Introducere.

1. Caracteristicile generale și clasificarea citokinelor.

1.1 Mecanisme de acțiune.

1.2 Proprietățile citokinelor.

1.3 Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului.

2. Studii speciale de citokine.

2.1 Rolul citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii.

2.2 Rolul oxidului nitric și citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute.

3. Metode de determinare a citokinelor

3.1 Determinarea activității biologice a citokinelor

3.2 Cuantificarea citokinelor folosind anticorpi

3.3 Determinarea citokinelor prin imunoanaliză enzimatică.

3.3.1 Factorul de necroză tumorală-alfa.

3.3.2 Interferon gamma.

3.3.3 Interleukina-4

3.3.4 Interleukina-8

3.3.5 Antagonist al receptorului interleukinei-1.

3.3.6 Alfa-interferon.

3.3.7 Anticorpi împotriva alfa-IFN.

4. Medicamente imunotrope pe bază de citokine.

Lista literaturii folosite.

Concluzie.

Introducere.

Nu a trecut mult timp de la descrierea primelor citokine. Cu toate acestea, cercetările lor au condus la alocarea unei secțiuni extinse de cunoștințe - citokinologia, care face parte integrantă din diferite domenii ale cunoașterii și, în primul rând, imunologia, care a dat un puternic impuls studiului acestor mediatori. Citokineologia pătrunde în toate disciplinele clinice, de la etiologia și patogeneza bolilor până la prevenirea și tratamentul diferitelor afecțiuni patologice. În consecință, cercetătorii științifici și clinicienii trebuie să navigheze în diversitatea moleculelor de reglare și să înțeleagă clar rolul fiecăreia dintre citokine în procesele studiate. Toate celulele sistemului imunitar au anumite funcții și funcționează într-o interacțiune clar coordonată, care este asigurată de substanțe biologice active speciale - citokine - regulatori ai reacțiilor imune. Citokinele sunt proteine ​​specifice cu ajutorul cărora diverse celule ale sistemului imunitar pot face schimb de informații între ele și pot coordona acțiuni. Setul și cantitatea de citokine care acționează asupra receptorilor de suprafață celulară - „mediul citokinelor” - reprezintă o matrice de semnale care interacționează și se schimbă frecvent. Aceste semnale sunt complexe datorită varietății largi de receptori de citokine și datorită faptului că fiecare dintre citokine poate activa sau suprima mai multe procese, inclusiv sinteza proprie și sinteza altor citokine, precum și formarea și apariția receptorilor de citokine pe suprafața celulei. Scopul muncii noastre este de a studia citakinele, funcțiile și proprietățile acestora, precum și posibila lor aplicare în medicină. Citokinele sunt proteine ​​mici (greutate moleculară de la 8 la 80 KDa) care acționează autocrin (adică asupra celulei care le produce) sau paracrine (asupra celulelor situate în apropiere). Formarea și eliberarea acestor molecule extrem de active este de scurtă durată și este bine reglementată.

Revizuire de literatura.

Caracteristicile generale și clasificarea citokinelor.

Citokinele sunt un grup de mediatori polipeptidici ai interacțiunii intercelulare, care sunt implicați în principal în formarea și reglarea reacțiilor de apărare ale corpului în timpul introducerii agenților patogeni și a perturbării integrității țesuturilor, precum și în reglarea unui număr de funcții fiziologice normale. Citokinele pot fi izolate într-un nou sistem de reglementare independent care există împreună cu sistemele nervoase și endocrine pentru menținerea homeostaziei, iar toate cele trei sisteme sunt strâns interconectate și interdependente. În ultimele două decenii, genele majorității citokinelor au fost clonate și s-au obținut analogi recombinați care repetă complet proprietățile biologice ale moleculelor naturale. Acum sunt cunoscute peste 200 de substanțe individuale aparținând familiei de citokine. Istoria studiului citokinelor a început în anii 40 ai secolului XX. Atunci au fost descrise primele efecte ale cachectinei, un factor prezent în serul sanguin și capabil să provoace cașexie sau scădere în greutate. Ulterior, acest mediator a fost izolat și s-a dovedit a fi identic cu factorul de necroză tumorală (TNF). În acel moment, studiul citokinelor a avut loc pe principiul detectării oricărui efect biologic, care a servit drept punct de plecare pentru numele mediatorului corespunzător. Deci, în anii 50, interferonul (IFN) a fost numit datorită capacității sale de a interfera sau de a crește rezistența în timpul infecției virale repetate. Interleukina-1 (IL-1) a fost, de asemenea, numită inițial pirogen endogen, spre deosebire de lipopolizaharidele bacteriene, care au fost considerate pirogeni exogeni. Următoarea etapă a studiului citokinelor, datând de la 60-70 de ani, este asociată cu purificarea moleculelor naturale și o caracterizare cuprinzătoare a acțiunii lor biologice. În acest moment, aparține descoperirea factorului de creștere a celulelor T, cunoscut acum sub numele de IL-2, și a unui număr de alte molecule care stimulează creșterea și activitatea funcțională a limfocitelor T-, B-limfocite și a altor tipuri de leucocite. În 1979, pentru desemnarea și sistematizarea lor, a fost propus termenul „interleukine”, adică mediatori care comunică între leucocite. Cu toate acestea, foarte curând a devenit clar că efectele biologice ale citokinelor se extind mult dincolo de sistemul imunitar și, prin urmare, termenul propus anterior de "citokine", care a supraviețuit până în prezent, a devenit mai acceptabil. O schimbare revoluționară în studiul citokinelor a avut loc la începutul anilor 1980, după clonarea genelor interferonului de șoarece și uman și a producției de molecule recombinante care au repetat complet proprietățile biologice ale citokinelor naturale. După aceasta, a fost posibilă clonarea genelor altor mediatori din această familie. O etapă importantă în istoria citokinelor a fost utilizarea clinică a interferonilor recombinați și în special a IL-2 recombinantă pentru tratamentul cancerului. Anii 90 au fost marcați de descoperirea structurii subunității receptorilor citokinici și formarea conceptului de „rețea de citokine”, și începutul secolului XXI - descoperirea multor citokine noi prin analiza genetică. Citokinele includ interferoni, factori de stimulare a coloniilor (LCR), chemokine care transformă factorii de creștere; factor de necroză tumorală; interleukini cu numere de serie istorice stabilite și alți mediatori endogeni. Interleukinele cu numere de serie începând de la 1 nu aparțin aceluiași subgrup de citokine legate de funcții comune. La rândul lor, acestea pot fi împărțite în citokine proinflamatorii, factori de creștere și diferențiere a limfocitelor și citokine individuale de reglare. Denumirea de „interleukină” este atribuită unui nou mediator descoperit dacă sunt îndeplinite următoarele criterii elaborate de comitetul de nomenclatură al Uniunii Internaționale a Societăților Imunologice: clonarea moleculară și expresia genei factorului studiat, prezența unui nucleotid unic și secvența de aminoacizi corespunzătoare, obținând anticorpi monoclonali neutralizanți. În plus, noua moleculă trebuie să fie produsă de celulele sistemului imunitar (limfocite, monocite sau alte tipuri de leucocite), să aibă o funcție biologică importantă în reglarea răspunsului imun, precum și funcții suplimentare, motiv pentru care nu poate să i se dea un nume funcțional. În cele din urmă, proprietățile enumerate ale noii interleukine ar trebui publicate într-un jurnal științific evaluat de colegi. Clasificarea citokinelor poate fi efectuată în funcție de proprietățile lor biochimice și biologice, precum și de tipurile de receptori prin care citokinele își îndeplinesc funcțiile biologice. Clasificarea citokinelor după structură (Tabelul 1) ia în considerare nu numai secvența de aminoacizi, ci mai presus de toate structura terțiară a proteinei, care reflectă mai precis originea evolutivă a moleculelor.

Tabelul 1. Clasificarea citokinelor după structură.

Clonarea genelor și analiza structurii receptorilor citokinici au arătat că, la fel ca citokinele în sine, aceste molecule pot fi împărțite în mai multe tipuri în funcție de similaritatea secvențelor de aminoacizi și de particularitățile organizării domeniilor extracelulare (Tabelul 2). Una dintre cele mai mari familii de receptori de citokine se numește familia de receptori de hematopoietină sau familia de receptori de citokine de tip I. O caracteristică structurală a acestui grup de receptori este prezența în moleculă a 4 cisteine ​​și secvența de aminoacizi Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), situată la mică distanță de membrana celulară. Receptorii citokinelor de clasa II interacționează cu interferoni și IL-10. Ambele prime tipuri de receptori au omologie între ele. Următoarele grupuri de receptori mediază interacțiunea cu citokinele din familia factorilor de necroză tumorală și familia IL-1. În prezent, mai mult de 20 de receptori diferiți de chemokine sunt cunoscuți că interacționează cu diferite grade de afinitate cu unul sau mai mulți liganzi din familia chemokinelor. Receptorii chemokinei aparțin superfamiliei receptorilor rodopsinei, au 7 domenii transmembranare și conduc un semnal cu participarea proteinelor G.

Tabelul 2. Clasificarea receptorilor de citokine.

Mulți receptori de citokine sunt compuși din 2-3 subunități codificate de diferite gene și exprimate independent. În acest caz, formarea unui receptor cu afinitate ridicată necesită interacțiunea simultană a tuturor subunităților. Un exemplu de astfel de organizare a receptorilor de citokine este structura complexului receptorilor IL-2. Surprinzător a fost descoperirea faptului că subunitățile individuale ale complexului receptorului IL-2 sunt comune IL-2 și altor citokine. Astfel, lanțul β este simultan o componentă a receptorului pentru IL-15, iar lanțul y servește ca subunitate comună a receptorilor pentru IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL- 15 și IL-21. Aceasta înseamnă că toate citokinele menționate anterior, ai căror receptori constau, de asemenea, din 2-3 polipeptide individuale, utilizează lanțul γ ca componentă a receptorilor lor, în plus, o componentă responsabilă pentru transmiterea semnalului. În toate cazurile, specificitatea interacțiunii pentru fiecare citokină este asigurată de alte subunități care diferă în structură. Dintre receptorii citokinici, există încă 2 subunități de receptor mai frecvente care conduc un semnal după interacțiunea cu diferite citokine. Este o subunitate de receptor comună βc (gp140) pentru receptorii IL-3, IL-5 și GM-CSF, precum și subunitatea receptorului gp130, care este comună membrilor familiei IL-6. Prezența unei subunități comune de semnalizare în receptorii citokinici servește ca una dintre abordările pentru clasificarea lor, deoarece permite găsirea de puncte comune atât în ​​structura liganzilor, cât și în efectele biologice.

Tabelul 3 prezintă clasificarea combinată structurală și funcțională, în care toate citokinele sunt împărțite în grupuri, ținând seama în primul rând de activitatea lor biologică, precum și de caracteristicile structurale de mai sus ale moleculelor citokinelor și ale receptorilor acestora.

Tabelul 3. Clasificarea structurală și funcțională a citokinelor.

	Familii de citokine	Subgrupuri și liganzi	Funcții biologice de bază
	Interferoni de tip I.	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Activitate antivirală, acțiune antiproliferativă, imunomodulatoare
	Factorii de creștere a celulelor hematopoietice	Factor de celule stem (kit-ligand, factor de oțel), ligand Flt-3, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Liganzi GP140: IL-3, IL-5, GM-KSF	Stimularea proliferării și diferențierea diferitelor tipuri de celule progenitoare în măduva osoasă, activarea hematopoiezei Eritropoietina, trombopoietina
	Superfamilia interleukinei-1 și FRF	Familia FRF: FRF acru, FRF de bază, FRF3 - FRF23 Familia IL-1 (F1-11): IL-1α, IL-1β, antagonist al receptorilor IL-1, IL-18, IL-33 etc.	Activarea proliferării fibroblastelor și a celulelor epiteliale Acțiune pro-inflamatorie, activarea imunității specifice
	Familia factorilor de necroză tumorală	TNF, limfotoxine α și β, ligand Fas etc.	Acțiune pro-inflamatorie, reglarea apoptozei și interacțiunea intercelulară a celulelor imunocompetente
	Familia Interleukin-6	Liganzi GP130: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Cardiotropin-1, Factor inhibitor al leucemiei, Factor neurotrofic ciliar	Efecte pro-inflamatorii și imunoreglatoare
	Chimiochine	SS, SXS (IL-8), SX3S, S	Reglarea chimiotaxiei diferitelor tipuri de leucocite
	Familia Interleukin-10	IL-10,19,20,22,24,26	Acțiune imunosupresivă
	Familia Interleukin-12		Reglarea diferențierii limfocitelor T ajutătoare
	Citokine ale clonelor T-helper și funcțiile de reglare ale limfocitelor	T-helpers tip 1: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg T-helpers tip 2: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 Liganzi ai lanțului γ al receptorului IL-2: IL-7 TSLP	Activarea imunității celulare Activarea imunității umorale, efect imunomodulator Stimularea diferențierii, proliferării și proprietăților funcționale ale diferitelor tipuri de limfocite, celule DC, NK, macrofage etc.
	Familia Interleukin 17	IL-17A, B, C, D, E, F	Activarea sintezei de citokine pro-inflamatorii
	Superfamilia factorului de creștere a nervilor, a factorului de creștere a trombocitelor și a factorilor de creștere transformatori	Familia factorilor de creștere a nervilor: NGF, factor neurotrofic al creierului Factori de creștere derivate din trombocite (PDGF), factori de creștere angiogenici (VEGF) Familia TRF: TPPb, activine, inhibine, nodale, proteine ​​morfogene osoase, substanță inhibitoare muleriană	Reglarea inflamației, angiogeneza, funcția neuronală, dezvoltarea embrionară și regenerarea țesuturilor
	Familia factorilor de creștere epidermică	ERF, TRFα etc.
	Familia de factori de creștere asemănători insulinei	IRF-I, IRF-II	Stimularea proliferării diferitelor tipuri de celule

Primul grup include interferoni de tip I și este cel mai simplu în organizare, deoarece toate moleculele incluse în acesta au o structură similară și în multe privințe aceleași funcții asociate cu protecția antivirală. Al doilea grup a inclus factori de creștere și diferențiere a celulelor hematopoietice, stimulând dezvoltarea celulelor progenitoare hematopoietice, începând de la celula stem. Acest grup include citokine care sunt strict specifice pentru anumite linii de diferențiere a celulelor hematopoietice (eritropoietină, trombopoietină și IL-7, care acționează asupra precursorilor limfocitelor TB), precum și citokine cu un spectru mai larg de activitate biologică, cum ar fi ca IL-3, IL-11, factori de stimulare a coloniei. În cadrul acestui grup de citokine, liganzii gp140, care au o subunitate de receptor comună, precum și trombopoietina și eritropoietina au fost izolați datorită similarității organizării structurale a moleculelor. Citokinele superfamiliei FGF și IL-1 au un grad ridicat de omologie și o structură similară a proteinelor, ceea ce confirmă originea comună. Cu toate acestea, în ceea ce privește manifestările activității biologice, FGF diferă în multe privințe de agoniștii familiei IL-1. Familia de molecule IL-1 în prezent, pe lângă numele funcționale, are denumirile F1-F11, unde F1 corespunde IL-1α, F2 la IL-1β, F3 antagonistului receptorului IL-1, F4 la IL- 18. Restul membrilor familiei au fost descoperiți ca urmare a analizei genetice și au o omologie destul de mare cu molecule IL-1, cu toate acestea, funcțiile lor biologice nu au fost pe deplin elucidate. Alte grupe de citokine includ familiile IL-6 (liganzi ai subunității receptorului comun gp130), factorul de necroză tumorală și chemokine, care sunt reprezentate de cel mai mare număr de liganzi individuali și sunt enumerate integral în capitolele respective. Familia factorului de necroză tumorală se formează în principal pe baza asemănării în structura liganzilor și a receptorilor acestora, constând din trei subunități identice necovalent legate, care formează molecule biologic active. În același timp, în ceea ce privește proprietățile biologice, această familie include citokine cu activități destul de diferite. De exemplu, TNF este una dintre cele mai strălucitoare citokine proinflamatorii, ligandul Fas induce apoptoza celulelor țintă, iar ligandul CD40 oferă un semnal stimulant în timpul interacțiunii intercelulare a limfocitelor T și B. Astfel de diferențe în activitatea biologică a moleculelor similare din punct de vedere structural sunt determinate în primul rând de caracteristicile expresiei și structurii receptorilor lor, de exemplu, prezența sau absența unui domeniu intracelular de „moarte”, care determină apoptoza celulară. Familiile IL-10 și IL-12 din ultimii ani au fost, de asemenea, completate cu noi membri care au primit numere de serie ale interleukinelor. Acesta este urmat de un grup foarte complex de citokine, care sunt mediatori ai activității funcționale a limfocitelor T-helper. Includerea în acest grup se bazează pe două principii de bază: 1) aparținând citokinelor sintetizate de Th1 sau Th2, ceea ce determină dezvoltarea reacțiilor imunologice de tip predominant umoral sau celular, 2) prezența unei subunități de receptor comune - lanțul gamma a complexului receptorului IL-2. Dintre liganzii lanțului gamma, IL-4 a fost izolat suplimentar, care are și subunități de receptor comune cu IL-13, care determină în mare măsură activitatea biologică parțial suprapusă a acestor citokine. IL-7, care are o structură comună a receptorilor cu TSLP, a fost izolat în mod similar. Avantajele clasificării de mai sus sunt asociate cu luarea în considerare simultană a proprietăților biologice și biochimice ale citokinelor. Fezabilitatea acestei abordări este confirmată în prezent de descoperirea de noi citokine prin analiza genetică a genomului și căutarea unor gene similare din punct de vedere structural. Datorită acestei metode, familia interferonilor de tip I, IL-1, IL-10, IL-12, s-a extins semnificativ, a apărut o nouă familie de citokine analogice IL-17, formată deja din 6 membri. Aparent, în viitorul apropiat, apariția de noi citokine va avea loc mult mai lent, deoarece analiza genomului uman este aproape completă. Modificările sunt cel mai probabil posibile datorită clarificării variantelor interacțiunilor ligand-receptor și a proprietăților biologice, care vor permite clasificarea citokinelor să dobândească o formă finală.

Mecanisme de acțiune.

B. Receptorii citokinelor. Citokinele sunt substanțe de semnalizare hidrofilă, a căror acțiune este mediată de receptori specifici din exteriorul membranei plasmatice. Legarea citokinelor de receptor (1) conduce printr-un număr de etape intermediare (2-5) la activarea transcrierii anumitor gene (6). Receptorii citokinici înșiși nu posedă activitate de tirozin kinază (cu câteva excepții). După legarea de citokină (1), moleculele receptorului se asociază pentru a forma homodimeri. În plus, pot forma heterodimeri prin asociere cu proteinele de transfer de semnal [STP] sau pot stimula dimerizarea BPS-urilor (2). Receptorii citokinelor de clasa I se pot agrega cu trei tipuri de BPS: proteinele GP130, βc sau γc. Aceste proteine ​​auxiliare în sine nu sunt capabile să lege citokinele, dar efectuează transducția semnalului la tirozin kinaze (3). Același spectru de activitate biologică a multor citokine se explică prin faptul că diferiți complexe de citokine-receptori pot activa același BPS.

Ca exemplu de transducție a semnalului de la citokine, diagrama arată cum receptorul IL-6 (IL-6), după legarea la ligand (1), stimulează dimerizarea GP130 (2). Dimerul proteinei de membrană GP130 se leagă și activează tirozin kinaza citoplasmatică a familiei YK (kinazele Janus cu două situsuri active) (3). Janus kinazele fosforilează receptorii citokinici, BPS și diverse proteine ​​citoplasmatice, care efectuează transducția suplimentară a semnalului; de asemenea, fosforilează factorii de transcripție - traductoare de semnal și activatori ai transcripției [PSAT (STAT, din engleză transducers and activators of transcription)]. Aceste proteine ​​aparțin familiei BPS, care au un domeniu SH3 în structura lor care recunoaște reziduurile de fosfotirozină (vezi p. 372). Prin urmare, au proprietatea de a se asocia cu un receptor de citokine fosforilat. Dacă se produce apoi fosforilarea moleculei PSAT (4), factorul se transformă într-o formă activă și formează un dimer (5). După translocare în nucleu, dimerul, ca factor de transcripție, se leagă de promotorul (vezi p. 240) al genei inițiate și induce transcrierea acesteia (6). Unii receptori de citokine pot pierde domeniul de legare a ligandului extracelular datorită proteolizei. (nu este prezentat în diagramă). Domeniul intră în sânge, unde concurează pentru legarea cu o citokină, ceea ce reduce concentrația de citokine din sânge. Împreună, citokinele formează o rețea de reglare (cascadă de citokine) cu efect multifuncțional. Suprapunerea dintre citokine duce la faptul că sinergismul este observat în acțiunea multora dintre ele, iar unele citokine sunt antagoniști. Întreaga cascadă de citokine cu feedback complex poate fi adesea observată în organism.

Proprietățile citokinelor.

Proprietățile generale ale citokinelor, datorită cărora acești mediatori pot fi combinați într-un sistem de reglementare independent.

1. Citokinele sunt polipeptide sau proteine, adesea glicozilate, cele mai multe dintre ele au un MW de 5 până la 50 kDa. Moleculele biologic active ale citokinelor pot consta din una, două, trei sau mai multe subunități identice sau diferite.

2. Citokinele nu au specificitate antigenică a acțiunii biologice. Acestea afectează activitatea funcțională a celulelor implicate în reacțiile imunității înnăscute și dobândite. Cu toate acestea, acționând asupra limfocitelor T și B, citokinele sunt capabile să stimuleze procesele induse de antigen în sistemul imunitar.

3. Există trei opțiuni de expresie pentru genele citokinelor: a) expresie specifică etapei în anumite etape ale dezvoltării embrionare, b) expresie constitutivă pentru reglarea unui număr de funcții fiziologice normale, c) tip de expresie inductibil caracteristic majorității citokinelor. Într-adevăr, majoritatea citokinelor în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun nu sunt sintetizate de celule. Exprimarea genelor citokinelor începe ca răspuns la pătrunderea agenților patogeni în organism, iritația antigenică sau deteriorarea țesuturilor. Structurile moleculare asociate agentului patogen sunt printre cei mai puternici inductori ai sintezei citokinelor proinflamatorii. Pentru a declanșa sinteza citokinelor celulelor T, este necesară activarea celulelor de către un antigen specific cu participarea unui receptor de antigen al celulelor T.

4. Citokinele sunt sintetizate ca răspuns la stimulare pentru o perioadă scurtă de timp. Sinteza este terminată datorită unei varietăți de mecanisme de autoreglare, inclusiv o instabilitate crescută a ARN și datorită existenței feedback-urilor negative mediate de prostaglandine, hormoni corticosteroizi și alți factori.

5. Una și aceeași citokină poate fi produsă de diferite tipuri de celule ale corpului în diferite organe din punct de vedere al originii histogenetice.

6. Citokinele pot fi asociate cu membranele celulelor care le sintetizează, posedând sub formă de membrană un spectru complet de activitate biologică și manifestându-și acțiunea biologică în timpul contactului intercelular.

7. Efectele biologice ale citokinelor sunt mediate prin complexe specifice de receptori celulari care leagă citokinele cu afinitate foarte mare, iar citokinele individuale pot utiliza subunități de receptor comune. Receptorii citokinelor pot exista într-o formă solubilă, păstrând capacitatea de a lega liganzi.

8. Citokinele au acțiune biologică pleiotropă. Aceeași citokină poate acționa asupra multor tipuri de celule, provocând efecte diferite în funcție de tipul de celule țintă (Fig. 1). Acțiunea pleiotropă a citokinelor este asigurată de expresia receptorilor citokinici asupra tipurilor de celule de diferite origini și funcții și conducerea semnalului utilizând mai mulți mesageri intracelulari și factori de transcripție.

9. Citokinele se caracterizează prin interschimbabilitatea acțiunii biologice. Mai multe citokine diferite pot provoca același efect biologic sau au activitate similară. Citokinele induc sau suprimă sinteza lor, a altor citokine și a receptorilor acestora.

10. Ca răspuns la semnalul de activare, celulele sintetizează simultan mai multe citokine care participă la formarea rețelei de citokine. Efectele biologice în țesuturi și la nivelul corpului depind de prezența și concentrația altor citokine cu efecte sinergice, aditive sau opuse.

11. Citokinele pot influența proliferarea, diferențierea și activitatea funcțională a celulelor țintă.

12. Citokinele acționează asupra celulelor în diferite moduri: autocrine - asupra celulei sintetizând și secretând această citokină; paracrina - pe celulele situate în apropierea celulei producătoare, de exemplu, în centrul inflamației sau în organul limfoid; endocrin - la distanță de celulele oricărui organ și țesut după intrarea în circulație. În acest din urmă caz, acțiunea citokinelor seamănă cu cea a hormonilor (Fig. 2).

Orez. 1. Una și aceeași citokină poate fi produsă de diferite tipuri de celule din corp în diferite organe de origine histogenetică și acționează asupra multor tipuri de celule, provocând efecte diferite în funcție de tipul de celule țintă.

Orez. 2. Trei variante ale manifestării acțiunii biologice a citokinelor.

Aparent, formarea sistemului de reglare a citokinelor a avut loc evolutiv odată cu dezvoltarea organismelor multicelulare și s-a datorat necesității formării mediatorilor de interacțiune intercelulară, care pot include hormoni, neuropeptide, molecule de aderență și altele. În acest sens, citokinele sunt cel mai versatil sistem de reglare, întrucât sunt capabile să prezinte activitate biologică atât la distanță după secreția de către celula producătoare (local și sistemic), cât și în timpul contactului intercelular, fiind biologic active sub formă de membrană. Acesta este modul în care sistemul de citokine diferă de moleculele de aderență, care îndeplinesc funcții mai înguste doar atunci când celulele sunt în contact direct. În același timp, sistemul de citokine diferă de hormoni, care sunt sintetizați în principal de organe specializate și acționează după intrarea în sistemul de circulație.

Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului.

Rolul citokinelor în reglarea funcțiilor fiziologice ale corpului poate fi împărțit în 4 componente principale:

1. Reglarea embriogenezei, stabilirea și dezvoltarea organelor, incl. organele sistemului imunitar.

2. Reglarea anumitor funcții fiziologice normale.

3. Reglarea reacțiilor de apărare ale organismului la nivel local și sistemic.

4. Reglarea proceselor de regenerare a țesuturilor.

Exprimarea genelor citokinelor individuale are loc în anumite stadii ale dezvoltării embrionare. Factorul celulelor stem, factorii de creștere transformatori, citokinele din familia TNF și chemokinele reglează diferențierea și migrația diferitelor celule și stabilirea organelor sistemului imunitar. După aceasta, sinteza unor citokine poate să nu se reia, în timp ce altele continuă să regleze procesele fiziologice normale sau să participe la dezvoltarea reacțiilor de protecție.

În ciuda faptului că majoritatea citokinelor sunt mediatori inductibili tipici și în perioada postnatală nu sunt sintetizate de celule în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun, unele citokine nu intră sub această regulă. Ca urmare a expresiei constitutive a genelor, unele dintre ele sunt sintetizate constant și sunt în circulație în cantități suficient de mari, reglând proliferarea și diferențierea anumitor tipuri de celule de-a lungul vieții. Exemple ale acestui tip de reglare fiziologică a funcțiilor de către citokine pot fi un nivel constant ridicat de eritropoietină și unele LCR pentru a asigura hematopoieza. Reglarea reacțiilor de apărare ale organismului de către citokine are loc nu numai în cadrul sistemului imunitar, ci și prin organizarea reacțiilor de apărare la nivelul întregului organism prin reglarea aproape a tuturor aspectelor dezvoltării inflamației și a răspunsului imun. Această funcție, care este cea mai importantă pentru întregul sistem de citokine, este asociată cu două direcții principale ale acțiunii biologice a citokinelor - protecția împotriva agenților infecțioși și refacerea țesuturilor deteriorate. Citokinele reglementează în primul rând dezvoltarea reacțiilor locale de apărare în țesuturi cu participarea diferitelor tipuri de celule sanguine, endoteliu, țesut conjunctiv și epiteliu. Protecția la nivel local se dezvoltă prin formarea unei reacții inflamatorii tipice cu manifestările sale clasice: hiperemie, dezvoltarea edemului, apariția durerii și disfuncționalității. Sinteza citokinelor începe atunci când agenții patogeni intră în țesuturi sau este încălcată integritatea acestora, care de obicei se desfășoară în paralel. Producția de citokine este o parte integrantă a răspunsului celular asociat cu recunoașterea de către celule a seriei mielomonocitice a componentelor structurale similare ale diferiților agenți patogeni, numite modele moleculare asociate cu agenții patogeni. Exemple de astfel de structuri patogene sunt lipopolizaharidele bacteriilor gram-negative, peptidoglicanii microorganismelor gram-pozitive, flagelina sau ADN bogat în secvențe CpolyG, care este tipic pentru ADN-ul tuturor tipurilor de bacterii. Leucocitele exprimă receptorii corespunzători de recunoaștere a modelelor, numiți și receptori Toll-like (TLR), și specifici anumitor modele structurale ale microorganismelor. După interacțiunea microorganismelor sau a componentelor acestora cu TLR, se declanșează o cascadă de transducție a semnalului intracelular, ceea ce duce la o creștere a activității funcționale a leucocitelor și la exprimarea genelor citokinei.

Activarea TLR duce la sinteza a două grupuri principale de citokine: citokinele proinflamatorii și interferonii de tip I, în principal IFNα / β. și reglarea inflamației, inclusiv toate tipurile de leucocite, celule dendritice, limfocite T și B, celule NK, celule endoteliale și epiteliale, fibroblaste și altele. Aceasta oferă etape consistente în dezvoltarea răspunsului inflamator, care este principalul mecanism pentru punerea în aplicare a imunității înnăscute. În plus, celulele dendritice încep să sintetizeze citokinele din familia IL-12, stimulând diferențierea limfocitelor T ajutătoare, care servește ca un fel de punte către începutul dezvoltării reacțiilor imunitare specifice asociate cu recunoașterea structurilor antigenice specifice. de microorganisme.

Al doilea mecanism nu mai puțin important asociat cu sinteza IFN asigură implementarea protecției antivirale. Interferonii de tip I prezintă 4 proprietăți biologice principale:

1. Acțiune antivirală directă prin blocarea transcrierii.

2. Suprimarea proliferării celulare, necesară pentru a bloca răspândirea virusului.

3. Activarea funcțiilor celulelor NK care au capacitatea de a liza celulele corpului infectate cu virus.

4. Exprimarea îmbunătățită a moleculelor complexe de histocompatibilitate majoră de clasa I necesare pentru creșterea eficienței prezentării antigenelor virale de către celulele infectate la limfocitele T citotoxice. Acest lucru duce la activarea recunoașterii specifice a celulelor infectate cu virus de către limfocitele T - prima etapă a lizei celulelor țintă infectate cu virus.

Ca urmare, pe lângă acțiunea antivirală directă, sunt activate mecanismele atât ale imunității înnăscute (celule NK), cât și ale imunității dobândite (limfocite T). Acesta este un exemplu al modului în care o moleculă mică de citokine cu MM de 10 ori mai mică decât MM de molecule de anticorp este capabilă să activeze mecanisme complet diferite de reacții de apărare datorită tipului pleiotrop de acțiune biologică, care vizează îndeplinirea unui singur obiectiv - îndepărtarea virusului care are a intrat în corp.

La nivel tisular, citokinele sunt responsabile pentru dezvoltarea inflamației și apoi regenerarea țesuturilor. Odată cu dezvoltarea unei reacții inflamatorii sistemice (răspuns de fază acută), citokinele afectează aproape toate organele și sistemele corpului implicate în reglarea homeostaziei. Acțiunea citokinelor proinflamatorii asupra sistemului nervos central duce la scăderea poftei de mâncare și la modificarea întregului complex de reacții comportamentale. Oprirea temporară a căutării de alimente și reducerea activității sexuale este benefică în ceea ce privește economisirea energiei pentru o sarcină - combaterea agentului patogen invadator. Acest semnal este furnizat de citokine, deoarece intrarea lor în circulație înseamnă cu siguranță că apărarea locală nu a făcut față agentului patogen și este necesară activarea unui răspuns inflamator sistemic. Una dintre primele manifestări ale unei reacții inflamatorii sistemice asociate cu acțiunea citokinelor asupra centrului termoreglator al hipotalamusului este creșterea temperaturii corpului. O creștere a temperaturii este o reacție de protecție eficientă, deoarece la temperaturi ridicate scade capacitatea mai multor bacterii de a se reproduce, dar, dimpotrivă, crește proliferarea limfocitelor.

În ficat, sub influența citokinelor, crește sinteza proteinelor în fază acută și a componentelor sistemului complementului necesare combaterii agentului patogen, dar în același timp scade sinteza albuminei. Un alt exemplu de acțiune selectivă a citokinelor este schimbarea compoziției ionice a plasmei sanguine în timpul dezvoltării unei reacții inflamatorii sistemice. În același timp, există o scădere a nivelului de ioni de fier, dar o creștere a nivelului de ioni de zinc și este bine cunoscut faptul că privarea unei celule bacteriene de ioni de fier înseamnă reducerea potențialului său proliferativ (acțiunea lactoferinei este bazat pe acest lucru). Pe de altă parte, o creștere a nivelurilor de zinc este necesară pentru funcționarea normală a sistemului imunitar, în special, este necesară pentru formarea factorului timic seric activ biologic - unul dintre principalii hormoni timici care asigură diferențierea limfocitelor. Efectul citokinelor asupra sistemului hematopoietic este asociat cu o activare semnificativă a hematopoiezei. Este necesară o creștere a numărului de leucocite pentru completarea pierderii și creșterea numărului de celule, în principal granulocite neutrofile, în centrul inflamației purulente. Acțiunea asupra sistemului de coagulare a sângelui are ca scop îmbunătățirea coagulării, care este necesară pentru a opri sângerarea și pentru a bloca direct agentul patogen.

Astfel, odată cu dezvoltarea inflamației sistemice, citokinele prezintă un spectru imens de activități biologice și interferează cu activitatea aproape tuturor sistemelor corpului. Cu toate acestea, nici una dintre modificările care apar nu sunt aleatorii: toate acestea sunt necesare fie pentru activarea directă a reacțiilor de apărare, fie sunt benefice în ceea ce privește comutarea fluxurilor de energie pentru o singură sarcină - pentru a combate agentul patogen invadator. Sub formă de reglare a expresiei genelor individuale, schimbări hormonale și modificări ale reacțiilor comportamentale, citokinele asigură activarea și eficiența maximă a muncii acelor sisteme corporale care sunt necesare la un moment dat pentru dezvoltarea reacțiilor de protecție. La nivelul întregului organism, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea unei singure reacții de apărare. Citokinele servesc ca sistem de organizare care formează și reglează întregul complex al reacțiilor de apărare ale corpului în timpul introducerii agenților patogeni. Aparent, un astfel de sistem de reglementare a fost format evolutiv și aduce beneficii necondiționate pentru cel mai optim răspuns de protecție al unui macroorganism. Prin urmare, aparent, este imposibil să se limiteze conceptul de reacții de apărare doar la participarea mecanismelor nespecifice de rezistență și la un răspuns imun specific. Întregul corp și toate sistemele care la prima vedere nu au legătură cu menținerea imunității participă la o singură reacție de protecție.

Studii speciale de citokine.

Importanța citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihailova. Universitatea Medicală de Stat din Rusia, Centrul Științific de Stat de Coloproctologie, Moscova și Institutul de Cercetare de Stat pentru Biologici Foarte Puri, Sankt Petersburg, lucrează pentru a studia importanța citokinelor în patogeneza bolilor inflamatorii ale colonului la copii. Bolile inflamatorii cronice ale tractului gastro-intestinal ocupă în prezent unul dintre locurile principale în patologia sistemului digestiv la copii. O importanță deosebită este acordată bolilor inflamatorii ale colonului (IBD), a căror incidență crește constant în întreaga lume. Un curs lung, cu recidive frecvente și, în unele cazuri, fatale, cu apariția complicațiilor locale și sistemice - toate acestea determină un studiu aprofundat al patogeniei bolii în căutarea unor noi abordări ale tratamentului IBD. În ultimele decenii, incidența colitei ulcerative (UC) a fost de 510 cazuri pe an la 100 mii populație, cu boala Crohn (CD) 16 cazuri pe an la 100 mii populație. Ratele de prevalență în Rusia, în regiunea Moscovei, corespund cu datele europene medii, dar semnificativ mai mici decât în ​​țările scandinave, America, Israel și Anglia. Pentru NUC, prevalența este de 19,3 la 100 de mii, iar incidența este de 1,2 la 100 de mii de persoane pe an. Pentru CD, prevalența este de 3,0 la 100 de mii, iar incidența este de 0,2 la 100 de mii de persoane pe an. Faptul că cea mai mare frecvență a fost observată în țările foarte dezvoltate se datorează nu numai factorilor sociali și economici, ci și caracteristicilor genetice și imunologice ale pacienților, care determină predispoziția la IBD. Acești factori sunt fundamentali în teoria imunopatogenetică a originii IBD. Teoriile virale și / sau bacteriene explică doar debutul acut al bolii, iar cronizarea procesului se datorează atât predispoziției genetice, cât și caracteristicilor răspunsului imun, care sunt, de asemenea, determinate genetic. Trebuie remarcat faptul că IBTC este clasificat în prezent ca o boală cu predispoziție complexă eterogenă genetic. Au fost identificate mai mult de 15 gene candidate supuse din 2 grupuri (imunospecifice și imunoregulatoare), care cauzează predispoziție ereditară. Cel mai probabil, predispoziția este determinată de mai multe gene care determină natura reacțiilor imunologice și inflamatorii. Pe baza rezultatelor numeroaselor studii, se poate concluziona că cea mai probabilă localizare a genelor asociate cu dezvoltarea IBT sunt cromozomii 3, 7, 12 și 16. În prezent, se acordă multă atenție studiului caracteristicilor funcției limfocitelor T și B, precum și a citokinelor mediator al inflamației. Rolul interleukinelor (IL), al interferonilor (IFN), al factorului de necroză tumorală-a (TNF-a), al macrofagelor și autoanticorpilor la proteinele membranei mucoase ale intestinului gros și la microflora auto este în curs de studiu. Trăsăturile tulburărilor lor în CD și UC au fost dezvăluite, dar nu este încă clar dacă aceste modificări apar în principal sau în mod secundar. Pentru o înțelegere a multor aspecte ale patogenezei, ar fi foarte importante studiile efectuate în stadiul preclinic al IBT, precum și la rudele de gradul I. Printre mediatorii inflamației, un rol special revine citokinelor, care sunt un grup de molecule polipeptidice cu o masă de 5 până la 50 kDa, care participă la formarea și reglarea reacțiilor de apărare ale corpului. La nivelul corpului, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea reacțiilor de apărare. Clasificarea citokinelor este prezentată în tabelul 2. Majoritatea citokinelor nu sunt sintetizate de celule în afara răspunsului inflamator și a răspunsului imun. Exprimarea genelor citokinelor începe ca răspuns la pătrunderea agenților patogeni în organism, iritația antigenică sau deteriorarea țesuturilor. Unul dintre cei mai puternici inductori ai sintezei citokinelor sunt componentele pereților celulari bacterieni: LPS, peptidoglicanii și muramildipeptidele. Producătorii de citokine pro-inflamatorii sunt în principal monocite, macrofage, celule T etc. În funcție de efectul asupra procesului inflamator, citokinele sunt împărțite în două grupe: pro-inflamatorii (IL-1, IL-6, IL-8 , TNF-a, IFN-g) și antiinflamator (IL-4, IL-10, TGF-b). Interleukina-1 (IL-1) este un mediator imunoregulator eliberat în timpul reacțiilor inflamatorii, afectării țesuturilor și infecțiilor (citokină pro-inflamatorie). IL-1 joacă un rol important în activarea celulelor T atunci când acestea interacționează cu antigenul. Există 2 tipuri de IL-1: IL-1a și IL-1b, produse din două loci genetice diferite situate pe cromozomul 2 uman. IL-1a rămâne în interiorul celulei sau poate fi sub formă de membrană și apare în cantități mici în spațiul extracelular. Rolul formei de membrană a IL-1a este transmiterea semnalelor de activare de la macrofag la limfocite T și alte celule în timpul contactului intercelular. IL - 1a este principalul mediator cu rază scurtă de acțiune. IL-1b, spre deosebire de IL-1a, este secretat activ de celule, acționând atât sistemic, cât și local. Astăzi se știe că IL-1 este unul dintre principalii mediatori ai reacțiilor inflamatorii, stimulează proliferarea celulelor T, crește expresia receptorului IL-2 pe celulele T și producția lor de IL-2. IL-2 împreună cu antigenul induce activarea și aderența neutrofilelor, stimulează formarea altor citokine (IL-2, IL-3, IL-6 etc.) de către celulele T activate și fibroblaste, stimulează proliferarea fibroblastelor și celulele endoteliale. Sistemic, IL-1 acționează sinergic cu TNF-a și IL-6. Odată cu creșterea concentrației în sânge, IL-1 afectează celulele hipotalamusului și provoacă o creștere a temperaturii corpului, febră, somnolență, scăderea poftei de mâncare și, de asemenea, stimulează celulele hepatice să producă proteine ​​de fază acută (CRP, amiloid A, a-2 macroglobulină și fibrinogen). IL4 (cromozomul 5). Inhibă activarea macrofagelor și blochează multe dintre efectele stimulate de IFNg, cum ar fi producerea de IL1, oxid nitric și prostaglandine, joacă un rol important în reacțiile antiinflamatorii și are un efect imunosupresor. IL6 (cromozomul 7), una dintre principalele citokine proinflamatorii, este principalul inductor al etapei finale de diferențiere a celulelor B și a macrofagelor, un puternic stimulator al producției de proteine ​​de fază acută de către celulele hepatice. Una dintre funcțiile principale ale IL6 este de a stimula producția de anticorpi in vivo și in vitro. IL8 (cromozomul 4). Se referă la mediatori chemokine care cauzează migrația dirijată (chemotaxis) a leucocitelor către focarul inflamației. Funcția principală a IL10 este inhibarea producției de citokine de către Thelpers de tip I (TNFb, IFNg) și macrofage activate (TNF-a, IL1, IL12). Se recunoaște acum că tipurile de răspuns imun sunt asociate cu una dintre variantele de activare a limfocitelor cu participarea predominantă a clonelor de ajutoare ale limfocitelor T de primul tip (TH2) sau al doilea tip (TH3). Produsele TH2 și TH3 afectează negativ activarea clonelor opuse. Activarea excesivă a oricărui tip de clone Th poate direcționa răspunsul imun conform uneia dintre opțiunile de dezvoltare. Dezechilibrul cronic în activarea clonelor Th duce la dezvoltarea condițiilor imunopatologice. Modificările citokinelor din IBTD pot fi studiate în diferite moduri cu determinarea nivelului lor în sânge sau in situ. Nivelurile de IL1 sunt crescute în toate bolile inflamatorii intestinale. Diferențele dintre NNC și CD sunt în expresia crescută a IL2. Dacă un nivel scăzut sau normal de IL2 se găsește în NUC, atunci în CD, nivelul său crescut este detectat. Conținutul de IL4 crește în NUC, în timp ce în CD rămâne normal sau chiar scade. Nivelul IL6, care mediază reacțiile de fază acută, este, de asemenea, crescut în toate formele de inflamație. Datele obținute cu privire la profilul citokinelor au făcut posibilă sugerarea faptului că cele două forme principale de IBD cronică sunt caracterizate prin activarea și exprimarea diferită a citokinelor. Rezultatele studiilor indică faptul că profilul citokinei observat la pacienții cu UC este mai consistent cu profilul TH3, în timp ce profilul TH2 ar trebui considerat mai caracteristic pentru pacienții cu DC. Atractivitatea acestei ipoteze cu privire la rolul profilurilor TH2 și TH3 este, de asemenea, că utilizarea citokinelor poate modifica răspunsul imun într-o direcție sau alta și poate duce la remisie cu restabilirea echilibrului citokinelor. Acest lucru poate fi confirmat, în special, prin utilizarea IL10. Studii suplimentare ar trebui să arate dacă răspunsul citokinelor este un fenomen secundar ca răspuns la stimulare sau, dimpotrivă, expresia citokinelor corespunzătoare determină reactivitatea organismului cu dezvoltarea manifestărilor clinice ulterioare. Studiul nivelului de citokine în IBD la copii nu a fost încă efectuat. Această lucrare este prima parte a unui studiu științific dedicat studiului stării citokinelor în IBD la copii. Scopul acestei lucrări a fost studierea activității umorale a macrofagelor cu determinarea nivelurilor (IL1a, IL8) în sângele copiilor cu NUC și CD, precum și dinamica acestora în timpul terapiei. Din 2000 până în 2002, 34 de copii cu NUC și 19 copii cu CD cu vârsta cuprinsă între 4 și 16 ani au fost examinați în secția de gastroenterologie a Spitalului Clinic pentru Copii din Rusia. Diagnosticul a fost verificat anamnestic, endoscopic și morfologic. Studiul nivelurilor de citokine proinflamatorii IL1a, IL8 a fost realizat prin metoda testului imunosorbent legat de enzime (ELISA). Pentru a determina concentrația de IL1a, IL8, am folosit sisteme de testare fabricate de OOO Cytokin (St. Petersburg, Rusia). Analiza a fost efectuată în laboratorul de imunofarmacologie al Centrului Științific de Stat al Institutului de Cercetări pentru Biopreparări Extrem de Pure (șeful laboratorului, MD, Prof. AS Simbirtsev). Rezultatele obținute în cursul studiului au relevat o creștere semnificativă a nivelurilor de IL1a, IL8 în perioada de exacerbare, mai pronunțată la copiii cu NUC decât la copiii cu CD. Fără exacerbare, nivelurile citokinelor proinflamatorii scad, dar nu ating normele. În UC, nivelurile de IL-1a, IL-8 au crescut în perioada de exacerbare la 76,2% și la 90% dintre copii și în perioada de remisie - la 69,2%, respectiv 92,3%. În CD, nivelurile de IL-1a, IL-8 sunt crescute în perioada de exacerbare la 73,3% și la 86,6% dintre copii și în perioada de remisie - la 50% și, respectiv, 75%.

În funcție de gravitatea bolii, copiii au primit terapie cu aminosalicilați sau glucocorticoizi. Natura terapiei a influențat semnificativ dinamica nivelului de citokine. În timpul tratamentului cu aminosalicilați, nivelurile de citokine proinflamatorii în grupul de copii cu NUC și CD au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul de control. În același timp, s-au observat rate mai mari la grupul de copii cu UC. În NUC pe fondul terapiei cu aminosalicilat, IL1a, IL8 sunt crescute la 82,4% și respectiv 100% dintre copii, în timp ce în timpul terapiei cu glucocorticoizi la 60% dintre copii pentru ambele citokine. În CD, IL1a, IL8 sunt crescute în timpul tratamentului cu aminosalicilați la toți copiii și în timpul terapiei cu glucocorticoizi la 55,5% și, respectiv, 77,7% dintre copii. Astfel, rezultatele acestui studiu indică o implicare semnificativă a legăturii macrofage a sistemului imunitar în procesul patogenetic la majoritatea copiilor cu UC și CD. Datele obținute în acest studiu nu diferă în mod fundamental de datele obținute în timpul examinării pacienților adulți. Diferențele dintre nivelurile de IL1a și IL8 la pacienții cu UC și CD sunt cantitative, dar nu calitative, ceea ce sugerează o natură nespecifică a acestor modificări datorită cursului unui proces inflamator cronic. Prin urmare, acești indicatori nu au valoare diagnostic. Rezultatele unui studiu dinamic al nivelurilor de IL1a și IL8 confirmă eficiența mai mare a terapiei cu medicamente glucocorticoide în comparație cu terapia cu aminosalicili. Datele prezentate sunt rezultatul primei etape a studiului stării citokinelor la copiii cu IBT. Este necesar un studiu suplimentar al problemei, luând în considerare indicatorii altor citokine pro-inflamatorii și antiinflamatorii.

Rolul oxidului nitric și citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya studiază această problemă: Departamentul de Anestezie și Reanimatologie, Universitatea de Stat din Vladivostok. Sindromul de leziuni pulmonare acute (sindromul de detresă respiratorie pentru adulți, ARDS) este una dintre cele mai severe forme de insuficiență respiratorie acută care apare la pacienții cu traume severe, sepsis, peritonită, pancreatită, pierderi profunde de sânge, aspirație, după intervenții chirurgicale extinse și în 50 60% din cazuri sunt fatale. Datele de cercetare privind patogeneza ARDS, dezvoltarea criteriilor pentru diagnosticarea precoce și prognosticul sindromului sunt puține, destul de contradictorii, ceea ce nu permite dezvoltarea unui concept coerent de diagnostic și terapeutic. S-a constatat că ARDS se bazează pe deteriorarea endoteliului capilarelor pulmonare și a epiteliului alveolar, încălcarea proprietăților reologice ale sângelui, ducând la edem al țesutului interstițial și alveolar, inflamație, atelectazie, hipertensiune pulmonară. În literatura din ultimii ani, există suficiente informații despre regulatorul universal al metabolismului celular și tisular - oxidul azotic. Interesul pentru oxidul nitric (NO) se datorează în primul rând faptului că este implicat în reglarea multor funcții, inclusiv tonusul vascular, contractilitatea cardiacă, agregarea trombocitelor, neurotransmisia, sinteza ATP și proteine ​​și apărarea imunitară. În plus, în funcție de alegerea țintei moleculare și de caracteristicile interacțiunii cu aceasta, NO are, de asemenea, un efect dăunător. Se crede că mecanismul declanșator al activării celulare este citokinemia dezechilibrată. Citokinele sunt peptide solubile care acționează ca mediatori ai sistemului imunitar și oferă cooperare celulară, imunoreglare pozitivă și negativă. Am încercat să sistematizăm informațiile disponibile în literatura de specialitate cu privire la rolul NO și al citokinelor în dezvoltarea sindromului de leziuni pulmonare acute. NO este un gaz solubil în apă și grăsimi. Molecula sa este un radical liber instabil, se difuzează ușor în țesut, este absorbită și distrusă atât de repede încât nu poate afecta decât celulele mediului imediat. Molecula de NO are toate proprietățile inerente mesagerilor clasici: se produce rapid, acționează în concentrații foarte scăzute, după încetarea semnalului extern, se transformă rapid în alți compuși, oxidându-se în oxizi de azot anorganici stabili: nitriți și nitrați. Durata de viață a NO în țesut este, conform diferitelor surse, de la 5 la 30 de secunde. Principalele ținte moleculare ale NO sunt enzimele și proteinele care conțin fier: guanilat ciclază solubilă, nitrooxid sintază (NOS) propriu-zisă, hemoglobină, enzime mitocondriale, enzime ale ciclului Krebs, proteine ​​și sinteza ADN-ului. Sinteza NO în organism are loc prin transformări enzimatice ale părții conținând azot a aminoacidului L-arginină sub influența unei enzime specifice NOS și este mediată de interacțiunea ionilor de calciu cu calmodulina. Enzima este inactivată la concentrații scăzute și este activă maxim la 1 μM calciu liber. Au fost identificate două izoforme ale NOS: constitutive (cNOS) și induse (iNOS), care sunt produse de gene diferite. CNOS dependent de calciu-calmodulină este prezent în mod constant în celulă și promovează eliberarea unor cantități mici de NO ca răspuns la stimularea fizică și a receptorilor. NU, generat sub influența acestei izoforme, acționează ca purtător într-o serie de răspunsuri fiziologice. INOS independent de calciu-calmodulină se formează în diferite tipuri de celule ca răspuns la citokine pro-inflamatorii, endotoxine și oxidanți. Această izoformă NOS este transcrisă de gene specifice de pe cromozomul 17 și promovează sinteza unor cantități mari de NO. Enzima este, de asemenea, clasificată în trei tipuri: NOS-I (neuronal), NOS-II (macrofag), NOS-III (endotelial). Familia de enzime care sintetizează NO se găsește într-o varietate de celule pulmonare: în celulele epiteliale bronșice, în alveolocite, în macrofage alveolare, în mastocite, în celulele endoteliale ale arterelor și venelor bronșice, în miocitele netede ale bronhiilor și vaselor de sânge, în neuronii non-adrenergici non-colinergici. Capacitatea constitutivă a celulelor epiteliale ale bronhiilor și alveolelor oamenilor și mamiferelor de a secreta NO a fost confirmată în numeroase studii. S-a stabilit că părțile superioare ale căilor respiratorii umane, precum și părțile inferioare, sunt implicate în formarea NO. Studiile efectuate la pacienții cu traheostomie au arătat că cantitatea de gaz din aer expirată prin traheostomie este semnificativ mai mică decât în ​​cavitatea nazală și orală. Sinteza NO endogen la pacienții cu ventilație mecanică suferă semnificativ. Cercetările confirmă faptul că eliberarea NO are loc în momentul bronhodilatării și este controlată de sistemul nervos vag. S-au obținut date care arată că formarea NO în epiteliul căilor respiratorii umane crește în bolile inflamatorii ale sistemului respirator. Sinteza gazelor este crescută datorită activării NOS induse sub influența citokinelor, precum și a endotoxinelor și lipopolizaharidelor.

În prezent, sunt cunoscute mai mult de o sută de citokine, care sunt împărțite în mod tradițional în mai multe grupuri.

1. Interleukinele (IL-1 - IL18) - proteine ​​reglatoare secretoare care asigură interacțiuni mediator în sistemul imunitar și conexiunea acestuia cu alte sisteme ale corpului.

2. Interferoni (IFN-alfa, beta, gamma) - citokine antivirale cu efect imunoreglator pronunțat.

3. Factorii de necroză tumorală (TNF alfa, beta) sunt citokine cu efecte citotoxice și reglatoare.

4. Factori de stimulare a coloniei (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - stimulatori ai creșterii și diferențierii celulelor hematopoietice, reglând hematopoieza.

5. Chimiochine (IL-8, IL-16) - chimioatractori pentru leucocite.

6. Factori de creștere - regulatori de creștere, diferențiere și activitate funcțională a celulelor aparținând diferitelor țesuturi (factor de creștere a fibroblastelor, factor de creștere a celulelor endoteliale, factor de creștere epidermică) și factori de creștere transformatori (TGF beta).

Aceste molecule de bioreglare determină tipul și durata răspunsului inflamator și imun, controlează proliferarea celulară, hematopoieza, angiogeneza, vindecarea rănilor și multe alte procese. Toți cercetătorii subliniază că citokinele nu au specificitate pentru antigeni. Experimentele cu macrofage pulmonare cultivate și mastocite au arătat formarea iNOS ca răspuns la interferon gamma, interleukină-1, factor de necroză tumorală și lipopolizaharide. Expresia iNOS și cNOS pentru citokinele proinflamatorii a fost găsită în alveolocitele animale și umane. Adăugarea factorului de creștere epidermică, un regulator al funcției celulelor epiteliale la cultură, a redus activitatea numai a enzimei induse. Se știe că, în funcție de natură, citokinele acționează autocrin - asupra celulelor producătoare, paracrine - asupra altor celule țintă sau endocrine - asupra diferitelor celule din afara locului de producție. În același timp, pot interacționa între ei în conformitate cu un principiu agonist sau antagonist, schimbând starea funcțională a celulelor țintă și formând o rețea de citokine. Astfel, citokinele nu sunt peptide izolate, ci un sistem integral, ale cărui componente principale sunt celule producătoare, proteina însăși este o citokină, receptorul ei și o celulă țintă. S-a constatat că odată cu dezvoltarea leziunii pulmonare acute, nivelul citokinelor pro-inflamatorii crește: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Efectul lor este asociat cu vasodilatație, o creștere a permeabilității lor și acumularea de lichid în țesutul pulmonar. În plus, studiile au arătat capacitatea IFN gamma și TNF alfa de a induce expresia moleculelor de aderență - ICAM -1 pe endoteliocite umane. Moleculele de adeziune, care aderă la leucocite, trombocite și celule endoteliale, formează neutrofile „rulante” și promovează agregarea particulelor de fibrină. Aceste procese contribuie la încălcarea fluxului sanguin capilar, cresc permeabilitatea capilară și induc edem tisular local. Încetinirea fluxului sanguin capilar este promovată de activarea NO, care determină dilatarea arteriolelor. Migrația suplimentară a leucocitelor către focarul inflamației este controlată de citokine speciale - chemokine, care sunt produse și secretate nu numai de macrofagele activate, ci și de celulele endoteliale, fibroblaste, miocite netede. Funcția lor principală este de a furniza neutrofile focarului inflamator și de a le activa activitatea funcțională. Principala chimiochină pentru neutrofile este Il-8. Inductorii săi cei mai puternici sunt lipopolizaharidele bacteriene, IL-1 și TNFalpha. R. Bahra și colab. cred că fiecare etapă a migrației transendoteliale a neutrofilelor este reglată prin stimularea concentrațiilor de TNF alfa. Odată cu dezvoltarea leziunii pulmonare acute, endoteliocitele vasculare, celulele epiteliale bronșice și macrofagele alveolare sunt activate și sunt implicate în interacțiunile de fază. Ca rezultat, pe de o parte, apar mobilizarea lor și îmbunătățirea proprietăților protectoare și, pe de altă parte, este posibilă deteriorarea celulelor în sine și a țesuturilor înconjurătoare. O serie de studii au arătat că produsul reducerii parțiale a oxigenului, superoxidul, se poate acumula în focarul inflamației, ceea ce inactivează efectul vasoactiv al NO. NO și anionul superoxid reacționează rapid pentru a forma peroxinitrit care dăunează celulei. Această reacție promovează îndepărtarea NO din pereții vasculari și bronșici, precum și de pe suprafața alveolocitelor. Studiile care arată că considerat în mod tradițional ca un mediator al toxicității NO, peroxinitritul poate avea un efect fiziologic și poate induce relaxarea vasculară printr-o creștere mediată de NO a cGMP în endoteliul vascular este de interes. La rândul său, peroxinitritul este un oxidant puternic capabil să afecteze epiteliul alveolar și surfactantul pulmonar. Provoacă distrugerea proteinelor și lipidelor membranei, dăunează endoteliului, crește agregarea trombocitelor și participă la endotoxemie. Formarea sa crescută a fost observată în sindromul de leziuni pulmonare acute. Cercetătorii consideră că NO produs ca urmare a activării enzimei induse este destinat protecției nespecifice a organismului împotriva unei game largi de agenți patogeni, inhibă agregarea trombocitelor și îmbunătățește circulația sanguină locală. S-a constatat că o cantitate excesivă de NO suprimă activitatea cNOS din celule datorită interacțiunii cu superoxid și, eventual, ca urmare a desensibilizării guanilat ciclazei, ducând la o scădere a cGMP în celulă și la o creștere a calciului intracelular. . Brett și colab. și Kooy și colab., analizând importanța mecanismelor nitrooxidergice în patogeneza ARDS, au sugerat că iNOS, peroxinitritul și nitrotirozina, principalul produs al efectului peroxinitritului asupra proteinelor, pot juca un rol cheie în dezvoltarea sindromului. Cuthbertson și colab. cred că baza leziunii pulmonare acute este efectul NO și al peroxinitritului asupra elastazei și interleukinei-8. Kobayashi și colab. de asemenea, a înregistrat o creștere a conținutului de iNOS, interleukină-1, interleukină-6, interleukină-8 în lichidul bronhoalveolar la pacienții cu sindrom de leziuni pulmonare acute. Meldrum și colab. a arătat o scădere a producției de citokine inflamatorii de către macrofagele pulmonare în ARDS sub influența substratului producției locale de NO - L-arginină. S-a constatat că în geneza sindromului de leziuni pulmonare acute, un rol semnificativ îl joacă afectarea permeabilității vasculare cauzată de acțiunea citokinelor - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, anticorpi monoclonali împotriva limfocitelor CD3 pe celulele endoteliale vasculare ale plămânii și imunocitele. O creștere rapidă și puternică a permeabilității vaselor pulmonare duce la migrarea neutrofilelor în țesutul pulmonar și la eliberarea de către acestea a mediatorilor citotoxici, ceea ce conduce la dezvoltarea alterării pulmonare patologice. În timpul dezvoltării leziunilor pulmonare acute, TNF alfa crește aderența neutrofilelor la peretele vascular, îmbunătățește migrația acestora în țesuturi, promovează modificări structurale și metabolice ale endoteliocitelor, perturbă permeabilitatea membranelor celulare, activează formarea altor citokine și eicosanoide, și provoacă apoptoză și necroză a celulelor epiteliale pulmonare. Datele obținute indică faptul că apoptoza macrofagelor indusă de introducerea LPS este în mare parte asociată cu IFN gamma și este redusă prin acțiunea IL-4, IL-10, TGF beta. Cu toate acestea, Kobayashi și colab. date obținute care indică faptul că IFN gamma poate fi implicat în repararea epiteliului mucoasei tractului respirator. Studiile lui Hagimoto conțin informații despre faptul că celulele epiteliale ale bronhiilor și alveolelor ca răspuns la TNF alfa sau ligand Fas eliberează IL-8, IL-12. Acest proces este asociat cu activarea factorului nuclear Carr-B de către ligandul Fas.

Se crede că IL-8 este una dintre cele mai importante citokine din fiziopatologia leziunii pulmonare acute. Miller și colab. în studiul lichidului bronho-alveolar la pacienții cu ARDS pe fondul sesisului, s-a constatat o creștere semnificativă a nivelului de IL-8, comparativ cu pacienții cu edem pulmonar cardiogen. S-a sugerat că sursa primară a Il-8 sunt plămânii, iar acest criteriu poate fi utilizat în diagnosticul diferențial al sindromului. Grau și colab. cred că celulele endoteliale ale capilarelor pulmonare sunt o sursă importantă de citokine - IL-6, IL-8 în dezvoltarea leziunii pulmonare acute. Goodman și colab. Atunci când se studiază dinamica nivelului de citokine în lichidul de spălare bronho-alveolară la pacienții cu SDRA, o creștere semnificativă a IL-1beta, IL-8, peptidă chemotactică monocitară-1, activator neutrofil celular epitelial, peptidă inflamatorie macrofagă -1 s-a găsit alfa. În același timp, autorii consideră că o creștere a conținutului de IL-1 beta poate servi drept marker al unui rezultat nefavorabil al sindromului. Bauer și colab. s-a demonstrat că controlul asupra conținutului de IL-8 în lichidul bronhoalveolar la pacienții cu SDRA poate fi utilizat pentru monitorizare, o scădere a nivelului de IL-8 indică un curs nefavorabil al procesului. O serie de studii conțin, de asemenea, informații că nivelul producției de citokine de către endoteliul vascular al plămânilor afectează dezvoltarea leziunii pulmonare acute și controlul căruia poate fi utilizat în practica clinică pentru diagnosticarea precoce. Posibilele consecințe negative ale creșterii nivelului de citokine proinflamatorii la pacienții cu SDRA sunt evidențiate de studiile lui Martin și colab., Warner și colab. Macrofagele alveolare activate de citokine și endotoxinele bacteriene cresc sinteza NO. Crește și nivelul producției de NO de către celulele epiteliale bronșice și alveolare, neutrofile, mastocite, celule endoteliale și miocitele netede ale vaselor pulmonare, probabil prin activarea factorului nuclear Carr-B. Autorii cred că oxidul nitric produs ca urmare a activării NOS induse este destinat în primul rând apărării nespecifice a corpului. Eliberat din macrofage, NO pătrunde rapid în bacterii și ciuperci, unde inhibă trei grupuri vitale de enzime: transportul electronilor H, ciclul Krebs și sinteza ADN-ului. NU este implicat în apărarea organismului în ultimele etape ale răspunsului imun și este considerat figurativ ca „sabia pedepsitoare” a sistemului imunitar. Cu toate acestea, acumularea în celulă în cantități inadecvate de mari, NO are, de asemenea, un efect dăunător. Astfel, odată cu dezvoltarea sindromului leziunii pulmonare acute, citokinele și NO declanșează un lanț secvențial de reacții care se exprimă în microcirculație afectată, hipoxie tisulară, edem alveolar și interstițial și afectarea funcției metabolice a plămânilor. Prin urmare, se poate afirma că studiul mecanismelor fiziologice și fiziopatologice ale acțiunii citokinelor și NO este un domeniu promițător pentru cercetare și va permite în viitor nu numai extinderea înțelegerii patogeniei ARDS, ci și determinarea markeri diagnostici și prognostici ai sindromului, pentru a dezvolta opțiuni pentru terapia bazată pe patogenetic care vizează reducerea letalității.

Metode de determinare a citokinelor.

Revizuirea este dedicată principalelor metode pentru studiul citokinelor utilizate în prezent. Posibilitățile și scopul metodelor sunt descrise pe scurt. Sunt prezentate avantajele și dezavantajele diferitelor abordări ale analizei expresiei genelor citokinelor la nivelul acizilor nucleici și la nivelul producției de proteine. (Citokine și inflamație. 2005. T. 4, nr. 1. S. 22-27.)

Citokinele sunt proteine ​​reglatoare care formează o rețea universală de mediatori, caracteristică atât sistemului imunitar, cât și celulelor altor organe și țesuturi. Toate evenimentele celulare au loc sub controlul acestei clase de proteine ​​reglatoare: proliferarea, diferențierea, apoptoza și activitatea funcțională specializată a celulelor. Efectele fiecărei citokine asupra celulelor se caracterizează prin pleiotropie, spectrul efectelor diferiților mediatori se suprapune și, în general, starea funcțională finală a celulei depinde de influența mai multor citokine care acționează sinergic. Astfel, sistemul de citokine este o rețea universală, polimorfă de reglare a mediatorilor concepută pentru a controla procesele de proliferare, diferențiere, apoptoză și activitate funcțională a elementelor celulare din sistemele hematopoietice, imune și alte sisteme homeostatice ale corpului. Metodele de determinare a citokinelor au suferit o evoluție foarte rapidă de-a lungul a 20 de ani de studiu intensiv și reprezintă astăzi o întreagă zonă de cunoștințe științifice. Cercetătorii în citokineologie la începutul activității lor se confruntă cu problema alegerii unei metode. Și aici cercetătorul trebuie să știe exact ce informații trebuie să obțină pentru a atinge obiectivul stabilit. În prezent, au fost dezvoltate sute de metode diferite de evaluare a sistemului citokinelor, care furnizează diverse informații despre acest sistem. Evaluarea citokinelor în diferite medii biologice se poate baza pe activitatea biologică specifică. Ele pot fi cuantificate folosind o varietate de metode de imunoanaliză folosind anticorpi poli și monoclonali. În plus față de studierea formelor secretoare ale citokinelor, este posibil să se studieze conținutul și producția intracelulară a acestora în țesuturi prin citometrie în flux, Western blot și imunohistochimie in situ. Informații foarte importante pot fi obținute prin studierea expresiei mRNA citokinei, a stabilității mARN, a prezenței izoformelor mRNA citokinei, a secvențelor naturale de nucleotide antisens. Studiul variantelor alelice ale genelor citokinei poate furniza informații importante despre producția programată genetic, mare sau scăzută, a unuia sau a altui mediator. Fiecare metodă are propriile sale dezavantaje și avantaje, propria rezoluție și precizie de determinare. Necunoașterea și neînțelegerea cercetătorului cu privire la aceste nuanțe îl pot duce la concluzii false.

Determinarea activității biologice a citokinelor.

Istoria descoperirii și primii pași în studiul citokinelor au fost strâns legate de cultivarea celulelor imunocompetente și a liniilor celulare. Apoi s-au arătat efectele reglatoare (activitatea biologică) a unui număr de factori solubili de natură proteică asupra activității proliferative a limfocitelor, asupra sintezei imunoglobulinelor, asupra dezvoltării răspunsurilor imune în modelele in vitro. Una dintre primele metode pentru determinarea activității biologice a mediatorilor este determinarea factorului de migrare a limfocitelor umane și a factorului de inhibare a acestuia. Deoarece efectele biologice ale citokinelor au fost studiate, au apărut diferite metode de evaluare a activității lor biologice. Astfel, IL-1 a fost determinată prin evaluarea proliferării timocitelor murine in vitro, IL-2 - prin capacitatea de a stimula activitatea proliferativă a limfoblastelor, IL-3 - prin creșterea coloniilor hematopoietice in vitro, IL-4 - prin efectul comitogen, prin expresia crescută a proteinelor Ia, prin inducerea formării IgG1 și IgE etc. Lista acestor metode poate fi continuată, este actualizată constant pe măsură ce sunt descoperite noi activități biologice ale factorilor solubili. Principalul lor dezavantaj sunt metodele nestandardizate, imposibilitatea unificării lor. Dezvoltarea ulterioară a metodelor pentru determinarea activității biologice a citokinelor a dus la crearea unui număr mare de linii celulare sensibile la una sau alta citokină sau linii multisensibile. Majoritatea acestor celule sensibile la citokine pot fi găsite acum pe listele comerciale de linii celulare. De exemplu, pentru testarea IL-1a și b, se utilizează linia celulară D10S, pentru IL-2 și IL-15, linia celulară CTLL-2, pentru IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 , IL-13, GM-CSF - linia celulară TF-1, pentru IL-6 - linia celulară B9, pentru IL-7 - linia celulară 2E8, pentru TNFa și TNFb - linia celulară L929, pentru IFNg - linia celulară WiDr, pentru IL-18 - linia de linie celulară KG-1. Cu toate acestea, această abordare a studiului proteinelor imunoactive, împreună cu avantaje bine cunoscute, cum ar fi măsurarea activității biologice reale a proteinelor mature și active, reproductibilitate ridicată în condiții standardizate, are dezavantajele sale. Acestea includ, în primul rând, sensibilitatea liniilor celulare nu la o citokină, ci la mai multe citokine înrudite, ale căror efecte biologice se suprapun. În plus, nu poate fi exclusă posibilitatea inducerii producției de alte citokine de către celulele țintă, care poate distorsiona parametrul testat (de regulă, proliferarea, citotoxicitatea, chimiotaxia). Nu cunoaștem încă toate citokinele și nu toate efectele lor, prin urmare, nu evaluăm citokina în sine, ci activitatea biologică specifică totală. Astfel, evaluarea activității biologice ca activitate totală a diferiților mediatori (lipsa de specificitate) este unul dintre dezavantajele acestei metode. În plus, folosind linii sensibile la citokine, este imposibil să se identifice moleculele inactivate și proteinele asociate. Aceasta înseamnă că astfel de metode nu reflectă producția efectivă pentru un număr de citokine. Un alt dezavantaj important al utilizării liniilor celulare este necesitatea unui laborator pentru cultura celulară. În plus, toate procedurile pentru creșterea celulelor, incubarea acestora cu proteinele și mediile studiate sunt consumatoare de timp. De asemenea, trebuie remarcat faptul că utilizarea pe termen lung a liniilor celulare necesită reînnoire sau recertificare, deoarece, ca rezultat al cultivării, acestea pot muta și modifica, ceea ce poate duce la o schimbare a sensibilității lor la mediatori și la o scădere a preciziei determinând activitatea biologică. Cu toate acestea, această metodă este ideală pentru testarea activității biologice specifice mediatorilor recombinați.

Cuantificarea citokinelor folosind anticorpi.

Citokinele produse de imunocompetente și alte tipuri de celule sunt eliberate în spațiul extracelular pentru interacțiuni de semnalizare paracrină și autocrină. Prin concentrația acestor proteine ​​în serul sanguin sau într-un mediu condiționat, se poate judeca natura procesului patologic și excesul sau lipsa anumitor funcții celulare la pacient. Metodele de determinare a citokinelor folosind anticorpi specifici sunt astăzi cele mai comune sisteme de detectare a acestor proteine. Aceste metode au trecut printr-o serie întreagă de modificări folosind diferite etichete (radioizotop, fluorescent, electrochiluminiscent, enzimă etc.). Dacă metodele radioizotopice au o serie de dezavantaje asociate cu utilizarea unei etichete radioactive și posibilitatea limitată a timpului de utilizare a reactivilor marcați (timpul de înjumătățire), atunci metodele imunosorbente legate de enzime au găsit o utilizare pe scară largă. Ele se bazează pe vizualizarea produselor insolubile ale unei reacții enzimatice, absorbind lumina cu o lungime de undă cunoscută, în cantități echivalente cu concentrația analitului. Pentru a lega substanțele care trebuie măsurate, se folosesc anticorpi aplicați pe o bază solidă de polimer, iar pentru vizualizare se folosesc anticorpi conjugați cu enzime, de obicei fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean. Avantajele metodei sunt evidente: precizie ridicată a determinării în condiții de depozitare standardizate pentru reactivi și proceduri, analiză cantitativă și reproductibilitate. Dezavantajele includ o gamă limitată de concentrații determinate, ca urmare a căreia toate concentrațiile care depășesc un anumit prag sunt considerate egale cu acesta. Trebuie remarcat faptul că timpul necesar pentru finalizarea metodei variază în funcție de recomandările producătorului. Cu toate acestea, în orice caz, vorbim despre câteva ore necesare pentru incubații și spălări cu reactivi. În plus, se determină formele latente și legate de citokine, care în concentrația lor pot depăși semnificativ formele libere, responsabile în principal de activitatea biologică a mediatorului. Prin urmare, este de dorit să se utilizeze această metodă împreună cu metodele de evaluare a activității biologice a mediatorului. O altă modificare a metodei de imunotest care a găsit o aplicare largă este metoda electrochiluminiscenței (ECL) pentru determinarea proteinelor cu anticorpi etichetați cu ruteniu și biotină. Această metodă are următoarele avantaje față de radioizotopul și imunoanaliza enzimatică: ușurință în implementare, timp scurt pentru finalizarea metodei, fără proceduri de spălare, volum mic de probă, o gamă largă de concentrații determinate de citokine în ser și într-un mediu condiționat, sensibilitate ridicată a metoda și reproductibilitatea acesteia. Metoda luată în considerare este acceptabilă pentru utilizare atât în ​​cercetarea științifică, cât și în studiile clinice. Următoarea metodă de evaluare a citokinelor în mediul biologic este dezvoltată pe baza tehnologiei fluorimetriei în flux. Vă permite să evaluați simultan până la sute de proteine ​​dintr-o probă. În prezent, au fost create truse comerciale pentru determinarea a până la 17 citokine. Cu toate acestea, avantajele acestei metode determină și dezavantajele acesteia. În primul rând, aceasta este laboriozitatea selecției condițiilor optime pentru determinarea mai multor proteine ​​și, în al doilea rând, producția de citokine este de natură în cascadă, cu vârfuri de producție în momente diferite. Prin urmare, determinarea unui număr mare de proteine ​​simultan nu este întotdeauna informativă. Cerința generală pentru metodele de imunoanaliză folosind așa-numitul. „sandwich”, este o selecție atentă a unei perechi de anticorpi, permițând determinarea formei libere sau legate a proteinei analizate, care impune limitări acestei metode și care trebuie întotdeauna luată în considerare la interpretarea datelor obținute. Aceste metode determină producția totală de citokine de către diferite celule, în același timp, este posibil să se judece producția specifică de antigen a citokinelor de către celulele imunocompetente numai ipotetic. În prezent, a fost dezvoltat sistemul ELISpot (Enzime-Liked ImmunoSpot), care elimină în mare măsură aceste dezavantaje. Metoda face posibilă evaluarea semi-cantitativă a producției de citokine la nivelul celulelor individuale. Rezoluția ridicată a acestei metode permite evaluarea producției de citokine stimulate de antigen, ceea ce este foarte important pentru evaluarea unui răspuns imun specific. Următoarea metodă, utilizată pe scară largă în scopuri științifice, este determinarea intracelulară a citokinelor prin citometrie în flux. Avantajele sale sunt evidente. Putem caracteriza fenotipic populația de celule producătoare de citokine și / sau determina spectrul de citokine produse de celule individuale, cu posibilitatea unei caracterizări cantitative relative a acestei producții. În același timp, metoda descrisă este destul de complicată și necesită echipamente costisitoare. Următoarea serie de metode, care sunt utilizate în principal în scopuri științifice, sunt metode imunohistochimice care utilizează anticorpi monoclonali marcați. Avantajele sunt evidente - determinarea producției de citokine direct în țesuturi (in situ), unde au loc diferite reacții imunologice. Cu toate acestea, metodele luate în considerare sunt foarte laborioase și nu oferă date cantitative exacte.

Determinarea citokinelor prin test imunoenzimatic.

Vector-Best CJSC sub conducerea T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov lucrează activ la determinarea citokinelor. Citokinele sunt un grup de mediatori polipeptidici, adesea glicozilați, cu o greutate moleculară de 8 până la 80 kDa. Citokinele sunt implicate în formarea și reglarea reacțiilor de apărare și a homeostaziei organismului. Sunt implicați în toate părțile răspunsului imun umoral și celular, inclusiv diferențierea celulelor progenitoare imunocompetente, prezentarea antigenului, activarea și proliferarea celulară, expresia moleculelor de aderență și răspunsul de fază acută. Unele dintre ele sunt capabile să prezinte multe efecte biologice asupra diferitelor celule țintă. Acțiunea citokinelor asupra celulelor se realizează în următoarele moduri: autocrină - asupra celulei sintetizând și secretând această citokină; paracrina - pe celulele situate în apropierea celulei producătoare, de exemplu, în centrul inflamației sau în organul limfoid; endocrin-de la distanță - pe celulele oricăror organe și țesuturi după ce citokina intră în circulația sângelui. Formarea și eliberarea citokinelor este de obicei de scurtă durată și bine reglată. Citokinele acționează asupra celulei prin legarea la receptori specifici de pe membrana citoplasmatică, provocând astfel o cascadă de reacții care conduc la inducerea, îmbunătățirea sau suprimarea activității unui număr de gene reglementate de acestea. Citokinele se caracterizează printr-o natură complexă a funcționării în rețea, în care producerea uneia dintre ele afectează formarea sau manifestarea activității unui număr de altele. Citokinele sunt mediatori locali, prin urmare, se recomandă măsurarea nivelurilor acestora în țesuturile corespunzătoare după extragerea proteinelor tisulare din biopsiile organelor corespunzătoare sau din fluidele naturale: urină, lichid lacrimal, lichid gingival de buzunar, spălare bronhoalveolară, secreții vaginale, ejaculare , spălări din cavități, măduva spinării sau lichide sinoviale etc. Informații suplimentare despre starea sistemului imunitar al organismului pot fi obținute prin studierea capacității celulelor sanguine de a produce citokine in vitro. Nivelurile de citokine plasmatice reflectă starea actuală a sistemului imunitar și dezvoltarea răspunsurilor de apărare in vivo. Producția spontană de citokine de către cultura celulelor mononucleare din sângele periferic face posibilă evaluarea stării celulelor corespunzătoare. Producția spontană crescută de citokine indică faptul că celulele sunt deja activate de antigen in vivo. Producția indusă de citokine face posibilă evaluarea capacității potențiale a celulelor corespunzătoare de a răspunde la stimularea antigenică. Inducerea redusă a citokinelor in vitro, de exemplu, poate servi ca unul dintre semnele unei stări de imunodeficiență. Prin urmare, ambele opțiuni pentru studierea nivelurilor de citokine atât în ​​sângele circulant, cât și în timpul producției lor de către culturi celulare sunt importante din punct de vedere al caracterizării imunoreactivității întregului organism și a funcției legăturilor individuale ale sistemului imunitar. Până de curând, în Rusia, câteva grupuri de cercetători erau implicați în studiul citokinelor, deoarece metodele de cercetare biologică consumă foarte mult timp, iar kiturile imunochimice importate sunt foarte scumpe. Odată cu apariția truselor imunosorbente domestice legate de enzime, medicii practicanți arată un interes tot mai mare în studierea profilului citokinelor. În acest moment, semnificația diagnostic a evaluării nivelului de citokine este de a preciza chiar faptul că crește sau scade concentrația acestora la un anumit pacient cu o boală specifică. Mai mult, pentru a evalua severitatea și a prezice evoluția bolii, este recomandabil să se determine concentrația citokinelor anti- și pro-inflamatorii în dinamica dezvoltării patologiei. De exemplu, conținutul de citokine din sângele periferic este determinat de momentul exacerbării, reflectă dinamica procesului patologic în boala ulcerului peptic și a altor boli ale tractului gastro-intestinal. În primele etape ale exacerbării, prevalează o creștere a conținutului de interleukină-1beta (IL-1beta), interleukină-8 (IL-8), apoi concentrația interleukinei-6 (IL-6), gamma-interferon (gamma -INF), factorul de necroză tumorală crește -alfa (alfa-TNF). Concentrația de interleukină-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF a atins maximul la înălțimea bolii, în timp ce conținutul markerilor fazei acute în această perioadă s-a apropiat de valorile normale. La vârful exacerbării, nivelul de alfa-TNF a depășit semnificativ conținutul de interleukină-4 (IL-4) atât în ​​serul sanguin, cât și direct în țesutul afectat al zonei peri-ulcer, după care a început treptat scădea. Pe măsură ce fenomenele de fază acută s-au diminuat și procesele de reparații s-au intensificat, concentrația IL-4 a crescut. Modificări ale profilului citokinelor pot fi utilizate pentru a evalua eficacitatea și fezabilitatea chimioterapiei. La efectuarea terapiei cu citokine, de exemplu, în timpul terapiei cu alfa-interferon (alfa-IFN), este necesar să se controleze atât nivelul conținutului său în sângele circulant, cât și producția de anticorpi împotriva alfa-IFN. Se știe că atunci când se produc un număr mare din acești anticorpi, terapia cu interferon nu numai că încetează să fie eficientă, dar poate duce și la boli autoimune. Recent, au fost dezvoltate și introduse în practică noi medicamente, care într-un fel sau altul modifică statutul de citokine al organismului. De exemplu, pentru tratamentul artritei reumatoide, este propus un medicament bazat pe anticorpi împotriva alfa-TNF, conceput pentru a elimina alfa-TNF, care este implicat în distrugerea țesutului conjunctiv. Cu toate acestea, conform datelor noastre și ale literaturii, nu toți pacienții cu poliartrită reumatoidă cronică au un nivel crescut de TNF-alfa, prin urmare, pentru acest grup de pacienți, o scădere a nivelului de TNF-alfa poate agrava și mai mult dezechilibrul sistemul imunitar. Astfel, terapia corectă cu citokine presupune controlul stării de citokine a organismului în timpul tratamentului. Rolul protector al citokinelor pro-inflamatorii se manifestă local, în centrul inflamației, dar producția lor sistemică nu duce la dezvoltarea imunității antiinfecțioase și nu împiedică dezvoltarea șocului bacterian-toxic, care este cauza mortalitate precoce la pacienții chirurgicali cu complicații purulente-septice. Baza patogeniei infecțiilor chirurgicale este inițierea cascadei de citokine, care include, pe de o parte, citokine pro-inflamatorii și, pe de altă parte, antiinflamatoare. Echilibrul dintre aceste două grupuri opuse determină în mare măsură natura cursului și rezultatul bolilor purulente-septice. Cu toate acestea, determinarea concentrației în sânge pentru o citokină din aceste grupuri (de exemplu, alfa-TNF sau IL-4) nu va reflecta în mod adecvat starea întregului echilibru de citokine. Prin urmare, este necesară o evaluare într-o etapă a nivelului mai multor mediatori (cel puțin 2-3 din subgrupurile opuse). În prezent, CJSC „Vector-Best” a dezvoltat și a produs serial kituri de reactivi pentru determinarea cantitativă a: factorului de necroză tumorală-alfa (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interferon gamma (sensibilitate - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukină-4 (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); interleukina-8 (sensibilitate - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); antagonist al receptorilor interleukinei-1 (IL-1RA) (sensibilitate - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); interferon alfa (sensibilitate - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); anticorpi autoimuni la alfa-interferon (sensibilitate - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Toate trusele sunt concepute pentru a determina concentrația acestor citokine în fluidele biologice umane, în supernatante de cultură atunci când se studiază capacitatea culturilor de celule umane de a produce citokine in vitro. Principiul analizei este o variantă „sandwich” a unei faze solide în trei etape (timp de incubație - 4 h) sau în două etape (timp de incubare - 3,5 h) test imunosorbent enzimatic legat pe plăci. Testul necesită 100 pl de lichid biologic sau supernatant de cultură per godeu. Contabilitatea rezultatelor - spectrofotometric la o lungime de undă de 450 nm. În toate kiturile, cromogenul este tetrametilbenzidina. Perioada de valabilitate a kiturilor noastre a fost prelungită la 18 luni de la data emiterii și la 1 lună de la începutul utilizării. Analiza datelor din literatura de specialitate a arătat că conținutul de citokine din plasma sanguină a persoanelor sănătoase depinde atât de trusele utilizate pentru a le determina, cât și de regiunea în care trăiesc acești oameni. Prin urmare, pentru a afla valorile concentrațiilor normale de citokine la rezidenții din regiunea noastră, am analizat probe aleatorii de plasmă (de la 80 la 400 de probe) de donatori de sânge practic sănătoși, reprezentanți ai diferitelor grupuri sociale cu vârste cuprinse între 18 și 60 de ani, fără clinici. manifestări ale patologiei somatice brute și absența anticorpilor HBsAg. împotriva virusurilor HIV, hepatitei B și C.

Factor de necroză tumorală-alfa.

TNF-alfa este o citokină pro-inflamatorie pleiotropă formată din două lanțuri b alungite cu o greutate moleculară de 17 kDa și care îndeplinesc funcții de reglare și efectoare în răspunsul imun și inflamație. Principalii producători de alfa-TNF sunt monocitele și macrofagele. Această citokină este secretată și de limfocitele și granulocitele din sânge, de celulele naturale ucigașe și de liniile de celule limfocitare T. Principalii inductori ai alfa-TNF sunt virușii, microorganismele și produsele metabolismului lor, inclusiv lipopolizaharida bacteriană. În plus, unele citokine, cum ar fi IL-1, IL-2, factorul de stimulare a coloniei de granulocite-macrofage, alfa și beta-INF, pot juca, de asemenea, rolul de inductori. Principalele direcții ale activității biologice a alfa-TNF: prezintă citotoxicitate selectivă în raport cu unele celule tumorale; activează granulocite, macrofage, celule endoteliale, hepatocite (producerea de proteine ​​de fază acută), osteoclaste și condrocite (resorbția țesutului osos și cartilajal), sinteza altor citokine pro-inflamatorii; stimulează proliferarea și diferențierea: neutrofile, fibroblaste, celule endoteliale (angiogeneză), celule hematopoietice, limfocite T și B; îmbunătățește fluxul de neutrofile din măduva osoasă în sânge; are activitate antitumorală și antivirală in vivo și in vitro; participă nu numai la reacțiile de apărare, ci și la procesele de distrugere și reparare care însoțesc inflamația; servește ca unul dintre mediatorii distrugerii țesuturilor, care este comună în inflamațiile cronice prelungite.

Orez. 1. Distribuția nivelului de alfa-TNF

în plasma donatorilor sănătoși.

Un nivel crescut de alfa-TNF se observă în serul sanguin în timpul stării post-traumatice, cu disfuncții pulmonare, încălcări ale cursului normal al sarcinii, cancer, astm bronșic. Nivelul alfa-TNF este de 5-10 ori mai mare decât norma în timpul exacerbării formei cronice a hepatitei virale C. În perioada de exacerbare a bolilor tractului gastro-intestinal, concentrația de alfa-TNF în ser depășește norma în medie de 10 ori, iar la unii pacienți - 75–80 de ori. Concentrații mari de alfa-TNF se găsesc în lichidul cefalorahidian la pacienții cu scleroză multiplă și meningită cerebrospinală și la pacienții cu poliartrită reumatoidă - în lichidul sinovial. Acest lucru sugerează implicarea TNF alfa în patogeneza unui număr de boli autoimune. Frecvența detectării alfa-TNF în serul sanguin, chiar și cu inflamație severă, nu depășește 50%, cu producție indusă și spontană - până la 100%. Gama de concentrații de alfa-TNF a fost 0-6 pg / ml, media - 1,5 pg / ml (Fig. 1).

Interferon gamma.

Orez. 2. Distribuția nivelurilor de IFN-gamma

în plasma donatorilor sănătoși.

Interleukina-4

IL-4 este o glicoproteină cu o greutate moleculară de 18-20 kDa, un inhibitor natural al inflamației. Împreună cu IFN-gamma, IL-4 este o citokină cheie produsă de celulele T (în principal limfocite TH-2). Suportă echilibrul TH-1 / TH-2. Principalele direcții ale activității biologice a IL-4: ameliorează eozinofilia, acumularea de mastocite, secreția de IgG4, răspuns imun umoral mediat de TH-2; are activitate antitumorală locală, stimulând populația de limfocite T citotoxice și infiltrarea tumorii cu eozinofile; inhibă eliberarea citokinelor inflamatorii (alfa-TNF, IL-1, IL-8) și a prostaglandinelor din monocitele activate, producerea de citokine de către limfocitele TH-1 (IL-2, gamma-INF etc.).

Orez. 3. Distribuția nivelului de IL-4 în plasmă

donatori sănătoși.

Un nivel crescut de IL-4 atât în ​​ser, cât și în limfocitele stimulate poate fi observat în bolile alergice (în special în momentul exacerbării), cum ar fi astmul bronșic, rinita alergică, febra fânului, dermatita atopică, în bolile tractului gastro-intestinal. Nivelul IL-4 este, de asemenea, semnificativ crescut la pacienții cu hepatită cronică C (CHC). În perioadele de exacerbare a CHC, cantitatea sa crește de aproape 3 ori comparativ cu norma, iar în timpul remisiei CHC, nivelul IL-4 scade, în special pe fondul tratamentului cu IL-2 recombinant. Gama de concentrații de IL-4 a fost de 0-162 pg / ml, media a fost de 6,9 ​​pg / ml, intervalul normal a fost de 0-20 pg / ml (Fig. 3).

Interleukina-8

IL-8 aparține chemokinelor, este o proteină cu o greutate moleculară de 8 kDa. IL-8 este produs de fagocite mononucleare, leucocite polimorfonucleare, celule endoteliale și alte tipuri de celule ca răspuns la diferiți stimuli, inclusiv bacterii și viruși și produsele lor metabolice, inclusiv citokine pro-inflamatorii (de exemplu, IL-1, TNF alfa ). Rolul principal al interleukinei-8 este de a spori chemotaxia leucocitelor. Acesta joacă un rol important atât în ​​inflamația acută, cât și în cea cronică. Un nivel crescut de IL-8 este observat la pacienții cu infecții bacteriene, boli pulmonare cronice și boli ale tractului gastro-intestinal. Nivelurile plasmatice de IL-8 sunt crescute la pacienții cu sepsis, iar concentrațiile mari sunt asociate cu creșterea mortalității. Rezultatele măsurării conținutului de IL-8 pot fi utilizate pentru a monitoriza cursul tratamentului și a prezice rezultatul bolii. Astfel, un conținut crescut de IL-8 a fost găsit în lichidul lacrimal la toți pacienții cu un curs favorabil de ulcere corneene. La toți pacienții cu un curs complicat de ulcer corneean, concentrația de IL-8 a fost de 8 ori mai mare decât la pacienții cu un curs favorabil al bolii. Astfel, conținutul de citokine proinflamatorii (în special IL-8) în lichidul lacrimal din ulcerele corneene poate fi utilizat ca criteriu de prognostic pentru evoluția acestei boli.

Orez. 4. Distribuția nivelului IL-8 în

plasma donatorilor sănătoși (Novosibirsk).

Conform datelor noastre și publicate, la persoanele sănătoase, IL-8 este detectată extrem de rar în serul sanguin; producția spontană de IL-8 de către celulele mononucleare din sânge este observată la 62%, iar producția indusă la 100% din donatorii sănătoși. Gama de concentrații de IL-8 a fost de 0-34 pg / ml, media a fost de 2 pg / ml, intervalul normal a fost de 0-10 pg / ml (Fig. 4).

Orez. 5. Distribuția nivelului de IL-8 în plasmă

donatori sănătoși (Rubtsovsk).

Antagonist al receptorului interleukinei-1.

IL-1RA este o citokină și este o oligopeptidă cu o greutate moleculară de 18-22 kDa. IL-1RA este un inhibitor endogen al IL-1, produs de macrofage, monocite, neutrofile, fibroblaste și celule epiteliale. IL-1RA inhibă activitatea biologică a interleukinelor IL-1alpha și IL-1beta, concurând cu acestea pentru legarea de receptorul celular.

Orez. 6. Distribuția nivelului IL-1RA

în plasma donatorilor sănătoși

Producția de IL-1RA este stimulată de multe citokine, produse virale și proteine ​​de fază acută. IL-1RA poate fi exprimat activ în focare inflamatorii într-o varietate de boli cronice: artrita cronică reumatoidă și juvenilă, lupus eritematos sistemic, leziuni cerebrale ischemice, boli inflamatorii intestinale, astm bronșic, pielonefrita, psoriazis și altele. În sepsis, se observă cea mai mare creștere a IL-1RA - până la 55 ng / ml în unele cazuri și sa constatat că concentrațiile crescute de IL-1RA se corelează cu un prognostic favorabil. Nivelurile ridicate de IL-1RA sunt observate la femeile cu obezitate ridicată, iar acest nivel scade semnificativ în decurs de 6 luni după liposucție. Gama de concentrații de IL-1RA a fost 0-3070 pg / ml, media a fost de 316 pg / ml. Intervalul normal este de 50-1000 pg / ml (Fig. 6).

Alfa interferon.

Alfa-IFN este o proteină monomerică neglicozilată cu o greutate moleculară de 18 kDa, care este sintetizată în principal de leucocite (limfocite B, monocite). Această citokină poate fi, de asemenea, produsă de practic orice tip de celulă ca răspuns la o excitație adecvată, iar infecțiile virale intracelulare pot fi stimulatori puternici ai sintezei IFN-alfa. Inductorii alfa-INF includ: viruși și produsele lor, printre care locul principal este ocupat de ARN-uri cu dublă catenă produse în timpul replicării virale, precum și bacterii, micoplasme și protozoare, citokine și factori de creștere (cum ar fi IL-1, IL -2, alfa -FNO, factori de stimulare a coloniei etc.). Reacția inițială de apărare a răspunsului imun antibacterian nespecific al organismului include inducerea IFN alfa și beta. În acest caz, este produs de celule care prezintă antigen (macrofage) care au invadat bacteriile. Interferonii (inclusiv alfa-IFN) joacă un rol important în legătura nespecifică a răspunsului imun antiviral. Acestea sporesc rezistența antivirală prin inducerea în celule a sintezei enzimelor care suprimă formarea acizilor nucleici și a proteinelor virusurilor. În plus, au un efect imunomodulator, sporesc expresia antigenelor din complexul principal de histocompatibilitate din celule. O modificare a conținutului de alfa-IFN a fost detectată în hepatită și ciroză hepatică de etiologie virală. În momentul exacerbării infecțiilor virale, concentrația acestei citokine crește semnificativ la majoritatea pacienților, iar în perioada de convalescență scade la un nivel normal. S-a arătat o relație între nivelul seric al alfa-INF și severitatea și durata infecției gripale.

Orez. 7. Distribuția nivelului alfa-IFN

în plasma donatorilor sănătoși.

O creștere a concentrației de alfa-IFN este observată în serul majorității pacienților care suferă de boli autoimune, cum ar fi poliartrita, artrita reumatoidă, spondiloza, artrita psoriazică, polimialgia reumatică și sclerodermia, lupusul eritematos sistemic și vasculita sistemică. Un nivel ridicat al acestui interferon este, de asemenea, observat la unii pacienți în timpul unei exacerbări a ulcerului peptic și a colelitiazei. Gama de concentrații de alfa-INF a fost 0-93 pg / ml, media a fost de 20 pg / ml. Intervalul normal este de până la 45 pg / ml (Fig. 7).

Anticorpi împotriva alfa-IFN.

Anticorpii împotriva alfa-IFN pot fi detectați în serurile pacienților cu lupus eritematos somatic. Inducerea spontană a anticorpilor împotriva alfa-IFN este observată și în serul pacienților cu diferite forme de cancer. În unele cazuri, anticorpii împotriva alfa-IFN au fost găsiți în serurile pacienților infectați cu HIV, precum și în lichidul cefalorahidian și serurile pacienților cu meningită în timpul fazei acute, în serurile pacienților cu poliartrită cronică.

Orez. 8. Distribuția nivelului de anticorpi față de alfa-IFN

în plasma donatorilor sănătoși.

Alfa-IFN este unul dintre medicamentele terapeutice antivirale și antitumorale eficiente, dar utilizarea sa pe termen lung poate duce la producerea de anticorpi specifici împotriva alfa-IFN. Acest lucru reduce eficacitatea tratamentului și, în unele cazuri, provoacă diverse efecte secundare: de la gripă la dezvoltarea bolilor autoimune. Având în vedere acest lucru, în timpul terapiei cu INF, este important să se controleze nivelul anticorpilor împotriva alfa-INF în corpul pacientului. Formarea lor depinde de tipul de medicament utilizat în terapie, de durata tratamentului și de tipul de boală. Gama de concentrații de anticorpi împotriva alfa-IFN a fost de 0-126 ng / ml, media a fost de 6,2 ng / ml. Intervalul normal este de până la 15 ng / ml (Fig. 8). Evaluarea nivelului de citokine folosind kituri de reactivi disponibile comercial la CJSC „Vector-Best” permite o nouă abordare a studiului stării sistemului imunitar al organismului în practica clinică.

Medicamente imunotrope pe bază de citokine.

Muncă interesantă S. Simbirtseva, Institutul de Cercetare de Stat pentru Produse Biologice Extrem de Pure, Ministerul Sănătății din Rusia, Sankt Petersburg). reglare și este în primul rând asociat cu menținerea homeostaziei în timpul introducerii agenților patogeni și a încălcării integrității țesuturilor. Această nouă clasă de molecule de reglare a fost creată de natură pe parcursul a milioane de ani de evoluție și are un potențial nelimitat de utilizare ca medicamente. În cadrul sistemului imunitar, citokinele mediază relația dintre răspunsurile de apărare nespecifice și imunitatea specifică, acționând în ambele direcții. La nivelul corpului, citokinele comunică între sistemul imunitar, nervos, endocrin, hematopoietic și alte sisteme și servesc la implicarea lor în organizarea și reglarea reacțiilor de apărare. Forța motrice a studiului intensiv al citokinelor a fost întotdeauna perspectiva promițătoare a utilizării lor clinice pentru tratamentul bolilor răspândite, inclusiv a cancerului, a bolilor infecțioase și a imunodeficienței. Mai multe preparate de citokine sunt înregistrate în Rusia, inclusiv interferoni, factori de stimulare a coloniilor, interleukine și antagoniștii acestora și factor de necroză tumorală. Toate preparatele de citokine pot fi împărțite în preparate naturale și recombinate. Preparatele naturale sunt preparate cu diferite grade de purificare, obținute din mediul de cultură al celulelor eucariote stimulate, în principal celule umane. Principalele dezavantaje sunt gradul scăzut de purificare, imposibilitatea standardizării datorită numărului mare de componente și utilizarea componentelor sanguine în producție. Aparent, viitorul terapiei cu citokine este asociat cu medicamente modificate genetic obținute folosind cele mai recente progrese în biotehnologie. În ultimele două decenii, genele majorității citokinelor au fost clonate și s-au obținut analogi recombinați care repetă complet proprietățile biologice ale moleculelor naturale. În practica clinică, există trei domenii principale de utilizare a citokinelor:

1) terapia cu citokine pentru a activa reacțiile de apărare ale organismului, imunomodulare sau pentru a completa lipsa de citokine endogene,

2) terapia imunosupresoare anti-citokine care vizează blocarea acțiunii biologice a citokinelor și a receptorilor acestora,

3) terapia genică a citokinelor cu scopul de a spori imunitatea antitumorală sau de a corecta defectele genetice ale sistemului citokinelor.

Un număr de citokine pot fi utilizate clinic pentru uz sistemic și local. Administrarea sistemică este justificată în cazurile în care este necesar să se asigure acțiunea citokinelor în mai multe organe pentru o activare mai eficientă a imunității sau pentru a activa celulele țintă situate în diferite părți ale corpului. În alte cazuri, aplicația topică are o serie de avantaje, deoarece vă permite să obțineți o concentrație locală ridicată a principiului activ, să țineți organul-țintă și să evitați manifestările sistemice nedorite. În prezent, citokinele sunt considerate unul dintre cele mai promițătoare medicamente pentru utilizare în practica clinică.

Concluzie.

Astfel, în prezent nu există nicio îndoială că citokinele sunt cei mai importanți factori în imunopatogenie. Studiul nivelului de citokine oferă informații despre activitatea funcțională a diferitelor tipuri de celule imunocompetente, raportul proceselor de activare a ajutoarelor T de tipul I și II, care este foarte important în diagnosticul diferențial al unui număr de procese imunopatologice. Citokinele sunt proteine ​​specifice pe care celulele sistemului imunitar le pot folosi pentru a face schimb de informații și a interacționa între ele. Astăzi, au fost descoperite peste o sută de citokine diferite, care sunt împărțite în mod convențional în pro-inflamatorii (provocând inflamații) și antiinflamatorii (prevenind dezvoltarea inflamației). Deci, diferitele funcții biologice ale citokinelor sunt împărțite în trei grupe: ele controlează dezvoltarea și homeostazia sistemului imunitar, controlează creșterea și diferențierea celulelor sanguine (sistemul hematopoietic) și participă la reacții de protecție nespecifice ale corpului, influențând inflamația inflamatorie procesele, coagularea sângelui, tensiunea arterială.

Lista literaturii folosite.

S.V. Belmer, A.S. Simbirtsev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihailova. / Universitatea medicală de stat rusă, Centrul științific de stat de coloproctologie, Moscova și Institutul de cercetare de stat pentru biopreparări extrem de pure, Sankt Petersburg.

S.V. Sennikov, A.N. Silkov // Jurnalul "Citokine și inflamație", 2005, nr. 1 T. 4, nr. 1. P.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofeeva, M. Yu. Rukavishnikov, materiale de lucru ale SA "Vector-Best".

A.S. Simbirtsev, Institutul de Cercetare de Stat pentru Produse Biologice Foarte Pure, Ministerul Sănătății din Rusia, Sankt Petersburg.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S .. Institutul de Cercetare de Stat pentru Biopreparări extrem de pure, Sankt Petersburg.

T.A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Dry-warm. Departamentul de Anestezie și Reanimatologie, Universitatea de Stat din Vladivostok.

În lucrările utilizate materialele de pe site-ul http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm

anumiți agenți patogeni ai bolilor infecțioase. Deci, norsulfazolul ...

1. Imunitate antivirală mecanisme moleculare și celulare, modele de dezvoltare și imunopatho

   Rezumat >> Medicină, sănătate

   ... „site” se referă la un anumit site anumit polipeptidă (antigen) cu care ... etapele sale timpurii. Citokineși chemokine. Alte citokine, pe lângă interferoni, ... produși de ei pe unitate de timp citokine determină intensitatea proliferării și ...

2. Studiul cauzelor fibrozei măduvei osoase în bolile mieloproliferative prin analiza efectului factorilor plachetari asupra celulelor stem mezenchimale

   Teme >> Medicină, sănătate

   Diverse concentrări; - cantitativ definiție proteinele din sistemele experimentale ... duc la acțiune prelungită citokină, care îmbunătățește procesul de fibroză ... trombocite. De asemenea, a crescut conținutul citokină a fost găsit în urină ...

3. Patogenia tuberculozei la om

   Rezumat >> Medicină, sănătate

   Dar alimentar este, de asemenea, posibil. Un anumit joacă un rol în infecția aerogenă ... joacă, secretată de macrofage și monocite citokină- factor de necroză tumorală (TNF). ... ioni, fiecare celulă posedă anumit un sistem care asigură transportul substanțelor ...

). Datorită faptului că au activat sau modulat proprietățile proliferative ale celulelor din această clasă, au fost denumite imunocitokine. După ce a devenit cunoscut faptul că acești compuși interacționează nu numai cu celulele sistemului imunitar, numele lor a fost scurtat la citokine, care includ, de asemenea, factorul de stimulare a coloniei (LCR) și mulți alții (vezi Agenți vasoactivi și inflamații).

Citokine [greacă. kytos- un vas, aici este o celulă și kineo- în mișcare, încurajator] - un grup mare și divers de mediatori proteici de dimensiuni mici (greutate moleculară de la 8 la 80 kDa) - molecule mediator („proteine ​​de comunicare”) implicate în semnalizarea intercelulară în principal în sistemul imunitar. Citokinele includ factorul de necroză tumorală, interferoni, o serie de interleukine etc. Citokinele care sunt sintetizate de limfocite și sunt regulatori ai proliferării și diferențierii, în special a celulelor hematopoietice și a celulelor sistemului imunitar, se numesc limfokine. Termenul „citokine” a fost propus de S. Coen și colab. în 1974

Toate celulele sistemului imunitar au anumite funcții și funcționează într-o interacțiune clar coordonată, care este asigurată de substanțe biologice active speciale - citokine - regulatori ai reacțiilor imune. Citokinele sunt proteine ​​specifice prin care diferite celule ale sistemului imunitar pot face schimb de informații între ele și își pot coordona acțiunile. Setul și cantitatea de citokine care acționează asupra receptorilor de suprafață celulară - „mediul citokinelor” - reprezintă o matrice de semnale care interacționează și se schimbă frecvent. Aceste semnale sunt complexe datorită varietății largi de receptori de citokine și datorită faptului că fiecare dintre citokine poate activa sau suprima mai multe procese, inclusiv sinteza proprie și sinteza altor citokine, precum și formarea și apariția receptorilor de citokine pe suprafața celulei. Diferite țesuturi au propriul „mediu citokinic” sănătos. Au fost descoperite peste o sută de citokine diferite.

Citokinele sunt un element important în interacțiunea diferitelor limfocite între ele și cu fagocitele (Fig. 4). Prin intermediul citokinelor, ajutoarele T ajută la coordonarea activității unei varietăți de celule implicate în răspunsul imun.

De la descoperirea interleukinelor în anii 1970, până acum s-au descoperit peste o sută de substanțe biologic active. Diverse citokine reglează proliferarea și diferențierea celulelor imunocompetente. Și dacă efectul citokinelor asupra acestor procese a fost studiat destul de bine, atunci datele despre efectul citokinelor asupra apoptozei au apărut relativ recent. De asemenea, acestea trebuie luate în considerare la utilizarea clinică a citokinelor.

Semnalizarea intercelulară în sistemul imunitar se realizează prin interacțiunea directă de contact a celulelor sau prin mediatorii interacțiunilor intercelulare. Studierea diferențierii celulelor imunocompetente și celulelor hematopoietice, precum și a mecanismelor de interacțiune intercelulară care formează răspunsul imun, un grup mare și diversificat de mediatori solubili de natură proteică - molecule mediator („proteine ​​de legare”) implicate în semnalizarea intercelulară - citokine a fost descoperit. Hormonii sunt de obicei excluși din această categorie pe baza naturii lor de acțiune endocrină (mai degrabă decât paracrină sau autocrină). (vezi Citokine: mecanisme de transmitere a semnalului hormonal). Împreună cu hormoni și neurotransmițători, ei formează baza limbajului de semnalizare chimică, prin care morfogeneza și regenerarea țesuturilor sunt reglementate într-un organism multicelular. Acestea joacă un rol central în reglarea pozitivă și negativă a răspunsului imun. Până în prezent, mai mult de o sută de citokine au fost descoperite și studiate la oameni într-un grad sau altul, așa cum s-a menționat mai sus, și există rapoarte constante despre descoperirea altora noi. Pentru unii, s-au obținut analogi prelucrați genetic. Citokinele acționează prin activarea receptorilor citokinici.

Destul de des, împărțirea citokinelor într-un număr de familii se realizează nu prin funcțiile lor, ci prin natura structurii tridimensionale, care reflectă similitudinea intragrupului în conformație și secvența de aminoacizi a receptorilor specifici ai citokinelor celulare (vezi „ Receptori pentru citokine "). Unele dintre ele sunt produse de celulele T (a se vedea „Citokinele produse de celulele T”). Principala activitate biologică a citokinelor este reglarea răspunsului imun în toate etapele dezvoltării sale, în care acestea joacă un rol central. În general, acest întreg grup mare de regulatoare endogene oferă o mare varietate de procese, cum ar fi:

Inducerea citotoxicității în macrofage,

Multe boli grave duc la creșteri semnificative ale nivelului alfa IL-1 și TNF. Aceste citokine promovează activarea fagocitelor, migrarea lor la locul inflamației, precum și eliberarea mediatorilor inflamatori - derivați lipidici, adică a prostaglandinei E2, a tromboxanilor și a factorului de activare a trombocitelor. În plus, ele cauzează direct sau indirect expansiunea arteriolelor, sinteza glicoproteinelor adezive și activează limfocitele T și B. IL-1 declanșează sinteza IL-8, care promovează chimiotaxia monocitelor și neutrofilelor și eliberarea enzimelor din neutrofile. În ficat, sinteza albuminei scade și sinteza proteinelor din faza acută a inflamației crește, inclusiv inhibitori de protează, componente complementare, fibrinogen, ceruloplasmină, feritină și haptoglobină. Nivelul proteinei C-reactive, care se leagă de celulele deteriorate și moarte, precum și de unele microorganisme, poate crește de până la 1000 de ori. Este posibilă și o creștere semnificativă a concentrației serice de amiloid A și depunerea acestuia în diferite organe, ceea ce duce la amiloidoză secundară. Cel mai important mediator al fazei acute a inflamației este IL-6, deși IL-1 și TNF-alfa pot provoca și modificările descrise în funcția ficatului. IL-1 și TNF-alfa își sporesc reciproc influența asupra manifestărilor locale și generale ale inflamației; prin urmare, combinația acestor două citokine, chiar și în doze mici, poate provoca insuficiență multiplă a organelor și hipotensiune arterială persistentă. Suprimarea activității oricăruia dintre aceștia elimină această interacțiune și îmbunătățește considerabil starea pacientului. IL-1 activează limfocitele T și B mai puternic la 39 * C decât la 37 * C. IL-1 și TNF alfa provoacă o scădere a masei corporale slabe și pierderea poftei de mâncare, ducând la cașexie cu febră prelungită. Aceste citokine pătrund în fluxul sanguin doar pentru o perioadă scurtă de timp, dar este suficient să declanșeze producția de IL-6. IL-6 este prezent în mod constant în sânge, astfel încât concentrația sa este mai consistentă cu severitatea febrei și a altor manifestări de infecție. Cu toate acestea, IL-6, spre deosebire de IL-1 și TNF-alfa, nu este considerată o citokină letală.

Rezumat. Citokinele sunt proteine ​​mici care acționează autocrin (adică asupra celulei care le produce) sau paracrine (asupra celulelor situate în apropiere). Formarea și eliberarea acestor molecule extrem de active este de scurtă durată și este bine reglementată. Citokinele, care sunt sintetizate de limfocite și sunt regulatori ai proliferării și diferențierii, în special a celulelor hematopoietice și a celulelor sistemului imunitar, se mai numesc limfokine și

Acest capitol va lua în considerare o abordare integrată a evaluării sistemului de citokine utilizând metodele moderne de cercetare descrise anterior.

În primul rând, prezentăm conceptele de bază ale sistemului de citokine.

Citokinele sunt considerate în prezent ca molecule proteină-peptidă produse de diferite celule ale corpului și care efectuează interacțiuni intercelulare și intersistemice. Citokinele sunt regulatori universali ai ciclului de viață al celulelor, controlează procesele de diferențiere, proliferare, activare funcțională și apoptoză a acestora din urmă.

Citokinele produse de celulele sistemului imunitar se numesc imunocitokine; sunt o clasă de mediatori peptidici solubili ai sistemului imunitar necesari dezvoltării, funcționării și interacțiunii cu alte sisteme ale corpului (Kovalchuk L.V. și colab., 1999).

Ca molecule reglatoare, citokinele joacă un rol important în reacțiile imunității înnăscute și adaptative, asigură interconectarea acestora, controlează hematopoieza, inflamația, vindecarea rănilor, formarea de noi vase de sânge (angiogeneza) și multe alte procese vitale.

În prezent, există mai multe clasificări diferite ale citokinelor, luând în considerare structura, activitatea funcțională, originea, tipul receptorilor citokinelor. În mod tradițional, în conformitate cu efectele biologice, este obișnuit să se distingă următoarele grupuri de citokine.

1. Interleukini(IL-1-IL-33) sunt proteine ​​reglatoare secretoare ale sistemului imunitar care asigură interacțiuni mediator în sistemul imunitar și conexiunea acestuia cu alte sisteme ale corpului. Interleukinele sunt clasificate în funcție de activitatea lor funcțională în citokine pro și antiinflamatoare, factori de creștere a limfocitelor, citokine reglatoare etc.

3. Factori de necroză tumorală (TNF)- citokine cu acțiuni citotoxice și reglatoare: TNFa și limfotoxine (LT).

4. Factorii de creștere a celulelor hematopoietice- factor de creștere a celulelor stem (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoietină, trobopoietină, factor de stimulare a coloniilor granulocite-macrofage - GM-CSF, granulocite CSF - G-CSF, macrophagal -

ny KSF - M-KSF).

5. Chimiochine- С, CC, СХС (IL-8), СХ3С - regulatori ai chimiotaxiei diferitelor tipuri de celule.

6. Factori de creștere a celulelor nelimfoide- regulatori de creștere, diferențiere și activitate funcțională a celulelor aparținând diferitelor țesuturi (factor de creștere a fibroblastelor - FGF, factor de creștere a celulelor endoteliale, factor de creștere epidermică - EGF al epidermei) și factori de creștere transformatori (TGFβ, TGFα).

Printre alții, în ultimii ani, a fost studiat în mod activ un factor care inhibă migrația macrofagelor (factorul de inhibare a migrației - MIF), care este considerat un neurohormon cu activitate de citokină și enzimatică (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV și colab. ,

Citokinele diferă prin structură, activitate biologică și alte proprietăți. Cu toate acestea, împreună cu diferențele, citokinele au proprietăți generale, caracteristic acestei clase de molecule de bioreglare.

1. Citokinele sunt, de regulă, polipeptide glicozilate cu greutate moleculară medie (mai mică de 30 kD).

2. Citokinele sunt produse de celulele sistemului imunitar și de alte celule (de exemplu, endoteliu, fibroblaste etc.) ca răspuns la un stimul activant (structuri moleculare asociate patogenilor, antigeni, citokine etc.) și participă la reacții de imunitate înnăscută și adaptativă, reglând puterea și durata acestora. Unele citokine sunt sintetizate constitutiv.

3. Secreția citokinelor este un proces pe termen scurt. Citokinele nu sunt stocate ca molecule preformate, ci ale lor

sinteza începe întotdeauna cu transcrierea genelor. Celulele produc citokine în concentrații mici (picograme pe mililitru).

4. În majoritatea cazurilor, citokinele sunt produse și acționează asupra celulelor țintă în imediata apropiere (acțiune pe termen scurt). Situl principal al acțiunii citokinelor este sinapsa intercelulară.

5. Redundanţă sistemul de citokine se manifestă prin faptul că fiecare tip de celulă este capabilă să producă mai multe citokine, iar fiecare citokină poate fi secretată de celule diferite.

6. Toate citokinele se caracterizează prin pleiotropie, sau polifuncționalitatea acțiunii. Astfel, manifestarea semnelor de inflamație se datorează influenței IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Duplicarea funcțiilor asigură fiabilitatea sistemului de citokine.

7. Acțiunea citokinelor asupra celulelor țintă este mediată de receptori de membrană foarte specifici cu afinitate ridicată, care sunt glicoproteine ​​transmembranare, constând de obicei din mai multe subunități. Partea extracelulară a receptorilor este responsabilă de legarea citokinelor. Există receptori care elimină excesul de citokine în focarul patologic. Aceștia sunt așa-numiții receptori capcană. Receptorii solubili sunt domeniul extracelular al receptorului de membrană, separat de o enzimă. Receptorii solubili sunt capabili să neutralizeze citokinele, participă la transportul lor către focarul inflamației și la excreția lor din corp.

8. Citokine lucrează pe principiul unei rețele. Pot acționa concertat. Multe funcții atribuite inițial unei singure citokine par a fi mediate de acțiunea concertată a mai multor citokine. (sinergie acțiuni). Exemple de interacțiuni sinergice ale citokinelor sunt stimularea reacțiilor inflamatorii (IL-1, IL-6 și TNF-a), precum și sinteza IgE

(IL-4, IL-5 și IL-13).

Unele citokine induc sinteza altor citokine (cascadă). Acțiunea în cascadă a citokinelor este necesară pentru dezvoltarea răspunsurilor inflamatorii și imune. Capacitatea unor citokine de a spori sau de a slăbi producția altora determină importante mecanisme de reglare pozitive și negative.

Efectul antagonist al citokinelor este cunoscut, de exemplu, producția de IL-6 ca răspuns la o creștere a concentrației de TNFα poate fi

un mecanism de reglare negativ pentru controlul producției acestui mediator în timpul inflamației.

Reglarea citokinelor a funcțiilor celulelor țintă se realizează utilizând mecanisme autocrine, paracrine sau endocrine. Unele citokine (IL-1, IL-6, TNFα etc.) pot participa la implementarea tuturor mecanismelor de mai sus.

Răspunsul celulei la influența unei citokine depinde de mai mulți factori:

Din tipul de celule și activitatea funcțională inițială a acestora;

Din concentrația locală a citokinei;

Din prezența altor molecule mediator.

Astfel, celulele producătoare, citokinele și receptorii lor specifici de pe celulele țintă formează o singură rețea de mediatori. Setul de peptide reglatoare, nu citokine individuale, determină răspunsul celular final. În prezent, sistemul de citokine este considerat un sistem universal de reglare la nivelul întregului organism, care asigură dezvoltarea reacțiilor de protecție (de exemplu, în timpul infecției).

În ultimii ani, ideea unui sistem de citokine care combină:

1) celule producătoare;

2) citokine solubile și antagoniștii acestora;

3) celulele țintă și receptorii lor (Fig. 7.1).

Încălcările diferitelor componente ale sistemului citokinelor duc la dezvoltarea a numeroase procese patologice și, prin urmare, identificarea defectelor în acest sistem de reglementare este importantă pentru diagnosticul corect și numirea unei terapii adecvate.

În primul rând, vom lua în considerare principalele componente ale sistemului de citokine.

Celule producătoare de citokine

I. Grupul principal de celule producătoare de citokine în răspunsul imun adaptiv sunt limfocitele. Celulele în repaus nu secretă citokine. Odată cu recunoașterea antigenului și cu participarea interacțiunilor receptorilor (CD28-CD80 / 86 pentru limfocitele T și CD40-CD40L pentru limfocitele B), are loc activarea celulelor, ducând la transcrierea genelor citokinelor, traducerea și secreția peptidelor glicozilate în celulele intercelulare. spaţiu.

Orez. 7.1. Sistemul de citokine

Ajutorii CD4 T sunt reprezentați de subpopulații: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, care diferă în spectrul citokinelor secretate ca răspuns la diverși antigeni.

Th0 produc o gamă largă de citokine la concentrații foarte scăzute.

Direcția de diferențiere Th0 determină dezvoltarea a două forme ale răspunsului imun cu predominanță a mecanismelor umorale sau celulare.

Natura antigenului, concentrația acestuia, localizarea în celulă, tipul de celule care prezintă antigen și un anumit set de citokine reglează direcția diferențierii Th0.

După captarea și procesarea antigenului, celulele dendritice prezintă peptide antigenice celulelor Th0 și produc citokine care reglează direcția diferențierii lor în celule efectoare. Rolul citokinelor individuale în acest proces este prezentat în Fig. 7.2. IL-12 induce sinteza IFNγ de către limfocitele T și] HGC. IFNu oferă diferențierea Th1, care începe să secrete citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFα, limfotoxine), care reglează dezvoltarea reacțiilor la agenții patogeni intracelulari

(hipersensibilitate de tip întârziat (TRS) și diferite tipuri de citotoxicitate celulară).

IL-4 asigură diferențierea Th0 în Th2. Th2 activat produce citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 etc.), care determină proliferarea limfocitelor B, diferențierea lor în celule plasmatice și dezvoltarea răspunsurilor anticorpilor, în principal la agenți patogeni extracelulari.

IFNu reglează negativ funcția celulelor Th2 și, dimpotrivă, IL-4, IL-10 secretate de Th2 inhibă funcția Th1 (Fig. 7.3). Mecanismul molecular al acestei reglementări este asociat cu factori de transcripție. Expresia T-bet și STAT4, determinată de IFNy, direcționează diferențierea celulelor T de-a lungul căii Th1 și suprimă dezvoltarea Th2. IL-4 induce expresia GATA-3 și STAT6, care, respectiv, asigură transformarea THO naiv în celule Th2 (Fig. 7.2).

În ultimii ani, a fost descrisă o subpopulație specială de celule T ajutătoare (Th17) care produc IL-17. Membrii familiei IL-17 pot fi exprimați prin celule de memorie activate (CD4CD45RO), celule y5T, celule NKT, neutrofile, monocite sub influența IL-23, IL-6, TGFβ produse de macrofage și celule dendritice. Principalul factor de diferențiere la om este ROR-C, la șoareci - ROR-γ l A fost arătat rolul cardinal al IL-17 în dezvoltarea inflamației cronice și a patologiei autoimune (vezi Fig. 7.2).

În plus, limfocitele T din timus se pot diferenția în celule reglatoare naturale (Treg) care exprimă markeri de suprafață CD4 + CD25 + și factorul de transcripție FOXP3. Aceste celule sunt capabile să suprime răspunsul imun mediat de celulele Th1 și Th2 prin contact intercelular direct și sinteza TGFβ și IL-10.

Diagramele de diferențiere a clonelor Th0 și citokinelor secretate de acestea sunt prezentate în Fig. 7.2 și 7.3 (vezi și inserția de culoare).

Celulele citotoxice T (CD8 +), celulele naturale ucigașe sunt producători slabi de citokine precum interferoni, TNF-a și limfotoxine.

Activarea excesivă a uneia dintre subpopulațiile Th poate determina dezvoltarea uneia dintre variantele răspunsului imun. Dezechilibrul cronic al activării Th poate duce la formarea afecțiunilor imunopatologice asociate cu manifestarea

alergii, patologie autoimună, procese inflamatorii cronice etc.

Orez. 7.2. Diferite subpopulații de limfocite T producătoare de citokine

II. În sistemul imunitar înnăscut, principalii producători de citokine sunt celulele mieloide. Cu ajutorul receptorilor Toll-like (TLR), aceștia recunosc structuri moleculare similare ale diferiților agenți patogeni, așa-numitele modele moleculare asociate patogenilor (RAMP), de exemplu, lipopolizaharida (LPS) a bacteriilor gram-negative, acizii lipoteicoici, peptidoglicanii microorganismelor gram-pozitive, flagelină, ADN bogat în repetări G etc. Ca rezultat

Această interacțiune cu TLR declanșează o cascadă de transducție a semnalului intracelular care duce la exprimarea genelor a două grupuri principale de citokine: proinflamatoare și IFN tip 1 (Fig. 7.4, vezi și inserția de culoare). În principal, aceste citokine (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokine etc.) induc dezvoltarea inflamației și sunt implicate în protejarea organismului împotriva infecțiilor bacteriene și virale.

Orez. 7.3. Spectrul de citokine secretate de celulele TH1 și TH2

III. Celulele care nu aparțin sistemului imunitar (celule ale țesutului conjunctiv, epiteliului, endoteliului) secretă constitutiv factori de creștere autocrină (FGF, EGF, TGFR etc.). și citokine care susțin proliferarea celulelor hematopoietice.

Citokinele și antagoniștii acestora sunt descrise în detaliu într-o serie de monografii (Kovalchuk L.V. și colab., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Orez. 7.4. Inducția mediată de TLR a producției de citokine de către celulele imune înnăscute

Supraexprimarea citokinelor este nesigură pentru organism și poate duce la dezvoltarea unui răspuns inflamator excesiv, un răspuns de fază acută. Diverși inhibitori sunt implicați în reglarea producției de citokine proinflamatorii. Astfel, au fost descrise o serie de substanțe care leagă nespecific citokina IL-1 și previn manifestarea acțiunii sale biologice (a2-macroglobulină, componenta C3 a complementului, uromodulina). Inhibitorii specifici ai IL-1 includ receptori solubili pentru momeală, anticorpi și un antagonist al receptorilor IL-1 (IL-1RA). Odată cu dezvoltarea inflamației, apare o creștere a expresiei genei IL-1RA. Dar chiar și în mod normal, acest antagonist este prezent în sânge în concentrații mari (până la 1 ng / ml sau mai mult), blocând acțiunea IL-1 endogen.

Celulele țintă

Acțiunea citokinelor asupra celulelor țintă este mediată prin receptori specifici care leagă citokinele cu afinitate foarte mare, iar citokinele individuale pot utiliza

subunități de receptor comune. Fiecare citokină se leagă de receptorul său specific.

Receptorii citokinelor sunt proteine ​​transmembranare și sunt împărțiți în 5 tipuri principale. Cel mai frecvent este așa-numitul receptor de tip hematopoietină, care are două domenii extracelulare, dintre care unul conține o secvență comună de resturi de aminoacizi a două repetări de triptofan și serină, separate prin orice aminoacid (motiv WSXWS). Al doilea tip de receptor poate avea două domenii extracelulare cu un număr mare de cisteine ​​conservate. Aceștia sunt receptori ai familiei IL-10 și IFN. Al treilea tip este reprezentat de receptori de citokine aparținând grupului TNF. Al patrulea tip de receptori de citokine aparține superfamiliei receptorilor de imunoglobulină cu domenii extracelulare care seamănă în structură cu domeniile moleculelor de imunoglobulină. Al cincilea tip de receptor care leagă moleculele din familia chemokinelor este reprezentat de proteinele transmembranare care traversează membrana celulară în 7 locuri. Receptorii citokinelor pot exista într-o formă solubilă, păstrând capacitatea de a lega liganzi (Ketlinsky S.A. și colab., 2008).

Citokinele pot influența proliferarea, diferențierea, activitatea funcțională și apoptoza celulelor țintă (vezi Fig. 7.1). Manifestarea activității biologice a citokinelor în celulele țintă depinde de participarea diferitelor sisteme intracelulare la transmiterea semnalului de la receptor, care este asociată cu caracteristicile celulelor țintă. Semnalul apoptozei este efectuat, printre altele, cu ajutorul unei regiuni specifice a familiei de receptori TNF, așa-numitul domeniu „moarte” (Fig. 7.5, vezi inserția de culoare). Semnalele de diferențiere și de activare sunt transmise prin proteinele Jak-STAT intracelulare - traductoare de semnal și activatori de transcripție (Fig. 7.6, vezi inserția de culoare). Proteinele G sunt implicate în semnalizarea de la chemokine, ceea ce duce la creșterea migrației și a aderenței celulare.

O analiză cuprinzătoare a sistemului de citokine include următoarele.

I. Evaluarea celulelor producătoare.

1. Determinarea expresiei:

Receptorii care recunosc un agent patogen sau antigen TCR, TLR) la nivelul genelor și moleculelor de proteine ​​(PCR, citometrie în flux);

Molecule adaptoare care conduc un semnal care declanșează transcrierea genelor citokinei (PCR etc.);

Orez. 7.5. Transmiterea semnalului de la receptorul TNF

Orez. 7.6. Jak-STAT - cale de semnalizare de la receptorii citokinelor de tip 1

Genele citokinelor (PCR); molecule de proteine ​​ale citokinelor (evaluarea funcției de sintetizare a citokinelor celulelor mononucleare umane).

2. Cuantificarea subpopulațiilor de celule care conțin anumite citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda de colorare intracelulară a citokinelor); determinarea numărului de celule care secretă anumite citokine (metoda ELISPOT, vezi Cap. 4).

II. Evaluarea citokinelor și a antagoniștilor acestora în mediul biologic al corpului.

1. Testarea activității biologice a citokinelor.

2. Determinarea cantitativă a citokinelor utilizând ELISA.

3. Colorarea imunohistochimică a citokinelor din țesuturi.

4. Determinarea raportului dintre citokinele opuse (pro- și antiinflamatoare), citokinele și antagoniștii receptorilor de citokine.

III. Evaluarea celulelor țintă.

1. Determinarea expresiei receptorilor citokinici la nivelul genelor și moleculelor proteice (PCR, metoda citometriei în flux).

2. Determinarea moleculelor de semnalizare în conținutul intracelular.

3. Determinarea activității funcționale a celulelor țintă.

În prezent, au fost dezvoltate numeroase metode de evaluare a sistemului de citokine, care oferă informații diverse. Printre acestea se disting:

1) metode biologice moleculare;

2) metode pentru determinarea cantitativă a citokinelor folosind imunoanaliza;

3) testarea activității biologice a citokinelor;

4) colorarea intracelulară a citokinelor;

5) Metoda ELISPOT, care permite detectarea citokinelor în jurul unei singure celule producătoare de citokine;

6) imunofluorescență.

Iată o scurtă descriere a acestor metode.

Prin utilizarea metode biologice moleculare este posibil să se studieze expresia genelor citokinelor, a receptorilor acestora, a moleculelor de semnalizare, pentru a studia polimorfismul acestor gene. În ultimii ani, au fost efectuate un număr mare de studii care au relevat asocieri între variantele de alele ale genelor moleculelor sistemului citokinelor și predispoziția

la o serie de boli. Studiul variantelor alelice ale genelor citokinelor poate furniza informații despre producția programată genetic a unei anumite citokine. Cea mai sensibilă este reacția în lanț a polimerazei în timp real - RT-PCR (vezi Capitolul 6). Metoda de hibridizare in situ permite clarificarea țesutului și localizarea celulară a expresiei genei citokinelor.

Determinarea cantitativă a citokinelor în fluidele biologice și în culturile de celule mononucleare din sânge periferic prin ELISA poate fi caracterizată după cum urmează. Deoarece citokinele sunt mediatori locali, este mai potrivit să se măsoare nivelurile acestora în țesuturile corespunzătoare după extragerea proteinelor tisulare sau în fluidele naturale, de exemplu, în lacrimi, spălare din cavități, urină, lichid amniotic, lichid cefalorahidian etc. Nivelurile de citokine din ser sau alte fluide corporale reflectă starea actuală a sistemului imunitar, adică sinteza citokinelor de către celulele corpului in vivo.

Determinarea nivelurilor de producție de citokine de către celulele mononucleare din sângele periferic (MNC) arată starea funcțională a celulelor. Producția spontană de citokine MNC în cultură indică faptul că celulele sunt deja activate in vivo. Sinteza citokinelor induse (de diferiți stimulenți, mitogeni) reflectă capacitatea potențială de rezervă a celulelor de a răspunde la un stimul antigenic (în special, la acțiunea medicamentelor). Producția redusă de citokine indusă poate servi drept unul dintre semnele unei stări de imunodeficiență. Citokinele nu sunt specifice pentru un anumit antigen. Prin urmare, este imposibil un diagnostic specific al bolilor infecțioase, autoimune și alergice prin determinarea nivelului anumitor citokine. În același timp, evaluarea nivelurilor de citokine permite obținerea de date cu privire la severitatea procesului inflamator, tranziția acestuia la nivel sistemic și prognostic, activitatea funcțională a celulelor sistemului imunitar, raportul dintre celulele Th1 și Th2, care este foarte important în diagnosticul diferențial al unui număr de procese infecțioase și imunopatologice.

În mediul biologic, citokinele pot fi cuantificate folosind o varietate de metode de imunotest, folosind anticorpi policlonali și monoclonali (vezi capitolul 4). ELISA vă permite să aflați care sunt concentrațiile exacte de citokine din bio-

fluide corporale logice. Testul imunosorbent enzimatic al citokinelor are o serie de avantaje față de alte metode (sensibilitate ridicată, specificitate, independență față de prezența antagoniștilor, posibilitatea unei contabilități automate precise, standardizare contabilă). Totuși, această metodă are și limitările sale: ELISA nu caracterizează activitatea biologică a citokinelor, poate da rezultate false datorită epitopilor care reacționează încrucișat.

Testarea biologică efectuate pe baza cunoașterii proprietăților de bază ale citokinelor, a acțiunii lor asupra celulelor țintă. Studiul efectelor biologice ale citokinelor a permis dezvoltarea a patru tipuri de testare a citokinelor:

1) prin inducerea proliferării celulelor țintă;

2) prin efect citotoxic;

3) prin inducerea diferențierii progenitorilor măduvei osoase;

4) pentru acțiunea antivirală.

IL-1 este determinat de efectul stimulator asupra proliferării timocitelor murine activate de mitogen in vitro; IL-2 - prin capacitatea de a stimula activitatea proliferativă a limfoblastelor; TNFα și limfotoxinele sunt testate pentru acțiunea citotoxică asupra fibroblastelor de șoarece (L929). Factorii de stimulare a coloniei sunt evaluați pentru capacitatea lor de a susține creșterea progenitorilor măduvei osoase sub formă de colonii în agar. Activitatea antivirală a IFN este detectată prin inhibarea acțiunii citopatice a virusurilor în cultura fibroblastelor diploide umane și a liniei tumorale a fibroblastelor șoarecilor L-929.

Au fost create linii celulare a căror creștere depinde de prezența anumitor citokine. Masa 7.1 este o listă a liniilor celulare utilizate pentru testarea citokinelor. Conform capacității de a induce proliferarea celulelor țintă sensibile, se efectuează biotestarea IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 etc. Cu toate acestea, aceste metode de testare nu sunt suficient de sensibile și informative. Moleculele inhibitoare și antagoniste pot masca activitatea biologică a citokinelor. Mai multe citokine prezintă activitate biologică generală. Cu toate acestea, aceste metode sunt ideale pentru testarea activității specifice a citokinelor recombinate.

Tabelul 7.1. Linii celulare utilizate pentru testarea activității biologice a citokinelor

Sfârșitul mesei. 7.1

Laboratorul 7-1

Determinarea activității biologice a IL-1 prin efectul comitogen asupra proliferării timocitelor de șoarece

Metoda de testare biologică a IL-1 se bazează pe capacitatea unei citokine de a stimula proliferarea timocitelor murine.

IL-1 poate fi determinat în cultura monocitelor stimulate cu LPS, precum și în orice fluid biologic al corpului. Este necesar să fiți atenți la o serie de detalii.

1. Timocitele șoarecilor C3H / HeJ stimulate la proliferare de către mitogeni (concanavalină A - ConA și fitohemaglutinină - PHA) sunt utilizate pentru testare. Timocitele C3H / HeJ nu au fost alese întâmplător: șoarecii din această linie consangvinizată nu răspund la LPS, care poate fi prezent în materialul testat și poate provoca producția de IL-1.

2. Timocitele răspund la IL-2 și mitogeni, prin urmare, prezența IL-2 și a mitogenilor ar trebui determinată și în preparatele testate pentru IL-1.

Procedura de operare

1. Obțineți o suspensie de timocite la o concentrație de 12 × 106 / ml de mediu RPMI 1640 conținând 10% ser de embrioni de vaci și 2-mercaptoetanol (5 × 10 -5 M).

2. Pregătiți o serie de diluții succesive duble de probe experimentale (fluide biologice corporale) și probe de control. Fluide biologice care conțin IL-1 sau probe obținute prin incubarea celulelor mononucleare fără LPS și preparat standard de laborator care conține IL-1 sunt utilizate ca martori. În plăci cu fund rotund cu 96 de godeuri, 50 μl sunt transferați din fiecare diluare în 6 godeuri.

3. În trei godeuri din fiecare diluare se adaugă 50 μl de PHA purificat (Wellcome) dizolvat în mediu complet la o concentrație de 3 μg / ml, iar în celelalte 3 godeuri - 50 μl de mediu.

4. Adăugați 50 μl de suspensie de timocit în fiecare godeu și incubați timp de 48 de ore la 37 ° C.

6. Înainte de sfârșitul cultivării, 50 g de soluție (1 μCi / ml) de ["3 H] -timidină se adaugă în godeuri și se incubează încă 20 de ore.

7. Pentru a determina nivelul de radioactivitate, celulele de cultură sunt transferate pe hârtie de filtru folosind un secerător automat de celule, filtrele sunt uscate și includerea etichetei este determinată de un contor de scintilație lichidă.

8. Rezultatele sunt exprimate ca factor de stimulare.

unde m cp este numărul mediu de impulsuri în 3 găuri.

Dacă timocitele răspund la stimulare cu IL-1 standard, atunci indicele de stimulare al probei de testare care depășește 3 indică în mod fiabil activitatea IL-1.

Bioanaliza este singura metodă de evaluare a funcției citokinelor, dar această metodă trebuie completată de diferite tipuri de control adecvat pentru specificitate folosind anticorpi monoclonali. Adăugarea anumitor anticorpi monoclonali la citokină în cultură blochează activitatea biologică a citokinei, ceea ce dovedește că citokina detectată servește drept semnal pentru proliferarea liniei celulare.

Utilizarea bioanalizei pentru detectarea interferonului. Principiul evaluării activității biologice a IFN se bazează pe efectul său antiviral, care este determinat de gradul de inhibare a înmulțirii virusului testat în cultura celulară.

Celulele sensibile la acțiunea IFN pot fi utilizate în această lucrare: în principal celule fibroblaste tripsinizate de embrioni de pui și umani, celule transplantate de fibroblaste diploide umane și cultură de celule de șoarece (L929).

Atunci când se evaluează efectul antiviral al IFN, este recomandabil să se utilizeze viruși cu un ciclu scurt de reproducere, sensibilitate ridicată la acțiunea IFN: virusul encefalomielitei de șoarece, stomatita veziculară a șoarecelui etc.

Laboratorul 7-2

Determinarea activității interferonului

1. O suspensie de fibroblaste diploide ale unui făt uman pe un mediu cu 10% ser de embrioni bovini (concentrație celulară - 15-20 × 10 6 / ml) este turnată în plăci sterile cu 96 de godeuri cu fund plat, 100 μl per godeu și plasat într-un incubator cu CO2 la o temperatură de 37 ° C.

2. După formarea unui monostrat complet, mediul de creștere este îndepărtat din godeuri și se adaugă 100 µl de mediu de sprijin în fiecare godeu.

3. Titrarea activității IFN în probele testate se efectuează prin metoda diluțiilor de două ori pe un monostrat de fibroblaste.

Concomitent cu probele, virusul encefalomielitei de șoarece (VEM) este introdus în godeuri la o doză care provoacă leziuni celulare de 100% la 48 de ore după infecție.

4. Pentru control folosiți puțuri cu celule intacte (netratate) infectate cu virusul.

În fiecare studiu, probele de referință IFN cu activitate cunoscută sunt utilizate ca medicamente de referință.

5. Plăcile cu probe diluate sunt incubate timp de 24 de ore la 37 ° C într-o atmosferă cu 5% CO 2.

6. Nivelul activității IFN este determinat de reciprocitatea diluției maxime a probei testate, care inhibă efectul citopatic al virusului cu 50% și se exprimă în unități de activitate pe ml.

7. Pentru a determina tipul de IFN, se adaugă la sistem antiser împotriva IFNα, IFNβ sau IFNγ. Antiserul anulează acțiunea citokinei corespunzătoare, ceea ce face posibilă identificarea tipului de IFN.

Determinarea activității biologice a migrației factorului inhibitor.În prezent, s-au format idei complet noi despre natura și proprietățile MITULUI, care a fost descoperit în anii 60 ai secolului trecut ca mediator al imunității celulare și a rămas mulți ani fără atenția cuvenită (Bloom BR, Bennet B., 1966 ; David JR, 1966). Abia în ultimii 10-15 ani a devenit clar: MITUL este unul dintre cei mai importanți mediatori biologici din organism, cu o gamă largă de funcții biologice ale citokinei, hormonului și enzimei. Acțiunea MIF asupra celulelor țintă se realizează prin receptorul CD74 sau prin calea non-clasică a endocitozei.

MITUL este considerat un important mediator al inflamației, activând funcția macrofagelor (producerea de citokine, fagocitoză, citotoxicitate etc.), precum și un hormon imunoregulator endogen care modulează activitatea glucocorticoidă.

Se acumulează tot mai multe informații despre rolul MIF în patogeneza multor boli inflamatorii, inclusiv sepsis, artrită reumatoidă (RA), glomerulonefrită etc. În RA, concentrația MIF în fluidul articulațiilor afectate este semnificativ crescută, care se corelează cu severitatea bolii. Sub influența MITULUI, crește producția de citokine pro-inflamatorii de către macrofage și celule sinoviale.

Sunt cunoscute diverse metode pentru testarea activității MIF, atunci când celulele migratoare (celule țintă pentru MIF) sunt plasate într-un capilar de sticlă (test capilar), într-o picătură de agaroză sau într-un puț de agaroză.

Prezentăm o metodă de screening relativ simplă bazată pe formarea microculturilor celulare (leucocite sau macrofage) standard în suprafață și numărul de celule de la baza puțurilor unei plăci cu fund plat de 96 de godeuri, urmată de cultivarea lor într-un mediu nutritiv și determinarea schimbării zonei acestor microculturi sub acțiunea MIF (Suslov A.P., 1989).

Laboratorul 7-3

Definiția activității MYTH

Determinarea activității biologice a MIF se realizează folosind un dispozitiv pentru formarea microculturilor celulare (Fig. 7.7) - MIGROSKRIN (Institutul de Cercetare pentru Epidemiologie și Microbiologie numit după NF Gamaleya RAMS).

1. În godeurile unei plăci cu 96 de godeuri (Flow, Marea Britanie sau similar) se adaugă 100 μl dintr-o probă diluată în mediu de cultură, în care se determină activitatea MITULUI (fiecare diluție în 4 paralele, probe experimentale). Mediul de cultură conține RPMI 1640, 2 mM L-glutamină, 5% ser fetal bovin, 40 μg / ml gentamicină.

2. Adăugați mediu de cultură (în 4 paralele) la godeurile de control, câte 100 µl fiecare.

3. Pregătiți o suspensie celulară de macrofage peritoneale, pentru care 2 șoareci hibrizi (CBAxC57B1 / 6) F1 sunt injectați intraperitoneal cu 10 ml soluție Hanks cu heparină (10 U / ml), masați ușor abdomenul timp de 2-3 minute. Apoi, animalul este sacrificat prin decapitare, peretele abdominal este străpuns cu atenție în zona inghinală și exsudatul este aspirat printr-un ac cu o seringă. Celulele exsudatului peritoneal sunt spălate de două ori cu soluție Hanks, centrifugate timp de 10-15 minute la 200 g. Apoi se prepară o suspensie celulară cu o concentrație de 10 ± 1 milion / ml de mediu RPMI 1640. Numărarea se efectuează într-o cameră Goryaev.

4. Asamblați sistemul MIGROSKRIN, care este un suport pentru fixarea direcționată și standard a vârfurilor cu culturi celulare într-o poziție strict verticală la o înălțime dată deasupra centrului unei puțuri a unei plăci de cultură cu 96 de godeuri și include, de asemenea, 92 de vârfuri pentru o pipetă automată de la Costar, SUA (Fig. 7.7).

Introduceți picioarele trepiedului în sondele de colț ale plăcii. Suspensia de celule este preluată cu o pipetă automată în vârfuri - 5 μl în fiecare, clătită din celulele în exces printr-o singură coborâre în mediu și introdusă vertical în prizele rack-ului sistemului. Raftul umplut cu vârfuri se menține la temperatura camerei timp de 1 oră pe o suprafață strict orizontală. În acest timp, celulele suspensiei se așează la fundul puțurilor, unde se formează microculturi celulare standard.

5. Raftul pentru vârfuri este îndepărtat cu grijă de pe placă. O placă cu o microcultură de celule este plasată într-o poziție strict orizontală într-un incubator de CO 2, unde este cultivată timp de 20 de ore. În timpul cultivării, celulele migrează de-a lungul fundului puțului.

6. Înregistrarea cantitativă a rezultatelor după incubare se efectuează pe o lupă binoculară, evaluând vizual dimensiunea coloniei pe scara din interiorul ocularului. Microculturile sunt circulare. Cercetătorii determină apoi diametrul mediu al coloniilor din măsurătorile coloniilor din 4 godeuri de testare sau de control. Eroarea de măsurare este de ± 1 mm.

Indicele de migrație (MI) este calculat prin formula:

Eșantionul are activitate MIT dacă valorile MI sunt egale

Pentru o unitate convențională (U) de activitate MIT, se ia reciprocitatea, egală cu valoarea celei mai mari diluții a eșantionului (eșantionului), la care indicele de migrare este de 0,6 ± 0,2.

Activitatea biologică a FEOα este evaluat prin efectul său citotoxic asupra liniei fibroblastelor transformate L-929. TNFa recombinant a fost folosit ca un control pozitiv, iar celulele dintr-un mediu de cultură au fost utilizate ca un control negativ.

Calculați indicele citotoxic (CI):

Unde A- numărul de celule vii din control; b- numărul de celule vii din experiment.

Orez. 7.7. Schema MIGROSKRIN - Dispozitive pentru cuantificarea migrării culturilor celulare

Celulele sunt colorate cu un colorant (albastru de metilen), care este încorporat numai în celulele moarte.

Valoarea diluării reciproce a eșantionului necesară pentru a obține 50% citotoxicitate celulară este luată ca o unitate convențională a activității TNF. Activitatea specifică a eșantionului - raportul de activitate în unități arbitrare la 1 ml față de concentrația de proteine ​​conținută în eșantion.

Colorarea citokinelor intracelulare. O modificare a raportului dintre celulele care produc diferite citokine poate reflecta patogeneza bolii și poate servi drept criteriu pentru prognosticul bolii și pentru evaluarea terapiei.

Prin metoda colorării intracelulare, se determină expresia unei citokine la nivelul unei celule. Citometria de flux vă permite să numărați numărul de celule care exprimă o anumită citokină.

Să enumerăm etapele principale în determinarea citokinelor intracelulare.

Celulele nestimulate produc cantități mici de citokine, care, de regulă, nu sunt depuse; prin urmare, o etapă importantă în evaluarea citokinelor intracelulare este stimularea limfocitelor și blocarea eliberării acestor produse din celule.

Cel mai frecvent utilizat inductor al citokinelor este activatorul proteinei kinazei C forbol-12-miristatul-13-acetat (PMA) în combinație cu ionomicina ionoforului de calciu (IN). Utilizarea unei astfel de combinații determină sinteza unei game largi de citokine: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Dezavantajul utilizării PMA-IN este problema detectării moleculelor CD4 pe suprafața limfocitelor după o astfel de activare. De asemenea, producția de citokine de către limfocitele T este indusă de mitogeni (PHA). Celulele B și monocitele stimulează

Celulele mononucleare sunt incubate în prezența inductorilor producției de citokine și a unui blocant al transportului lor intracelular, brefeldin A sau monensin, timp de 2-6 ore.

Celulele sunt apoi resuspendate în soluție salină tamponată. Pentru fixare, se adaugă 2% formaldehidă, incubată timp de 10-15 minute la temperatura camerei.

Apoi celulele sunt tratate cu saponină, ceea ce crește permeabilitatea membranei celulare și colorate cu anticorpi monoclonali specifici citokinelor detectate. Colorarea prealabilă a markerilor de suprafață (CD4, CD8) mărește cantitatea de informații obținute despre celulă și vă permite să determinați mai exact identitatea populației sale.

Există unele limitări în aplicarea metodelor descrise mai sus. Deci, cu ajutorul lor, este imposibil să se analizeze sinteza citokinelor de către o singură celulă, este imposibil să se determine numărul de celule producătoare de citokine într-o subpopulație, este imposibil să se determine dacă celulele producătoare de citokine exprimă markeri unici, dacă citokine diferite sunt sintetizate de celule diferite sau de aceleași. Răspunsul la aceste întrebări este obținut folosind alte metode de cercetare. Pentru a determina frecvența celulelor producătoare de citokine într-o populație, se utilizează metoda de limitare a diluțiilor și o variantă a testului imunosorbent legat de enzimă ELISPOT (vezi capitolul 4).

Metoda de hibridizare in situ. Metoda include:

2) fixarea cu paraformaldehidă;

3) detectarea ARNm utilizând ADNc marcat. În unele cazuri, mARN-ul citokinei este determinat pe secțiuni folosind radioizotop PCR.

Imunofluorescența. Metoda include:

1) înghețarea organului și pregătirea secțiunilor de criostat;

2) fixare;

3) prelucrarea secțiunilor cu anticorpi anti-citokine marcate cu fluoresceină;

4) observarea vizuală a fluorescenței.

Aceste tehnici (hibridizare in situși imunofluorescența) sunt rapide și nu depind de concentrațiile de prag ale produsului secretat. Cu toate acestea, ele nu cuantifică cantitatea de citokină secretată și pot fi complexe din punct de vedere tehnic. Este necesară o varietate de monitorizare atentă a reacțiilor nespecifice.

Folosind metodele prezentate pentru evaluarea citokinelor, au fost identificate procesele patologice asociate cu tulburări ale sistemului citokinelor la diferite niveluri.

Astfel, evaluarea sistemului citokinelor este extrem de importantă pentru caracterizarea stării sistemului imunitar al organismului. Studiul diferitelor niveluri ale sistemului citokinic oferă informații despre activitatea funcțională a diferitelor tipuri de celule imunocompetente, despre severitatea procesului inflamator, despre tranziția sa la nivel sistemic și prognosticul bolii.

Întrebări și sarcini

1. Enumerați proprietățile generale ale citokinelor.

2. Dați clasificarea citokinelor.

3. Enumerați principalele componente ale sistemului de citokine.

4. Enumerați celulele producătoare de citokine.

5. Descrieți familiile receptorilor de citokine.

6. Care sunt mecanismele funcționării rețelei de citokine?

7. Spuneți-ne despre producția de citokine în sistemul imunitar înnăscut.

8. Care sunt principalele abordări pentru o evaluare cuprinzătoare a sistemului de citokine?

9. Care sunt metodele de testare a citokinelor din fluidele corporale?

10. Care sunt defectele sistemului citokinelor în diferite patologii?

11. Care sunt principalele metode de testare biologică a IL-1, IFN, MIF, TNFa în fluidele biologice?

12. Descrieți procesul de determinare a conținutului intracelular al citokinelor.

13. Descrieți procesul de determinare a citokinelor secretate de o singură celulă.

14. Descrieți secvența metodelor utilizate pentru a detecta un defect la nivelul receptorului citokinei.

15. Descrieți secvența metodelor utilizate pentru a detecta un defect la nivelul celulelor producătoare de citokine.

16. Ce informații se pot obține examinând producția de citokine în cultura celulelor mononucleare, în serul sanguin?

Introducere

Informații generale

Clasificarea citokinelor

Receptorii citokinelor

Citokine și reglarea răspunsului imun

Concluzie

Literatură

Introducere

Citokinele sunt una dintre cele mai importante părți ale sistemului imunitar. Sistemul imunitar are nevoie de un sistem de alertă de la celulele corpului, ca un strigăt de ajutor. Aceasta este poate cea mai bună definiție a citokinelor. Când o celulă este deteriorată sau afectată de un organism patogen, macrofagele și celulele deteriorate eliberează citokine. Aceasta include factori precum interleukina, interferonul și factorul de necroză tumorală-alfa. Acesta din urmă dovedește, de asemenea, că distrugerea țesutului tumoral este controlată de sistemul imunitar. Când citokinele sunt eliberate, ele apelează la celule imune specifice, cum ar fi celulele albe din sânge și celulele T și B.

Citokinele semnalează, de asemenea, un obiectiv specific pe care aceste celule trebuie să îl îndeplinească. Citokinele și anticorpii sunt complet diferite, deoarece anticorpii sunt asociați cu antigenii, permit sistemului imunitar să identifice invazia organismelor străine. Astfel, se poate face o analogie: citokinele sunt principalul semnal de alarmă pentru invadatori, iar anticorpii sunt cercetași. Procesul de analiză a citokinelor se numește detectarea citokinelor.

Informații generale

Citokine [greacă. kytos - un vas, aici - o celulă și kineo - se mișcă, induc] - un grup mare și divers de mediatori proteici de dimensiuni mici (greutate moleculară de la 8 la 80 kDa) - molecule mediator („proteine ​​de comunicare”) implicate în semnalizarea intercelulară predominant în sistemul imunitar.

Citokinele includ factorul de necroză tumorală, interferoni, o serie de interleukine etc. Citokinele care sunt sintetizate de limfocite și sunt regulatori ai proliferării și diferențierii, în special a celulelor hematopoietice și a celulelor sistemului imunitar, se numesc limfokine.

Toate celulele sistemului imunitar au anumite funcții și funcționează într-o interacțiune clar coordonată, care este asigurată de substanțe biologice active speciale - citokine - regulatori ai reacțiilor imune. Citokinele sunt proteine ​​specifice prin care diferite celule ale sistemului imunitar pot face schimb de informații între ele și își pot coordona acțiunile.

Setul și cantitatea de citokine care acționează asupra receptorilor de suprafață celulară - „mediul citokinelor” - reprezintă o matrice de semnale care interacționează și se schimbă frecvent. Aceste semnale sunt complexe datorită varietății largi de receptori de citokine și datorită faptului că fiecare dintre citokine poate activa sau suprima mai multe procese, inclusiv sinteza proprie și sinteza altor citokine, precum și formarea și apariția receptorilor de citokine pe suprafața celulei.

Semnalizarea intercelulară în sistemul imunitar se realizează prin interacțiunea directă de contact a celulelor sau prin mediatorii interacțiunilor intercelulare. Studierea diferențierii celulelor imunocompetente și celulelor hematopoietice, precum și a mecanismelor de interacțiune intercelulară care formează răspunsul imun, un grup mare și diversificat de mediatori solubili de natură proteică - molecule mediator („proteine ​​de legare”) implicate în semnalizarea intercelulară - citokine a fost descoperit.

Hormonii sunt de obicei excluși din această categorie pe baza naturii lor de acțiune endocrină (mai degrabă decât paracrină sau autocrină). (vezi Citokine: mecanisme de transmitere a semnalului hormonal). Împreună cu hormoni și neurotransmițători, ei formează baza limbajului de semnalizare chimică, prin care morfogeneza și regenerarea țesuturilor sunt reglementate într-un organism multicelular.

Acestea joacă un rol central în reglarea pozitivă și negativă a răspunsului imun. Până în prezent, mai mult de o sută de citokine au fost descoperite și studiate la oameni într-un grad sau altul, așa cum s-a menționat mai sus, și există rapoarte constante despre descoperirea altora noi. Pentru unii, s-au obținut analogi prelucrați genetic. Citokinele acționează prin activarea receptorilor citokinici.

A. Interferoni (IFN):

1. Natural IFN (prima generație):

2. Recombinant IFN (a doua generație):

a) de scurtă durată:

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex și colab.

(IFN-uri pegilate): peginterferon

B. Inductori de interferon (interferonogeni):

1... Sintetic- cicloferon, tiloron, dibazol si etc.

2. Natural- ridostin etc.

V. Interleukini : interleukin-2 recombinant (roncoleukin, aldesleukin, proleukin, ) , interleukină recombinantă 1-beta (betaleukină).

G. Factori de stimulare a coloniei (molgramostim etc.)

Preparate peptidice

Preparate peptidice timice .

Compuși peptidici produși de glanda timusului stimulează maturarea limfocitelor T.(timopoietine).

La valori inițial reduse, preparatele peptidelor tipice cresc numărul de celule T și activitatea funcțională a acestora.

Fondatorul primei generații de preparate timice din Rusia a fost Taktivin, care este un complex de peptide extrase din timusul bovinelor. Preparatele care conțin un complex de peptide timice includ, de asemenea Timalin, Timoptinși altele, și celor care conțin extracte de timus - Timostimulin și Vilozen.

Preparate peptidice timus bovine timalin, timostimulin injectat intramuscular și taktivin, timoptin- sub piele, în principal cu imunitate celulară insuficientă:

Cu imunodeficiențe T,

Infecții virale

Pentru prevenirea infecțiilor în timpul radioterapiei și chimioterapiei tumorilor.

Eficacitatea clinică a preparatelor timice din prima generație este fără îndoială, dar au un dezavantaj: reprezintă un amestec nedivizat de peptide biologic active, care sunt destul de greu de standardizat.

Progresele în domeniul medicamentelor de origine timică au mers pe linia creării de medicamente din a doua și a treia generație - analogi sintetici ai hormonilor timici naturali sau fragmente ale acestor hormoni cu activitate biologică.

Medicament modern Imunofan - hexapeptida, un analog sintetic al centrului activ al timopoietinei, este utilizată pentru imunodeficiențe și tumori. Medicamentul stimulează formarea IL-2 de către celulele imunocompetente, crește sensibilitatea celulelor limfoide la această limfokină, reduce producția de TNF (factor de necroză tumorală), are un efect reglator asupra producției de mediatori imunitari (inflamație) și imunoglobuline.

Preparate peptidice din măduva osoasă

Mielopid obținut din cultura celulelor măduvei osoase de mamifere (viței, porci). Mecanismul de acțiune al medicamentului este asociat cu stimularea proliferării și activității funcționale a celulelor B și T.

În organism, este luată în considerare ținta acestui medicament Limfocitele B.În caz de imuno- sau hematopoieză afectată, introducerea mielopidului duce la o creștere a activității mitotice generale a celulelor măduvei osoase și direcția diferențierii acestora către limfocitele B mature.

Mielopidul este utilizat în terapia complexă a stărilor de imunodeficiență secundară cu leziune predominantă a legăturii umorale a imunității, pentru prevenirea complicațiilor infecțioase după operație, traume, osteomielită, pentru boli pulmonare nespecifice, piodermă cronică. Efectele secundare ale medicamentului sunt amețeli, slăbiciune, greață, hiperemie și durere la locul injectării.

Toate medicamentele din acest grup sunt contraindicate la femeile gravide, mielopidul și imunofanul sunt contraindicate în prezența unui conflict Rh între mamă și făt.

Preparate de imunoglobulină

Imunoglobuline umane

a) Imunoglobuline pentru administrare intramusculară

Nespecific: imunoglobulină umană normală

Specific: imunoglobulină umană împotriva hepatitei B, imunoglobulină antistafilococică umană, imunoglobulină tetanică umană, imunoglobulină umană împotriva encefalitei transmise prin căpușe, imunoglobulină umană împotriva virusului rabiei etc.

b) Imunoglobuline pentru administrare intravenoasă

Nespecific: imunoglobulină umană normală pentru administrare intravenoasă (gabriglobină, imunovenină, intraglobină, humaglobină)

Specific: imunoglobulină împotriva hepatitei umane B (neohepatect), pentaglobină (conține IgM antibacterian, IgG, IgA), imunoglobulină împotriva citomegalovirusului (citotect), imunoglobulină umană împotriva encefalitei transmise prin căpușe, IG anti-rabic, etc.

c) Imunoglobuline pentru administrare orală: prepararea complexului de imunoglobulină (CIP) pentru administrarea enterală în infecțiile intestinale acute; imunoglobulină anti-rotavirus pentru administrare orală.

Imunoglobuline heteroloage:

imunoglobulină antirabică din ser de cal, ser de cal polivalent antigangrenos etc.

Preparatele de imunoglobuline nespecifice sunt utilizate pentru imunodeficiențe primare și secundare, preparate de imunoglobuline specifice pentru infecții adecvate (cu scop terapeutic sau profilactic).

Citokine și preparate pe baza acestora

Reglarea răspunsului imun dezvoltat este realizată de citokine - un complex complex de molecule imunoregulatoare endogene, care stau la baza creării unui grup mare de medicamente imunomodulatoare atât naturale, cât și recombinate.

Interferoni (IFN):

1. Natural IFN (prima generație):

Alfaferoni: IFN leucocitar uman etc.

Betaferoni: fibroblast uman IFN și altele.

2. Recombinant IFN (a doua generație):

a) de scurtă durată:

IFN a2a: reaferon, viferon etc.

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex și colab.

b) acțiune prelungită(IFN pegilate): peginterferon (IFN a2b + Polietilen glicol) etc.

Principala direcție de acțiune a medicamentelor IFN este limfocitele T (celule ucigașe naturale și limfocite T citotoxice).

Interferonii naturali se obțin în cultura leucocitelor din sângele donatorului (în cultura limfoblastoidului și a altor celule) sub influența virusului inductor.

Interferonii recombinați sunt produși printr-o metodă de inginerie genetică - prin cultivarea tulpinilor bacteriene care conțin în aparatul lor genetic o plasmidă recombinantă încorporată a genei interferonului uman.

Interferonii au efecte antivirale, antitumorale și imunomodulatoare.

Ca agenți antivirali, preparatele de interferon sunt cele mai eficiente în tratamentul bolilor herpetice ale ochilor (local sub formă de picături, subconjunctival), herpes simplex localizat pe piele, mucoase și organe genitale, zona zoster (local sub formă de hidrogel unguent), hepatita virală acută și cronică B și C (parenteral, rectal în supozitoare), în tratamentul și prevenirea infecțiilor virale gripale și respiratorii acute (intranazal sub formă de picături). În infecția cu HIV, preparatele de interferon recombinant normalizează parametrii imunologici, reduc severitatea evoluției bolii în mai mult de 50% din cazuri și determină o scădere a nivelului de viremie și a conținutului markerilor serici ai bolii. În SIDA se efectuează o terapie combinată cu azidotimidină.

Efectul antitumoral al preparatelor de interferon este asociat cu efectul antiproliferativ și cu stimularea activității celulelor ucigașe naturale. Ca agenți antineoplazici, se utilizează IFN-alfa, IFN-alfa 2a, IFN-alfa-2b, IFN-alfa-n1, IFN-beta.

IFN-beta-lb este utilizat ca imunomodulator în scleroza multiplă.

Preparatele de interferon cauzează similar efecte secundare... Caracterizat de un sindrom asemănător gripei; modificări ale sistemului nervos central: amețeli, vedere încețoșată, confuzie, depresie, insomnie, parestezie, tremor. Din tractul gastro-intestinal: pierderea poftei de mâncare, greață; din partea sistemului cardiovascular, sunt posibile simptome de insuficiență cardiacă; din sistemul urinar - proteinurie; din partea sistemului hematopoietic - leucopenie tranzitorie. De asemenea, pot apărea erupții cutanate, mâncărime, alopecie, impotență temporară, sângerări nazale.

Inductori de interferon (interferonogeni):

1. Sintetic - cicloferon, tiloron, poludan etc.

2. Natural - ridostin etc.

Inductorii interferonului sunt medicamente care îmbunătățesc sinteza interferonului endogen. Aceste medicamente au mai multe avantaje față de interferonii recombinați. Nu au activitate antigenică. Sinteza stimulată a interferonului endogen nu provoacă hiperinterferonemie.

Tiloron(amiksin) se referă la compuși sintetici cu greutate moleculară mică, este un inductor oral al interferonului. Posedă un spectru larg de activitate antivirală împotriva virusurilor ADN și ARN. Ca agent antiviral și imunomodulator, este utilizat pentru prevenirea și tratamentul gripei, infecțiilor virale respiratorii acute, hepatitei A, pentru tratamentul hepatitei virale, herpes simplex (inclusiv urogenital) și herpes zoster, în terapia complexă a infecțiilor cu clamidie, boli neurovirale și infecțio-alergice, cu imunodeficiențe secundare. Medicamentul este bine tolerat. Posibile simptome dispeptice, frisoane pe termen scurt, tonus general crescut, care nu necesită întreruperea medicamentului.

Poludan este un complex polibonucleotidic biosintetic de acizi poliadenilici și poliuridilici (în raporturi echimolare). Medicamentul are un efect inhibitor pronunțat asupra virusurilor herpes simplex. Se utilizează sub formă de picături oftalmice și injecții sub conjunctivă. Medicamentul este prescris adulților pentru tratamentul bolilor oculare virale: conjunctivită herpetică și adenovirală, keratoconjunctivită, keratită și keratoiridociclită (keratouveită), iridociclită, corioretinită, neurită optică.

Efecte secundare apar rar și se manifestă prin dezvoltarea reacțiilor alergice: mâncărime și senzație de corp străin în ochi.

Cicloferon- inductor de interferon cu greutate moleculară mică. Are efecte antivirale, imunomodulatoare și antiinflamatoare. Cicloferonul este eficient împotriva virușilor de encefalită transmisă de căpușe, herpes, citomegalovirus, HIV etc. Are un efect anti-Chlamydial. Eficient pentru bolile sistemice ale țesutului conjunctiv. S-a stabilit efectul radioprotector și antiinflamator al medicamentului.

Arbidol sunt prescrise intern pentru prevenirea și tratamentul gripei și a altor infecții virale respiratorii acute, precum și pentru bolile herpetice.

Interleukine:

IL-2 recombinant (aldesleukin, proleukin, roncoleukin ) , IL-1beta recombinant ( betaleukin).

Preparatele de citokine de origine naturală, care conțin un set destul de mare de citokine de inflamație și prima fază a răspunsului imun, se caracterizează printr-un efect multifacetic asupra corpului uman. Aceste medicamente acționează asupra celulelor implicate în inflamație, regenerare și răspunsul imun.

Aldesleukin- un analog recombinant al IL-2. Are efect imunomodulator și antitumoral. Activează imunitatea celulară. Îmbunătățește proliferarea limfocitelor T și a populațiilor de celule dependente de IL-2. Crește citotoxicitatea limfocitelor și a celulelor ucigașe, care recunosc și distrug celulele tumorale. Îmbunătățește producția de interferon gamma, TNF, IL-1. Este utilizat pentru cancerul de rinichi.

Betaleukin- IL-1 beta uman recombinant. Stimulează leucopoieza și apărarea imună. Se administrează sub piele sau intravenos pentru procese purulente cu imunodeficiență, pentru leucopenie ca urmare a chimioterapiei, pentru tumori.

Roncoleukin- un preparat recombinant de interleukină-2 este administrat intravenos pentru sepsis cu imunodeficiență, precum și pentru cancer la rinichi.

Factori de stimulare a coloniei:

Molgramostim(Leukomax) este un preparat recombinant de factor de stimulare a coloniei de granulocite-macrofage umane. Stimulează leucopoieza, are activitate imunotropă. Îmbunătățește proliferarea și diferențierea precursorilor, crește conținutul de celule mature din sângele periferic, creșterea granulocitelor, monocitelor, macrofagelor. Crește activitatea funcțională a neutrofilelor mature, îmbunătățește fagocitoza și metabolismul oxidativ, asigurând mecanismele fagocitozei, crește citotoxicitatea împotriva celulelor maligne.

Filgrastim(Neupogen) este un preparat recombinant de factor de stimulare a coloniei de granulocite umane. Filgrastim reglează producția de neutrofile și intrarea lor în sânge din măduva osoasă.

Lenograstim- un preparat recombinant de factor de stimulare a coloniilor de granulocite umane. Este o proteină foarte rafinată. Este un imunomodulator și stimulator al leucopoiezei.

Imunostimulante sintetice: levamisol, izoprinosin polioxidoniu, galavit.

Levamisol(decaris), un derivat imidazol, este utilizat ca imunostimulant, precum și ca agent antihelmintic pentru ascariază. Proprietățile imunostimulatoare ale levamisolului sunt asociate cu o creștere a activității macrofagelor și a limfocitelor T.

Levamisolul este prescris pe cale orală pentru infecțiile cu herpes recurent, hepatita virală cronică, bolile autoimune (artrita reumatoidă, lupus eritematos sistemic, boala Crohn). Medicamentul este, de asemenea, utilizat pentru tumorile intestinului gros după terapia chirurgicală, radioterapică sau medicamentoasă a tumorilor.

Izoprinosina- un preparat care conține inozină. Stimulează activitatea macrofagelor, producția de interleukine, proliferarea limfocitelor T.

Alocați în interior pentru infecții virale, infecții cronice ale tractului respirator și urinar, imunodeficiență.

Polyoxidonium- compus sintetic polimeric solubil în apă. Medicamentul are un efect imunostimulator și detoxifiant, crește rezistența imună a organismului împotriva infecțiilor locale și generalizate. Polioxidoniul activează toți factorii de rezistență naturală: celulele sistemului monocitar-macrofagic, neutrofilele și celulele ucigașe naturale, crescând activitatea lor funcțională la ratele reduse inițial.

Galavit- un derivat al ftalhidrazidei. Particularitatea acestui medicament constă în prezența nu numai a proprietăților imunomodulatoare, ci și a proprietăților antiinflamatorii pronunțate.

Medicamente din alte clase farmacologice cu activitate imunostimulantă

1. Adaptogeni și preparate pe bază de plante (fitopreparate): preparate de echinacea (imunitară), eleutherococcus, ginseng, rhodiola rosea etc.

2. Vitamine: acid ascorbic (vitamina C), acetat de tocoferol (vitamina E), acetat de retinol (vitamina A) (vezi secțiunea „Vitamine”).

Preparate Echinacea au proprietăți imunostimulante și antiinflamatoare. Atunci când sunt administrate pe cale orală, aceste medicamente cresc activitatea fagocitară a macrofagelor și neutrofilelor, stimulează producția de interleukină-1, activitatea ajutoarelor T și diferențierea limfocitelor B.

Preparatele Echinacea sunt utilizate pentru imunodeficiențe și boli inflamatorii cronice. În special, imunitar sunt prescrise pe cale orală în picături pentru prevenirea și tratamentul infecțiilor respiratorii acute, precum și împreună cu agenți antibacterieni pentru infecții ale pielii, căilor respiratorii și urinare.

Principiile generale ale utilizării imunostimulantelor la pacienții cu imunodeficiență secundară

Cea mai rezonabilă utilizare a imunostimulantelor pare să fie în cazul imunodeficiențelor, manifestate prin creșterea morbidității infecțioase. Ținta principală a medicamentelor imunostimulatoare rămâne imunodeficiențele secundare, care se manifestă prin boli recurente frecvente, dificil de tratat, infecțioase și inflamatorii de toate localizările și orice etiologie. În centrul fiecărui proces cronic infecțios și inflamator se află modificările sistemului imunitar, care sunt unul dintre motivele persistenței acestui proces.

· Imunomodulatorii sunt prescriși în terapie complexă simultan cu antibiotice, antifungice, antiprotozoice sau agenți antivirali.

· Când se efectuează măsuri de imunorehabilitare, în special cu recuperare incompletă după o boală infecțioasă acută, imunomodulatorii pot fi folosiți ca monoterapie.

· Se recomandă utilizarea imunomodulatorilor pe fundalul monitorizării imunologice, care trebuie efectuată indiferent de prezența sau absența modificărilor inițiale ale sistemului imunitar.

· Imunomodulatorii care acționează asupra legăturii fagocitare a imunității pot fi prescriși pacienților cu tulburări identificate și nedetectate ale stării imune, adică baza utilizării lor este tabloul clinic.

O scădere a oricărui parametru de imunitate, relevată în timpul unui studiu de imunodiagnostic la o persoană practic sănătoasă, nu neapărat este baza numirii terapiei imunomodulatoare.

Întrebări de control:

1. Ce sunt imunostimulantele, care sunt indicațiile pentru imunoterapie, în ce tipuri sunt împărțite stările de imunodeficiență?

2. Clasificarea imunomodulatorilor în funcție de selectivitatea preferențială de acțiune?

3. Imunostimulanți de origine microbiană și analogii lor sintetici, proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

4. Imunostimulanți endogeni și analogii lor sintetici, proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

5. Preparatele peptidelor timice și ale măduvei osoase, proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

6. Preparate de imunoglobuline și interferoni (IFN), proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

7. Preparate ale inductorilor de interferon (interferonogeni), proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

8. Preparatele interleukinelor și factorii de stimulare a coloniilor, proprietățile lor farmacologice, indicațiile de utilizare, contraindicațiile, efectele secundare?

9. Imunostimulanții sintetici, proprietățile lor farmacologice, indicații de utilizare, contraindicații, efecte secundare?

10. Medicamente de alte clase farmacologice cu activitate imunostimulatoare și principii generale de utilizare a imunostimulanților la pacienții cu imunodeficiență secundară?