Réaction en chaîne par polymérase, son essence et ses applications. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) et son application Méthode de réaction en chaîne par polymérase PCR

Il n'y a pas si longtemps, une méthode fiable, très sensible et rapide pour diagnostiquer diverses maladies infectieuses chez l'homme a été développée. Cette méthode est appelée « analyse PCR ». Qu'est-ce que c'est, quelle est son essence, quels micro-organismes il peut détecter et comment le prendre correctement, nous vous le dirons dans notre article.

Historique de la découverte

En outre, les méthodes PCR sont utilisées dans le diagnostic du cancer.

Avantages de la méthode

Le diagnostic PCR présente de nombreux avantages :

Haute sensibilité. Même s'il n'y a que quelques molécules d'ADN d'un micro-organisme, l'analyse PCR détecte la présence d'une infection. La méthode aidera avec les maladies chroniques et latentes. Souvent, dans de tels cas, le micro-organisme n'est pas cultivé par d'autres moyens.
Tout matériel convient à la recherche, par exemple la salive, le sang, les sécrétions génitales, les cheveux, les cellules épithéliales. Le plus courant est un test sanguin et un frottis urogénital pour la PCR.
La culture à long terme des cultures n'est pas nécessaire. Le processus de diagnostic automatisé vous permet d'obtenir les résultats de l'étude après 4 à 5 heures.
La méthode est fiable à presque 100 %. Seuls quelques cas de faux négatifs ont été enregistrés.
La capacité d'identifier plusieurs types d'agents pathogènes à partir d'un échantillon de matériel. Cela accélère non seulement le processus de diagnostic de la maladie, mais réduit également considérablement les coûts de matériel. Souvent, le médecin prescrit une analyse PCR complète. Le coût de l'examen, qui consiste à identifier six agents pathogènes, est d'environ 1 500 roubles.

Pour que les résultats soient fiables lors de la réalisation d'une étude PCR, il est nécessaire de réussir l'analyse, en suivant les recommandations de préparation préalable au diagnostic :

Avant de donner de la salive, vous devez vous abstenir de manger et de prendre des médicaments pendant 4 heures avant de prendre le matériel. Immédiatement avant la procédure, rincez-vous la bouche avec de l'eau bouillie.
Les règles ci-dessus doivent être suivies lors du prélèvement d'un échantillon de la surface interne de la joue. Après rinçage, il est recommandé d'effectuer un léger massage de la peau pour libérer la sécrétion de la glande.
L'urine est généralement recueillie à la maison. Pour ce faire, vous devez effectuer une toilette approfondie des organes génitaux. Recueillir 50-60 ml d'urine dans un récipient en plastique stérile. Pour garantir la pureté du matériau, il est recommandé aux femmes d'insérer un tampon dans le vagin et aux hommes de retirer le plus possible le pli cutané. Vous ne pouvez pas donner de matériel pendant la période de flux menstruel.
Pour donner du sperme, vous devez vous abstenir de rapports sexuels pendant 3 jours avant de prendre le matériel. En outre, les médecins conseillent d'arrêter de visiter le sauna et de prendre un bain chaud, de boire de l'alcool et des aliments épicés. Pendant 3 heures avant l'analyse, vous devez vous abstenir d'uriner.
Pour l'accouchement, par exemple, si une analyse de la chlamydia PCR est effectuée, il est recommandé aux femmes et aux hommes d'avoir un repos sexuel pendant 3 jours. Les médicaments antibactériens ne doivent pas être pris 2 semaines avant l'analyse. Pendant une semaine, vous devez arrêter d'utiliser des gels intimes, des pommades, des suppositoires vaginaux, des douches vaginales. Pendant 3 heures avant l'étude, vous devez vous abstenir d'uriner. Pendant la menstruation, le matériel n'est pas prélevé, seulement 3 jours après l'arrêt de l'écoulement sanguin, vous pouvez effectuer un frottis urogénital.

PCR pendant la grossesse

En attendant le bébé, de nombreuses infections sexuellement transmissibles sont extrêmement dangereuses pour le développement normal du fœtus. Les MST peuvent provoquer un retard de croissance intra-utérin, une fausse couche ou une naissance prématurée, des malformations congénitales de l'enfant. Par conséquent, il est extrêmement important de subir un examen PCR au début de la grossesse. Il est nécessaire de réussir l'analyse lors de l'inscription - jusqu'à 12 semaines.

Le matériau est prélevé dans le canal cervical à l'aide d'une brosse spéciale. La procédure est indolore et ne présente aucun danger pour le bébé. Habituellement, pendant la grossesse, une analyse est effectuée pour la chlamydia par la méthode PCR, ainsi que pour l'uréeplasmose, la mycoplasmose, le cytomégalovirus, l'herpès, le papillomavirus. Un tel complexe d'examen est appelé PCR-6.

PCR pour le diagnostic du VIH

En raison du fait que la méthode est très sensible aux changements dans le corps et aux conditions du diagnostic, de nombreux facteurs peuvent affecter le résultat. Par conséquent, l'analyse de la PCR pour l'infection par le VIH n'est pas une méthode fiable, son efficacité est de 96 à 98 %. Dans les 2 à 4 % des cas restants, le test donne des résultats faussement positifs.

Mais dans certaines situations, le diagnostic PCR du VIH est indispensable. Il est généralement administré aux personnes ayant un test ELISA faussement négatif. De tels indicateurs indiquent qu'une personne n'a pas encore développé d'anticorps contre le virus et qu'ils ne peuvent pas être détectés sans une augmentation multiple de la quantité. C'est exactement ce qui peut être réalisé avec un test sanguin PCR.

De tels diagnostics sont également nécessaires pour les enfants de la première année de vie nés d'une mère séropositive. La méthode est le seul moyen de déterminer de manière fiable le statut d'un enfant.

PCR pour le diagnostic de l'hépatite

La méthode de réaction en chaîne par polymérase permet de détecter l'ADN du virus de l'hépatite A, B, C bien avant la formation d'anticorps anti-infectieux ou l'apparition des symptômes de la maladie. L'analyse PCR pour l'hépatite C est particulièrement efficace, car dans 85% des cas, une telle maladie est asymptomatique et sans traitement rapide passe à un stade chronique.

La détection rapide de l'agent pathogène aidera à éviter les complications et le traitement à long terme.

Examen PCR complet

Analyse PCR complète : examen par réaction en chaîne polymésar, qui comprend la détermination de plusieurs types d'infections simultanément : mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomégalovirus, types d'herpès 1 et 2, gonorrhée, papillomavirus. Le prix d'un tel diagnostic varie de 2 000 à 3 500 roubles. selon la clinique, les matériels et équipements utilisés, ainsi que selon le type d'analyse : qualitative ou quantitative. Ce qui est nécessaire dans votre cas - le médecin décidera. Dans certains cas, il suffit de déterminer la présence de l'agent pathogène, dans d'autres, par exemple, avec l'infection par le VIH, le titre quantitatif joue un rôle important. Lors du diagnostic de tous les agents pathogènes ci-dessus, l'examen est appelé "analyse PCR-12".

Interprétation des résultats d'analyse

Le décodage de l'analyse PCR n'est pas difficile. Il n'y a que 2 échelles de l'indicateur - "résultat positif" et "résultat négatif". Lorsqu'un agent pathogène est détecté, les médecins peuvent confirmer la présence de la maladie avec une certitude de 99 % et commencer à traiter le patient. Avec la méthode quantitative de détermination de l'infection, l'indicateur numérique des bactéries détectées sera indiqué dans la colonne correspondante. Seul un médecin peut déterminer le degré de la maladie et prescrire le traitement nécessaire.

Dans certains cas, par exemple, lors de la détermination de l'infection par le VIH par PCR, en cas de résultat négatif, il devient nécessaire de procéder à des examens supplémentaires pour confirmer les indicateurs obtenus.

Où se faire tester ?

Où faire l'analyse PCR : dans une clinique publique ou dans un laboratoire privé ? Malheureusement, dans les institutions médicales municipales, les équipements et les méthodes sont souvent obsolètes. Par conséquent, il est préférable de privilégier les laboratoires privés dotés d'équipements modernes et d'un personnel hautement qualifié. De plus, dans une clinique privée, vous obtiendrez des résultats beaucoup plus rapidement.

À Moscou, de nombreux laboratoires privés proposent des analyses PCR pour diverses infections. Par exemple, dans des cliniques telles que "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro", une analyse PCR est effectuée. Le coût de l'examen est de 200 roubles. pour l'identification d'un agent pathogène.

On peut en conclure que le diagnostic de maladies infectieuses par PCR est dans la plupart des cas un moyen rapide et fiable de détecter l'agent pathogène dans le corps aux premiers stades de l'infection. Mais encore, dans certains cas, il vaut la peine de choisir d'autres méthodes de diagnostic. Seul un spécialiste peut déterminer la nécessité d'une telle étude. Le décodage de l'analyse PCR nécessite également une approche professionnelle. Suivez les recommandations du médecin et ne faites pas vous-même des tests qui ne sont pas nécessaires.

Il est souvent utilisé comme méthode rapide pour l'indication et l'identification des virus.

Cette méthode a été développée pour la première fois par K. Mullis (États-Unis) en 1983. En raison de sa sensibilité élevée, de sa spécificité et de sa facilité de mise en œuvre, elle est largement utilisée en génétique, en médecine légale, en diagnostic et dans d'autres domaines.

L'essence de la méthode est l'amplification, c'est-à-dire une augmentation du nombre de copies de fragments strictement définis d'une molécule d'ADN in vitro. Dans cette méthode, le mécanisme matriciel et le principe de complémentarité opèrent. Deux chaînes polynucléotidiques simples (acides nucléiques) sont capables de créer des liaisons hydrogène en une chaîne double brin si les séquences nucléotidiques de l'une correspondent exactement à la séquence nucléotidique de l'autre de sorte que leurs bases azotées peuvent former des paires adénine-thymine et guanine-cytosine.

La PCR est basée sur l'amplification d'ADN à l'aide d'une ADN polymérase thermostable, qui synthétise des brins d'ADN mutuellement complémentaires à partir de deux amorces. Une amorce est un morceau d'ADN d'une longueur de 20 à 30 nucléotides. Ces amorces (amorces) sont complémentaires des brins d'ADN opposés. Au cours de la synthèse d'ADN, des amorces sont insérées dans la chaîne de molécules d'ADN nouvellement synthétisées.

Typiquement, la PCR est effectuée en 25-40 cycles. Chaque cycle comprend trois étapes : la première est la dénaturation à 92-95°C. Dans ce cas, les deux brins d'ADN divergent ; deuxième - recuit, ou fixation d'amorces à 50-65°C; le troisième est l'élongation, ou polymérisation à 68-72°C, tandis que l'ADN polymérase complète les brins de la matrice d'ADN à l'aide de quatre types de nucléotides. À la suite d'un cycle, le matériel génétique requis est doublé. Les brins d'ADN formés au premier cycle servent de matrices au deuxième cycle, etc. Après le premier cycle, seul le fragment entre les deux amorces est amplifié. Ainsi, il y a un doublement du nombre de copies de la région amplifiée, ce qui permet de synthétiser des millions (2 n) de fragments d'ADN en 25-40 cycles - une quantité suffisante pour leur indication par diverses méthodes (par la méthode d'hybridation sondes contenant un certain marqueur, électrophorèse, etc.) ... Le plus souvent à cette fin, la méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose avec coloration au bromure d'éthidium est utilisée.

Dans la PCR, les amorces sont utilisées à partir de sections de l'ADN de l'agent pathogène, qui ont une séquence unique de nucléotides qui ne sont caractéristiques que d'un agent pathogène particulier.

La technique PCR est réduite à ce qui suit : la matrice d'ADN est isolée du matériel d'essai ; dans un tube à essai, combiner l'ADN isolé avec un mélange d'amplification, qui comprend de l'ADN polymérase, les 4 types de nucléotides, 2 types d'amorces, MgCl, un tampon, de l'eau déminéralisée et de l'huile minérale. Puis les tubes sont placés dans un amplificateur, et l'amplification est réalisée en mode automatique selon un programme donné correspondant au type d'agent pathogène. Les résultats sont enregistrés le plus souvent par électrophorèse en gel d'agarose 1-2% en présence de bromure d'éthidium, qui se combine avec des fragments d'ADN et est détecté sous forme de bandes lumineuses lorsque le gel est irradié aux rayons UV sur un transilluminateur. Toutes les procédures PCR prennent 1-2 jours ouvrables.

Afin d'augmenter la spécificité et la sensibilité de la PCR, différentes options sont utilisées : la PCR nichée ; PCR avec "hot start" utilisant une couche de paraffine ou blocage des centres actifs de polymérase avec des anticorps monoclonaux. En outre, certaines entreprises produisent des kits de réactifs d'amplification d'ADN lyophilisés, qui peuvent accélérer le processus de PCR et réduire la possibilité de résultats faussement positifs.

Actuellement, une nouvelle technologie de PCR-PCR en temps réel (Real-Time PCR) est en cours d'introduction. Sa principale caractéristique est la surveillance et l'analyse quantitative de l'accumulation de produits de réaction en chaîne par polymérase et l'enregistrement et l'interprétation automatiques des résultats obtenus. Cette méthode ne nécessite pas d'étape d'électrophorèse, ce qui permet de réduire les besoins de laboratoire pour la PCR. La PCR en temps réel utilise des sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence pour détecter l'ADN lors de son amplification. La PCR en temps réel permet une analyse complète d'un échantillon en 20 à 60 minutes et, théoriquement, un moyen de détecter même une molécule d'ADN ou d'ARN dans un échantillon.

Le système de détection de produit de réaction en chaîne par polymérase "en temps réel" (surveillance PCR) permet cycle après cycle de surveiller l'accumulation d'ADN amplifié. Le système comprend également une sonde oligonucléotidique qui est capable de se fixer (s'hybrider) au segment interne de l'ADN cible. A l'extrémité 5', la sonde est marquée avec un colorant reporter fluorescent, et à l'extrémité 3', avec un colorant quencher. Au fur et à mesure que le produit PCR s'accumule, la sonde s'y hybride, mais aucune luminescence ne se produit en raison de la proximité entre le rapporteur et le bloqueur. A la suite de la copie de séquence, la polymérase atteint l'extrémité 5' de la sonde. L'activité 5'-3'-exonucléase de la polymérase détache le marqueur fluorescent de l'extrémité 3' de l'échantillon, libérant ainsi le rapporteur fluorescent de sa liaison avec le bloqueur de signal, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence. Le niveau de fluorescence est ainsi proportionnel à la quantité du produit de réaction spécifique. Il est important que les résultats de la PCR soient enregistrés par la présence de fluorescence dans des tubes fermés et, ainsi, l'un des principaux problèmes de cette méthode soit résolu - le problème de la contamination par les amplicons.

Avantages de la PCR : analyse rapide ; sensibilité et spécificité élevées; la quantité minimale de matériel d'essai ; simplicité d'exécution et possibilité d'automatisation complète.

En raison du fait que la sensibilité de la PCR peut atteindre la détection d'une copie de la matrice d'ADN, il existe un risque élevé d'obtenir des résultats faussement positifs. Par conséquent, le laboratoire de diagnostic génétique, lors de la mise en place de la PCR, doit impérativement se conformer à des exigences particulières en matière d'aménagement et de mode de fonctionnement.

La PCR est l'une des méthodes complémentaires existantes dans le diagnostic virologique. Cette réaction est très importante pour le diagnostic des infections virales lorsque les antigènes viraux ou les anticorps spécifiques du virus ne peuvent pas être détectés et lorsque la présence d'acide nucléique viral peut être le seul signe d'infection, en particulier dans les infections latentes et mixtes.

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A reçu le prix Nobel.

Au début de l'utilisation de la méthode, après chaque cycle de chauffage-refroidissement, de l'ADN polymérase devait être ajoutée au mélange réactionnel, car elle était inactivée à la température élevée requise pour séparer les brins de l'hélice d'ADN. La procédure de réaction était relativement inefficace, nécessitant beaucoup de temps et d'enzymes. En 1986, la méthode de réaction en chaîne par polymérase a été considérablement améliorée. Il a été proposé d'utiliser des ADN polymérases de bactéries thermophiles. Ces enzymes se sont avérées thermiquement stables et étaient capables de résister à de multiples cycles de réaction. Leur utilisation a permis de simplifier et d'automatiser la PCR. L'une des premières ADN polymérases thermostables a été isolée à partir de bactéries Thermus aquatique et nommé Taq-polymérase. L'inconvénient de cette polymérase est que la probabilité d'y introduire un nucléotide erroné est assez élevée, car cette enzyme manque de mécanismes de correction d'erreurs (activité exonucléase 3 "→ 5"). Polymérase Pfu et Pwo isolées d'archées possèdent un tel mécanisme, leur utilisation réduit considérablement le nombre de mutations dans l'ADN, mais la vitesse de leur travail (processivité) est inférieure à celle de Taq... Les mélanges sont maintenant utilisés Taq et Pfu pour atteindre à la fois une vitesse de polymérisation élevée et une précision de copie élevée.

Au moment de l'invention de la méthode, Carey Mullis travaillait comme chimiste de synthèse (il synthétisait des oligonucléotides, qui étaient ensuite utilisés pour détecter des mutations ponctuelles par hybridation avec l'ADN génomique) à la Cetus Corporation, qui a breveté la méthode PCR. En 1992, Cetus a vendu les droits de la méthode et le brevet d'utilisation Taq-polymérase de Hoffman-La Roche pour 300 millions de dollars. Cependant, il s'est avéré que Taq-polymérase a été caractérisée par les biochimistes soviétiques A. Kaledin, A. Slyusarenko et S. Gorodetsky en 1980, et aussi 4 ans avant cette publication soviétique, c'est-à-dire en 1976, par les biochimistes américains Alice Chien, David B. Edgar et John M Tréla. En conséquence, Promega a tenté de poursuivre Roche pour qu'elle renonce à ses droits exclusifs sur l'enzyme. Le brevet américain de la méthode PCR a expiré en mars 2005.

PCR

La méthode est basée sur la copie sélective multiple d'une région d'ADN spécifique à l'aide d'enzymes dans des conditions artificielles ( in vitro). Dans ce cas, la copie n'a lieu que sur la zone qui remplit les conditions spécifiées, et uniquement si elle est présente dans l'échantillon à l'étude. Contrairement à l'amplification de l'ADN dans les organismes vivants (réplication), des sections relativement courtes d'ADN sont amplifiées par PCR. Dans un processus PCR conventionnel, la longueur des régions d'ADN copiées ne dépasse pas 3000 paires de bases (3 kpb). En utilisant un mélange de diverses polymérases, en utilisant des additifs et dans certaines conditions, la longueur du fragment PCR peut atteindre 20 à 40 000 paires de bases. C'est encore nettement inférieur à la longueur de l'ADN chromosomique d'une cellule eucaryote. Par exemple, le génome humain se compose d'environ 3 milliards de paires de bases.

Composants de réaction

Pour réaliser la PCR dans le cas le plus simple, les composants suivants sont nécessaires :

matrice d'ADN contenant la portion d'ADN que vous souhaitez amplifier.
Deux amorces complémentaires aux extrémités opposées des différents brins du fragment d'ADN souhaité.
Thermostable ADN polymérase- une enzyme qui catalyse la réaction de polymérisation de l'ADN. La polymérase destinée à être utilisée dans la PCR doit conserver son activité à haute température pendant une longue période. Par conséquent, des enzymes isolées des thermophiles sont utilisées - Thermus aquatique(Taq polymérase), Pyrococcus furiosus(Pfu polymérase), Pyrococcus woesei(Pwo-polymérase) et autres.
Désoxyribonucléosides triphosphates(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ions Mg 2+ nécessaires au fonctionnement de la polymérase.
Solution tampon fournir les conditions de réaction nécessaires - pH, force ionique de la solution. Contient des sels, de l'albumine de sérum bovin.

Pour éviter l'évaporation du mélange réactionnel, une huile à haut point d'ébullition, par exemple de la vaseline, est ajoutée au tube à essai. Ceci n'est pas nécessaire si un thermocycleur avec un couvercle chauffant est utilisé.

L'ajout de pyrophosphatase peut augmenter le rendement de la réaction PCR. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse du pyrophosphate, un sous-produit de l'addition de nucléotides triphosphates à la chaîne d'ADN en croissance, à l'orthophosphate. Le pyrophosphate peut inhiber la réaction PCR.

Amorces

La spécificité de la PCR repose sur la formation de complexes complémentaires entre la matrice et les amorces, de courts oligonucléotides synthétiques de 18 à 30 bases de long. Chacune des amorces est complémentaire à l'un des brins de la matrice double brin et délimite le début et la fin de la région amplifiée.

Après hybridation de la matrice avec une amorce (hybridation), cette dernière sert d'amorce à l'ADN polymérase dans la synthèse du brin complémentaire de la matrice (voir).

La caractéristique la plus importante des amorces est la température de fusion (T m) du complexe amorce-matrice.

T m est la température à laquelle la moitié des matrices d'ADN forment un complexe avec l'amorce oligonucléotidique. La formule moyenne de calcul de T m pour un oligonucléotide court (et pour des fragments d'ADN longs), en tenant compte de la concentration en ions K + et DMSO :

où L est le nombre de nucléotides dans l'amorce, K + est la concentration molaire d'ions potassium, G + C est la somme de toutes les guanines et cytosines.

En cas de mauvais choix de la longueur et de la composition nucléotidique de l'amorce ou de la température d'annelage, la formation de complexes partiellement complémentaires avec d'autres régions de l'ADN matrice est possible, ce qui peut conduire à l'apparition de produits non spécifiques. La limite supérieure du point de fusion est limitée par la température optimale d'action de la polymérase, dont l'activité diminue à des températures supérieures à 80°C.

Lors du choix des apprêts, il est conseillé de respecter les critères suivants:

Amplificateur

Riz. 1: Amplificateur pour PCR

La PCR est réalisée dans un amplificateur - un appareil qui assure un refroidissement et un chauffage périodiques des tubes, généralement avec une précision d'au moins 0,1 ° C. Les amplificateurs modernes vous permettent de définir des programmes complexes, y compris avec la possibilité de "démarrage à chaud", Touchdown PCR (voir ci-dessous) et stockage ultérieur des molécules amplifiées à 4 ° C. Pour la PCR en temps réel, des dispositifs équipés d'un détecteur fluorescent sont réalisés. Il existe également des instruments avec un couvercle automatique et un compartiment pour microplaques pour une intégration dans des systèmes automatisés.

Progression de la réaction

Photo d'un gel contenant de l'ADN marqueur (premier et dernier slots) et des produits PCR

Habituellement, lors de la réalisation de la PCR, 20 à 35 cycles sont effectués, chacun comprenant trois étapes (Fig. 2).

Dénaturation

La matrice d'ADN double brin est chauffée à 94-96°C (ou 98°C si une polymérase particulièrement thermostable est utilisée) pendant 0,5-2 min pour permettre aux brins d'ADN de se séparer. Cette étape est appelée dénaturation, car les liaisons hydrogène entre deux brins d'ADN sont détruites. Parfois, avant le premier cycle (avant d'ajouter la polymérase), le mélange réactionnel est préchauffé pendant 2-3 minutes pour dénaturer complètement la matrice et les amorces. Cette technique s'appelle démarrage à chaud, il permet de réduire la quantité de produits de réaction non spécifiques.

recuit

Lorsque les brins se sont dispersés, la température est abaissée afin que les amorces puissent se lier à la matrice simple brin. Cette étape est appelée recuit... La température de recuit dépend de la composition des primaires et est généralement choisie égale à la température de fusion des primaires. Un mauvais choix de température de recuit conduit soit à une mauvaise fixation des amorces à la matrice (à haute température), soit à une mauvaise fixation et à l'apparition de produits non spécifiques (à basse température). Le temps de l'étape d'annelage est de 30 sec, en même temps, pendant ce temps la polymérase parvient déjà à synthétiser plusieurs centaines de nucléotides. Par conséquent, il est recommandé de sélectionner des amorces avec une température de fusion supérieure à 60 ° C et de recuit et allonger en même temps, à 60-72 ° C.

Élongation

L'ADN polymérase réplique le brin matrice en utilisant une amorce comme graine. C'est la scène élongation... La polymérase commence la synthèse du deuxième brin à partir de l'extrémité 3" de l'amorce, qui s'est liée à la matrice, et se déplace le long de la matrice, synthétisant un nouveau brin dans la direction allant de l'extrémité 5" à 3". La température d'élongation dépend de la polymérase. 72 ° C. Le temps d'élongation dépend à la fois du type d'ADN polymérase et de la longueur du fragment amplifié. Habituellement, le temps d'élongation est pris égal à une minute pour mille paires de bases. Après la fin de tous les cycles , une étape supplémentaire est souvent réalisée allongement final pour compléter tous les fragments simple brin. Cette étape dure 7 à 10 minutes.

Riz. 2: Représentation schématique du premier cycle de PCR. (1) Dénaturation à 94-96°C. (2) Recuit à 68°C (par exemple). (3) Allongement à 72°C (P = polymérase). (4) Premier cycle terminé. Les deux brins d'ADN résultants servent de matrice pour le cycle suivant, de sorte que la quantité d'ADN matrice double au cours de chaque cycle.

La quantité d'un produit de réaction spécifique (limité par des amorces) augmente théoriquement proportionnellement à 2 n - 2n, où n est le nombre de cycles de réaction. En fait, l'efficacité de chaque cycle peut être inférieure à 100 %, donc en réalité P ~ (1 + E) n, où P est la quantité de produit, E est l'efficacité moyenne du cycle.

Le nombre de copies « longues » d'ADN augmente également, mais de façon linéaire, de sorte qu'un fragment spécifique domine dans les produits de réaction.

La croissance du produit requis est limitée de manière exponentielle par la quantité de réactifs, la présence d'inhibiteurs et la formation de sous-produits. Dans les derniers cycles de réaction, la croissance ralentit, c'est ce qu'on appelle "l'effet plateau".

Variétés de PCR

PCR imbriquée(PCR nichée) - utilisé pour réduire le nombre de sous-produits de réaction. Deux paires d'amorces sont utilisées et deux réactions consécutives sont réalisées. Une seconde paire d'amorces amplifie un segment d'ADN dans le produit de la première réaction.
PCR inversée(PCR inverse (eng.)) - utilisé lorsque seule une petite section dans la séquence souhaitée est connue. Cette méthode est particulièrement utile lorsque vous devez déterminer des séquences adjacentes après avoir inséré l'ADN dans le génome. Pour réaliser la PCR inversée, une série de coupures d'ADN avec des enzymes de restriction est réalisée, suivie d'une jonction des fragments (ligation). En conséquence, les fragments connus apparaissent aux deux extrémités de la région inconnue, après quoi la PCR peut être effectuée comme d'habitude.
PCR par transcription inverse(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (eng.)) - utilisé pour amplifier, isoler ou identifier une séquence connue à partir d'une bibliothèque d'ARN. Avant la PCR conventionnelle, une molécule d'ADN simple brin est synthétisée sur la matrice d'ARNm à l'aide de la transcriptase inverse et un ADNc simple brin est obtenu, qui est utilisé comme matrice pour la PCR. Cette méthode est souvent utilisée pour déterminer où et quand ces gènes sont exprimés.
PCR asymétrique(eng. PCR asymétrique) - est réalisée lorsqu'il est nécessaire d'amplifier principalement l'un des brins de l'ADN d'origine. Utilisé dans certaines techniques d'analyse de séquençage et d'hybridation. La PCR est réalisée comme d'habitude, sauf que l'une des amorces est prise en large excès. La modification de cette méthode est l'anglais. L dans l'oreille- UNE après- T il- E xponentiel-PCR (LATE-PCR), qui utilise des amorces avec des concentrations différentes et une amorce à faible concentration est associée à un (point de fusion) plus élevé qu'une amorce à forte concentration. La PCR est effectuée à une température de recuit élevée, maintenant ainsi l'efficacité de la réaction tout au long de tous les cycles.
PCR quantitative(PCR quantitative, Q-PCR) ou Pcr en temps réel- est utilisé pour l'observation directe de la mesure de la quantité d'un produit PCR spécifique dans chaque cycle de la réaction. Cette méthode utilise des amorces ou des sondes d'ADN marquées par fluorescence pour mesurer avec précision la quantité d'un produit de réaction au fur et à mesure qu'il s'accumule ; ou un colorant intercalant fluorescent est utilisé Sybr vert je qui se lie à l'ADN double brin. Sybr vert je fournit une option simple et rentable pour détecter et quantifier les produits PCR en temps réel sans avoir besoin de sondes ou d'amorces fluorescentes spécifiques. Lors de l'amplification, le colorant SYBR Vert I est intégré dans le petit sillon de l'ADN des produits PCR et émet un signal fluorescent, qui est plus fort que le colorant non lié, lorsqu'il est irradié avec un laser bleu. SYBR Vert I Compatible avec tous les appareils PCR en temps réel actuellement connus. Absorption maximale pour SYBR Vert I est à une longueur d'onde de 494 nm. En plus du principal, le spectre du colorant contient deux petits maximums d'absorption supplémentaires - à 290 nm et 380 nm. Émission maximale pour SYBR Vert I est à une longueur d'onde de 521 nm (vert).
PCR par étapes(PCR Touchdown) - Cette approche réduit l'effet de la liaison à l'amorce non spécifique. Les premiers cycles sont effectués à une température supérieure à la température de recuit optimale, puis tous les quelques cycles la température de recuit est progressivement réduite jusqu'à l'optimum. Ceci est fait pour que l'amorce s'hybride au brin complémentaire sur toute sa longueur ; alors qu'à la température d'annelage optimale, l'amorce s'hybride partiellement au brin complémentaire. L'hybridation partielle d'une amorce à l'ADN génomique conduit à une amplification non spécifique s'il y a suffisamment de sites de liaison pour l'amorce. Dans la plupart des cas, les dix premiers cycles de PCR peuvent être effectués à une température de recuit de 72-75°C, puis immédiatement réduite à l'optimum, par exemple, à 60-65°C.
Méthode de colonie moléculaire(Gel PCR, ing. Colonie - Colonie PCR) - le gel d'acrylamide est polymérisé avec tous les composants PCR sur la surface et la PCR est réalisée. Aux points contenant l'ADN analysé, l'amplification se produit avec la formation de colonies moléculaires.
PCR avec amplification rapide des extrémités d'ADNc(eng. Amplification rapide des extrémités d'ADNc, RACE-PCR ).
PCR de longs fragments(eng. PCR longue distance) - modification de la PCR pour l'amplification de régions d'ADN étendues (10 000 bases ou plus). Un mélange de deux polymérases est utilisé, dont l'une est une polymérase Taq à haute processivité (c'est-à-dire capable de synthétiser une longue chaîne d'ADN en un seul passage), et la seconde est une ADN polymérase avec une activité exonucléase de 3 "-5", généralement Pfu polymérase. La deuxième polymérase est nécessaire pour corriger les erreurs introduites par la première, puisque la Taq polymérase arrête la synthèse d'ADN si un nucléotide non complémentaire a été ajouté. Ce nucléotide non complémentaire est éliminé par la Pfu polymérase. Le mélange de polymérases est pris dans un rapport de 50:1 ou même inférieur à 100:1, où la polymérase Taq est prise 25 à 100 fois plus par rapport à la polymérase Pfu.
RAPD(eng. Amplification aléatoire de l'ADN polymorphe ), la PCR avec amplification aléatoire d'ADN polymorphe - est utilisée lorsqu'il est nécessaire de distinguer des organismes proches dans leur séquence génétique, par exemple, différentes variétés de plantes cultivées, des races de chiens ou des micro-organismes étroitement apparentés. Cette méthode utilise généralement une petite amorce (environ 10 pb). Cette amorce sera partiellement complémentaire aux régions d'ADN aléatoires des organismes étudiés. En sélectionnant les conditions (longueur d'amorce, composition, température, etc.), il est possible d'obtenir une différence satisfaisante dans le motif PCR pour deux organismes.
PCR spécifique au groupe(eng. PCR spécifique au groupe) - PCR pour des séquences apparentées au sein d'une ou entre différentes espèces, en utilisant des amorces conservatrices pour ces séquences. Par exemple, la sélection d'amorces universelles pour ribosomal 18S et 26S gènes pour l'amplification d'un espaceur intergénique spécifique à une espèce : séquence de gènes 18S et 26S conservatrice entre espèces, donc une PCR entre ces gènes sera réalisée pour toutes les espèces étudiées. Le contraire de cette méthode est - PCR unique(eng. PCR unique), dans laquelle la tâche consiste à sélectionner des amorces pour l'amplification d'une seule séquence spécifique parmi les séquences apparentées.
PCR de démarrage à chaud(eng. PCR de démarrage à chaud) - modification de PCR à l'aide d'ADN polymérase, dans laquelle l'activité polymérase est bloquée à température ambiante par des anticorps ou mimant des anticorps par de petites molécules de type Affibody, c'est-à-dire au moment de la réaction avant la première dénaturation en PCR. Habituellement la première dénaturation est réalisée à 95°C pendant 10 minutes.
PCR virtuelle(Anglais in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) est une méthode mathématique pour l'analyse informatique d'une réaction en chaîne par polymérase théorique utilisant une liste de séquences d'amorces (ou sondes d'ADN) pour prédire l'amplification potentielle de l'ADN du génome, du chromosome , ADN circulaire ou tout autre morceau d'ADN.

Si la séquence nucléotidique de la matrice est partiellement ou pas connue du tout, vous pouvez utiliser amorces dégénérées, dont la séquence contient des positions dégénérées dans lesquelles toutes les bases peuvent être localisées. Par exemple, une séquence d'amorces pourrait être : ... ATH ..., où H est A, T ou C.

Demande de PCR

La PCR est utilisée dans de nombreux domaines pour l'analyse et les expériences scientifiques.

Médecine légale

La PCR est utilisée pour comparer ce qu'on appelle les « empreintes génétiques ». Un échantillon du matériel génétique de la scène du crime est requis - sang, salive, sperme, cheveux, etc. Il est comparé au matériel génétique du suspect. Une très petite quantité d'ADN suffit, théoriquement - une copie. L'ADN est clivé en fragments, puis amplifié par PCR. Les fragments sont séparés par électrophorèse d'ADN. L'image résultante de l'emplacement des bandes d'ADN est appelée empreinte génétique(eng. empreinte génétique).

Établir la paternité

Riz. 3: Résultats d'électrophorèse de fragments d'ADN amplifiés par PCR. (1) Père. (2) Enfant. (3) Mère. L'enfant a hérité de certaines des caractéristiques de l'empreinte génétique des deux parents, ce qui a donné une nouvelle empreinte unique.

Bien que les « empreintes génétiques » soient uniques (sauf dans le cas de jumeaux identiques), les liens familiaux peuvent toujours être établis en faisant plusieurs de ces empreintes (Fig. 3). La même méthode peut être appliquée, avec de légères modifications, pour établir une parenté évolutive entre les organismes.

Diagnostic médical

La PCR permet d'accélérer et de faciliter considérablement le diagnostic des maladies héréditaires et virales. Le gène souhaité est amplifié par PCR en utilisant les amorces appropriées puis séquencé pour détecter les mutations. Les infections virales peuvent être détectées immédiatement après l'infection, des semaines ou des mois avant l'apparition des symptômes.

Médecine personnalisée

Parfois, les médicaments sont toxiques ou allergisants pour certains patients. Cela s'explique en partie par les différences individuelles dans la sensibilité et le métabolisme des médicaments et de leurs dérivés. Ces différences sont déterminées au niveau génétique. Par exemple, chez un patient, un certain cytochrome (une protéine du foie responsable du métabolisme des substances étrangères) peut être plus actif, chez un autre moins. Afin de déterminer quel type de cytochrome possède un patient donné, il a été proposé d'effectuer une analyse PCR avant d'utiliser le médicament. Cette analyse est appelée génotypage préliminaire (eng. génotypage prospectif).

Clonage de gènes

Le clonage de gènes (à ne pas confondre avec le clonage d'organismes) est le processus consistant à isoler des gènes et, à la suite de manipulations de génie génétique, à obtenir une grande quantité du produit d'un gène donné. La PCR est utilisée pour amplifier un gène, qui est ensuite inséré dans vecteur- un fragment d'ADN qui transfère un gène étranger dans le même ou un autre organisme propice à la croissance. Comme vecteurs sont utilisés, par exemple, des plasmides ou de l'ADN viral. L'insertion de gènes dans un organisme étranger est généralement utilisée pour obtenir le produit de ce gène - l'ARN ou, plus souvent, une protéine. Ainsi, de nombreuses protéines sont obtenues en quantités industrielles pour une utilisation en agriculture, en médecine, etc.

Riz. 4: Clonage d'un gène à l'aide d'un plasmide.
(1) ADN chromosomique de l'organisme A. (2) PCR. (3) Nombreuses copies du gène de l'organisme A. (4) Insertion du gène dans le plasmide. (5) Plasmide avec le gène de l'organisme A. (6) Introduction du plasmide dans l'organisme B. (7) Multiplication du nombre de copies du gène de l'organisme A dans l'organisme B.

séquençage ADN

Dans la méthode de séquençage utilisant des didésoxynucléotides isotopiques marqués par fluorescence ou radioactifs, la PCR fait partie intégrante, puisque c'est lors de la polymérisation que les dérivés nucléotidiques marqués d'un marqueur fluorescent ou radioactif sont incorporés dans la chaîne d'ADN. La fixation d'un didésoxynucléotide sur le brin synthétisé conduit à l'arrêt de la synthèse, permettant de déterminer la position de nucléotides spécifiques après séparation dans le gel.

Mutagenèse

Actuellement, la PCR est devenue la principale méthode de mutagenèse (modification de la séquence nucléotidique de l'ADN). L'utilisation de la PCR a permis de simplifier et d'accélérer la procédure de réalisation de la mutagenèse, ainsi que de la rendre plus fiable et reproductible.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode de haute précision pour diagnostiquer les pathologies héréditaires, les infections, les maladies virales à tout stade (aigu ou chronique), ainsi que - à un stade précoce - avant les manifestations évidentes de la maladie en identifiant les agents pathogènes sur la base de leur ADN, ARN , qui est du matériel génétique, dans des échantillons prélevés sur le patient. Et aujourd'hui, nous parlerons de l'essence, des étapes de diagnostic et des principes des méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR), ainsi que de son coût.

Qu'est-ce que la réaction en chaîne par polymérase

La base de l'analyse est l'amplification (doublement) - la création de copies multiples à partir d'un court morceau d'ADN (acide désoxyribonucléique), qui représente le complexe génétique humain. L'étude nécessite une très petite quantité de substance physiologique (expectorations, selles, grattage de l'épithélium, suc de la prostate, sang, sperme, liquide amniotique, mucus, tissu placentaire, urine, salive, liquide pleural, liquide céphalo-rachidien). Dans ce cas, par exemple, dans le tractus urogénital d'un patient, il est possible de détecter même un seul microbe nocif.

La méthode de PCR (polymérase en chaîne) a été développée par le scientifique américain K. Mullis, qui a reçu le prix Nobel en 1993.

Utilisé activement :

dans le diagnostic précoce des infections, génétiques,;
lors d'un examen médico-légal en présence d'une quantité extrêmement faible d'ADN pour la recherche ;
en médecine vétérinaire, pharmacie, biologie, génétique moléculaire ;
pour l'identification d'une personne par ADN, confirmation de paternité ;
en paléontologie, anthropologie, écologie (lors du suivi de la qualité des produits, facteurs environnementaux).

Cette vidéo vous expliquera en détail ce qu'est une réaction en chaîne par polymérase :

A qui est-il attribué ?

La réaction en chaîne par polymérase dans le diagnostic des maladies infectieuses est l'une des méthodes les plus fiables d'une précision et d'une fiabilité particulières. Par exemple, la fiabilité de l'analyse PCR pour la chlamydia et de nombreux autres agents pathogènes est proche de 100 % (absolu). Le plus souvent, la procédure de réaction en chaîne par polymérase est prescrite aux patients qui, une fois diagnostiqués, ont des difficultés à identifier un agent pathogène spécifique.

Le test de laboratoire PCR est utilisé :

pour la détection d'agents pathogènes provoquant une infection des organes urinaires et génitaux, difficiles à identifier lors de l'utilisation de cultures ou de méthodes immunologiques;
re-diagnostiquer le VIH au stade initial en cas de résultat positif mais discutable du test initial (par exemple, chez les nouveau-nés de parents infectés par le SIDA) ;
établir une maladie oncologique à un stade précoce (étude des mutations des oncogènes) et correction individuelle du schéma thérapeutique chez un patient particulier ;
dans un but de détection précoce et de traitement potentiel des pathologies héréditaires.

Ainsi, les futurs parents font une analyse pour savoir s'ils sont porteurs d'une pathologie génétique, chez les enfants, la PCR détermine la probabilité de susceptibilité à une maladie héréditaire.

détecter les pathologies fœtales au début de la période de gestation (les cellules individuelles d'un embryon en croissance sont examinées pour détecter d'éventuelles mutations);
chez les patients avant transplantation d'organe - pour le "typage tissulaire" (détermination de la compatibilité tissulaire);
identifier les organismes pathogènes dangereux dans le sang donné ;
chez les nouveau-nés - pour détecter les infections cachées;
pour évaluer les résultats du traitement antiviral et antimicrobien.

Pourquoi passer par une telle procédure

La PCR étant une méthode de diagnostic très efficace qui donne presque 100% du résultat, la procédure est utilisée :

confirmer ou exclure le diagnostic final ;
évaluation rapide de l'efficacité de la thérapie.

Dans de nombreux cas, la PCR est le seul test possible pour détecter une maladie en développement si les autres méthodes de diagnostic bactériologique, immunologique et virologique sont inutiles.

Les virus sont détectés par PCR immédiatement après l'infection et avant l'apparition des signes de maladie. La détection précoce du virus permet un traitement rapide.
La soi-disant "charge virale" (ou - le nombre de virus dans le corps) est également déterminée par analyse ADN par une méthode quantitative.
Des agents pathogènes spécifiques (par exemple le bacille tuberculeux de Koch) sont difficiles et prennent trop de temps à cultiver. L'analyse PCR vous permet d'identifier rapidement le nombre minimum d'agents pathogènes (vivants et morts) dans les échantillons qui sont pratiques pour les tests.

Une analyse détaillée de l'ADN de l'agent pathogène est utilisée :

déterminer sa sensibilité à des types spécifiques d'antibiotiques, ce qui vous permet de commencer immédiatement le traitement;
contrôler la propagation des épidémies parmi les animaux domestiques et sauvages;
identifier et suivre les nouvelles espèces microbiennes infectieuses et les sous-types d'agents pathogènes qui ont déclenché des épidémies précédentes.

Types de diagnostic

Méthode standard

L'analyse de la réaction en chaîne par polymérase est réalisée sur la base d'une amplification multiple (doublement) d'un fragment spécifique d'ADN et d'ARN à l'aide d'enzymes amorces spéciales. Grâce à la chaîne de copie, suffisamment de matériel est obtenu pour la recherche.

Au cours de la procédure, seul le fragment souhaité est copié (correspondant aux conditions spécifiques spécifiées) et s'il est effectivement présent dans l'échantillon.

Le fonctionnement de la PCR est décrit dans cette vidéo détaillée avec des schémas utiles :

Autres méthodes

Pcr en temps réel... Dans ce type de recherche, le processus d'identification d'un fragment d'ADN donné est lancé après chaque cycle, et non après que la chaîne entière ait été complétée pendant 30 à 40 cycles. Ce type d'étude permet d'obtenir des informations sur la quantité d'un agent pathogène (virus ou microbe) dans l'organisme, c'est-à-dire de réaliser une analyse quantitative.
RT-PCR (mode de transcription inverse)... Cette analyse permet de trouver des ARN à simple brin pour détecter des virus dont la base génétique est précisément l'ARN (par exemple, virus de l'hépatite C, virus de l'immunodéficience). Dans une telle étude, une enzyme spéciale est utilisée - la transcriptase inverse et une certaine amorce, et l'ADN simple brin est construit sur la base de l'ARN. Ensuite, le deuxième brin d'ADN est récupéré à partir de ce brin et la procédure standard est effectuée.

Indications pour

La procédure PCR est utilisée dans la clinique des maladies infectieuses, néonatologie, obstétrique, pédiatrie, urologie, gynécologie, vénéréologie, neurologie, néphrologie, ophtalmologie.

Indications aux fins de l'analyse :

découvrir le risque de développer des anomalies génétiques chez un enfant avec une probabilité de pathologies héréditaires;
diagnostic des deux parents lors de la planification de la grossesse ou de l'état grave de la mère au cours de la grossesse ;
difficultés de conception, identification des causes de l'infertilité;
suspicion d'infections génitales au stade aigu et avec des symptômes de leur transition vers la chronique;
détection des causes de processus inflammatoires d'origine inconnue;
rapports sexuels occasionnels et répétés non protégés;
détermination de la sensibilité d'un micro-organisme pathogène à des antibiotiques spécifiques;
les patients suspectés d'infection latente pour détecter les agents pathogènes avant l'apparition de symptômes manifestes (diagnostic préclinique) ;
patients pour confirmer la guérison de la maladie (diagnostic rétrospectif) ; :

Le diagnostic est également utilisé lorsqu'il est nécessaire d'identifier avec précision les agents pathogènes suivants :

virus de l'hépatite (A B C G), virus de l'immunodéficience humaine, cytomégalovirus;
vibrion cholérique;
virus de l'herpès simplex, espèce herpétiforme;
rétro - adéno - et rhinovirus;
virus de la rubéole, virus Epstein-Barr, varicelle (Zoster - virus);
parvo - et picornovirus;
la bactérie Helicobacter pylori ;
Legionella, types pathogènes de coli;
Staphylococcus aureus;
agent pathogène;
clostridia, diphtérie et haemophilus influenzae;

Il est également utilisé pour identifier les infections :

Mononucléose infectieuse;
borréliose, listériose, encéphalite à tiques;
candidose causée par des champignons Candida;
infections génitales - trichomonase, uréeplasmose, tréponème pâle, gardnerellose, gonorrhée, mycoplasmose, chlamydia;
tuberculose.

Contre-indications pour

L'intervention étant réalisée non pas avec le patient, sans aucun effet sur l'organisme, mais avec le matériel biologique prélevé pour la recherche, il n'y a pas de contre-indications à la PCR en raison de l'absence de danger potentiel.

Cependant, le prélèvement de biomatériau du canal cervical de l'utérus n'est pas réalisé après la procédure de colposcopie. La délivrance de frottis, de grattages pour analyse n'est autorisée que 4 à 6 jours après la fin des règles et l'arrêt complet de l'écoulement.

La méthode est-elle sûre

Aucun impact négatif sur le patient lors d'une étude isolée de son biomatériau en conditions de laboratoire n'est impossible.

Préparation à la procédure (livraison de substances biologiques pour analyse)

En tant qu'échantillon pour l'analyse PCR, dans lequel l'ADN d'un agent pathogène étranger est détecté, tout fluide biologique, tissu, sécrétions du corps servent. L'échantillonnage de la substance d'essai est effectué sous forme de prélèvement de sang dans une veine, de grattage du larynx, de la cavité nasale, de l'urètre, de la cavité pleurale, du col de l'utérus.

Avant la procédure de diagnostic, le médecin explique au patient quel matériel sera prélevé:

Lors de l'examen des infections génitales, des écoulements des organes génitaux, de l'urine, un frottis de l'urètre sont prélevés.
Lorsqu'ils sont analysés pour les infections herpétiques, le cytomégalovirus, la mononucléose - ils prennent de l'urine, un frottis de la gorge, pour l'hépatite, la toxoplasmose - le sang d'une veine.
Afin de diagnostiquer divers types, le liquide céphalo-rachidien est prélevé.
En pneumologie, les échantillons à analyser sont les expectorations et le liquide pleural.
Lorsqu'une étude d'éventuelles infections intra-utérines est réalisée pendant le portage d'un fœtus, le liquide amniotique et les cellules placentaires sont utilisés pour l'analyse.

La fiabilité et la précision de l'analyse dépendent de la stérilité des conditions de prélèvement du matériau. L'étude PCR étant très sensible, toute contamination de la substance d'essai peut fausser le résultat.

Une préparation compétente pour la livraison de biomatériau ne présente aucune difficulté pour les patients. Il y a certaines recommandations :

lorsqu'il est analysé pour les infections génitales :
- exclure les contacts intimes 72 heures avant la livraison du matériel ;
- arrêtez d'utiliser des produits vaginaux 3 jours à l'avance ;
- à partir du soir de la veille, ne pas procéder à l'hygiène de la zone investiguée ;
- exclure la miction pendant 3 à 4 heures lors du prélèvement d'un échantillon de l'urètre;
arrêtez de prendre des antibiotiques un mois avant de subir un test de dépistage des infections ;
le sang est donné le matin avant de manger et de boire;
le prélèvement de la première portion d'urine du matin est effectué dans un récipient stérile après une toilette intime approfondie.

Découvrez ci-dessous comment le diagnostic utilisant la technique de réaction en chaîne par polymérase est effectué.

Comment est la procédure

Lors de la réalisation d'une étude PCR, indéfiniment dans le réacteur (amplificateur ou thermocycleur), certains cycles sont répétés :

La première étape est la dénaturation... La salive, le sang, la biopsie, les échantillons gynécologiques, les expectorations, dans lesquels la présence d'ADN (ou d'ARN) de l'agent pathogène est suspectée, sont placés dans un amplificateur, où le matériel est chauffé et l'ADN est divisé en deux brins distincts.
La deuxième étape consiste à recuire ou à refroidir légèrement le matériau et en y ajoutant des amorces qui sont capables de reconnaître et de se lier aux régions souhaitées dans la molécule d'ADN.
La troisième étape est l'allongement- survient après la fixation de 2 amorces sur chacun des brins d'ADN. Au cours du processus, un fragment de l'ADN de l'agent pathogène est complété et une copie est formée.

Ces cycles sont répétés dans un type "réaction en chaîne", conduisant à chaque fois à la duplication de copies d'un fragment d'ADN spécifique (par exemple, un segment où un certain virus est programmé). En quelques heures, plusieurs copies du fragment d'ADN sont formées et leur présence est détectée dans l'échantillon. Après cela, l'analyse et la comparaison des résultats avec les données de la base de données de différents types d'agents pathogènes sont effectuées afin de déterminer le type d'infection.

Lisez à propos de l'interprétation des résultats et de la conclusion basée sur la réaction PCR ci-dessous.

Décoder les résultats

Le résultat final de l'étude est délivré 1 à 2 jours après la livraison du matériel biologique. Souvent - déjà le premier jour après l'analyse.

Analyse qualitative

Négatif le résultat signifie qu'aucune trace d'agents infectieux n'a été trouvée dans la substance soumise à la recherche.
Positif le résultat signifie la détection de virus ou de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique avec un degré de précision très élevé au moment de la livraison.

Si le résultat est positif, mais qu'il n'y a aucun signe d'activation de l'infection, cet état du corps est appelé "portage sain" asymptomatique. Le plus souvent observé lors de la prise de biomatériau à un certain endroit (canal cervical, urètre, cavité buccale) dans les maladies virales. Dans ce cas, le traitement n'est pas requis, mais une surveillance médicale constante est obligatoire, car il existe une possibilité:

propagation du virus à partir de porteurs et infection de personnes en bonne santé;
l'activation du processus et la transition de la maladie vers une forme chronique.

Cependant, si un test sanguin est positif, cela indique que l'infection a frappé l'organisme, et il ne s'agit plus d'un état de porteur, mais d'une pathologie qui nécessite une thérapie spécifique immédiate.

Analyse quantitative

Le résultat quantitatif est déterminé par un spécialiste spécifiquement pour un type particulier d'infection. Sur sa base, il est possible d'évaluer le degré de développement, le stade de la maladie, ce qui permet de prescrire rapidement le traitement approprié.

coût moyen

Les tarifs de réalisation de l'amplification en chaîne par polymérase sont déterminés par : le type d'étude, la complexité d'identification du pathogène, la difficulté de récolter du matériel biologique, le type d'analyse (qualitative ou quantitative), le niveau de prix en laboratoire.

D'autre part, dans l'étude de la PCR, plusieurs agents pathogènes peuvent être identifiés à la fois lors de la prise d'un type de matériel pour analyse. Cela permet d'économiser sur d'autres analyses de laboratoire.

En gros, le coût de l'analyse PCR en roubles :

gonocoque, gardnerella, Trichomonas vaginalis - à partir de 180
chlamydia trachomatis - à partir de 190
papillomavirus - de 380 à 500
biocénose du tractus urogénital chez la femme (évaluation quantitative et qualitative de la microflore) - à partir de 800.

Pour des informations encore plus utiles concernant les tests PCR, voir la vidéo ci-dessous :

Génétique des bactéries. Informations pour la deuxième leçon.

Réaction en chaîne par polymérase

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode qui permet une augmentation multiple (amplification) du nombre de certaines molécules d'ADN dans l'échantillon analysé (y compris le matériel biologique ou la culture pure).

Les principaux avantages de la PCR en tant que méthode de diagnostic en microbiologie sont sa très haute sensibilité, qui permet la détection de concentrations extrêmement faibles d'agents pathogènes dans les échantillons, ainsi que sa spécificité ajustable, qui permet de détecter ou d'identifier les agents pathogènes au niveau générique, espèce ou sous- niveau de l'espèce. Le principal inconvénient de la PCR provient de sa sensibilité extrêmement élevée - il est très facile pour les images de contaminer l'ADN d'un contrôle positif, d'un autre échantillon ou d'un produit PCR, entraînant une réaction faussement positive. Cela impose des restrictions sévères sur les conditions dans lesquelles le mélange PCR et le travail avec les produits PCR finis sont effectués.

Réalisation de PCR. Un mélange réactionnel est préparé contenant les composants suivants :

ADN extrait de l'échantillon d'essai,

solution tampon,

Mg2 + ions (nécessaires au fonctionnement de l'enzyme),

Deux amorces sont de courtes molécules d'ADN simple brin (le plus souvent de 18 à 24 nucléotides de longueur), complémentaires aux extrémités des différents brins de la séquence d'ADN détectée.

Un mélange de désoxynucléotide triphosphates.

ADN polymérase résistante à la chaleur (le plus souvent utilisé est la polymérase Taq - une polymérase isolée de Thermes aquatique).

Ensuite, ce mélange réactionnel est placé dans un four, qui est en fait un thermostat programmable. Le thermocycleur effectue 30 à 40 cycles de changement de température. Chacun de ces cycles comprend trois étapes (voir Fig. 1) :

Dénaturation (température 94 о С) - les chaînes d'hydrogène sont brisées et les chaînes d'ADN divergent.

Recuit des amorces (la température est généralement de l'ordre de 50-60 о С) - les amorces sont attachées aux extrémités des brins d'ADN. En général, avec une diminution de la température, la réunification des brins d'ADN originaux de l'échantillon à l'étude (renaturation) est énergétiquement plus favorable ; cependant, la concentration d'amorces dans le mélange réactionnel est de plusieurs ordres de grandeur plus élevée que la concentration d'ADN à partir de l'échantillon (au moins dans les cycles de PCR initiaux), par conséquent, la réaction d'hybridation de l'amorce se déroule plus rapidement que la renaturation. La température de recuit est choisie en fonction des températures de fusion (dénaturation) des amorces.

Allongement (la température est généralement de 72 ° C) - L'ADN polymérase complète les amorces le long de la matrice des longs brins d'ADN. La température correspond à la température de travail optimale de l'ADN polymérase utilisée.

La détection des résultats diffère selon les différentes variantes de la stadification PCR et est décrite dans la section "Variétés PCR".

Dynamique PCR

Dans les premiers cycles de PCR, le nombre de molécules d'ADN double brin, dont la taille est déterminée par la distance entre les sites d'atterrissage des amorces, double à chaque cycle. En outre, une petite quantité de molécules d'ADN plus longues se forme, ce qui peut être négligé (voir la figure 2).

Ainsi, dans les premiers cycles, la quantité de produit PCR est décrite par la formule m * 2 n, où m est la quantité initiale de l'ADN souhaité dans l'échantillon, n est le nombre de cycles. Ensuite, la réaction atteint un plateau. Ceci est dû à l'accumulation du produit de réaction, à une diminution de la concentration d'amorces et de désoxynucléotides triphosphates, ainsi qu'à une augmentation de la concentration de pyrophosphate (voir figure 3).

Variétés de PCR

PCR conventionnelle

Dans cette variante de la configuration PCR, la réaction se déroule pendant un nombre présélectionné de cycles (30-40), après quoi il est analysé si l'accumulation de molécules d'ADN double brin s'est produite dans le mélange réactionnel.

Cette variante de la production PCR lorsqu'elle est utilisée comme méthode de diagnostic est une méthode qualitative. Une réaction positive indique la présence d'au moins des traces des molécules d'ADN souhaitées dans l'échantillon. Une réaction négative indique leur absence. Une évaluation quantitative du contenu des molécules d'ADN initiales dans l'échantillon est impossible car la réaction atteint un plateau.

La principale méthode de détection de la présence d'un produit est l'électrophorèse sur gel d'agarose ou de polyacrylamide. Les produits de PCR sont séparés dans le gel sous l'action d'un champ électrique en fonction de leur poids moléculaire. Un colorant intercalant est ajouté au gel (fluorescent dans un état lié à l'ADN double brin - le plus souvent bromure d'éthidium). Ainsi, lors d'une irradiation en lumière ultraviolette, il sera possible de constater la présence ou l'absence d'une bandelette correspondant à l'ADN du poids moléculaire requis. Lorsque la PCR est effectuée à des fins de diagnostic, des contrôles de réaction positifs et négatifs sont toujours placés contre lesquels les échantillons sont comparés (voir Fig. 4).

Pcr en temps réel

Dans cette variante de la configuration PCR, la quantité de produit PCR dans le mélange réactionnel est constamment enregistrée au cours de la réaction. Cela permet de construire une courbe du déroulement de la réaction (voir Fig. 3) et, sur cette base, de calculer le nombre de molécules d'ADN requises dans les échantillons.

L'un des types de PCR en temps réel utilise un colorant intercalant, qui est ajouté directement au mélange réactionnel (le plus souvent SYBRGreen est utilisé). Un autre type utilise l'un des types de sondes fluorescentes qui se lient à un site à l'intérieur du produit PCR, ce qui permet d'augmenter la spécificité de détection (voir Fig. 5). La fluorescence est détectée directement dans le dispositif au cours de la réaction.

En plus de la capacité de détection quantitative, il existe d'autres avantages de la PCR en temps réel par rapport à la PCR conventionnelle. Cette option PCR est plus simple, plus rapide et ne nécessite pas d'ouvrir les tubes avec des produits PCR, ce qui réduit le risque de contamination d'autres échantillons. Le principal inconvénient est le coût plus élevé du thermocycleur avec capacité de détection de fluorescence intégrée par rapport au thermocycleur conventionnel.

PCR quantitative numérique

Une nouvelle variante coûteuse et encore peu courante de la PCR, qui permet une détermination plus précise de la quantité d'ADN dans un échantillon. Dans cette variante, le mélange réactionnel contenant un colorant fluorescent est divisé en un grand nombre de volumes microscopiques (par exemple, gouttelettes dans une émulsion). Après le déroulement de la PCR, il est analysé dans quelle proportion de gouttelettes la réaction s'est avérée positive et, en conséquence, une fluorescence est observée. Cette proportion sera proportionnelle au nombre de molécules d'ADN souhaitées dans l'échantillon.

PCR par transcription inverse

Dans ce cas, une réaction de transcription inverse (ARN dans ADN) utilisant l'enzyme de transcription inverse est réalisée avant l'un ou l'autre variant PCR. Ainsi, cette méthode permet la détection qualitative ou quantitative de molécules d'ARN. Cela peut être utilisé pour détecter des virus à ARN ou déterminer le niveau de transcription (quantité d'ARNm) d'un gène particulier.

Image 1.Étapes de la PCR. Les amorces sont marquées en rouge.

Figure 2. Accumulation de molécules d'ADN double brin limitées par des amorces pendant la PCR.

Figure 3. La dynamique de la réaction PCR à différentes concentrations initiales des molécules d'ADN souhaitées dans l'échantillon. (a) - concentration la plus élevée (b) - concentration intermédiaire (c) - concentration la plus faible

Figure 4. Electrophorèse sur agarose de produits PCR. K + - contrôle positif (on sait que l'ADN souhaité est présent). 1-7 - échantillons de test (dont 1-2 positifs, 3-7 négatifs). K- - contrôle négatif (l'ADN recherché est manifestement absent). Dans de nombreux cas, en plus du produit cible, des produits de réaction non spécifiques plus légers (amorces-dimères) sont visibles.

Figure 5. Méthodes de détection par PCR en temps réel. (a) - colorant intercalant - fluorescent lors de la liaison à l'ADN double brin (b) - sonde Taqman - la fluorescence se produit lorsque la sonde est clivée par l'ADN polymérase avec une activité endonucléase 5'-3' due à la séparation du fluorophore et de l'extincteur. (c) - Sonde MolecularBeacon - la fluorescence se produit lors de l'hybridation de la sonde avec le fragment cible en raison de la distance spatiale entre le fluorophore et l'extincteur (d) - Sondes LightCycler - la fluorescence de l'accepteur se produit lors de l'hybridation des sondes (contenant un accepteur et un donneur) avec le fragment cible en raison du transfert par résonance de l'énergie du fluor (FRET).