Reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Esența metodei PCR. ADN polimeraza

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă experimentală de biologie moleculară care permite o creștere semnificativă a concentrațiilor mici de anumite fragmente de acid nucleic din materialul biologic. Acest proces de creștere a numărului de copii de ADN este numit amplificare... Copierea ADN în timpul PCR este efectuată de o enzimă specială - polimeraza. ADN polimeraza (Fig. 3) este o enzimă implicată în replicarea ADN-ului (amplificarea ADN-ului în organismele vii). Enzimele din această clasă catalizează polimerizarea deoxiribonucleotidelor de-a lungul lanțului de nucleotide ADN, pe care enzima „le citește” și le folosește ca șablon. Tipul unei noi nucleotide este determinat în conformitate cu principiul complementarității cu șablonul din care este citit.

ADN polimeraza adaugă nucleotide libere la capătul de 3 "al catenei asamblate. Aceasta duce la o alungire a catenei în direcția 5" -3 ". Niciuna dintre ADN-polimerazele cunoscute nu poate crea o catena de la zero: pot adăuga doar nucleotide o grupare deja existentă de 3 "-hidroxil. Din acest motiv, ADN polimeraza are nevoie grund- o scurtă secvență de nucleotide (de obicei 20-25), complementară capetelor genei în studiu - la care ar putea adăuga prima nucleotidă. Primerii constau întotdeauna din baze de ADN și ARN, în timp ce primele două baze sunt întotdeauna baze de ARN. Grundurile sunt sintetizate de o altă enzimă - primazoy... O altă enzimă - helicase- este necesar pentru derularea dublei spirale ADN cu formarea unei structuri monocatenare, care asigură replicarea ambelor catene în conformitate cu modelul de replicare ADN semiconservat.

Unele ADN polimeraze au, de asemenea, capacitatea de a corecta erorile în catena de ADN nou asamblată. Dacă este detectată o pereche incorectă de nucleotide, ADN polimeraza este întoarsă cu un pas înapoi, exclude nucleotida incorectă din lanț, apoi introduce nucleotida corectă în locul său, după care replicarea continuă ca de obicei.

Efectuarea PCR

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o metodă de amplificare a ADN-ului, cu ajutorul căreia, în câteva ore, o secvență specifică de ADN poate fi izolată și multiplicată de miliarde de ori. Posibilitatea de a obține un număr imens de copii ale unei regiuni strict definite a genomului simplifică foarte mult studiul unei probe de ADN disponibile.

Pentru a efectua reacția în lanț a polimerazei, trebuie îndeplinite o serie de condiții. Pentru a efectua PCR în cel mai simplu caz, sunt necesare următoarele componente:

Șablon ADN care conține regiunea ADN care urmează să fie amplificată.

Două grunduri complementare capetelor fragmentului dorit. (O pereche de oligonucleotide sintetizate artificial, de obicei între 15 și 30 bp, sunt identice cu regiunile corespunzătoare ale ADN-ului țintă. Acestea joacă un rol cheie în formarea produselor de reacție de amplificare. Primerii selectați corect oferă specificitatea și sensibilitatea sistemul de testare.)

ADN polimerază termostabilă. Polimeraza utilizată în PCR trebuie să rămână activă la temperaturi ridicate pentru o lungă perioadă de timp, prin urmare, sunt utilizate enzime izolate din termofile - Thermus aquaticus (Taq polimeraza) și altele.

Deoxinucleotide trifosfați (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ioni Mg 2+ necesari pentru ca polimeraza să funcționeze.

Soluție tampon care asigură condițiile de reacție necesare - pH, rezistență ionică a soluției. Conține săruri, albumină serică.

Pentru a evita evaporarea amestecului de reacție, în eprubetă se adaugă un ulei cu fierbere ridicată, de exemplu, vaselină. Dacă utilizați un aparat cu capac încălzit, acest lucru nu este necesar.

Adăugarea pirofosfatazei poate crește randamentul reacției PCR. Această enzimă catalizează hidroliza pirofosfatului, un produs secundar al adăugării de nucleotide trifosfați la lanțul de ADN în creștere, la ortofosfat. Pirofosfatul poate inhiba reacția PCR.

Pentru a multiplica numărul de copii ale ADN-ului original, este necesară o reacție ciclică. De obicei, fiecare dintre ciclurile PCR repetate secvențial constă din trei etape:

1... Denaturarea sau „topirea” ADN-ului.Șablonul de ADN cu catenă dublă este încălzit la 94 - 96 ° C (sau până la 98 ° C, dacă se utilizează o polimerază deosebit de termostabilă) timp de 0,5 - 2 minute, pentru a permite firelor de ADN să se separe. Această etapă se numește denaturare, deoarece legăturile de hidrogen dintre cele două fire ADN sunt distruse. Uneori, înainte de primul ciclu (înainte de adăugarea polimerazei), amestecul de reacție este preîncălzit timp de 2 - 5 minute pentru a denatura complet șablonul și primerii. Această tehnică se numește start fierbinte, permite reducerea cantității de produse de reacție nespecifice.

2. Recuocare - legarea primerilor la ADN-ul șablon... Când lanțurile au divergut, temperatura este coborâtă încet, astfel încât parimerii să se poată lega de matricea monocatenară. Temperatura de recoacere depinde de compoziția primerilor și este de obicei aleasă la 50-65 ° C. Timp de etapă - 20 - 60 de secunde. Alegerea greșită a temperaturii de recoacere duce fie la legarea slabă a grundurilor la șablon (la temperaturi ridicate), fie la legarea într-un loc greșit și la apariția unor produse nespecifice (la temperaturi scăzute).

3. Sinteză (alungirea lanțului). ADN polimeraza replică firul șablon folosind un primer ca „sămânță”. Polimeraza începe sinteza celei de-a doua toroane de la capătul 3 'al primerului, care se leagă de șablon și se deplasează de-a lungul șablonului. Temperatura de alungire depinde de polimerază. Polimerazele Taq și Pfu utilizate frecvent sunt cele mai active la 72 ° C. Timpul de sinteză depinde de tipul de ADN polimerază și de lungimea fragmentului de amplificat De obicei, timpul de alungire este luat egal cu un minut pentru fiecare mie de perechi de baze. executat alungire finală pentru a completa toate fragmentele monocatenare. Această etapă durează 7 - 10 minute.

Ulterior, etapele de denaturare, recoacere și alungire se repetă de multe ori (de 30 sau mai multe ori). La fiecare ciclu, numărul de copii sintetizate ale fragmentului de ADN se dublează.

Toate reacțiile sunt efectuate în eprubete cufundate într-un termostat. Regimul de temperatură este modificat și menținut automat.

Pentru a înțelege exact modul în care are loc amplificarea unui anumit segment de ADN în timpul PCR, este necesar să ne imaginăm clar poziția tuturor primerilor și a secvențelor complementare ale acestora în catene amplificate în fiecare rundă. În prima rundă, fiecare dintre catene nou sintetizate este mult mai mare decât distanța de la gruparea 3'-hidroxil a primerului său la nucleotida terminală a secvenței complementare celui de-al doilea primer. Astfel de catene sunt numite "șabloane lungi", ele va fi folosit pentru sinteza ulterioară.

În cea de-a doua rundă, ADN-ul cu catenă dublă constând din catene similare și nou sintetizate (șablon lung) este denaturat din nou și apoi recoacut cu primeri. În timpul sintezei din această rundă, sunt sintetizate din nou „șabloane lungi”, precum și un număr de fire cu un primer la un capăt și cu o secvență complementară celui de-al doilea primer la celălalt („șabloane scurte”). În timpul celei de-a treia runde, toate heteroduplexele formate anterior sunt simultan denaturate și recuite cu grunduri și apoi reproduse. În rundele ulterioare, numărul „matricilor scurte” devine din ce în ce mai mare, iar până la runda a 30-a numărul lor depășește deja numărul de lanțuri originale sau „matrice lungi” de 10 de 6 ori.

Cantitatea unui produs de reacție specific (limitat de primeri) crește teoretic proporțional cu 2 n, unde n este numărul de cicluri de reacție. De fapt, eficiența fiecărui ciclu poate fi mai mică de 100%, deci în realitate:

unde P este cantitatea de produs, E este eficiența medie a ciclului.

Numărul de copii ADN „lungi” crește, de asemenea, dar liniar, prin urmare, un fragment specific domină în produsele de reacție. Creșterea produsului necesar este limitată exponențial de cantitatea de reactivi, prezența inhibitorilor și formarea de produse secundare.

PCR este o metodă extrem de sensibilă, prin urmare, dacă există chiar și o cantitate nesemnificativă de ADN în proba de testare, care a ajuns accidental de la un amestec de reacție la altul, se pot obține rezultate fals pozitive. Acest lucru face necesară monitorizarea atentă a tuturor soluțiilor și ustensilelor utilizate pentru PCR.

Principiile de bază ale selecției primerului.

La crearea unui sistem de testare PCR, una dintre sarcinile principale este selectarea corectă a grundurilor, care trebuie să îndeplinească o serie de criterii:

1. Grundele trebuie să fie specifice. O atenție deosebită este acordată capetelor 3 'ale primerilor, deoarece de la aceștia începe să se acumuleze catena de ADN complementară Taq polimerază. Dacă specificitatea lor este insuficientă, atunci este posibil ca în eprubetă să apară procese nedorite cu amestecul de reacție, și anume, sinteza ADN-ului nespecific (fragmente scurte sau lungi). Este vizibil pe electroforeză sub formă de benzi suplimentare grele sau ușoare. Acest lucru interferează cu evaluarea rezultatelor reacției, deoarece este ușor să confundați un produs de amplificare specific cu ADN străin sintetizat.la o pierdere semnificativă de sensibilitate.

2. Grundurile nu trebuie să formeze dimeri și bucle; nu trebuie formate lanțuri duble stabile ca urmare a recoacerii primerilor la ei înșiși sau unul la altul.

Ceea ce vă permite să detectați în materialul biologic cantități mici de mai precis anumite fragmente din acesta și să le multiplicați de multe ori. Ele sunt apoi identificate vizual prin electroforeză pe gel. Reacția a fost dezvoltată în 1983 de K. Mullis și este inclusă în lista descoperirilor remarcabile din ultimii ani.

Care sunt mecanismele PCR

Întreaga tehnică se bazează pe capacitatea acizilor nucleici de a se replica independent, care în acest caz se realizează artificial într-un laborator. Reproducerea ADN-ului poate începe nu în nicio regiune a moleculei, ci doar în regiuni cu o anumită secvență de nucleotide - fragmente de pornire. Pentru ca reacția în lanț a polimerazei să înceapă, sunt necesari primeri (sau sonde ADN). Acestea sunt fragmente scurte ale unui lanț ADN cu o secvență de nucleotide dată. Acestea sunt complementare (adică, corespunzătoare) site-urilor de pornire

Desigur, pentru a crea primeri, oamenii de știință trebuie să studieze secvența nucleotidică a celui implicat în tehnică. Aceste sonde ADN sunt cele care oferă specificitatea reacției și inițierea acesteia. nu va funcționa dacă proba nu conține cel puțin o moleculă de ADN dorit. În general, reacția necesită primerii de mai sus, un set de nucleotide și o ADN polimerază rezistentă la căldură. Aceasta din urmă este o enzimă - un catalizator pentru sinteza de noi molecule de acid nucleic pe baza unei probe. Toate aceste substanțe, inclusiv materialul biologic în care este necesar să se identifice ADN-ul, sunt combinate într-un amestec de reacție (soluție). Este plasat într-un termostat special care se încălzește și se răcește foarte repede într-un anumit timp - un ciclu. De obicei sunt 30-50 dintre ele.

Cum merge această reacție?

Esența sa este că în timpul unui ciclu, primerii sunt atașați la secțiunile dorite ale ADN-ului, după care sunt dublate sub acțiunea unei enzime. Pe baza catenelor ADN rezultate, noi și noi fragmente identice ale moleculei sunt sintetizate în ciclurile următoare.

Reacția în lanț a polimerazei se desfășoară secvențial, se disting următoarele etape. Primul se caracterizează printr-o dublare a cantității de produs în timpul fiecărui ciclu de încălzire și răcire. În a doua etapă, reacția încetinește, deoarece enzima este deteriorată și, de asemenea, își pierde activitatea. În plus, rezervele de nucleotide și primeri sunt epuizate. În ultima etapă - un platou - produsele nu se mai acumulează, deoarece reactivii s-au epuizat.

Unde este folosit

Fără îndoială, cea mai largă aplicare a reacției în lanț a polimerazei este în medicină și știință. Este utilizat în biologie generală și privată, medicină veterinară, farmacie și chiar ecologie. Mai mult, în acesta din urmă, acest lucru se face pentru a urmări calitatea alimentelor și a obiectelor din mediul extern. Reacția în lanț a polimerazei este utilizată activ în practica criminalistică pentru a confirma paternitatea și a identifica personalitatea unei persoane. În examinarea medicală criminalistică, precum și în paleontologie, această tehnică este adesea singura cale de ieșire, deoarece de obicei o cantitate extrem de mică de ADN este disponibilă pentru cercetare. Desigur, metoda a găsit o aplicare foarte largă în medicina practică. Este necesar în domenii precum genetica, bolile infecțioase și oncologice.

Cu toate acestea, la acel moment această idee a rămas neaclamată. Reacția în lanț a polimerazei a fost redescoperită în 1983 de Carey Mallis. Scopul său a fost să creeze o metodă care să permită amplificarea ADN-ului în cursul multiplelor duplicări secvențiale ale moleculei originale de ADN utilizând enzima ADN polimerază. La 7 ani de la publicarea acestei idei, în 1993, Mullis a primit Premiul Nobel pentru aceasta.

La începutul utilizării metodei, după fiecare ciclu de încălzire - răcire, a fost necesar să se adauge ADN polimerază la amestecul de reacție, deoarece a fost rapid inactivată la temperatura ridicată necesară pentru a separa firele helixului ADN. Procedura a fost foarte ineficientă și a necesitat mult timp și enzimă. În 1986, a fost îmbunătățit semnificativ. S-a propus utilizarea ADN polimerazelor de la bacterii termofile. Aceste enzime s-au dovedit a fi stabile termic și au fost capabile să reziste la cicluri de reacție multiple. Utilizarea lor a făcut posibilă simplificarea și automatizarea PCR. Una dintre primele ADN polimeraze termostabile a fost izolată de bacterii Thermus aquaticusși numit Taq-polimeraza. Dezavantajul acestei polimeraze este că probabilitatea introducerii unei nucleotide eronate este destul de mare, deoarece această enzimă nu are mecanisme de corectare a erorilor (activitate de exonuclează de 3 "→ 5"). Polimeraza Pfuși Pwo izolate de arhaea posedă un astfel de mecanism, utilizarea lor reduce semnificativ numărul de mutații în ADN, dar viteza muncii lor (procesivitate) este mai mică decât cea a Taq... Acum se folosesc amestecuri Taqși Pfu pentru a obține atât o viteză mare de polimerizare, cât și o precizie ridicată a copiei.

La momentul invenției metodei, Mallis lucra pentru Cetus Corporation, care a brevetat metoda PCR. În 1992, Cetus a vândut drepturile asupra metodei și brevetului de utilizare Taq-polimeraza de la compania Hoffmann-La Roche pentru 300 de milioane de dolari. Cu toate acestea, sa dovedit că Taq-polimeraza a fost caracterizată de biochimistul rus Alexei Kaledin în 1980, în legătură cu care compania Promega (Promega) a încercat să-l oblige pe Roche în instanță să renunțe la drepturile exclusive asupra acestei enzime. Brevetul SUA pentru metoda PCR a expirat în martie 2005.

Efectuarea PCR

Metoda se bazează pe copierea selectivă multiplă a unei regiuni specifice de ADN folosind enzime în condiții artificiale ( in vitro). În acest caz, numai secțiunea care îndeplinește condițiile specificate este copiată și numai dacă este prezentă în eșantionul studiat. Spre deosebire de amplificarea ADN-ului în organismele vii, (replicare), secțiuni relativ scurte de ADN sunt amplificate folosind PCR. Într-un proces PCR convențional, lungimea regiunilor ADN copiate nu depășește 3000 perechi de baze (3 kbp). Folosind un amestec de diverse polimeraze, folosind aditivi și în anumite condiții, lungimea fragmentului PCR poate ajunge la 20-40 mii perechi de baze. Aceasta este încă semnificativ mai mică decât lungimea ADN-ului cromozomial al unei celule eucariote. De exemplu, genomul uman este format din aproximativ 3 miliarde de perechi de baze.

Componente de reacție

Pentru a efectua PCR în cel mai simplu caz, sunt necesare următoarele componente:

Matrice ADN care conține porțiunea de ADN pe care doriți să o amplificați.
Două grunduri complementare capetelor opuse ale diferitelor fire ale fragmentului de ADN dorit.
Termostabil ADN polimerază- o enzimă care catalizează reacția de polimerizare a ADN-ului. Polimeraza pentru utilizare în PCR trebuie să păstreze activitatea la o temperatură ridicată mult timp, prin urmare, se folosesc enzime izolate din termofili - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) și altele.
Deoxinucleozid trifosfați(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ioni Mg 2+ necesari pentru ca polimeraza să funcționeze.
Soluție tampon asigurarea condițiilor de reacție necesare - pH, puterea ionică a soluției. Conține săruri, albumină serică bovină.

Pentru a evita evaporarea amestecului de reacție, în eprubetă se adaugă un ulei cu fierbere ridicată, de exemplu, vaselină. Acest lucru nu este necesar dacă se utilizează un termociclator cu capac încălzit.

Grunduri

Specificitatea PCR se bazează pe formarea de complexe complementare între șablon și grunduri, oligonucleotide scurte sintetice cu lungimea de 18-30 de baze. Fiecare dintre grunduri este complementar cu unul dintre firele șablonului cu două fire și delimitează începutul și sfârșitul regiunii amplificate.

După hibridizarea șablonului cu primerul (recoacere), acesta din urmă servește ca primer pentru ADN polimeraza în sinteza catenei complementare a șablonului (vezi).

Cea mai importantă caracteristică a grundurilor este temperatura de topire (Tm) a complexului grund-șablon. Tm este temperatura la care jumătate din șabloanele de ADN formează un complex cu primerul oligonucleotidic. Punctul de topire poate fi determinat aproximativ de formula, unde n X este numărul de X nucleotide din primer. În cazul unei alegeri incorecte a lungimii și compoziției nucleotidice a primerului sau a temperaturii de recoacere, este posibilă formarea de complexe parțial complementare cu alte regiuni ale ADN-ului șablon, ceea ce poate duce la apariția unor produse nespecifice. Limita superioară a punctului de topire este limitată de temperatura optimă a acțiunii polimerazei, a cărei activitate scade la temperaturi peste 80 ° C.

Atunci când alegeți grundurile, este recomandabil să respectați următoarele criterii:

Amplificator

Orez. 1: Amplificator pentru PCR

PCR se efectuează într-un amplificator - un dispozitiv care asigură răcirea și încălzirea periodică a tuburilor, de obicei cu o precizie de cel puțin 0,1 ° C. Amplificatoarele moderne vă permit să setați programe complexe, inclusiv cu posibilitatea de „pornire la cald”, Touchdown PCR (a se vedea mai jos) și stocarea ulterioară a moleculelor amplificate la 4 ° C. Pentru PCR în timp real, sunt produse dispozitive echipate cu un detector fluorescent. Există, de asemenea, instrumente cu capac automat și compartiment pentru microplacă pentru integrare în sisteme automate.

Progresul reacției

Fotografia unui gel care conține ADN marker (1) și produse de reacție PCR (2,3). Numerele arată lungimea fragmentelor de ADN în perechi de nucleotide

De obicei, atunci când se efectuează PCR, se efectuează 20-35 de cicluri, fiecare dintre ele constând din trei etape (Fig. 2).

Denaturare

Șablonul de ADN cu catenă dublă este încălzit la 94-96 ° C (sau 98 ° C dacă se utilizează o polimerază deosebit de termostabilă) timp de 0,5-2 minute pentru a permite separarea catenelor de ADN. Această etapă se numește denaturare, deoarece legăturile de hidrogen dintre cele două fire ADN sunt distruse. Uneori, înainte de primul ciclu (înainte de adăugarea polimerazei), amestecul de reacție este preîncălzit timp de 2-5 minute. pentru denaturarea completă a șablonului și grundurilor. Această tehnică se numește start fierbinte, permite reducerea cantității de produse de reacție nespecifice.

Recomandare

Când firele s-au dispersat, temperatura este redusă astfel încât grundii să se poată lega de șablonul monocatenar. Această etapă se numește recoacere... Temperatura de recoacere depinde de compoziția primerilor și este de obicei aleasă cu 4-5 ° C sub punctul lor de topire. Timp de etapă - 0,5-2 minute. Alegerea greșită a temperaturii de recoacere duce fie la legarea slabă a grundurilor la șablon (la temperaturi ridicate), fie la legarea într-un loc greșit și la apariția unor produse nespecifice (la temperaturi scăzute).

Elongaţie

Soiuri de PCR

PCR „cuibărit” (PCR imbricat (eng.)) - utilizat pentru a reduce numărul de produse secundare ale reacției. Se folosesc două perechi de primer și se efectuează două reacții consecutive. O a doua pereche de primeri amplifică o întindere de ADN în cadrul produsului primei reacții.
PCR "invers" (PCR invers (eng.)) - utilizat în cazul în care se cunoaște doar o mică zonă din secvența dorită. Această metodă este utilă mai ales atunci când este necesar să se determine secvențele adiacente după introducerea ADN-ului în genom. Pentru a efectua PCR inversat, se efectuează o serie de tăieri ADN cu endonucleaze de restricție, urmate de unirea fragmentelor (ligare). Ca rezultat, fragmentele cunoscute apar la ambele capete ale regiunii necunoscute, după care PCR poate fi efectuat ca de obicei.
Transcrierea inversă PCR (RT-PCR) este utilizată pentru a amplifica, izola sau identifica o secvență cunoscută dintr-o bibliotecă de ARN. Înainte de PCR convențională, o moleculă de ADN monocatenar este sintetizată pe șablonul mARN folosind transcriptază inversă și se obține un ADNc monocatenar, care este utilizat ca șablon pentru PCR. Această metodă este adesea utilizată pentru a determina unde și când sunt exprimate aceste gene.
PCR asimetric (rus. PCR asimetric) - se efectuează atunci când este necesar să se amplifice în principal una dintre firele ADN-ului original. Utilizat în unele tehnici de analiză a secvențierii și hibridizării. PCR se efectuează ca de obicei, cu excepția faptului că unul dintre primeri este luat într-un exces mare.
PCR cantitativă (Q-PCR) este utilizată pentru a măsura rapid cantitatea de ADN, ADNc sau ARN specific dintr-o probă.
PCR cantitativă în timp real - Această metodă utilizează reactivi etichetați fluorescent pentru a măsura cu precizie cantitatea unui produs de reacție pe măsură ce se acumulează.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - cu această metodă, efectul legării primerului nespecifice asupra formării produsului este redus. Primele cicluri se efectuează la o temperatură peste temperatura de recoacere, apoi temperatura este redusă la fiecare câteva cicluri. La o anumită temperatură, sistemul va trece prin banda de specificitate optimă a primerilor pentru ADN.
Metoda coloniei moleculare (gel PCR) Polony - PCR Colony) - gelul de acrilamidă este polimerizat cu toate componentele PCR de pe suprafață și se efectuează PCR. În punctele care conțin ADN-ul analizat, amplificarea are loc odată cu formarea coloniilor moleculare.
PCR cu amplificare rapidă a capetelor ADNc (rus. Amplificarea rapidă a capetelor de ADNc, RACE-PCR )
Fragment lung PCR (rus. PCR cu rază lungă de acțiune) - modificarea PCR pentru amplificarea regiunilor extinse de ADN (10 mii baze și mai mult). Se utilizează două polimeraze, dintre care una este polimeraza Taq cu procesivitate ridicată (adică capabilă să sintetizeze un lanț lung de ADN într-o singură trecere), iar a doua este o ADN polimerază cu activitate de endonuclează 3 "-5". A doua polimerază este necesară pentru a corecta erorile introduse de prima.
RAPD PCR (eng. Amplificarea aleatorie a ADN-ului polimorf PCR , PCR cu amplificare aleatorie a ADN-ului polimorf - este utilizat atunci când este necesar să se distingă organisme apropiate în secvență genetică, de exemplu, diferite soiuri de plante cultivate, rase de câini sau microorganisme strâns legate. Această metodă folosește de obicei un primer mic (20-25 bp). Acest primer va fi parțial complementar regiunilor aleatorii de ADN ale organismelor studiate. Prin selectarea condițiilor (lungimea primerului, compoziția, temperatura etc.), este posibil să se obțină o diferență satisfăcătoare în modelul PCR pentru două organisme.

Dacă secvența de nucleotide a șablonului este parțială sau deloc necunoscută, puteți utiliza grunduri degenerate, secvența căreia conține poziții degenerate în care se pot localiza orice baze. De exemplu, secvența de grund poate fi: ... ATH ..., unde H este A, T sau C.

Aplicație PCR

PCR este utilizat în multe domenii pentru analize și experimente științifice.

Criminalistica

PCR este utilizată pentru a compara așa-numitele „amprente genetice”. Este necesară o probă de material genetic de la locul crimei - sânge, salivă, material seminal, păr etc. Este comparată cu materialul genetic al suspectului. O cantitate foarte mică de ADN este suficientă, teoretic - un exemplar. ADN-ul este clivat în fragmente, apoi amplificat prin PCR. Fragmentele sunt separate folosind electroforeza ADN-ului. Imaginea rezultată a localizării benzilor ADN este numită amprenta genetica(eng. amprenta genetica).

Stabilirea paternității

Orez. 3: Rezultate ale electroforezei fragmentelor de ADN amplificate prin PCR. (1) Tată. (2) Copil. (3) Mama. Copilul a moștenit unele dintre caracteristicile amprentei genetice a ambilor părinți, ceea ce a dat o amprentă nouă, unică.

Deși „amprentele genetice” sunt unice (cu excepția cazului gemenilor identici), legăturile de familie pot fi stabilite încă prin realizarea mai multor astfel de amprente (Fig. 3). Aceeași metodă poate fi aplicată, cu ușoare modificări, pentru a stabili înrudirea evolutivă între organisme.

Diagnostic medical

PCR face posibilă accelerarea semnificativă și facilitarea diagnosticului bolilor ereditare și virale. Gena dorită este amplificată prin PCR folosind primerii corespunzători și apoi secvențiată pentru a detecta mutațiile. Infecțiile virale pot fi detectate imediat după infecție, cu săptămâni sau luni înainte de apariția simptomelor.

Medicină personalizată

Se știe că majoritatea medicamentelor nu funcționează la toți pacienții cărora le sunt destinate, ci doar la 30-70% din numărul lor. În plus, multe medicamente sunt toxice sau alergene pentru unii pacienți. Motivele pentru aceasta sunt parțial diferențele individuale în sensibilitatea și metabolismul medicamentelor și al derivaților acestora. Aceste diferențe sunt determinate la nivel genetic. De exemplu, la un pacient, un anumit citocrom (o proteină hepatică responsabilă de metabolismul substanțelor străine) poate fi mai activ, în altul mai puțin. Pentru a determina ce fel de citocrom posedă un anumit pacient, s-a propus efectuarea unei analize PCR înainte de a utiliza medicamentul. Această analiză se numește genotipare preliminară (eng. genotipare prospectivă).

Clonarea genelor

Clonarea genelor (care nu trebuie confundată cu organismele de clonare) este procesul de izolare a genelor și, ca urmare a manipulărilor de inginerie genetică, obținerea unei cantități mari din produsul unei gene date. PCR este utilizată pentru a amplifica o genă, care este apoi inserată în vector- un fragment de ADN care transferă o genă străină în același sau altul, convenabil pentru creștere, organism. Ca vectori sunt utilizați, de exemplu, plasmide sau ADN viral. Inserarea genelor într-un organism străin este de obicei utilizată pentru a obține produsul acestei gene - ARN sau, mai des, o proteină. Astfel, multe proteine sunt obținute în cantități industriale pentru utilizare în agricultură, medicină etc.

Orez. 4: Clonarea unei gene folosind o plasmidă. ...
(1) ADN cromozomial al organismului A. (2) PCR. (3) Multe copii ale genei organismului A. (4) Inserarea genei în plasmidă. (5) Plasmida cu gena organismului A. (6) Introducerea plasmidei în organismul B. (7) Înmulțirea numărului de copii ale genei organismului A din organismul B.

Secvențierea ADN-ului

În metoda de secvențiere care utilizează dideoxinucleotide cu izotop marcat fluorescent sau radioactiv, PCR este o parte integrantă, deoarece în timpul polimerizării se încorporează în catena ADN derivații nucleotidici etichetați cu o etichetă fluorescentă sau radioactivă. Aceasta oprește reacția, permițând determinarea poziției nucleotidelor specifice după separarea firelor sintetizate în gel.

Mutageneză

În prezent, PCR a devenit principala metodă pentru efectuarea mutagenezei. Utilizarea PCR a făcut posibilă simplificarea și accelerarea procedurii de efectuare a mutagenezei, precum și îmbunătățirea fiabilității și reproductibilității acesteia.

1. Reacția în lanț a polimerazei (PCR)

2. Principiul metodei de reacție în lanț a polimerazei

2.1 Prezența unui număr de componente în amestecul de reacție

2.2 Condiții de temperatură ciclică

2.3 Principiile de bază ale selecției primerului

2.4 Efectul „platou”

3. Etapele producției PCR

3.2 Amplificare

3.4.1 Controale pozitive

3.4.2 Controale interne

4.1 Analiza calitativă

4.1.2 Detectarea moleculelor de ARN

3.1 Pregătirea unei probe de material biologic

Pentru extracția ADN-ului, se utilizează diverse tehnici, în funcție de sarcini. Esența lor constă în extracția (extracția) ADN-ului dintr-un produs biologic și în eliminarea sau neutralizarea impurităților pentru a obține un preparat ADN cu o puritate adecvată pentru PCR.

Metoda pentru obținerea unui preparat ADN pur descris de Marmur este considerată standard și a devenit deja clasică. Include proteoliza enzimatică urmată de deproteinizare și reprecipitarea ADN-ului cu alcool. Această metodă vă permite să obțineți un preparat ADN pur. Cu toate acestea, este destul de laborios și implică lucrul cu substanțe agresive și înțepătoare precum fenolul și cloroformul.

Una dintre metodele populare în prezent este metoda de extracție a ADN-ului propusă de Boom și colab. Această metodă se bazează pe utilizarea unui agent chaotropic puternic, tiocianat de guanidină (GuSCN), pentru liza celulară și absorbția ulterioară a ADN-ului pe un purtător (margele de sticlă, pământ de diatomee, „lapte” de sticlă etc.). După spălare, ADN-ul rămâne în probă, adsorbit pe un purtător, din care poate fi ușor îndepărtat folosind un tampon de eluție. Metoda este convenabilă, tehnologică și adecvată pentru pregătirea unei probe pentru amplificare. Cu toate acestea, pierderile de ADN sunt posibile datorită sorbției ireversibile asupra purtătorului, precum și în procesul de numeroase spălări. Acest lucru este deosebit de important atunci când se lucrează cu cantități mici de ADN din probă. În plus, chiar și urme de GuSCN pot inhiba PCR. Prin urmare, atunci când se utilizează această metodă, alegerea corectă a sorbentului și respectarea atentă a nuanțelor tehnologice sunt foarte importante.

Un alt grup de metode de preparare a probelor se bazează pe utilizarea schimbătorilor de ioni de tip Chilex, care, spre deosebire de sticlă, nu adsorb ADN-ul, ci, dimpotrivă, impuritățile care interferează cu reacția. De regulă, această tehnologie include două etape: fierberea probei și absorbția impurităților pe schimbătorul de ioni. Metoda este extrem de atractivă pentru simplitatea sa de execuție. În majoritatea cazurilor, este potrivit pentru lucrul cu material clinic. Din păcate, uneori există probe cu astfel de impurități care nu pot fi eliminate cu ajutorul schimbătorilor de ioni. În plus, unele microorganisme nu pot fi distruse prin simpla fierbere. În aceste cazuri, este necesar să se introducă etape suplimentare de prelucrare a probelor.

Astfel, alegerea metodei de preparare a probei ar trebui luată în considerare cu o înțelegere a obiectivelor analizelor intenționate.

3.2 Amplificare

Pentru a efectua reacția de amplificare, este necesar să se pregătească un amestec de reacție și să se adauge proba de ADN analizată la acesta. În acest caz, este important să se țină seama de unele dintre caracteristicile recoacerii grundului. Faptul este că, de regulă, proba biologică analizată conține o varietate de molecule de ADN, la care primerii utilizați în reacție au omologie parțială și, în unele cazuri, semnificativă. În plus, grundurile se pot recoace reciproc pentru a forma dimeri de grund. Ambele duc la un consum semnificativ de primeri pentru sinteza produselor secundare de reacție (nespecifice) și, în consecință, reduce semnificativ sensibilitatea sistemului. Acest lucru face dificilă sau imposibilă citirea rezultatelor reacției în timpul electroforezei.

3.3 Evaluarea rezultatelor reacției

Pentru o evaluare corectă a rezultatelor PCR, este important să înțelegem că această metodă nu este cantitativă. Teoretic, produsele de amplificare a moleculelor de ADN cu țintă unică pot fi detectate prin electroforeză după 30-35 de cicluri. Cu toate acestea, în practică, acest lucru se face numai în cazurile în care reacția are loc în condiții apropiate de ideal, ceea ce nu se întâlnește adesea în viață. Gradul de puritate al preparatului ADN are o influență deosebit de mare asupra eficienței amplificării, adică prezența anumitor inhibitori în amestecul de reacție, care în unele cazuri poate fi extrem de dificil de scăpat. Uneori, datorită prezenței lor, nu este posibil să se amplifice nici măcar zeci de mii de molecule de ADN țintă. Astfel, de multe ori nu există o relație directă între cantitatea inițială de ADN țintă și cantitatea finală de produse de amplificare.

3.3.1 Metoda de electroforeză orizontală

Sunt utilizate diverse metode pentru a vizualiza rezultatele amplificării. Cea mai comună metodă astăzi este electroforeza, bazată pe separarea moleculelor de ADN în funcție de mărime. Pentru a face acest lucru, pregătiți o placă de gel de agaroză, care este înghețată după topire într-un agaroză tampon de electroforeză la o concentrație de 1,5-2,5% cu adăugarea unui colorant ADN special, de exemplu, bromură de etidiu. Agaroza înghețată formează o rețea spațială. La umplerea cu piepteni, se formează puțuri speciale în gel, în care sunt introduse ulterior produse de amplificare. Placa de gel este plasată într-un aparat de electroforeză orizontală pe gel și este conectată o sursă de tensiune constantă. ADN-ul încărcat negativ începe să se deplaseze de la minus la plus în gel. În acest caz, moleculele ADN mai scurte se mișcă mai repede decât cele lungi. Viteza mișcării ADN-ului în gel este influențată de concentrația de agaroză, intensitatea câmpului electric, temperatura, compoziția tamponului de electroforeză și, într-o măsură mai mică, compoziția GC a ADN-ului. Toate moleculele de aceeași dimensiune se mișcă cu aceeași viteză. Colorantul este încorporat (intercalat) în grupuri plane în molecule de ADN. După sfârșitul electroforezei, care durează de la 10 minute la 1 oră, gelul este plasat pe filtrul unui transiluminator care emite lumină în domeniul ultraviolet (254 - 310 nm). Energia UV absorbită de ADN în regiunea de 260 nm este transferată la colorant, provocând fluorescența în regiunea roșu-portocaliu a spectrului vizibil (590 nm).

Luminozitatea benzilor produselor de amplificare poate fi diferită. Cu toate acestea, acest lucru nu poate fi legat de cantitatea inițială de ADN țintă din eșantion.

3.3.2 Metoda de electroforeză verticală

Metoda electroforezei verticale este fundamental similară cu electroforeza orizontală. Diferența lor constă în faptul că în acest caz se folosesc geluri de poliacrilamidă în locul agarozei. Se efectuează într-o cameră specială pentru electroforeză verticală. Electroforeza pe gel de poliacrilamidă are o rezoluție mai mare în comparație cu electroforeza cu agaroză și face posibilă distingerea moleculelor de ADN de diferite dimensiuni cu o precizie de un nucleotid. Prepararea unui gel de poliacrilamidă este ceva mai complicată decât un gel de agaroză. În plus, acrilamida este o substanță toxică. Deoarece rareori apare necesitatea de a determina mărimea produsului de amplificare cu o precizie de 1 nucleotidă, metoda de electroforeză orizontală este utilizată în lucrările de rutină.

3.4 Controlul asupra trecerii reacției de amplificare

3.4.1 Controale pozitive

Un preparat ADN al microorganismului dorit este utilizat ca „control pozitiv”. Ampliconii nespecifici diferă ca mărime de ampliconii generați prin amplificare cu un preparat ADN de control. Dimensiunea produselor nespecifice poate fi mai mare sau mai mică decât controlul pozitiv. În cel mai rău caz, aceste dimensiuni pot coincide și sunt citite în electroforeză ca fiind pozitive.

Pentru a controla specificitatea produsului de amplificare generat, puteți utiliza sonde de hibridizare (regiuni ADN situate în interiorul secvenței amplificate) etichetate cu etichete enzimatice sau izotopi radioactivi și care interacționează cu ADN în conformitate cu aceleași principii ca primerii. Acest lucru complică și prelungește semnificativ analiza, iar costul acesteia crește semnificativ.

3.4.2 Controale interne

Este necesar să se controleze cursul amplificării în fiecare tub cu amestecul de reacție. În acest scop, se folosește un așa-numit „control intern” suplimentar. Este orice preparat ADN care este diferit de ADN-ul microorganismului țintă. Dacă controlul intern este adăugat la amestecul de reacție, acesta va deveni aceeași țintă pentru recoacerea primerului ca ADN-ul cromozomial al agentului infecțios dorit. Mărimea produsului de amplificare a controlului intern este selectată astfel încât să fie de 2 sau mai multe ori mai mare decât ampliconii formați din amplificarea ADN-ului dorit al microorganismului. Ca rezultat, dacă ADN-ul de control intern este adăugat la amestecul de reacție împreună cu proba de testare, atunci indiferent de prezența microorganismului în proba biologică, controlul intern va provoca formarea de ampliconi specifici, dar mult mai lung (greu ) decât ampliconul microorganismului. Prezența ampliconilor grei în amestecul de reacție va indica progresul normal al reacției de amplificare și absența inhibitorilor. Dacă nu s-au format ampliconi de dimensiunea necesară, dar nici nu s-au format ampliconi ai controlului intern, se poate concluziona că există probe nedorite în proba analizată, care ar trebui eliminate, dar nu și despre absența ADN-ului dorit .

Din păcate, în ciuda atractivității acestei abordări, are un defect semnificativ. Dacă ADN-ul necesar se află în amestecul de reacție, atunci eficiența amplificării acestuia este redusă brusc datorită concurenței cu controlul intern pentru grunduri. Acest lucru este deosebit de important la concentrații scăzute de ADN în proba de testare, ceea ce poate duce la rezultate fals negative.

Cu toate acestea, dacă problema competiției pentru grunduri este rezolvată, această metodă de control al eficienței amplificării va fi cu siguranță foarte utilă.

4. Metode bazate pe reacția în lanț a polimerazei

4.1 Analiza calitativă

Metoda clasică de realizare a PCR, ale cărei principii au fost subliniate mai sus, și-a găsit dezvoltarea în unele modificări care vizează depășirea limitărilor PCR și creșterea eficienței reacției.

4.1.1 Metoda de configurare a PCR utilizând „pornirea la cald”

Pentru a reduce riscul de formare a produselor nespecifice ale reacției de amplificare, se utilizează o abordare numită „pornire la cald” („pornire la cald”).

Faptul este că, în funcție de compoziția și dimensiunea GC, primerii au un anumit punct de topire (Tm). Dacă temperatura sistemului depășește Tm, grundul este incapabil să adere la firul ADN și se denaturează. În condiții optime, adică la temperatura de recoacere apropiată de temperatura de topire, grundul formează o moleculă dublu catenară numai în condiția complementarității sale complete și, astfel, asigură specificitatea reacției.

Există diferite opțiuni pentru implementarea unui start rapid:

Introducerea Taq-polimerazei în amestecul de reacție în timpul primului ciclu după încălzirea tubului la temperatura de denaturare.

Separarea ingredientelor amestecului de reacție cu un strat de parafină în straturi (în partea inferioară - grunduri, în partea superioară - Taq-polimerază și țintă ADN), care sunt amestecate atunci când parafina este topită (~ 65-75 0 С ).

Utilizarea anticorpilor monoclonali împotriva Taq polimerazei. Enzima legată de anticorpii monoclonali devine activă numai după prima etapă de denaturare, când anticorpii monoclonali denaturează și eliberează ireversibil site-urile active ale polimerazei Taq.

În toate aceste cazuri, chiar dacă recoacerea nespecifică a avut loc înainte de apariția ciclului de temperatură, alungirea nu are loc, iar la încălzire, complexele primer-ADN sunt denaturate, prin urmare nu se formează produse nespecifice. Mai mult, temperatura din eprubetă nu scade sub temperatura de topire, ceea ce asigură formarea unui produs de amplificare specific.

4.1.2 Detectarea moleculelor de ARN

Posibilitatea utilizării ARN ca țintă pentru PCR extinde semnificativ gama de aplicații ale acestei metode. De exemplu, genomul multor virusuri (hepatita C, virusul gripal, picornavirusurile etc.) sunt reprezentate de ARN. În același timp, nu există nicio fază intermediară de transformare în ADN în ciclurile lor de viață. Pentru a detecta ARN-ul, este necesar în primul rând să-l transformăm în formă de ADN. Pentru aceasta se folosește transcriptaza inversă, care este izolată de doi viruși diferiți: virusul mieloblastozei aviare și virusul leucemiei murine Moloney. Utilizarea acestor enzime este asociată cu unele dificultăți. În primul rând, acestea sunt termolabile și, prin urmare, pot fi utilizate la temperaturi care nu depășesc 42 ° C. Deoarece la această temperatură moleculele de ARN formează cu ușurință structuri secundare, eficiența reacției este redusă considerabil și, conform diferitelor estimări, este de aproximativ 5%. Se încearcă eludarea acestui dezavantaj folosind o polimerază termostabilă obținută din microorganismul termofil Thermus Thermophilus, care prezintă activitate transcriptază în prezența Mn 2+, ca transcriptază inversă. Este singura enzimă cunoscută capabilă să prezinte atât activitate de polimerază, cât și activitate de transcriptază.

Pentru a efectua reacția de transcripție inversă în amestecul de reacție, precum și în PCR, primerii trebuie să fie prezenți ca primer și un amestec de 4 dNTP ca material de construcție.

După reacția de transcripție inversă, moleculele ADNc rezultate pot servi drept țintă pentru PCR.

5. Organizarea procesului tehnologic de stadializare PCR

Sensibilitatea potențial ridicată a reacției în lanț a polimerazei face esențială o proiectare de laborator PCR deosebit de amănunțită. Acest lucru se datorează celei mai acute probleme a metodei - contaminarea.

Contaminarea este pătrunderea unor molecule ADN specifice din mediul extern în amestecul de reacție care pot servi drept ținte în reacția de amplificare și pot da rezultate fals pozitive.

Există mai multe modalități de a face față acestui fenomen neplăcut. Una dintre ele este utilizarea enzimei N-uracil-glicozilaza (UG). Această metodă se bazează pe capacitatea UG de a cliva moleculele ADN cu uracil încorporat. Reacția de amplificare se efectuează folosind un amestec de dNTP, în care dTTP este înlocuit cu uracil, iar după ciclul termic, toți ampliconii formați în eprubetă vor conține uracil. Dacă se adaugă UG la amestecul de reacție înainte de amplificare, atunci ampliconii din amestecul de reacție vor fi distruși, în timp ce ADN-ul nativ va rămâne intact și va servi în continuare ca țintă pentru amplificare.

Astfel, această metodă elimină într-o oarecare măsură sursa de contaminare și nu garantează împotriva rezultatelor fals pozitive.

O altă modalitate de a face față rezultatelor contaminării este de a reduce semnificativ numărul de cicluri de reacție (până la 25-30 de cicluri). Dar chiar și cu această abordare, riscul de a obține rezultate fals pozitive este mare, deoarece, în acest caz, în absența inhibitorilor, este ușor să obțineți un produs de amplificare din cauza contaminării.

Astfel, în ciuda beneficiilor măsurilor de preamplificare care vizează inactivarea moleculelor de ADN care provoacă rezultate fals pozitive, cel mai radical mijloc este o organizare bine gândită a laboratorului.

Concluzie

Cea mai răspândită metodă de PCR este primită în prezent ca metodă pentru diagnosticarea diferitelor boli infecțioase. PCR vă permite să identificați etiologia infecției, chiar dacă proba luată pentru analiză conține doar câteva molecule de ADN ale agentului patogen. PCR este utilizat pe scară largă în diagnosticul precoce al infecțiilor cu HIV, hepatitelor virale etc. Astăzi, nu există aproape niciun agent infecțios care să nu poată fi detectat folosind PCR.

Nu cu mult timp în urmă, a fost dezvoltată o metodă fiabilă, extrem de sensibilă și rapidă pentru diagnosticarea diferitelor boli infecțioase la om. Această metodă se numește „analiză PCR”. Ce este, care este esența sa, ce microorganisme poate detecta și cum să o ia corect, vă vom spune în articolul nostru.

Istoria descoperirilor

De asemenea, metodele PCR sunt utilizate în diagnosticul cancerului.

Avantajele metodei

Diagnosticul PCR are o serie de avantaje:

Sensibilitate crescută. Chiar dacă există doar câteva molecule de ADN ale unui microorganism, analiza PCR detectează prezența unei infecții. Metoda va ajuta cu bolile cronice și latente. Adesea, în astfel de cazuri, microorganismul este necultivat prin alte mijloace.
Orice material este potrivit pentru cercetare, de exemplu, saliva, sângele, secrețiile genitale, părul, celulele epiteliale. Cel mai frecvent este un test de sânge și un frotiu urogenital pentru PCR.
Cultivarea pe termen lung a culturilor nu este necesară. Procesul automat de diagnosticare vă permite să obțineți rezultatele studiului după 4-5 ore.
Metoda este aproape 100% fiabilă. Au fost înregistrate doar câteva cazuri de rezultate false negative.
Capacitatea de a identifica mai multe tipuri de agenți patogeni dintr-un eșantion de material. Acest lucru nu numai că accelerează procesul de diagnosticare a bolii, ci și reduce semnificativ costurile materiale. Adesea medicul prescrie o analiză PCR cuprinzătoare. Costul examinării, care constă în identificarea a șase agenți patogeni, este de aproximativ 1.500 de ruble.

Pentru ca rezultatele să fie fiabile atunci când se efectuează un studiu PCR, este necesar să treceți analiza, urmând recomandările pentru pregătirea preliminară pentru diagnostic:

Înainte de a dona salivă, trebuie să vă abțineți de la a lua alimente și medicamente timp de 4 ore înainte de a lua materialul. Imediat înainte de procedură, clătiți-vă gura cu apă fiartă.
Regulile de mai sus trebuie respectate atunci când se ia o probă de pe suprafața interioară a obrazului. După clătire, se recomandă efectuarea unui masaj ușor al pielii pentru a elibera secreția glandei.
Urina se colectează de obicei acasă. Pentru a face acest lucru, trebuie să efectuați o toaletă completă a organelor genitale. Se colectează 50-60 ml de urină într-un recipient de plastic steril. Pentru a asigura puritatea materialului, este recomandat femeilor să introducă un tampon în vagin, iar bărbaților să scoată cât mai mult posibil pliul pielii. Nu puteți dona material în perioada fluxului menstrual.
Pentru a dona spermă, trebuie să vă abțineți de la actul sexual timp de 3 zile înainte de a lua materialul. De asemenea, medicii sfătuiesc să renunțe la vizitarea saunei și la baia fierbinte, consumul de alcool și alimente picante. Cu 3 ore înainte de analiză, trebuie să vă abțineți de la urinare.
Pentru livrare, de exemplu, dacă se efectuează o analiză pentru Chlamydia PCR, atât femeilor, cât și bărbaților li se recomandă să se odihnească sexual timp de 3 zile. Medicamentele antibacteriene nu trebuie luate cu 2 săptămâni înainte de analiză. Timp de o săptămână, trebuie să nu mai folosiți geluri intime, unguente, supozitoare vaginale, dușuri. Cu 3 ore înainte de studiu, trebuie să vă abțineți de la urinare. În timpul menstruației, materialul nu este luat, doar la 3 zile după încetarea scurgerii de sânge, puteți lua un frotiu urogenital.

PCR în timpul sarcinii

În așteptarea bebelușului, multe infecții cu transmitere sexuală sunt extrem de periculoase pentru dezvoltarea normală a fătului. BTS poate provoca întârzierea creșterii intrauterine, avort spontan sau naștere prematură, malformații congenitale ale copilului. Prin urmare, este extrem de important să se supună unui examen PCR în stadiile incipiente ale sarcinii. Este necesar să treceți analiza la înregistrare - până la 12 săptămâni.

Materialul este preluat din canalul cervical folosind o perie specială. Procedura este nedureroasă și nu reprezintă un pericol pentru copil. De obicei, în timpul sarcinii, se efectuează o analiză pentru chlamydia prin metoda PCR, precum și pentru ureaplasmoză, micoplasmoză, citomegalovirus, herpes, papilomavirus. Un astfel de complex de examinare se numește PCR-6.

PCR pentru diagnosticul HIV

Datorită faptului că metoda este foarte sensibilă la schimbările din corp și la condițiile de diagnosticare, mulți factori pot afecta rezultatul. Prin urmare, analiza PCR pentru infecția cu HIV nu este o metodă fiabilă, eficiența sa este de 96-98%. În restul de 2-4% din cazuri, testul dă rezultate fals pozitive.

Dar, în unele situații, diagnosticul PCR al HIV este indispensabil. Se administrează de obicei persoanelor cu un test ELISA fals negativ. Astfel de indicatori indică faptul că o persoană nu a dezvoltat încă anticorpi împotriva virusului și nu pot fi detectați fără o creștere multiplă a cantității. Exact acest lucru se poate realiza cu un test de sânge PCR.

Astfel de diagnostice sunt necesare și copiilor din primul an de viață născuți de o mamă seropozitivă. Metoda este singura modalitate de a determina în mod fiabil statutul unui copil.

PCR pentru diagnosticul hepatitei

Metoda de reacție în lanț a polimerazei permite detectarea ADN-ului virusului hepatitei A, B, C cu mult înainte de formarea anticorpilor împotriva infecției sau apariția simptomelor bolii. Analiza PCR pentru hepatita C este deosebit de eficientă, deoarece în 85% din cazuri o astfel de boală este asimptomatică și fără tratament în timp util intră într-o etapă cronică.

Detectarea la timp a agentului patogen va ajuta la evitarea complicațiilor și a tratamentului pe termen lung.

Examinare PCR cuprinzătoare

Analiză PCR cuprinzătoare: examinarea prin reacție în lanț polimesar, care include determinarea mai multor tipuri de infecții în același timp: mycoplasma genitalia, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovirus, herpes 1 și 2 tipuri, gonoree, papilomavirus. Prețul unui astfel de diagnostic variază de la 2.000 la 3.500 de ruble. în funcție de clinică, de materialele și echipamentele utilizate, precum și de tipul de analiză: calitativă sau cantitativă. Ce este necesar în cazul dumneavoastră - medicul va decide. În unele cazuri, este suficient doar pentru a determina prezența agentului patogen, în altele, de exemplu, cu infecția cu HIV, titrul cantitativ joacă un rol important. La diagnosticarea tuturor agenților patogeni de mai sus, examinarea se numește „analiză PCR-12”.

Interpretarea rezultatelor analizei

Decodarea analizei PCR nu este dificilă. Există doar 2 scale ale indicatorului - „rezultat pozitiv” și „rezultat negativ”. Când este detectat un agent patogen, medicii pot confirma prezența bolii cu o certitudine de 99% și pot începe tratamentul pacientului. Cu metoda cantitativă pentru determinarea infecției, indicatorul numeric al bacteriilor detectate va fi indicat în coloana corespunzătoare. Numai un medic poate determina gradul bolii și poate prescrie tratamentul necesar.

În unele cazuri, de exemplu, atunci când se determină infecția cu HIV prin PCR, în cazul unui rezultat negativ, devine necesară efectuarea unor examinări suplimentare pentru confirmarea indicatorilor obținuți.

Unde să fii testat?

Unde să luați analiza PCR: într-o clinică de stat sau într-un laborator privat? Din păcate, în instituțiile medicale municipale, echipamentele și metodele sunt adesea depășite. Prin urmare, este mai bine să acordați preferință laboratoarelor private cu echipamente moderne și personal înalt calificat. În plus, într-o clinică privată, veți obține rezultate mult mai repede.

La Moscova, multe laboratoare private oferă analize PCR pentru diverse infecții. De exemplu, în clinici precum „Vita”, „Clinică complexă”, „Familia fericită”, „Uro-Pro”, se efectuează analiza PCR. Costul examinării este de la 200 de ruble. pentru identificarea unui agent patogen.

Se poate concluziona că diagnosticul bolilor infecțioase prin PCR în majoritatea cazurilor este un mod rapid și fiabil de a detecta agentul patogen din organism în stadiile incipiente ale infecției. Dar totuși, în anumite cazuri, merită să alegeți alte metode de diagnostic. Numai un specialist poate determina necesitatea unui astfel de studiu. Decodarea analizei PCR necesită, de asemenea, o abordare profesională. Urmați recomandările medicului și nu efectuați singuri teste care nu sunt necesare.