinai yra IL-6 sintezės induktoriai. Be to, IL-6, veikiant pagumburio-hipofizės sistemą, padidina kortizolio gamybą, kuri slopina IL-6 geno, taip pat kitų priešuždegiminių citokinų, ekspresiją.

Į IL-6 šeimą taip pat įeina onkotostinas M (OnM), pasižymintis itin plačiu veiksmų spektru. Jo molekulinė masė yra 28 kDa. Buvo nustatyta, kad OnM gali slopinti daugelio navikų augimą. Jis skatina IL-6, plazminogeno aktyvatoriaus, vazoaktyvių žarnyno peptidų ir CWA, susidarymą. Iš to, kas išdėstyta, matyti, kad OnM turėtų atlikti svarbų vaidmenį reguliuojant imuninį atsaką, kraujo krešėjimą ir fibrinolizę.

IL-8 priklauso vadinamai chemokinų šeimai, kuri stimuliuoja chemotaksį ir chemokinezę ir suskaičiuoja iki 60 atskirų medžiagų, turinčių savo struktūrines ir biologines savybes. Subrendęs IL-8 egzistuoja keliomis formomis, kurios skiriasi polipeptido grandinės ilgiu. Vienos ar kitos formos susidarymas priklauso nuo specifinių proteazių, veikiančių ne glikozilintos pirmtako molekulės N-gale. Priklausomai nuo to, kurios ląstelės sintezuoja IL-8, jame yra skirtingas aminorūgščių skaičius. Didžiausią biologinį aktyvumą turi IL-8 forma, susidedanti iš 72 aminorūgščių (A.S. Simbirtsevas).

IL-8 išskiria polimorfonukleariniai leukocitai, monocitai, makrofagai, megakariocitai, neutrofilai, T-limfocitai (Tx), fibroblastai, chondrocitai, keratinocitai, endotelio ir epitelio ląstelės, hepatocitai ir mikroglijos.

IL-8 gaminamas reaguojant į biologiškai aktyvių junginių, įskaitant priešuždegiminius citokinus, taip pat IL-2, IL-3, IL-5, GM-CSF, įvairių mitogenų, lipopolisacharidų, lektinų, poveikį. ir virusų skilimo produktai, o priešuždegiminiai citokinai (IL-4, IL-10) sumažina IL-8 gamybą. Jo aktyvavimas ir išsiskyrimas taip pat vyksta veikiant trombinui, plazminogeno aktyvatoriui, streptokinazei ir tripsinui, o tai rodo glaudų šio citokino funkcijos ir hemostazinės sistemos ryšį.

IL-8 sintezė atliekama veikiant įvairiems endogeniniams ar egzogeniniams dirgikliams, atsirandantiems uždegimo metu, kai vystosi vietinė gynybinė reakcija į patogeninio agento įvedimą. Šiuo atžvilgiu IL-8 gamyba turi daug panašumų su kitais uždegimą skatinančiais citokinais. Tuo pačiu metu IL-8 sintezę slopina steroidiniai hormonai IL-4, IL-10, Ifa ir Ifg.

IL-8 stimuliuoja neutrofilų, bazofilų, T-limfocitų (mažesniu mastu) ir keratinocitų chemotaksį ir chemokinezę, sukeldamas šių ląstelių degranuliaciją. Sušvirkštus IL-8 į kraujagyslę, atsiranda greita ir aštri granulocitopenija, po to padidėja neutrofilų kiekis periferiniame kraujyje. Tokiu atveju neutrofilai migruoja į kepenis, blužnį, plaučius, bet ne į pažeistus audinius. Be to, eksperimentas parodė, kad intraveninis IL-8 vartojimas blokuoja neutrofilų migraciją į intradermines uždegimo vietas.

Nestimuliuojamuose neutrofiluose IL-8 sukelia baltymų, susijusių su vitaminu B 12, išsiskyrimą iš specifinių granulių ir želatinazę iš sekrecinių pūslelių. Azurofilinių granulių degranuliacija neutrofiluose įvyksta tik jas stimuliuojant citochlazinu-B. Tuo pačiu metu išsiskiria elastazė, mieloperoksidazė, b-gliukoronidazė ir kitos elastazės, taip pat atsiranda lipnių molekulių ekspresija ant leukocitų membranos, užtikrinant neutrofilų sąveiką su endoteliu. Reikėtų pažymėti, kad IL-8 negali sukelti kvėpavimo takų sprogimo, tačiau gali sustiprinti kitų chemokinų poveikį šiam procesui.

IL-8 gali stimuliuoti angiogenezę, aktyvindamas proliferacinius procesus endotelio ląstelėse ir lygiųjų raumenų ląstelėse, o tai vaidina svarbų vaidmenį atkuriant audinius. Be to, jis gali slopinti IL-4 sukeltą IgE sintezę.

Matyt, IL-8 vaidina svarbų vaidmenį gleivinės vietiniame imunitete. Sveikiems žmonėms jis randamas seilių, ašarų, prakaito liaukų sekretuose, priešpienyje. Nustatyta, kad žmogaus trachėjos lygiųjų raumenų ląstelės gali gaminti nereikšmingą IL-8 kiekį. Veikiant bradikininui, IL-8 gamyba padidėja 50 kartų. Baltymų sintezės blokatoriai slopina IL-8 sintezę. Yra pagrindo manyti, kad lokaliai IL-8 užtikrina apsauginių reakcijų eigą, patekus į viršutinių kvėpavimo takų patogeninę florą.

IL-12 atrado daugiau nei prieš dešimt metų, tačiau jo savybės buvo tiriamos tik pastaraisiais metais. Jį gamina makrofagai, monocitai, neutrofilai, dendritinės ląstelės ir aktyvuoti B-limfocitai. Daug mažesniu mastu IL-12 gali išskirti keratinocitus, Langerhanso ląsteles ir ilsėtis B-limfocitus. Be to, jį gamina mikroglijos ląstelės ir astrocitai, todėl jiems reikia bendradarbiauti. IL-12 yra heterodimeras, susidedantis iš dviejų kovalentiškai sujungtų polipeptidų grandinių: sunkios (45 kDa) ir lengvos (35 kDa). Biologinis aktyvumas būdingas tik dimeriui; kiekviena atskira grandinė neturi panašių savybių.

Nepaisant to, pagrindinės IL-12 tikslinės ląstelės išlieka NK, T-limfocitai (CD4 + ir CD8 +) ir, mažesniu mastu, B-limfocitai. Galima manyti, kad tai yra jungtis tarp makrofagų ir monocitų, prisidedanti prie Th1 ir citotoksinių ląstelių aktyvumo padidėjimo. Taigi šis citokinas labai prisideda prie antivirusinės ir priešvėžinės apsaugos. IL-12 sintezės induktoriai yra mikrobų komponentai ir priešuždegiminiai citokinai.

IL-12 priklauso hepariną surišančiam citokinui, o tai rodo jo dalyvavimą hemostazės procese.

Pastaraisiais metais buvo įrodyta, kad IL-12 yra pagrindinis citokinas, stiprinantis ląstelių sukeltą imuninį atsaką ir veiksmingai apsaugantis nuo infekcijų nuo virusų, bakterijų, grybelių ir pirmuonių. Apsauginį IL-12 poveikį infekcijoms lemia nuo Ifg priklausomi mechanizmai, padidėjusi azoto oksido gamyba ir T-ląstelių infiltracija. Tačiau pagrindinis jo poveikis yra Ifg sintezė. Pastarasis, nors ir kaupiasi organizme, skatina IL-12 sintezę makrofagų. Svarbiausia IL-12 funkcija yra Tx0 diferenciacijos kryptis link Tx1. Šiame procese IL-12 yra Ifg sąveika. Tuo tarpu po diferenciacijos Th1 nebereikia IL-12 kaip stimuliuojančios molekulės. Imuninio atsako pobūdis labai priklauso nuo IL-12: ar jis vystysis pagal ląstelių ar humoralinį imunitetą.

Viena iš svarbiausių IL-12 funkcijų yra staigus B-limfocitų diferenciacijos į antikūnus gaminančių ląstelių padidėjimas. Šis citokinas vartojamas pacientams, sergantiems alergija ir bronchine astma.

IL-12 slopina atminties T-limfocitų IL-4 gamybą, tarpininkaujant APC. Savo ruožtu IL-4 slopina IL-12 gamybą ir sekreciją.

IL-12 sinergininkai yra IL-2 ir IL-7, nors abu šie citokinai dažnai veikia skirtingas tikslines ląsteles. Fiziologinis IL-12 antagonistas ir inhibitorius yra IL-10, tipiškas priešuždegiminis citokinas, slopinantis Th1 funkciją.

IL-16- išskiria T-limfocitai, daugiausia stimuliuojami CD4 +, CD8 +, eozinofilų ir bronchų epitelio ląstelių. Padidėjusi IL-16 sekrecija buvo nustatyta, kai T ląstelės buvo gydomos histaminu. Pagal cheminę prigimtį tai yra homotetrameris, kurio molekulinė masė yra 56000–80000 D. Tai imunomoduliuojantis ir priešuždegiminis citokinas, nes yra chemotaktinis monocitų ir eozinofilų, taip pat T-limfocitų (CD4 +) faktorius, pagerinti jų sukibimą.

Reikėtų pažymėti, kad išankstinis gydymas CD4 + rekombinantiniu IL-16 slopina ŽIV-1 promotoriaus aktyvumą maždaug 60%. Remiantis aukščiau pateiktais faktais, buvo pateikta hipotezė, pagal kurią IL-16 poveikis ŽIV-1 replikacijai pastebimas viruso ekspresijos lygiu.

IL-17 suformuotas makrofagų. Šiuo metu buvo gautas rekombinantinis IL-17 ir ištirtos jo savybės. Paaiškėjo, kad veikiant IL-17, žmogaus makrofagai intensyviai sintetina ir išskiria priešuždegiminius citokinus-IL-1b ir TNFa, o tai yra tiesiogiai proporcinga tirto citokino dozei. Didžiausias poveikis pastebimas praėjus maždaug 9 valandoms nuo makrofagų su rekombinantiniu IL-17 inkubacijos pradžios. Be to, IL-17 skatina IL-6, IL-10, IL-12, PgE 2, RIL-1 antagonisto ir stromalizino sintezę ir sekreciją. Priešuždegiminiai citokinai-IL-4 ir IL-10-visiškai panaikina IL-17 sukeltą IL-1b išsiskyrimą, o GTFb 2 ir IL-13 tik iš dalies blokuoja šį poveikį. IL-10 slopina sukeltą TNFa išsiskyrimą, tuo tarpu IL-4, IL-13 ir GTFb 2 mažesniu mastu slopina šio citokino sekreciją. Pateikti faktai tvirtai rodo, kad IL-17 turėtų vaidinti svarbų vaidmenį inicijuojant ir palaikant uždegiminį procesą.

IL-18 kalbant apie biologinį poveikį, jis yra funkcinis IL-12 dvigubintojas ir sinergetas. Pagrindiniai IL-18 gamintojai yra makrofagai ir monocitai. Jo struktūra yra labai panaši į IL-1. IL-18 sintezuojamas neaktyvios pirmtako molekulės pavidalu, todėl norint jį paversti aktyvia forma reikia dalyvauti IL-1b konvertuojančio fermento.

Veikiant IL-18, padidėja organizmo atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Bakterinės infekcijos atveju IL-18 kartu su IL-12 arba Ifa / b reguliuoja Ifx gamybą Tx ir NK ląstelėse ir sustiprina Fas ligando ekspresiją NK ir T limfocituose. Neseniai buvo nustatyta, kad IL-18 yra CTL aktyvatorius. Jo įtakoje padidėja CD8 + ląstelių aktyvumas, palyginti su piktybinių navikų ląstelėmis.

Kaip ir IL-12, IL-18 skatina lengvatinį Th0 diferenciaciją į Th1. Be to, IL-18 sukelia GM-CSF susidarymą ir taip sustiprina leukopoezę bei slopina osteoklastų susidarymą.

IL-23 susideda iš 2 subvienetų (p19 ir p40), kurie yra IL-12 dalis. Atskirai, kiekvienas iš išvardytų subvienetų neturi biologinio aktyvumo, tačiau kartu jie, kaip ir IL-12, sustiprina T-limfoblastų proliferacinį aktyvumą ir Ifg sekreciją. IL-23 yra mažiau stiprus nei IL-12.

TNF yra polipeptidas, kurio molekulinė masė yra apie 17 kDa (susideda iš 157 aminorūgščių) ir yra padalintas į 2 frakcijas - a ir b. Abi frakcijos turi maždaug tas pačias biologines savybes ir veikia tuos pačius ląstelių receptorius. TNFa išskiria monocitai ir makrofagai, Th1, endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelės, keratinocitai, NK limfocitai, neutrofilai, astrocitai, osteoblastai ir kt. Mažesniu mastu TNFa gamina kai kurios naviko ląstelės. Pagrindinis TNFa sintezės induktorius yra bakterinis lipopolisacharidas, taip pat kiti bakterinės kilmės komponentai. Be to, TNFa sintezę ir sekreciją skatina citokinai: IL-1, IL-2, Ifa ir b, GM-CSF ir kt. Epstein-Barr virusas, Ifa / b, IL-4, IL-6, IL - 10, G-CSF, TGFb ir kt.

Pagrindinis TNFa biologinio aktyvumo pasireiškimas yra poveikis kai kurioms naviko ląstelėms. Šiuo atveju TNFa sukelia hemoraginę nekrozę ir tiekiančių kraujagyslių trombozę. Tuo pačiu metu, veikiant TNFa, padidėja natūralus monocitų, makrofagų ir NK ląstelių citotoksiškumas. Naviko ląstelių regresija ypač intensyviai vyksta kartu veikiant TNFa ir Ifg.

Veikiant TNFa, slopinama lipoproteinų kinazės, vieno iš pagrindinių lipogenezę reguliuojančių fermentų, sintezė.

TNFa, kaip citotoksiškumo tarpininkas, gali slopinti daugelio ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir funkcinį aktyvumą.

TNFa yra tiesiogiai susijęs su imuniniu atsaku. Jis atlieka nepaprastai svarbų vaidmenį ankstyvosiose uždegiminės reakcijos pradžios akimirkose, nes suaktyvina endotelį ir skatina lipnių molekulių ekspresiją, o tai lemia granulocitų sukibimą su vidiniu indo paviršiumi. Veikiant TNFa, atsiranda leukocitų transendotelinė migracija į uždegiminį židinį. Šis citokinas aktyvina granulocitus, monocitus ir limfocitus ir skatina kitų priešuždegiminių citokinų-IL-1, IL-6, Ifg, GM-CSF, kurie yra TNFa sinergininkai, gamybą.

Vietos formuojamas TNFa, esantis uždegimo ar infekcinio proceso židinyje, smarkiai padidina monocitų ir neutrofilų fagocitinį aktyvumą ir, sustiprindamas peroksidacijos procesus, prisideda prie visiškos fagocitozės vystymosi. Kartu su IL-2 TNFa žymiai padidina T limfocitų Ifg gamybą.

TNFa taip pat dalyvauja sunaikinimo ir atstatymo procesuose, nes sukelia fibroblastų augimą ir skatina angiogenezę.

Pastaraisiais metais buvo nustatyta, kad TNF yra svarbus kraujodaros reguliatorius. Tiesiogiai arba kartu su kitais citokinais TNF veikia visų tipų kraujodaros ląsteles.

Jo įtakoje sustiprėja pagumburio-hipofizės-antinksčių sistemos funkcija, taip pat kai kurios endokrininės liaukos-skydliaukė, sėklidės, kiaušidės, kasa ir kt. (A.F. Vozianovas).

Interferonai susidaro beveik bet kurios žmogaus kūno ląstelės, tačiau jų gamybą daugiausia atlieka kraujas ir kaulų čiulpų ląstelės. Interferonų sintezė vyksta veikiant antigeninei stimuliacijai, nors labai maža šių junginių koncentracija paprastai randama kaulų čiulpuose, bronchuose, įvairiuose virškinimo trakto organuose, odoje ir kt. Interferono sintezės lygis nesidalijančiose ląstelėse visuomet yra aukštesnis nei greitai besidalijančiose ląstelėse.

Įvadas.

1. Bendrosios citokinų charakteristikos ir klasifikacija.

1.1 Veikimo mechanizmai.

1.2 Citokinų savybės.

1.3 Citokinų vaidmuo reguliuojant fiziologines organizmo funkcijas.

2. Specialūs citokinų tyrimai.

2.1 Citokinų vaidmuo vaikų storosios žarnos uždegiminių ligų patogenezėje.

2.2 Azoto oksido ir citokinų vaidmuo kuriant ūminį plaučių pažeidimo sindromą.

3. Citokinų nustatymo metodai

3.1 Citokinų biologinio aktyvumo nustatymas

3.2 Citokinų kiekybinis įvertinimas naudojant antikūnus

3.3 Citokinų nustatymas naudojant imuninį fermentų tyrimą.

3.3.1 Naviko nekrozės faktorius alfa.

3.3.2 Gama interferonas.

3.3.3 Interleukinas-4

3.3.4 Interleukinas-8

3.3.5 Interleukino-1 receptorių antagonistas.

3.3.6 Alfa-interferonas.

3.3.7 Antikūnai prieš alfa-IFN.

4. Imunotropiniai vaistai, pagrįsti citokinais.

Naudotos literatūros sąrašas.

Išvada.

Įvadas.

Nuo pirmųjų citokinų aprašymo nepraėjo daug laiko. Tačiau, atlikus jų tyrimus, buvo paskirta plati žinių dalis - citokinologija, kuri yra neatskiriama įvairių žinių sričių ir visų pirma imunologijos dalis, suteikusi galingą impulsą šių tarpininkų studijoms. Citokineologija persmelkia visas klinikines disciplinas - nuo ligų etiologijos ir patogenezės iki įvairių patologinių būklių prevencijos ir gydymo. Todėl mokslininkai ir gydytojai turi naršyti reguliavimo molekulių įvairovę ir aiškiai suprasti kiekvieno citokino vaidmenį tiriamuose procesuose. Visos imuninės sistemos ląstelės atlieka tam tikras funkcijas ir veikia aiškiai koordinuotoje sąveikoje, kurią užtikrina specialios biologiškai aktyvios medžiagos - citokinai - imuninių reakcijų reguliatoriai. Citokinai yra specifiniai baltymai, kurių pagalba įvairios imuninės sistemos ląstelės gali keistis informacija tarpusavyje ir koordinuoti veiksmus. Citokinų, veikiančių ląstelių paviršiaus receptorius - „citokinų aplinką“, rinkinys ir kiekis yra sąveikaujančių ir dažnai besikeičiančių signalų matrica. Šie signalai yra sudėtingi dėl daugybės citokinų receptorių ir dėl to, kad kiekvienas citokinas gali suaktyvinti arba slopinti kelis procesus, įskaitant savo ir kitų citokinų sintezę, taip pat citokinų receptorių susidarymą ir išvaizdą. ant ląstelės paviršiaus. Mūsų darbo tikslas yra ištirti citakinus, jų funkcijas ir savybes bei galimą jų pritaikymą medicinoje. Citokinai yra maži baltymai (molekulinė masė nuo 8 iki 80 KDa), kurie veikia autokriniškai (t. Y. Juos gaminančioje ląstelėje) arba parakrininiai (šalia esančių ląstelių). Šių labai aktyvių molekulių susidarymas ir išsiskyrimas yra trumpalaikis ir griežtai reguliuojamas.

Literatūros apžvalga.

Bendrosios citokinų savybės ir klasifikacija.

Citokinai yra tarpląstelinės sąveikos polipeptidų tarpininkų grupė, daugiausia susijusi su organizmo gynybinių reakcijų formavimu ir reguliavimu įvedant patogenus ir sutrikdant audinių vientisumą, taip pat reguliuojant daugelį normalių fiziologinių funkcijų. Citokinus galima išskirti į naują nepriklausomą reguliavimo sistemą, kuri egzistuoja kartu su nervų ir endokrininėmis sistemomis homeostazei palaikyti, o visos trys sistemos yra glaudžiai tarpusavyje susijusios ir viena nuo kitos priklausomos. Per pastaruosius du dešimtmečius daugumos citokinų genai buvo klonuoti ir buvo gauti rekombinantiniai analogai, kurie visiškai pakartoja natūralių molekulių biologines savybes. Dabar žinoma daugiau nei 200 atskirų medžiagų, priklausančių citokinų šeimai. Citokinų tyrimo istorija prasidėjo XX amžiaus 40 -aisiais. Būtent tada buvo aprašytas pirmasis kachektino, kraujo serume esančio veiksnio, galinčio sukelti kacheksiją ar svorio netekimą, poveikis. Vėliau šis tarpininkas buvo izoliuotas ir įrodyta, kad jis yra identiškas naviko nekrozės faktoriui (TNF). Tuo metu citokinų tyrimas buvo atliktas remiantis bet kurio biologinio poveikio aptikimo principu, kuris buvo pradinis atitinkamo tarpininko pavadinimo taškas. Taigi 50 -aisiais interferonas (IFN) buvo vadinamas dėl jo gebėjimo trukdyti ar padidinti atsparumą pakartotinės virusinės infekcijos metu. Interleukinas-1 (IL-1) taip pat iš pradžių buvo vadinamas endogeniniu pirogenu, priešingai nei bakteriniai lipopolisacharidai, kurie buvo laikomi egzogeniniais pirogenais. Kitas citokinų tyrimo etapas, datuojamas 60–70 metų, yra susijęs su natūralių molekulių valymu ir visapusišku jų biologinio veikimo apibūdinimu. Iki to laiko priklauso T-ląstelių augimo faktoriaus, dabar žinomo kaip IL-2, ir daugelio kitų molekulių, skatinančių T-, B-limfocitų ir kitų tipų leukocitų augimą ir funkcinį aktyvumą, atradimas. 1979 m. Jų žymėjimui ir sisteminimui buvo pasiūlytas terminas „interleukinai“, tai yra tarpininkai, bendraujantys tarp leukocitų. Tačiau labai greitai paaiškėjo, kad citokinų biologinis poveikis toli gražu neapsiriboja imunine sistema, todėl anksčiau pasiūlytas terminas „citokinai“, išlikęs iki šių dienų, tapo priimtinesnis. Revoliucinis posūkis citokinų tyrime įvyko devintojo dešimtmečio pradžioje po pelių ir žmogaus interferono genų klonavimo ir rekombinantinių molekulių gamybos, kurios visiškai pakartojo natūralių citokinų biologines savybes. Po to buvo galima klonuoti kitų šios šeimos tarpininkų genus. Svarbus etapas citokinų istorijoje buvo klinikinis rekombinantinių interferonų, ypač rekombinantinio IL-2, naudojimas vėžiui gydyti. 90 -tieji metai buvo pažymėti citokinų receptorių subvieneto struktūros atradimu ir „citokinų tinklo“ sąvokos formavimu, o XXI amžiaus pradžia - genetinės analizės būdu atrasta daug naujų citokinų. Citokinai apima interferonus, kolonijas stimuliuojančius faktorius (CSF), chemokinus, kurie transformuoja augimo faktorius; naviko nekrozės faktorius; interleukinai su nustatytais istoriniais serijos numeriais ir kai kurie kiti endogeniniai tarpininkai. Interleukinai, kurių serijos numeriai prasideda nuo 1, nepriklauso tam pačiam citokinų pogrupiui, susijusiam su bendromis funkcijomis. Savo ruožtu juos galima suskirstyti į priešuždegiminius citokinus, limfocitų augimo ir diferenciacijos faktorius ir atskirus reguliuojančius citokinus. Pavadinimas „interleukinas“ priskiriamas naujai atrastam tarpininkui, jei tenkinami šie Tarptautinės imunologinių draugijų sąjungos nomenklatūros komiteto sukurti kriterijai: molekulinis klonavimas ir tiriamo faktoriaus geno ekspresija, unikalus nukleotidas ir atitinkamą aminorūgščių seką, gaunant neutralizuojančius monokloninius antikūnus. Be to, naują molekulę turi gaminti imuninės sistemos ląstelės (limfocitai, monocitai ar kitos rūšies leukocitai), ji turi atlikti svarbią biologinę funkciją reguliuojant imuninį atsaką, taip pat papildomas funkcijas, todėl ji negali bus suteiktas funkcinis pavadinimas. Galiausiai, išvardytos naujojo interleukino savybės turėtų būti paskelbtos recenzuojamame mokslo žurnale. Citokinų klasifikacija gali būti atliekama pagal jų biochemines ir biologines savybes, taip pat pagal receptorių tipus, per kuriuos citokinai atlieka savo biologines funkcijas. Klasifikuojant citokinus pagal struktūrą (1 lentelė) atsižvelgiama ne tik į aminorūgščių seką, bet visų pirma į tretinę baltymo struktūrą, kuri tiksliau atspindi evoliucinę molekulių kilmę.

1 lentelė. Citokinų klasifikacija pagal struktūrą.

Genų klonavimas ir citokinų receptorių struktūros analizė parodė, kad, kaip ir patys citokinai, šias molekules galima suskirstyti į keletą tipų pagal aminorūgščių sekų panašumą ir tarpląstelinių domenų organizavimo ypatumus (2 lentelė). Viena didžiausių citokinų receptorių šeimų vadinama kraujodaros receptorių šeima arba I tipo citokinų receptorių šeima. Šios receptorių grupės struktūrinis bruožas yra tai, kad molekulėje yra 4 cisteinai ir aminorūgščių seka Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), esanti nedideliu atstumu nuo ląstelės membranos. II klasės citokinų receptoriai sąveikauja su interferonais ir IL-10. Abu pirmieji receptorių tipai yra tarpusavyje homologiški. Šios receptorių grupės tarpininkauja su naviko nekrozės faktoriaus šeimos ir IL-1 šeimos citokinais. Šiuo metu žinoma, kad daugiau nei 20 skirtingų chemokino receptorių sąveikauja su įvairaus laipsnio afinitetu su vienu ar daugiau chemokinų šeimos ligandų. Chemokino receptoriai priklauso rodopsino receptorių šeimai, turi 7 transmembraninius domenus ir atlieka signalą dalyvaujant G baltymams.

2 lentelė. Citokinų receptorių klasifikacija.

Daugelis citokinų receptorių susideda iš 2-3 subvienetų, kuriuos koduoja skirtingi genai ir išreiškiami nepriklausomai. Šiuo atveju, norint suformuoti didelio afiniteto receptorių, būtina tuo pačiu metu sąveikauti su visais subvienetais. Tokios citokinų receptorių organizacijos pavyzdys yra IL-2 receptorių komplekso struktūra. Stebino tai, kad atskiri IL-2 receptorių komplekso subvienetai yra bendri IL-2 ir kai kuriems kitiems citokinams. Taigi, β grandinė tuo pačiu metu yra IL-15 receptoriaus komponentas, o γ grandinė tarnauja kaip bendras IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- receptorių subvienetas. 15 ir IL-21. Tai reiškia, kad visi minėti citokinai, kurių receptorius taip pat sudaro 2-3 atskiri polipeptidai, naudoja γ grandinę kaip savo receptorių komponentą, be to, komponentą, atsakingą už signalo perdavimą. Visais atvejais kiekvieno citokino sąveikos specifiškumą užtikrina kiti subvienetai, kurie skiriasi struktūra. Tarp citokinų receptorių yra 2 labiau paplitę receptorių subvienetai, kurie perduoda signalą, sąveikaudami su skirtingais citokinais. Tai yra bendras receptorių subvienetas βc (gp140) IL-3, IL-5 ir GM-CSF receptoriams, taip pat gp130 receptorių subvienetas, kuris yra bendras IL-6 šeimos nariams. Bendras signalizavimo subvienetas citokinų receptoriuose yra vienas iš jų klasifikavimo būdų, nes tai leidžia rasti bendrumo tiek ligandų struktūroje, tiek biologiniame poveikyje.

3 lentelėje parodyta kombinuota struktūrinė ir funkcinė klasifikacija, kai visi citokinai yra suskirstyti į grupes, visų pirma atsižvelgiant į jų biologinį aktyvumą, taip pat į aukščiau nurodytas citokinų molekulių ir jų receptorių struktūrines savybes.

3 lentelė. Citokinų struktūrinė ir funkcinė klasifikacija.

Citokinų šeimos	Pogrupiai ir ligandai	Pagrindinės biologinės funkcijos
I tipo interferonai	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Antivirusinis aktyvumas, antiproliferacinis, imunomoduliacinis poveikis
Hematopoetinių ląstelių augimo faktoriai	Kamieninių ląstelių faktorius (rinkinys-ligandas, plieno faktorius), Flt-3 ligandas, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandai: IL-3, IL-5, GM-KSF	Įvairių tipų kamieninių ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos stimuliavimas kaulų čiulpuose, kraujodaros aktyvinimas Eritropoetinas, trombopoetinas
Interleukino-1 ir FRF superšeima	FRF šeima: Rūgštus FRF, pagrindinis FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) šeima: IL-1α, IL-1β, IL-1 receptorių antagonistas, IL-18, IL-33 ir kt.	Fibroblastų ir epitelio ląstelių proliferacijos aktyvinimas Priešuždegiminis poveikis, specifinio imuniteto aktyvinimas
Naviko nekrozės faktorių šeima	TNF, limfotoksinai α ir β, Fas ligandas ir kt.	Priešuždegiminis poveikis, apoptozės reguliavimas ir imunokompetentingų ląstelių tarpląstelinė sąveika
Interleukino-6 šeima	Gp130 ligandai: IL-6, IL-11, IL-31, Onkostatinas-M, kardiotropinas-1, leukemiją slopinantis faktorius, ciliarinis neurotrofinis faktorius	Priešuždegiminis ir imunoreguliacinis poveikis
Chemokinai	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Įvairių tipų leukocitų chemotaksės reguliavimas
Interleukino-10 šeima	IL-10,19,20,22,24,26	Imunosupresinis veiksmas
Interleukino-12 šeima		Pagalbinių T-limfocitų diferenciacijos reguliavimas
T-pagalbinių klonų citokinai ir limfocitų reguliavimo funkcijos	1 tipo T-pagalbininkai: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg 2 tipo T-pagalbininkai: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 receptorių γ grandinės ligandai: IL-7 TSLP	Ląstelinio imuniteto aktyvinimas Humoralinio imuniteto aktyvinimas, imunomoduliacinis poveikis Įvairių tipų limfocitų, DC, NK ląstelių, makrofagų ir kt. Diferenciacijos, proliferacijos ir funkcinių savybių stimuliavimas.
Interleukin 17 šeima	IL-17A, B, C, D, E, F	Priešuždegiminių citokinų sintezės aktyvinimas
Nervų augimo faktoriaus, trombocitų augimo faktoriaus ir transformuojančių augimo faktorių šeima	Nervų augimo faktorių šeima: NGF, smegenų neurotrofinis faktorius Trombocitų augimo faktoriai (PDGF), angiogeniniai augimo faktoriai (VEGF) TRF šeima: TPPb, aktyvinai, inhibitoriai, mazgai, kaulų morfogeniniai baltymai, Mullerio slopinanti medžiaga	Uždegimo, angiogenezės, neuronų funkcijos, embriono vystymosi ir audinių regeneracijos reguliavimas
Epidermio augimo faktorių šeima	ERF, TRFα ir kt.
Į insuliną panašių augimo faktorių šeima	IRF-I, IRF-II	Įvairių tipų ląstelių proliferacijos skatinimas

Pirmajai grupei priskiriami I tipo interferonai ir ji yra paprasčiausia organizuoti, nes visos į ją įtrauktos molekulės turi panašią struktūrą ir daugeliu atžvilgių tas pačias funkcijas, susijusias su antivirusine apsauga. Antroji grupė apėmė kraujodaros ląstelių augimo ir diferenciacijos veiksnius, skatinančius kraujodaros kamieninių ląstelių vystymąsi, pradedant nuo kamieninių ląstelių. Šiai grupei priklauso citokinai, kurie yra specifiniai tam tikroms kraujodaros ląstelių diferenciacijos linijoms (eritropoetinas, trombopoetinas ir IL-7, veikiantis TB limfocitų pirmtakus), taip pat platesnio biologinio aktyvumo spektro citokinai. kaip IL-3, IL-11, kolonijas stimuliuojantys veiksniai. Šioje citokinų grupėje dėl molekulių struktūrinės struktūros panašumo išskirti gp140 ligandai, turintys bendrą receptorių subvienetą, taip pat trombopoetinas ir eritropoetinas. FGF ir IL-1 superšeimų citokinai turi aukštą homologijos laipsnį ir panašią baltymų struktūrą, o tai patvirtina bendrą kilmę. Nepaisant to, atsižvelgiant į biologinio aktyvumo apraiškas, FGF daugeliu atžvilgių skiriasi nuo IL-1 šeimos agonistų. Šiuo metu IL-1 molekulių šeima, be funkcinių pavadinimų, turi pavadinimus F1-F11, kur F1 atitinka IL-1α, F2-IL-1β, F3-IL-1 receptorių antagonistas, F4-IL- 18. Likę šeimos nariai buvo atrasti dėl genetinės analizės ir turi gana aukštą homologiją su IL-1 molekulėmis, tačiau jų biologinės funkcijos nėra iki galo išaiškintos. Kitos citokinų grupės apima IL-6 šeimas (bendro receptoriaus subvieneto gp130 ligandai), naviko nekrozės faktorių ir chemokinus, kuriuos sudaro didžiausias skaičius atskirų ligandų ir kurie yra išvardyti visuose atitinkamuose skyriuose. Naviko nekrozės faktoriaus šeima susidaro daugiausia remiantis ligandų ir jų receptorių struktūros panašumu, susidedančiu iš trijų nekovalentiškai susietų vienodų subvienetų, sudarančių biologiškai aktyvias molekules. Tuo pačiu metu, kalbant apie biologines savybes, šiai šeimai priklauso gana skirtingos veiklos citokinai. Pavyzdžiui, TNF yra vienas ryškiausių priešuždegiminių citokinų, Fas ligandas sukelia tikslinių ląstelių apoptozę, o CD40 ligandas suteikia stimuliuojantį signalą T ir B limfocitų tarpląstelinės sąveikos metu. Tokius struktūriškai panašių molekulių biologinio aktyvumo skirtumus pirmiausia lemia jų receptorių išraiškos ir struktūros ypatybės, pavyzdžiui, ląstelės „mirties“ domeno buvimas ar nebuvimas, lemiantis ląstelių apoptozę. Pastaraisiais metais IL-10 ir IL-12 šeimos taip pat buvo papildytos naujais nariais, gavusiais interleukinų serijos numerius. Po to seka labai sudėtinga citokinų grupė, kuri yra T-pagalbinių limfocitų funkcinio aktyvumo tarpininkė. Įtraukimas į šią grupę grindžiamas dviem pagrindiniais principais: 1) priklausymas Th1 arba Th2 sintezuojamiems citokinams, lemiantiems daugiausia humoralinio ar ląstelinio tipo imunologinių reakcijų vystymąsi, 2) bendro receptorių subvieneto - gama grandinės - buvimas. IL-2 receptorių kompleksas. Tarp gama grandinės ligandų buvo papildomai izoliuotas IL-4, kuris taip pat turi bendrus receptorių subvienetus su IL-13, o tai daugiausia lemia iš dalies sutampančią šių citokinų biologinę veiklą. Panašiu būdu buvo išskirtas IL-7, turintis bendrą receptorių struktūrą su TSLP. Aukščiau pateiktos klasifikacijos pranašumai yra susiję su tuo pačiu metu atsižvelgiama į citokinų biologines ir biochemines savybes. Šio metodo įgyvendinamumą šiuo metu patvirtina naujų citokinų atradimas genetine genomo analize ir struktūriškai panašių genų paieška. Šio metodo dėka I tipo interferonų šeima, IL-1, IL-10, IL-12, gerokai išsiplėtė, atsirado nauja IL-17 analoginių citokinų šeima, kurią jau sudaro 6 nariai. Matyt, artimiausiu metu naujų citokinų atsiradimas įvyks daug lėčiau, nes žmogaus genomo analizė yra beveik baigta. Pokyčiai greičiausiai įmanomi paaiškinus ligandų ir receptorių sąveikos variantus ir biologines savybes, kurios leis klasifikuoti citokinus galutinę formą.

Veikimo mechanizmai.

B. Citokinų receptoriai. Citokinai yra hidrofilinės signalinės medžiagos, kurių veikimą lemia specifiniai receptoriai, esantys plazmos membranos išorėje. Citokinų prisijungimas prie receptoriaus (1) per keletą tarpinių etapų (2–5) suaktyvina tam tikrų genų transkripciją (6). Patys citokinų receptoriai neturi tirozinkinazės aktyvumo (su keliomis išimtimis). Prisijungę prie citokino (1), receptorių molekulės susijungia ir sudaro homodimerus. Be to, jie gali sudaryti heterodimerus, susieti su signalo perdavimo baltymais [STP] arba skatinti pačių BPS dimerizaciją (2). I klasės citokinų receptoriai gali agreguoti su trijų tipų BPS: baltymais GP130, βc arba γc. Šie pagalbiniai baltymai patys negali surišti citokinų, tačiau jie atlieka signalo perdavimą į tirozino kinazes (3). Tie patys daugelio citokinų biologinio aktyvumo spektrai paaiškinami tuo, kad skirtingi citokinų receptorių kompleksai gali suaktyvinti tą patį BPS.

Kaip signalo perdavimo iš citokinų pavyzdys, diagramoje parodyta, kaip IL-6 (IL-6) receptorius, prisijungęs prie ligando (1), stimuliuoja GP130 dimerizaciją (2). Membraninis baltymų dimeris GP130 suriša ir aktyvuoja YK šeimos citoplazminę tirozinkinazę (Janus kinazės su dviem aktyviomis vietomis) (3). Janus kinazės fosforilina citokinų receptorius, BPS ir įvairius citoplazminius baltymus, kurie atlieka tolesnį signalo perdavimą; jie taip pat fosforilina transkripcijos faktorius - signalų keitiklius ir transkripcijos aktyvatorius [PSAT (STAT, iš anglų kalbos signalų keitiklių ir transkripcijos aktyvatorių)]. Šie baltymai priklauso BPS šeimai, kurios struktūroje yra SH3 domenas, atpažįstantis fosfotirozino liekanas (žr. P. 372). Todėl jie turi savybę prisijungti prie fosforilinto citokinų receptoriaus. Jei tada įvyksta PSAT molekulės (4) fosforilinimas, faktorius virsta aktyvia forma ir sudaro dimerą (5). Po perkėlimo į branduolį dimeris, kaip transkripcijos faktorius, jungiasi prie inicijuoto geno promotoriaus (žr. 240 psl.) Ir sukelia jo transkripciją (6). Kai kurie citokinų receptoriai dėl proteolizės gali prarasti tarpląstelinį ligandą surišantį domeną (neparodyta diagramoje). Domenas patenka į kraują, kur konkuruoja dėl surišimo su citokinu, kuris sumažina citokinų koncentraciją kraujyje Kartu citokinai sudaro daugiafunkcinio poveikio reguliavimo tinklą (citokinų kaskadą). Citokinų sutapimas lemia tai, kad daugelio jų veikloje pastebimas sinergizmas, o kai kurie citokinai yra antagonistai. Organizme dažnai galima stebėti visą citokinų kaskadą su sudėtingu grįžtamuoju ryšiu.

Citokinų savybės.

Bendrosios citokinų savybės, dėl kurių šie tarpininkai gali būti sujungti į nepriklausomą reguliavimo sistemą.

1. Citokinai yra polipeptidai arba baltymai, dažnai glikozilinti, daugumos jų MW yra nuo 5 iki 50 kDa. Biologiškai aktyvios citokinų molekulės gali būti sudarytos iš vieno, dviejų, trijų ar daugiau vienodų ar skirtingų subvienetų.

2. Citokinai neturi antigeninio biologinio poveikio specifiškumo. Jie veikia funkcinį ląstelių, dalyvaujančių įgimto ir įgyto imuniteto reakcijose, aktyvumą. Nepaisant to, veikiant T- ir B-limfocitams, citokinai gali stimuliuoti antigeno sukeltus imuninės sistemos procesus.

3. Yra trys citokinų genų ekspresijos variantai: a) etapui būdinga ekspresija tam tikruose embriono vystymosi etapuose, b) konstitucinė išraiška, skirta daugeliui normalių fiziologinių funkcijų reguliuoti, c) daugumai citokinų būdingas indukuojamas ekspresijos tipas. Iš tiesų, dauguma citokinų, esančių už uždegiminio atsako ir imuninio atsako ribų, nėra sintezuojami ląstelėse. Citokinų genų ekspresija prasideda reaguojant į patogenų įsiskverbimą į organizmą, antigeninį dirginimą ar audinių pažeidimus. Su patogenu susijusios molekulinės struktūros yra vieni iš stipriausių priešuždegiminių citokinų sintezės induktorių. Norint paskatinti T-ląstelių citokinų sintezę, reikalingas ląstelių aktyvavimas specifiniu antigenu, dalyvaujant T-ląstelių antigeno receptoriui.

4. Citokinai sintezuojami reaguojant į stimuliaciją trumpą laiką. Sintezė nutraukiama dėl įvairių autoreguliacijos mechanizmų, įskaitant padidėjusį RNR nestabilumą, ir dėl neigiamų atsiliepimų, kuriuos sukelia prostaglandinai, kortikosteroidų hormonai ir kiti veiksniai.

5. Vieną ir tą patį citokiną gali gaminti skirtingų tipų organų ląstelės skirtinguose organuose pagal histogenetinę kilmę.

6. Citokinai gali būti siejami su juos sintetinančių ląstelių membranomis, membranos pavidalu turintys visą biologinio aktyvumo spektrą ir išreiškiantys savo biologinį poveikį tarpląstelinio sąlyčio metu.

7. Biologinį citokinų poveikį lemia specifiniai ląstelių receptorių kompleksai, jungiantys citokinus labai dideliu afinitetu, o atskiri citokinai gali naudoti bendrus receptorių subvienetus. Citokinų receptoriai gali egzistuoti tirpia forma, išlaikant galimybę surišti ligandus.

8. Citokinai turi pleiotropinį biologinį poveikį. Tas pats citokinas gali veikti daugelio tipų ląsteles, sukeldamas skirtingą poveikį, priklausomai nuo tikslinių ląstelių tipo (1 pav.). Citokinų pleiotropinį poveikį užtikrina citokinų receptorių ekspresija skirtingos kilmės ir funkcijų ląstelių tipuose ir signalo laidumas, naudojant kelis skirtingus tarpląstelinius pasiuntinius ir transkripcijos faktorius.

9. Citokinai pasižymi biologinio veikimo keičiamumu. Keli skirtingi citokinai gali sukelti tą patį biologinį poveikį arba turėti panašų aktyvumą. Citokinai sukelia arba slopina savo, kitų citokinų ir jų receptorių sintezę.

10. Reaguodamos į aktyvinimo signalą, ląstelės vienu metu sintezuoja kelis citokinus, dalyvaujančius formuojant citokinų tinklą. Biologinis poveikis audiniuose ir organizmo lygiu priklauso nuo kitų citokinų, turinčių sinergetinį, papildomą ar priešingą poveikį, buvimo ir koncentracijos.

11. Citokinai gali turėti įtakos tikslinių ląstelių proliferacijai, diferenciacijai ir funkciniam aktyvumui.

12. Citokinai veikia ląsteles įvairiai: autokrininė - ląstelę, sintezuojančią ir išskiriančią šį citokiną; parakrinas - ląstelės, esančios šalia gamintojo ląstelės, pavyzdžiui, uždegimo židinyje arba limfoidiniame organe; endokrininė - nutolusi nuo bet kokių organų ir audinių ląstelių, patekusi į kraujotaką. Pastaruoju atveju citokinų veikimas panašus į hormonų (2 pav.).

Ryžiai. 1. Vieną ir tą patį citokiną gali gaminti skirtingų tipų kūno ląstelės skirtinguose histogenetinės kilmės organuose ir veikti daugelio tipų ląstelėse, sukeldamos skirtingą poveikį, priklausomai nuo tikslinių ląstelių tipo.

Ryžiai. 2. Trys citokinų biologinio veikimo pasireiškimo variantai.

Matyt, citokinų reguliavimo sistemos formavimasis evoliuciškai įvyko kartu su daugialąsčių organizmų vystymusi ir dėl to, kad reikia formuoti tarpląstelinės sąveikos tarpininkus, kurie gali apimti hormonus, neuropeptidus, sukibimo molekules ir kai kuriuos kitus. Šiuo atžvilgiu citokinai yra pati universaliausia reguliavimo sistema, nes jie gali parodyti biologinį aktyvumą tiek toli po sekrecijos, kurią gamina ląstelė (lokaliai ir sistemiškai), tiek tarpląstelinio kontakto metu, būdami biologiškai aktyvūs membranos pavidalu. Taip citokinų sistema skiriasi nuo sukibimo molekulių, kurios atlieka siauresnes funkcijas tik tada, kai ląstelės tiesiogiai liečiasi. Tuo pačiu metu citokinų sistema skiriasi nuo hormonų, kuriuos daugiausia sintezuoja specializuoti organai ir kurie veikia patekę į kraujotakos sistemą.

Citokinų vaidmuo reguliuojant kūno fiziologines funkcijas.

Citokinų vaidmenį reguliuojant kūno fiziologines funkcijas galima suskirstyti į 4 pagrindinius komponentus:

1. Embriogenezės reguliavimas, organų kūrimasis ir vystymasis, įsk. imuninės sistemos organai.

2. Tam tikrų normalių fiziologinių funkcijų reguliavimas.

3. Kūno gynybinių reakcijų reguliavimas vietiniu ir sisteminiu lygiu.

4. Audinių regeneracijos procesų reguliavimas.

Atskirų citokinų genų ekspresija vyksta tam tikroje stadijoje tam tikruose embriono vystymosi etapuose. Kamieninių ląstelių faktorius, transformuojantys augimo faktoriai, TNF šeimos citokinai ir chemokinai reguliuoja įvairių ląstelių diferenciaciją ir migraciją bei imuninės sistemos organų kūrimąsi. Po to kai kurių citokinų sintezė gali būti atnaujinta, o kiti ir toliau reguliuoja normalius fiziologinius procesus arba dalyvauja kuriant apsaugines reakcijas.

Nepaisant to, kad dauguma citokinų yra tipiški indukuojami tarpininkai ir pogimdyminiu laikotarpiu ląstelės nesintetina uždegiminio atsako ir imuninio atsako, kai kuriems citokinams ši taisyklė netaikoma. Dėl konstitucinės genų ekspresijos kai kurie iš jų yra nuolat sintetinami ir yra pakankamai dideliais kiekiais, reguliuojantys tam tikrų ląstelių tipų dauginimąsi ir diferenciaciją visą gyvenimą. Šio tipo fiziologinio funkcijų reguliavimo citokinais pavyzdžiai gali būti nuolat didelis eritropoetino ir kai kurių CSF kiekis, siekiant užtikrinti kraujodarą. Citokinų organizmo gynybinių reakcijų reguliavimas vyksta ne tik imuninės sistemos viduje, bet ir organizuojant gynybines reakcijas viso organizmo lygiu, reguliuojant beveik visus uždegimo vystymosi ir imuninio atsako aspektus. Ši funkcija, kuri yra svarbiausia visai citokinų sistemai, yra susijusi su dviem pagrindinėmis citokinų biologinio veikimo kryptimis - apsauga nuo infekcinių ligų sukėlėjų ir pažeistų audinių atstatymu. Citokinai pirmiausia reguliuoja vietinių gynybinių reakcijų vystymąsi audiniuose, dalyvaujant įvairių tipų kraujo ląstelėms, endoteliui, jungiamajam audiniui ir epiteliui. Apsauga vietiniu lygmeniu vystosi formuojant tipišką uždegiminę reakciją, pasireiškiančią klasikinėmis apraiškomis: hiperemija, edemos išsivystymu, skausmo atsiradimu ir disfunkcija. Citokinų sintezė prasideda, kai patogenai patenka į audinius arba pažeidžiamas jų vientisumas, kuris paprastai vyksta lygiagrečiai. Citokinų gamyba yra neatskiriama ląstelinio atsako dalis, susijusi su ląstelių atpažinimu iš mielomonocitinės serijos panašių įvairių patogenų struktūrinių komponentų, vadinamų su patogenais susijusiais molekuliniais modeliais. Tokių patogenų struktūrų pavyzdžiai yra gramneigiamų bakterijų lipopolisacharidai, gramteigiamų mikroorganizmų peptidoglikanai, flagellinas arba DNR, turinti daug CpolyG sekų, o tai būdinga visų tipų bakterijų DNR. Leukocitai išreiškia atitinkamus modelio atpažinimo receptorius, dar vadinamus „Toll-like receptoriais“ (TLR), būdingus tam tikriems mikroorganizmų struktūriniams modeliams. Po mikroorganizmų ar jų komponentų sąveikos su TLR suaktyvėja tarpląstelinė signalo perdavimo kaskada, dėl kurios padidėja leukocitų funkcinis aktyvumas ir citokinų genų ekspresija.

Dėl TLR aktyvacijos sintezuojamos dvi pagrindinės citokinų grupės: priešuždegiminiai citokinai ir I tipo interferonai, daugiausia IFNα / β. Uždegiminės reakcijos išsivystymas ir į ventiliatorių panašus įvairių tipų ląstelių, aktyviai dalyvaujančių priežiūroje, aktyvinimas ir uždegimo reguliavimas, įskaitant visų tipų leukocitus, dendritines ląsteles, T ir B limfocitus, NK ląsteles, endotelio ir epitelio ląsteles, fibroblastus ir kt. Tai užtikrina nuoseklius uždegiminio atsako vystymosi etapus, kurie yra pagrindinis įgimto imuniteto įgyvendinimo mechanizmas. Be to, dendritinės ląstelės pradeda sintetinti IL-12 šeimos citokinus, skatindamos pagalbinių T-limfocitų diferenciaciją, kuri yra savotiškas tiltas į specifinių imuniteto reakcijų, susijusių su specifinių antigeninių struktūrų pripažinimu, vystymosi pradžią. mikroorganizmų.

Antrasis ne mažiau svarbus mechanizmas, susijęs su IFN sinteze, užtikrina antivirusinės apsaugos įgyvendinimą. I tipo interferonai pasižymi 4 pagrindinėmis biologinėmis savybėmis:

1. Tiesioginis antivirusinis poveikis blokuojant transkripciją.

2. Ląstelių proliferacijos slopinimas, būtinas siekiant užkirsti kelią viruso plitimui.

3. NK ląstelių, galinčių lizuoti virusu užkrėstų kūno ląstelių, funkcijų aktyvinimas.

4. Sustiprinta I klasės pagrindinių histokompatibilumo komplekso molekulių ekspresija, reikalinga padidinti virusinių antigenų pateikimo infekuotoms ląstelėms efektyvumą citotoksiniams T-limfocitams. Tai veda prie to, kad T-limfocitai aktyvina specifinį virusu užkrėstų ląstelių atpažinimą-pirmąjį virusu užkrėstų tikslinių ląstelių lizės etapą.

Dėl to, be tiesioginio antivirusinio poveikio, aktyvuojami ir įgimto (NK ląstelių), ir įgyto (T-limfocitų) imuniteto mechanizmai. Tai pavyzdys, kaip viena maža citokinų molekulė, kurios MM yra 10 kartų mažesnė už MM antikūnų molekulių, dėl pleiotropinio biologinio poveikio gali suaktyvinti visiškai skirtingus gynybos reakcijų mechanizmus, kuriais siekiama vieno tikslo - pašalinti virusą, pateko į kūną.

Audinių lygmenyje citokinai yra atsakingi už uždegimo vystymąsi, o vėliau - audinių regeneraciją. Kai išsivysto sisteminė uždegiminė reakcija (ūminės fazės atsakas), citokinai veikia beveik visus organus ir kūno sistemas, dalyvaujančias homeostazės reguliavime. Dėl priešuždegiminių citokinų poveikio centrinei nervų sistemai sumažėja apetitas ir pasikeičia visas elgesio reakcijų kompleksas. Laikinai sustabdyti maisto paieškas ir sumažinti seksualinį aktyvumą yra naudinga taupant energiją vienai užduočiai - kovoti su įsibrovusiu patogenu. Šį signalą teikia citokinai, nes jų patekimas į kraujotaką neabejotinai reiškia, kad vietinė gynyba nesusitvarkė su patogenu, todėl reikia aktyvuoti sisteminį uždegiminį atsaką. Viena iš pirmųjų sisteminės uždegiminės reakcijos apraiškų, susijusių su citokinų poveikiu pagumburio termoreguliacijos centrui, yra kūno temperatūros padidėjimas. Temperatūros padidėjimas yra veiksminga apsauginė reakcija, nes esant aukštai temperatūrai daugelio bakterijų gebėjimas daugintis mažėja, tačiau, priešingai, padidėja limfocitų dauginimasis.

Kepenyse, veikiant citokinams, padidėja ūminės fazės baltymų ir komplemento sistemos komponentų, būtinų kovai su patogenu, sintezė, tačiau kartu mažėja albumino sintezė. Kitas selektyvaus citokinų veikimo pavyzdys yra kraujo plazmos joninės sudėties pasikeitimas kuriant sisteminę uždegiminę reakciją. Tuo pačiu metu sumažėja geležies jonų kiekis, bet padidėja cinko jonų kiekis, ir gerai žinoma, kad atimti iš geležies jonų bakterijų ląstelę reiškia sumažinti jų proliferacinį potencialą (laktoferino poveikis remiantis tuo). Kita vertus, norint normaliai funkcionuoti imuninei sistemai, būtina padidinti cinko kiekį, visų pirma tai būtina biologiškai aktyviam serumo užkrūčio liaukos faktoriui - vienam iš pagrindinių užkrūčio liaukos hormonų, kurie užtikrina limfocitų diferenciaciją, susidaryti. Citokinų poveikis kraujodaros sistemai yra susijęs su reikšmingu hematopoezės aktyvavimu. Padidėjęs leukocitų skaičius yra būtinas norint papildyti nuostolius ir padidinti ląstelių, daugiausia neutrofilinių granulocitų, skaičių, esantį pūlingo uždegimo centre. Veiksmas kraujo krešėjimo sistemai skirtas sustiprinti krešėjimą, kuris yra būtinas kraujavimui sustabdyti ir tiesiogiai užkirsti kelią patogenui.

Taigi, vystantis sisteminiam uždegimui, citokinai pasižymi didžiuliu biologinės veiklos spektru ir trukdo beveik visų kūno sistemų darbui. Tačiau nė vienas iš įvykusių pokyčių nėra atsitiktinis: visi jie reikalingi tiesioginiam gynybinių reakcijų aktyvavimui arba yra naudingi keičiant energijos srautus tik vienai užduočiai - kovai su įsibrovusiu patogenu. Reguliuojant atskirų genų išraišką, hormoninius poslinkius ir elgesio reakcijų pokyčius, citokinai užtikrina tų kūno sistemų, kurios tam tikru metu reikalingos apsauginėms reakcijoms vystytis, aktyvavimą ir maksimalų darbo efektyvumą. Viso organizmo lygmenyje citokinai bendrauja tarp imuninės, nervų, endokrininės, kraujodaros ir kitų sistemų ir padeda juos įtraukti į vienos gynybos reakcijos organizavimą ir reguliavimą. Citokinai tarnauja kaip organizacinė sistema, formuojanti ir reguliuojanti visą organizmo gynybinių reakcijų kompleksą įvedant patogenus. Matyt, tokia reguliavimo sistema buvo suformuota evoliuciškai ir turi besąlygišką naudą optimaliausiam apsauginiam makroorganizmo atsakui. Todėl, matyt, neįmanoma apsiriboti gynybinių reakcijų samprata tik nespecifinių atsparumo mechanizmų ir specifinio imuninio atsako dalyvavimu. Visas kūnas ir visos sistemos, kurios iš pirmo žvilgsnio nėra susijusios su imuniteto palaikymu, dalyvauja vienoje apsauginėje reakcijoje.

Specialūs citokinų tyrimai.

Citokinų reikšmė vaikų storosios žarnos uždegiminių ligų patogenezėje.

S.V. Belmeris, A.S. Simbirtsevas, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Michailova. Rusijos valstybinis medicinos universitetas, Valstybinis mokslinis koloproktologijos centras, Maskva ir Valstybinis labai grynų biologinių tyrimų institutas, Sankt Peterburgas, tiria citokinų svarbą vaikų storosios žarnos uždegiminių ligų patogenezėje. Lėtinės uždegiminės virškinimo trakto ligos šiuo metu užima vieną iš pirmaujančių vietų vaikų virškinimo sistemos patologijoje. Ypatinga reikšmė teikiama uždegiminėms storosios žarnos ligoms (IBD), kurių dažnis nuolat didėja visame pasaulyje. Ilgas kursas su dažnais, o kartais ir mirtinais recidyvais, vietinių ir sisteminių komplikacijų išsivystymu - visa tai skatina nuodugniai ištirti ligos patogenezę, ieškant naujų būdų, kaip gydyti IBD. Pastaraisiais dešimtmečiais opiniu kolitu (UC) serga 510 atvejų per metus 100 tūkstančių gyventojų, o Krono liga (CD) - 16 atvejų per metus 100 tūkstančių gyventojų. Paplitimo rodikliai Rusijoje, Maskvos regione atitinka vidutinius Europos duomenis, tačiau žymiai mažesni nei Skandinavijos šalyse, Amerikoje, Izraelyje ir Anglijoje. NUC paplitimas yra 19,3 iš 100 tūkst., Dažnis - 1,2 iš 100 tūkst. Žmonių per metus. CD sergamumas yra 3,0 100 tūkst., Dažnis - 0,2 100 tūkst. Žmonių per metus. Tai, kad didžiausias dažnis buvo pastebėtas labai išsivysčiusiose šalyse, lemia ne tik socialiniai ir ekonominiai veiksniai, bet ir genetinės bei imunologinės pacientų savybės, lemiančios polinkį sirgti IBD. Šie veiksniai yra esminiai imunopatogenezinėje IBD kilmės teorijoje. Virusų ir (arba) bakterijų teorijos paaiškina tik ūmią ligos pradžią, o proceso chronizaciją lemia tiek genetinis polinkis, tiek imuninio atsako ypatybės, kurios taip pat yra nulemtos genetiškai. Reikėtų pažymėti, kad IBTC šiuo metu yra klasifikuojama kaip liga, turinti genetiškai nevienalytį kompleksinį polinkį. Nustatyta daugiau nei 15 tariamų genų kandidatų iš 2 grupių (imunospecifinių ir imunoreguliacinių), sukeliančių paveldimą polinkį. Labiausiai tikėtina, kad polinkį lemia keli genai, lemiantys imunologinių ir uždegiminių reakcijų pobūdį. Remiantis daugybės tyrimų rezultatais, galima daryti išvadą, kad labiausiai tikėtina genų, susijusių su IBT vystymusi, lokalizacija yra 3, 7, 12 ir 16 chromosomos. Šiuo metu daug dėmesio skiriama T ir B limfocitų, taip pat uždegimo mediatorių citokinų funkcijos ypatybių tyrimui. Aktyviai tiriamas interleukinų (IL), interferonų (IFN), naviko nekrozės faktoriaus a (TNF-a), makrofagų ir autoantikūnų vaidmuo storosios žarnos gleivinės baltymams ir auto mikroflorai. Buvo atskleisti jų CD ir UC sutrikimų bruožai, tačiau vis dar neaišku, ar šie pokyčiai atsiranda pirmiausia, ar antraeiliai. Norint suprasti daugelį patogenezės aspektų, labai svarbūs tyrimai, atlikti ikiklinikinėje IBT stadijoje, taip pat pirmojo laipsnio giminaičiams. Tarp uždegimo tarpininkų ypatingas vaidmuo tenka citokinams, kurie yra 5–50 kDa masės polipeptidų molekulių grupė, dalyvaujanti formuojant ir reguliuojant organizmo gynybines reakcijas. Kūno lygmenyje citokinai bendrauja tarp imuninės, nervų, endokrininės, kraujodaros ir kitų sistemų ir padeda juos įtraukti į gynybos reakcijų organizavimą ir reguliavimą. Citokinų klasifikacija pateikta 2 lentelėje. Daugumą citokinų nesintetina ląstelės, nepriklausančios uždegiminiam atsakui ir imuniniam atsakui. Citokinų genų ekspresija prasideda reaguojant į patogenų įsiskverbimą į organizmą, antigeninį dirginimą ar audinių pažeidimus. Vienas iš galingiausių citokinų sintezės induktorių yra bakterijų ląstelių sienelių komponentai: LPS, peptidoglikanai ir muramildipeptidai. Priešuždegiminių citokinų gamintojai daugiausia yra monocitai, makrofagai, T-ląstelės ir kt. Priklausomai nuo poveikio uždegiminiam procesui, citokinai skirstomi į dvi grupes: priešuždegiminius (IL-1, IL-6, IL-8) , TNF-a, IFN-g) ir priešuždegiminiai (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukinas-1 (IL-1) yra imunoreguliacinis tarpininkas, išsiskiriantis uždegiminių reakcijų, audinių pažeidimų ir infekcijų metu (priešuždegiminis citokinas). IL-1 vaidina svarbų vaidmenį aktyvinant T ląsteles, kai jos sąveikauja su antigenu. Yra 2 IL-1 tipai: IL-1a ir IL-1b, dviejų skirtingų genų lokusų, esančių žmogaus 2 chromosomoje, produktai. IL-1a lieka ląstelės viduje arba gali būti membranos pavidalu ir nedideliais kiekiais atsiranda tarpląstelinėje erdvėje. IL-1a membranos formos vaidmuo yra aktyvuojančių signalų perdavimas iš makrofagų į T-limfocitus ir kitas ląsteles. IL-1a yra pagrindinis trumpo nuotolio tarpininkas. IL-1b, priešingai nei IL-1a, aktyviai išskiria ląstelės, veikdamos tiek sistemiškai, tiek lokaliai. Šiandien žinoma, kad IL-1 yra vienas iš pagrindinių uždegiminių reakcijų tarpininkų, stimuliuoja T-ląstelių dauginimąsi, padidina IL-2 receptorių ekspresiją T-ląstelėse ir jų IL-2 gamybą. IL-2 kartu su antigenu skatina neutrofilų aktyvaciją ir sukibimą, stimuliuoja kitų citokinų (IL-2, IL-3, IL-6 ir kt.) Susidarymą aktyvuotų T-ląstelių ir fibroblastų pagalba, skatina fibroblastų dauginimąsi. ir endotelio ląstelės. Sistemiškai IL-1 veikia sinergiškai su TNF-a ir IL-6. Padidėjus koncentracijai kraujyje, IL-1 veikia pagumburio ląsteles ir sukelia kūno temperatūros padidėjimą, karščiavimą, mieguistumą, sumažėjusį apetitą, taip pat skatina kepenų ląsteles gaminti ūminės fazės baltymus (CRP, amiloidą A, a-2 makroglobulinas ir fibrinogenas). IL4 (5 chromosoma). Jis slopina makrofagų aktyvaciją ir blokuoja daugelį IFNg stimuliuojamų poveikių, pavyzdžiui, IL1, azoto oksido ir prostaglandinų gamybą, vaidina svarbų vaidmenį priešuždegiminėse reakcijose ir turi imunosupresinį poveikį. IL6 (7 chromosoma), vienas iš pagrindinių priešuždegiminių citokinų, yra pagrindinis paskutinio B ląstelių ir makrofagų diferenciacijos etapo induktorius, galingas kepenų ląstelių ūminės fazės baltymų gamybos stimuliatorius. Viena iš pagrindinių IL6 funkcijų yra stimuliuoti antikūnų gamybą in vivo ir in vitro. IL8 (4 chromosoma). Nurodo chemokinų tarpininkus, kurie sukelia nukreiptą leukocitų migraciją (chemotaksę) į uždegimo židinį. Pagrindinė IL10 funkcija yra slopinti citokinų gamybą naudojant I tipo Thelpers (TNFb, IFNg) ir aktyvintus makrofagus (TNF-a, IL1, IL12). Dabar pripažįstama, kad imuninio atsako tipai yra susiję su vienu iš limfocitų aktyvacijos variantų, kuriuose vyrauja pirmojo tipo (TH2) arba antrojo tipo (TH3) T limfocitų pagalbininkų klonai. Produktai TH2 ir TH3 neigiamai veikia priešingų klonų aktyvavimą. Pernelyg aktyvus bet kurio tipo Th klonų tipas gali nukreipti imuninį atsaką pagal vieną iš vystymosi galimybių. Lėtinis Th klonų aktyvavimo disbalansas sukelia imunopatologinių sąlygų vystymąsi. IBTD citokinų pokyčius galima tirti įvairiais būdais, nustatant jų kiekį kraujyje arba in situ. Visų uždegiminių žarnyno ligų IL1 lygis yra padidėjęs. Skirtumai tarp NNC ir CD yra padidėjusi IL2 ekspresija. Jei NUC nustatomas sumažėjęs arba normalus IL2 lygis, tada CD nustatomas padidėjęs jo kiekis. IL4 kiekis padidėja NUC, o CD - išlieka normalus arba net sumažėja. Visų uždegimo formų atveju taip pat padidėja IL6, tarpininkaujančio ūminės fazės reakcijoms, lygis. Gauti duomenys apie citokinų profilį leido manyti, kad dviem pagrindinėms lėtinio IBD formoms būdingas skirtingas citokinų aktyvinimas ir ekspresija. Tyrimų rezultatai rodo, kad pacientams, sergantiems UC, pastebėtas citokinų profilis labiau atitinka TH3 profilį, o TH2 profilis turėtų būti laikomas labiau būdingu pacientams, sergantiems CD. Šios hipotezės apie TH2 ir TH3 profilių vaidmenį patrauklumas taip pat yra tas, kad citokinų naudojimas gali pakeisti imuninį atsaką viena ar kita kryptimi ir sukelti remisiją atkuriant citokinų pusiausvyrą. Tai visų pirma galima patvirtinti naudojant IL10. Tolesni tyrimai turėtų parodyti, ar citokinų atsakas yra antrinis reiškinys, reaguojantis į stimuliaciją, ar, priešingai, atitinkamų citokinų ekspresija lemia organizmo reaktyvumą vystantis vėlesnėms klinikinėms apraiškoms. Citokinų lygio vaikų IBD tyrimas dar nebuvo atliktas. Šis darbas yra pirmoji mokslinio tyrimo dalis, skirta vaikų IBD citokinų būklei tirti. Šio darbo tikslas buvo ištirti makrofagų humoralinį aktyvumą, nustatant vaikų (sergančių NUC ir CD) lygius (IL1a, IL8) kraujyje, taip pat jų dinamiką gydymo metu. 2000–2002 m. Rusijos vaikų klinikinės ligoninės gastroenterologijos skyriuje buvo tiriami 34 vaikai su NUC ir 19 vaikų su CD nuo 4 iki 16 metų. Diagnozė buvo patvirtinta anamnestiškai, endoskopiškai ir morfologiškai. Priešuždegiminių citokinų IL1a, IL8 lygių tyrimas buvo atliktas naudojant su fermentais susietą imunosorbentinį tyrimą (ELISA). IL1a, IL8 koncentracijai nustatyti naudojome bandymų sistemas, pagamintas OOO Cytokin (Sankt Peterburgas, Rusija). Analizė buvo atlikta labai grynų biologinių preparatų tyrimų instituto Valstybinio mokslinio centro imunofarmakologijos laboratorijoje (laboratorijos vadovas, MD, prof. AS Simbirtsev). Tyrimo metu gauti rezultatai parodė, kad paūmėjimo laikotarpiu pastebimai padidėjo IL1a, IL8 lygis, labiau išreikštas vaikams, sergantiems NUC, nei vaikams, sergantiems CD. Be paūmėjimo priešuždegiminių citokinų kiekis sumažėja, bet nepasiekia normos. UC IL-1a, IL-8 koncentracija paūmėjimo laikotarpiu padidėjo 76,2% ir 90% vaikų, o remisijos laikotarpiu-atitinkamai 69,2% ir 92,3%. Sergant CD, paūmėjimo laikotarpiu IL-1a, IL-8 koncentracija padidėja 73,3% ir 86,6% vaikų, o remisijos laikotarpiu-atitinkamai 50% ir 75%.

Priklausomai nuo ligos sunkumo, vaikai buvo gydomi aminosalicilatais arba gliukokortikoidais. Terapijos pobūdis labai paveikė citokinų lygio dinamiką. Gydant aminosalicilatais, priešuždegiminių citokinų kiekis vaikų, sergančių NUC ir CD, grupėje buvo žymiai didesnis nei kontrolinės grupės. Tuo pačiu metu didesnis skaičius buvo pastebėtas vaikų, sergančių UC, grupėje. Gydant aminosalicilatu, NUC IL1a, IL8 padidėja atitinkamai 82,4% ir 100% vaikų, o gydymo gliukokortikoidais metu 60% vaikų - abu citokinai. Sergant CD, IL1a, IL8 padidėja gydant aminosalicilatus visiems vaikams, o gydant gliukokortikoidais - atitinkamai 55,5% ir 77,7% vaikų. Taigi šio tyrimo rezultatai rodo, kad daugumai vaikų, sergančių UC ir CD, imuninės sistemos makrofagų ryšys yra labai susijęs su patogeneziniu procesu. Šiame tyrime gauti duomenys iš esmės nesiskiria nuo duomenų, gautų tiriant suaugusius pacientus. Pacientų, sergančių UC ir CD, IL1a ir IL8 lygių skirtumai yra kiekybiniai, bet ne kokybiniai, o tai rodo, kad šie pokyčiai yra nespecifiniai dėl lėtinio uždegiminio proceso eigos. Todėl šie rodikliai neturi diagnostinės vertės. Dinaminio IL1a ir IL8 lygio tyrimo rezultatai patvirtina didesnį gydymo gliukokortikoidais veiksmingumą, palyginti su gydymu aminosalicilais. Pateikti duomenys yra pirmojo IBT sergančių vaikų citokinų būklės tyrimo etapo rezultatas. Reikia toliau tirti problemą, atsižvelgiant į kitų priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų rodiklius.

Azoto oksido ir citokinų vaidmuo kuriant ūminį plaučių pažeidimo sindromą.

T. A. Šumatova, V. B. Šumatovas, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya studijuoja šią problemą: Vladivostoko valstybinio medicinos universiteto Anesteziologijos ir reanimatologijos katedra. Ūminis plaučių sužalojimo sindromas (suaugusiųjų kvėpavimo distreso sindromas, ARDS) yra viena iš sunkiausių ūminio kvėpavimo nepakankamumo formų, pasireiškianti pacientams, sergantiems sunkia trauma, sepsiu, peritonitu, pankreatitu, dideliu kraujo netekimu, aspiracija, po didelių chirurginių intervencijų ir 50 m. 60% atvejų yra mirtini. Tyrimų duomenų apie ARDS patogenezę, ankstyvo sindromo diagnozavimo ir prognozavimo kriterijų kūrimo yra nedaug, jie yra gana prieštaringi, o tai neleidžia sukurti nuoseklios diagnostinės ir terapinės koncepcijos. Nustatyta, kad ARDS yra pagrįstas plaučių kapiliarų ir alveolių epitelio endotelio pažeidimu, kraujo reologinių savybių pažeidimu, sukeliančiu intersticinio ir alveolinio audinio edemą, uždegimą, atelektazę, plaučių hipertenziją. Pastarųjų metų literatūroje yra pakankamai informacijos apie universalų ląstelių ir audinių apykaitos reguliatorių - azoto oksidą. Susidomėjimas azoto oksidu (NO) pirmiausia kyla dėl to, kad jis dalyvauja reguliuojant daugelį funkcijų, įskaitant kraujagyslių tonusą, širdies susitraukimą, trombocitų agregaciją, neurotransmisiją, ATP ir baltymų sintezę bei imuninę gynybą. Be to, priklausomai nuo molekulinio taikinio pasirinkimo ir sąveikos su juo savybių, NO taip pat turi žalingą poveikį. Manoma, kad ląstelių aktyvavimo mechanizmas yra nesubalansuota citokinemija. Citokinai yra tirpūs peptidai, kurie veikia kaip imuninės sistemos tarpininkai ir užtikrina ląstelių bendradarbiavimą, teigiamą ir neigiamą imunoreguliaciją. Mes bandėme susisteminti literatūroje turimą informaciją apie NO ir citokinų vaidmenį vystantis ūminiam plaučių pažeidimo sindromui. NO yra vandenyje ir riebaluose tirpios dujos. Jo molekulė yra nestabilus laisvasis radikalas, lengvai pasklinda į audinius, absorbuojamas ir sunaikinamas taip greitai, kad gali paveikti tik artimiausios aplinkos ląsteles. NO molekulė turi visas savybes, būdingas klasikiniams pasiuntiniams: ji greitai pagaminama, veikia labai mažomis koncentracijomis, nutraukus išorinį signalą, greitai virsta kitais junginiais, oksiduojasi į stabilius neorganinius azoto oksidus: nitritą ir nitratą. Įvairių šaltinių duomenimis, NO gyvenimo trukmė audiniuose yra nuo 5 iki 30 sekundžių. Pagrindiniai NO molekuliniai taikiniai yra geležies turintys fermentai ir baltymai: tirpi guanilato ciklazė, nitrooksido sintazė (NOS), hemoglobinas, mitochondrijų fermentai, Krebso ciklo fermentai, baltymų ir DNR sintezė. NO sintezė organizme vyksta fermentinėmis transformacijomis azoto turinčioje aminorūgšties L-arginino dalyje, veikiant specifiniam fermentui NOS, ir yra tarpininkaujant kalcio jonams sąveikaujant su kalmodulinu. Fermentas yra inaktyvuojamas esant mažoms koncentracijoms ir yra maksimaliai aktyvus esant 1 μM laisvo kalcio. Nustatytos dvi NOS izoformos: konstitucinė (cNOS) ir indukuota (iNOS), kurios yra skirtingų genų produktai. Nuo kalcio-kalmodulino priklausomas cNOS ląstelėje nuolat yra ir skatina nedidelio NO kiekio išsiskyrimą, reaguojant į receptorius ir fizinę stimuliaciją. NO, susidaręs veikiant šiai izoformai, veikia kaip nešėjas daugelyje fiziologinių reakcijų. Nuo kalcio ir kalmodulino nepriklausomas iNOS susidaro įvairių tipų ląstelėse, reaguodamas į priešuždegiminius citokinus, endotoksinus ir oksidantus. Ši NOS izoforma yra transkribuota specifinių 17 chromosomos genų ir skatina didelių NO kiekių sintezę. Fermentas taip pat skirstomas į tris tipus: NOS-I (neuroninis), NOS-II (makrofagas), NOS-III (endotelis). Fermentų, kurie sintezuoja NO, šeima yra įvairiose plaučių ląstelėse: bronchų epitelio ląstelėse, alveolocituose, alveoliniuose makrofaguose, stiebo ląstelėse, bronchų arterijų ir venų endotelio ląstelėse, lygiuose bronchų ir kraujagyslių miocituose, ne adrenerginiuose necholinerginiuose neuronuose. Žmonių ir žinduolių bronchų ir alveolių epitelio ląstelių konstitucinis gebėjimas išskirti NO buvo patvirtintas daugelyje tyrimų. Nustatyta, kad žmogaus kvėpavimo takų viršutinės dalys, taip pat ir apatinės, dalyvauja formuojant NO. Tyrimai, atlikti su pacientais, kuriems atlikta tracheostomija, parodė, kad per tracheostomiją iškvepiamame ore dujų kiekis yra žymiai mažesnis nei nosies ir burnos ertmėje. Endogeninio NO sintezė pacientams, kuriems taikoma mechaninė ventiliacija, labai nukenčia. Tyrimai patvirtina, kad NO išsiskiria bronchų išsiplėtimo metu ir yra kontroliuojamas klajoklio nervų sistemos. Gauti duomenys, kad NO susidarymas žmogaus kvėpavimo takų epitelyje padidėja sergant uždegiminėmis kvėpavimo sistemos ligomis. Dujų sintezė padidėja dėl to, kad veikiant citokinams, taip pat endotoksinams ir lipopolisacharidams, suaktyvėja indukuota NOS.

Šiuo metu žinoma daugiau nei šimtas citokinų, kurie tradiciškai skirstomi į kelias grupes.

1. Interleukinai (IL -1 - IL18) - sekreciją reguliuojantys baltymai, užtikrinantys tarpininko sąveiką imuninėje sistemoje ir jos ryšį su kitomis kūno sistemomis.

2. Interferonai (IFN -alfa, beta, gama) - antivirusiniai citokinai, turintys ryškų imunoreguliacinį poveikį.

3. Naviko nekrozės faktoriai (TNF alfa, beta) yra citokinai, turintys citotoksinį ir reguliacinį poveikį.

4. Kolonijas stimuliuojantys veiksniai (G-CSF, M-CSF, GM-CSF)-kraujodaros ląstelių augimo ir diferenciacijos stimuliatoriai, reguliuojantys kraujodarą.

5. Chemokinai (IL-8, IL-16)-chemoatraktantai leukocitams.

6. Augimo faktoriai - įvairių audinių ląstelių augimo, diferenciacijos ir funkcinio aktyvumo reguliatoriai (fibroblastų augimo faktorius, endotelio ląstelių augimo faktorius, epidermio augimo faktorius) ir transformuojantys augimo faktoriai (TGF beta).

Šios bioreguliacinės molekulės nustato uždegiminio ir imuninio atsako tipą ir trukmę, kontroliuoja ląstelių dauginimąsi, kraujodarą, angiogenezę, žaizdų gijimą ir daugelį kitų procesų. Visi tyrinėtojai pabrėžia, kad citokinai neturi specifiškumo antigenams. Eksperimentai su kultivuotais plaučių makrofagais ir stiebo ląstelėmis parodė, kad iNOS susidaro reaguojant į gama interferoną, interleukiną-1, naviko nekrozės faktorių ir lipopolisacharidus. INOS ir cNOS ekspresija priešuždegiminiams citokinams buvo nustatyta gyvūnų ir žmonių alveolocituose. Prie kultūros pridėjus epidermio augimo faktorių, epitelio ląstelių funkcijos reguliatorių, sumažėjo tik indukuoto fermento aktyvumas. Yra žinoma, kad, priklausomai nuo pobūdžio, citokinai veikia autokriniškai - pačias gaminančias ląsteles, parakrinas - kitas tikslines ląsteles arba endokrinines - skirtingas ląsteles už jų gamybos vietos ribų. Tuo pačiu metu jie gali sąveikauti tarpusavyje pagal agonistinį ar antagonistinį principą, pakeisdami tikslinių ląstelių funkcinę būseną ir sudarydami citokinų tinklą. Taigi, citokinai nėra izoliuoti peptidai, o vientisa sistema, kurios pagrindiniai komponentai yra ląstelės gamintojos, pats baltymas yra citokinas, jo receptorius ir tikslinė ląstelė. Nustatyta, kad išsivysčius ūminiam plaučių pažeidimui, padidėja priešuždegiminių citokinų kiekis: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Jų poveikis yra susijęs su kraujagyslių išsiplėtimu, jų pralaidumo padidėjimu ir skysčių kaupimu plaučių audinyje. Be to, tyrimai parodė IFN gama ir TNF alfa gebėjimą sukelti sukibimo molekulių - ICAM -1 - ekspresiją žmogaus endoteliocituose. Sukibusios molekulės, prilipusios prie leukocitų, trombocitų ir endotelio ląstelių, sudaro „riedančius“ neutrofilus ir skatina fibrino dalelių agregaciją. Šie procesai prisideda prie kapiliarų kraujotakos pažeidimo, padidina kapiliarų pralaidumą ir sukelia vietinę audinių edemą. Kapiliarų kraujotakos sulėtėjimą skatina NO, kuris sukelia arteriolių išsiplėtimą. Tolesnę leukocitų migraciją į uždegimo židinį kontroliuoja specialūs citokinai - chemokinai, kuriuos gamina ir išskiria ne tik aktyvuoti makrofagai, bet ir endotelio ląstelės, fibroblastai, lygieji miocitai. Jų pagrindinė funkcija yra aprūpinti neutrofilus uždegimo židiniu ir suaktyvinti jų funkcinę veiklą. Pagrindinis neutokilų chemokinas yra Il-8. Stipriausi jo induktoriai yra bakteriniai lipopolisacharidai, IL-1 ir TNFalpha. R. Bahra ir kt. mano, kad kiekvienas neutrofilų transendotelio migracijos žingsnis yra reguliuojamas stimuliuojant TNF alfa koncentraciją. Vystantis ūminiam plaučių pažeidimui, kraujagyslių endoteliocitai, bronchų epitelio ląstelės ir alveoliniai makrofagai yra aktyvuojami ir dalyvauja fazių sąveikoje. Dėl to, viena vertus, atsiranda jų mobilizacija ir sustiprinamos apsauginės savybės, kita vertus, galima pažeisti pačias ląsteles ir aplinkinius audinius. Keletas tyrimų parodė, kad dalinio deguonies redukcijos produktas, superoksidas, gali kauptis uždegimo židinyje, o tai inaktyvuoja vazoaktyvų NO poveikį. NO ir superoksido anijonas greitai reaguoja ir sudaro ląsteles žalojantį peroksinitritą. Ši reakcija skatina NO pašalinimą iš kraujagyslių ir bronchų sienelių, taip pat nuo alveolocitų paviršiaus. Tyrimai, rodantys, kad tradiciškai laikomi NO toksiškumo tarpininkais, peroksinitritas gali turėti fiziologinį poveikį ir sukelti kraujagyslių atsipalaidavimą per NO endokrininį cGMP padidėjimą kraujagyslių endotelyje. Savo ruožtu peroksinitritas yra stiprus oksidatorius, galintis pažeisti alveolių epitelį ir plaučių paviršiaus aktyviąją medžiagą. Jis sunaikina membraninius baltymus ir lipidus, pažeidžia endotelį, padidina trombocitų agregaciją ir dalyvauja endotoksemijoje. Padidėjęs jo susidarymas pastebėtas esant ūminiam plaučių pažeidimo sindromui. Mokslininkai mano, kad NO, susidaręs suaktyvinus sukeltą fermentą, yra skirtas nespecifinei organizmo apsaugai nuo daugybės patogeninių veiksnių, slopina trombocitų agregaciją ir gerina vietinę kraujotaką. Nustatyta, kad per didelis NO kiekis slopina cNOS aktyvumą ląstelėse dėl sąveikos su superoksidu ir, galbūt, dėl desensibilizuojančios guanilato ciklazės, dėl to sumažėja cGMP ląstelėje ir padidėja tarpląstelinis kalcis . Brett ir kt. ir Kooy ir kt., analizuodami nitrooksiderginių mechanizmų svarbą ARDS patogenezėje, pasiūlė, kad iNOS, peroksinitritas ir nitrotirozinas, pagrindinis peroksinitrito poveikio baltymui produktas, gali atlikti pagrindinį vaidmenį vystantis sindromui. Cuthbertson ir kt. mano, kad ūminio plaučių pažeidimo pagrindas yra NO ir peroksinitrito poveikis elastazei ir interleukinui-8. Kobayashi ir kt. taip pat užfiksavo padidėjusį iNOS, interleukino-1, interleukino-6, interleukino-8 kiekį bronchų-alveolių skystyje pacientams, sergantiems ūminiu plaučių pažeidimo sindromu. Meldrum ir kt. parodė uždegiminių citokinų gamybos sumažėjimą plaučių makrofaguose ARDS, veikiant vietinio NO -L -arginino gamybos substratui. Nustatyta, kad ūminio plaučių pažeidimo sindromo genezėje svarbų vaidmenį vaidina kraujagyslių pralaidumo sutrikimas, kurį sukelia citokinų-TNF alfa, IL-2, GM-CSF, monokloninių antikūnų prieš CD3 limfocitus-veikimas kraujagyslių endotelio ląstelėse. plaučius ir imunocitus. Greitas ir stiprus plaučių kraujagyslių pralaidumo padidėjimas sukelia neutrofilų migraciją į plaučių audinį ir jų išskiriamus citotoksinius tarpininkus, o tai lemia patologinių plaučių pakitimų vystymąsi. Ūminio plaučių pažeidimo metu TNF alfa padidina neutrofilų sukibimą su kraujagyslių sienele, pagerina jų migraciją į audinius, skatina struktūrinius ir metabolinius endoteliocitų pokyčius, sutrikdo ląstelių membranų pralaidumą, suaktyvina kitų citokinų ir eikozanoidų susidarymą, ir sukelia plaučių epitelio ląstelių apoptozę ir nekrozę. Gauti duomenys rodo, kad makrofagų apoptozė, kurią sukelia LPS įvedimas, iš esmės yra susijusi su IFN gama ir sumažėja veikiant IL-4, IL-10, TGF beta. Tačiau Kobayashi ir kt. gauti duomenys, rodantys, kad IFN gama gali dalyvauti kvėpavimo takų gleivinės epitelio atstatyme. Hagimoto tyrimuose yra informacijos, kad bronchų ir alveolių epitelio ląstelės, reaguodamos į TNF alfa arba Fas ligandą, atpalaiduoja IL-8, IL-12. Šis procesas yra susijęs su branduolinio faktoriaus Carr-B aktyvavimu Fas ligandu.

Manoma, kad IL-8 yra vienas iš svarbiausių citokinų ūminio plaučių pažeidimo patofiziologijoje. Miller ir kt. tiriant broncho-alveolinį skystį pacientams, sergantiems ARDS sesės fone, nustatytas reikšmingas IL-8 lygio padidėjimas, palyginti su pacientais, sergančiais kardiogenine plaučių edema. Buvo pasiūlyta, kad pagrindinis Il-8 šaltinis yra plaučiai, ir šis kriterijus gali būti naudojamas diferencinei sindromo diagnostikai. Grau ir kt. mano, kad plaučių kapiliarų endotelio ląstelės yra svarbus citokinų-IL-6, IL-8-šaltinis vystantis ūminiam plaučių pažeidimui. Goodman ir kt. Tiriant citokinų lygio dinamiką bronchų alveolinio plovimo skystyje pacientams, sergantiems ARDS, žymiai padidėjo IL-1beta, IL-8, monocitinis chemotaktinis peptidas-1, epitelio ląstelių neutrofilinis aktyvatorius, makrofagų uždegiminis peptidas -1 alfa buvo rasta. Tuo pačiu metu autoriai mano, kad padidėjęs IL-1 beta kiekis gali būti nepalankaus sindromo rezultato ženklas. Bauer ir kt. buvo įrodyta, kad pacientams, sergantiems ARDS, galima kontroliuoti IL-8 turinį bronchoalveoliniame skystyje, o IL-8 lygio sumažėjimas rodo nepalankią proceso eigą. Daugelyje tyrimų taip pat yra informacijos, kad plaučių kraujagyslių endotelio citokinų gamybos lygis turi įtakos ūminio plaučių pažeidimo vystymuisi, o jų kontrolė gali būti naudojama klinikinėje praktikoje ankstyvai diagnozei nustatyti. Galimas neigiamas priešuždegiminių citokinų lygio padidėjimo pasekmes pacientams, sergantiems ARDS, įrodo Martin ir kt., Warner ir kt. Tyrimai. Alveoliniai makrofagai, aktyvuojami citokinų ir bakterinių endotoksinų, padidina NO sintezę. Taip pat padidėja bronchų ir alveolių epitelio ląstelių, neutrofilų, putliųjų ląstelių, endotelio ląstelių ir lygių plaučių kraujagyslių miocitų NO gamybos lygis, tikriausiai suaktyvinus branduolinį faktorių Carr-B. Autoriai mano, kad azoto oksidas, susidaręs suaktyvinus sukeltą NOS, pirmiausia yra skirtas nespecifinei organizmo gynybai. Išsiskyręs iš makrofagų, NO greitai prasiskverbia į bakterijas ir grybelius, kur slopina tris gyvybiškai svarbias fermentų grupes: H-elektronų pernešimą, Krebso ciklą ir DNR sintezę. NO dalyvauja organizmo gynyboje paskutiniuose imuninio atsako etapuose ir vaizdžiai laikomas imuninės sistemos „baudžiamuoju kardu“. Tačiau kaupiantis ląstelėje neadekvačiai dideliais kiekiais, NO taip pat turi žalingą poveikį. Taigi, išsivysčius ūminio plaučių pažeidimo sindromui, citokinai ir NO sukelia nuoseklią reakcijų grandinę, pasireiškiančią sutrikusia mikrocirkuliacija, audinių hipoksija, alveolių ir intersticine edema ir pažeidus plaučių metabolinę funkciją. Todėl galima teigti, kad citokinų ir NO veikimo fiziologinių ir patofiziologinių mechanizmų tyrimas yra perspektyvi mokslinių tyrimų sritis ir ateityje leis ne tik išplėsti ARDS patogenezės supratimą, bet ir nustatyti diagnostinius ir prognostinius sindromo žymenis, sukurti patogenetiškai pagrįstos terapijos, kuria siekiama sumažinti mirtingumą, galimybes.

Citokinų nustatymo metodai.

Apžvalga skirta pagrindiniams šiuo metu naudojamų citokinų tyrimo metodams. Trumpai aprašomos metodų galimybės ir tikslas. Pateikiami įvairių metodų, skirtų citokinų genų ekspresijos analizei nukleorūgščių ir baltymų gamybos lygmenyje, privalumai ir trūkumai. (Citokinai ir uždegimas. 2005. T. 4, Nr. 1. S. 22-27.)

Citokinai yra reguliuojantys baltymai, sudarantys universalų tarpininkų tinklą, būdingą tiek imuninei sistemai, tiek kitų organų ir audinių ląstelėms. Visi ląstelių įvykiai vyksta kontroliuojant šios klasės reguliavimo baltymus: proliferacija, diferenciacija, apoptozė ir specializuotas funkcinis ląstelių aktyvumas. Kiekvieno citokino poveikiui ląstelėms būdinga pleiotropija, skirtingų mediatorių poveikio spektras sutampa ir apskritai galutinė ląstelės funkcinė būsena priklauso nuo kelių sinergiškai veikiančių citokinų įtakos. Taigi, citokinų sistema yra universalus, polimorfinis mediatorių reguliavimo tinklas, skirtas kontroliuoti ląstelių elementų proliferacijos, diferenciacijos, apoptozės ir funkcinio aktyvumo procesus kraujodaros, imuninėje ir kitose organizmo homeostatinėse sistemose. Citokinų nustatymo metodai per 20 intensyvaus tyrimo metų labai sparčiai vystėsi ir šiandien yra visa mokslinių žinių sritis. Citokineologijos tyrinėtojai savo darbo pradžioje susiduria su metodo pasirinkimo klausimu. Ir čia tyrėjas turi tiksliai žinoti, kokią informaciją jis turi gauti, kad pasiektų užsibrėžtą tikslą. Šiuo metu sukurta šimtai skirtingų citokinų sistemos vertinimo metodų, kurie suteikia įvairios informacijos apie šią sistemą. Citokinų įvertinimas įvairiose biologinėse terpėse gali būti pagrįstas specifiniu biologiniu aktyvumu. Juos galima kiekybiškai įvertinti naudojant įvairius imuninio tyrimo metodus, naudojant poli- ir monokloninius antikūnus. Be sekrecinių citokinų formų tyrimo, galima tirti jų tarpląstelinį turinį ir gamybą audiniuose, naudojant srauto citometriją, Western blot analizę ir in situ imunohistochemiją. Labai svarbios informacijos galima gauti tiriant citokinų mRNR raišką, mRNR stabilumą, citokinų mRNR izoformų buvimą, natūralias antisense nukleotidų sekas. Alelinių citokinų genų variantų tyrimas gali suteikti svarbios informacijos apie genetiškai užprogramuotą didelę ar mažą vieno ar kito tarpininko gamybą. Kiekvienas metodas turi savo trūkumų ir privalumų, savo skiriamąją gebą ir nustatymo tikslumą. Tyrėjo nežinojimas ir šių niuansų nesupratimas gali sukelti klaidingų išvadų.

Citokinų biologinio aktyvumo nustatymas.

Atradimo istorija ir pirmieji citokinų tyrimo žingsniai buvo glaudžiai susiję su imunokompetentingų ląstelių ir ląstelių linijų auginimu. Tada buvo parodytas daugelio baltymų pobūdžio tirpių faktorių reguliacinis poveikis (biologinis aktyvumas) limfocitų proliferaciniam aktyvumui, imunoglobulinų sintezei ir imuninio atsako vystymuisi in vitro modeliuose. Vienas iš pirmųjų tarpininkų biologinio aktyvumo nustatymo metodų yra žmogaus limfocitų migracijos faktoriaus ir jo slopinimo faktoriaus nustatymas. Tiriant biologinį citokinų poveikį, atsirado įvairūs jų biologinio aktyvumo vertinimo metodai. Taigi IL-1 buvo nustatytas įvertinus pelių timocitų proliferaciją in vitro, IL-2-pagal gebėjimą stimuliuoti limfoblastų proliferacinį aktyvumą, IL-3-pagal kraujodaros kolonijų augimą in vitro, IL-4-pagal komitogeninis poveikis, padidėjęs Ia baltymų ekspresija, indukuojant IgG1 ir IgE susidarymą ir kt. Šių metodų sąrašą galima tęsti, jis nuolat atnaujinamas, kai aptinkama naujų biologinių tirpių veiksnių veiklos. Pagrindinis jų trūkumas yra nestandartiniai metodai, neįmanoma jų suvienyti. Toliau plėtojant citokinų biologinio aktyvumo nustatymo metodus, buvo sukurta daugybė ląstelių linijų, jautrių vienam ar kitam citokinui, arba kelių jautrių linijų. Daugumą šių citokinams jautrių ląstelių dabar galima rasti komerciniuose ląstelių linijų sąrašuose. Pavyzdžiui, IL-1a ir b tyrimams naudojama D10S ląstelių linija, IL-2 ir IL-15-CTLL-2 ląstelių linija, skirta IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL -13, GM -CSF - ląstelių linija TF -1, IL -6 - ląstelių linija B9, IL -7 - ląstelių linija 2E8, TNFa ir TNFb - ląstelių linija L929, IFNg - ląstelių linija WiDr, skirta IL-18-ląstelių linija KG-1. Tačiau šis požiūris į imunoaktyvių baltymų tyrimą kartu su žinomais privalumais, tokiais kaip brandaus ir aktyvaus baltymo tikrojo biologinio aktyvumo matavimas, didelis atkuriamumas standartizuotomis sąlygomis, turi trūkumų. Tai visų pirma apima ląstelių linijų jautrumą ne vienam citokinui, o keliems susijusiems citokinams, kurių biologinis poveikis sutampa. Be to, negalima atmesti galimybės, kad tikslinės ląstelės gali sukelti kitų citokinų gamybą, o tai gali iškreipti išbandytą parametrą (paprastai proliferacija, citotoksiškumas, chemotaksė). Mes dar nežinome visų citokinų ir ne visų jų poveikio, todėl vertiname ne patį citokiną, o bendrą specifinį biologinį aktyvumą. Taigi, biologinio aktyvumo, kaip bendros skirtingų mediatorių veiklos (specifiškumo stoka), įvertinimas yra vienas iš šio metodo trūkumų. Be to, naudojant citokinams jautrias linijas, neįmanoma nustatyti inaktyvuotų molekulių ir susijusių baltymų. Tai reiškia, kad tokie metodai neatspindi faktinės daugelio citokinų gamybos. Kitas svarbus ląstelių linijų naudojimo trūkumas yra ląstelių kultūros laboratorijos poreikis. Be to, visos ląstelių auginimo procedūros, inkubuojant jas su tiriamais baltymais ir terpėmis, užima daug laiko. Taip pat reikėtų pažymėti, kad ilgalaikis ląstelių linijų naudojimas reikalauja atnaujinimo arba pakartotinio sertifikavimo, nes dėl auginimo jos gali mutuoti ir modifikuoti, todėl gali pasikeisti jų jautrumas tarpininkams ir sumažėti nustatant biologinį aktyvumą. Tačiau šis metodas idealiai tinka išbandyti specifinį rekombinantinių tarpininkų biologinį aktyvumą.

Citokinų kiekybinis įvertinimas naudojant antikūnus.

Citokinai, kuriuos gamina imunokompetentingos ir kitų tipų ląstelės, išleidžiami į tarpląstelinę erdvę, skirtą parakrininei ir autokrininei signalinei sąveikai. Pagal šių baltymų koncentraciją kraujo serume arba sąlygotoje aplinkoje galima spręsti apie patologinio proceso pobūdį ir tam tikrų paciento ląstelių funkcijų perteklių ar trūkumą. Citokinų nustatymo metodai, naudojant specifinius antikūnus, šiandien yra labiausiai paplitusios šių baltymų aptikimo sistemos. Šie metodai patyrė daugybę modifikacijų, naudojant skirtingas etiketes (radioizotopas, fluorescencinė, elektrocheminė liuminescencinė, fermentas ir kt.). Jei radioizotopų metodai turi daug trūkumų, susijusių su radioaktyviosios etiketės naudojimu ir ribota laiko galimybe naudoti pažymėtus reagentus (pusinės eliminacijos laikas), tada su fermentais susieti imunosorbentiniai metodai buvo plačiai naudojami. Jie pagrįsti netirpių fermentinės reakcijos produktų vizualizavimu, sugeriančiu žinomo bangos ilgio šviesą, kiekiais, lygiaverčiais analitės koncentracijai. Norint surišti matuojamas medžiagas, naudojami ant kieto polimero pagrindo uždėti antikūnai, o vizualizavimui - antikūnai, konjuguoti su fermentais, dažniausiai šarminės fosfatazės ar krienų peroksidazės. Metodo privalumai akivaizdūs: didelis nustatymo tikslumas standartinėmis reagentų ir procedūrų laikymo sąlygomis, kiekybinė analizė ir atkuriamumas. Trūkumai apima ribotą nustatytų koncentracijų diapazoną, todėl visos koncentracijos, viršijančios tam tikrą ribą, laikomos jam lygiomis. Reikėtų pažymėti, kad metodui atlikti reikalingas laikas skiriasi priklausomai nuo gamintojo rekomendacijų. Tačiau bet kuriuo atveju mes kalbame apie kelias valandas, kurių reikia inkubacijai ir plovimui reagentu. Be to, nustatomos latentinės ir surištos citokinų formos, kurių koncentracija gali žymiai viršyti laisvas formas, daugiausia atsakingas už tarpininko biologinį aktyvumą. Todėl pageidautina šį metodą naudoti kartu su tarpininko biologinio aktyvumo vertinimo metodais. Kitas plačiai pritaikytas imunologinio tyrimo metodo pakeitimas yra elektrocheminio liuminescencijos metodas (ECL), skirtas baltymams nustatyti su antikūnais, pažymėtais ruteniu ir biotinu. Šis metodas, palyginti su radioizotopų ir fermentų imunologiniu tyrimu, turi šiuos privalumus: lengvas įgyvendinimas, trumpas metodo užbaigimo laikas, skalbimo procedūrų nebuvimas, mažas mėginio tūris, didelis nustatytų citokinų koncentracijų diapazonas serume ir kondicionuotoje aplinkoje, didelis jautrumas metodas ir jo atkuriamumas. Nagrinėjamas metodas yra priimtinas naudoti tiek moksliniuose tyrimuose, tiek klinikiniuose tyrimuose. Kitas metodas citokinų vertinimui biologinėje terpėje yra sukurtas remiantis srauto fluorimetrijos technologija. Tai leidžia vienu metu įvertinti iki šimtų baltymų mėginyje. Šiuo metu yra sukurti komerciniai rinkiniai, skirti nustatyti iki 17 citokinų. Tačiau šio metodo privalumai lemia ir jo trūkumus. Pirma, tai yra daug pastangų reikalaujanti parinkti optimalias sąlygas keliems baltymams nustatyti, antra, citokinų gamyba yra kaskadinio pobūdžio, o gamybos smailės yra skirtingos. Todėl didelio kiekio baltymų nustatymas vienu metu ne visada yra informatyvus. Bendras imuninio tyrimo metodų reikalavimas naudojant vadinamuosius. „sumuštinis“ - tai kruopštus antikūnų poros pasirinkimas, leidžiantis nustatyti laisvą arba surištą analizuojamo baltymo formą, kuri apriboja šį metodą ir į kurią visada reikia atsižvelgti aiškinant gautus duomenis. Šie metodai nustato bendrą citokinų gamybą skirtingose ląstelėse, tuo pačiu galima tik hipotetiškai spręsti apie antigenui būdingą citokinų gamybą imunokompetentingose ląstelėse. Šiuo metu sukurta sistema ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), kuri iš esmės pašalina šiuos trūkumus. Šis metodas leidžia pusiau kiekybiškai įvertinti citokinų gamybą atskirų ląstelių lygiu. Didelė šio metodo skiriamoji geba leidžia įvertinti antigeno stimuliuojamą citokinų gamybą, o tai labai svarbu vertinant specifinį imuninį atsaką. Kitas, plačiai naudojamas mokslo tikslams, metodas yra citokinų nustatymas ląstelėje srauto citometrijos metodu. Jo privalumai akivaizdūs. Mes galime fenotipiškai apibūdinti citokinus gaminančių ląstelių populiaciją ir (arba) nustatyti atskirų ląstelių gaminamų citokinų spektrą, turėdami galimybę santykinai kiekybiškai apibūdinti šią produkciją. Tuo pačiu metu aprašytas metodas yra gana sudėtingas ir reikalauja brangios įrangos. Kita metodų serija, daugiausia naudojama moksliniais tikslais, yra imunohistocheminiai metodai, naudojant žymėtus monokloninius antikūnus. Privalumai akivaizdūs - citokinų gamybos nustatymas tiesiogiai audiniuose (in situ), kur vyksta įvairios imunologinės reakcijos. Tačiau svarstomi metodai yra labai sunkūs ir neteikia tikslių kiekybinių duomenų.

Citokinų nustatymas naudojant imuninį fermentų tyrimą.

„Vector-Best CJSC“, vadovaujamas T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksinas, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavišnikovas aktyviai dirba nustatydamas citokinus. Citokinai yra polipeptidų tarpininkų grupė, dažnai glikozilinta, kurių molekulinė masė yra nuo 8 iki 80 kDa. Citokinai dalyvauja formuojant ir reguliuojant organizmo gynybines reakcijas ir homeostazę. Jie dalyvauja visose humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako dalyse, įskaitant imunokompetentingų kamieninių ląstelių diferenciaciją, antigeno pateikimą, ląstelių aktyvaciją ir proliferaciją, sukibimo molekulių ekspresiją ir ūminės fazės atsaką. Kai kurie iš jų gali parodyti daugybę biologinių poveikių įvairioms tikslinėms ląstelėms. Citokinų poveikis ląstelėms atliekamas šiais būdais: autokrininė - ląstelė, sintezuojanti ir išskirianti šį citokiną; parakrinas - ląstelės, esančios šalia gamintojo ląstelės, pavyzdžiui, uždegimo židinyje arba limfoidiniame organe; endokrininė - nuotoliniu būdu - ant bet kokių organų ir audinių ląstelių, citokinui patekus į kraują. Citokinų susidarymas ir išsiskyrimas paprastai yra trumpalaikis ir griežtai reguliuojamas. Citokinai veikia ląstelę, jungdamiesi prie specifinių citoplazminės membranos receptorių, taip sukeldami reakcijų, sukeliančių daugelio jų reguliuojamų genų aktyvumą, sukėlimą, sustiprėjimą ar slopinimą. Citokinams būdingas sudėtingas tinklo veikimo pobūdis, kai vieno iš jų gamyba turi įtakos daugelio kitų veiklos formavimui ar pasireiškimui. Citokinai yra vietiniai tarpininkai, todėl patartina išmatuoti jų kiekį atitinkamuose audiniuose, ištraukus audinių baltymus iš atitinkamų organų biopsijų arba natūraliuose skysčiuose: šlapime, ašarų skystyje, dantenų kišenėje, bronchoalveoliniame plovime, makšties išskyros, ejakuliacijoje. , plaunami iš ertmių, nugaros smegenų ar sinovijų skysčių ir kt. Papildomos informacijos apie organizmo imuninės sistemos būklę galima gauti tiriant kraujo ląstelių gebėjimą gaminti citokinus in vitro. Plazmos citokinų kiekis atspindi dabartinę imuninės sistemos būklę ir gynybinių reakcijų vystymąsi in vivo. Spontaniška citokinų gamyba periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių kultūroje leidžia įvertinti atitinkamų ląstelių būklę. Padidėjusi spontaniška citokinų gamyba rodo, kad ląstelės jau yra aktyvuotos antigeno in vivo. Indukuota citokinų gamyba leidžia įvertinti galimą atitinkamų ląstelių gebėjimą reaguoti į antigeninę stimuliaciją. Pavyzdžiui, sumažėjusi citokinų indukcija in vitro gali būti vienas iš imunodeficito būsenos požymių. Todėl abi galimybės tirti citokinų kiekį tiek cirkuliuojančiame kraujyje, tiek jų gaminant ląstelių kultūras yra svarbios, apibūdinant viso organizmo imunoreaktyvumą ir atskirų imuninės sistemos grandžių funkciją. Dar visai neseniai Rusijoje citokinų tyrimu užsiėmė kelios mokslininkų grupės, nes biologiniai tyrimo metodai užima daug laiko, o importuoti imunocheminiai rinkiniai yra labai brangūs. Atsiradus vietiniams su fermentais susijusiems imunosorbentų rinkiniams, praktikuojantys gydytojai rodo vis didesnį susidomėjimą tyrinėti citokinų profilį. Šiuo metu citokinų lygio vertinimo diagnostinė reikšmė yra konstatuoti faktą, kad padidėja arba sumažėja jų koncentracija tam tikram pacientui, sergančiam konkrečia liga. Be to, norint įvertinti ligos sunkumą ir numatyti ligos eigą, patologijos vystymosi dinamikoje patartina nustatyti tiek priešuždegiminių, tiek priešuždegiminių citokinų koncentraciją. Pavyzdžiui, citokinų kiekis periferiniame kraujyje nustatomas pagal paūmėjimo laiką, atspindi patologinio proceso dinamiką sergant pepsine opa ir kitomis virškinimo trakto ligomis. Ankstyvosiose paūmėjimo stadijose vyrauja interleukino-1beta (IL-1beta), interleukino-8 (IL-8) kiekio padidėjimas, tada interleukino-6 (IL-6), gama-interferono (gama) koncentracija -INF), padidėja naviko nekrozės faktorius -alfa (alfa -TNF). Interleukino-12 (IL-12), gama-INF, alfa-TNF koncentracija pasiekė didžiausią ligos įkarštyje, o ūminės fazės žymenų kiekis per šį laikotarpį artėjo prie normalių verčių. Paūmėjimo piko metu alfa-TNF lygis žymiai viršijo interleukino-4 (IL-4) kiekį tiek kraujo serume, tiek tiesiogiai paveiktame peri-opos zonos audinyje, po kurio jis pradėjo palaipsniui mažėti. mažinti. Mažėjant ūminės fazės reiškiniams ir intensyvėjant remonto procesams, IL-4 koncentracija padidėjo. Pakeitus citokinų profilį, galima įvertinti chemoterapijos veiksmingumą ir įgyvendinamumą. Gydant citokinus, pavyzdžiui, gydant alfa-interferonu (alfa-IFN), būtina kontroliuoti tiek jo kiekį cirkuliuojančiame kraujyje, tiek antikūnų prieš alfa-IFN gamybą. Yra žinoma, kad kai gaminama daug šių antikūnų, interferono terapija ne tik nustoja būti veiksminga, bet ir gali sukelti autoimunines ligas. Pastaruoju metu buvo sukurti ir į praktiką įtraukti nauji vaistai, kurie vienaip ar kitaip keičia organizmo citokinų būklę. Pavyzdžiui, reumatoidiniam artritui gydyti siūlomas vaistas, pagrįstas alfa-TNF antikūnais, skirtas pašalinti alfa-TNF, kuris yra susijęs su jungiamojo audinio sunaikinimu. Tačiau, remiantis mūsų duomenimis ir literatūra, ne visiems pacientams, sergantiems lėtiniu reumatoidiniu artritu, yra padidėjęs TNF-alfa kiekis, todėl šiai pacientų grupei sumažėjęs TNF-alfa kiekis gali dar labiau sustiprinti disbalansą. imuninę sistemą. Taigi teisinga citokinų terapija prisiima organizmo citokinų būklės kontrolę gydymo metu. Apsauginis priešuždegiminių citokinų vaidmuo pasireiškia lokaliai, uždegimo židinyje, tačiau jų sisteminė gamyba nesukelia priešinfekcinio imuniteto ir netrukdo vystytis bakteriniam toksiniam šokui, kuris yra ankstyvas chirurginių pacientų, sergančių pūlingomis-septinėmis komplikacijomis, mirtingumas. Chirurginių infekcijų patogenezės pagrindas yra citokinų kaskados inicijavimas, kuris, viena vertus, apima priešuždegiminius ir, priešingai, priešuždegiminius citokinus. Šių dviejų priešingų grupių pusiausvyra iš esmės lemia eigos pobūdį ir pūlingų-septinių ligų baigtį. Tačiau vieno citokino koncentracijos kraujyje nustatymas iš šių grupių (pavyzdžiui, alfa-TNF ar IL-4) tinkamai neatspindės visos citokinų pusiausvyros būklės. Todėl būtina įvertinti vieno tarpininko kelių etapų (bent 2-3 priešingų pogrupių) lygį. Šiuo metu CJSC "Vector-Best" sukūrė ir serijiniu būdu gaminamus reagentų rinkinius, skirtus kiekybiniam nustatymui: naviko nekrozės faktoriaus alfa (jautrumas-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gama interferonas (jautrumas - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukinas -4 (jautrumas - 2 pg / ml, 0–400 pg / ml); interleukinas-8 (jautrumas-2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interleukino-1 receptorių antagonistas (IL-1RA) (jautrumas-20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa interferonas (jautrumas - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); autoimuniniai antikūnai prieš alfa-interferoną (jautrumas-2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Visi rinkiniai yra skirti nustatyti šių citokinų koncentraciją žmogaus biologiniuose skysčiuose, kultūros supernatantuose, tiriant žmogaus ląstelių kultūrų gebėjimą gaminti citokinus in vitro. Analizės principas yra kieto fazės trijų pakopų (inkubacinis laikas-4 val.) Arba dviejų pakopų (inkubacinis laikas-3,5 val.) Su fermentais susijusio imunosorbentinio tyrimo „sumuštinis“ variantas plokštelėse. Tyrimui reikia 100 µl biologinio skysčio arba kultūros supernatanto kiekvienoje duobutėje. Rezultatų apskaita - spektrofotometriškai esant 450 nm bangos ilgiui. Visuose rinkiniuose chromogenas yra tetrametilbenzidinas. Mūsų rinkinių galiojimo laikas buvo pratęstas iki 18 mėnesių nuo išleidimo datos ir 1 mėnesio nuo naudojimo pradžios. Literatūros duomenų analizė parodė, kad citokinų kiekis sveikų žmonių kraujo plazmoje priklauso ir nuo rinkinių, naudojamų jiems nustatyti, ir nuo regiono, kuriame šie žmonės gyvena. Todėl, norėdami sužinoti normalių citokinų koncentracijų vertes mūsų regiono gyventojams, išanalizavome atsitiktinius plazmos mėginius (nuo 80 iki 400 mėginių) iš praktiškai sveikų kraujo donorų, įvairių socialinių grupių atstovų nuo 18 iki 60 metų be klinikinių tyrimų. sunkios somatinės patologijos apraiškos ir HBsAg antikūnų prieš ŽIV, hepatito B ir C virusus nebuvimas.

Naviko nekrozės faktorius-alfa.

TNF-alfa yra pleiotropinis priešuždegiminis citokinas, susidedantis iš dviejų pailgų b-grandinių, kurių molekulinė masė yra 17 kDa ir kurios atlieka imuninio atsako ir uždegimo reguliavimo ir efektoriaus funkcijas. Pagrindiniai alfa-TNF gamintojai yra monocitai ir makrofagai. Šį citokiną taip pat išskiria kraujo limfocitai ir granulocitai, natūralios žudikų ląstelės ir T-limfocitų ląstelių linijos. Pagrindiniai alfa-TNF induktoriai yra virusai, mikroorganizmai ir jų metabolizmo produktai, įskaitant bakterinį lipopolisacharidą. Be to, kai kurie citokinai, tokie kaip IL-1, IL-2, granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius, alfa ir beta-INF, taip pat gali atlikti induktorių vaidmenį. Pagrindinės alfa-TNF biologinio aktyvumo kryptys: pasižymi selektyviu citotoksiškumu kai kurioms naviko ląstelėms; aktyvina granulocitus, makrofagus, endotelio ląsteles, hepatocitus (ūminės fazės baltymų gamybą), osteoklastus ir chondrocitus (kaulų ir kremzlių audinių rezorbciją), kitų priešuždegiminių citokinų sintezę; skatina proliferaciją ir diferenciaciją: neutrofilai, fibroblastai, endotelio ląstelės (angiogenezė), kraujodaros ląstelės, T- ir B-limfocitai; padidina neutrofilų srautą iš kaulų čiulpų į kraują; turi priešnavikinį ir antivirusinį aktyvumą in vivo ir in vitro; dalyvauja ne tik gynybinėse reakcijose, bet ir uždegimą lydinčiuose sunaikinimo ir taisymo procesuose; tarnauja kaip vienas iš audinių naikinimo tarpininkų, kuris būdingas užsitęsusiam, lėtiniam uždegimui.

Ryžiai. 1. Alfa-TNF lygio pasiskirstymas

sveikų donorų plazmoje.

Padidėjęs alfa-TNF kiekis kraujo serume pastebimas potrauminės būklės metu, pasireiškiant plaučių funkcijos sutrikimams, normalios nėštumo eigos pažeidimams, vėžiui, bronchinei astmai. Paūmėjus lėtinei virusinei hepatito C formai, alfa-TNF lygis yra 5-10 kartų didesnis už normą. Virškinimo trakto ligų paūmėjimo laikotarpiu alfa-TNF koncentracija serume viršija normą vidutiniškai 10 kartų, o kai kuriems pacientams - 75–80 kartų. Didelės alfa -TNF koncentracijos nustatomos smegenų skystyje pacientams, sergantiems išsėtine skleroze ir cerebrospinaliniu meningitu, o reumatoidiniu artritu - sinoviniame skystyje. Tai rodo, kad TNF alfa dalyvauja daugelio autoimuninių ligų patogenezėje. Alfa -TNF aptikimo dažnis kraujo serume, net ir esant stipriam uždegimui, neviršija 50%, o sukelta ir savaiminė gamyba - iki 100%. Alfa-TNF koncentracijos intervalas buvo 0-6 pg / ml, vidutinis-1,5 pg / ml (1 pav.).

Gama interferonas.

Ryžiai. 2. IFN-gama lygių pasiskirstymas

sveikų donorų plazmoje.

Interleukinas-4

IL-4 yra glikoproteinas, kurio molekulinė masė yra 18–20 kDa, natūralus uždegimo inhibitorius. Kartu su IFN-gama IL-4 yra pagrindinis citokinas, kurį gamina T ląstelės (daugiausia TH-2 limfocitai). Palaiko TH-1 / TH-2 balansą. Pagrindinės IL-4 biologinio aktyvumo kryptys: sustiprina eozinofiliją, putliųjų ląstelių kaupimąsi, IgG4 sekreciją, TH-2 tarpininkaujantį humoralinį imuninį atsaką; turi vietinį priešnavikinį aktyvumą, stimuliuoja citotoksinių T-limfocitų populiaciją ir naviko infiltraciją su eozinofilais; slopina uždegiminių citokinų (alfa-TNF, IL-1, IL-8) ir prostaglandinų išsiskyrimą iš aktyvuotų monocitų, TH-1-limfocitų (IL-2, gama-INF ir kt.) citokinų gamybą.

Ryžiai. 3. IL-4 lygio pasiskirstymas plazmoje

sveikų donorų.

Padidėjęs IL-4 kiekis tiek serume, tiek stimuliuojamuose limfocituose gali būti pastebėtas sergant alerginėmis ligomis (ypač paūmėjimo metu), tokiomis kaip bronchinė astma, alerginis rinitas, šienligė, atopinis dermatitas, sergant virškinimo trakto ligomis. Pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu C (CHC), IL-4 lygis taip pat žymiai padidėja. CHC paūmėjimo laikotarpiais jo kiekis padidėja beveik 3 kartus, palyginti su norma, o CHC remisijos metu IL-4 lygis mažėja, ypač atsižvelgiant į gydymą rekombinantiniu IL-2. IL-4 koncentracijos intervalas buvo 0–162 pg / ml, vidurkis-6,9 pg / ml, normalus-0–20 pg / ml (3 pav.).

Interleukinas-8

IL-8 priklauso chemokinams, tai yra baltymas, kurio molekulinė masė yra 8 kDa. IL-8 gamina mononukleariniai fagocitai, polimorfonukleariniai leukocitai, endotelio ląstelės ir kitų tipų ląstelės, reaguodamos į įvairius dirgiklius, įskaitant bakterijas ir virusus bei jų metabolinius produktus, įskaitant priešuždegiminius citokinus (pvz., IL-1, TNF alfa). ). Pagrindinis interleukino-8 vaidmuo yra padidinti leukocitų chemotaksę. Jis vaidina svarbų vaidmenį esant ūminiam ir lėtiniam uždegimui. Padidėjęs IL-8 kiekis stebimas pacientams, sergantiems bakterinėmis infekcijomis, lėtinėmis plaučių ligomis ir virškinimo trakto ligomis. Sepsiu sergantiems pacientams padidėja IL-8 koncentracija plazmoje, o didelė koncentracija yra susijusi su padidėjusiu mirtingumu. IL-8 kiekio matavimo rezultatai gali būti naudojami stebint gydymo eigą ir prognozuojant ligos baigtį. Taigi padidėjęs IL-8 kiekis ašarų skystyje buvo nustatytas visiems pacientams, kuriems buvo palanki ragenos opų eiga. Visiems pacientams, sergantiems sudėtinga ragenos opos eiga, IL-8 koncentracija buvo 8 kartus didesnė nei pacientų, kuriems buvo palanki ligos eiga. Taigi priešuždegiminių citokinų (ypač IL-8) kiekis ragenos opų ašarų skystyje gali būti naudojamas kaip šios ligos eigos prognostinis kriterijus.

Ryžiai. 4. IL-8 lygio pasiskirstymas

sveikų donorų plazma (Novosibirskas).

Remiantis mūsų ir paskelbtais duomenimis, sveikiems žmonėms IL-8 kraujo serume aptinkamas itin retai; spontaniška IL-8 gamyba kraujo mononuklearinėse ląstelėse stebima 62%, o sukelta gamyba-100% sveikų donorų. IL-8 koncentracijos intervalas buvo 0–34 pg / ml, vidurkis-2 pg / ml, normalus-0–10 pg / ml (4 pav.).

Ryžiai. 5. IL-8 lygio pasiskirstymas plazmoje

sveiki donorai (Rubtsovskas).

Interleukino-1 receptorių antagonistas.

IL-1RA yra citokinas ir yra oligopeptidas, kurio molekulinė masė yra 18–22 kDa. IL-1RA yra endogeninis IL-1 inhibitorius, kurį gamina makrofagai, monocitai, neutrofilai, fibroblastai ir epitelio ląstelės. IL-1RA slopina interleukinų IL-1alfa ir IL-1beta biologinį aktyvumą, konkuruoja su jais dėl prisijungimo prie ląstelių receptorių.

Ryžiai. 6. IL-1RA lygio pasiskirstymas

sveikų donorų plazmoje

IL-1RA gamybą skatina daugelis citokinų, virusinių produktų ir ūminės fazės baltymų. IL-1RA gali būti aktyviai išreikštas uždegiminiuose židiniuose sergant įvairiomis lėtinėmis ligomis: reumatoidiniu ir nepilnamečių lėtiniu artritu, sistemine raudonąja vilklige, išeminiais smegenų pažeidimais, uždegiminėmis žarnyno ligomis, bronchine astma, pielonefritu, psoriaze ir kt. Sepsio atveju pastebimas didžiausias IL-1RA padidėjimas-kai kuriais atvejais iki 55 ng / ml, ir nustatyta, kad padidėjusi IL-1RA koncentracija koreliuoja su palankiomis prognozėmis. Didelės IL-1RA koncentracijos stebimos labai nutukusioms moterims, ir šis lygis pastebimai sumažėja per 6 mėnesius po riebalų nusiurbimo. IL-1RA koncentracijos intervalas buvo 0–3070 pg / ml, vidurkis-316 pg / ml. Įprastas diapazonas yra 50–1000 pg / ml (6 pav.).

Alfa interferonas.

Alfa-IFN yra monomerinis ne glikozilintas baltymas, kurio molekulinė masė yra 18 kDa, kurį daugiausia sintezuoja leukocitai (B-limfocitai, monocitai). Šį citokiną taip pat gali gaminti beveik bet koks ląstelių tipas, reaguodamas į tinkamą sužadinimą, o ląstelinės virusinės infekcijos gali būti stiprūs IFN-alfa sintezės stimuliatoriai. Alfa-INF induktoriai yra: virusai ir jų produktai, tarp kurių pirmaujanti vieta yra dvigubos RNR, susidariusios viruso replikacijos metu, taip pat bakterijos, mikoplazmos ir pirmuonys, citokinai ir augimo faktoriai (pvz., IL-1, IL). -2, alfa -FNO, kolonijas stimuliuojantys veiksniai ir kt.). Pradinė organizmo nespecifinio antibakterinio imuninio atsako gynybinė reakcija apima alfa ir beta IFN indukciją. Šiuo atveju jį gamina antigenus pristatančios ląstelės (makrofagai), įsiveržusios į bakterijas. Interferonai (įskaitant alfa-IFN) vaidina svarbų vaidmenį nespecifiniame antivirusinio imuninio atsako ryšyje. Jie sustiprina antivirusinį atsparumą, skatindami ląstelėse fermentų, slopinančių nukleorūgščių ir virusų baltymų susidarymą, sintezę. Be to, jie turi imunomoduliacinį poveikį, padidina pagrindinio histokompatibilumo komplekso antigenų ekspresiją ląstelėse. Nustatytas hepatito ir virusinės etiologijos kepenų cirozės alfa-IFN turinio pokytis. Virusinių infekcijų paūmėjimo metu daugumoje pacientų šio citokino koncentracija žymiai padidėja, o sveikimo laikotarpiu jis nukrenta iki normalaus lygio. Nustatytas ryšys tarp alfa-INF lygio serume ir gripo infekcijos sunkumo bei trukmės.

Ryžiai. 7. Alfa-IFN lygio pasiskirstymas

sveikų donorų plazmoje.

Daugumos pacientų, sergančių autoimuninėmis ligomis, tokiomis kaip poliartritas, reumatoidinis artritas, spondilozė, psoriazinis artritas, polimialgija, reumatinė ir sklerodermija, sisteminė raudonoji vilkligė ir sisteminis vaskulitas, serume pastebima padidėjusi alfa-IFN koncentracija. Didelis šio interferono kiekis taip pat pastebimas kai kuriems pacientams, paūmėjus pepsinei opai ir tulžies akmenligei. Alfa-INF koncentracijos intervalas buvo 0–93 pg / ml, vidurkis-20 pg / ml. Įprastas diapazonas yra iki 45 pg / ml (7 pav.).

Antikūnai prieš alfa-IFN.

Antikūnų prieš alfa-IFN galima aptikti sergančiųjų somatine raudonąja vilklige serumuose. Spontaniškas antikūnų prieš alfa-IFN indukcija stebimas ir sergančiųjų įvairiomis vėžio formomis serume. Kai kuriais atvejais antikūnų prieš alfa-IFN buvo rasta ŽIV infekuotų pacientų serumuose, taip pat smegenų skystyje ir sergančiųjų meningitu serume ūminės fazės metu, sergančiųjų lėtiniu poliartritu serumuose.

Ryžiai. 8. Antikūnų prieš alfa-IFN lygio pasiskirstymas

sveikų donorų plazmoje.

Alfa-IFN yra vienas iš veiksmingų antivirusinių ir priešnavikinių terapinių vaistų, tačiau ilgalaikis jo vartojimas gali sukelti specifinių alfa-IFN antikūnų gamybą. Tai sumažina gydymo efektyvumą ir kai kuriais atvejais sukelia įvairius šalutinius poveikius: nuo gripo tipo iki autoimuninių ligų vystymosi. Atsižvelgiant į tai, INF terapijos metu svarbu kontroliuoti antikūnų prieš alfa-INF kiekį paciento organizme. Jų susidarymas priklauso nuo terapijoje naudojamo vaisto tipo, gydymo trukmės ir ligos tipo. Antikūnų prieš alfa-IFN koncentracijos diapazonas buvo 0–126 ng / ml, vidurkis-6,2 ng / ml. Įprastas diapazonas yra iki 15 ng / ml (8 pav.). Citokinų lygio įvertinimas naudojant reagentų rinkinius, kuriuos galima įsigyti CJSC „Vector-Best“, leidžia naujai įvertinti kūno imuninės sistemos būklę klinikinėje praktikoje.

Imunotropiniai vaistai, pagrįsti citokinais.

Įdomus darbas S. Simbirtseva, Valstybinis labai grynų biologinių produktų tyrimų institutas, Rusijos sveikatos apsaugos ministerija, Sankt Peterburgas). Citokinus galima išskirti į naują nepriklausomą pagrindinių kūno funkcijų reguliavimo sistemą, egzistuojančią kartu su nervų ir endokrinine sistema reguliavimas ir pirmiausia yra susijęs su homeostazės palaikymu įvedant patogenus ir pažeidžiant audinių vientisumą. Šią naują reguliavimo molekulių klasę sukūrė gamta per milijonus evoliucijos metų ir turi neribotą potencialą naudoti kaip vaistus. Imuninėje sistemoje citokinai tarpininkauja ryšiui tarp nespecifinių gynybinių reakcijų ir specifinio imuniteto, veikiantys abiem kryptimis. Kūno lygmenyje citokinai bendrauja tarp imuninės, nervų, endokrininės, kraujodaros ir kitų sistemų ir padeda juos įtraukti į gynybos reakcijų organizavimą ir reguliavimą. Intensyvaus citokinų tyrimo varomoji jėga visada buvo perspektyvi jų klinikinio naudojimo perspektyva plačiai paplitusių ligų, įskaitant vėžį, infekcines ir imunodeficito ligas, gydymui. Rusijoje registruoti keli citokinų preparatai, įskaitant interferonus, kolonijas stimuliuojančius veiksnius, interleukinus ir jų antagonistus bei naviko nekrozės faktorių. Visus citokinų preparatus galima suskirstyti į natūralius ir rekombinantinius. Natūralūs preparatai yra įvairaus grynumo preparatai, gauti iš stimuliuojamų eukariotinių ląstelių, daugiausia žmogaus ląstelių, terpės. Pagrindiniai trūkumai yra mažas valymo laipsnis, neįmanoma standartizuoti dėl didelio komponentų skaičiaus ir kraujo komponentų naudojimas gamyboje. Matyt, citokinų terapijos ateitis siejama su genetiškai modifikuotais vaistais, gautais naudojant naujausius biotechnologijų pasiekimus. Per pastaruosius du dešimtmečius daugumos citokinų genai buvo klonuoti ir buvo gauti rekombinantiniai analogai, kurie visiškai pakartoja natūralių molekulių biologines savybes. Klinikinėje praktikoje yra trys pagrindinės citokinų naudojimo sritys:

1) citokinų terapija, skirta aktyvuoti organizmo gynybines reakcijas, imunomoduliaciją arba papildyti endogeninių citokinų trūkumą,

2) anti-citokinų imunosupresinė terapija, skirta blokuoti citokinų ir jų receptorių biologinį poveikį,

3) citokinų genų terapija, skirta sustiprinti priešnavikinį imunitetą arba ištaisyti genetinius citokinų sistemos defektus.

Nemažai citokinų gali būti kliniškai naudojami sisteminiam ir vietiniam naudojimui. Sisteminis administravimas yra pateisinamas tais atvejais, kai būtina užtikrinti citokinų veikimą keliuose organuose, siekiant efektyviau suaktyvinti imunitetą, arba suaktyvinti tikslines ląsteles, esančias skirtingose kūno dalyse. Kitais atvejais vietinis vartojimas turi daug privalumų, nes leidžia pasiekti didelę vietinę veikliosios medžiagos koncentraciją, tikslinį organą ir išvengti nepageidaujamų sisteminių apraiškų. Šiuo metu citokinai yra laikomi vienu perspektyviausių vaistų klinikinėje praktikoje.

Išvada.

Taigi šiuo metu nėra jokių abejonių, kad citokinai yra svarbiausi imunopatogenezės veiksniai. Citokinų lygio tyrimas suteikia informacijos apie įvairių tipų imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą, I ir II tipo T-pagalbininkų aktyvinimo procesų santykį, o tai labai svarbu atliekant daugelio infekcinių ir imunopatologiniai procesai. Citokinai yra specifiniai baltymai, kuriuos imuninės sistemos ląstelės gali naudoti keisdamosi informacija ir sąveikaudamos tarpusavyje. Šiandien buvo atrasta daugiau nei šimtas skirtingų citokinų, kurie paprastai skirstomi į priešuždegiminius (provokuojančius uždegimą) ir priešuždegiminius (užkertančius kelią uždegimo vystymuisi). Taigi įvairios citokinų biologinės funkcijos yra suskirstytos į tris grupes: jos kontroliuoja imuninės sistemos vystymąsi ir homeostazę, kontroliuoja kraujo ląstelių (kraujodaros sistemos) augimą ir diferenciaciją ir dalyvauja nespecifinėse organizmo apsauginėse reakcijose, darančiose įtaką uždegiminiams procesams. procesai, kraujo krešėjimas, kraujospūdis.

Naudotos literatūros sąrašas.

S.V. Belmeris, A.S. Simbirtsevas, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Michailova. / Rusijos valstybinis medicinos universitetas, Valstybinis mokslinis koloproktologijos centras, Maskva ir Valstybinis labai grynų biologinių preparatų tyrimų institutas, Sankt Peterburgas.

S.V. Sennikovas, A. N. Silkovas // Žurnalas "Citokinai ir uždegimas", 2005, Nr. 1 T. 4, Nr. 1. P.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksinas, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavišnikovas, UAB „Vector-Best“ darbo medžiaga.

A. S. Simbirtsevas, Valstybinis labai grynų biologinių produktų tyrimų institutas, Rusijos sveikatos apsaugos ministerija, Sankt Peterburgas.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Valstybinis labai grynų biologinių preparatų tyrimų institutas, Sankt Peterburgas.

T. A. Šumatova, V. B. Šumatovas, E. V. Markelova, L. G. Sausas-šiltas. Vladivostoko valstybinio medicinos universiteto anesteziologijos ir reanimatologijos katedra.

Darbe naudojamos medžiagos iš svetainės http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

kai kurie infekcinių ligų sukėlėjai. Taigi, norsulfazolas ...

Antivirusinis imunitetas molekuliniai ir ląsteliniai mechanizmai, vystymosi modeliai ir imunopato
Santrauka >> Medicina, sveikata
... „svetainė“ reiškia konkrečią svetainę tam tikras polipeptidas (antigenas), su kuriuo ... jo ankstyvosios stadijos. Citokinai ir chemokinai. Kiti citokinai, be interferonų, ... jie gaminami per laiko vienetą citokinai nustato proliferacijos intensyvumą ir ...
Mieloproliferacinių ligų kaulų čiulpų fibrozės priežasčių tyrimas, analizuojant trombocitų faktorių poveikį mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms
Namų darbai >> Medicina, sveikata
Įvairios koncentracijos; - kiekybinis apibrėžimas baltymai eksperimentinėse sistemose ... veda prie ilgo veikimo citokinas, kuris sustiprina fibrozės procesą ... trombocitai. Taip pat padidėjo turinys citokinas rastas šlapime ...
Žmonių tuberkuliozės patogenezė
Santrauka >> Medicina, sveikata
Bet taip pat galima valgyti. Tam tikras vaidina svarbų vaidmenį aerogeninėje infekcijoje ... vaidina, išskiriami makrofagų ir monocitų citokinas- naviko nekrozės faktorius (TNF). ... jonai, kiekviena ląstelė turi tam tikras sistema, kuri užtikrina medžiagų transportavimą ...

Citokinai yra pagrindiniai humoraliniai uždegimo veiksniai, būtini įgimto imuniteto apsauginėms funkcijoms įgyvendinti. Kuriant uždegimą dalyvauja trys citokinų grupės-uždegiminiai arba priešuždegiminiai citokinai, chemokinai, kolonijas stimuliuojantys veiksniai, taip pat funkciškai susiję faktoriai IL-12 ir IFNy. Citokinai taip pat vaidina svarbų vaidmenį slopinant ir kontroliuojant uždegiminį atsaką. Priešuždegiminiai citokinai apima transformuojantį augimo faktorių β (TGFp), IL-10; dažnai priešuždegiminį faktorių atlieka IL-4.
Yra 3 pagrindiniai priešuždegiminių citokinų grupės atstovai-TNFa, IL-1 ir IL-6; palyginti neseniai prie jų buvo pridėta IL-17 ir IL-18. Šiuos citokinus daugiausia gamina aktyvuoti monocitai ir makrofagai, daugiausia uždegimo vietoje. Uždegiminius citokinus taip pat gali gaminti neutrofilai, dendritinės ląstelės, aktyvuoti B-, NK- ir T-limfocitai. Patekę į patogeną, citokinai yra pirmieji, kurie susintetina keletą vietinių uždegiminių makrofagų. Tuomet, leukocitų emigracijos iš kraujotakos metu, padidėja gamintojų ląstelių skaičius ir plečiasi jų spektras. Visų pirma, epitelio, endotelio, sinovijos, glijos ląstelės ir fibroblastai, kuriuos stimuliuoja mikroorganizmų produktai ir uždegimo faktoriai, yra susiję su priešuždegiminių citokinų sinteze. Citokinų genai klasifikuojami kaip indukuojami. Natūralūs jų ekspresijos induktoriai yra patogenai ir jų produktai, veikiantys per TLR ir kitus patogenus atpažįstančius receptorius. Klasikinis induktorius yra bakterinis LPS. Tuo pačiu metu kai kurie priešuždegiminiai citokinai (IL-1, TNFa) patys gali sukelti priešuždegiminių citokinų sintezę.
Uždegiminiai citokinai sintezuojami ir išskiriami gana greitai, nors įvairių šios grupės citokinų sintezės kinetika nevienoda. Įprastais atvejais (greitas pasirinkimas) jų mRNR ekspresija pastebima praėjus 15–30 minučių po indukcijos, baltyminio produkto atsiradimas citoplazmoje-po 30–60 minučių jo kiekis ekstraląstelinėje aplinkoje pasiekia maksimalų lygį per 3–3 minutes. 4 valandos.Citokinų sintezė konkrečioje ląstelėje tęsiasi gana trumpą laiką - paprastai šiek tiek daugiau nei dieną. Ne visa susintetinta medžiaga yra išskiriama. Tam tikras kiekis citokinų yra išreikštas ląstelės paviršiuje arba yra citoplazminėse granulėse. Granulių išsiskyrimas gali sukelti tuos pačius aktyvinančius signalus, kaip ir citokinų gamyba. Tai užtikrina greitą (per 20 minučių) citokinų patekimą į pažeidimo židinį.
Uždegiminiai citokinai atlieka daugybę funkcijų. Pagrindinis jų vaidmuo yra uždegiminio atsako „organizavimas“ (2.55 pav.). Vienas iš svarbiausių ir ankstyviausių priešuždegiminių citokinų poveikių yra padidėjęs adhezijos molekulių ekspresija endotelio ląstelėse, taip pat pačiuose leukocituose, dėl ko leukocitai migruoja iš kraujotakos į uždegimo židinį (žr. 2.3.3 skyrių). ). Be to, citokinai skatina ląstelių deguonies apykaitos padidėjimą, citokinų receptorių ir kitų uždegiminių veiksnių ekspresiją, stimuliuoja citokinų, baktericidinių peptidų ir kt. Uždegiminiai citokinai turi daugiausia vietinį poveikį. Per daug išskiriamų priešuždegiminių citokinų patekimas į kraują prisideda prie sisteminio uždegimo poveikio pasireiškimo, taip pat skatina citokinų gamybą ląstelėse, esančiose toli nuo uždegimo židinio. Sisteminiu lygiu priešuždegiminiai citokinai skatina ūminės fazės baltymų gamybą, padidina kūno temperatūrą ir veikia

Ryžiai. 2.55. Intraląstelinis signalizavimas, kurį sukelia priešuždegiminiai citokinai ir priešuždegiminių genų aktyvacijos mechanizmai

endokrininės ir nervų sistemos, o didelėmis dozėmis sukelia patologinį poveikį (kūnas iki šoko, panašus į septinį).
IL-1 yra bendras baltymų šeimos pavadinimas, apimantis daugiau nei 11 molekulių. Daugumos jų funkcija nežinoma, tačiau 5 molekulės-IL-1a (pagal šiuolaikinę klasifikaciją-IL-1F1), IL-1p (IL-1F2), IL-1RA (IL-1F3), IL-18 (IL -1F4) ir IL-33 (IL-1F11) yra aktyvūs citokinai.
IL-1a ir IL-1P tradiciškai vadinami IL-1, nes jie sąveikauja su tuo pačiu receptoriumi ir jų poveikis nesiskiria. Šių citokinų genai yra ant ilgos žmogaus 2 chromosomos rankos. Tarp jų homologija nukleotidų lygyje yra 45%, aminorūgščių - 26%. Abi molekulės turi p sulankstytą struktūrą: jose yra 6 poros antiparallelinių p sluoksnių ir trefoil formos. Ląstelės sintezuoja pirmtako molekulę, kurios molekulinė masė yra apie 30 kDa, be signalinių peptidų, o tai rodo neįprastą IL-1 molekulės apdorojimo būdą. Subrendusių baltymų molekulinė masė yra apie 18 kDa.
IL -1a yra trijų formų - tarpląstelinė (tirpi molekulė yra citozolyje ir atlieka reguliavimo funkcijas), membrana (molekulė patenka į ląstelės paviršių per mechanizmą, panašų į receptorių perdirbimą ir yra įtvirtinta membranoje) ir sekrecija (molekulė išsiskiria pradine forma, tačiau yra apdorojama - skaldoma ekstraląstelinėmis proteazėmis, susidaro aktyvus citokinas, sveriantis 18 kDa). Pagrindinis IL-1a molekulės variantas žmonėms yra membraninis variantas. Šioje formoje citokino poveikis yra ryškesnis, tačiau pasireiškia tik lokaliai.
IL-1P apdorojimas vyksta ląstelės viduje, dalyvaujant specializuotam fermentui IL-1 konvertazei (kaspazei 1), esančiai lizosomose.
Šis fermentas yra aktyvuojamas kaip uždegimo dalis - laikina supramolekulinė struktūra, apimanti ne tik neaktyvią kaspazę 1, bet ir NLR šeimos tarpląstelinius receptorius (žr. 2.2.3 skyrių) - NOD1, NOD2, IPAF ir kt. aktyvinimo signalo. Dėl to susidaro transkripcijos faktorius NF-kB ir indukuojami priešuždegiminiai genai, taip pat suaktyvėja uždegimas ir jame esanti kaspazė 1. Aktyvuotas fermentas skaido IL-1P pirmtaką ir susidaręs subrendęs citokinas, kurio molekulinė masė yra 18 kDa, išsiskiria iš ląstelės.
IL-1a, IL-1P ir IL-1 receptorių antagonistas turi bendrus receptorius, spontaniškai ekspresuojamus daugelio tipų ląstelėse. Kai ląstelės yra aktyvuojamos, ant jų padidėja IL-1 membraninių receptorių skaičius. Pagrindiniame, IL-1RI, tarpląstelinėje dalyje yra 3 į imunoglobuliną panašūs domenai. Jo tarpląstelinė dalis yra TIR domenas, kuris struktūriškai yra panašus į analogiškus TLR domenus ir sukelia tuos pačius signalizacijos kelius (žr. 2.2.1 skyrių). Šių receptorių skaičius yra mažas (200–300 vienoje ląstelėje), tačiau jie turi didelį afinitetą IL-1 (Kd yra 10–11 M). Kitas receptorius, IL-1RII, neturi signalinio komponento citoplazminėje dalyje, neperduoda signalo ir tarnauja kaip jauko receptorius. Signalo perdavimas iš IL-1RI apima tuos pačius veiksnius kaip ir TLR (pvz., „MyD88“, IRAK ir TRAF6), todėl gaunami panašūs rezultatai-susidaro transkripcijos faktoriai NF-kB ir AP-1, kurie sukelia tas pats genų rinkinys (žr. 2.12 pav.). Šie genai yra atsakingi už priešuždegiminių citokinų, chemokinų, sukibimo molekulių, fermentų, užtikrinančių baktericidinį fagocitų poveikį, ir kitų genų, kurių produktai yra susiję su uždegiminio atsako vystymu, sintezę. IL-1 pats priklauso produktams, kurių sekreciją sukelia IL-1, t.y. šiuo atveju įjungiama teigiamo grįžtamojo ryšio kilpa.
Bet kurios kūno ląstelės gali būti IL-1 taikiniai. Didžiausias jo poveikis veikia endotelio ląsteles, visų tipų leukocitus, kremzlės ir kaulinio audinio ląsteles, sinovines ir epitelines ląsteles, daugelio tipų nervų ląsteles. Veikiant IL-1, sukeliama daugiau nei 100 genų ekspresija; dalyvaujant daugiau nei 50 skirtingų biologinių reakcijų. Pagrindinis IL-1 poveikis yra leukocitų emigracija ir jų fagocitinio bei baktericidinio aktyvumo aktyvinimas. Jie taip pat veikia krešėjimo sistemą ir kraujagyslių tonusą, nustatydami hemodinamikos ypatybes uždegimo židinyje. IL-1 turi daugialypį poveikį ne tik įgimto, bet ir adaptacinio imuniteto ląstelėms, dažniausiai stimuliuoja abiejų pasireiškimus.
IL-1 turi daug sisteminio poveikio. Jis stimuliuoja ūminės fazės baltymų gamybą hepatocituose, veikiant pagumburio termoreguliacijos centrui, sukelia karščiavimą, dalyvauja kuriant sistemines uždegiminio proceso apraiškas (pvz., Negalavimą, sumažėjusį apetitą, mieguistumą, adynamia), kuris yra susijęs su IL-1 poveikiu centrinei nervų sistemai. Padidindamas kolonijas stimuliuojančių veiksnių receptorių ekspresiją, IL-1 sustiprina kraujodarą, kuri yra susijusi su jo radioprotekciniu poveikiu. IL-1 skatina leukocitų, visų pirma neutrofilų, įskaitant nesubrendusius, išsiskyrimą iš kaulų čiulpų, todėl uždegimo metu atsiranda leukocitozė ir leukocitų formulė pasislenka į kairę (nesubrendusių ląstelių formų kaupimasis). IL-1 poveikis veikia autonomines funkcijas ir dar didesnį nervų aktyvumą (elgesio reakcijų pokyčiai ir kt.). Chondrocitai ir osteocitai taip pat gali būti IL-1 taikiniai, susiję su IL-1 gebėjimu sunaikinti kremzles ir kaulus, kai jie dalyvauja uždegiminiame procese, ir atvirkščiai, patologinių audinių hiperplazija (reumatoidinis artritas). Žalingas IL-1 poveikis taip pat pasireiškia septiniu šoku, sąnarių pažeidimais sergant reumatoidiniu artritu ir daugeliu kitų patologinių procesų.
Bakterinių produktų IL-1 poveikio dubliavimas yra susijęs su poreikiu daugkartinio aktyvuojančio patogenų poveikio dauginimosi neplatinant. Mikroorganizmai stimuliuoja tik ląsteles, esančias visai šalia patekimo vietos, pirmiausia vietinius makrofagus. Tada tą patį efektą daug kartų atkuria IL-1p molekulės. Šios funkcijos vykdymą IL-1 palengvina jų receptorių ekspresija beveik visose kūno ląstelėse suaktyvinus (pirmiausia tai yra uždegimo židinys).
IL-1 receptorių antagonistas (IL-1RA) yra homologinis IL-1a ir IL-1P (homologija yra atitinkamai 26% ir 19%). Jis sąveikauja su IL-1 receptoriais, tačiau negali perduoti signalo į ląstelę. Dėl to IL-1RA veikia kaip specifinis IL-1 antagonistas. IL-1RA išskiria tos pačios ląstelės, kaip ir IL-1, šis procesas nereikalauja kaspazės 1. IL-1RA gamybą skatina tie patys veiksniai, kaip ir IL-1 sintezė, tačiau kai kurie iš jų yra spontaniškai gamina makrofagai ir hepatocitai. Dėl to šis faktorius nuolat būna kraujo serume. Tai tikriausiai būtina siekiant užkirsti kelią neigiamoms sisteminio poveikio IL-1, kuri ūminio uždegimo metu susidaro dideliais kiekiais, pasekmėms. Rekombinantinis IL-1RA šiuo metu bandomas kaip vaistas lėtinėms uždegiminėms ligoms (reumatoidiniam artritui ir kt.) Gydyti.
IL-18 yra priešuždegiminis citokinas, susijęs su IL-f: jis taip pat sintetinamas kaip pirmtakas, paverstas kaspazės 1; sąveikauja su receptoriumi, kurio citoplazminėje dalyje yra TIR domenas, ir perduoda signalą, dėl kurio suaktyvėja NF-kB. Dėl to suaktyvėja visi uždegimą skatinantys genai, tačiau jis yra mažiau ryškus nei veikiant IL-1. Atskira IL-18 savybė yra IFNy sintezės indukcija (ypač kartu su IL-12) ląstelėse. Nesant IL-12, IL-18 skatina IFNy antagonisto IL-4 sintezę ir skatina alerginių reakcijų vystymąsi. IL-18 veikimą riboja tirpus antagonistas, kuris suriša jį skystoje fazėje.
IL-33 yra struktūriškai labai panašus į IL-18. IL-33 apdorojimas taip pat vyksta dalyvaujant kaspazei 1. Tačiau šis citokinas savo funkcijomis skiriasi nuo kitų IL-1 šeimos narių. IL-33 veikimo unikalumą daugiausia lemia tai, kad jo receptorius Ig2 ląstelėse yra ekspresuojamas selektyviai. Šiuo atžvilgiu IL-33 skatina ^ 2-citokinų IL-4, IL-5, IL-13 sekreciją ir alerginių procesų vystymąsi. Jis neturi reikšmingo priešuždegiminio poveikio.
Naviko nekrozės faktorius a (TNFa arba TNFa) yra kitos imunologiškai reikšmingų baltymų šeimos narys. Tai priešuždegiminis citokinas, turintis platų veikimo spektrą. TNFa turi dvigubą struktūrą. Jis sintezuojamas kaip funkciškai aktyvi membraninė molekulė pro-TNFa, kurios molekulinė masė yra 27 kDa, kuri yra II tipo transmembraninis baltymas (t. Y. Jo N-galo dalis nukreipta į ląstelę). Dėl proteolizės tarpląsteliniame domene susidaro tirpus monomeras, kurio molekulinė masė yra 17 kDa. TNFa monomerai spontaniškai sudaro 52 kDa trimerį, atspindintį pagrindinę šio citokino formą. Trimeris yra varpelio formos, o subvienetai yra sujungti jų C galais, kurių kiekviename yra 3 surišimo vietos su receptoriumi, o N galai nėra sujungti vienas su kitu ir nedalyvauja sąveikoje su receptoriais (ir todėl citokinas atlieka savo funkcijas). Esant rūgštinėms pH vertėms, TNFa įgauna a-spiralinę struktūrą, dėl kurios pasikeičia kai kurios jo funkcijos, ypač padidėjęs citotoksiškumas. TNF yra prototipinis didelės TNF superšeimos molekulių šeimos narys (2.31 lentelė). Į jį įeina limfotoksinai a ir b (tik pirmasis egzistuoja tirpioje formoje), taip pat daugelis membraninių molekulių, dalyvaujančių tarpląstelinėje sąveikoje (CD154, FasL, BAFF, OX40-L, TRAIL, APRIL, LIGHT), kurios bus paminėtos žemiau įvairiuose kontekstuose. Remiantis šiuolaikine nomenklatūra, superšeimos narių pavadinimą sudaro santrumpa TNFSF ir serijos numeris (TNFa - TNFSF2, limfotoksino a - TNFSF1).
2.31 lentelė. Pagrindiniai naviko nekrozės faktoriaus ir jo receptorių šeimų atstovai

Faktorius (ligandas)	Chro mosoma	Molekulinė masė, kDa	Receptorius
TNFa (TNFSF2)	6p	17; trimeris - 52; glikozilinta forma - 25.6	TNF-R1, TNF-R2 (TNFRSF1, TNFRSF2)
Limfotoksinas (TNFSF1)	6p	22,3	TNF-R1, TNF-R2
Limfotoksinas B (TNFSF3)	6p	25,4	LTp-R (TNFRSF3)
OX-40L (TNFSF4)	1q	34,0	OX-40 (TNFRSF4; CD134)
CD40L (TNFSF5; CD154)	Xp	39,0	CD40 (TNFRSF5)
„FasL“ (TNFSF6; CD178)	1q	31,5	Fas / APO-1 (CD95) (TNFRSF6)
CD27L (TNFSF7, CD70)	19p	50,0	CD27 (TNFRSF7)
CD30L (TNFSF8)	9q	40,0	CD30 (TNFRSF8)
4-1BBL (TNFSF9)	19p	27,5	4-1BB (TNFRSF9; CD137)
TRAIL (TNFSF10)	3q	32,0	VK4b VK5
BALANDŽIS (TNFSF13)	17p	27,0	BCMA, TACI
ŠVIESA (TNFSF14)	16q	26,0	HVEM (TNFRSF14)
GITRL (TNFSF18)	1p	22,7	GITR (TNFRSF18)
BAFF (TNFSF20)	13	31,2	BAFFR, TACI, BCMA

Pagrindiniai TNFa, kaip ir IL-1, gamintojai yra monocitai ir makrofagai. Jį taip pat išskiria neutrofilai, endotelio ir epitelio ląstelės, eozinofilai, stiebo ląstelės, B ir T limfocitai, kai jie dalyvauja uždegiminiame procese. TNFa kraujyje aptinkamas anksčiau nei kiti priešuždegiminiai citokinai - jau praėjus 20–30 minučių po uždegimo sukėlimo, kuris yra susijęs su ląstelės membranos formos „dempingu“, o galbūt ir su TNFa išsiskyrimu granulių turinyje.
Yra dviejų tipų TNF receptoriai, bendri TNFa ir limfotoksinui a - TNFRI (iš naviko nekrozės faktoriaus I receptoriaus) ir TNFRII, kurių molekulinė masė atitinkamai yra 55 ir 75 kDa. TNFRI yra beveik visose kūno ląstelėse, išskyrus eritrocitus, o TNFRII daugiausia yra imuninės sistemos ląstelėse. TNFR sudaro didelę šeimą, apimančią molekules, dalyvaujančias ląstelių sąveikoje ir ląstelių mirties sukėlime - apoptozėje. TNFa afinitetas TNFRI yra mažesnis nei TNFRII (atitinkamai apie 5x10-10 M ir 55x10-11 M) .Prisijungus TNFa-trimeriui, atsiranda jo receptorių trimerizacija, reikalinga signalui perduoti.
Signalo perdavimo iš šių receptorių ypatybes daugiausia lemia jų tarpląstelinės dalies struktūra. TNFRI citoplazminę dalį vaizduoja vadinamasis mirties domenas, iš kurio gaunami signalai, dėl kurių suaktyvėja apoptozės mechanizmas; TNFRII trūksta mirties domeno. Signalizacija iš TNFRI vyksta dalyvaujant adapterio baltymams TRADD (su TNFR susijusi mirties sritis) ir FADD (su Fas susijusi mirties sritis), kuriuose taip pat yra mirties domenų. Be apoptozės vystymosi kelio (aktyvuojant kaspazę 8 arba sintezuojant keramidą), išskiriami keli signalizacijos keliai, kurie aktyvuojami dalyvaujant TRAF2 / 5 ir RIP-1 veiksniams. Pirmasis iš šių veiksnių perduoda signalą keliu, vedančiu į NF-kB faktoriaus aktyvavimą, t.y. klasikiniu uždegimą skatinančių genų indukcijos keliu (žr. 2.55 pav.). Signalizacijos kelias, suaktyvintas veiksniu RIP-1, suaktyvina MAP kaskadą su galutiniu produktu-transkripcijos faktoriumi AP-1. Šis veiksnys apima genus, kurie užtikrina ląstelių aktyvaciją ir neleidžia vystytis apoptozei. Taigi ląstelių likimą lemia pro- ir anti-apoptotinių mechanizmų pusiausvyra, suveikusi, kai TNFa prisijungia prie TNFRI.
TNFa funkcijų įgyvendinimas daugiausia susijęs su veiksmu per TNFRI - išjungus atitinkamą geną atsiranda sunkus imunodeficitas, o TNFRII geno inaktyvavimo pasekmės yra nereikšmingos. Uždegiminio atsako piko metu TNFa receptorius galima „išmesti“ iš membranos ir išleisti į tarpląstelinę erdvę, kur jie suriša TNFa ir daro priešuždegiminį poveikį. Šiuo atžvilgiu tirpios TNFR formos naudojamos gydant lėtines uždegimines ligas. Paaiškėjo, kad vaistas, kurio pagrindą sudaro tirpus TNFRII, kliniškai pasirodė pats efektyviausias.
Kaip ir IL-1, TNFa sustiprina sukibimo molekulių ekspresiją, priešuždegiminių citokinų ir chemokinų, ūminės fazės baltymų, fagocitinių ląstelių fermentų ir kt. Kartu su IL-1 TNFa dalyvauja formuojant visas pagrindines vietines ir kai kurias sistemines uždegimo apraiškas. Jis aktyvina endotelio ląsteles, stimuliuoja angiogenezę, gerina migraciją ir aktyvina leukocitus. TNFa labiau nei IL-1 veikia limfocitų aktyvaciją ir proliferaciją. Kartu su IFNy TNFa sukelia NO sintazės aktyvumą fagocituose, o tai žymiai padidina jų baktericidinį potencialą. TNFa skatina fibroblastų dauginimąsi, skatina žaizdų gijimą. Padidėjus vietinei TNFa gamybai, vyrauja audinių pažeidimo procesai, pasireiškiantys hemoragine nekroze. Be to, TNFa slopina lipoproteinų lipazės aktyvumą, kuris silpnina lipogenezę ir sukelia kacheksiją (vienas iš pradinių TNFa pavadinimų yra kacheksinas). Padidėjęs TNFa išsiskyrimas ir jo kaupimasis kraujotakoje, pavyzdžiui, veikiant didelėms bakterijų superantigenų dozėms, sukelia sunkią patologiją - septinį šoką. Taigi, TNFa veikimą, skirtą atlikti apsauginę funkciją ir palaikyti homeostazę, gali lydėti stiprus toksinis poveikis (vietinis ir sisteminis), dažnai sukeliantis mirtį.
IL-6 yra plataus spektro priešuždegiminis citokinas. Jis taip pat yra prototipinis citokinų šeimos veiksnys, kuris, be paties IL-6, apima onkotostiną M (OSM), leukemiją slopinantį faktorių (LIF), ciliarinį neurotrofinį faktorių (CNTF), kardiotropiną-1 (CT-1). ), ir IL-11 bei IL-31. IL-6 molekulinė masė yra 21 kDa. IL-6 gamina monocitai ir makrofagai, endotelio, epitelio, glijos, lygiųjų raumenų ląstelės, fibroblastai, Th2 tipo T-limfocitai, taip pat daugelis naviko ląstelių. Mieloidinių ląstelių IL-6 gamybą skatina jų TLR sąveika su mikroorganizmais ir jų produktais, taip pat IL-1 ir TNFa įtaka. Šiuo atveju per 2 valandas IL-6 kiekis kraujo plazmoje padidėja 1000 kartų.
Visų IL -6 šeimos veiksnių receptoriai turi bendrą komponentą - gp130 grandinę, kuri yra beveik visose kūno ląstelėse. Antrasis receptoriaus komponentas yra individualus kiekvienam citokinui. Tam tikra IL-6 receptoriaus grandinė (gp80) yra atsakinga už šio citokino surišimą, o gp130 dalyvauja signalo perdavime, nes yra susijęs su tirozino kinazėmis Jak1 ir Jak2. Kai IL-6 sąveikauja su receptoriumi, atsiranda tokia įvykių seka: IL-6 monomeras sąveikauja su gp80 grandine, atsiranda kompleksų dimerizacija (2 citokinų molekulės-2 gp80 grandinės), po to prie jų prijungiamos 2 gp130 grandinės. kompleksas, kuris veda prie Jak-kinazės fosforilinimo. Pastarieji fosforilina faktorius STAT1 ir STAT3, kurie dimerizuojasi, persikelia į branduolį ir suriša tikslinių genų promotorius. „Gp80“ grandinė lengvai nuplaunama nuo ląstelės; laisva forma jis sąveikauja su citokinu, jį inaktyvuoja, t.y. veikia kaip specifinis IL-6 inhibitorius.
IL-6 dalyvauja beveik viso vietinio uždegimo pasireiškimo komplekso sukėlime. Tai daro įtaką fagocitų migracijai, padidina CC-chemokinų, kurie pritraukia monocitus ir limfocitus, gamybą ir susilpnina neutrofilus pritraukiančių CX-chemokinų gamybą. Priešuždegiminis IL-6 poveikis yra silpnesnis nei IL-1 ir TNFa, priešingai, jis nedidina, bet slopina dalyvaujančių ląstelių priešuždegiminių citokinų (IL-1, TNFa ir IL-6) ir chemokinų gamybą. uždegiminiame procese. Taigi, IL-6 sujungia priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų savybes ir dalyvauja ne tik vystant, bet ir ribojant uždegiminį atsaką.
IL-6 yra pagrindinis veiksnys, sukeliantis ūminės fazės baltymų genų ekspresiją hepatocituose. IL-6 veikia įvairius kraujodaros etapus, įskaitant kamieninių ląstelių dauginimąsi ir diferenciaciją. Jis tarnauja kaip nesubrendusių plazmos ląstelių augimo faktorius, žymiai sustiprinantis humoralinį imuninį atsaką. IL-6 taip pat veikia T limfocitus, padidindamas citotoksinių T ląstelių aktyvumą.
IL-17 ir susiję citokinai. Citokinų grupė, įskaitant IL-17 rūšis, sulaukė plataus dėmesio, kai buvo atrastas specialus T-pagalbininkų tipas-Th17, kuris yra susijęs su kai kurių žalingų uždegiminių reakcijų formų, ypač autoimuniniai procesai (žr. 3.4.3.2 skyrių). Šių citokinų vaidmuo reaguojant į adaptacinį imuninį atsaką bus aptartas toliau. Čia pateiksime tik bendrą citokinų aprašymą ir trumpai apsvarstysime jų vaidmenį įgimto imuniteto reakcijose.
IL-17 šeimą sudaro 6 baltymai, pažymėti raidėmis nuo A iki F. Jų uždegimą skatinančių citokinų savybės yra IL-17A ir IL-17F. Jie yra disulfidu surišti homodimerai; jų molekulinė masė yra 17,5 kDa. Šiuos citokinus gamina minėti Th17, taip pat CD8 + T ląstelės, eozinofilai, neutrofilai. IL-23 skatina TH7 ląstelių vystymąsi ir IL-17 gamybą.
IL -17 receptorius ekspresuoja daugelis ląstelių - epitelio ląstelės, fibroblastai, imuninės sistemos ląstelės, ypač neutrofilai. Pagrindinis IL-17 sąveikos su receptoriumi rezultatas, kaip ir kitų priešuždegiminių citokinų veikimas, yra NF-kB faktoriaus indukcija ir daugelio nuo NF-KB priklausomų uždegimo genų ekspresija.
Vienas iš svarbių biologinių IL-17 (kartu su IL-23) poveikių yra neutrofilų homeostazės palaikymas. Šie citokinai skatina neutrofilų gamybą, skatindami G-CSF gamybą. Tuo pačiu metu IL-17 ir IL-23 gamybos padidėjimą arba sumažėjimą reguliuoja neutrofilų skaičius periferiniuose audiniuose: sumažėjus šių ląstelių skaičiui dėl apoptozės, padidėja citokinų gamyba.
Priešuždegiminis IL-17 poveikis pasireiškia daugiausia padidėjus kitų citokinų (IL-8, IL-6, y-CSF, nemažai chemokinų) gamybai ir sukibimo molekulių ekspresijai. Pelėms, kurios yra transgeninės IL-17 arba IL-23, išsivysto sisteminis lėtinis intersticinio pobūdžio uždegimas, kurio metu infiltruojasi įvairių organų neutrofilai, eozinofilai, makrofagai ir limfocitai. Šie citokinai yra pripažinti pagrindiniu vaidmeniu vystantis lėtinėms autoimuninėms ligoms.
IL-12 šeima
Nustatyta, kad IL-12 gali aktyvuoti NK ląsteles, sukelti T limfocitų proliferaciją ir sukelti IFNy sintezę. IL-12 užima ypatingą vietą tarp įgimtos imuninės sistemos ląstelių gaminamų citokinų, nes jis (kaip ir jo pagrindiniai gamintojai, dendritinės ląstelės) yra ryšys tarp įgimto ir prisitaikančio imuniteto. Kita vertus, IL-12 yra IL-12-IFNy tandemo dalis, kuri atlieka pagrindinį vaidmenį imuninėje gynyboje nuo tarpląstelinių patogenų.
IL-12 yra dimeris, sudarytas iš p40 ir p35 subvienetų. Jo bendra molekulinė masė yra 75 kDa. Funkcinis IL-12 aktyvumas yra susijęs su jo p40 subvienetu. „Pilno masto“ IL-12 išskiria aktyvuoti monocitai, makrofagai, mieloidinės dendritinės ląstelės, neutrofilai ir barjerinių audinių epitelio ląstelės (jie gamina ir Ig-12p35, ir IL-12p40 citokinų subvienetus). Dauguma kūno ląstelių sintezuoja tik funkciškai neaktyvų subvienetą ^ -12p35. Ląstelės išskiriamo IL-12 heterodimero kiekį riboja p35 subvienetas. IL-12p40 sintezuojama per daug ir gali dimerizuotis, sudarydama homodimerą, kuris veikia kaip IL-12 antagonistas, taip pat kaip chemoattraktantas. IL-12 gamybos induktoriai pirmiausia yra patogenai, kuriuos atpažįsta TLR ir kiti modelio atpažinimo receptoriai. IL-12 gamybą sustiprina IL-1, IFNy, taip pat tarpląstelinė sąveika, kurią sukelia CD40-CD154 ir kitos šeimų molekulių poros-TNFR.
IL-12 receptorius stipriausiai ekspresuojamas NK ląstelėse, aktyvuotose TH ląstelėse ir citotoksiniuose T limfocituose, mažesniu mastu-dendritinėse ląstelėse. IL-12 receptoriaus ekspresija aktyvuotose T ląstelėse sustiprėja veikiant IL-12, IFNy, IFNa, TNFa ir stimuliuojant CD28 receptorių. IL-12 receptorius yra dimeris, kurį sudaro IL-12RP1 (100 kDa) ir IL-12RP2 (130 kDa, CD212) subvienetai, su kuriais siejamas 85 kDa baltymas. Tiek Pj, tiek p2 grandinės dalyvauja IL-12 surišime, o IL-12RP2 subvienetas daugiausia dalyvauja signalo perdavime. Pj grandinės tarpląstelinis domenas yra susijęs su JAK2 kinaze, P2 grandinės tarpląstelinis domenas yra susijęs su Tyk2 kinaze. Kinazės fosforilina transkripcijos faktorius STAT1, STAT3, STAT4 ir STAT5.
Pagrindinė IL-12 funkcija, nes ji gali stimuliuoti citotoksinius limfocitus (NK ir T) ir skatinti Thl ląstelių diferenciaciją (žr. 3.4.3.1 skyrių), yra ląstelių gynybos mechanizmų prieš ląstelinius patogenus sužadinimas. IL-12 veikia NK ir NKT ląsteles jau ankstyvose imuninių procesų stadijose, didindamas NK ląstelių proliferaciją ir citotoksinį aktyvumą, o vėliau-citotoksinius T limfocitus ir visų šių ląstelių IFNy sintezę. Kiek vėliau IL-12 sukelia Thl ląstelių, kurios taip pat gamina IFNy, diferenciaciją. Thl ląstelių indukcijos sąlyga yra išankstinė IL-12RP2 receptorių subvieneto ekspresija aktyvuotomis CD4 + T ląstelėmis. Po to ląstelės įgyja galimybę surišti IL-12, o tai suaktyvina STAT4 faktorių, kuris reguliuoja Thl ląstelėms būdingų genų ekspresiją (IFNG geno ekspresijai transkripcijos faktoriaus T poveikis -lažybos yra svarbesnės). Tuo pačiu metu IL-12 slopina ^ 2 ląstelių diferenciaciją ir silpnina ląstelių gamybą
B serijos IgE ir IgA klasių antikūnai. Veikdamas dendritinius ir kitus APC, IL-12 sukelia kostimuliacinių molekulių (CD80 / 86 ir kt.), Taip pat MHC-II APC produktų, ekspresiją. Taigi IL-12 atlieka ryšį tarp įgimto ir prisitaikančio imuniteto ir stiprina imuninius mechanizmus, atsakingus už apsaugą nuo tarpląstelinių patogenų ir navikų.
IL-12 šeimą sudaro IL-23, IL-27 ir IL-35. Šie citokinai yra heterodimerai: IL-23 sudaro du subvienetai-I-23p19 ir IL-12p40 (identiškas atitinkamam IL-12 subvienetui), IL-27-subvienetams Ebi3 ir IL-27p28, IL-35-pagal subvienetai Ebi3 ir IL-12p35. Šiuos citokinus daugiausia gamina dendritinės ląstelės. IL-12 šeimos citokinų gamybą skatina PAMP ir citokinai, esantys ant patogenų, ypač GM-CSF.
IL-23 priėmimą vykdo dvi skirtingos struktūros: IL-12p40 subvienetą atpažįsta IL-12 receptoriaus p-grandinė, o R-23p19 subvienetą atpažįsta specialus receptorius IL-23R. STAT4 vaidina svarbų vaidmenį perduodant signalą iš IL-23. IL-27 receptorius aktyvuoja molekules WSX-1 (IL-12R p2 subvieneto homologas) ir gp130 (polipeptidinė grandinė, kuri yra IL-6 šeimos citokinų receptorių dalis).
Kaip ir IL-12, IL-23 ir IL-27 daugiausia veikia CD4 + T ląsteles, skatindamos jų diferenciaciją Th1 keliu. IL-23 ypatybės-vyraujantis poveikis atminties T ląstelėms, taip pat galimybė palaikyti Th17 tipo T pagalbininkų vystymąsi. IL-27 nuo kitų dviejų šeimos citokinų skiriasi tuo, kad gali sukelti ne tik aktyvuotų, bet ir ramybės būsenoje esančių CD4 + T ląstelių dauginimąsi. Neseniai buvo įrodyta, kad IL-27 ir IL-35 gali veikti kaip reguliavimo (slopinimo) veiksniai, nes jų subvienetas Ebi3 yra pagrindinis reguliavimo T ląstelių FOXP3 veiksnys.
Kolonijas stimuliuojančius veiksnius (CSF) (2.32 lentelė) arba hematopoetinus vaizduoja trys citokinai-GM-CSF, G-CSF ir M-CSF. IL-3 (Multi-CSF) yra funkcionaliai arti jų. Šie veiksniai vadinami kolonijas stimuliuojančiais veiksniais, nes jie pirmą kartą buvo identifikuoti pagal jų gebėjimą palaikyti atitinkamos sudėties kraujodaros ląstelių kolonijų augimą in vitro. IL-3 turi plačiausią veikimo spektrą, nes jis palaiko bet kokių kraujodaros ląstelių kolonijų augimą, išskyrus limfoidines ląsteles. GM-CSF palaiko tiek mišrių granulocitų-monocitų kolonijų, tiek atskirai granulocitų ir monocitų / makrofagų kolonijų augimą. G-CSF ir M-CSF specializuojasi palaikydami atitinkamų kolonijų augimą ir diferenciaciją. Šie veiksniai ne tik užtikrina šių tipų kraujodaros ląstelių išlikimą ir dauginimąsi, bet ir sugeba aktyvuoti jau subrendusias diferencijuotas ląsteles (M -CSF - makrofagai, G -CSF - neutrofilai). M-CSF dalyvauja monocitų diferenciacijoje į makrofagus ir slopina monocitų diferenciaciją į dendritines ląsteles. G-CSF ne tik veikia granulocitinę kraujodaros šaką, bet ir sukelia kraujodaros kamieninių ląstelių mobilizaciją iš kaulų čiulpų į kraują.
2.32 lentelė. Kolonijas stimuliuojančių veiksnių apibūdinimas

vardas nie	Chromo šamas	Molekulinė masė, kDa	Ląstelės gamintojų	Ląstelės taikinys	Receptas tori
GM-CSF	5q	22	Makrofagai, T ląstelės, NK ląstelės, stromos ląstelės, epitelio ląstelės	Makrofagai, neutrofilai, eozinofilai, T ląstelės, dendritinės ląstelės, kraujodaros ląstelės	GM- CSFR a / p
G-CSF	17q	18-22		Neutrofilai, eozinofilai, T ląstelės, kraujodaros ląstelės	G-CSFR (1 grandinė)
M-CSF	5q	45/70 (dimeris)	Makrofagai, stromos ląstelės, epitelio ląstelės	Makrofagai, kraujodaros ląstelės	c-Fms
Kamieninių ląstelių faktorius	12q	32	Stromal ląstelės	Hematopoetinės ląstelės, B ląstelės, stiebo ląstelės	„c-Kit“
Flt-3- ligandas	19q	26,4	Stromal ląstelės	Hematopoetinės ląstelės, stiebo ląstelės	Flt-3

G-CSF, GM-CSF ir IL-3 yra struktūriškai apibūdinami kaip hematopoetinai, turintys 4 a-spiralinius domenus. Jų receptoriai turi 2 polipeptidines grandines, jie priklauso hematopoetino receptorių šeimai. M-CSF skiriasi nuo kitų CSF. Tai yra dimerinė molekulė ir egzistuoja tiek tirpios, tiek su membrana susijusios formos. Jo receptorius turi tarpląstelinius Ig panašius domenus ir tarpląstelinį domeną su tirozinkinazės aktyvumu (šios proto onkogeninės kinazės pavadinimas-c-Fms-kartais perkeliamas į visą receptorių). Kai M-CSF jungiasi prie receptorių, atsiranda jų dimerizacija ir kinazės aktyvavimas.
Kolonijas stimuliuojančius veiksnius gamina endotelio ląstelės ir fibroblastai, taip pat monocitai / makrofagai. GM-CSF ir IL-3 taip pat sintezuoja T limfocitai. Veikiant bakteriniams produktams (per modelio atpažinimo receptorius) ir priešuždegiminiams citokinams, žymiai padidėja kolonijas stimuliuojančių veiksnių sintezė ir sekrecija, todėl padidėja mielopoezė. Ypač stipriai stimuliuojama granulocitopoezė, kurią lydi spartesnė ląstelių, įskaitant nesubrendusių, emigracija į periferiją. Tai sukuria neutrofilinės leukocitozės vaizdą, kai formulė pasislenka į dešinę, o tai labai būdinga uždegimui. Preparatai, pagrįsti GM ir G-CSF, klinikinėje praktikoje naudojami siekiant skatinti granulocitopoezę, susilpnintą dėl citotoksinio poveikio (spinduliuotė, chemoterapija navikų ligoms gydyti ir kt.). G-CSF naudojamas kraujodaros kamieninėms ląstelėms mobilizuoti, po to indukuota leukomasė naudojama sutrikusios kraujodaros atkūrimui.
Kamieninių ląstelių faktorių (SCF - kamieninių ląstelių faktorius, c -rinkinio ligandas) išskiria kaulų čiulpų stromos ląstelės (fibroblastai, endotelio ląstelės), taip pat skirtingų tipų ląstelės embriono vystymosi metu. SCF egzistuoja kaip transmembraninė ir tirpi molekulė (pastaroji susidaro dėl tarpląstelinės dalies proteolitinio skilimo). SCF aptinkamas kraujo plazmoje. Jo molekulė turi du disulfidinius ryšius. SCF receptorius c-Kk turi tirozinkinazės aktyvumą ir yra struktūriškai panašus į Flt-3 ir c-Fms (M-CSF receptorius). Kai SCF jungiasi, receptoriai yra dimerizuojami ir fosforilinami. Signalas perduodamas dalyvaujant PI3K ir MAP kaskadai.
SCF geno ir jo receptorių mutacijos jau seniai aprašytos (plieno mutacijos); pelėms jie pasireiškia kailio spalvos pasikeitimu ir kraujodaros pažeidimu. Mutacijos, sutrikdančios faktoriaus membranos formos sintezę, sukelia didelius embriono vystymosi defektus. Kartu su kitais veiksniais SCF dalyvauja palaikant kraujodaros kamieninių ląstelių gyvybingumą, užtikrina jų dauginimąsi ir palaiko ankstyvąsias kraujodaros stadijas. SCF yra ypač svarbus eritropoezės ir putliųjų ląstelių vystymuisi, taip pat tarnauja kaip timocitų augimo faktorius DN1 ir DN2 stadijose.
Kalbant apie struktūrą ir biologinį aktyvumą, Flt-3L faktorius (į Fms panašus tirozinkinazės 3-ligandas) turi savybių, panašių į SCF, kartu su kitais veiksniais, palaikančiais ankstyvąsias mielopoezės stadijas ir B-limfocitų vystymąsi. SCF atlieka leukeminių mieloblastų augimo faktoriaus vaidmenį.
Chemokinai, kurie yra svarbus humoralinis uždegimo ir įgimto imuniteto veiksnys, aptariami aukščiau leukocitų chemotaksės aprašyme (žr. 2.3.2 skyrių).

Kas yra citokinų terapija

Teigiamas veiksmas

Onkoimunologija ir citokinų terapija

Citokinų funkcijos organizme

Citokinai kaip vaistai

Šalutiniai poveikiai

Kam citokinų terapijos metodas netinka

Citokinų terapijos kaina

Antivirusinis imunitetas molekuliniai ir ląsteliniai mechanizmai, vystymosi modeliai ir imunopato

Mieloproliferacinių ligų kaulų čiulpų fibrozės priežasčių tyrimas, analizuojant trombocitų faktorių poveikį mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms

Žmonių tuberkuliozės patogenezė