Bevezetés.

1. A citokinek általános jellemzői és osztályozása.

1.1 Hatásmechanizmusok.

1.2 A citokinek tulajdonságai.

1.3 A citokinek szerepe a szervezet élettani funkcióinak szabályozásában.

2. Citokinek speciális vizsgálatai.

2.1 A citokinek szerepe a vastagbél gyulladásos betegségeinek patogenezisében gyermekeknél.

2.2 A nitrogén-monoxid és a citokinek szerepe az akut tüdősérülés szindróma kialakulásában.

3. A citokinek meghatározására szolgáló módszerek

3.1 A citokinek biológiai aktivitásának meghatározása

3.2 A citokinek mennyiségi meghatározása antitestek segítségével

3.3 Citokinek meghatározása enzim immunoassay segítségével.

3.3.1 Tumor nekrózis faktor-alfa.

3.3.2 Gamma-interferon.

3.3.3 Interleukin-4

3.3.4 Interleukin-8

3.3.5 Interleukin-1 receptor antagonista.

3.3.6 Alfa-interferon.

3.3.7 Alfa-IFN elleni antitestek.

4. Citokineken alapuló immunotróp gyógyszerek.

Felhasznált irodalom jegyzéke.

Következtetés.

Bevezetés.

Kis idő telt el az első citokinek leírása óta. Kutatásaik azonban a tudás kiterjedt szakaszának kiosztásához vezettek - a citokinológiához, amely a különböző tudásterületek és mindenekelőtt az immunológia szerves részét képezi, amely erőteljes lendületet adott e közvetítők tanulmányozásának. A citokineológia minden klinikai tudományágat áthat, a betegségek etiológiájától és patogenezisétől a különféle kóros állapotok megelőzéséig és kezeléséig. Következésképpen a tudományos kutatóknak és a klinikusoknak el kell tájékozódniuk a szabályozó molekulák sokféleségében, és világosan meg kell érteniük az egyes citokinek szerepét a vizsgált folyamatokban. Az immunrendszer minden sejtje bizonyos funkciókat lát el, és egyértelműen összehangolt kölcsönhatásban működik, amelyet speciális biológiailag aktív anyagok - citokinek - az immunreakciók szabályozói biztosítanak. A citokinek olyan specifikus fehérjék, amelyek segítségével az immunrendszer különböző sejtjei információt cserélhetnek egymással és összehangolhatják a cselekvéseket. A sejtfelszíni receptorokra ható citokinek halmaza és mennyisége – a „citokin környezet” – kölcsönható és gyakran változó jelek mátrixát jelenti. Ezek a jelek összetettek a citokinreceptorok sokfélesége miatt, valamint abból a tényből adódóan, hogy mindegyik citokin több folyamatot képes aktiválni vagy elnyomni, beleértve a saját szintézisét és más citokinek szintézisét, valamint a citokin receptorok kialakulását és megjelenését. a sejt felszínén. Munkánk célja a citokinek, azok funkcióinak és tulajdonságainak tanulmányozása, valamint lehetséges alkalmazásuk az orvostudományban. A citokinek kisméretű fehérjék (8-80 kDa molekulatömeg), amelyek autokrin (azaz az őket termelő sejtre) vagy parakrin (a közeli sejtekre) hatnak. Ezeknek a rendkívül aktív molekuláknak a kialakulása és felszabadulása rövid életű és szigorúan szabályozott.

Szakirodalmi áttekintés.

A citokinek általános jellemzői és osztályozása.

A citokinek az intercelluláris kölcsönhatás polipeptid-közvetítőinek csoportját alkotják, amelyek főként a szervezet védekező reakcióinak kialakításában és szabályozásában vesznek részt a kórokozók bejutása és a szövetek integritásának megzavarása során, valamint számos normális élettani funkció szabályozásában. A citokinek egy új független szabályozórendszerré izolálhatók, amely az idegrendszerrel és az endokrin rendszerrel együtt létezik a homeosztázis fenntartása érdekében, és mindhárom rendszer szorosan összekapcsolódik és kölcsönösen függ egymástól. Az elmúlt két évtizedben a legtöbb citokin génjét klónozták, és olyan rekombináns analógokat kaptak, amelyek teljesen megismétlik a természetes molekulák biológiai tulajdonságait. Jelenleg több mint 200, a citokincsaládba tartozó egyedi anyag ismeretes. A citokinek tanulmányozásának története a 20. század 40-es éveiben kezdődött. Ekkor írták le a cachectin, a vérszérumban jelenlévő faktor első hatásait, amely cachexiát vagy súlycsökkenést okozhat. Ezt követően ezt a mediátort izoláltuk, és kimutattuk, hogy azonos a tumor nekrózis faktorral (TNF). Abban az időben a citokinek vizsgálata bármely biológiai hatás kimutatásának elve alapján zajlott, ami a megfelelő mediátor nevének kiindulópontjaként szolgált. Tehát az 50-es években az interferont (IFN) azért hívták, mert képes volt interferonra vagy rezisztencia növelésére az ismételt vírusfertőzés során. Az interleukin-1-et (IL-1) eredetileg endogén pirogénnek is nevezték, szemben a bakteriális lipopoliszacharidokkal, amelyeket exogén pirogénnek tekintettek. A citokinek tanulmányozásának következő, 60-70 éves szakasza a természetes molekulák megtisztításával és biológiai hatásuk átfogó jellemzésével jár. Ekkorra már a T-sejt növekedési faktor, ma IL-2 néven ismert, és számos más molekula felfedezése tartozik ide, amelyek serkentik a T-, B-limfociták és más típusú leukociták növekedését és funkcionális aktivitását. 1979-ben a megnevezésükre és rendszerezésükre az „interleukinek” kifejezést javasolták, vagyis a leukociták között kommunikáló mediátorokat. Nagyon hamar kiderült azonban, hogy a citokinek biológiai hatásai messze túlmutatnak az immunrendszeren, ezért a korábban javasolt, máig fennmaradt „citokinek” kifejezés elfogadottabbá vált. A citokinek tanulmányozásában forradalmi fordulat következett be az 1980-as évek elején, miután az egér és az emberi interferon gének klónozása, valamint a természetes citokinek biológiai tulajdonságait teljes mértékben megismétlő rekombináns molekulák előállítása után következett be. Ezt követően más mediátorok génjeit is klónozták ebből a családból. A citokinek történetében fontos mérföldkő volt a rekombináns interferonok, és különösen a rekombináns IL-2 klinikai alkalmazása a rák kezelésére. A 90-es éveket a citokinreceptorok alegységszerkezetének felfedezése és a „citokinhálózat” fogalmának kialakulása, valamint a XXI. század eleje jellemezte – sok új citokin felfedezése genetikai elemzés révén. A citokinek közé tartoznak az interferonok, a telepstimuláló faktorok (CSF), a növekedési faktorokat átalakító kemokinek; tumor nekrózis faktor; történelmileg kialakult sorozatszámú interleukinek és néhány más endogén mediátor. Az 1-től kezdődő sorozatszámú interleukinok nem tartoznak a citokinek ugyanabba az alcsoportjába, amelyek közös funkciójuk szerint kapcsolódnak egymáshoz. Ezeket pedig proinflammatorikus citokinekre, limfociták növekedési és differenciálódási faktoraira, valamint egyedi szabályozó citokinekre oszthatjuk fel. Az "interleukin" nevet egy újonnan felfedezett közvetítőnek adják, ha az Immunológiai Társaságok Nemzetközi Szövetsége nómenklatúra bizottsága által kidolgozott alábbi kritériumok teljesülnek: molekuláris klónozás és a vizsgált faktor génjének expressziója, egyedi nukleotid jelenléte és a megfelelő aminosavszekvenciát, semlegesítő monoklonális antitesteket nyerve. Emellett az új molekulát az immunrendszer sejtjeinek (limfociták, monociták vagy más típusú leukociták) kell termelniük, fontos biológiai funkcióval kell rendelkezniük az immunválasz szabályozásában, valamint további funkciókat kell ellátniuk, ezért nem tud. funkcionális nevet kapjanak. Végül az új interleukin felsorolt ​​tulajdonságait közzé kell tenni egy lektorált tudományos folyóiratban. A citokinek osztályozása elvégezhető biokémiai és biológiai tulajdonságaik, valamint azon receptorok típusai szerint, amelyeken keresztül a citokinek biológiai funkcióikat ellátják. A citokinek szerkezet szerinti osztályozása (1. táblázat) nemcsak az aminosav-szekvenciát veszi figyelembe, hanem mindenekelőtt a fehérje harmadlagos szerkezetét, amely pontosabban tükrözi a molekulák evolúciós eredetét.

1. táblázat A citokinek osztályozása szerkezet szerint.

A génklónozás és a citokinreceptorok szerkezetének elemzése kimutatta, hogy a citokinekhez hasonlóan ezek a molekulák is több típusra oszthatók az aminosavszekvenciák hasonlósága és az extracelluláris domének szerveződésének sajátosságai alapján (2. táblázat). A citokin receptorok egyik legnagyobb családját hematopoietin receptor családnak vagy I. típusú citokin receptor családnak nevezik. Ennek a receptorcsoportnak a szerkezeti jellemzője a 4 cisztein molekulában való jelenléte, valamint a Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) aminosavszekvencia, amely a sejtmembrántól rövid távolságban található. A II. osztályú citokinreceptorok interferonokkal és IL-10-zel lépnek kölcsönhatásba. Mindkét első típusú receptor homológiát mutat egymással. A következő receptorcsoportok közvetítenek kölcsönhatást a tumornekrózis faktor család és az IL-1 család citokineivel. Jelenleg több mint 20 különböző kemokinreceptor ismert, amelyek különböző fokú affinitással lépnek kölcsönhatásba a kemokincsalád egy vagy több ligandjával. A kemokin receptorok a rodopszin receptorok szupercsaládjába tartoznak, 7 transzmembrán doménnel rendelkeznek, és G-fehérjék részvételével jelet vezetnek.

2. táblázat A citokin receptorok osztályozása.

Sok citokin receptor 2-3 alegységből áll, amelyeket különböző gének kódolnak és egymástól függetlenül expresszálódnak. Ebben az esetben egy nagy affinitású receptor kialakításához az összes alegység egyidejű kölcsönhatása szükséges. A citokinreceptorok ilyen szerveződésére példa az IL-2 receptor komplex szerkezete. Meglepő volt annak a ténynek a felfedezése, hogy az IL-2 receptor komplex egyes alegységei közösek az IL-2-vel és néhány más citokinnel. Így a β-lánc egyidejűleg az IL-15 receptorának komponense, a γ-lánc pedig az IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-receptorok közös alegységeként szolgál. 15 és IL-21. Ez azt jelenti, hogy az összes fent említett citokin, amelynek receptorai szintén 2-3 egyedi polipeptidből állnak, a γ-láncot használják receptoraik alkotóelemeként, sőt, a jelátvitelért felelős komponensként. A kölcsönhatás specifitását minden citokin esetében más, szerkezetükben eltérő alegységek biztosítják. A citokin receptorok között 2 gyakoribb receptor alegység található, amelyek jelet vezetnek, miután kölcsönhatásba lépnek különböző citokinekkel. Az IL-3, IL-5 és GM-CSF receptorok βc (gp140) közös receptor alegysége, valamint a gp130 receptor alegység, amely az IL-6 család tagjai számára közös. A közös jelátviteli alegység jelenléte a citokin receptorokban osztályozásuk egyik megközelítése, mivel lehetővé teszi, hogy mind a ligandumok szerkezetében, mind pedig a biológiai hatásokban közösséget találjunk.

A 3. táblázat a kombinált szerkezeti és funkcionális besorolást mutatja, ahol az összes citokin csoportokra van osztva, elsősorban biológiai aktivitásukat, valamint a citokinmolekulák és receptoraik fenti szerkezeti jellemzőit figyelembe véve.

3. táblázat A citokinek szerkezeti és funkcionális osztályozása.

	A citokinek családjai	Alcsoportok és ligandumok	Alapvető biológiai funkciók
	I-es típusú interferonok	IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l)	Vírusellenes hatás, antiproliferatív, immunmoduláló hatás
	Hematopoietikus sejtnövekedési faktorok	Őssejt faktor (kit-ligand, steel factor), Flt-3 ligand, G-CSF, M-CSF, IL-7, IL-11 Gp140 ligandumok: IL-3, IL-5, GM-KSF	Különböző típusú progenitor sejtek proliferációjának és differenciálódásának serkentése a csontvelőben, a vérképzés aktiválása Eritropoetin, trombopoetin
	Az interleukin-1 és az FRF szupercsaládja	FRF család: Savanyú FRF, alap FRF, FRF3 - FRF23 IL-1 (F1-11) család: IL-1α, IL-1β, IL-1 receptor antagonista, IL-18, IL-33 stb.	A fibroblasztok és a hámsejtek proliferációjának aktiválása Gyulladásgátló hatás, specifikus immunitás aktiválása
	Tumor nekrózis faktor család	TNF, α és β limfotoxinok, Fas ligandum stb.	Gyulladásgátló hatás, az apoptózis szabályozása és az immunkompetens sejtek intercelluláris interakciója
	Interleukin-6 család	Gp130 ligandumok: IL-6, IL-11, IL-31, Oncostatin-M, Cardiotropin-1, Leukémia-gátló faktor, Ciliáris neurotróf faktor	Gyulladásgátló és immunszabályozó hatások
	Kemokinek	SS, SHS (IL-8), SH3S, S	Különböző típusú leukociták kemotaxisának szabályozása
	Interleukin-10 család	IL-10,19,20,22,24,26	Immunszuppresszív hatás
	Interleukin-12 család		A helper T-limfociták differenciálódásának szabályozása
	A T-helper klónok citokinek és a limfociták szabályozó funkciói	1-es típusú T-helpers: IL-2, IL-15, IL-21, IFNg 2-es típusú T-helpers: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 IL-2 receptor y-lánc ligandumok: IL-7 TSLP	A sejtes immunitás aktiválása A humorális immunitás aktiválása, immunmoduláló hatás Különböző típusú limfociták, DC, NK sejtek, makrofágok, stb. differenciálódásának, proliferációjának és funkcionális tulajdonságainak serkentése.
	Interleukin 17 család	IL-17A, B, C, D, E, F	A gyulladást elősegítő citokinek szintézisének aktiválása
	Az idegi növekedési faktor, a vérlemezke növekedési faktor és a transzformáló növekedési faktorok szupercsaládja	Idegnövekedési faktor család: NGF, agyi neurotróf faktor Thrombocyta eredetű növekedési faktorok (PDGF), angiogén növekedési faktorok (VEGF) TRF család: TPPb, aktivinek, inhibinek, csomópont, csontmorfogén fehérjék, Mulleri-gátló anyag	A gyulladás, az angiogenezis, a neuronális működés, az embrionális fejlődés és a szöveti regeneráció szabályozása
	Epidermális növekedési faktor család	ERF, TRFα stb.
	Inzulinszerű növekedési faktorok családja	IRF-I, IRF-II	Különféle sejttípusok szaporodásának serkentése

Az első csoportba tartoznak az I. típusú interferonok, és a legegyszerűbb felépítésű, mivel a benne lévő összes molekula hasonló szerkezettel és sok tekintetben ugyanazokkal a funkciókkal rendelkezik, amelyek a vírusellenes védelemhez kapcsolódnak. A második csoportba a hematopoietikus sejtek növekedési és differenciálódási faktorai kerültek, amelyek az őssejttől kezdve serkentik a vérképző progenitor sejtek fejlődését. Ebbe a csoportba tartoznak a hematopoietikus sejtek egyedi differenciálódási vonalaira szűken specifikus citokinek (eritropoetin, trombopoietin és IL-7, amely a TB limfociták prekurzoraira hat), valamint a szélesebb biológiai aktivitási spektrummal rendelkező citokinek, mint pl. IL-3, IL-11, telepstimuláló faktorok. A citokinek ezen csoportján belül a molekulák szerkezeti felépítésének hasonlósága miatt izolálták a közös receptor alegységet tartalmazó gp140 ligandumokat, valamint a trombopoietint és az eritropoetint. Az FGF és IL-1 szupercsalád citokinjei nagyfokú homológiát és hasonló fehérjeszerkezetet mutatnak, ami megerősíti a közös eredetet. Mindazonáltal a biológiai aktivitás megnyilvánulásait tekintve az FGF sok tekintetben különbözik az IL-1 család agonistáitól. Az IL-1 molekulák családja jelenleg a funkcionális neveken kívül az F1-F11 jelöléssel rendelkezik, ahol az F1 az IL-1α-nak, az F2 az IL-1β-nak, az F3 az IL-1 receptor antagonistának, az F4 az IL-nek felel meg. 18. A család többi tagját genetikai analízis eredményeként fedezték fel, és meglehetősen nagy homológiát mutatnak az IL-1 molekulákkal, biológiai funkciójuk azonban nem teljesen tisztázott. A citokinek további csoportjai közé tartoznak az IL-6 családok (a közös receptor alegység gp130 ligandumai), a tumor nekrózis faktor és a kemokinek, amelyeket a legtöbb egyedi ligand képvisel, és amelyeket a megfelelő fejezetekben részletesen felsorolunk. A tumor nekrózis faktor családja főként a ligandumok és receptoraik szerkezetének hasonlósága alapján jön létre, három, nem kovalensen kapcsolt azonos alegységből, amelyek biológiailag aktív molekulákat alkotnak. Ugyanakkor a biológiai tulajdonságokat tekintve ebbe a családba meglehetősen eltérő aktivitású citokinek tartoznak. Például a TNF az egyik legszembetűnőbb proinflammatorikus citokin, a Fas ligandum a célsejtek apoptózisát indukálja, a CD40 ligandum pedig stimuláló jelet biztosít a T- és B-limfociták intercelluláris kölcsönhatása során. A szerkezetileg hasonló molekulák biológiai aktivitásában mutatkozó ilyen különbségeket elsősorban receptoraik expressziójának és szerkezetének sajátosságai határozzák meg, például a sejt apoptózisát meghatározó intracelluláris „halál” domén jelenléte vagy hiánya. Az elmúlt években az IL-10 és IL-12 családok is új tagokkal bővültek, akik sorozatszámú interleukint kaptak. Ezt követi a citokinek nagyon összetett csoportja, amelyek a T-helper limfociták funkcionális aktivitásának közvetítői. Az ebbe a csoportba való besorolás két alapelven alapul: 1) a Th1 vagy Th2 által szintetizált citokinekhez való tartozás, amely meghatározza a túlnyomórészt humorális vagy celluláris típusú immunológiai reakciók kialakulását, 2) egy közös receptor alegység - a gamma lánc - jelenléte. IL-2 receptor komplex. A gamma-lánc ligandumai közül ezenkívül az IL-4-et is izolálták, amelynek szintén közös receptor alegységei vannak az IL-13-mal, ami nagymértékben meghatározza ezen citokinek részben átfedő biológiai aktivitását. Hasonló módon izolálták az IL-7-et, amely a TSLP-vel közös receptorszerkezettel rendelkezik. A fenti osztályozás előnyei a citokinek biológiai és biokémiai tulajdonságainak egyidejű figyelembevételével járnak. Ennek a megközelítésnek a megvalósíthatóságát jelenleg a genom genetikai elemzésével új citokinek felfedezése és szerkezetileg hasonló gének keresése igazolja. Ennek a módszernek köszönhetően jelentősen bővült az I-es típusú interferonok, az IL-1, IL-10, IL-12 család, megjelent az IL-17 analóg citokinek új családja, amely már 6 tagból áll. Úgy tűnik, a közeljövőben az új citokinek megjelenése sokkal lassabban fog megtörténni, mivel az emberi genom elemzése majdnem befejeződött. A változások nagy valószínűséggel a ligandum-receptor kölcsönhatások variánsainak és biológiai tulajdonságainak tisztázása miatt lehetségesek, ami lehetővé teszi a citokinek osztályozásának végleges formáját.

Hatásmechanizmusok.

B. A citokinek receptorai. A citokinek hidrofil jelzőanyagok, amelyek hatását a plazmamembrán külső oldalán található specifikus receptorok közvetítik. A citokinek kötődése a receptorhoz (1) számos köztes szakaszon (2-5) keresztül vezet bizonyos gének transzkripciójának aktiválásához (6), maguk a citokin receptorok (néhány kivételtől eltekintve) nem rendelkeznek tirozin kináz aktivitással. A citokinhez (1) való kötődés után a receptormolekulák homodimerekké asszociálódnak. Ezenkívül heterodimereket képezhetnek jelátviteli fehérjékkel [STP-kkel] társulva, vagy maguk a BPS-ek dimerizációját is stimulálhatják (2). Az I. osztályú citokinreceptorok háromféle BPS-sel aggregálódhatnak: GP130, βc vagy γc fehérjékkel. Ezek a segédfehérjék maguk nem képesek megkötni a citokineket, de jelátvitelt végeznek tirozin-kinázokhoz (3) Sok citokin biológiai aktivitásának azonos spektruma magyarázható azzal, hogy különböző citokin-receptor komplexek képesek ugyanazt a BPS-t aktiválni.

A citokinekből származó jelátvitel példájaként az ábra azt mutatja, hogy az IL-6 (IL-6) receptor a ligandumhoz (1) való kötődés után hogyan stimulálja a GP130 dimerizációját (2). A GP130 membránfehérje dimerje megköti és aktiválja az YK család citoplazmatikus tirozin kinázát (két aktív hellyel rendelkező Janus kinázok) (3). A Janus kinázok foszforilálják a citokin receptorokat, a BPS-t és a különböző citoplazmatikus fehérjéket, amelyek további jelátvitelt hajtanak végre; transzkripciós faktorokat is foszforilálnak - jelátalakítókat és transzkripció aktivátorokat [PSAT (STAT, angol szóból: signal transducers and activators of transcription)]. Ezek a fehérjék a BPS családba tartoznak, amelyek szerkezetében egy SH3-domén található, amely felismeri a foszfotirozint (lásd 372. oldal). Ezért megvan az a tulajdonságuk, hogy foszforilált citokinreceptorhoz kapcsolódnak. Ha ezután a PSAT molekula (4) foszforilációja következik be, a faktor aktív formává alakul, és dimert (5) képez. A sejtmagba történő transzlokáció után a dimer, mint transzkripciós faktor, az iniciált gén promoteréhez (lásd 240. oldal) kötődik, és indukálja annak transzkripcióját (6) Egyes citokin receptorok a proteolízis következtében elveszíthetik az extracelluláris ligandumkötő domént (az ábrán nem látható). A domén bejut a véráramba, ahol verseng a citokinhez való kötődésért, ami csökkenti a citokin koncentrációját a vérben.A citokinek együtt egy szabályozó hálózatot (citokin kaszkád) alkotnak, többfunkciós hatással. A citokinek közötti átfedés azt a tényt eredményezi, hogy sokuk hatásában szinergizmus figyelhető meg, és egyes citokinek antagonisták. A szervezetben gyakran megfigyelhető az egész citokin kaszkád komplex visszacsatolásokkal.

A citokinek tulajdonságai.

A citokinek általános tulajdonságai, amelyeknek köszönhetően ezek a mediátorok önálló szabályozó rendszerré kombinálhatók.

1. A citokinek polipeptidek vagy fehérjék, gyakran glikoziláltak, legtöbbjük MW 5-50 kDa. A citokinek biológiailag aktív molekulái egy, két, három vagy több azonos vagy különböző alegységből állhatnak.

2. A citokinek nem rendelkeznek biológiai hatású antigénspecificitással. Befolyásolják a veleszületett és szerzett immunitás reakcióiban részt vevő sejtek funkcionális aktivitását. Ennek ellenére a citokinek a T- és B-limfocitákra hatva képesek serkenteni az antigén által kiváltott folyamatokat az immunrendszerben.

3. A citokin gének esetében három expressziós változat létezik: a) stádium-specifikus expresszió az embrionális fejlődés bizonyos szakaszaiban, b) konstitutív expresszió számos normál fiziológiai funkció szabályozására, c) az expresszió indukálható típusa, amely a legtöbbre jellemző. citokinek. Valójában a legtöbb citokint a gyulladásos válaszon és az immunválaszon kívül nem szintetizálják a sejtek. A citokin gének expressziója a kórokozók szervezetbe való behatolására, antigén irritációra vagy szövetkárosodásra válaszul kezdődik. A kórokozókhoz kapcsolódó molekuláris szerkezetek a proinflammatorikus citokinek szintézisének legerősebb induktorai közé tartoznak. A T-sejt citokinek szintézisének elindításához a sejteket egy specifikus antigénnel aktiválni kell egy T-sejt antigén receptor részvételével.

4. A citokinek a stimuláció hatására szintetizálódnak rövid ideig. A szintézis számos autoregulációs mechanizmus miatt leáll, beleértve a megnövekedett RNS instabilitást, valamint a prosztaglandinok, kortikoszteroid hormonok és egyéb tényezők által közvetített negatív visszacsatolások megléte miatt.

5. Hisztogenetikai eredetüket tekintve különböző típusú testsejtek különböző szervekben egy és ugyanazt a citokint képesek előállítani.

6. A citokinek az őket szintetizáló sejtek membránjaihoz köthetők, amelyek membrán formájában rendelkeznek a biológiai aktivitás teljes spektrumával, és az intercelluláris érintkezés során mutatják meg biológiai hatásukat.

7. A citokinek biológiai hatásait specifikus sejtreceptor komplexek közvetítik, amelyek nagyon nagy affinitással kötik meg a citokineket, és az egyes citokinek közös receptor alegységeket használhatnak. A citokin receptorok oldható formában létezhetnek, megtartva ligandumkötő képességüket.

8. A citokinek pleiotróp biológiai hatást fejtenek ki. Ugyanaz a citokin sokféle sejtre hathat, és a célsejtek típusától függően eltérő hatást válthat ki (1. ábra). A citokinek pleiotróp hatását a citokin receptorok különböző eredetű és funkciójú sejttípusokon történő expressziója, valamint a jelvezetés több különböző intracelluláris hírvivő és transzkripciós faktor segítségével biztosítja.

9. A citokineket a biológiai hatás felcserélhetősége jellemzi. Számos különböző citokin okozhat azonos biológiai hatást vagy hasonló aktivitást. A citokinek indukálják vagy elnyomják önmaguk, más citokinek és receptoraik szintézisét.

10. Az aktivációs jelre válaszul a sejtek egyidejűleg több citokint szintetizálnak, amelyek részt vesznek a citokinhálózat kialakításában. A szövetekben és a szervezet szintjén kifejtett biológiai hatások más, szinergikus, additív vagy ellentétes hatású citokinek jelenlététől és koncentrációjától függenek.

11. A citokinek befolyásolhatják a célsejtek proliferációját, differenciálódását és funkcionális aktivitását.

12. A citokinek különböző módon hatnak a sejtekre: autokrin - a sejt szintetizálja és kiválasztja ezt a citokint; parakrin - a termelő sejt közelében található sejteken, például a gyulladás fókuszában vagy a limfoid szervben; endokrin - a keringésbe jutás után távoli bármely szerv és szövet sejtjétől. Ez utóbbi esetben a citokinek hatása a hormonokéhoz hasonlít (2. ábra).

Rizs. 1. Ugyanazt a citokint a szervezet különböző sejtjei termelhetik különböző hisztogenetikai eredetű szervekben, és sokféle sejtre hatnak, a célsejtek típusától függően eltérő hatást váltva ki.

Rizs. 2. A citokinek biológiai hatásának megnyilvánulásának három változata.

Nyilvánvalóan a citokinszabályozási rendszer kialakulása evolúciósan a többsejtű organizmusok fejlődésével együtt ment végbe, és az intercelluláris interakció mediátorainak kialakulásának szükségessége miatt következett be, amelyek lehetnek hormonok, neuropeptidek, adhéziós molekulák és mások. Ebből a szempontból a citokinek a legsokoldalúbb szabályozórendszerek, mivel képesek biológiai aktivitást kifejteni mind a termelő sejt általi szekréció után távolról (lokálisan és szisztémásan), mind pedig az intercelluláris érintkezés során, biológiailag aktívak membrán formájában. Így különbözik a citokinrendszer az adhéziós molekuláktól, amelyek szűkebb funkciót csak akkor látnak el, ha a sejtek közvetlenül érintkeznek. Ugyanakkor a citokinrendszer eltér a hormonoktól, amelyeket főként speciális szervek szintetizálnak, és a keringési rendszerbe való belépés után hatnak.

A citokinek szerepe a szervezet élettani funkcióinak szabályozásában.

A citokinek szerepe a szervezet élettani funkcióinak szabályozásában 4 fő összetevőre osztható:

1. Az embriogenezis szabályozása, a szervek létrehozása és fejlődése, beleértve az immunrendszer szervei.

2. Egyes normál élettani funkciók szabályozása.

3. A szervezet védekező reakcióinak szabályozása helyi és szisztémás szinten.

4. A szöveti regenerációs folyamatok szabályozása.

Az egyes citokinek génjeinek expressziója az embrionális fejlődés bizonyos szakaszaiban stádium-specifikusan történik. Az őssejt faktor, a transzformáló növekedési faktorok, a TNF család citokinek és a kemokinek szabályozzák a különböző sejtek differenciálódását és migrációját, valamint az immunrendszer szerveinek kialakítását. Ezt követően előfordulhat, hogy egyes citokinek szintézise nem folytatódik, míg mások továbbra is szabályozzák a normális élettani folyamatokat, vagy részt vesznek a védőreakciók kialakulásában.

Annak ellenére, hogy a legtöbb citokin tipikus indukálható mediátor, és a posztnatális időszakban nem szintetizálják a sejtek a gyulladásos válaszon és az immunválaszon kívül, néhány citokin nem tartozik e szabály hatálya alá. A gének konstitutív expressziója eredményeként néhányuk folyamatosan szintetizálódik, és kellően nagy mennyiségben van forgalomban, szabályozva bizonyos sejttípusok proliferációját és differenciálódását az élet során. A funkciók ilyen típusú, citokinek általi fiziológiás szabályozásának példája lehet a folyamatosan magas eritropoetinszint és néhány CSF a vérképzés biztosítására. A szervezet védekező reakcióinak citokinek általi szabályozása nemcsak az immunrendszeren belül történik, hanem az egész szervezet szintjén zajló védekezési reakciók megszervezésével a gyulladás kialakulásának és az immunválasz szinte minden aspektusának szabályozásával. Ez a funkció, amely a legfontosabb az egész citokinrendszer számára, a citokinek biológiai hatásának két fő irányához kapcsolódik - a fertőző ágensek elleni védelemhez és a sérült szövetek helyreállításához. A citokinek elsősorban a helyi védekezési reakciók kialakulását szabályozzák a szövetekben különböző típusú vérsejtek, endotélium, kötőszövet és hám részvételével. A lokális szintű védelem tipikus gyulladásos reakció kialakulásával alakul ki klasszikus megnyilvánulásaival: hyperemia, ödéma kialakulása, fájdalom és működési zavarok megjelenése. A citokinek szintézise akkor kezdődik, amikor a kórokozók bejutnak a szövetekbe, vagy megsértik azok integritását, ami általában párhuzamosan megy végbe. A citokinek termelése szerves részét képezi annak a sejtes válasznak, amely a mielomonocita sorozat sejtjei általi felismeréséhez kapcsolódik különböző kórokozók hasonló szerkezeti komponenseinek, úgynevezett patogén-asszociált molekuláris mintázatoknak. Ilyen patogén struktúrák például a Gram-negatív baktériumok lipopoliszacharidjai, a Gram-pozitív mikroorganizmusok peptidoglikánjai, a flagellin vagy a CpolyG szekvenciákban gazdag DNS, amely minden típusú baktérium DNS-ére jellemző. A leukociták kifejezik a megfelelő mintázatfelismerő receptorokat, amelyeket Toll-szerű receptoroknak (TLR) is neveznek, és amelyek a mikroorganizmusok bizonyos szerkezeti mintáira specifikusak. A mikroorganizmusok vagy komponenseik TLR-rel való kölcsönhatása után intracelluláris jelátviteli kaszkád indul be, ami a leukociták funkcionális aktivitásának és a citokin gének expressziójának növekedéséhez vezet.

A TLR aktiválása a citokinek két fő csoportjának szintéziséhez vezet: a proinflammatorikus citokinek és az I-es típusú interferonok, elsősorban az IFNα / β, gyulladásos reakció kialakulásához, valamint a fenntartásban részt vevő különböző típusú sejtek aktiválásának legyezőszerű kiterjesztéséhez. és a gyulladás szabályozása, beleértve minden típusú leukocitát, dendritikus sejtet, T- és B-limfocitát, NK-sejteket, endoteliális és epiteliális sejteket, fibroblasztokat és másokat. Ez következetes szakaszokat biztosít a gyulladásos válasz kialakulásában, amely a veleszületett immunitás megvalósításának fő mechanizmusa. Ezenkívül megkezdődik az IL-12 családba tartozó citokinek szintézise a dendritikus sejtek által, serkentve a T-helper limfociták differenciálódását, ami egyfajta hídként szolgál a specifikus immunreakciók kialakulásának kezdetéhez, amelyek a specifikus felismeréssel járnak. mikroorganizmusok antigén szerkezetei.

Az IFN szintéziséhez kapcsolódó második nem kevésbé fontos mechanizmus biztosítja a vírusellenes védelem megvalósítását. Az I. típusú interferonok 4 fő biológiai tulajdonsággal rendelkeznek:

1. Közvetlen vírusellenes hatás a transzkripció blokkolásával.

2. A sejtproliferáció elnyomása, amely a vírus terjedésének gátlásához szükséges.

3. A vírussal fertőzött testsejtek lízisére képes NK-sejtek funkcióinak aktiválása.

4. Az I. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex molekulák fokozott expressziója, amely szükséges a vírusantigének fertőzött sejtek által a citotoxikus T-limfociták számára történő bemutatásának hatékonyságának növeléséhez. Ez a vírussal fertőzött sejtek T-limfociták általi specifikus felismerésének aktiválásához vezet - ez a vírussal fertőzött célsejtek lízisének első szakasza.

Ennek eredményeként a közvetlen vírusellenes hatás mellett a veleszületett (NK-sejtek) és a szerzett (T-limfociták) immunitás mechanizmusai is aktiválódnak. Ez egy példa arra, hogy egy kis citokinmolekula, amelynek MM-je 10-szer kevesebb, mint MM antitestmolekula, képes a pleiotróp típusú biológiai hatás miatt teljesen más védekezési reakciók aktiválására, amelyek célja egy cél elérése - a vírus eltávolítása. belépett a testbe.

Szöveti szinten a citokinek felelősek a gyulladás kialakulásáért, majd a szöveti regenerációért. A szisztémás gyulladásos reakció (akut fázis válasz) kialakulásával a citokinek szinte minden, a homeosztázis szabályozásában részt vevő szervet és rendszert érintenek. A proinflammatorikus citokinek hatása a központi idegrendszerre az étvágy csökkenéséhez és a viselkedési reakciók teljes komplexumának megváltozásához vezet. Az élelemkeresés ideiglenes leállítása és a szexuális aktivitás csökkentése egy feladathoz – a behatoló kórokozó elleni küzdelemhez – energiamegtakarítás szempontjából előnyös. Ezt a jelet a citokinek adják, hiszen a keringésbe kerülésük minden bizonnyal azt jelenti, hogy a lokális védekezés nem birkózott meg a kórokozóval, és szisztémás gyulladásos válasz aktiválása szükséges. A citokinek hipotalamusz hőszabályozó központjára gyakorolt ​​hatásával összefüggő szisztémás gyulladásos reakció egyik első megnyilvánulása a testhőmérséklet emelkedése. A hőmérséklet emelkedése hatékony védőreakció, mivel magasabb hőmérsékleten számos baktérium szaporodási képessége csökken, de éppen ellenkezőleg, a limfociták szaporodása fokozódik.

A májban a citokinek hatására fokozódik a kórokozó elleni küzdelemhez szükséges akut fázisú fehérjék és a komplementrendszer komponenseinek szintézise, ​​ugyanakkor csökken az albumin szintézise. A citokinek szelektív hatásának másik példája a vérplazma ionösszetételének változása a szisztémás gyulladásos reakció kialakulása során. Ezzel párhuzamosan a vasionok szintje csökken, de a cinkionok szintje növekszik, és köztudott, hogy egy baktériumsejt megvonása a vasionoktól azt jelenti, hogy csökken a proliferációs potenciálja (a laktoferrin hatása Ennek alapján). Másrészt a cink szintjének növelése szükséges az immunrendszer normál működéséhez, különösen a csecsemőmirigy biológiailag aktív szérumfaktorának kialakulásához, amely az egyik fő csecsemőmirigyhormon. a limfociták differenciálódása. A citokinek hematopoietikus rendszerre gyakorolt ​​hatása a vérképzés jelentős aktiválásával jár. A leukociták számának növelése szükséges a veszteség pótlásához és a sejtek, elsősorban a neutrofil granulociták számának növeléséhez a gennyes gyulladás fókuszában. A véralvadási rendszerre gyakorolt ​​hatás a koagulálhatóság fokozására irányul, ami a vérzés megállításához és a kórokozó közvetlen blokkolásához szükséges.

Így a szisztémás gyulladás kialakulásával a citokinek hatalmas biológiai aktivitást mutatnak, és szinte az összes testrendszer munkáját zavarják. Azonban a bekövetkező változások egyike sem véletlen: mindegyikre vagy a védekezési reakciók közvetlen aktiválásához van szükség, vagy csak egyetlen feladathoz – a betörő kórokozó elleni küzdelemhez – hasznos az energiaáramlás átváltása. Az egyes gének expressziójának szabályozása, a hormonális eltolódások és a viselkedési reakciók változása formájában a citokinek biztosítják azon testrendszerek működésének aktiválását és maximális hatékonyságát, amelyek egy adott időpontban szükségesek a védőreakciók kialakulásához. A citokinek az egész szervezet szintjén kommunikálnak az immun-, ideg-, endokrin-, vérképző- és egyéb rendszerek között, és arra szolgálnak, hogy bevonják őket egyetlen védekezési reakció megszervezésébe és szabályozásába. A citokinek pontosan az a szervezőrendszer, amely a kórokozók bejuttatása során a szervezet védőreakcióinak teljes komplexumát kialakítja és szabályozza. Nyilvánvalóan egy ilyen szabályozási rendszer evolúciósan alakult ki, és feltétlen előnyökkel jár a makroorganizmus legoptimálisabb védőreakciója szempontjából. Ezért nyilvánvalóan lehetetlen a védekezési reakciók fogalmát csak a nem specifikus rezisztencia mechanizmusok és egy specifikus immunválasz részvételére korlátozni. Az egész szervezet és minden olyan rendszer, amely első pillantásra nem kapcsolódik az immunitás fenntartásához, egyetlen védőreakcióban vesz részt.

A citokinek speciális vizsgálatai.

A citokinek jelentősége a vastagbél gyulladásos betegségeinek patogenezisében gyermekeknél.

S.V. Belmer, A.S. Szimbircev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihajlov. Az Orosz Állami Orvostudományi Egyetem, a moszkvai Állami Koloproktológiai Kutatóközpont és a Szentpétervári Állami Tiszta Biológiai Kutatóintézet azon dolgozik, hogy tanulmányozza a citokinek jelentőségét a gyermekek vastagbélgyulladásos betegségeinek patogenezisében. A gyomor-bél traktus krónikus gyulladásos betegségei jelenleg az egyik vezető helyet foglalják el a gyermekek emésztőrendszerének patológiájában. Különös jelentőséget tulajdonítanak a vastagbél gyulladásos betegségeinek (IBD), amelyek előfordulása világszerte folyamatosan növekszik. Hosszú lefolyás gyakori, és egyes esetekben végzetes visszaesésekkel, helyi és szisztémás szövődmények kialakulásával - mindez a betegség patogenezisének alapos tanulmányozását készteti az IBD kezelésének új megközelítései után. Az elmúlt évtizedekben a colitis ulcerosa (UC) incidenciája 100 ezer lakosonként évi 510 eset, a Crohn-betegség (CD) 100 ezer lakosonként évi 16 eset volt. A prevalencia arányok Oroszországban, a moszkvai régióban megfelelnek az átlagos európai adatoknak, de lényegesen alacsonyabbak, mint a skandináv országokban, Amerikában, Izraelben és Angliában. A NUC esetében a prevalencia 19,3/100 ezer fő, az incidencia 1,2/100 ezer fő évente. CD esetében a prevalencia 3,0/100 ezer fő, az előfordulás 0,2/100 ezer fő évente. Az a tény, hogy a legmagasabb gyakoriságot a magasan fejlett országokban figyelik meg, nemcsak társadalmi és gazdasági tényezők, hanem a betegek genetikai és immunológiai jellemzői is meghatározzák, amelyek meghatározzák az IBD-re való hajlamot. Ezek a tényezők alapvetőek az IBD eredetének immunpatogenetikai elméletében. A vírusos és/vagy bakteriális elméletek csak a betegség akut megjelenését magyarázzák, a folyamat kronizálása pedig mind a genetikai hajlamnak, mind az immunválasz sajátosságainak köszönhető, amelyek szintén genetikailag meghatározottak. Meg kell jegyezni, hogy az IBTC jelenleg a genetikailag heterogén komplex hajlamú betegségek közé tartozik. Több mint 15 feltételezett jelölt gént azonosítottak 2 csoportból (immunspecifikus és immunszabályozó), amelyek örökletes hajlamot okoznak. Valószínűleg a hajlamot több gén határozza meg, amelyek meghatározzák az immunológiai és gyulladásos reakciók természetét. Számos tanulmány eredménye alapján megállapítható, hogy az IBT kialakulásához kapcsolódó gének legvalószínűbb lokalizációja a 3., 7., 12. és 16. kromoszóma. Jelenleg nagy figyelmet fordítanak a T- és B-limfociták, valamint a gyulladást közvetítő citokinek funkcióinak vizsgálatára. Az interleukinok (IL), az interferonok (IFN), a tumor nekrózis faktor-a (TNF-a), a makrofágok és a vastagbél nyálkahártya fehérjéivel szembeni autoantitestek és az automikroflóra szerepét aktívan tanulmányozzák. A CD és UC betegségeik sajátosságaira fény derült, de még mindig nem tisztázott, hogy ezek a változások elsődlegesen vagy másodlagosan jelentkeznek. A patogenezis számos aspektusának megértéséhez nagyon fontosak lennének az IBD preklinikai szakaszában, valamint az első fokú rokonokon végzett vizsgálatok. A gyulladás mediátorai között kiemelt szerep jut a citokineknek, amelyek 5-50 kDa tömegű polipeptidmolekulák csoportja, amelyek részt vesznek a szervezet védekező reakcióinak kialakításában és szabályozásában. A szervezet szintjén a citokinek az immun-, ideg-, endokrin-, hematopoietikus és egyéb rendszerek között kommunikálnak, és arra szolgálnak, hogy bevonják őket a védekezési reakciók megszervezésébe és szabályozásába. A citokinek osztályozása a 2. táblázatban látható. A legtöbb citokint nem szintetizálják a gyulladásos és immunválaszon kívüli sejtek. A citokin gének expressziója a kórokozók szervezetbe való behatolására, antigén irritációra vagy szövetkárosodásra válaszul kezdődik. A citokinszintézis egyik legerősebb indukálója a bakteriális sejtfal összetevői: LPS, peptidoglikánok és muramil-dipeptidek. A pro-inflammatorikus citokinek termelői főként monociták, makrofágok, T-sejtek stb. A gyulladásos folyamatra gyakorolt ​​hatástól függően a citokinek két csoportra oszthatók: pro-inflammatorikus (IL-1, IL-6, IL-8) , TNF-a, IFN-g ) és gyulladásgátló (IL-4, IL-10, TGF-b). Az interleukin-1 (IL-1) gyulladásos reakciók, szövetkárosodás és fertőzések során felszabaduló immunszabályozó mediátor (gyulladást elősegítő citokin). Az IL-1 fontos szerepet játszik a T-sejtek aktiválásában, amikor kölcsönhatásba lépnek az antigénnel. Az IL-1-nek két típusa létezik: az IL-1a és az IL-1b, amelyek a 2-es emberi kromoszómán található két különböző génlókusz termékei. Az IL-1a a sejtben marad, vagy lehet membrán formában, és kis mennyiségben megjelenik az extracelluláris térben. Az IL-1a membrán formájának szerepe az aktiváló jelek átvitele a makrofágoktól a T-limfocitákhoz és más sejtekhez az intercelluláris érintkezés során. Az IL-1a a fő rövid távú közvetítő. Az IL-1b-t, ellentétben az IL-1a-val, aktívan szekretálják a sejtek, és mind szisztémás, mind lokálisan hat. Ma már ismert, hogy az IL-1 a gyulladásos reakciók egyik fő közvetítője, serkenti a T-sejtek proliferációját, fokozza az IL-2 receptor expresszióját a T-sejteken és azok IL-2 termelését. Az IL-2 az antigénnel együtt indukálja a neutrofilek aktivációját és adhézióját, serkenti más citokinek (IL-2, IL-3, IL-6 stb.) képződését az aktivált T-sejtek és fibroblasztok által, serkenti a fibroblasztok proliferációját és endoteliális sejtek. Szisztémásan az IL-1 szinergikusan hat a TNF-a-val és az IL-6-tal. A vérben a koncentráció növekedésével az IL-1 hatással van a hipotalamusz sejtjeire, és testhőmérséklet-emelkedést, lázat, álmosságot, csökkent étvágyat okoz, valamint serkenti a májsejteket akut fázisú fehérjék (CRP, amiloid A, a-2 makroglobulin és fibrinogén). IL4 (5. kromoszóma). Gátolja a makrofágok aktiválódását, és blokkol számos, az IFNg által stimulált hatást, például az IL1, a nitrogén-monoxid és a prosztaglandinok termelődését, fontos szerepet játszik a gyulladáscsökkentő reakciókban, valamint immunszuppresszív hatású. Az IL6 (7. kromoszóma), az egyik fő proinflammatorikus citokin, a B-sejtek és a makrofágok differenciálódásának végső szakaszának fő indukálója, a májsejtek akut fázisú fehérjetermelésének erőteljes stimulátora. Az IL6 egyik fő funkciója az antitestek termelésének serkentése in vivo és in vitro. IL8 (4. kromoszóma). Olyan kemokinek mediátorokra utal, amelyek a leukociták irányított migrációját (kemotaxist) okozzák a gyulladásos fókusz felé. Az IL10 fő funkciója az I. típusú Thelperek (TNFb, IFNg) és az aktivált makrofágok (TNF-a, IL1, IL12) citokintermelésének gátlása. Ma már felismerték, hogy az immunválasz típusai a limfocita aktiválás egyik változatához kapcsolódnak az első típusú (TH2) vagy a második típusú (TH3) T-limfocita helperek klónjainak túlnyomó részvételével. A TH2 és TH3 termékek negatívan befolyásolják az ellentétes klónok aktiválását. A Th-klónok bármelyikének túlzott aktiválása az immunválaszt az egyik fejlődési lehetőségnek megfelelően irányíthatja. A Th-klónok aktiválásának krónikus egyensúlyhiánya immunpatológiai állapotok kialakulásához vezet. Az IBTD-ben a citokinek változásait többféleképpen lehet tanulmányozni a vérben vagy in situ szintjének meghatározásával. Az IL1 szintje emelkedett minden gyulladásos bélbetegségben. Az NNC és a CD közötti különbség az IL2 fokozott expressziójában rejlik. Ha a NUC-ban csökkent vagy normális IL2-szintet találunk, akkor CD-ben annak emelkedett szintjét mutatjuk ki. Az IL4-tartalom NUC-ban nő, míg CD-ben normális marad, vagy akár csökken is. Az akut fázis reakcióit közvetítő IL6 szintje szintén megemelkedik a gyulladás minden formája esetén. A citokinek profiljára vonatkozó adatok alapján feltételezhető, hogy a krónikus IBD két fő formáját a citokinek eltérő aktivációja és expressziója jellemzi. A vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az UC-s betegeknél megfigyelt citokinprofil jobban megfelel a TH3-profilnak, míg a TH2-profilt inkább a CD-s betegekre kell jellemzőbbnek tekinteni. A TH2 és TH3 profilok szerepére vonatkozó hipotézis vonzereje abban is rejlik, hogy a citokinek alkalmazása egy vagy másik irányba megváltoztathatja az immunválaszt, és a citokin egyensúly helyreállításával remisszióhoz vezethet. Ezt különösen az IL10 használatával lehet megerősíteni. További vizsgálatoknak meg kell mutatniuk, hogy a citokinválasz másodlagos jelenség-e a stimuláció hatására, vagy éppen ellenkezőleg, a megfelelő citokinek expressziója határozza meg a szervezet reaktivitását a későbbi klinikai megnyilvánulások kialakulásával. A citokinek szintjének tanulmányozását IBD-ben gyermekeknél még nem végezték el. Ez a munka annak a tudományos tanulmánynak az első része, amely a gyermekek IBD-ben előforduló citokinállapotának vizsgálatára irányul. A munka célja a makrofágok humorális aktivitásának vizsgálata volt NUC-s és CD-s gyermekek vérének (IL1a, IL8) szintjének meghatározásával, valamint ezek dinamikájának vizsgálata a terápia során. 2000 és 2002 között az Orosz Gyermekklinikai Kórház gasztroenterológiai osztályán 34 NUC-s és 19 CD-s gyermeket vizsgáltak meg 4 és 16 év között. A diagnózist anamnesztikusan, endoszkóposan és morfológiailag igazoltuk. Az IL1a, IL8 proinflammatorikus citokinek szintjének vizsgálatát enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) módszerével végeztük. Az IL1a, IL8 koncentrációjának meghatározásához az OOO Cytokin (Szentpétervár, Oroszország) által gyártott tesztrendszereket használtuk. Az elemzést a Magas Tiszta Biopreparátumok Kutatóintézetének Állami Tudományos Központjának immunfarmakológiai laboratóriumában végezték (a laboratórium vezetője, MD, Prof. AS Simbirtsev). A vizsgálat során kapott eredmények az IL1a, IL8 szintjének szignifikáns növekedését mutatták ki az exacerbáció időszakában, ami kifejezettebb NUC-ban szenvedő gyermekeknél, mint CD-s gyermekeknél. Exacerbáció nélkül a proinflammatorikus citokinek szintje csökken, de nem éri el a normát. UC-ban az IL-1a, az IL-8 szintje az exacerbáció időszakában a gyermekek 76,2% -ánál és 90% -ánál, a remisszió időszakában pedig 69,2% és 92,3% volt. CD-ben az IL-1a, IL-8 szintje az exacerbáció időszakában a gyermekek 73,3%-ánál és 86,6%-ánál, a remisszió időszakában pedig 50%-nál, illetve 75%-ánál emelkedik.

A betegség súlyosságától függően a gyermekek aminoszalicilátokkal vagy glükokortikoidokkal kezelték. A terápia jellege jelentősen befolyásolta a citokinszint dinamikáját. Az aminoszalicilátokkal végzett kezelés során a proinflammatorikus citokinek szintje a NUC-s és CD-s gyermekek csoportjában szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollcsoportban. Ugyanakkor magasabb arányt figyeltek meg az UC-s gyermekek csoportjában. NUC-ban az aminoszalicilát terápia hátterében az IL1a, IL8 a gyermekek 82,4%-ában, illetve 100%-ában emelkedik, míg glükokortikoid terápia során a gyermekek 60%-ában mindkét citokin esetében. CD-ben az IL1a, IL8 az aminoszalicilát-terápia során minden gyermeknél, glükokortikoid terápia során pedig a gyermekek 55,5%-ánál, illetve 77,7%-ánál emelkedik. Így ennek a vizsgálatnak az eredményei azt jelzik, hogy a legtöbb UC-s és CD-s gyermekben az immunrendszer makrofág kapcsolata jelentős szerepet játszik a patogenetikai folyamatban. Az ebben a vizsgálatban kapott adatok alapvetően nem térnek el a felnőtt betegek vizsgálata során nyert adatoktól. Az IL1a és IL8 szintjei közötti különbségek UC-s és CD-s betegekben kvantitatívak, de nem kvalitatívak, ami arra utal, hogy ezek a változások nem specifikusak a krónikus gyulladásos folyamat lefolyása miatt. Ezért ezek a mutatók nem rendelkeznek diagnosztikai értékkel. Az IL1a és IL8 szintjének dinamikus vizsgálatának eredményei alátámasztják a glükokortikoid gyógyszerekkel végzett terápia nagyobb hatékonyságát, mint az aminoszalicilekkel végzett terápia. A bemutatott adatok az IBT-s gyermekek citokinállapotának vizsgálatának első szakaszának eredményei. A probléma további tanulmányozására van szükség, figyelembe véve más gyulladáskeltő és gyulladásgátló citokinek mutatóit.

A nitrogén-monoxid és a citokinek szerepe az akut tüdőkárosodás szindróma kialakulásában.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Suhoteplaya tanulmányozza ezt a problémát: Vlagyivosztok Állami Orvostudományi Egyetem Aneszteziológiai és Reanimatológiai Tanszéke. Az akut tüdőkárosodás szindróma (felnőtt légzési distressz szindróma, ARDS) az akut légzési elégtelenség egyik legsúlyosabb formája, amely súlyos trauma, szepszis, hashártyagyulladás, hasnyálmirigy-gyulladás, nagymértékű vérveszteség, aspiráció, kiterjedt sebészeti beavatkozások hátterében jelentkezik. és az esetek 50 60%-a halálos. Az ARDS patogenezisére, a szindróma korai diagnózisának és prognózisának kritériumainak kialakítására vonatkozó kutatási adatok kevések, meglehetősen ellentmondásosak, ami nem teszi lehetővé koherens diagnosztikai és terápiás koncepció kialakítását. Megállapítást nyert, hogy az ARDS a tüdőkapillárisok endotéliumának és az alveoláris epitéliumnak a károsodásán, a vér reológiai tulajdonságainak megsértésén alapul, ami intersticiális és alveoláris szövetek ödémájához, gyulladáshoz, atelektáziához, pulmonális hipertóniához vezet. Az elmúlt évek irodalmában elegendő információ áll rendelkezésre a sejt- és szövetanyagcsere univerzális szabályozójáról - a nitrogén-monoxidról. A nitrogén-monoxid (NO) iránti érdeklődés elsősorban annak köszönhető, hogy számos funkció szabályozásában vesz részt, többek között az értónusban, a szív összehúzódásában, a vérlemezke-aggregációban, a neurotranszmisszióban, az ATP- és fehérjeszintézisben, valamint az immunvédelemben. Emellett a molekuláris célpont megválasztásától és a vele való kölcsönhatás jellemzőitől függően a NO-nak is van káros hatása. Úgy gondolják, hogy a sejtaktiváció kiváltó mechanizmusa a kiegyensúlyozatlan citokinémia. A citokinek oldható peptidek, amelyek az immunrendszer mediátoraiként működnek, és sejtes együttműködést, pozitív és negatív immunregulációt biztosítanak. Igyekeztünk rendszerezni a NO és a citokinek szerepéről az akut tüdősérülés szindróma kialakulásában játszott szakirodalomban fellelhető információkat. A NO vízben és zsírban oldódó gáz. Molekulája instabil szabad gyök, könnyen bediffundál a szövetekbe, olyan gyorsan felszívódik és elpusztul, hogy csak a közvetlen környezet sejtjeire képes hatni. A NO-molekula rendelkezik mindazon tulajdonságokkal, amelyek a klasszikus hírvivőkben rejlenek: gyorsan termelődik, nagyon alacsony koncentrációban fejti ki hatását, a külső jel megszűnése után gyorsan átalakul más vegyületekké, oxidálódva stabil szervetlen nitrogén-oxidokká: nitritté és nitráttá. A NO élettartama a szövetekben különböző források szerint 5-30 másodperc. Az NO fő molekuláris célpontjai a vastartalmú enzimek és fehérjék: az oldható guanilát-cikláz, maga a nitrooxid-szintáz (NOS), a hemoglobin, a mitokondriális enzimek, a Krebs-ciklus enzimei, a fehérjeszintézis és a DNS-szintézis. A NO szintézise a szervezetben az L-arginin aminosav nitrogéntartalmú részének enzimatikus átalakulásán keresztül megy végbe, egy specifikus NOS enzim hatására, és a kalciumionok kalmodulinnal való kölcsönhatása közvetíti. Az enzim alacsony koncentrációban inaktiválódik, és 1 μM szabad kalcium esetén maximálisan aktív. A NOS két izoformáját azonosították: konstitutív (cNOS) és indukált (iNOS), amelyek különböző gének termékei. A kalcium-kalmodulin-függő cNOS folyamatosan jelen van a sejtben, és elősegíti a kis mennyiségű NO felszabadulását a receptor és a fizikai stimuláció hatására. Az ezen izoforma hatására keletkező NO számos fiziológiai reakcióban hordozóként működik. A kalcium-kalmodulin-független iNOS különböző sejttípusokban képződik, válaszul a gyulladást elősegítő citokinekre, endotoxinokra és oxidánsokra. Ezt a NOS izoformát a 17. kromoszómán lévő specifikus gének írják át, és elősegíti nagy mennyiségű NO szintézisét. Az enzim három típusba is sorolható: NOS-I (neuronális), NOS-II (makrofág), NOS-III (endotheliális). A NO-t szintetizáló enzimek családja számos tüdősejtekben megtalálható: hörgőhámsejtekben, alveolocitákban, alveoláris makrofágokban, hízósejtekben, hörgőartériák és vénák endothel sejtjeiben, hörgők és erek sima myocytáiban, nem adrenerg nemkolinerg neuronokban. Az emberek és emlősök hörgői és alveolusai hámsejtjeinek konstitutív NO-kiválasztási képességét számos tanulmány igazolta. Megállapítást nyert, hogy az emberi légutak felső részei, valamint az alsó részei részt vesznek az NO képződésében. A tracheostomiás betegeken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a légcsőben kilélegzett gáz mennyisége lényegesen kisebb, mint az orrüregben és a szájüregben. Az endogén NO szintézise a gépi lélegeztetés alatt álló betegeknél jelentősen megsérül. A kutatások megerősítik, hogy az NO felszabadulása a hörgőtágulat idején történik, és a vagus idegrendszer szabályozza. Adatokat szereztek arra vonatkozóan, hogy a NO képződése az emberi légutak hámjában fokozódik a légzőrendszer gyulladásos megbetegedéseiben. A gázszintézis fokozódik a citokinek, valamint az endotoxinok és lipopoliszacharidok hatására indukált NOS aktiválódása miatt.

Jelenleg több mint száz citokin ismert, amelyeket hagyományosan több csoportra osztanak.

1. Interleukinok (IL-1 - IL18) - szekréciót szabályozó fehérjék, amelyek mediátor kölcsönhatásokat biztosítanak az immunrendszerben és annak kapcsolatát más testrendszerekkel.

2. Interferonok (IFN-alfa, béta, gamma) - antivirális citokinek kifejezett immunszabályozó hatással.

3. A tumornekrózis faktorok (TNF alfa, béta) citokinek citotoxikus és szabályozó hatásúak.

4. Kolóniastimuláló faktorok (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) - a hematopoietikus sejtek növekedésének és differenciálódásának serkentői, a vérképzést szabályozók.

5. Kemokinek (IL-8, IL-16) - kemoattraktánsok a leukociták számára.

6. Növekedési faktorok - a különböző szövetekhez tartozó sejtek növekedésének, differenciálódásának és funkcionális aktivitásának szabályozói (fibroblaszt növekedési faktor, endothel sejt növekedési faktor, epidermális növekedési faktor) és transzformáló növekedési faktorok (TGF béta).

Ezek a bioregulációs molekulák meghatározzák a gyulladásos és immunválasz típusát és időtartamát, szabályozzák a sejtproliferációt, a vérképzést, az angiogenezist, a sebgyógyulást és sok más folyamatot. Minden kutató hangsúlyozza, hogy a citokinek nem rendelkeznek specifikus antigénekkel. Tenyésztett tüdőmakrofágokkal és hízósejtekkel végzett kísérletek kimutatták az iNOS képződését interferon gamma, interleukin-1, tumornekrózis faktor és lipopoliszacharidok hatására. Az iNOS és a cNOS expresszióját proinflammatorikus citokinek esetében állati és humán alveolocitákban találták. Az epidermális növekedési faktor – a hámsejtek működésének szabályozója – hozzáadása a tenyészethez csak az indukált enzim aktivitását csökkentette. Ismeretes, hogy természetüktől függően a citokinek autokrin - magukra a termelő sejtekre, parakrin - más célsejtekre, vagy endokrin - különböző sejtekre hatnak a termelésük helyén kívül. Ugyanakkor agonista vagy antagonista elv szerint kölcsönhatásba léphetnek egymással, megváltoztatva a célsejtek funkcionális állapotát és citokin hálózatot alkotva. A citokinek tehát nem izolált peptidek, hanem egy integrált rendszer, melynek fő összetevői a termelő sejtek, maga a fehérje egy citokin, annak receptora és egy célsejt. Megállapították, hogy az akut tüdőkárosodás kialakulásával a proinflammatorikus citokinek szintje emelkedik: IL-1, 6, 8, 12, TNF alfa, IFN alfa. Hatásuk értágulattal, permeabilitásuk növekedésével és a tüdőszövetben a folyadék felhalmozódásával jár. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy az IFN gamma és a TNF alfa képes adhéziós molekulák - ICAM -1 expresszióját indukálni a humán endotheliocitákon. A leukocitákhoz, vérlemezkékhez és endoteliális sejtekhez tapadt adhéziós molekulák "gördülő" neutrofileket képeznek, és elősegítik a fibrinrészecskék aggregációját. Ezek a folyamatok hozzájárulnak a kapilláris véráramlás megsértéséhez, növelik a kapillárisok permeabilitását és helyi szöveti ödémát váltanak ki. A kapilláris véráramlás lassulását elősegíti a NO aktiválása, ami az arteriolák tágulását okozza. A leukociták további migrációját a gyulladás fókuszába speciális citokinek - kemokinek - szabályozzák, amelyeket nemcsak az aktivált makrofágok, hanem az endothel sejtek, fibroblasztok, sima myociták is termelnek és szekretálnak. Fő funkciójuk a gyulladásos fókusz neutrofilekkel való ellátása és funkcionális aktivitásuk aktiválása. A neutrofilek fő kemokinje az Il-8. Legerősebb induktorai a bakteriális lipopoliszacharidok, az IL-1 és a TNFalpha. R. Bahra és mtsai. úgy vélik, hogy a neutrofilek transzendotheliális migrációjának minden lépését a TNF-alfa stimuláló koncentrációja szabályozza. Az akut tüdőkárosodás kialakulásával a vaszkuláris endotheliociták, a hörgőhámsejtek és az alveoláris makrofágok aktiválódnak, és részt vesznek a fáziskölcsönhatásokban. Ennek eredményeként egyrészt mobilizálódásuk, védő tulajdonságaik fokozódása következik be, másrészt maguk a sejtek és a környező szövetek károsodása is lehetséges. Számos tanulmány kimutatta, hogy a részleges oxigénredukció terméke, a szuperoxid felhalmozódhat a gyulladásos fókuszban, ami inaktiválja a NO vazoaktív hatását. Az NO és a szuperoxid anion gyorsan reagálva sejtkárosító peroxinitrit keletkezik. Ez a reakció elősegíti az NO eltávolítását az ér- és hörgőfalakból, valamint az alveolociták felszínéről. Érdekesek azok a vizsgálatok, amelyek azt mutatják, hogy hagyományosan az NO toxicitás mediátoraként tartott peroxinitritnek fiziológiás hatása lehet, és érrelaxációt válthat ki a vaszkuláris endotéliumban a cGMP NO által közvetített növekedése révén. A peroxinitrit viszont egy erős oxidálószer, amely képes károsítani az alveoláris epitéliumot és a tüdő felületaktív anyagot. A membránfehérjék és lipidek pusztulását okozza, károsítja az endotéliumot, fokozza a vérlemezke-aggregációt, részt vesz az endotoxémiában. Fokozott képződését akut tüdősérülés szindrómában figyelték meg. A kutatók úgy vélik, hogy az indukált enzim aktiválása következtében termelődő NO a szervezet nem specifikus védelmét szolgálja a kórokozók széles körével szemben, gátolja a vérlemezke-aggregációt és javítja a helyi vérkeringést. Azt találták, hogy a túlzott mennyiségű NO elnyomja a cNOS aktivitását a sejtekben a szuperoxiddal való kölcsönhatás miatt, és valószínűleg a guanilát-cikláz deszenzitizációja következtében, ami a sejtben a cGMP csökkenéséhez és az intracelluláris kalcium növekedéséhez vezet. . Brett és mtsai. és Kooy és munkatársai, a nitrooxiderg mechanizmusok jelentőségét elemezve az ARDS patogenezisében, felvetették, hogy az iNOS, a peroxinitrit és a nitrotirozin, a peroxinitrit fehérjére gyakorolt ​​hatásának fő terméke kulcsszerepet játszhat a szindróma kialakulásában. Cuthbertson et al. úgy vélik, hogy az akut tüdőkárosodás alapja a NO és a peroxinitrit hatása az elasztázra és az interleukin-8-ra. Kobayashi et al. akut tüdőkárosodás szindrómában szenvedő betegek hörgőalveoláris folyadékában az iNOS, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-8 tartalmának növekedését is rögzítették. Meldrum et al. a pulmonalis makrofágok gyulladásos citokinek termelésének csökkenését mutatták ki ARDS-ben a helyi NO-L-arginin termelés szubsztrátjának hatására. Megállapítást nyert, hogy az akut tüdősérülés-szindróma kialakulásában jelentős szerepet játszik a citokinek - TNF alfa, IL-2, GM-CSF, CD3 limfociták elleni monoklonális antitestek vaszkuláris endoteliális sejtjein - hatása miatti csökkent vaszkuláris permeabilitás. a tüdő és az immunociták. A tüdőerek permeabilitásának gyors és erőteljes növekedése a neutrofilek tüdőszövetbe vándorlásához és citotoxikus mediátorok felszabadulásához vezet, ami kóros tüdőelváltozások kialakulásához vezet. Az akut tüdőkárosodás kialakulása során a TNF alfa fokozza a neutrofilek tapadását az érfalhoz, fokozza a szövetekbe való migrációjukat, elősegíti az endothelsejtek szerkezeti és metabolikus változásait, megzavarja a sejtmembránok permeabilitását, aktiválja más citokinek és eikozanoidok képződését, és a tüdőhámsejtek apoptózisát és nekrózisát okozza. A kapott adatok azt mutatják, hogy az LPS bejuttatása által kiváltott makrofágok apoptózisa nagymértékben összefügg az IFN gamma-val, és az IL-4, IL-10, TGF béta hatása csökkenti. Azonban Kobayashi et al. olyan adatokat szereztek, amelyek arra utalnak, hogy az IFN gamma részt vehet a légúti nyálkahártya hámjának helyreállításában. A Hagimoto-vizsgálatok olyan információt tartalmaznak, hogy a hörgők és az alveolusok hámsejtjei a TNF alfa vagy Fas ligandum hatására IL-8-at, IL-12-t szabadítanak fel. Ez a folyamat a Carr-B nukleáris faktor Fas ligandum általi aktiválásával jár.

Úgy gondolják, hogy az IL-8 az egyik legfontosabb citokin az akut tüdőkárosodás patofiziológiájában. Miller és mtsai. az ARDS-ben szenvedő betegek hörgő-alveoláris folyadékának vizsgálata során a sesis hátterében, az IL-8 szintjének jelentős növekedését találták a kardiogén tüdőödémában szenvedő betegekhez képest. Feltételezték, hogy az Il-8 elsődleges forrása a tüdő, és ez a kritérium felhasználható a szindróma differenciáldiagnózisában. Grau et al. úgy vélik, hogy a tüdőkapillárisok endothel sejtjei a citokinek - IL-6, IL-8 - fontos forrásai az akut tüdőkárosodás kialakulásában. Goodman et al. Az ARDS-ben szenvedő betegek hörgő-alveoláris mosófolyadékában lévő citokinek szintjének dinamikájának tanulmányozásakor az IL-1béta, IL-8, monocita kemotaktikus peptid-1, epithelialis celluláris neutrofil aktivátor, makrofág gyulladásos peptid -1 szignifikáns növekedése tapasztalható. alfa talált. Ugyanakkor a szerzők úgy vélik, hogy az IL-1 béta-tartalom növekedése a szindróma kedvezőtlen kimenetelének markereként szolgálhat. Bauer et al. kimutatták, hogy az ARDS-ben szenvedő betegek bronchoalveoláris folyadékának IL-8 tartalmának ellenőrzése monitorozásra használható, az IL-8 szint csökkenése a folyamat kedvezőtlen lefolyását jelzi. Számos tanulmány tartalmaz információt arról is, hogy a tüdő vaszkuláris endotéliumának citokintermelésének mértéke befolyásolja az akut tüdőkárosodás kialakulását, és ennek szabályozása a klinikai gyakorlatban felhasználható a korai diagnózis érdekében. Az ARDS-ben szenvedő betegek proinflammatorikus citokinek szintjének növekedésének lehetséges negatív következményeit Martin és munkatársai, Warner és munkatársai tanulmányai igazolják. A citokinek és bakteriális endotoxinok által aktivált alveoláris makrofágok fokozzák a NO szintézisét. A hörgő- és alveoláris epiteliális sejtek, a neutrofilek, a hízósejtek, az endothelsejtek és a tüdőerek sima myocytái által termelt NO szint is nő, valószínűleg a Carr-B nukleáris faktor aktiválása révén. A szerzők úgy vélik, hogy az indukált NOS aktiválása következtében keletkező nitrogén-monoxid elsősorban a szervezet nem specifikus védelmét szolgálja. A makrofágokból felszabaduló NO gyorsan behatol a baktériumokba és gombákba, ahol gátolja az enzimek három létfontosságú csoportját: a H-elektrontranszportot, a Krebs-ciklust és a DNS-szintézist. A NO részt vesz a szervezet védekezésében az immunválasz utolsó szakaszában, és átvitt értelemben az immunrendszer „büntető kardjának” tekintik. A sejtben nem megfelelően nagy mennyiségben felhalmozódó NO-nak azonban káros hatása is van. Így az akut tüdősérülés szindróma kialakulásával a citokinek és az NO egymás utáni reakcióláncot váltanak ki, amely a mikrokeringés károsodásában, a szöveti hipoxiában, az alveoláris és intersticiális ödémában, valamint a tüdő metabolikus funkcióinak károsodásában fejeződik ki. Kijelenthető tehát, hogy a citokinek és NO hatásmechanizmusának fiziológiai és patofiziológiai mechanizmusainak vizsgálata ígéretes kutatási terület, amely a jövőben nemcsak az ARDS patogenezisének megértését teszi lehetővé, hanem annak meghatározását is. a szindróma diagnosztikai és prognosztikai markerei, a letalitás csökkentését célzó patogenetikai alapú terápia lehetőségeinek kidolgozása.

A citokinek meghatározásának módszerei.

Az áttekintés a jelenleg használt citokinek vizsgálatának főbb módszereivel foglalkozik. Röviden ismertetjük a módszerek lehetőségeit és célját. Bemutatjuk a citokin gének nukleinsavak szintjén és fehérjetermelés szintjén történő expressziójának elemzésére szolgáló különféle megközelítések előnyeit és hátrányait. (Citokinek és gyulladások. 2005. T. 4, No. 1. S. 22-27.)

A citokinek olyan szabályozó fehérjék, amelyek mediátorok univerzális hálózatát alkotják, amelyek mind az immunrendszerre, mind más szervek és szövetek sejtjeire jellemzőek. Minden sejtes esemény a szabályozó fehérjék ezen osztályának ellenőrzése alatt zajlik: proliferáció, differenciálódás, apoptózis és a sejtek speciális funkcionális aktivitása. Az egyes citokinek sejtekre gyakorolt ​​hatása pleiotróp, a különböző mediátorok hatásspektruma átfedi egymást, és általában a sejt végső funkcionális állapota több, szinergikusan ható citokin hatásától függ. A citokinrendszer tehát a mediátorok univerzális, polimorf szabályozó hálózata, amely a sejtes elemek proliferációs, differenciálódásának, apoptózisának és funkcionális aktivitásának szabályozására szolgál a szervezet vérképző, immun- és egyéb homeosztatikus rendszereiben. A citokinek meghatározására szolgáló módszerek 20 év intenzív tanulmányozása során nagyon gyors fejlődésen mentek keresztül, és ma a tudományos ismeretek egész területét képviselik. A citokineológiával foglalkozó kutatók munkájuk elején a módszer megválasztásának kérdésével szembesülnek. És itt a kutatónak pontosan tudnia kell, milyen információkat kell megszereznie a kitűzött cél eléréséhez. Jelenleg több száz különböző módszert fejlesztettek ki a citokinrendszer értékelésére, amelyek sokrétű információt szolgáltatnak erről a rendszerről. A citokinek értékelése különböző biológiai közegekben specifikus biológiai aktivitáson alapulhat. Számszerűsíthetők különféle immunológiai vizsgálati módszerekkel, poli- és monoklonális antitestek felhasználásával. A citokinek szekréciós formáinak tanulmányozása mellett lehetőség nyílik azok intracelluláris tartalmának és szöveti termelődésének tanulmányozására áramlási citometriával, Western blottal és in situ immunhisztokémiával. Nagyon fontos információkhoz juthatunk a citokin mRNS expressziójának, mRNS stabilitásának, citokin mRNS izoformák jelenlétének, természetes antiszensz nukleotid szekvenciák vizsgálatával. A citokin gének allél variánsainak vizsgálata fontos információkkal szolgálhat az egyik vagy másik mediátor genetikailag programozott magas vagy alacsony termeléséről. Mindegyik módszernek megvannak a maga hátrányai és előnyei, saját felbontása és meghatározási pontossága. A kutató ezen árnyalatok tudatlansága és félreértése hamis következtetésekre vezethet.

A citokinek biológiai aktivitásának meghatározása.

A felfedezés története és a citokinek kutatásának első lépései szorosan összefüggtek az immunkompetens sejtek és sejtvonalak tenyésztésével. Ezután számos oldható fehérje jellegű faktor szabályozó hatását (biológiai aktivitását) mutatták ki a limfociták proliferatív aktivitására, az immunglobulinok szintézisére, az immunválaszok kialakulására in vitro modellekben. A mediátorok biológiai aktivitásának meghatározásának egyik első módszere a humán limfociták migrációs tényezőjének és gátlási tényezőjének meghatározása. A citokinek biológiai hatásainak tanulmányozása során különféle módszerek születtek biológiai aktivitásuk értékelésére. Így az IL-1-et a rágcsáló timociták in vitro, az IL-2 - a limfoblasztok proliferatív aktivitását serkentő képessége, az IL-3 - a vérképző telepek in vitro növekedése, az IL-4 - a limfoblasztok proliferatív aktivitását serkentő képessége alapján határozták meg. a komitogén hatás az Ia-fehérjék expressziójának fokozásával, az IgG1 és IgE képződésének indukálásával stb. Ezeknek a módszereknek a listája folytatható, folyamatosan frissül, amint az oldható faktorok új biológiai aktivitásait fedezik fel. Legfőbb hátrányuk a nem szabványos módszerek, egységesítésük lehetetlensége. A citokinek biológiai aktivitásának meghatározására szolgáló módszerek továbbfejlesztése nagyszámú, egyik vagy másik citokinre érzékeny sejtvonal, vagy multi-érzékeny vonal létrehozásához vezetett. Ezen citokin-érzékeny sejtek többsége már megtalálható a kereskedelmi sejtvonal-listákon. Például az IL-1a és b tesztelésére a D10S sejtvonalat, az IL-2 és az IL-15 esetében a CTLL-2 sejtvonalat, az IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 esetében , IL-13, GM-CSF - TF-1 sejtvonal, IL-6 esetében - B9 sejtvonal, IL-7 esetében - 2E8 sejtvonal, TNFa és TNFb esetében - L929 sejtvonal, IFNg esetében - WiDr sejtvonal, IL-18 - KG-1 sejtvonal. Az immunaktív fehérjék tanulmányozásának ez a megközelítése azonban, valamint az olyan jól ismert előnyök, mint az érett és aktív fehérjék valós biológiai aktivitásának mérése, a szabványos körülmények közötti nagy reprodukálhatóság, megvannak a maga hátrányai. Ide tartozik mindenekelőtt a sejtvonalak érzékenysége nem egy citokinre, hanem több rokon citokinre, amelyek biológiai hatásai átfedik egymást. Ezenkívül nem zárható ki annak a lehetősége, hogy a célsejtek más citokinek termelését indukálják, ami torzíthatja a vizsgált paramétert (általában proliferáció, citotoxicitás, kemotaxis). Még nem ismerjük az összes citokint és nem minden hatását, ezért nem magát a citokint, hanem a teljes specifikus biológiai aktivitást értékeljük. Így a biológiai aktivitás értékelése a különböző mediátorok összesített aktivitásaként (specifitás hiánya) ennek a módszernek az egyik hátránya. Ezenkívül citokin-érzékeny vonalak használatával lehetetlen azonosítani az inaktivált molekulákat és a kapcsolódó fehérjéket. Ez azt jelenti, hogy az ilyen módszerek nem tükrözik számos citokin tényleges termelését. A sejtvonalak használatának másik fontos hátránya a sejttenyésztéshez szükséges laboratórium szükségessége. Ezen túlmenően a sejttenyésztésre, a vizsgált fehérjékkel és táptalajokkal való inkubálására szolgáló összes eljárás időigényes. Azt is meg kell jegyezni, hogy a sejtvonalak hosszú távú felhasználása megújítást vagy újratanúsítást igényel, mivel a tenyésztés eredményeként mutálódhatnak és módosulhatnak, ami a mediátorokkal szembeni érzékenységük megváltozásához és a sejtvonalak pontosságának csökkenéséhez vezethet. biológiai aktivitás meghatározása. Ez a módszer azonban ideális a rekombináns mediátorok specifikus biológiai aktivitásának tesztelésére.

A citokinek mennyiségi meghatározása antitestek segítségével.

Az immunkompetens és más típusú sejtek által termelt citokinek az extracelluláris térbe kerülnek a parakrin és autokrin jelátviteli kölcsönhatások megvalósítása érdekében. Ezeknek a fehérjéknek a vérszérumban vagy kondicionált környezetben való koncentrációjából meg lehet ítélni a kóros folyamat természetét és a betegben bizonyos sejtfunkciók túlzott vagy hiányát. A citokinek specifikus antitestek felhasználásával történő meghatározására szolgáló módszerek ma a legelterjedtebb rendszerek e fehérjék kimutatására. Ezek a módszerek egy sor módosításon mentek keresztül különböző jelölések (radioizotóp, fluoreszcens, elektrokemilumineszcens, enzim stb.) segítségével. Ha a radioaktív izotópos módszereknek számos hátránya van a radioaktív jelölés használatához és a jelzett reagensek felhasználásának korlátozott időbeli lehetőségéhez (felezési idő), akkor az enzimkapcsolt immunszorbens módszerek a legelterjedtebbek. Ezek egy enzimatikus reakció oldhatatlan termékeinek megjelenítésén alapulnak, amelyek ismert hullámhosszúságú fényt nyelnek el, az analit koncentrációjával egyenértékű mennyiségben. A mérendő anyagok megkötésére szilárd polimer bázisra felvitt antitesteket, vizualizáláshoz enzimekhez, általában alkalikus foszfatázhoz vagy torma-peroxidázhoz konjugált antitesteket használnak. A módszer előnyei nyilvánvalóak: nagy pontosságú meghatározás a reagensek és eljárások szabványos tárolási körülményei között, kvantitatív elemzés és reprodukálhatóság. A hátrányok közé tartozik a meghatározott koncentrációk korlátozott tartománya, aminek következtében minden egy bizonyos küszöbértéket meghaladó koncentrációt azzal egyenlőnek tekintünk. Meg kell jegyezni, hogy a módszer végrehajtásához szükséges idő a gyártó ajánlásaitól függően változik. Mindenesetre az inkubációhoz és a reagensmosáshoz szükséges több óráról beszélünk. Ezenkívül meghatározzák a citokinek látens és kötött formáit, amelyek koncentrációjukban jelentősen meghaladhatják a közvetítő biológiai aktivitásáért főként felelős szabad formákat. Ezért kívánatos ezt a módszert a mediátor biológiai aktivitásának értékelésére szolgáló módszerekkel együtt alkalmazni. Az immunoassay módszer másik, széles körben elterjedt változata az elektrokemilumineszcencia módszer (ECL) fehérjék meghatározására ruténiummal és biotinnal jelölt antitestekkel. Ennek a módszernek a következő előnyei vannak a radioizotópos és enzimes immunológiai vizsgálatokkal szemben: egyszerű kivitelezés, a módszer rövid végrehajtási ideje, mosási eljárások hiánya, kis mintatérfogat, a citokinek meghatározott koncentrációinak nagy tartománya a szérumban és kondicionált környezetben, nagy érzékenység a módszer és reprodukálhatósága. A vizsgált módszer tudományos kutatásban és klinikailag egyaránt alkalmazható. A következő módszert a citokinek biológiai tápközegben történő értékelésére az áramlási fluorimetriás technológián alapulóan fejlesztették ki. Lehetővé teszi akár több száz fehérje egyidejű kiértékelését egy mintában. Jelenleg kereskedelmi készleteket hoztak létre akár 17 citokin meghatározására. Ennek a módszernek az előnyei azonban meghatározzák a hátrányait is. Egyrészt ez a több fehérje meghatározásához szükséges optimális feltételek kiválasztásának fáradságossága, másrészt a citokinek termelése lépcsőzetesen történik, különböző időpontokban termelési csúcsokkal. Ezért a nagyszámú fehérje egyidejű meghatározása nem mindig informatív. Az immunoassay módszerek általános követelménye az ún. A "szendvics" egy ellenanyagpár gondos kiválasztása, amely lehetővé teszi az elemzett fehérje szabad vagy kötött formájának meghatározását, ami korlátokat szab ennek a módszernek, és amelyet mindig figyelembe kell venni a kapott adatok értelmezésekor. Ezek a módszerek meghatározzák a különböző sejtek teljes citokintermelését, ugyanakkor az immunkompetens sejtek antigén-specifikus citokintermeléséről csak hipotetikusan lehet megítélni. Jelenleg az ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) rendszert fejlesztették ki, amely nagyrészt kiküszöböli ezeket a hátrányokat. A módszer lehetővé teszi a citokinek termelésének szemikvantitatív értékelését az egyes sejtek szintjén. A módszer nagy felbontása lehetővé teszi az antigén-stimulált citokintermelés értékelését, ami nagyon fontos egy specifikus immunválasz értékeléséhez. A következő, tudományos célokra széles körben használt módszer a citokinek intracelluláris meghatározása áramlási citometriával. Előnyei nyilvánvalóak. Fenotípusosan jellemezhetjük a citokintermelő sejtek populációját és/vagy meghatározhatjuk az egyes sejtek által termelt citokinek spektrumát, e termelés relatív kvantitatív jellemzésének lehetőségével. Ugyanakkor a leírt módszer meglehetősen bonyolult és drága berendezéseket igényel. A következő, főként tudományos célokra használt módszersorozat a jelölt monoklonális antitesteket alkalmazó immunhisztokémiai módszerek. Az előnyök nyilvánvalóak - a citokintermelés meghatározása közvetlenül a szövetekben (in situ), ahol különféle immunológiai reakciók mennek végbe. A vizsgált módszerek azonban nagyon munkaigényesek, és nem adnak pontos mennyiségi adatokat.

Citokinek meghatározása enzim immunoassay segítségével.

A Vector-Best CJSC T.G. vezetésével. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavishnikov aktívan dolgozik a citokinek meghatározásán. A citokinek a polipeptid mediátorok egy csoportját alkotják, gyakran glikozilezettek, molekulatömegük 8-80 kDa között van. A citokinek részt vesznek a szervezet védekező reakcióinak és homeosztázisának kialakításában és szabályozásában. Részt vesznek a humorális és celluláris immunválasz minden láncszemében, beleértve az immunkompetens progenitor sejtek differenciálódását, az antigénprezentációt, a sejtaktivációt és -proliferációt, az adhéziós molekulák expresszióját és az akut fázisválaszt. Némelyikük számos biológiai hatást képes kifejteni különböző célsejteken. A citokinek sejtekre gyakorolt ​​hatását a következő módokon hajtják végre: autokrin - a citokint szintetizáló és szekretáló sejten; parakrin - a termelő sejt közelében található sejteken, például a gyulladás fókuszában vagy a limfoid szervben; endokrin távolról - bármely szerv és szövet sejtjére, miután a citokin belép a vérkeringésbe. A citokinek képződése és felszabadulása általában rövid életű és szigorúan szabályozott. A citokinek úgy hatnak a sejtre, hogy a citoplazma membrán specifikus receptoraihoz kötődnek, és ezáltal reakciók sorozatát idézik elő, amelyek számos általuk szabályozott gén aktivitásának indukciójához, fokozásához vagy elnyomásához vezetnek. A citokinekre a működés összetett hálózati jellege jellemző, amelyben az egyik termelése számos másik aktivitásának kialakulását vagy megnyilvánulását befolyásolja. A citokinek lokális mediátorok, ezért a megfelelő szervek biopsziás szöveti fehérjéinek kinyerése után érdemes megmérni azok szintjét a megfelelő szövetekben vagy természetes folyadékokban: vizeletben, könnyfolyadékban, ínyzsebfolyadékban, bronchoalveoláris mosásban, hüvelyváladékban, ejakulátumban. , lemosások az üregekből, a gerincvelőből vagy az ízületi folyadékokból stb. A szervezet immunrendszerének állapotáról további információkhoz juthatunk, ha megvizsgáljuk a vérsejtek citokintermelő képességét in vitro. A plazma citokinszintje az immunrendszer jelenlegi állapotát és a védekezési válaszok in vivo fejlődését tükrözi. A citokinek spontán termelődése perifériás vér mononukleáris sejtek tenyésztésével lehetővé teszi a megfelelő sejtek állapotának felmérését. A citokinek fokozott spontán termelése azt jelzi, hogy a sejteket az antigén már in vivo aktiválja. A citokinek indukált termelése lehetővé teszi a megfelelő sejtek antigénstimulációra való válaszadási képességének felmérését. Például a citokinek in vitro csökkent indukciója az immunhiányos állapot egyik jele lehet. Ezért mindkét lehetőség a citokinek szintjének vizsgálatára mind a keringő vérben, mind a sejtkultúrák általi előállítása során fontos az egész szervezet immunreaktivitásának jellemzői és az immunrendszer egyes láncszemeinek működése szempontjából. Egészen a közelmúltig Oroszországban néhány kutatócsoport foglalkozott a citokinek tanulmányozásával, mivel a biológiai kutatási módszerek nagyon időigényesek, és az importált immunkémiai készletek nagyon drágák. A rendelkezésre álló hazai enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálatok megjelenésével a gyakorló orvosok egyre nagyobb érdeklődést mutatnak a citokinprofil tanulmányozása iránt. Jelenleg a citokinek szintjének felmérésének diagnosztikus jelentősége éppen az a tény, hogy a citokinek koncentrációja emelkedik vagy csökken egy adott betegségben szenvedő betegben. Ezenkívül a betegség súlyosságának felmérése és a lefolyás előrejelzése érdekében tanácsos meghatározni mind az anti-, mind a pro-inflammatorikus citokinek koncentrációját a patológia kialakulásának dinamikájában. Például a citokinek tartalmát a perifériás vérben az exacerbáció időzítése határozza meg, tükrözi a kóros folyamat dinamikáját peptikus fekélybetegségben és a gyomor-bél traktus egyéb betegségeiben. Az exacerbáció legkorábbi szakaszában az interleukin-1béta (IL-1béta), az interleukin-8 (IL-8) tartalom növekedése, majd az interleukin-6 (IL-6), a gamma-interferon (gamma) koncentrációja érvényesül. -INF), a tumor nekrózis faktor növeli -alfa (alfa-TNF). Az interleukin-12 (IL-12), gamma-INF, alfa-TNF koncentrációja a betegség csúcspontjában érte el maximumát, míg az akut fázis markereinek tartalma ebben az időszakban megközelítette a normál értéket. Az exacerbáció csúcsán az alfa-TNF szintje jelentősen meghaladta az interleukin-4 (IL-4) tartalmát mind a vérszérumban, mind közvetlenül a fekélykörüli zóna érintett szövetében, majd fokozatosan emelkedni kezdett. csökken. Az akut fázis jelenségeinek lecsengésével és a javítási folyamatok felerősödésével az IL-4 koncentrációja nőtt. A citokinprofil változásai felhasználhatók a kemoterápia hatékonyságának és megvalósíthatóságának megítélésére. Citokinterápia során, például alfa-interferon (alfa-IFN) terápia során, ellenőrizni kell mind a keringő vérben lévő mennyiségét, mind az alfa-IFN elleni antitestek termelését. Ismeretes, hogy ha ezekből az antitestekből nagyszámú termelődik, az interferonterápia nemcsak hatástalanná válik, hanem autoimmun betegségekhez is vezethet. A közelmúltban új gyógyszereket fejlesztettek ki és vezettek be a gyakorlatba, amelyek így vagy úgy megváltoztatják a szervezet citokin állapotát. Például a rheumatoid arthritis kezelésére olyan alfa-TNF elleni antitesteken alapuló gyógyszert javasolnak, amely a kötőszövetek elpusztításában szerepet játszó alfa-TNF eltávolítására szolgál. Azonban mind adataink, mind szakirodalmi adatok szerint nem minden krónikus rheumatoid arthritisben szenvedő betegnél emelkedett a TNF-alfa szintje, ezért ennél a betegcsoportnál a TNF-alfa szintjének csökkenése tovább súlyosbíthatja a TNF-alfa szintjét. az immunrendszert. Így a helyes citokinterápia feltételezi a szervezet citokinállapotának ellenőrzését a kezelés során. A proinflammatorikus citokinek védő szerepe lokálisan, a gyulladás fókuszában nyilvánul meg, de szisztémás termelésük nem vezet fertőzésellenes immunitás kialakulásához és nem akadályozza meg a bakteriális-toxikus sokk kialakulását, ami a korai halálozás oka. gennyes-szeptikus szövődményekkel küzdő sebészeti betegeknél. A sebészeti fertőzések patogenezisének alapja a citokin kaszkád beindulása, amely egyrészt pro-inflammatorikus, másrészt gyulladásgátló citokineket tartalmaz. A két ellentétes csoport közötti egyensúly nagymértékben meghatározza a gennyes-szeptikus betegségek lefolyásának jellegét és kimenetelét. Az ezekből a csoportokból származó egy citokin (például alfa-TNF vagy IL-4) vérbeli koncentrációjának meghatározása azonban nem tükrözi megfelelően a teljes citokin egyensúly állapotát. Ezért több mediátor (legalább 2-3 ellentétes alcsoport) szintjének egylépcsős felmérése szükséges. Jelenleg a CJSC "Vector-Best" kifejlesztett és sorozatban gyártott reagenskészleteket a következők mennyiségi meghatározására: tumor nekrózis faktor-alfa (érzékenység - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); gamma-interferon (érzékenység - 5 pg / ml, 0-2000 pg / ml); interleukin-4 (érzékenység - 2 pg / ml, 0-400 pg / ml); interleukin-8 (érzékenység - 2 pg / ml, 0-250 pg / ml); interleukin-1 receptor antagonista (IL-1RA) (érzékenység - 20 pg / ml, 0-2500 pg / ml); alfa-interferon (érzékenység - 10 pg / ml, 0-1000 pg / ml); az alfa-interferon elleni autoimmun antitestek (érzékenység - 2 ng / ml, 0-500 ng / ml). Minden készletet úgy terveztek, hogy meghatározza e citokinek koncentrációját az emberi biológiai folyadékokban, a tenyészet felülúszójában, amikor az emberi sejttenyészetek citokintermelő képességét vizsgálják in vitro. Az analízis alapelve egy szilárd fázisú háromfázisú (inkubációs idő - 4 óra) vagy kétlépcsős (inkubációs idő - 3,5 óra) enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati lemezeken végzett "szendvics" változata. A vizsgálathoz lyukanként 100 µl biológiai folyadékra vagy tenyészet felülúszóra van szüksége. Eredmények elszámolása - spektrofotometriásan 450 nm hullámhosszon. Minden készletben a kromogén tetrametil-benzidin. Készleteink eltarthatóságát a kiadástól számított 18 hónapra, a használat megkezdését követő 1 hónapra meghosszabbítottuk. A szakirodalmi adatok elemzése kimutatta, hogy az egészséges emberek vérplazmájának citokinek tartalma mind a meghatározásukhoz használt készletektől, mind attól a régiótól függ, ahol ezek az emberek élnek. Ezért, hogy megtudjuk régiónk lakosaiban a citokinek normál koncentrációjának értékét, véletlenszerű plazmamintákat (80-400 mintát) elemeztünk gyakorlatilag egészséges véradóktól, különböző társadalmi csoportok képviselőitől, 18 és 60 év közötti életkortól. a súlyos szomatikus patológia klinikai megnyilvánulásai és a HIV, hepatitis B és C vírusok elleni HBsAg antitestek hiánya.

Tumor nekrózis faktor-alfa.

A TNF-alfa egy pleiotróp proinflammatorikus citokin, amely két megnyúlt, 17 kDa molekulatömegű b-láncból áll, és szabályozó és effektor funkciókat lát el az immunválaszban és a gyulladásban. Az alfa-TNF fő termelői a monociták és a makrofágok. Ezt a citokint a vér limfociták és granulociták, természetes gyilkos sejtek és T-limfocita sejtvonalak is kiválasztják. Az alfa-TNF fő induktorai a vírusok, mikroorganizmusok és metabolizmusuk termékei, beleértve a bakteriális lipopoliszacharidot is. Emellett egyes citokinek, mint például az IL-1, IL-2, a granulocita-makrofág telep-stimuláló faktor, az alfa és a béta-INF szintén induktor szerepet játszhatnak. Az alfa-TNF biológiai aktivitásának fő irányai: szelektív citotoxicitást mutat egyes tumorsejtekkel szemben; aktiválja a granulocitákat, makrofágokat, endothel sejteket, hepatocitákat (akut fázisú fehérjék termelése), oszteoklasztokat és kondrocitákat (csont- és porcszövet reszorpciója), egyéb gyulladáskeltő citokinek szintézisét; serkenti a proliferációt és a differenciálódást: neutrofilek, fibroblasztok, endoteliális sejtek (angiogenezis), hematopoietikus sejtek, T- és B-limfociták; fokozza a neutrofilek áramlását a csontvelőből a vérbe; tumor- és vírusellenes aktivitással rendelkezik in vivo és in vitro; nemcsak a védekezési reakciókban vesz részt, hanem a gyulladást kísérő pusztítási és helyreállítási folyamatokban is; a szövetpusztulás egyik közvetítőjeként szolgál, ami gyakori az elhúzódó, krónikus gyulladásokban.

Rizs. 1. Az alfa-TNF szintjének megoszlása

egészséges donorok plazmájában.

Az alfa-TNF megnövekedett szintjét figyelik meg a vérszérumban a poszttraumás állapotban, tüdőműködési zavarokkal, a terhesség normális lefolyásának megsértésével, onkológiai megbetegedésekkel, bronchiális asztmával. A vírusos hepatitis C krónikus formájának súlyosbodása során az alfa-TNF szintje 5-10-szer magasabb a normánál. A gyomor-bélrendszeri betegségek súlyosbodásának időszakában az alfa-TNF koncentrációja a szérumban meghaladja a normát. átlagosan 10-szer, egyes betegeknél pedig 75-80-szor. Az alfa-TNF magas koncentrációja a sclerosis multiplexben és a cerebrospinális agyhártyagyulladásban szenvedő betegek agy-gerincvelői folyadékában, a rheumatoid arthritisben szenvedő betegeknél pedig az ízületi folyadékban található. Ez arra utal, hogy a TNF-alfa részt vesz számos autoimmun betegség patogenezisében. Az alfa-TNF kimutatásának gyakorisága a vérszérumban, még súlyos gyulladás esetén sem haladja meg az 50% -ot, indukált és spontán termelés esetén - akár 100%. Az alfa-TNF koncentrációtartománya 0-6 pg/ml volt, az átlagos - 1,5 pg/ml (1. ábra).

Gamma interferon.

Rizs. 2. Az IFN-gamma szintek megoszlása

egészséges donorok plazmájában.

Interleukin-4

Az IL-4 egy 18-20 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely természetes gyulladásgátló. Az IFN-gamma mellett az IL-4 a T-sejtek (főleg a TH-2 limfociták) által termelt kulcsfontosságú citokin. Támogatja a TH-1 / TH-2 egyensúlyt. Az IL-4 biológiai aktivitásának fő irányai: fokozza az eozinofiliát, a hízósejtek felhalmozódását, az IgG4 szekréciót, a TH-2 közvetítette humorális immunválaszt; helyi daganatellenes aktivitással rendelkezik, serkenti a citotoxikus T-limfociták populációját és a tumor eozinofilekkel való beszűrődését; gátolja a gyulladásos citokinek (alfa-TNF, IL-1, IL-8) és prosztaglandinok felszabadulását az aktivált monocitákból, a TH-1-limfociták citokinek termelését (IL-2, gamma-INF stb.).

Rizs. 3. Az IL-4 szintjének megoszlása ​​a plazmában

egészséges donorok.

Mind a szérumban, mind a stimulált limfocitákban megnövekedett IL-4 szint figyelhető meg allergiás betegségekben (különösen az exacerbáció idején), mint például bronchiális asztma, allergiás nátha, szénanátha, atópiás dermatitis, gyomor-bélrendszeri betegségekben. Az IL-4 szintje szintén jelentősen megemelkedett krónikus hepatitis C-ben (CHC) szenvedő betegeknél. A CHC exacerbációjának időszakában mennyisége a normához képest csaknem háromszorosára nő, és a CHC remissziója során az IL-4 szintje csökken, különösen a rekombináns IL-2 kezelés hátterében. Az IL-4 koncentráció tartománya 0-162 pg/ml, az átlag 6,9 pg/ml, a normál tartomány 0-20 pg/ml volt (3. ábra).

Interleukin-8

Az IL-8 a kemokinek közé tartozik, 8 kDa molekulatömegű fehérje. Az IL-8-at mononukleáris fagociták, polimorfonukleáris leukociták, endoteliális sejtek és más típusú sejtek termelik különféle ingerekre válaszul, beleértve a baktériumokat és vírusokat, valamint metabolikus termékeiket, beleértve a gyulladást elősegítő citokineket (például IL-1, TNF alfa). ). Az interleukin-8 fő szerepe a leukociták kemotaxisának fokozása. Akut és krónikus gyulladás esetén egyaránt fontos szerepet játszik. Az IL-8 megnövekedett szintjét bakteriális fertőzésekben, krónikus tüdőbetegségekben és gyomor-bélrendszeri betegségekben szenvedő betegeknél figyelték meg. Az IL-8 plazmaszintje megnő a szepszisben szenvedő betegeknél, és a magas koncentrációk fokozott mortalitást okoznak. Az IL-8 tartalom mérésének eredményei felhasználhatók a kezelés lefolyásának nyomon követésére és a betegség kimenetelének előrejelzésére. Így megnövekedett IL-8 tartalmat találtak a könnyfolyadékban minden olyan betegnél, akiknél a szaruhártyafekélyek kedvező lefolyása volt. A szaruhártyafekély bonyolult lefolyású betegeinél az IL-8 koncentrációja 8-szor magasabb volt, mint azoknál a betegeknél, akiknél a betegség lefolyása kedvező volt. Így a szaruhártyafekélyek könnyfolyadékában a proinflammatorikus citokinek (különösen az IL-8) tartalma prognosztikai kritériumként használható a betegség lefolyására.

Rizs. 4. Az IL-8 szint megoszlása

egészséges donorok plazmája (Novoszibirszk).

Saját és publikált adataink szerint egészséges emberekben az IL-8 rendkívül ritkán mutatható ki a vérszérumban; a vér mononukleáris sejtek spontán IL-8 termelése az egészséges donorok 62%-ánál, indukált termelés pedig 100%-ánál figyelhető meg. Az IL-8 koncentráció tartománya 0-34 pg/ml, az átlag 2 pg/ml, a normál tartomány 0-10 pg/ml volt (4. ábra).

Rizs. 5. Az IL-8 szintjének megoszlása ​​a plazmában

egészséges donorok (Rubtsovsk).

Interleukin-1 receptor antagonista.

Az IL-1RA a citokinek közé tartozik, egy 18-22 kDa molekulatömegű oligopeptid. Az IL-1RA az IL-1 endogén inhibitora, amelyet makrofágok, monociták, neutrofilek, fibroblasztok és epiteliális sejtek termelnek. Az IL-1RA gátolja az IL-1alfa és IL-1béta interleukinok biológiai aktivitását, versenyezve velük a sejtreceptorhoz való kötődésért.

Rizs. 6. Az IL-1RA szint megoszlása

egészséges donorok plazmájában

Az IL-1RA termelését számos citokin, vírustermék és akut fázisú fehérje stimulálja. Az IL-1RA aktívan expresszálható gyulladásos gócokban számos krónikus betegségben: rheumatoid és juvenilis krónikus ízületi gyulladás, szisztémás lupus erythematosus, ischaemiás agyi elváltozások, gyulladásos bélbetegségek, bronchiális asztma, pyelonephritis, pikkelysömör és mások. Szepszisben az IL-1RA legmagasabb növekedése figyelhető meg - egyes esetekben akár 55 ng / ml-ig, és azt találták, hogy az IL-1RA megnövekedett koncentrációja kedvező prognózissal korrelál. Az IL-1RA magas szintjét figyelték meg erősen elhízott nőknél, és ez a szint jelentősen csökken a zsírleszívás utáni 6 hónapon belül. Az IL-1RA koncentráció tartománya 0-3070 pg/ml, az átlag 316 pg/ml volt. A normál tartomány 50-1000 pg/ml (6. ábra).

Alfa interferon.

Az alfa-IFN egy 18 kDa molekulatömegű monomer, nem glikozilált fehérje, amelyet főként leukociták (B-limfociták, monociták) szintetizálnak. Ezt a citokint gyakorlatilag bármilyen sejttípus termelheti megfelelő gerjesztésre válaszul, és az intracelluláris vírusfertőzések az IFN-alfa szintézisének erős stimulátorai lehetnek. Az alfa-INF indukálói a következők: vírusok és termékeik, amelyek között a vezető helyet a vírusreplikáció során keletkező kettős szálú RNS-ek, valamint baktériumok, mikoplazmák és protozoák, citokinek és növekedési faktorok (például IL-1, IL) foglalják el. -2, alfa -FNO, telepstimuláló faktorok stb.). A szervezet nem specifikus antibakteriális immunválaszának kezdeti védekező reakciója magában foglalja az alfa- és béta-IFN indukcióját. Ebben az esetben antigénprezentáló sejtek (makrofágok) termelik, amelyek megszállták a baktériumokat. Az interferonok (beleértve az alfa-IFN-t is) fontos szerepet játszanak az antivirális immunválasz nem specifikus kapcsolatában. Növelik a vírusellenes rezisztenciát azáltal, hogy a sejtekben olyan enzimek szintézisét indukálják, amelyek elnyomják a vírusok nukleinsavainak és fehérjéinek képződését. Ezenkívül immunmoduláló hatásuk van, fokozzák a fő hisztokompatibilitási komplex antigénjeinek expresszióját a sejtekben. Az alfa-IFN-tartalom változását vírusos etiológiájú hepatitisben és májcirrhosisban észlelték. A vírusfertőzések súlyosbodása idején ennek a citokinnek a koncentrációja a legtöbb betegben jelentősen megemelkedik, a lábadozás időszakában pedig a normál szintre csökken. Összefüggést mutattak ki az alfa-INF szérumszintje és az influenzafertőzés súlyossága és időtartama között.

Rizs. 7. Az alfa-IFN szintjének megoszlása

egészséges donorok plazmájában.

Az alfa-IFN koncentrációjának növekedését figyelték meg a legtöbb olyan autoimmun betegségben, mint például polyarthritisben, rheumatoid arthritisben, spondylosisban, arthritis psoriaticában, polymyalgia rheumaticában és sclerodermában, szisztémás lupus erythematosusban és szisztémás vasculitisben szenvedő betegek szérumában. Ennek az interferonnak a magas szintjét egyes betegeknél a peptikus fekély és az epehólyag súlyosbodása során is megfigyelték. Az alfa-INF koncentrációtartománya 0-93 pg/ml, az átlag 20 pg/ml volt. A normál tartomány legfeljebb 45 pg/ml (7. ábra).

Alfa-IFN elleni antitestek.

A szomatikus erythemás lupusban szenvedő betegek szérumában alfa-IFN elleni antitestek mutathatók ki. Az alfa-IFN elleni antitestek spontán indukciója a rák különböző formáiban szenvedő betegek szérumában is megfigyelhető. Egyes esetekben alfa-IFN-ellenes antitesteket találtak HIV-fertőzött betegek szérumában, valamint az akut fázisban agyhártyagyulladásban szenvedő betegek liquorjában és szérumában, a krónikus polyarthritisben szenvedő betegek szérumában.

Rizs. 8. Az alfa-IFN elleni antitestek szintjének megoszlása

egészséges donorok plazmájában.

Az alfa-IFN az egyik hatékony vírus- és daganatellenes terápiás gyógyszer, de hosszú távú alkalmazása az alfa-IFN-ellenes specifikus antitestek termelődéséhez vezethet. Ez csökkenti a kezelés hatékonyságát, esetenként különféle mellékhatásokat okoz: az influenzaszerűtől az autoimmun betegségek kialakulásáig. Erre tekintettel az INF-terápia során fontos az alfa-INF elleni antitestek szintjének szabályozása a páciens szervezetében. Kialakulásuk a terápiában használt gyógyszer típusától, a kezelés időtartamától és a betegség típusától függ. Az alfa-IFN elleni antitestek koncentrációtartománya 0-126 ng/ml, az átlag 6,2 ng/ml volt. A normál tartomány legfeljebb 15 ng / ml (8. ábra). A citokinek szintjének értékelése a CJSC "Vector-Best"-nél kereskedelemben kapható reagenskészletekkel új megközelítést tesz lehetővé a szervezet immunrendszerének állapotának vizsgálatában a klinikai gyakorlatban.

Citokineken alapuló immunotróp gyógyszerek.

Érdekes munka S. Simbirtseva, Nagy tisztaságú Biológiai Termékek Állami Kutatóintézete, Oroszország Egészségügyi Minisztériuma, Szentpétervár). A citokinek a szervezet fő funkcióit szabályozó új független rendszerré izolálhatók, amely az idegrendszerrel és az endokrin rendszerrel együtt létezik. szabályozása, és elsősorban a homeosztázis fenntartásához kapcsolódik a kórokozók bejutása és a szövetek integritásának megsértése során. A szabályozó molekulák ezen új osztályát a természet hozta létre több millió éves evolúció során, és korlátlan számú gyógyszerként használható fel. Az immunrendszeren belül a citokinek közvetítik a kapcsolatot a nem specifikus védekezési válaszok és a specifikus immunitás között, mindkét irányba hatnak. A szervezet szintjén a citokinek az immun-, ideg-, endokrin-, hematopoietikus és egyéb rendszerek között kommunikálnak, és arra szolgálnak, hogy bevonják őket a védekezési reakciók megszervezésébe és szabályozásába. A citokinek intenzív tanulmányozásának mozgatórugója mindig is a klinikai alkalmazásuk ígéretes lehetősége volt széles körben elterjedt betegségek, köztük rák, fertőző és immunhiányos betegségek kezelésére. Oroszországban számos citokin készítményt tartanak nyilván, köztük interferonokat, telepstimuláló faktorokat, interleukineket és antagonistáikat, valamint tumornekrózis faktort. Minden citokin készítmény felosztható természetes és rekombinánsra. A természetes készítmények különböző tisztítási fokozatú készítmények, amelyeket stimulált eukarióta sejtek, főleg emberi sejtek tápközegéből nyernek. A fő hátrányok az alacsony tisztítási fok, a szabványosítás lehetetlensége a nagy komponensszám miatt, valamint a vérkomponensek felhasználása a gyártás során. Úgy tűnik, a citokinterápia jövője a biotechnológia legújabb vívmányainak felhasználásával előállított, genetikailag módosított gyógyszerekhez kapcsolódik. Az elmúlt két évtizedben a legtöbb citokin génjét klónozták, és olyan rekombináns analógokat kaptak, amelyek teljesen megismétlik a természetes molekulák biológiai tulajdonságait. A klinikai gyakorlatban a citokinhasználatnak három fő területe van:

1) citokinterápia a szervezet védekező reakcióinak aktiválására, immunmodulációra vagy az endogén citokinek hiányának pótlására,

2) anti-citokin immunszuppresszív terápia, amelynek célja a citokinek és receptoraik biológiai hatásának gátlása,

3) citokin génterápia a daganatellenes immunitás fokozása vagy a citokinrendszer genetikai hibáinak korrigálása céljából.

Számos citokin alkalmazható klinikailag szisztémás és helyi alkalmazásra. A szisztémás alkalmazás olyan esetekben indokolt, amikor az immunitás hatékonyabb aktiválása érdekében több szervben is biztosítani kell a citokinek hatását, vagy a test különböző részein elhelyezkedő célsejtek aktiválása szükséges. Más esetekben a helyi alkalmazásnak számos előnye van, mivel lehetővé teszi a hatóanyag magas helyi koncentrációjának elérését, a célszerv célzott befolyásolását és a nem kívánt szisztémás megnyilvánulások elkerülését. Jelenleg a citokinek az egyik legígéretesebb gyógyszer a klinikai gyakorlatban való felhasználásra.

Következtetés.

Így jelenleg nem kétséges, hogy a citokinek az immunpatogenezis legfontosabb tényezői. A citokinek szintjének tanulmányozása lehetővé teszi, hogy információkat szerezzenek a különböző típusú immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásáról, az I. és II. típusú T-helperek aktiválási folyamatainak arányáról, ami nagyon fontos számos sejt differenciáldiagnózisában. fertőző és immunpatológiai folyamatok. A citokinek olyan specifikus fehérjék, amelyeken keresztül az immunrendszer sejtjei információt cserélhetnek és kölcsönhatásba léphetnek egymással. Napjainkra több mint száz különféle citokint fedeztek fel, amelyeket hagyományosan gyulladást előidéző ​​(gyulladást kiváltó) és gyulladáscsökkentő (gyulladást kiváltó) sejtekre osztanak fel. Tehát a citokinek különféle biológiai funkcióit három csoportra osztják: szabályozzák az immunrendszer fejlődését és homeosztázisát, szabályozzák a vérsejtek növekedését és differenciálódását (hematopoietikus rendszer), valamint részt vesznek a szervezet nem specifikus védőreakcióiban, befolyásolva a gyulladásos folyamatokat. folyamatok, véralvadás, vérnyomás.

Felhasznált irodalom jegyzéke.

S.V. Belmer, A.S. Szimbircev, O. V. Golovenko, L.V. Bubnova, L.M. Karpina, N.E. Shchigoleva, T.L. Mihajlov. / Orosz Állami Orvostudományi Egyetem, Állami Koloproktológiai Tudományos Központ, Moszkva és Állami Tiszta Biopreparátumok Kutatóintézete, Szentpétervár.

S.V. Szennyikov, A.N. Silkov // Folyóirat "Citokinek és gyulladás", 2005, No. 1 T. 4, No. 1. P.22-27.

T.G. Ryabicheva, N.A. Varaksin, N.V. Timofejeva, M. Yu. Rukavishnikov, a "Vector-Best" JSC munkájának anyagai.

A.S.Simbirtsev, Nagy tisztaságú Biológiai Kutatóintézet, Oroszország Egészségügyi Minisztériuma, Szentpétervár.

Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.. Állami Kutatóintézet a Magas tisztaságú Biopreparátumokért, Szentpétervár.

T. A. Shumatova, V. B. Shumatov, E. V. Markelova, L. G. Száraz meleg. Vlagyivosztoki Állami Orvostudományi Egyetem Aneszteziológiai és Reanimatológiai Osztálya.

A munkában a http://humbio.ru/humbio/spid/000402c2.htm webhelyről származó anyagokat használtak fel

fertőző betegségek bizonyos kórokozói. Szóval a norszulfazol...

1. Vírusellenes immunitás molekuláris és sejtes mechanizmusai, fejlődési minták és immunopatho

   Absztrakt >> Orvostudomány, egészségügy

   ... "webhely" egy adott webhelyre utal bizonyos polipeptid (antigén), amellyel ... annak korai szakaszában. Citokinekés kemokinek. Egyéb citokinek, az interferonok mellett ... általuk időegység alatt termelt citokinek meghatározza a burjánzás intenzitását és ...

2. A csontvelő fibrózis kialakulásának okainak vizsgálata mieloproliferatív betegségekben a vérlemezke faktorok mezenchimális őssejtekre gyakorolt ​​hatásának elemzésével

   Házi feladat >> Orvostudomány, egészségügy

   Különféle koncentrációk; - mennyiségi meghatározás fehérje kísérleti rendszerekben ... elhúzódó hatáshoz vezet citokin, amely fokozza a fibrózis folyamatát ... vérlemezkék. Megnövelt tartalom is citokin vizeletben találtak...

3. A tuberkulózis patogenezise emberekben

   Absztrakt >> Orvostudomány, egészségügy

   De az étkezés is lehetséges. Egy bizonyos szerepet játszik az aerogén fertőzésben ... játszik, makrofágok és monociták választják ki citokin- tumor nekrózis faktor (TNF). ... ionok, minden sejt rendelkezik bizonyos olyan rendszer, amely biztosítja az anyagok szállítását ...

). Tekintettel arra, hogy aktiválták vagy modulálták az ebbe az osztályba tartozó sejtek proliferációs tulajdonságait, immuncitokineknek nevezték el őket. Miután ismertté vált, hogy ezek a vegyületek nem csak az immunrendszer sejtjeivel lépnek kölcsönhatásba, nevüket citokinekre rövidítették, amelyek magukban foglalják a kolóniastimuláló faktort (CSF) és sok mást is (lásd Vasoactive Agents and Inflammation).

Citokinek [gör. kytos- egy edény, itt van egy cella és kineo- mozgató, biztató] - kisméretű (8-80 kDa molekulatömegű) fehérje mediátorok - mediátor molekulák ("kommunikációs fehérjék") nagy és változatos csoportja, amelyek elsősorban az immunrendszerben vesznek részt az intercelluláris jelátvitelben. A citokinek közé tartoznak a tumornekrózis faktor, interferonok, számos interleukin stb. A limfociták által szintetizált citokineket, amelyek a proliferáció és a differenciálódás szabályozói, különösen a hematopoietikus sejtek és az immunrendszer sejtjei, limfokineknek nevezzük. A „citokinek” kifejezést S. Coen és munkatársai javasolták. 1974-ben

Az immunrendszer minden sejtje bizonyos funkciókat lát el, és egyértelműen összehangolt kölcsönhatásban működik, amelyet speciális biológiailag aktív anyagok - citokinek - az immunreakciók szabályozói biztosítanak. A citokinek olyan specifikus fehérjék, amelyek segítségével az immunrendszer különböző sejtjei információt cserélhetnek egymással és összehangolhatják tevékenységeiket. A sejtfelszíni receptorokra ható citokinek halmaza és mennyisége – a „citokin környezet” – kölcsönható és gyakran változó jelek mátrixát jelenti. Ezek a jelek összetettek a citokinreceptorok sokfélesége miatt, valamint abból a tényből adódóan, hogy mindegyik citokin több folyamatot képes aktiválni vagy elnyomni, beleértve a saját szintézisét és más citokinek szintézisét, valamint a citokin receptorok kialakulását és megjelenését. a sejt felszínén. A különböző szöveteknek megvan a maguk egészséges "citokin környezete". Több mint száz különböző citokint fedeztek fel.

A citokinek fontos elemei a különböző limfociták egymással és fagocitákkal való kölcsönhatásában (4. ábra). A citokinek révén a T-helperek segítik az immunválaszban részt vevő különféle sejtek munkájának koordinálását.

Az interleukinek 1970-es évekbeli felfedezése óta eddig több mint száz biológiailag aktív anyagot fedeztek fel. Különféle citokinek szabályozzák az immunkompetens sejtek proliferációját és differenciálódását. És ha a citokinek hatását ezekre a folyamatokra elég jól tanulmányozták, akkor a citokinek apoptózisra gyakorolt ​​​​hatására vonatkozó adatok viszonylag nemrég jelentek meg. Ezeket a citokinek klinikai alkalmazása során is figyelembe kell venni.

Az intercelluláris jelátvitel az immunrendszerben a sejtek közvetlen kontaktus interakciójával vagy az intercelluláris kölcsönhatások közvetítőinek segítségével történik. Az immunkompetens és hematopoietikus sejtek differenciálódásának, valamint az immunválaszt alkotó intercelluláris kölcsönhatás mechanizmusainak tanulmányozása, a fehérje jellegű oldható mediátorok nagy és változatos csoportja - az intercelluláris jelátvitelben részt vevő mediátor molekulák ("kötőfehérjék") - citokinek felfedezett. A hormonokat rendszerint endokrin (nem pedig parakrin vagy autokrin) hatásuk alapján zárják ki ebből a kategóriából. (lásd Citokinek: a hormonális jelátvitel mechanizmusai). A hormonokkal és a neurotranszmitterekkel együtt ezek képezik a kémiai jelátvitel nyelvének alapját, amellyel a morfogenezist és a szövetregenerációt szabályozzák egy többsejtű szervezetben. Központi szerepet játszanak az immunválasz pozitív és negatív szabályozásában. A mai napig több mint száz citokint fedeztek fel és tanulmányoztak emberben ilyen vagy olyan mértékben, ahogy fentebb említettük, és folyamatosan érkeznek hírek újak felfedezéséről. Egyesek számára génmanipulált analógokat kaptak. A citokinek a citokin receptorok aktiválásán keresztül hatnak.

Gyakran előfordul, hogy a citokinek több családra való felosztását nem funkcióik, hanem a háromdimenziós szerkezet természete végzi, ami tükrözi a specifikus sejtes citokinreceptorok konformációjában és aminosavszekvenciájában a csoporton belüli hasonlóságot (lásd " Citokinek receptorai"). Némelyiküket T-sejtek termelik (lásd "T-sejtek által termelt citokinek"). A citokinek fő biológiai aktivitása az immunválasz szabályozása fejlődésének minden szakaszában, amelyben központi szerepet játszanak. Általánosságban elmondható, hogy az endogén szabályozók egész nagy csoportja a folyamatok széles skáláját biztosítja, mint például:

Citotoxicitás kiváltása makrofágokban,

Számos súlyos betegség az IL-1 és a TNF-alfa szintjének jelentős emelkedését eredményezi. Ezek a citokinek elősegítik a fagociták aktivációját, a gyulladás helyére való migrációját, valamint a gyulladásos mediátorok - lipidszármazékok, azaz a prosztaglandin E2, a tromboxánok és a vérlemezke-aktiváló faktor felszabadulását. Ezen kívül közvetve vagy közvetlenül az arteriolák tágulását, adhezív glikoproteinek szintézisét idézik elő, valamint aktiválják a T- és B-limfocitákat. Az IL-1 beindítja az IL-8 szintézisét, amely elősegíti a monociták és neutrofilek kemotaxisát, valamint az enzimek felszabadulását a neutrofilekből. A májban az albuminszintézis csökken, és a gyulladás akut fázisában lévő fehérjék szintézise fokozódik, ideértve a proteázgátlókat, a komplement komponenseket, a fibrinogént, a ceruloplazmint, a ferritint és a haptoglobint. A sérült és elhalt sejtekhez, valamint egyes mikroorganizmusokhoz kötődő C-reaktív fehérje szintje akár 1000-szeresére is emelkedhet. Szintén lehetséges a szérum amiloid A-koncentráció jelentős növekedése és lerakódása a különböző szervekben, ami másodlagos amiloidózishoz vezet. A gyulladás akut fázisának legfontosabb mediátora az IL-6, bár az IL-1 és a TNF-alfa is okozhatja a leírt májfunkciós változásokat. Az IL-1 és a TNF-alfa fokozza egymás hatását a gyulladás lokális és általános megnyilvánulásaira, ezért e két citokin kombinációja már kis dózisban is többszörös szervi elégtelenséget és tartós artériás hipotenziót okozhat. Bármelyikük aktivitásának elnyomása megszünteti ezt a kölcsönhatást, és jelentősen javítja a beteg állapotát. Az IL-1 39 °C-on erősebben aktiválja a T- és B-limfocitákat, mint 37 °C-on. Az IL-1 és a TNF-alfa csökkenti a sovány testtömeget és étvágytalanságot, ami elhúzódó lázzal járó cachexiához vezet. Ezek a citokinek csak rövid ideig jutnak be a véráramba, de elegendőek az IL-6 termelődésének beindításához. Az IL-6 folyamatosan jelen van a vérben, így koncentrációja jobban megfelel a láz súlyosságának és a fertőzés egyéb megnyilvánulásainak. Az IL-6 azonban, ellentétben az IL-1-gyel és a TNF-alfával, nem tekinthető halálos citokinnek.

Összegzés. A citokinek olyan kis fehérjék, amelyek autokrin (azaz az őket termelő sejtre) vagy parakrin (a közeli sejtekre) hatnak. Ezeknek a rendkívül aktív molekuláknak a kialakulása és felszabadulása rövid életű és szigorúan szabályozott. A limfociták által szintetizált citokineket, amelyek a proliferáció és differenciálódás szabályozói, különösen a vérképző sejtek és az immunrendszer sejtjei, limfokineknek és

Ez a fejezet a citokinrendszer értékelésének integrált megközelítését tárgyalja a korábban leírt modern kutatási módszerek alkalmazásával.

Először felvázoljuk a citokinrendszer alapfogalmait.

A citokineket jelenleg a test különböző sejtjei által termelt fehérje-peptid molekuláknak tekintik, amelyek intercelluláris és rendszerközi kölcsönhatásokat folytatnak. A citokinek a sejtek életciklusának univerzális szabályozói, szabályozzák az utóbbiak differenciálódási, proliferációs, funkcionális aktivációját és apoptózisát.

Az immunrendszer sejtjei által termelt citokineket immuncitokineknek nevezik; ezek az immunrendszer oldható peptid közvetítőinek egy osztályát képezik, amelyek szükségesek annak fejlődéséhez, működéséhez és a test más rendszereivel való kölcsönhatáshoz (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Szabályozó molekulaként a citokinek fontos szerepet játszanak a veleszületett és adaptív immunitás reakcióiban, biztosítják azok összekapcsolódását, szabályozzák a vérképzést, a gyulladásokat, a sebgyógyulást, az új erek képződését (angiogenezis) és sok más létfontosságú folyamatot.

Jelenleg a citokineknek többféle osztályozása létezik, figyelembe véve szerkezetüket, funkcionális aktivitásukat, eredetüket, citokin receptorok típusát. Hagyományosan a biológiai hatásoknak megfelelően a citokinek alábbi csoportjait szokás megkülönböztetni.

1. Interleukinok(IL-1-IL-33) az immunrendszer szekréciót szabályozó fehérjéi, amelyek mediátor kölcsönhatásokat biztosítanak az immunrendszerben és a szervezet más rendszereivel való kapcsolatát. Az interleukineket funkcionális aktivitásuk szerint pro- és gyulladásgátló citokinek, limfocita növekedési faktorok, szabályozó citokinek stb.

3. Tumor nekrózis faktorok (TNF)- citotoxikus és szabályozó hatású citokinek: TNFa és limfotoxinok (LT).

4. Hematopoietikus sejtnövekedési faktorok- őssejt növekedési faktor (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetin, trobopoietin, granulocita-makrofág telep-stimuláló faktor - GM-CSF, granulocita CSF - G-CSF, makrofág -

ny KSF - M-KSF).

5. Kemokinek- С, CC, СХС (IL-8), СХ3С - különféle típusú sejtek kemotaxisának szabályozói.

6. Nem limfoid sejtnövekedési faktorok- a különböző szövetekhez tartozó sejtek növekedésének, differenciálódásának és funkcionális aktivitásának szabályozói (fibroblaszt növekedési faktor - FGF, endoteliális sejtek növekedési faktora, epidermális növekedési faktor - epidermisz EGF) és transzformáló növekedési faktorok (TGFβ, TGFα).

Többek között az elmúlt években aktívan tanulmányozták a makrofágok migrációját gátló faktort (migrációgátló faktor – MIF), amelyet citokin- és enzimaktivitású neurohormonnak tartanak (Suslov AP, 2003; Kovalchuk LV et al. ,

A citokinek szerkezetükben, biológiai aktivitásukban és egyéb tulajdonságaikban különböznek egymástól. A különbségekkel együtt azonban a citokinek igen általános tulajdonságok, jellemző a bioregulátor molekulák ezen osztályára.

1. A citokinek általában átlagos molekulatömegű (30 kD-nál kisebb) glikozilezett polipeptidek.

2. A citokineket az immunrendszer sejtjei és más sejtek (például endotélium, fibroblasztok stb.) állítják elő aktiváló ingerre (kórokozóhoz kapcsolódó molekulaszerkezetek, antigének, citokinek stb.) adott válaszként, és részt vesznek a reakciókban a veleszületett és adaptív immunitást, szabályozva azok erejét és időtartamát. Egyes citokinek konstitutív módon szintetizálódnak.

3. A citokinek szekréciója rövid távú folyamat. A citokinek nem előre kialakított molekulákként tárolódnak, hanem azok

A szintézis mindig a géntranszkripcióval kezdődik. A sejtek alacsony koncentrációban termelnek citokineket (pikogramm per milliliter).

4. A legtöbb esetben citokinek termelődnek, és a célsejtekre közvetlen közelségben hatnak (rövid hatótávolságú hatás). A citokin hatásának fő helye az intercelluláris szinapszis.

5. Redundancia A citokinek rendszere abban nyilvánul meg, hogy minden sejttípus több citokint képes termelni, és minden citokin más-más sejtek által szekretálható.

6. Minden citokinre jellemző pleiotrópia, vagy a cselekvés polifunkcionalitása. Így a gyulladás jeleinek megnyilvánulása az IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 hatásának köszönhető. A funkciók megkettőzése biztosítja a citokinrendszer megbízhatóságát.

7. A citokinek célsejtekre gyakorolt ​​hatását rendkívül specifikus, nagy affinitású membránreceptorok közvetítik, amelyek transzmembrán glikoproteinek, amelyek általában egynél több alegységből állnak. A receptorok extracelluláris része felelős a citokin kötődésért. Vannak receptorok, amelyek megszüntetik a felesleges citokineket a patológiás fókuszban. Ezek az úgynevezett trap receptorok. Az oldható receptorok a membránreceptor extracelluláris doménjei, amelyeket egy enzim választ el. Az oldható receptorok képesek semlegesíteni a citokineket, részt venni a gyulladásos fókuszba való szállításukban és a szervezetből történő kiválasztódásukban.

8. Citokinek hálózat elvén működnek. Együtt is felléphetnek. Úgy tűnik, hogy számos funkciót, amelyet eredetileg egyetlen citokinnek tulajdonítottak, több citokin összehangolt működése közvetít. (szinergia akciók). A citokinek szinergikus kölcsönhatásaira példa a gyulladásos reakciók (IL-1, IL-6 és TNF-a), valamint az IgE szintézis stimulálása.

(IL-4, IL-5 és IL-13).

Egyes citokinek más citokinek szintézisét indukálják (vízesés). A citokinek kaszkádhatása szükséges a gyulladásos és immunválaszok kialakulásához. Egyes citokinek azon képessége, hogy fokozzák vagy gyengítsék mások termelését, fontos pozitív és negatív szabályozó mechanizmusokat határoz meg.

A citokinek antagonista hatása ismert, például az IL-6 termelése a TNFα koncentrációjának növekedésére adott válaszként.

negatív szabályozó mechanizmus e mediátor termelésének szabályozására a gyulladás során.

A célsejtek funkcióinak citokin szabályozása autokrin, parakrin vagy endokrin mechanizmusok segítségével történik. Néhány citokin (IL-1, IL-6, TNFα stb.) képes részt venni a fenti mechanizmusok mindegyikének megvalósításában.

A sejt válasza a citokin hatására több tényezőtől függ:

A sejtek típusától és kezdeti funkcionális aktivitásuktól;

A citokin helyi koncentrációjából;

Más közvetítő molekulák jelenlététől.

Így a termelő sejtek, citokinek és specifikus receptoraik a célsejteken egyetlen mediátor hálózatot alkotnak. A szabályozó peptidek halmaza, nem pedig az egyes citokinek, amelyek meghatározzák a végső sejtválaszt. Jelenleg a citokinrendszert az egész szervezet szintjén univerzális szabályozási rendszernek tekintik, amely biztosítja a védőreakciók kialakulását (például fertőzés során).

Az elmúlt években egy olyan citokin rendszer ötlete született, amely egyesíti:

1) termelő sejtek;

2) oldható citokinek és antagonistáik;

3) célsejtek és receptoraik (7.1. ábra).

A citokinrendszer különböző összetevőinek megsértése számos kóros folyamat kialakulásához vezet, ezért e szabályozási rendszer hibáinak azonosítása fontos a helyes diagnózis és a megfelelő terápia kijelölése szempontjából.

Először is megvizsgáljuk a citokinrendszer fő összetevőit.

Citokin-termelő sejtek

I. Az adaptív immunválaszban a citokintermelő sejtek fő csoportja a limfociták. A nyugvó sejtek nem választanak ki citokineket. Az antigén felismeréssel és a receptor kölcsönhatások (CD28-CD80 / 86 a T-limfociták és CD40-CD40L a B-limfociták) részvételével sejtaktiváció történik, ami citokin gének transzkripciójához, a glikozilált peptidek transzlációjához és intercelluláris szekréciójához vezet. tér.

Rizs. 7.1. Citokin rendszer

A CD4 T-helpereket alpopulációk képviselik: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, amelyek különböznek a szekretált citokinek spektrumában a különféle antigénekre adott válaszként.

A Th0 a citokinek széles skáláját termeli nagyon alacsony koncentrációban.

A differenciálódás iránya Th0 meghatározza az immunválasz két formájának kialakulását humorális vagy celluláris mechanizmusok túlsúlyával.

Az antigén természete, koncentrációja, lokalizációja a sejtben, az antigénprezentáló sejtek típusa és bizonyos citokinkészletek szabályozzák a Th0 differenciálódás irányát.

Az antigén befogása és feldolgozása után a dendritikus sejtek antigén peptideket mutatnak be a Th0 sejteknek, és citokineket termelnek, amelyek szabályozzák az effektor sejtekké történő differenciálódás irányát. Az egyes citokinek szerepét ebben a folyamatban az ábra mutatja. 7.2. Az IL-12 indukálja az IFNγ szintézisét a T-limfociták és a HGC által. Az IFNu biztosítja a Th1 differenciálódását, amelyek citokineket (IL-2, IFNu, IL-3, TNF-a, limfotoxinok) kezdenek el kiválasztani, amelyek szabályozzák az intracelluláris kórokozókkal szembeni reakciók kialakulását

(késleltetett típusú túlérzékenység (HRT) és különböző típusú sejtes citotoxicitás).

Az IL-4 biztosítja a Th0 differenciálódását Th2-vé. Az aktivált Th2 citokineket (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 stb.) termel, amelyek meghatározzák a B-limfociták proliferációját, további plazmasejtekké történő differenciálódását, valamint az ellenanyag-válaszok kialakulását, elsősorban a extracelluláris kórokozók.

Az IFNu negatívan szabályozza a Th2 sejtek működését, és fordítva, az IL-4, a Th2 által szekretált IL-10 gátolja a Th1 funkciót (7.3. ábra). Ennek a szabályozásnak a molekuláris mechanizmusa a transzkripciós faktorokhoz kapcsolódik. A T-bet és a STAT4 IFNy által meghatározott expressziója irányítja a T-sejtek differenciálódását a Th1 útvonalon, és gátolja a Th2 fejlődését. Az IL-4 indukálja a GATA-3 és a STAT6 expresszióját, ami biztosítja a naiv THO Th2 sejtekké való átalakulását (7.2. ábra).

Az elmúlt években az IL-17-et termelő helper T-sejtek (Th17) egy speciális szubpopulációját írták le. Az IL-17 család tagjait aktivált memóriasejtek (CD4 CD45RO), y5T sejtek, NKT sejtek, neutrofilek, monociták expresszálhatják IL-23, IL-6, makrofágok és dendritikus sejtek által termelt TGFβ hatására. A fő megkülönböztető tényező emberben a ROR-C, egerekben - ROR-γ l Kimutatták az IL-17 döntő szerepét a krónikus gyulladások és autoimmun patológiák kialakulásában (lásd 7.2. ábra).

Ezenkívül a csecsemőmirigyben lévő T-limfociták természetes szabályozósejtekké (Treg) differenciálódhatnak, amelyek CD4 + CD25 + felszíni markereket és FOXP3 transzkripciós faktort expresszálnak. Ezek a sejtek képesek elnyomni a Th1 és Th2 sejtek által közvetített immunválaszt közvetlen intercelluláris kontaktussal, valamint a TGFβ és IL-10 szintézisével.

A Th0 klónok és az általuk szekretált citokinek differenciálódási sémáit az 1. ábra mutatja. 7.2 és 7.3 (lásd még a színes betétet).

A T-citotoxikus sejtek (CD8+), a természetes gyilkos sejtek a citokinek, például az interferonok, a TNF-a és a limfotoxinok gyenge termelői.

Az egyik Th-alpopuláció túlzott aktivációja meghatározhatja az immunválasz egyik változatának kialakulását. A Th-aktiváció krónikus egyensúlyhiánya immunpatológiás állapotok kialakulásához vezethet, amelyek a

allergia, autoimmun patológia, krónikus gyulladásos folyamatok stb.

Rizs. 7.2. A T-limfociták különböző alpopulációi, amelyek citokineket termelnek

II. A veleszületett immunrendszerben a citokinek fő termelői a mieloid sejtek. A Toll-like receptorok (TLR) segítségével felismerik a különböző kórokozók hasonló molekuláris szerkezetét, az úgynevezett patogen-asszociált molekuláris mintázatot (RAMP), például a gram-negatív baktériumok lipopoliszacharidját (LPS), lipoteichoin savakat, Gram-pozitív mikroorganizmusok peptidoglikánjai, flagellin, G ismétlődésekben gazdag DNS, stb.

Ez a TLR-rel való kölcsönhatás intracelluláris jelátviteli kaszkádot indít el, amely a citokinek két fő csoportja génjeinek expressziójához vezet: a proinflammatorikus és az 1-es típusú IFN (7.4. ábra, lásd még a színbeillesztést). Főleg ezek a citokinek (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, kemokinek stb.) indukálják a gyulladás kialakulását, és részt vesznek a szervezet bakteriális és vírusos fertőzésekkel szembeni védelmében.

Rizs. 7.3. A TH1 és TH2 sejtek által kiválasztott citokinek spektruma

III. Az immunrendszerhez nem tartozó sejtek (kötőszöveti sejtek, hámsejtek, endotéliumok) konstitutívan szekretálnak autokrin növekedési faktorokat (FGF, EGF, TGFR stb.). és a hematopoietikus sejtek proliferációját támogató citokinek.

Citokinek és antagonistáik számos monográfiában részletesen le vannak írva (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Rizs. 7.4. A citokintermelés TLR által közvetített indukciója veleszületett immunsejtek által

A citokinek túlzott expressziója nem biztonságos a szervezet számára, és túlzott gyulladásos válasz, akut fázisú válasz kialakulásához vezethet. A proinflammatorikus citokinek termelésének szabályozásában különféle inhibitorok vesznek részt. Így számos olyan anyagot írtak le, amely nem specifikusan kötődik az IL-1 citokinhez, és megakadályozza biológiai hatásának megnyilvánulását (a2-makroglobulin, komplement C3-komponense, uromodulin). Az IL-1 specifikus inhibitorai közé tartoznak az oldható csalireceptorok, antitestek és egy IL-1 receptor antagonista (IL-1RA). A gyulladás kialakulásával az IL-1RA gén expressziója fokozódik. De még normális esetben is, ez az antagonista nagy koncentrációban van jelen a vérben (legfeljebb 1 ng / ml vagy több), blokkolva az endogén IL-1 hatását.

Célsejtek

A citokinek célsejtekre gyakorolt ​​hatását specifikus receptorok közvetítik, amelyek nagyon nagy affinitással kötik meg a citokineket, és az egyes citokinek

közös receptor alegységek. Mindegyik citokin a saját specifikus receptorához kötődik.

A citokin receptorok transzmembrán fehérjék, és 5 fő típusra oszthatók. A leggyakoribb az úgynevezett hematopoietin típusú receptor, amelynek két extracelluláris doménje van, amelyek közül az egyik a triptofán és a szerin két ismétlődésének közös aminosav-szekvenciáját tartalmazza, bármilyen aminosavval elválasztva (WSXWS motívum). A második típusú receptornak két extracelluláris doménje lehet nagyszámú konzervált ciszteinnel. Ezek az IL-10 és az IFN család receptorai. A harmadik típust a TNF csoportba tartozó citokin receptorok képviselik. A citokin receptorok negyedik típusa az immunglobulin receptorok szupercsaládjába tartozik, extracelluláris doménekkel, amelyek szerkezetükben az immunglobulin molekulák doménjeihez hasonlítanak. A kemokin család molekuláit megkötő ötödik típusú receptort a sejtmembránon 7 helyen áthaladó transzmembrán fehérjék képviselik. A citokinreceptorok oldható formában létezhetnek, megtartva ligandumkötő képességüket (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

A citokinek képesek befolyásolni a célsejtek proliferációját, differenciálódását, funkcionális aktivitását és apoptózisát (lásd 7.1. ábra). A citokinek biológiai aktivitásának megnyilvánulása a célsejtekben attól függ, hogy a különböző intracelluláris rendszerek részt vesznek a receptortól érkező jelátvitelben, ami a célsejtek jellemzőivel függ össze. Az apoptózis jelzése többek között a TNF-receptorcsalád egy specifikus régiója, az úgynevezett „halál” domén segítségével történik (7.5. ábra, lásd a színes betétet). A differenciálódási és aktiváló jelek az intracelluláris Jak-STAT fehérjéken keresztül – jelátalakítókon és transzkripció aktivátorokon keresztül – keresztül jutnak el (7.6. ábra, lásd a színbetétet). A G-fehérjék részt vesznek a kemokinek jelátvitelében, ami fokozott migrációhoz és sejtadhézióhoz vezet.

A citokinrendszer átfogó elemzése a következőket tartalmazza.

I. A termelősejtek értékelése.

1. A kifejezés meghatározása:

Patogént vagy antigént felismerő receptorok TCR, TLR) gének és fehérjemolekulák szintjén (PCR, áramlási citometria);

Adapter molekulák, amelyek a citokin gének transzkripcióját kiváltó jelet vezetnek (PCR stb.);

Rizs. 7.5. Jelátvitel a TNF receptortól

Rizs. 7.6. Jak-STAT - jelátviteli útvonal az 1-es típusú citokin receptoroktól

citokin gének (PCR); citokinek fehérjemolekulái (humán mononukleáris sejtek citokinszintetizáló funkciójának értékelése).

2. Bizonyos citokineket tartalmazó sejtek szubpopulációinak számszerűsítése: Th1, Th2 Th17 (citokinek intracelluláris festésének módszere); bizonyos citokineket szekretáló sejtek számának meghatározása (ELISPOT módszer, lásd 4. fejezet).

II. Citokinek és antagonistáik értékelése a szervezet biológiai közegében.

1. Citokinek biológiai aktivitásának vizsgálata.

2. A citokinek kvantitatív meghatározása ELISA-val.

3. Citokinek immunhisztokémiai festése szövetekben.

4. Ellentétes citokinek (pro- és gyulladásgátló), citokinek és citokin receptor antagonisták arányának meghatározása.

III. A célsejtek értékelése.

1. Citokin receptorok expressziójának meghatározása gének és fehérje molekulák szintjén (PCR, áramlási citometria módszer).

2. Jelátviteli molekulák meghatározása az intracelluláris tartalomban.

3. A célsejtek funkcionális aktivitásának meghatározása.

Jelenleg számos módszert fejlesztettek ki a citokinrendszer értékelésére, amelyek sokrétű információt szolgáltatnak. Közülük megkülönböztethető:

1) molekuláris biológiai módszerek;

2) módszerek a citokinek mennyiségi meghatározására immunoassay alkalmazásával;

3) citokinek biológiai aktivitásának tesztelése;

4) citokinek intracelluláris festése;

5) ELISPOT módszer, amely lehetővé teszi a citokinek kimutatását egyetlen citokintermelő sejt körül;

6) immunfluoreszcencia.

Itt található ezeknek a módszereknek egy rövid leírása.

Használva molekuláris biológiai módszerek lehetőség nyílik citokinek génjeinek expressziójának, receptoraik, jelzőmolekuláik tanulmányozására, ezen gének polimorfizmusának vizsgálatára. Az elmúlt években számos tanulmányt végeztek, amelyek összefüggéseket tártak fel a citokinrendszer molekuláinak génjeinek allélváltozatai és a hajlam között.

számos betegségre. A citokin gének allél variánsainak vizsgálata információkat szolgáltathat egy adott citokin genetikailag programozott termeléséről. A legérzékenyebb a valós idejű polimeráz láncreakció - RT-PCR (lásd a 6. fejezetet). Hibridizációs módszer in situ lehetővé teszi a citokin gének expressziójának szöveti és sejtes lokalizációjának tisztázását.

A citokinek mennyiségi meghatározása biológiai folyadékokban és perifériás vér mononukleáris sejttenyészeteiben ELISA-val a következőképpen jellemezhető. Mivel a citokinek lokális mediátorok, célszerűbb a szöveti fehérjék kivonása után a megfelelő szövetekben vagy természetes folyadékokban mérni a szintjüket, például könnyben, üregekből történő öblítésben, vizeletben, magzatvízben, agy-gerincvelői folyadékban stb. A szérum vagy más testnedvek citokinszintje az immunrendszer aktuális állapotát tükrözi, pl. citokinek szintézise a test sejtjei által in vivo.

A perifériás vér mononukleáris sejtek (MNC) citokintermelési szintjének meghatározása a sejtek funkcionális állapotát mutatja. Az MNC citokinek spontán termelődése a tenyészetben azt jelzi, hogy a sejtek már aktiválódtak in vivo. A citokinek (különféle stimulánsok, mitogének által) indukált szintézise tükrözi a sejtek potenciális tartalék képességét, hogy reagáljanak egy antigén ingerre (különösen a gyógyszerek hatására). A citokinek csökkent indukált termelése az immunhiányos állapot egyik jele lehet. A citokinek nem specifikusak egy adott antigénre. Ezért a fertőző, autoimmun és allergiás betegségek specifikus diagnózisa bizonyos citokinek szintjének meghatározásával lehetetlen. Ugyanakkor a citokinszintek felmérése lehetővé teszi a gyulladásos folyamat súlyosságáról, a szisztémás szintre való átmenetről és a prognózisról, az immunrendszer sejtjeinek funkcionális aktivitásáról, a Th1 és Th2 sejtek arányáról, amely adatokat nyer. nagyon fontos számos fertőző és immunpatológiai folyamat differenciáldiagnózisában.

Biológiai tápközegben a citokinek számszerűsíthetők különféle módszerekkel immunoassay módszerek, poliklonális és monoklonális antitestek felhasználásával (lásd a 4. fejezetet). Az ELISA lehetővé teszi, hogy megtudja, mi a pontos citokinek koncentrációja a bio-

logikai testnedvek. A citokinek enzimhez kötött immunszorbens vizsgálata számos előnnyel rendelkezik más módszerekkel szemben (nagy érzékenység, specificitás, függetlenség az antagonisták jelenlététől, pontos automatizált elszámolás lehetősége, számviteli standardizálás). Ennek a módszernek azonban megvannak a maga korlátai is: az ELISA nem jellemzi a citokinek biológiai aktivitását, keresztreagáló epitópok miatt hamis eredményeket adhat.

Biológiai vizsgálat a citokinek alapvető tulajdonságainak, célsejtekre gyakorolt ​​hatásának ismerete alapján végezzük. A citokinek biológiai hatásainak tanulmányozása négyféle citokinteszt kifejlesztését tette lehetővé:

1) a célsejtek proliferációjának indukálásával;

2) citotoxikus hatással;

3) a csontvelői progenitorok differenciálódásának indukálásával;

4) vírusellenes hatásra.

Az IL-1-et a mitogén által aktivált egér timociták proliferációjára kifejtett stimuláló hatása határozza meg in vitro; IL-2 - a limfoblasztok proliferatív aktivitását serkentő képessége révén; A TNFα-t és a limfotoxinokat egér fibroblasztokon (L929) kifejtett citotoxikus hatás szempontjából tesztelték. A telepstimuláló faktorokat arra vonatkozóan értékeljük, hogy képesek-e támogatni a csontvelő progenitorok növekedését telepek formájában agarban. Az IFN antivirális aktivitását a vírusok citopátiás hatásának gátlása mutatja humán diploid fibroblasztok tenyészetében és L-929 egerek fibroblasztjainak tumorvonalában.

Olyan sejtvonalakat hoztak létre, amelyek növekedése bizonyos citokinek jelenlététől függ. asztal A 7.1 a citokin teszteléshez használt sejtvonalak listája. Az érzékeny célsejtek proliferációját indukáló képességének megfelelően az IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 stb. biotesztjét végzik el, azonban ezek a vizsgálati módszerek elégtelen érzékenység és információtartalom jellemzi. Az inhibitor és antagonista molekulák elfedhetik a citokinek biológiai aktivitását. Számos citokin általános biológiai aktivitást mutat. Mindazonáltal ezek a módszerek ideálisak a rekombináns citokinek specifikus aktivitásának tesztelésére.

7.1. táblázat. A citokinek biológiai aktivitásának tesztelésére használt sejtvonalak

A táblázat vége. 7.1

Labor 7-1

Az IL-1 biológiai aktivitásának meghatározása az egér timociták proliferációjára gyakorolt ​​komitogén hatással

Az IL-1 biológiai tesztelésének módszere egy citokin azon képességén alapul, hogy stimulálja az egér timociták proliferációját.

Az IL-1 meghatározható LPS-sel stimulált monociták tenyészetében, valamint a test bármely biológiai folyadékában. Számos részletre kell figyelni.

1. A teszteléshez C3H / HeJ egerek timocitáit használjuk, amelyeket mitogének (concanavalin A - ConA és fitohemagglutinin - PHA) stimuláltak proliferációra. A С3Н / HeJ timocitákat nem véletlenül választottuk ki: ebbe a beltenyésztett vonalba tartozó egerek nem reagálnak az LPS-re, amely jelen lehet a tesztanyagban és IL-1 termelést okozhat.

2. A timociták reagálnak az IL-2-re és a mitogénekre, ezért az IL-2 és mitogének jelenlétét is meg kell határozni az IL-1-re vizsgált készítményekben.

Működési eljárás

1. Készítsen timociták szuszpenzióját 12 × 10 6/ml koncentrációjú RPMI 1640 táptalajból, amely 10% tehénembriószérumot és 2-merkaptoetanolt (5 × 10 -5 M) tartalmaz.

2. Készítsen sorozatot egymás után kétszeres hígításokból a kísérleti (biológiai testnedvek) és a kontroll mintákból. Kontrollként IL-1-et tartalmazó biológiai folyadékokat vagy mononukleáris sejtek LPS nélküli inkubálásával nyert mintákat és laboratóriumi standard IL-1-tartalmú készítményt használunk. 96 lyukú, kerek fenekű lemezeken minden hígításból 50 μl-t viszünk át 6 lyukba.

3. Mindegyik hígítás három üregébe adjon 50 µl tisztított PHA-t (Wellcome) teljes tápközegben 3 µg/ml koncentrációban, a másik 3 lyukba pedig 50 µl táptalajt.

4. Adjon 50 μl timocita szuszpenziót minden lyukba, és inkubálja 48 órán át 37 °C-on.

6. A tenyésztés befejezése előtt 50 μl ["3 H] -timidin oldatot (1 μCi / ml) adunk a lyukakba, és további 20 órán át inkubáljuk.

7. A radioaktivitás szintjének meghatározásához a sejttenyészetet automata sejtgyűjtővel szűrőpapírra visszük, a szűrőket megszárítjuk, és folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg a jelölés beépülését.

8. Az eredményeket stimulációs faktorként fejezzük ki.

ahol m cp az impulzusok átlagos száma 3 lyukban.

Ha a timociták reagálnak a standard IL-1-gyel végzett stimulációra, akkor a tesztminta 3-at meghaladó stimulációs indexe megbízhatóan jelzi az IL-1 aktivitást.

A bioassay az egyetlen módszer a citokinfunkció értékelésére, de ezt a módszert ki kell egészíteni a specifitás különböző típusaival, monoklonális antitestek felhasználásával. A citokinhez bizonyos monoklonális antitestek hozzáadása a tenyészetbe blokkolja a citokin biológiai aktivitását, ami azt bizonyítja, hogy a kimutatott citokin jelként szolgál a sejtvonal proliferációjához.

Bioassay alkalmazása az interferon kimutatására. Az IFN biológiai aktivitásának értékelésének elve vírusellenes hatásán alapul, amelyet a tesztvírus sejttenyészetben történő szaporodásának gátlásának mértéke határoz meg.

Ebben a munkában az IFN hatására érzékeny sejtek használhatók: elsősorban csirke és humán embriók tripszinezett fibroblaszt sejtjei, humán diploid fibroblasztok transzplantált sejtjei és egérsejtkultúra (L929).

Az IFN vírusellenes hatásának értékelésekor célszerű rövid szaporodási ciklusú, az IFN hatására nagy érzékenységű vírusokat használni: egér encephalomyelitis vírus, egér hólyagos szájgyulladás stb.

Lab 7-2

Az interferon aktivitás meghatározása

1. Emberi magzat diploid fibroblasztjainak szuszpenzióját 10% szarvasmarhaembrió-szérumot tartalmazó táptalajon (sejtkoncentráció - 15-20 × 10 6 / ml) steril, 96 lyukú lapos fenekű lemezekre öntjük, 100 μl per lyuk. és CO 2 inkubátorba helyezzük 37 °C hőmérsékleten.

2. A teljes egyrétegű réteg kialakulása után a táptalajt eltávolítjuk az üregekből, és 100 µl hordozó táptalajt adunk minden egyes lyukba.

3. A vizsgálati minták IFN-aktivitásának titrálását egy fibroblasztrétegen kétszeres hígítás módszerével végezzük.

A mintákkal egyidejűleg az egér encephalomyelitis vírust (VEM) olyan dózisban juttatjuk be a lyukakba, hogy 48 órával a fertőzés után 100%-os sejtkárosodást okozzon.

4. Kontrollként használjon vírussal fertőzött, intakt (kezeletlen) sejteket tartalmazó üregeket.

Minden vizsgálatban ismert aktivitású referencia-IFN-mintákat használtak referenciagyógyszerként.

5. A mintahígításokkal ellátott lemezeket 24 órán át 37 °C-on 5% CO 2 -tartalmú atmoszférában inkubáljuk.

6. Az IFN aktivitás szintjét a vizsgált minta maximális hígításának reciproka határozza meg, amely 50%-kal gátolja a vírus citopátiás hatását, és az aktivitás mértékegysége ml-ben van kifejezve.

7. Az IFN típusának meghatározásához IFNα, IFNβ vagy IFNγ elleni antiszérumot adnak a rendszerhez. Az antiszérum megszünteti a megfelelő citokin hatását, ami lehetővé teszi az IFN típusának azonosítását.

A gátló faktor migrációjának biológiai aktivitásának meghatározása. Jelenleg teljesen új elképzelések születtek a Mítosz természetéről és tulajdonságairól, amelyet a múlt század 60-as éveiben fedeztek fel a sejtes immunitás közvetítőjeként, és sok éven át kellő figyelem nélkül maradt (Bloom BR, Bennet B., 1966). David JR, 1966). Csak az elmúlt 10-15 évben vált világossá: a MÍTOSZ az egyik legfontosabb biológiai közvetítő a szervezetben, amely számos citokin, hormon és enzim biológiai funkcióját tölti be. A MYTH célsejtekre gyakorolt ​​hatása a CD74 - receptoron vagy az endocitózis nem klasszikus útvonalán keresztül valósul meg.

A MYTH-t a gyulladás fontos közvetítőjének tartják, aktiválja a makrofágok működését (citokintermelés, fagocitózis, citotoxicitás stb.), valamint endogén immunszabályozó hormonként, amely modulálja a glükokortikoid aktivitást.

Egyre több információ gyűlik fel a MIF szerepéről számos gyulladásos betegség, köztük a szepszis, rheumatoid arthritis (RA), glomerulonephritis stb. patogenezisében. RA-ban az érintett ízületek folyadékában a MIF koncentrációja jelentősen megnő, ami korrelál a betegség súlyosságával. A MYTH hatására mind a makrofágok, mind a szinoviális sejtek gyulladáskeltő citokinek termelése megnő.

Különféle módszerek ismertek a MIF aktivitásának tesztelésére, amikor a vándorló sejteket (MIF célsejtek) üvegkapillárisba (kapilláris teszt), egy csepp agarózba vagy agaróz lyukba helyezik.

Egy viszonylag egyszerű szűrési módszert mutatunk be, amely a sejtmikrokultúrák (leukociták vagy makrofágok) szabványos terület és sejtszám kialakításán alapul egy 96 lyukú lapos fenekű lemez üregeinek alján, majd ezeket tápközegben tenyésztjük. és e mikrokultúrák területének változásának meghatározása a MIF hatására (Suslov A.P., 1989).

Labor 7-3

A MÍTOSZ tevékenység meghatározása

A MIF biológiai aktivitásának meghatározása sejtmikrokultúrák kialakítására szolgáló eszközzel (7.7. ábra) - MIGROSKRIN (NF Gamaleya RAMS-ról elnevezett Epidemiológiai és Mikrobiológiai Kutatóintézet) történik.

1. Egy 96 lyukú lemez (Flow, UK vagy hasonló) lyukaiba adjunk 100 μl tápközegben hígított mintát, amelyben a MYTH aktivitást határozzuk meg (minden hígítás 4 párhuzamosban, kísérleti minták). A táptalaj RPMI 1640-et, 2 mM L-glutamint, 5% magzati szarvasmarha-szérumot, 40 μg/ml gentamicint tartalmaz.

2. A kontroll lyukakba adjon 100 μl táptalajt (4 párhuzamosan).

3. Készítsen sejtszuszpenziót peritoneális makrofágokból, amelyhez 2 hibrid egér (CBAxC57B1 / 6) F1 injekciót adunk intraperitoneálisan 10 ml heparinos Hanks oldattal (10 U / ml), gyengéden masszírozza a hasat 2-3 percig. Ezután az állatot lefejezéssel levágják, a hasfalat óvatosan átszúrják az ágyékban, és a váladékot egy tűn keresztül fecskendővel kiszívják. A peritoneális váladék sejtjeit kétszer mossuk Hanks-oldattal, majd 10-15 percig 200 g-vel centrifugáljuk. Ezután sejtszuszpenziót készítünk 10 ± 1 millió/ml koncentrációjú RPMI 1640 táptalajból, és a számlálást Goryaev kamrában végezzük.

4. Szerelje össze a MIGROSKRIN rendszert, amely egy rack a hegyek irányított és szabványos rögzítésére sejttenyészetekkel szigorúan függőleges helyzetben, egy 96 lyukú tenyésztőlemez üregének közepe felett adott magasságban, és 92 hegyet is tartalmaz egy automata pipetta az USA-beli Costarból (7.7. ábra).

Helyezze be az állvány lábait a lemez saroknyílásaiba. A sejtszuszpenziót egy automata pipettával 5 μl-es hegyekbe veszik, egyszeri leengedéssel a táptalajba öblítik le a felesleges sejtektől, és függőlegesen helyezik be a rendszerállvány aljzataiba. A hegyekkel megtöltött állványt 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk szigorúan vízszintes felületen. Ezalatt a szuszpenzió sejtjei leülepednek a lyukak alján, ahol standard sejtmikrokultúrák jönnek létre.

5. A csúcstartót óvatosan vegye le a lemezről. A sejt mikrotenyészetét tartalmazó lemezt szigorúan vízszintes helyzetbe helyezzük egy CO 2 inkubátorba, ahol 20 órán át tenyésztjük, a tenyésztés során a sejtek a lyuk alján vándorolnak.

6. Az inkubálás utáni eredmények kvantitatív elszámolását binokuláris nagyítón végezzük, vizuálisan értékelve a telep méretét a szemlencse belsejében lévő skálán. A mikrokultúrák kör alakúak. A kutatók ezután meghatározzák az átlagos telepátmérőt a telepek 4 teszt- vagy kontrollüregben mért mérései alapján. A mérési hiba ± 1 mm.

A migrációs indexet (MI) a következő képlettel számítjuk ki:

A mintának MYTH-aktivitása van, ha az MI értékek egyenlőek

A MYTH aktivitás egyezményes egységére (U) a reciprok értéket veszik fel, amely megegyezik a minta (minta) legmagasabb hígításának értékével, amelynél a migrációs index 0,6 ± 0,2.

A FEO biológiai aktivitása Az α-t a transzformált L-929 fibroblasztok vonalára gyakorolt ​​citotoxikus hatása alapján értékeljük. Pozitív kontrollként rekombináns TNFa-t, negatív kontrollként tenyésztő tápközegben lévő sejteket használtunk.

Számítsa ki a citotoxikus indexet (CI):

ahol a- a kontrollban lévő élő sejtek száma; b- a kísérletben lévő élő sejtek száma.

Rizs. 7.7. MIGROSKRIN séma – Eszközök a sejtkultúrák vándorlásának számszerűsítésére

A sejteket festékkel (metilénkék) festik, amely csak az elhalt sejtekbe épül be.

Az 50%-os sejtes citotoxicitás eléréséhez szükséges minta reciprok hígításának értékét a TNF-aktivitás hagyományos mértékegységének tekintjük. A minta fajlagos aktivitása - az aktivitás aránya tetszőleges egységekben 1 ml-ben a mintában lévő fehérje koncentrációjához képest.

Intracelluláris citokin festés. A különböző citokineket termelő sejtek arányának változása tükrözheti a betegség patogenezisét, és a betegség prognózisának és a terápia értékelésének ismérveként szolgálhat.

Az intracelluláris festés módszerével meghatározzuk a citokin expresszióját egy sejt szintjén. Az áramlási citometria lehetővé teszi az adott citokint expresszáló sejtek számának megszámlálását.

Soroljuk fel az intracelluláris citokinek meghatározásának főbb lépéseit.

A nem stimulált sejtek kis mennyiségű citokineket termelnek, amelyek általában nem rakódnak le, ezért az intracelluláris citokinek értékelésének fontos lépése a limfociták stimulálása és ezeknek a termékeknek a sejtekből történő felszabadulásának blokkolása.

A leggyakrabban használt citokininduktor a protein-kináz C aktivátor, a forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) kalcium-ionofor ionomicinnel (IN) kombinálva. Egy ilyen kombináció alkalmazása a citokinek széles körének szintézisét idézi elő: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. A PMA-IN alkalmazásának hátránya, hogy az ilyen aktiválás után a limfociták felszínén CD4 molekulákat mutatnak ki. Ezenkívül a T-limfociták citokinek termelését mitogének (PHA) indukálják. A B-sejtek és a monociták stimulálják

A mononukleáris sejteket citokintermelést indukáló anyagok és intracelluláris transzportjuk blokkolója, a brefeldin A vagy monenzin jelenlétében inkubáljuk 2-6 órán keresztül.

A sejteket ezután pufferolt sóoldatban újraszuszpendáljuk. A rögzítéshez 2% formaldehidet adunk hozzá, 10-15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

Ezután a sejteket szaponinnal kezeljük, ami növeli a sejtmembrán permeabilitását, és a kimutatott citokinekre specifikus monoklonális antitestekkel festjük. A felületi markerek (CD4, CD8) előfestése növeli a sejtről nyert információ mennyiségét, és lehetővé teszi a populáció azonosságának pontosabb meghatározását.

A fent leírt módszerek alkalmazásának van néhány korlátozása. Így segítségükkel nem lehet elemezni a citokinek szintézisét egyetlen sejtben, nem lehet meghatározni a citokintermelő sejtek számát egy szubpopulációban, nem lehet meghatározni, hogy a citokintermelő sejtek kifejeznek-e egyedi markereket, különböző citokineket szintetizálnak különböző sejtek vagy ugyanazok. Ezekre a kérdésekre más kutatási módszerek segítségével kapjuk meg a választ. A populációban a citokintermelő sejtek gyakoriságának meghatározására a limitáló hígítási módszert és az ELISPOT enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati módszer egy változatát alkalmazzák (lásd 4. fejezet).

In situ hibridizációs módszer. A módszer a következőket tartalmazza:

2) rögzítés paraformaldehiddel;

3) mRNS kimutatása jelölt cDNS használatával. Egyes esetekben a citokin mRNS-t radioizotópos PCR segítségével határozzák meg a metszeteken.

Immunfluoreszcencia. A módszer a következőket tartalmazza:

1) a szerv lefagyasztása és kriosztát metszetek elkészítése;

2) rögzítés;

3) a metszetek feldolgozása fluoreszceinnel jelölt anti-citokin antitestekkel;

4) a fluoreszcencia vizuális megfigyelése.

Ezek a technikák (hibridizáció in situés immunfluoreszcencia) gyorsak, és nem függenek a szekretált termék küszöbkoncentrációitól. Azonban nem számszerűsítik a kiválasztott citokin mennyiségét, és technikailag összetettek lehetnek. Különféle gondos monitorozásra van szükség a nem specifikus reakciók tekintetében.

A bemutatott citokinek értékelési módszerekkel azonosították a citokinrendszer különböző szintű zavaraihoz kapcsolódó kóros folyamatokat.

Így a citokinrendszer felmérése rendkívül fontos a szervezet immunrendszerének állapotának jellemzése szempontjából. A citokinrendszer különböző szintjeinek vizsgálata információkat nyújt a különböző típusú immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásáról, a gyulladásos folyamat súlyosságáról, a szisztémás szintre való átmenetről és a betegség prognózisáról.

Kérdések és feladatok

1. Sorolja fel a citokinek általános tulajdonságait!

2. Adja meg a citokinek osztályozását!

3. Sorolja fel a citokinrendszer fő összetevőit!

4. Sorolja fel a citokintermelő sejteket!

5. Ismertesse a citokin receptorok családjait!

6. Melyek a citokinhálózat működési mechanizmusai?

7. Meséljen a citokinek termeléséről a veleszületett immunrendszerben!

8. Melyek a citokinrendszer átfogó értékelésének főbb megközelítései?

9. Milyen módszerek vannak a testnedvekben található citokinek vizsgálatára?

10. Melyek a citokinrendszer hibái különböző patológiákban?

11. Melyek az IL-1, IFN, MIF, TNFa biológiai vizsgálatának főbb módszerei biológiai folyadékokban?

12. Ismertesse a citokinek intracelluláris tartalmának meghatározásának folyamatát!

13. Ismertesse az egyetlen sejt által szekretált citokinek meghatározásának folyamatát!

14. Ismertesse a citokin receptor szintű defektus kimutatására használt módszerek sorrendjét!

15. Ismertesse a citokintermelő sejtek szintjén a defektus kimutatására használt módszerek sorrendjét!

16. Milyen információkhoz juthatunk a citokinek termelésének vizsgálatával mononukleáris sejtek tenyészetében, vérszérumban?

Bevezetés

Általános információ

Citokin osztályozás

Citokin receptorok

Citokinek és az immunválasz szabályozása

Következtetés

Irodalom

Bevezetés

A citokinek az immunrendszer egyik legfontosabb részét képezik. Az immunrendszernek szüksége van egy éber rendszerre a test sejtjeitől, mint a segélykiáltás. Ez a citokinek talán legjobb meghatározása. Ha egy sejtet egy kórokozó szervezet károsít vagy befolyásol, a makrofágok és a sérült sejtek citokineket szabadítanak fel. Ez magában foglalja az olyan tényezőket, mint az interleukin, az interferon és a tumor nekrózis faktor-alfa. Ez utóbbi is azt bizonyítja, hogy a daganatszövet pusztítását az immunrendszer irányítja. Amikor a citokinek felszabadulnak, specifikus immunsejteket, például fehérvérsejteket, valamint T- és B-sejteket hívnak meg.

A citokinek egy konkrét célt is jeleznek, amelyet ezeknek a sejteknek teljesíteniük kell. A citokinek és az antitestek teljesen különböznek egymástól, mivel az antitestek az antigénekhez kapcsolódnak, lehetővé teszik az immunrendszer számára, hogy azonosítsa a behatoló idegen organizmusokat. Így egy analógia vonható: a citokinek a fő vészjelzés a betolakodók számára, az antitestek pedig a felderítők. A citokinek elemzésének folyamatát citokindetektálásnak nevezik.

Általános információ

Citokinek [gör. kytos - egy ér, itt - egy sejt és kineo - mozgat, indukál] - kis méretű (8-80 kDa molekulatömegű) fehérje mediátorok - mediátor molekulák ("kommunikációs fehérjék") nagy és változatos csoportja, amelyek részt vesznek az intercelluláris jelátvitelben túlnyomórészt az immunrendszerben.

A citokinek közé tartoznak a tumornekrózis faktor, interferonok, számos interleukin stb. A limfociták által szintetizált citokineket, amelyek a proliferáció és a differenciálódás szabályozói, különösen a hematopoietikus sejtek és az immunrendszer sejtjei, limfokineknek nevezzük.

Az immunrendszer minden sejtje bizonyos funkciókat lát el, és egyértelműen összehangolt kölcsönhatásban működik, amelyet speciális biológiailag aktív anyagok - citokinek - az immunreakciók szabályozói biztosítanak. A citokinek olyan specifikus fehérjék, amelyek segítségével az immunrendszer különböző sejtjei információt cserélhetnek egymással és összehangolhatják tevékenységeiket.

A sejtfelszíni receptorokra ható citokinek halmaza és mennyisége – a „citokin környezet” – kölcsönható és gyakran változó jelek mátrixát jelenti. Ezek a jelek összetettek a citokinreceptorok sokfélesége miatt, valamint abból a tényből adódóan, hogy mindegyik citokin több folyamatot képes aktiválni vagy elnyomni, beleértve a saját szintézisét és más citokinek szintézisét, valamint a citokin receptorok kialakulását és megjelenését. a sejt felszínén.

Az intercelluláris jelátvitel az immunrendszerben a sejtek közvetlen kontaktus interakciójával vagy az intercelluláris kölcsönhatások közvetítőinek segítségével történik. Az immunkompetens és hematopoietikus sejtek differenciálódásának, valamint az immunválaszt alkotó intercelluláris kölcsönhatás mechanizmusainak tanulmányozása, a fehérje jellegű oldható mediátorok nagy és változatos csoportja - az intercelluláris jelátvitelben részt vevő mediátor molekulák ("kötőfehérjék") - citokinek felfedezett.

A hormonokat rendszerint endokrin (nem pedig parakrin vagy autokrin) hatásuk alapján zárják ki ebből a kategóriából. (lásd Citokinek: a hormonális jelátvitel mechanizmusai). A hormonokkal és a neurotranszmitterekkel együtt ezek képezik a kémiai jelátvitel nyelvének alapját, amellyel a morfogenezist és a szövetregenerációt szabályozzák egy többsejtű szervezetben.

Központi szerepet játszanak az immunválasz pozitív és negatív szabályozásában. A mai napig több mint száz citokint fedeztek fel és tanulmányoztak emberben ilyen vagy olyan mértékben, ahogy fentebb említettük, és folyamatosan érkeznek hírek újak felfedezéséről. Egyesek számára génmanipulált analógokat kaptak. A citokinek a citokin receptorok aktiválásán keresztül hatnak.

A. Interferonok (IFN):

1. Természetes IFN (1. generáció):

2. Rekombináns IFN (2. generáció):

a) rövid hatású:

IFN a2b: intron-A

IFN β: avonex et al.

(pegilált IFN-ek): peginterferon

B. Interferon induktorok (interferonogének):

1... Szintetikus- cikloferon, tiloron, dibazol satöbbi.

2. Természetes- ridostin stb.

V. Interleukinok : rekombináns interleukin-2 (ronkoleukin, aldesleukin, proleukin, ) , rekombináns interleukin 1-béta (bétaleukin).

G. Kolónia-stimuláló tényezők (molgramostim stb.)

Peptid készítmények

Thimic peptid készítmények .

A csecsemőmirigy által termelt peptidvegyületek serkenti a T-limfociták érését(timopoietinek).

A kezdetben csökkentett értékek mellett a tipikus peptidek preparátumai növelik a T-sejtek számát és funkcionális aktivitásukat.

A csecsemőmirigy-készítmények első generációjának alapítója Oroszországban volt Taktivin, amely szarvasmarha csecsemőmirigyéből kivont peptidek komplexe. A csecsemőmirigy-peptidek komplexét tartalmazó készítmények közé tartoznak még Timalin, Timoptinés mások, valamint a csecsemőmirigy-kivonatot tartalmazók Timostimulin és Vilozen.

Peptidkészítmények szarvasmarha csecsemőmirigyből timalin, timosztimulin intramuszkulárisan injekciózva, és taktivin, timoptin- bőr alatt, főleg elégtelen sejtes immunitás esetén:

T-immunhiány esetén,

Vírusos fertőzések

A daganatok sugárkezelése és kemoterápiája során fellépő fertőzések megelőzésére.

Az első generációs csecsemőmirigy-készítmények klinikai hatékonysága kétségtelen, de van egy hátrányuk: a biológiailag aktív peptidek osztatlan keverékét képviselik, amelyeket meglehetősen nehéz standardizálni.

A csecsemőmirigy-eredetű gyógyszerek területén a második és harmadik generációs gyógyszerek - a természetes csecsemőmirigyhormonok szintetikus analógjai vagy e hormonok biológiai aktivitású fragmentumai - létrehozása mentén haladtak.

Modern gyógyszer Imunofan - A hexapeptidet, a timopoietin aktív centrumának szintetikus analógját immunhiányos betegségek és daganatok kezelésére használják. A gyógyszer serkenti az IL-2 képződését az immunkompetens sejtek által, növeli a limfoid sejtek érzékenységét erre a limfokinre, csökkenti a TNF (tumornekrózis faktor) termelését, szabályozó hatással van az immunmediátorok (gyulladás) és immunglobulinok termelésére.

Csontvelő peptid készítmények

mielopid emlős csontvelősejtek (borjú, sertés) tenyészetéből nyerik. A gyógyszer hatásmechanizmusa a B- és T-sejtek proliferációjának és funkcionális aktivitásának stimulálásával függ össze.

A szervezetben ennek a gyógyszernek a célpontját tekintik B-limfociták. Károsodott immun- vagy hematopoiesis esetén a myelopid bevezetése a csontvelői sejtek általános mitotikus aktivitásának növekedéséhez és az érett B-limfociták felé történő differenciálódásuk irányának növekedéséhez vezet.

A Myelopidot másodlagos immunhiányos állapotok komplex terápiájában alkalmazzák az immunitás humorális kapcsolatának túlnyomó károsodásával, sebészeti beavatkozások utáni fertőző szövődmények megelőzésére, trauma, osteomyelitis, nem specifikus tüdőbetegségek, krónikus pyoderma. A gyógyszer mellékhatásai szédülés, gyengeség, hányinger, hiperémia és fájdalom az injekció beadásának helyén.

Az ebbe a csoportba tartozó összes gyógyszer ellenjavallt terhes nőknél, a myelopid és az immunofan ellenjavallt az anya és a magzat közötti Rh-konfliktus jelenlétében.

Immunglobulin készítmények

Humán immunglobulinok

a) Immunglobulinok intramuszkuláris beadásra

Nem specifikus: humán immunglobulin normális

Különleges: humán immunglobulin hepatitis B ellen, humán antistaphylococcus immunglobulin, humán tetanusz immunglobulin, humán immunglobulin kullancs encephalitis ellen, humán immunglobulin veszettség vírus ellen stb.

b) Immunglobulinok intravénás beadásra

Nem specifikus: normál humán immunglobulin intravénás beadásra (gabriglobin, immunovenin, intraglobin, humaglobin)

Különleges: immunglobulin humán hepatitis B ellen (neohepatect), pentaglobin (antibakteriális IgM-et, IgG-t, IgA-t tartalmaz), immunglobulin citomegalovírus ellen (cytotect), humán immunglobulin kullancsencephalitis ellen, veszettség elleni IG stb.

c) Orális adagolásra szánt immunglobulinok: immunglobulin komplex készítmény (CIP) enterális adagolásra akut bélfertőzések esetén; anti-rotavírus immunglobulin orális adagolásra.

Heterológ immunglobulinok:

lószérumból származó veszettség elleni immunglobulin, antigangrén polivalens lószérum stb.

A nem specifikus immunglobulinok készítményeit elsődleges és másodlagos immunhiány esetén, specifikus immunglobulinkészítményeket - megfelelő fertőzésekre (terápiás vagy profilaktikus célokra) használnak.

Citokinek és az azokon alapuló készítmények

A kialakult immunválasz szabályozását a citokinek - endogén immunszabályozó molekulák komplex komplexe, amelyek mind a természetes, mind a rekombináns immunmoduláló gyógyszerek nagy csoportjának létrehozásának alapját képezik.

Interferonok (IFN):

1. Természetes IFN (1. generáció):

Alfaferonok: humán leukocita IFN stb.

Betaferonok: humán fibroblaszt IFN és mások.

2. Rekombináns IFN (2. generáció):

a) rövid hatású:

IFN a2a: reaferon, viferon stb.

IFN a2b: intron-A

IFN β: avonex et al.

b) elhúzódó hatás(pegilált IFN-ek): peginterferon (IFN a2b + polietilénglikol) stb.

Az IFN gyógyszerek fő hatásiránya a T-limfociták (természetes ölősejtek és citotoxikus T-limfociták).

A természetes interferonokat donorvér leukociták tenyészetében (limfoblasztoid és más sejtek tenyészetében) nyerik az induktor vírus hatására.

A rekombináns interferonokat géntechnológiai módszerrel állítják elő - olyan baktériumtörzsek tenyésztésével, amelyek genetikai berendezésükben a humán interferon gén beágyazott rekombináns plazmidját tartalmazzák.

Az interferonok vírusellenes, daganatellenes és immunmoduláló hatásúak.

Vírusellenes szerekként az interferon készítmények a leghatékonyabbak a herpeszes szembetegségek (lokálisan cseppek formájában, subconjunctivalis), a bőrön, nyálkahártyákon és nemi szerveken lokalizált herpes simplex, övsömör (lokálisan hidrogél alapú formában). kenőcs), akut és krónikus vírusos hepatitis B és C (parenterálisan, rektálisan kúpokban), influenza és akut légúti vírusfertőzések kezelésére és megelőzésére (intranazálisan cseppek formájában). HIV-fertőzés esetén a rekombináns interferonkészítmények normalizálják az immunológiai paramétereket, az esetek több mint 50% -ában csökkentik a betegség lefolyásának súlyosságát, és csökkentik a virémia szintjét és a betegség szérummarkereinek tartalmát. AIDS esetén azidotimidinnel kombinált terápiát végeznek.

Az interferon készítmények daganatellenes hatása a természetes ölősejtek antiproliferatív hatásával és aktivitásának stimulálásával jár. Antineoplasztikus szerekként IFN-alfát, IFN-alfa 2a-t, IFN-alfa-2b-t, IFN-alfa-n1-et, IFN-béta-t használnak.

Az IFN-béta-lb-t immunmodulátorként használják sclerosis multiplexben.

Az interferon készítmények hasonlót okoznak mellékhatások... Influenzaszerű szindróma jellemzi; változások a központi idegrendszerben: szédülés, homályos látás, zavartság, depresszió, álmatlanság, paresztézia, remegés. A gyomor-bél traktusból: étvágytalanság, hányinger; a szív- és érrendszer oldaláról a szívelégtelenség tünetei lehetségesek; a húgyúti rendszerből - proteinuria; a hematopoietikus rendszer részéről - átmeneti leukopenia. Kiütés, viszketés, alopecia, átmeneti impotencia, orrvérzés is előfordulhat.

Interferon induktorok (interferonogének):

1. Szintetikus - cikloferon, tiloron, poludan stb.

2. Természetes - ridostin stb.

Az interferon induktorok olyan gyógyszerek, amelyek fokozzák az endogén interferon szintézisét. Ezek a gyógyszerek számos előnnyel rendelkeznek a rekombináns interferonokkal szemben. Nincs antigén aktivitásuk. Az endogén interferon stimulált szintézise nem okoz hiperinferonémiát.

Tiloron(amiksin) kis molekulatömegű szintetikus vegyületekre utal, az interferon orális induktora. Széles spektrumú antivirális aktivitással rendelkezik a DNS és RNS vírusok ellen. Vírusellenes és immunmoduláló szerként influenza, akut légúti vírusfertőzések, hepatitis A megelőzésére és kezelésére, vírusos hepatitis, herpes simplex (beleértve az urogenitális) és herpes zoster kezelésére, a chlamydia fertőzések komplex terápiájában, neurovírusos és fertőző-allergiás betegségek, másodlagos immunhiányos állapotokkal. A gyógyszer jól tolerálható. Lehetséges diszpepsziás tünetek, rövid távú hidegrázás, fokozott általános tónus, amely nem igényli a gyógyszer abbahagyását.

Poludan poliadenil- és poliuridilsavak bioszintetikus poliribonukleotid komplexe (ekvimoláris arányban). A gyógyszer kifejezett gátló hatást fejt ki a herpes simplex vírusokra. Szemcseppek és injekciók formájában alkalmazzák a kötőhártya alá. A gyógyszert felnőtteknek írják fel vírusos szembetegségek kezelésére: herpetikus és adenovírusos kötőhártya-gyulladás, keratoconjunctivitis, keratitis és keratoiridocyclitis (keratouveitis), iridocyclitis, chorioretinitis, opticus neuritis.

Mellékhatások ritkán fordulnak elő, és allergiás reakciók kialakulásában nyilvánulnak meg: viszketés és idegen test érzése a szemben.

Cycloferon- kis molekulatömegű interferon induktor. Vírusellenes, immunmoduláló és gyulladáscsökkentő hatása van. A Cycloferon hatásos kullancsencephalitis vírusok, herpesz, citomegalovírus, HIV stb. ellen. Chlamydia ellenes hatása van. Hatékony szisztémás kötőszöveti betegségek esetén. Megállapították a gyógyszer sugárvédő és gyulladáscsökkentő hatását.

Arbidol belsőleg írják fel az influenza és más akut légúti vírusfertőzések, valamint a herpesz betegségek megelőzésére és kezelésére.

Interleukinok:

rekombináns IL-2 (aldesleukin, proleukin, roncoleukin ) , rekombináns IL-1béta ( betaleukin).

A természetes eredetű citokinkészítményekre, amelyek meglehetősen nagy gyulladásos citokinkészletet és az immunválasz első fázisát tartalmazzák, az emberi szervezetre gyakorolt ​​sokrétű hatás jellemző. Ezek a gyógyszerek a gyulladásban, a regenerációban és az immunválaszban részt vevő sejtekre hatnak.

Aldesleukin- az IL-2 rekombináns analógja. Immunmoduláló és daganatellenes hatása van. Aktiválja a sejtes immunitást. Fokozza a T-limfociták és az IL-2-függő sejtpopulációk proliferációját. Növeli a limfociták és a gyilkos sejtek citotoxicitását, amelyek felismerik és elpusztítják a tumorsejteket. Fokozza a gamma-interferon, TNF, IL-1 termelését. Veserák kezelésére használják.

Betaleukin- rekombináns humán IL-1 béta. Stimulálja a leukopoiesist és az immunvédelmet. Bőr alá vagy intravénásan alkalmazzák immunhiányos gennyes folyamatokra, kemoterápia következtében fellépő leukopéniára, daganatokra.

Roncoleukin- az interleukin-2 rekombináns készítményét intravénásan adják be immunhiányos szepszis, valamint veserák esetén.

Kolónia-stimuláló tényezők:

Molgramostim(Leukomax) a humán granulocita-makrofág telep-stimuláló faktor rekombináns készítménye. Stimulálja a leukopoiesist, immunotróp aktivitással rendelkezik. Fokozza a prekurzorok proliferációját és differenciálódását, növeli az érett sejtek tartalmát a perifériás vérben, a granulociták, monociták, makrofágok növekedését. Növeli az érett neutrofilek funkcionális aktivitását, fokozza a fagocitózist és az oxidatív metabolizmust, biztosítva a fagocitózis mechanizmusait, növeli a rosszindulatú sejtekkel szembeni citotoxicitást.

Filgrastim(Neupogen) a humán granulocita telep-stimuláló faktor rekombináns készítménye. A filgrasztim szabályozza a neutrofilek termelődését és a csontvelőből a vérbe jutását.

Lenograstim- humán granulocita telep-stimuláló faktor rekombináns készítménye. Ez egy nagyon finomított fehérje. Immunmodulátor és leukopoiesis stimulátor.

Szintetikus immunstimulánsok: levamizol, izoprinozin-polioxidónium, galavit.

Levamizol(decaris), egy imidazol-származék, immunstimulánsként, valamint féregellenes szerként használják az ascariasis kezelésére. A levamizol immunstimuláló tulajdonságai a makrofágok és a T-limfociták aktivitásának növekedésével járnak.

A levamisolt szájon át írják fel visszatérő herpeszfertőzések, krónikus vírusos hepatitis, autoimmun betegségek (rheumatoid arthritis, szisztémás lupus erythematosus, Crohn-betegség) kezelésére. A gyógyszert vastagbéldaganatok kezelésére is használják a daganatok műtéti, sugár- vagy gyógyszeres terápiája után.

Izoprinozin- inozint tartalmazó készítmény. Serkenti a makrofágok aktivitását, az interleukin termelését, a T-limfociták szaporodását.

Rendelje hozzá vírusfertőzésekhez, krónikus légúti és húgyúti fertőzésekhez, immunhiányhoz.

polioxidónium- szintetikus vízoldható polimer vegyület. A gyógyszer immunstimuláló és méregtelenítő hatású, növeli a szervezet immunrezisztenciáját a helyi és általános fertőzésekkel szemben. A polioxidónium aktiválja a természetes rezisztencia összes tényezőjét: a monocita-makrofág rendszer sejtjeit, a neutrofileket és a természetes ölősejteket, növelve funkcionális aktivitásukat a kezdetben csökkentett ütemben.

Galavit- a ftalhidrazid származéka. Ennek a gyógyszernek a sajátossága nemcsak immunmoduláló, hanem kifejezett gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal is rendelkezik.

Más farmakológiai osztályokba tartozó, immunstimuláló hatású gyógyszerek

1. Adaptogének és gyógynövénykészítmények (fitopreparátumok): echinacea (immunális), eleutherococcus, ginzeng, rhodiola rosea stb.

2. Vitaminok: aszkorbinsav (C-vitamin), tokoferol-acetát (E-vitamin), retinol-acetát (A-vitamin) (lásd a "Vitaminok" részt).

Echinacea készítmények immunstimuláló és gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal rendelkeznek. Szájon át szedve ezek a gyógyszerek fokozzák a makrofágok és neutrofilek fagocitáló aktivitását, serkentik az interleukin-1 termelődését, a T-helperek aktivitását és a B-limfociták differenciálódását.

Az echinacea készítményeket immunhiányos betegségek és krónikus gyulladásos betegségek esetén alkalmazzák. Különösen, immunis Orálisan, cseppekben akut légúti fertőzések megelőzésére és kezelésére, valamint a bőr-, légúti- és húgyúti fertőzések kezelésére szolgáló antibakteriális szerekkel együtt írják fel.

Az immunstimulánsok alkalmazásának általános elvei másodlagos immunhiányos betegeknél

Az immunstimulánsok legésszerűbb alkalmazásának a fokozott fertőző morbiditásban megnyilvánuló immunhiányos állapotok esetén valósítható meg. Az immunstimuláló gyógyszerek fő célpontja továbbra is a másodlagos immunhiány, amely gyakran visszatérő, nehezen kezelhető fertőző és gyulladásos betegségekben nyilvánul meg, bármilyen lokalizációjú és etiológiájú. Minden krónikus fertőző és gyulladásos folyamat középpontjában az immunrendszer változásai állnak, amelyek az egyik oka e folyamat fennmaradásának.

· Az immunmodulátorokat komplex terápiában írják fel antibiotikumokkal, gombaellenes, antiprotozoális vagy vírusellenes szerekkel egyidejűleg.

· Immunrehabilitációs intézkedések végrehajtásakor, különösen akut fertőző betegség utáni nem teljes gyógyulás esetén, az immunmodulátorok monoterápiaként alkalmazhatók.

· Célszerű immunmodulátorokat alkalmazni az immunológiai monitorozás hátterében, amelyet az immunrendszer kezdeti változásainak meglététől vagy hiányától függetlenül kell elvégezni.

· Az immunitás fagocita láncszemére ható immunmodulátorok felírhatók mind az azonosított, mind a fel nem ismert immunállapotú betegeknek, pl. használatuk alapja a klinikai kép.

Az immunitás bármely paraméterének csökkenése, amelyet egy gyakorlatilag egészséges ember immundiagnosztikai vizsgálata során mutattak ki, nem szükségszerűen az immunmoduláló terápia kinevezésének alapja.

Ellenőrző kérdések:

1. Mik azok az immunstimulánsok, mik az immunterápia javallatai, milyen típusokra osztják az immunhiányos állapotokat?

2. Az immunmodulátorok osztályozása a hatás preferált szelektivitása szerint?

3. Mikrobás eredetű immunstimulánsok és szintetikus analógjaik, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

4. Endogén immunstimulánsok és szintetikus analógjaik, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

5. A csecsemőmirigy és a csontvelő peptidek készítményei, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

6. Immunglobulinok és interferonok (IFN) készítményei, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

7. Interferon induktorok (interferonogén) készítmények, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

8. Interleukinek és telepstimuláló faktorok készítményei, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

9. Szintetikus immunstimulánsok, farmakológiai tulajdonságaik, használati javallatok, ellenjavallatok, mellékhatások?

10. Egyéb, immunstimuláló hatású farmakológiai csoportokba tartozó gyógyszerek és az immunstimulánsok alkalmazásának általános elvei másodlagos immunhiányos betegeknél?