Antigene bacteriene:
specific de grup (găsește în specii diferite din același gen sau familie)
specifică speciei (la reprezentanți diferiți ai aceleiași specii);
specific de tip (se determină variante serologice - serovare, antigenovari în cadrul unei specii).
În funcție de localizarea în celula bacteriană, se disting antigenele K-, H-, O (notate cu litere ale alfabetului latin).
O-AG - lipopolizaharidă a peretelui celular al bacteriilor gram-negative. Este format dintr-un lanț polizaharidic (de fapt O-Ag) și lipide A.
Polizaharida este termostabilă (rezistă la fierbere 1-2 ore), stabilă chimic (rezistă la tratarea cu formol și etanol). O-AG pur este slab imunogen. Prezintă variabilitate structurală și distinge multe serovariante ale bacteriilor din aceeași specie. De exemplu, fiecare grup de Salmonella este caracterizat de prezența unui anumit O-AG (polizaharidă) - în grupa A
Acesta este factorul 2, grupul B are factorul 4 și așa mai departe. În formele R ale bacteriilor, O-AG pierde lanțurile laterale
polizaharidă și specificitatea tipului.
Lipida A - contine glucozamina si acizi grasi. Are activitate adjuvantă puternică, imunostimulatoare nespecifică și toxicitate. În general, LPS este o endotoxină. Deja în doze mici, provoacă febră datorită activării macrofagelor și eliberării de IL1, TNF și a altor citokine, degranulării degranulocitelor și agregării trombocitelor. Se poate lega de orice celule din organism, dar mai ales de macrofage. În doze mari, inhibă fagocitoza, provoacă toxicoză, disfuncții ale sistemului cardiovascular, tromboză, șoc endotoxic. LPS al unor bacterii face parte din imunostimulante (prodigiosan,
pirogenă). Peptidoglicanii din peretele celular bacterian au un efect adjuvant puternic asupra celulelor SI.
H-AG face parte din flagelul bacterian, baza sa este proteina flagelină. Termobila.
K-AG este un grup eterogen de bacterii AG superficiale, capsulare.
Sunt într-o capsulă. Conțin în principal polizaharide acide, care includ acizi galacturonic, glucuronic și iduronic. Există variații în structura acestor antigene, pe baza cărora, de exemplu, se disting 75 de tipuri (serotipuri) de pneumococi, 80 de tipuri de Klebsiella etc. Antigenele capsulare sunt utilizate pentru prepararea vaccinurilor meningococice, pneumococice și Klebsiella. Cu toate acestea, administrarea de doze mari de antigene polizaharide poate induce toleranță.
Antigenii bacteriilor sunt, de asemenea, toxinele, ribozomii și enzimele lor.
Unele microorganisme conțin determinanți antigenici reactivi încrucișați găsiți la microorganisme și la oameni/animale.
În microbii diferitelor specii și la oameni, există AG comune, similare ca structură. Aceste fenomene se numesc mimetism antigenic. Adesea, antigenele reactive încrucișate reflectă comunitatea filogenetică a acestor reprezentanți, uneori sunt rezultatul unei asemănări aleatorii în conformație și încărcături - molecule de antigen.
De exemplu, Forsman's AG se găsește în eritrocitele Barach, salmonella și la cobai.
Streptococii hemolitici din grupa A conțin antigene cu reacție încrucișată (în special, proteina M) care sunt comune cu antigenele endocardului și glomerulilor rinichilor umani. Astfel de antigene bacteriene provoacă formarea de anticorpi care reacţionează încrucişat cu celulele umane, ceea ce duce la dezvoltarea reumatismului şi a glomerulonefritei post-streptococice.
Agentul cauzal al sifilisului are fosfolipide similare ca structură cu cele găsite în inima animalelor și oamenilor. Prin urmare, antigenul cardiolipin al inimii animalelor este utilizat pentru a detecta anticorpi la spirochetă la persoanele bolnave (reacția Wassermann).
Antigenele sunt compuși cu greutate moleculară mare. Când sunt ingerate, ele provoacă o reacție imună și interacționează cu produsele acestei reacții: anticorpi și limfocite activate.
Clasificarea antigenelor.
1. După origine:
1) naturale (proteine, carbohidrați, acizi nucleici, exo- și endotoxine bacteriene, antigeni de țesut și celule sanguine);
2) artificiale (proteine dinitrofenilate și carbohidrați);
3) sintetice (poliaminoacizi sintetizati, polipeptide).
2. După natura chimică:
1) proteine (hormoni, enzime etc.);
2) carbohidrați (dextran);
3) acizi nucleici (ADN, ARN);
4) antigene conjugate (proteine dinitrofenilice);
5) polipeptide (polimeri ai a-aminoacizilor, copolimeri ai glutaminei și alaninei);
6) lipide (colesterol, lecitină, care poate acționa ca o haptenă, dar atunci când sunt combinate cu proteinele din serul sanguin, acestea capătă proprietăți antigenice).
3. Prin relație genetică:
1) autoantigene (provin din țesuturile propriului corp);
2) izoantigene (provin de la un donator identic genetic);
3) aloantigene (provin de la un donator neînrudit din aceeași specie);
4) xenoantigene (provin de la un donator al altei specii).
4. După natura răspunsului imun:
1) antigene dependente de timus (răspunsul imun depinde de participarea activă a limfocitelor T);
2) antigene timus-independente (declanșează răspunsul imun și sinteza anticorpilor de către celulele B fără limfocite T).
Există, de asemenea:
1) antigeni externi; pătrunde în corp din exterior. Acestea sunt microorganisme, celule transplantate și particule străine care pot pătrunde în organism pe căi alimentare, inhalatorie sau parenterală;
2) antigene interne; apar din moleculele corpului deteriorate care sunt recunoscute ca străine;
3) antigene latente - anumiți antigeni (de exemplu, țesutul nervos, proteinele cristalinului și spermatozoizii); separată anatomic de sistemul imunitar prin bariere histohematice în timpul embriogenezei; nu apare toleranța la aceste molecule; intrarea lor în fluxul sanguin poate duce la un răspuns imun.
Reactivitatea imunologică împotriva auto-antigenelor modificate sau ascunse apare în unele boli autoimune.
Proprietățile antigenelor:
1) antigenicitate - capacitatea de a provoca formarea de anticorpi;
2) imunogenitatea - capacitatea de a crea imunitate;
3) specificitate - caracteristici antigenice, datorită prezenței cărora antigenele diferă unele de altele.
Haptenele sunt substanțe cu greutate moleculară mică care în condiții normale nu provoacă un răspuns imun, dar atunci când sunt legate de molecule cu greutate moleculară mare devin imunogene. Haptenele includ medicamente și majoritatea substanțelor chimice. Ele sunt capabile să induce un răspuns imunitar după ce se leagă de proteinele corpului.
Antigenele sau haptenele care provoacă o reacție alergică atunci când sunt reintroduse în organism se numesc alergeni.
2. Antigenele microorganismelor
Antigenele infectioase sunt antigene ale bacteriilor, virusurilor, ciupercilor, protozoarelor.
Există următoarele tipuri de antigene bacteriene:
1) specific de grup (se găsește la specii diferite din același gen sau familie);
2) specifică speciei (se găsesc la reprezentanți diferiți ai aceleiași specii);
3) specific de tip (se determină variante serologice - serovare, antigenovari - în cadrul aceleiași specii).
În funcție de localizarea în celula bacteriană, există:
1) O - AG - polizaharid; face parte din peretele celular bacterian. Determină specificitatea antigenică a lipopolizaharidei peretelui celular; distinge serovariante de bacterii din aceeași specie. A - AG este slab imunogen. Este stabil termic (rezistă la fierbere 1–2 h), stabil din punct de vedere chimic (rezistă la tratarea cu formol și etanol);
2) lipidă A - heterodimer; conține glucozamină și acizi grași. Are activitate adjuvantă puternică, imunostimulatoare nespecifică și toxicitate;
3) H - AG; face parte din flagelul bacterian, baza sa este proteina flagelină. Termolabil;
4) K - AG - un grup heterogen de antigene de suprafață, capsulare ale bacteriilor. Ele sunt încapsulate și asociate cu stratul de suprafață de lipopolizaharide al peretelui celular;
5) toxine, nucleoproteine, ribozomi și enzime bacteriene.
Antigeni virali:
1) antigene supercapside - înveliș de suprafață;
2) antigene proteice și glicoproteice;
3) capside - coajă;
4) antigene nucleoproteice (nucleu).
Toate antigenele virale sunt dependente de T.
Antigenii de protecție sunt un set de determinanți antigenici (epitopi) care provoacă cel mai puternic răspuns imun, care protejează organismul de reinfectarea cu acest agent patogen.
Modalități de penetrare a antigenelor infecțioase în organism:
1) prin piele deteriorată și uneori intactă;
2) prin mucoasele nasului, gurii, tractului gastrointestinal, tractului urinar.
Heteroantigenele sunt complexe antigenice comune reprezentanților diferitelor specii sau determinanți antigenici comuni pe complexe care diferă în alte proprietăți. Datorită heteroantigenilor, pot apărea reacții încrucișate imunologice.
La microbii de diferite specii și la oameni, există antigene comune similare ca structură. Aceste fenomene se numesc mimetism antigenic.
Superantigenele sunt un grup special de antigene care, la doze foarte mici, determină activarea policlonală și proliferarea unui număr mare de limfocite T. Superantigenele sunt enterotoxine bacteriene, stafilococi, toxine holerice, unele virusuri (rotavirusuri).
Izolarea microorganismelor din diverse materiale și obținerea culturilor acestora este utilizată pe scară largă în practica de laborator pentru diagnosticul microbiologic al bolilor infecțioase, în activitatea de cercetare și în producția microbiologică de vaccinuri, antibiotice și alte produse biologic active ale vieții microbiene.
Condiţiile de cultură depind şi de proprietăţile microorganismelor respective. Majoritatea microbilor patogeni sunt cultivați pe medii nutritive la 37°C timp de 12 zile. Cu toate acestea, unele dintre ele necesită perioade mai lungi. De exemplu, bacteriile pertussis - în 2-3 zile, și Mycobacterium tuberculosis - în 3-4 săptămâni.
Pentru stimularea proceselor de creștere și reproducere a microbilor aerobi, precum și pentru reducerea timpului de cultivare a acestora, se folosește metoda de cultivare profundă, care constă în aerarea continuă și amestecarea mediului nutritiv. Metoda adâncimii și-a găsit o largă aplicație în biotehnologie.
Pentru cultivarea anaerobilor se folosesc metode speciale, a căror esență este eliminarea aerului sau înlocuirea acestuia cu gaze inerte în termostate sigilate - anaerostate. Anaerobii sunt cultivați pe medii nutritive care conțin substanțe reducătoare (glucoză, acid formic de sodiu etc.), care reduc potențialul redox.
În practica de diagnosticare, au o importanță deosebită culturile pure de bacterii, care sunt izolate din materialul de testat prelevat de la un pacient sau obiecte din mediu. În acest scop, se folosesc medii nutritive artificiale, care sunt împărțite în diagnostic de bază, diferențial și electiv de cea mai diversă compoziție. Alegerea unui mediu nutritiv pentru izolarea unei culturi pure este esențială pentru diagnosticul bacteriologic.
În cele mai multe cazuri, se folosesc medii nutritive solide, turnate în prealabil în vase Petri. Materialul de testat este plasat pe suprafața mediului cu o buclă și frecat cu o spatulă pentru a obține colonii izolate care au crescut dintr-o celulă. Subcultura unei colonii izolate pe un mediu de agar oblic într-o eprubetă are ca rezultat o cultură pură.
Pentru identificare, i.e. determinând afilierea generică și de specie a unei culturi selectate, cel mai adesea studiază caracteristicile fenotipice:
a) morfologia celulelor bacteriene în frotiuri colorate sau preparate native;
b) caracteristicile biochimice ale culturii în funcție de capacitatea acesteia de a fermenta carbohidrații (glucoză, lactoză, zaharoză, maltoză, manitol etc.), de a forma indol, amoniac și hidrogen sulfurat, care sunt produse ale activității proteolitice a bacteriilor.
Pentru o analiză mai completă se utilizează cromografia gaz-lichid și alte metode.
Alături de metodele bacteriologice, metodele de cercetare imunologică sunt utilizate pe scară largă pentru identificarea culturilor pure, care au ca scop studierea structurii antigenice a culturii izolate. În acest scop se folosesc reacții serologice: aglutinare, precipitare prin imunofluorescență, fixare a complementului, imunotest enzimatic, metode radioimune etc.
Metode de izolare a culturii pure
Pentru a izola o cultură pură de microorganisme, este necesar să se separe numeroasele bacterii care se află în material una de cealaltă. Acest lucru se poate realiza prin metode care se bazează pe două principii − mecanic și biologic disocierea bacteriilor.
Metode de izolare a culturilor pure bazate pe principiul mecanic
Metoda de diluare în serie , propus de L. Pasteur, a fost unul dintre primele, care a fost folosit pentru separarea mecanică a microorganismelor. Constă în efectuarea de diluții în serie a materialului care conține microbi într-un mod steril lichid mediu nutritiv. Această tehnică este destul de minuțioasă și imperfectă în funcționare, deoarece nu permite controlul numărului de celule microbiene care intră în eprubete în timpul diluțiilor.
Acest dezavantaj nu Metoda Koch (metoda diluării plăcilor ). R. Koch a folosit medii nutritive dense pe bază de gelatină sau agar-agar. Materialul cu asociații de diferite tipuri de bacterii a fost diluat în mai multe eprubete cu gelatină topită și ușor răcită, al cărei conținut a fost turnat ulterior pe plăci de sticlă sterile. După gelificarea mediului, acesta a fost cultivat la temperatura optimă. În grosimea sa s-au format colonii izolate de microorganisme, care pot fi ușor transferate într-un mediu nutritiv proaspăt folosind o buclă de platină pentru a obține o cultură pură de bacterii.
Metoda Drygalski este o metodă mai avansată care este utilizată pe scară largă în practica microbiologică de zi cu zi. Mai întâi, materialul de testat este aplicat pe suprafața mediului într-o cutie Petri cu o pipetă sau o buclă. Folosind o spatulă de metal sau sticlă, frecați-o cu grijă în mediu. Cupa se ține deschisă în timpul inoculării și se rotește ușor pentru a distribui uniform materialul. Fără a steriliza spatula, o cheltuiesc pe material într-un alt vas Petri, dacă este necesar - în a treia. Abia după aceea, spatula se scufundă într-o soluție dezinfectantă sau se prăjește într-o flacără a arzătorului. Pe suprafața mediului din primul vas, de regulă, observăm o creștere continuă a bacteriilor, în al doilea - o creștere densă, iar în al treilea - creștere sub formă de colonii izolate.
Colonii după metoda Drygalski
Metoda accidentului vascular cerebral astăzi este folosit în laboratoarele de microbiologie cel mai des. Materialul care conține microorganisme este colectat cu o buclă bacteriologică și aplicat pe suprafața mediului nutritiv lângă marginea cupei. Excesul de material este îndepărtat și ocupat în mișcări paralele de la o margine la alta a cupei. După o zi de incubare a culturilor la temperatura optimă, pe suprafața vasului cresc colonii izolate de microbi.
Metoda accidentului vascular cerebral
Pentru a obține colonii izolate, puteți folosi un tampon, care a fost folosit pentru colectarea materialului de testat. Vasul Petri cu mediul nutritiv este ușor deschis, se introduce un tampon în ea, iar materialul este frecat cu grijă pe suprafața vasului, returnând treptat tamponul și vasul.
Astfel, un avantaj semnificativ al metodelor de diluare a plăcilor Koch, Drygalski și streak plate este că creează colonii izolate de microorganisme, care, atunci când sunt inoculate pe un alt mediu nutritiv, se transformă într-o cultură pură.
Metode de izolare a culturilor pure bazate pe principiul biologic
Principiul biologic al separării bacteriilor prevede o căutare intenționată a metodelor care țin cont de numeroasele caracteristici ale celulelor microbiene. Printre cele mai comune metode se numără următoarele:
1. După tipul de respirație. Toate microorganismele în funcție de tipul de respirație sunt împărțite în două grupuri principale: aerobic (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio sholeraeetc)și anaerob (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringenssi etc.). Dacă materialul din care ar trebui izolați agenții patogeni anaerobi este preîncălzit și apoi cultivat în condiții anaerobe, atunci aceste bacterii vor crește.
2. Prin sporulare . Se știe că unii microbi (bacili și clostridii) sunt capabili de sporulare. Printre ei Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacilul cereus. Sporii sunt rezistenți la factorii de mediu. Prin urmare, materialul de testat poate fi supus acțiunii unui factor termic și apoi transferat inoculativ într-un mediu nutritiv. După ceva timp, exact acele bacterii care sunt capabile de sporulare vor crește pe ea.
3. Rezistenta microbilor la actiunea acizilor si alcalinelor. Unii microbi (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) ca urmare a particularităților structurii lor chimice, ele sunt rezistente la acizi. De aceea, materialul care le conține, de exemplu, sputa pentru tuberculoză, este pretratat cu un volum egal de soluție de acid sulfuric 10% și apoi semănat pe medii nutritive. Flora străină moare, iar micobacteriile, ca urmare a rezistenței lor la acizi, cresc.
Vibrio cholerae (Vibrio sholerae) , dimpotrivă, este o bacterie halofilă, prin urmare, pentru a crea condiții optime de creștere, se seamănă pe medii care conțin alcali (1% apă peptonă alcalină). Deja după 4-6 ore, pe suprafața mediului apar semne caracteristice de creștere sub forma unei pelicule delicate albăstrui.
4. Mobilitatea bacteriilor. Unii microbi (Proteus vulgaris) tind să crească târâtor și sunt capabili să se răspândească rapid pe suprafața unui mediu umed. Pentru a izola astfel de agenți patogeni, aceștia sunt însămânțați într-o picătură de lichid de condensare, care se formează atunci când coloana de agar oblic este răcită. După 16-18 ani se răspândesc pe toată suprafața mediului. Dacă luăm material din vârful agarului, vom avea o cultură pură de agenți patogeni.
5. Sensibilitatea microbilor la acțiunea substanțelor chimice, a antibioticelor și a altor agenți antimicrobieni. Ca urmare a particularităților metabolismului bacteriilor, acestea pot avea o sensibilitate diferită la anumiți factori chimici. Se știe că stafilococii, bacili aerobi care formează spori, sunt rezistenți la acțiunea clorurii de sodiu 7,5-10%. De aceea, pentru izolarea acestor agenți patogeni se folosesc medii nutritive elective (agar-gălbenuș-sare, agar-beckoning-sare), care conțin tocmai această substanță. Alte bacterii practic nu cresc la această concentrație de clorură de sodiu.
6. Introducerea unor antibiotice (nistatina) este utilizat pentru a inhiba creșterea ciupercilor în materialul care este puternic contaminat cu acestea. În schimb, adăugarea penicilinei antibiotice în mediu favorizează creșterea florei bacteriene în cazul în care ciupercile vor fi izolate. Adăugarea furazolidonei în anumite concentrații în mediul nutritiv creează condiții selective pentru creșterea corinebacteriilor și a micrococilor.
7. Capacitatea microorganismelor de a pătrunde în pielea intactă. Unele bacterii patogene (Yersinia pestis) ca urmare a prezenței unui număr mare de enzime de agresiune, acestea sunt capabile să pătrundă în pielea intactă. Pentru a face acest lucru, părul de pe corpul unui animal de laborator este ras și materialul de testat, care conține agentul patogen și o cantitate mare de microfloră terță parte, este frecat în această zonă. După ceva timp, animalul este sacrificat, iar microbii sunt izolați din sânge sau din organele interne.
8. Sensibilitatea animalelor de laborator la agenții patogeni ai bolilor infecțioase. Unele animale prezintă o sensibilitate ridicată la diferite microorganisme.
De exemplu, cu orice metodă de administrare Streptococcus pneumoniaeșoarecii albi dezvoltă o infecție pneumococică generalizată. O imagine similară se observă atunci când cobaii sunt infectați cu agenți patogeni de tuberculoză. (Mycobacterium tuberculosis) .
În practica de zi cu zi, bacteriologii folosesc concepte precum încordareși cultură pură microorganisme. Sub tulpină înțelegeți microbii aceleiași specii, care sunt izolați din surse diferite sau din aceeași sursă, dar în momente diferite. Cultura pură de bacterii sunt microorganisme din aceeași specie, descendenți ai unei celule microbiene, care au crescut pe (în) un mediu nutritiv.
Izolarea culturii pure aerobic microorganisme constă dintr-un număr de pași.
Prima zi (cercetare 1 etapă) materialul patologic este preluat într-un recipient steril (eprubetă, balon, flacon). Se studiază - aspectul, consistența, culoarea, mirosul și alte semne, se prepară un frotiu, se pictează și se examinează la microscop. În unele cazuri (gonoree acută, ciuma), în acest stadiu este posibil să se facă un diagnostic preliminar și, în plus, să se selecteze mediul pe care va fi semănat materialul. Apoi se efectuează cu o buclă bacteriologică (folosită cel mai des), cu o spatulă - prin metoda Drygalsky, cu un tampon de tifon de bumbac. Cupele se inchid, se intorc cu susul in jos, se semneaza cu un creion special si se pun intr-un termostat la temperatura optima (37°C) timp de 18-48 ore. Scopul etapei este obținerea de colonii izolate de microorganisme.
Cu toate acestea, uneori, pentru a îngrămădi materialul, acesta este însămânțat pe medii nutritive lichide.
În a doua zi (Faza 2 a studiului) pe suprafața unui mediu nutritiv dens, microorganismele formează o creștere continuă, densă sau colonii izolate. colonia- sunt acumulări de bacterii vizibile cu ochiul liber la suprafață sau în grosimea mediului nutritiv. De regulă, fiecare colonie este formată din descendenții unei celule microbiene (clone), astfel încât compoziția lor este destul de omogenă. Caracteristicile creșterii bacteriene pe mediile nutritive sunt o manifestare a proprietăților lor culturale.
Plăcile sunt examinate cu atenție și examinate pentru colonii izolate care au crescut pe suprafața agarului. Acordați atenție dimensiunii, formei, culorii, naturii marginilor și suprafeței coloniilor, consistenței acestora și altor caracteristici. Dacă este necesar, examinați coloniile la o lupă, la microscop cu mărire mică sau mare. Structura coloniilor este examinată în lumină transmisă la o mărire mică a microscopului. Pot fi hialine, granulare, filamentoase sau fibroase, care se caracterizează prin prezența firelor împletite în grosimea coloniilor.
Caracterizarea coloniilor este o parte importantă a muncii unui bacteriolog și a unui asistent de laborator, deoarece microorganismele fiecărei specii au propriile lor colonii speciale.
In cea de-a treia zi (Etapa 3 a studiului) studiază natura creșterii unei culturi pure de microorganisme și realizează identificarea acesteia.
În primul rând, se acordă atenție caracteristicilor de creștere a microorganismelor pe mediu și se face un frotiu, colorându-l cu metoda Gram, pentru a verifica puritatea culturii. Dacă la microscop se observă bacterii cu același tip de morfologie, dimensiune și proprietăți tinctoriale (capacitate de vopsire), se ajunge la concluzia că cultura este pură. În unele cazuri, deja în aspectul și caracteristicile creșterii lor, este posibil să se tragă o concluzie despre tipul de agenți patogeni izolați. Determinarea speciilor de bacterii după caracteristicile lor morfologice se numește identificare morfologică. Determinarea tipului de agenți patogeni după caracteristicile lor culturale se numește identificare culturală.
Cu toate acestea, aceste studii nu sunt suficiente pentru a face o concluzie finală despre tipul de microbi izolați. Prin urmare, ei studiază proprietățile biochimice ale bacteriilor. Sunt destul de variate.
Identificarea bacteriilor.
Determinarea tipului de agent patogen prin proprietățile sale biochimice se numește identificarea biochimică.
Pentru a stabili apartenența la specii a bacteriilor, se studiază adesea structura lor antigenică, adică sunt identificate prin proprietăți antigenice. Fiecare microorganism are în compoziția sa diferite substanțe antigenice. În special, reprezentanții familiei Enterobacteriaceae (Yescherichia, Salmonella, Shigels) conțin înveliș O-antigen, flagel H-antigen și capsular K-antigen. Sunt eterogene în compoziția lor chimică, de aceea există în multe variante. Ele pot fi determinate folosind seruri aglutinante specifice. Această definiție a unei specii bacteriene se numește identificarea serologică.
Uneori, bacteriile sunt identificate prin infectarea animalelor de laborator cu o cultură pură și observarea modificărilor pe care agenții patogeni le produc în organism (tuberculoză, botulism, tetanos, salmoneloză și altele asemenea). O astfel de metodă se numește identificarea prin proprietăți biologice. Ca obiecte, cel mai des sunt folosiți cobai, șoareci albi și șobolani.
APLICAȚII
(tabele si diagrame)
Fiziologia bacteriilor
Schema 1. Fiziologia bacteriilor.
reproducere
cultivare pe medii nutritive
Tabelul 1. Tabelul general de fiziologie bacteriană.
|
Caracteristică |
||
|
Procesul de dobândire a energiei și a substanțelor. |
||
|
Un set de procese biochimice, în urma cărora este eliberată energia necesară activității vitale a celulelor microbiene. |
||
|
Reproducerea coordonată a tuturor componentelor și structurilor celulare, conducând în cele din urmă la o creștere a masei celulare |
||
|
reproducere |
Creșterea numărului de celule dintr-o populație |
|
|
Creșterea pe medii nutritive. |
În condiţii de laborator, microorganismele se cultivă pe medii nutritive care trebuie să fie sterile, transparente, umede, să conţină anumiţi nutrienţi (proteine, glucide, vitamine, oligoelemente etc.), să aibă o anumită capacitate de tamponare, să aibă un pH corespunzător, potenţial redox. |
Tabelul 1.1 Compoziția chimică și funcțiile fiziologice ale elementelor.
|
element de compozitie |
Caracteristici și rol în fiziologia celulară. |
||
|
Componenta principală a unei celule bacteriene, reprezentând aproximativ 80% din masa acesteia. Este într-o stare liberă sau legată de elementele structurale ale celulei. În spori, cantitatea de apă scade la 18,20%. Apa este un solvent pentru multe substanțe și joacă, de asemenea, un rol mecanic în furnizarea turgenței. În timpul plasmolizei - pierderea apei de către celulă într-o soluție hipertonică - are loc exfolierea protoplasmei din membrana celulară. Eliminarea apei din celulă, uscarea suspendă procesele de metabolism. Majoritatea microorganismelor tolerează bine uscarea. În lipsa apei, microorganismele nu se înmulțesc. Uscarea în vid din starea înghețată (liofilizare) oprește reproducerea și promovează conservarea pe termen lung a speciilor microbiene. |
|||
|
40 - 80% greutate uscată. Determinați cele mai importante proprietăți biologice ale bacteriilor și constau, de obicei, în combinații de 20 de aminoacizi. Bacteriile conțin acid diaminopimelic (DAP), care este absent în celulele umane și animale. Bacteriile conțin peste 2000 de proteine diferite care se află în componente structurale și sunt implicate în procesele metabolice. Majoritatea proteinelor au activitate enzimatică. Proteinele unei celule bacteriene determină antigenitatea și imunogenitatea, virulența și speciile de bacterii. |
|||
|
element de compozitie |
Caracteristici și rol în fiziologia celulară. |
||
|
Acizi nucleici |
Ei îndeplinesc funcții similare cu acizii nucleici ai celulelor eucariote: o moleculă de ADN sub formă de cromozom este responsabilă de ereditate, acizii ribonucleici (informații, sau matrice, transport și ribozomal) sunt implicați în biosinteza proteinelor. |
||
|
Carbohidrați |
Sunt reprezentate de substanțe simple (mono- și dizaharide) și compuși complecși. Polizaharidele se găsesc adesea în capsule. Unele polizaharide intracelulare (amidon, glicogen etc.) sunt nutrienți de rezervă. |
||
|
Ele fac parte din membrana citoplasmatică și derivații acesteia, precum și din peretele celular bacterian, de exemplu, membrana exterioară, unde, pe lângă stratul biomolecular de lipide, există LPS. Lipidele pot acționa ca nutrienți de rezervă în citoplasmă. Lipidele bacteriene sunt reprezentate de fosfolipide, acizi grași și gliceride. Mycobacterium tuberculosis conține cea mai mare cantitate de lipide (până la 40%). |
|||
|
Minerale |
Găsit în cenușă după ce celulele sunt arse. Fosfor, potasiu, sodiu, sulf, fier, calciu, magneziu, precum și oligoelemente (zinc, cupru, cobalt, bariu, mangan, etc.) sunt detectate în cantități mari. Ele sunt implicate în reglarea presiunii osmotice, a pH-ului. , potențialul redox , activarea enzimelor, fac parte din enzime, vitamine și componente structurale ale celulelor microbiene. |
||
Tabelul 1.2. Baze azotate.
Tabelul 1.2.1 Enzime
|
Caracteristică |
|||
|
Definiție |
Catalizatori proteici specifici și eficienți prezenți în toate celulele vii. |
||
|
Enzimele reduc energia de activare, asigurând fluxul unor astfel de reacții chimice care fără ele ar putea avea loc doar la temperatură ridicată, suprapresiune și în alte condiții nefiziologice care sunt inacceptabile pentru o celulă vie. |
|||
|
Enzimele măresc viteza de reacție cu aproximativ 10 ordine de mărime, ceea ce reduce timpul de înjumătățire al oricărei reacții de la 300 de ani la o secundă. |
|||
|
Enzimele „recunosc” substratul după aranjarea spațială a moleculei sale și distribuția sarcinilor în acesta. Pentru legarea de substrat, o anumită parte a moleculei de proteină enzimatică este responsabilă - centrul său catalitic. În acest caz, se formează un complex intermediar enzimă-substrat, care apoi se descompune cu formarea unui produs de reacție și a unei enzime libere. |
|||
|
Soiuri |
Enzimele reglatoare (alosterice) percep diverse semnale metabolice și, în conformitate cu acestea, își modifică activitatea catalitică. |
Enzime efectoare - enzime care catalizează anumite reacții (pentru detalii, vezi Tabelul 1.2.2.) |
|
|
activitate functionala |
Activitatea funcțională a enzimelor și viteza reacțiilor enzimatice depind de condițiile în care se află un anumit microorganism și, mai ales, de temperatura mediului și pH-ul acestuia. Pentru multe microorganisme patogene, temperatura optimă este de 37°C și pH-ul 7,2-7,4. |
||
CLASELE DE ENZIME:
microorganismele sintetizează diverse enzime aparținând tuturor celor șase clase cunoscute.
Tabelul 1.2.2. Clase de enzime efectoare
|
Clasa de enzime |
Cataliza: |
|
|
Oxidorreductaza |
Transferul de electroni |
|
|
Transferaze |
Transferul diferitelor grupe chimice |
|
|
Hidrolazele |
Transferul grupărilor funcționale la o moleculă de apă |
|
|
Atașarea grupărilor duble legături și reacții inverse |
||
|
Izomeraze |
Transfer de grupări în cadrul unei molecule pentru a forma forme izomerice |
|
|
Formarea legăturilor C-C, C-S, C-O, C-N datorită reacțiilor de condensare asociate cu descompunerea adenozin trifosfatului (ATP) |
Tabelul 1.2.3. Tipuri de enzime prin formare într-o celulă bacteriană
|
Caracteristică |
Note |
||
|
iducibil (adaptabil) enzime "inductie de substrat" |
Enzime, a căror concentrație în celulă crește brusc ca răspuns la apariția unui substrat inductor în mediu. Sintetizată de o celulă bacteriană numai în prezența acestei enzime în mediul substrat | ||
|
Enzime represibile |
Sinteza acestor enzime este suprimată ca urmare a acumulării excesive a produsului reacției catalizate de această enzimă. |
Un exemplu de represiune enzimatică este sinteza triptofanului, care este format din acid antranilic cu participarea antranilat sintetazei. |
|
|
Enzime constitutive |
Enzime sintetizate indiferent de condițiile de mediu |
Enzime de glicoliză |
|
|
Complexe multienzimatice |
Enzimele intracelulare combinate structural și funcțional |
Enzime ale lanțului respirator situate pe membrana citoplasmatică. |
Tabelul 1.2.4. Enzime specifice
|
Enzime |
Identificarea bacteriilor |
|
|
Superoxid dismutază și catalază |
Toți aerobii sau anaerobii facultativi posedă superoxid dismutază și catalază, enzime care protejează celula de produșii toxici ai metabolismului oxigenului. Aproape toți anaerobii obligați nu sintetizează aceste enzime. Doar un grup de bacterii aerobe, bacteriile lactice, sunt catalaze negative. |
|
|
Peroxidaza |
Bacteriile lactice acumulează peroxidaza, enzimă care catalizează oxidarea compuşilor organici sub acţiunea H2O2 (se reduce în apă). |
|
|
Arginina dihidrolază |
O caracteristică diagnostică care distinge speciile saprofite de Pseudomonas de cele fitopatogenice. |
|
|
Dintre cele cinci grupuri principale ale familiei Enterobacteriaceae, doar două - Escherichiae și Erwiniae - nu sintetizează ureaza. |
Tabelul 1.2.5. Utilizarea enzimelor bacteriene în microbiologia industrială.
|
Enzime |
Aplicație |
|
|
Amilază, celulază, protează, lipază |
Pentru a îmbunătăți digestia, se folosesc preparate gata preparate din enzime, care facilitează hidroliza amidonului, celulozei, proteinelor și, respectiv, lipidelor. |
|
|
Invertază de drojdie |
În fabricarea dulciurilor pentru a preveni cristalizarea zaharozei |
|
|
pectinaza |
Folosit pentru a clarifica sucurile de fructe |
|
|
Colagenaza clostridiană și streptokinaza streptococică |
Hidrolizează proteinele, promovează vindecarea rănilor și a arsurilor |
|
|
Enzime litice ale bacteriilor |
Secretate în mediu, acționează asupra pereților celulari ai microorganismelor patogene și servesc ca un instrument eficient în lupta împotriva acestora din urmă, chiar dacă au rezistență multiplă la antibiotice. |
|
|
Ribonucleaze, dezoxiribonucleaze, polimeraze, ADN ligaze și alte enzime care modifică acizii nucleici într-o manieră țintită |
Folosit ca set de instrumente în chimia bioorganică, inginerie genetică și terapia genică |
Tabelul 1.2.6. Clasificarea enzimelor după localizare.
|
Localizare | |||
|
Endoenzime |
în citoplasmă în membrana citoplasmatică În spațiul periplasmatic |
Ele funcționează numai în interiorul celulei. Ele catalizează reacțiile de biosinteză și metabolismul energetic. |
|
|
Exoenzime |
Eliberat în mediu. |
Ele sunt eliberate de celulă în mediu și catalizează reacțiile de hidroliză a compușilor organici complecși în compuși mai simpli, disponibili pentru asimilarea de către celula microbiană. Printre acestea se numără enzimele hidrolitice, care joacă un rol extrem de important în nutriția microorganismelor. |
Tabelul 1.2.7. Enzime ale microbilor patogeni (enzime de agresiune)
|
Enzime | |||
|
Lecitovitellaza Lecitinaza |
Rupe membranele celulare |
Inocularea materialului de testat pe mediul nutritiv JSA Rezultat: zonă tulbure din jurul coloniilor pe LSA. |
|
|
Hemolizină |
Distruge celulele roșii din sânge |
Inocularea materialului de testat pe un mediu nutritiv cu agar sânge. Rezultat: zonă completă de hemoliză în jurul coloniilor pe agar-sânge. |
|
|
Culturi coagulazo-pozitive |
Determină coagularea plasmei sanguine |
Inocularea materialului de testat pe plasma sanguină citrată sterilă. Rezultat: coagularea plasmei |
|
|
Culturi coagulazo-negative |
Producția de manitol |
Semănat pe un mediu nutritiv manitol în condiții anaerobe. Rezultat: Apariția coloniilor colorate (în culoarea indicatorului) |
|
|
Enzime |
Formarea unor enzime în laborator |
||
|
Hialuronidază |
Hidrolizează acidul hialuronic - componenta principală a țesutului conjunctiv |
Semănatul materialului de testat pe un mediu nutritiv care conține acid hialuronic. Rezultat: în eprubetele care conțin hialuronidază nu se formează cheaguri. |
|
|
Neuraminidaza |
Desprinde acidul sialic (neuraminic) din diverse glicoproteine, glicolipide, polizaharide, crescând permeabilitatea diferitelor țesuturi. |
Detectare: reactie pentru determinarea anticorpilor la neuraminidaza (RINA) si altele (imunodifuzie, imunoenzima si metode radioimune). |
Tabelul 1.2.8. Clasificarea enzimelor în funcție de proprietățile biochimice.
|
Enzime |
Detectare |
||
|
zaharolitic |
Defalcarea zaharurilor |
Medii de diagnostic diferențial, cum ar fi mediul Hiss, mediul Olkenitsky, mediul Endo, mediul Levin, mediul Ploskirev. |
|
|
Proteolitic |
Defalcarea proteinelor |
Microbii sunt inoculați prin injectare într-o coloană de gelatină, iar după 3-5 zile de incubare la temperatura camerei se remarcă caracterul lichefierii gelatinei. Activitatea proteolitică este determinată și de formarea produselor de descompunere a proteinelor: indol, hidrogen sulfurat, amoniac. Pentru determinarea lor, microorganismele sunt inoculate în bulion de carne-peptonă. |
|
|
Enzime identificate prin produsele finite |
Formarea alcaline Formarea acidului Formarea hidrogenului sulfurat Formarea amoniacului etc. |
Pentru a distinge unele tipuri de bacterii de altele pe baza activității lor enzimatice, medii de diagnostic diferenţial |
Schema 1.2.8. Compoziția enzimatică.
COMPOZIȚIA ENZIMICĂ A ORICE MICROORGANISM:
Determinată de genomul său
Este o caracteristică stabilă
Folosit pe scară largă pentru identificarea lor
Determinarea proprietăților zaharolitice, proteolitice și a altor proprietăți.
Tabelul 1.3. Pigmenti
|
Pigmenti |
Sinteza de către un microorganism |
|
|
Pigmenți carotenoizi liposolubili în roșu, portocaliu sau galben |
Ele formează sarcine, mycobacterium tuberculosis, unele actinomicete. Acești pigmenți îi protejează de razele UV. |
|
|
Pigmenți negri sau maro - melanine |
Sintetizată de anaerobi obligați Bacteroides niger și altele.Insolubil în apă și chiar în acizi puternici |
|
|
Un pigment pirolic roșu strălucitor, prodigiozină |
Formată din nişte serţiuni |
|
|
Pigmentul fenozin solubil în apă este piocianina. |
Produs de bacteria Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). În acest caz, mediul nutritiv cu pH neutru sau alcalin devine albastru-verde. |
Tabelul 1.4. Microorganisme luminoase și producătoare de aromă
|
Condiție și caracteristică |
||
|
Strălucire (luminiscență) |
Bacteriile provoacă strălucirea acelor substraturi, cum ar fi solzi de pește, ciuperci superioare, copaci în descompunere, produse alimentare, pe suprafața cărora se înmulțesc. Majoritatea bacteriilor luminoase sunt specii halofile care se pot multiplica la concentrații ridicate de sare. Ei trăiesc în mări și oceane și rareori în apă dulce. Toate bacteriile luminoase sunt aerobe. Mecanismul de strălucire este asociat cu eliberarea de energie în procesul de oxidare biologică a substratului. |
|
|
formarea aromei |
Unele microorganisme produc substanțe aromatice volatile, cum ar fi esterii acetic-etil și acetic-amil, care conferă aromă vinului, berii, acidului lactic și altor produse alimentare, drept urmare sunt utilizate în producerea lor. |
Tabelul 2.1.1 Metabolism
|
Definiție |
|||
|
Metabolism |
Procesele biochimice care au loc în celulă sunt unite într-un singur cuvânt - metabolism (metabol greacă - transformare). Acest termen este echivalent cu conceptul de „metabolism și energie”. Există două aspecte ale metabolismului: anabolism și catabolism. |
||
|
Anabolism - un set de reacții biochimice care realizează sinteza componentelor celulare, adică acea parte a metabolismului, care se numește metabolism constructiv. |
Catabolismul este un set de reacții care furnizează celulei energia necesară, în special, pentru reacțiile de schimb constructiv. Prin urmare, catabolismul este definit și ca metabolismul energetic al celulei. |
||
|
amfibolism |
Metabolismul intermediar, care transformă fragmentele de nutrienți cu greutate moleculară mică într-o serie de acizi organici și esteri fosforici, se numește |
||
Schema 2.1.1. Metabolism
METABOLISM -
o combinație a două procese opuse, dar care interacționează: catabolismul și anabolismul
Anabolism= asimilare = metabolism plastic = metabolism constructiv
catabolism= disimilare = metabolism energetic = dezintegrare = asigurarea celulei cu energie
Sinteză (componente celulare)
Reacții catabolice enzimatice care au ca rezultat eliberare de energie, care s-a acumulat în moleculele de ATP.
Biosinteza monomerilor:
aminoacizi nucleotide monozaharide acizi grași
Biosinteza polimerilor:
proteine acizi nucleici polizaharide lipide
Ca urmare a reacțiilor anabolice enzimatice, energia eliberată în procesul de catabolism este cheltuită pentru sinteza de macromolecule de compuși organici, din care sunt apoi montați biopolimeri - componente ale celulei microbiene.
Energia este cheltuită pentru sinteza componentelor celulare
Tabelul 2.1.3. Metabolismul și transformarea energiei celulare.
|
Metabolism |
Caracteristică |
Note |
|
|
Metabolismul asigură un echilibru dinamic inerent unui organism viu ca sistem, în care sinteza și distrugerea, reproducerea și moartea sunt echilibrate reciproc. |
Metabolismul este principalul semn al vieții |
||
|
schimb plastic Sinteza proteinelor, grăsimilor, carbohidraților. |
Acesta este un set de reacții de sinteză biologică. |
Din substanțele care intră în celulă din exterior, se formează molecule asemănătoare compușilor celulari, adică are loc asimilarea. |
|
|
schimb de energie |
Procesul este opusul sintezei. Acesta este un set de reacții de clivaj. |
Când compușii cu molecule înalte sunt scindați, energia necesară reacției de biosinteză este eliberată, adică are loc disimilarea. În timpul descompunerii glucozei, energia este eliberată în etape, cu participarea unui număr de enzime. |
Tabelul 2.1.2. Diferența de metabolism pentru identificare.
Tabelul 2.2 Anabolism (metabolism constructiv)
Schema 2.2.2. Biosinteza aminoacizilor la procariote.
Schema 2.2.1. Biosinteza carbohidraților în microorganisme.
Figura 2.2.3. Biosinteza lipidelor
Tabelul 2.2.4. Etape ale metabolismului energetic - Catabolism.
|
Etape |
Caracteristică |
Notă |
|
|
pregătitoare |
Molecule de dizaharide și polizaharide, proteinele se descompun în molecule mici - glucoză, glicerol și acizi grași, aminoacizi. Molecule mari de acizi nucleici în nucleotide. |
În această etapă, se eliberează o cantitate mică de energie, care este disipată sub formă de căldură. |
|
|
Anoxic sau incomplet sau anaerob sau fermentație sau disimilare. |
Substanțele formate în această etapă cu participarea enzimelor suferă o scindare suplimentară. De exemplu: glucoza se descompune în două molecule de acid lactic și două molecule de ATP. |
ATP și H3PO4 sunt implicate în descompunerea glucozei. În timpul descompunerii fără oxigen a glucozei sub forma unei legături chimice, 40% din energie este stocată în molecula ATP, restul este disipată sub formă de căldură. În toate cazurile, descompunerea unei molecule de glucoză produce două molecule de ATP. |
|
|
Stadiul respirației aerobe sau divizării oxigenului. |
Când oxigenul pătrunde în celulă, substanțele formate în etapa anterioară sunt oxidate (descompuse) în produse finite. CO 2 șiH 2 O. |
Ecuația totală a respirației aerobe:
|
Schema 2.2.4. Fermentaţie.
Metabolismul fermentativ - caracterizată prin formarea de ATP prin fosforilarea substraturilor.
Prima (oxidare) = scindare
A doua (recuperare)
Include conversia glucozei în acid piruvic.
Include utilizarea hidrogenului pentru recuperarea acidului piruvic.
Căi de formare a acidului piruvic din carbohidrați
Schema 2.2.5. acid piruvic.
Calea glicolitică (calea Embden-Meyerhof-Parnassus)
Calea Entner-Doudoroff
Calea pentozo-fosfatului
Tabelul 2.2.5. Fermentaţie.
|
Tipul de fermentație |
Reprezentanți |
Produs final |
Note |
|
|
acid lactic |
|
Formează acid lactic din piruvat |
În unele cazuri (fermentația homoenzimatică) se formează doar acid lactic, în altele și produse secundare. |
|
|
Acid formic |
Enterobacteriaceae |
Acidul formic este unul dintre produsele finale. (împreună cu ea - lateral) |
Unele tipuri de enterobacterii descompun acidul formic în H 2 și CO 2 / |
|
|
butiric |
Acid butiric și produse secundare |
Unele specii de clostridii, împreună cu acizi butiric și alți acizi, formează butanol, acetonă etc. (atunci se numește fermentație acetonă-butil). |
||
|
acid propionic |
Propionobacteria |
Formează acid propionic din piruvat |
Multe bacterii, la fermentarea carbohidraților, împreună cu alte produse, formează alcool etilic. Cu toate acestea, nu este produsul principal. |
Tabelul 2.3.1. Sistem de sinteză a proteinelor, schimb ionic.
|
Numele elementului |
Caracteristică |
|
|
Subunitățile ribozomale 30S și 50S |
În cazul ribozomilor bacterieni, subunitatea 70S conține ARNr-ul 50S (~3000 nucleotide lungime) iar subunitatea 30S conține ARNr 16S (~1500 nucleotide lungime); o subunitate ribozomală mare, pe lângă un ARNr „lung”, conține și unul sau două ARNr „scurte” (ARNr 5S al subunităților ribozomale bacteriene 50S sau 5S și ARNr 5,8S al subunităților ribozomale mari eucariote). (pentru detalii vezi Fig. 2.3.1.) |
|
|
ARN mesager (ARNm) | ||
|
Un set complet de douăzeci de aminoacil-ARNt care necesită aminoacizi corespunzători, aminoacil-ARNt sintetaze, tARN și ATP pentru a se forma |
Este un aminoacid încărcat cu energie și asociat cu ARNt, gata pentru livrare la ribozom și încorporare în polipeptida sintetizată pe acesta. |
|
|
Transfer ARN (ARNt) |
Acid ribonucleic, a cărui funcție este de a transporta aminoacizi la locul de sinteză a proteinelor. |
|
|
Factori de inițiere ai proteinelor |
(la procariote - IF-1, IF-2, IF-3) Și-au primit numele deoarece sunt implicați în organizarea complexului activ (complexul 708) al subunităților 30S și 50S, ARNm și inițiatorul aminoacil-ARNt ( la procariote - formilmetionil-ARNt), care „începe” (inițiază) activitatea ribozomilor - traducerea ARNm. |
|
|
Factori de alungire a proteinelor |
(la procariote - EF-Tu, EF-Ts, EF-G) Participa la alungirea (alungirea) lanțului polipeptidic sintetizat (peptidil). Factorii de terminare a proteinei sau de eliberare (ing. - factori de eliberare - RF) asigură separarea specifică codonului a polipeptidei de ribozom și sfârșitul sintezei proteinelor. |
|
|
Numele elementului |
Caracteristică |
|
|
Factori de terminare a proteinei |
(pentru procariote - RF-1, RF-2, RF-3) |
|
|
Alți factori proteici (asocieri, disocieri de subunități, eliberări etc.). |
Factori de translație a proteinelor necesari pentru funcționarea sistemului |
|
|
Guanozin trifosfat (GTP) |
Pentru implementarea traducerii, este necesară participarea GTP. Necesitatea sistemului de sinteză a proteinelor pentru GTP este foarte specifică: acesta nu poate fi înlocuit cu niciunul dintre ceilalți trifosfați. Celula cheltuiește mai multă energie pe biosinteza proteinelor decât pe sinteza oricărui alt biopolimer. Formarea fiecărei noi legături peptidice necesită scindarea a patru legături de înaltă energie (ATP și GTP): două pentru a încărca molecula de ARNt cu un aminoacid și încă două în timpul alungirii - una în timpul legării aa-ARNt și cealaltă în timpul translocării . |
|
|
Cationi anorganici într-o anumită concentrație. |
Pentru a menține pH-ul sistemului în limite fiziologice. Ionii de amoniu sunt folosiți de unele bacterii pentru a sintetiza aminoacizi, ionii de potasiu sunt folosiți pentru a lega tARN de ribozomi. Ionii de fier și magneziu acționează ca un cofactor într-o serie de procese enzimatice |
Figura 2.3.1. Reprezentarea schematică a structurilor ribozomilor procarioți și eucarioți.
Tabelul 2.3.2. Caracteristicile schimbului de ioni în bacterii.
|
Particularitate |
Caracterizat de: |
||
|
presiune osmotică ridicată |
Datorită concentrației intracelulare semnificative a ionilor de potasiu în bacterii, se menține o presiune osmotică ridicată. |
||
|
aportul de fier |
Pentru o serie de bacterii patogene și oportuniste (Escherichia, Shigella etc.), consumul de fier în organismul gazdă este dificil din cauza insolubilității sale la valori ale pH-ului neutru și ușor alcalin. |
Siderofori - substante speciale care, prin legarea fierului, il fac solubil si transportabil. |
|
|
Asimilare |
Bacteriile asimilează activ anionii SO2/ și P034+ din mediu pentru a sintetiza compuși care conțin aceste elemente (aminoacizi care conțin sulf, fosfolipide etc.). |
||
|
Pentru creșterea și reproducerea bacteriilor sunt necesari compuși minerali - ioni NH4 +, K +, Mg2 + etc. (pentru mai multe detalii, vezi Tabelul 2.3.1.) |
|||
Tabelul 2.3.3. Schimb de ioni
|
Denumirea compușilor minerali |
Funcţie |
|
|
NH 4 + (ioni de amoniu) |
Folosit de unele bacterii pentru a sintetiza aminoacizi |
|
|
K+ (ioni de potasiu) |
Folosit pentru a lega tARN de ribozomi Menține presiunea osmotică ridicată |
|
|
Fe 2+ (ioni de fier) |
Acționează ca cofactori într-un număr de procese enzimatice Ele fac parte din citocromi și alte hemoproteine |
|
|
Mg 2+ (ioni de magneziu) |
||
|
SO 4 2 - (anion sulfat) |
Necesar pentru sinteza compușilor care conțin aceste elemente (aminoacizi care conțin sulf, fosfolipide etc.) |
|
|
PO 4 3- (anion fosfat) |
Schema 2.4.1. metabolismul energetic.
Pentru a sintetiza, bacteriile au nevoie de...
Nutrienți
Tabelul 2.4.1. Metabolismul energetic (oxidarea biologică).
|
Proces |
Necesar: |
|
|
Sinteza componentelor structurale ale unei celule microbiene și menținerea proceselor vitale |
Cantitate suficientă de energie. Această nevoie este satisfăcută de oxidarea biologică, care are ca rezultat sinteza moleculelor de ATP. |
|
|
Energie (ATP) |
Bacteriile de fier primesc energia eliberată în timpul oxidării directe a fierului (Fe2+ la Fe3+), care este folosită pentru fixarea CO2, bacteriile metabolizatoare de sulf își asigură energie datorită oxidării compușilor care conțin sulf. Cu toate acestea, marea majoritate a procariotelor obțin energie prin dehidrogenare. Energia este primită și în procesul de respirație (pentru un tabel detaliat, consultați secțiunea corespunzătoare). |
Schema 2.4. Oxidarea biologică la procariote.
Descompunerea polimerilor în monomeri
Carbohidrați
glicerina și acizii grași
aminoacizi
monozaharide
Clivaj în condiții anoxice
Formarea intermediarilor
Oxidarea în condiții de oxigen la produsele finite
Tabelul 2.4.2. metabolismul energetic.
|
concept |
Caracteristică |
|
|
Esența metabolismului energetic |
Furnizarea energiei celulelor necesare manifestării vieții. |
|
|
Molecula de ATP este sintetizată ca urmare a transferului unui electron de la donorul său primar la acceptorul final. |
||
|
Respirația este oxidare biologică (divizare). În funcție de care este acceptorul final de electroni, există suflare: Aerob - în timpul respirației aerobe, oxigenul molecular O 2 servește ca acceptor final de electroni. Compușii anaerobi - anorganici servesc ca acceptor final de electroni: NO 3 -, SO 3 -, SO 4 2- |
||
|
Mobilizarea energiei |
Energia este mobilizată în reacții de oxidare și reducere. |
|
|
Reacția de oxidare |
Capacitatea unei substanțe de a dona electroni (de a fi oxidată) |
|
|
Reacția de recuperare |
Capacitatea unei substanțe de a accepta electroni. |
|
|
Potential redox |
Capacitatea unei substanțe de a dona (oxida) sau de a accepta (recuperare) electroni. (expresie cantitativă) |
Schema 2.5. Sinteză.
carbohidrați
Tabelul 2.5.1. Sinteză
Tabelul 2.5.1. Sinteză
|
Biosinteza |
Din ce |
Note |
|
|
biosinteza carbohidraților |
Autotrofii sintetizează glucoza din CO2. Heterotrofei sintetizează glucoza din compuși care conțin carbon. |
Ciclul Calvin (vezi diagrama 2.2.1.) |
|
|
Biosinteza aminoacizilor |
Majoritatea procariotelor sunt capabile să sintetizeze toți aminoacizii din: piruvat α-cetoglutorat fumorate |
Sursa de energie este ATP. Piruvatul se formează în ciclul glicolitic. Microorganisme auxotrofe - se consuma gata preparate in organismul gazda. |
|
|
Biosinteza lipidelor |
Lipidele sunt sintetizate din compuși mai simpli - produse ale metabolismului proteinelor și carbohidraților. |
Proteinele purtătoare de acetil joacă un rol important. Microorganisme auxotrofe - se consuma gata preparate in organismul gazda sau din medii nutritive. |
Tabelul 2.5.2. Principalele etape ale biosintezei proteinelor.
|
Etape |
Caracteristică |
Note |
|
|
Transcriere |
Procesul de sinteză a ARN-ului pe gene. Acesta este procesul de rescriere a informațiilor de la ADN - genă la mARN - genă. |
Se realizează cu ajutorul ADN - ARN - polimerazei dependente. Transferul de informații despre structura proteinei către ribozomi are loc cu ajutorul ARNm. |
|
|
Difuzare (transmisie) |
Procesul de biosinteză a proteinelor. Procesul de descifrare a codului genetic în ARNm și implementarea acestuia sub forma unui lanț polipeptidic. |
Deoarece fiecare codon conține trei nucleotide, același text genetic poate fi citit în trei moduri diferite (începând de la prima, a doua și a treia nucleotide), adică în trei cadre de citire diferite. |
Notă la tabel: Structura primară a fiecărei proteine este secvența de aminoacizi din ea.
Schema 2.5.2. Lanțuri de transfer de electroni de la donorul primar de hidrogen (electroni) la acceptorul său final O 2 .
materie organică
(donator primar de electroni)
Flavoproteină (- 0,20)
Chinonă (-0,07)
Citocrom (+0,01)
Citocromul C (+0,22)
Citocromul A (+0,34)
acceptor final
Tabelul 3.1. Clasificarea organismelor pe tipuri de nutriție.
|
Element organogen |
Tipuri de alimente |
Caracteristică |
|
|
Carbon (C) |
Autotrofi |
Ei înșiși sintetizează toate componentele celulei care conțin carbon din CO2. |
|
|
Heterotrofe |
Ei nu își pot satisface nevoile în detrimentul CO 2, folosesc compuși organici gata preparati. |
||
|
Saprofite |
Sursă de hrană - substraturi organice moarte. |
||
|
Sursa de nutriție este țesuturile vii ale animalelor și plantelor. |
|||
|
Prototrofe |
Satisface-le nevoile cu azot atmosferic și mineral |
||
|
Auxotrofe |
Au nevoie de compuși azotați organici gata preparati. |
||
|
Hidrogen (H) |
Sursa principală este H2O |
||
|
Oxigen (O) |
|||
Tabelul 3.1.2. Transformarea energiei
Tabelul 3.1.3. Modalități de alimentare cu carbon
|
Sursa de energie |
Donator de electroni |
Mod de alimentare cu carbon |
|
|
Energia luminii solare |
compuși anorganici |
Fotolitoheterotrofe |
|
|
compusi organici |
Fotoorganoheterotrofe |
||
|
Reacții redox |
compuși anorganici |
Chemolitoheterotrofe |
|
|
compusi organici |
Chimioorganoheterotrofe |
Tabelul 3.2. Mecanisme de putere:
|
Mecanism |
Condiții |
gradient de concentrație |
Costurile energiei |
Specificitatea substratului |
|
|
difuzie pasiva |
Concentrația de nutrienți din mediu depășește concentrația din celulă. |
De-a lungul gradientului de concentrație | |||
|
Difuzare facilitată |
Proteinele permeazei sunt implicate. |
De-a lungul gradientului de concentrație | |||
|
transport activ |
Proteinele permeazei sunt implicate. | ||||
|
Translocarea grupelor chimice |
În procesul de transfer, are loc modificarea chimică a nutrienților. |
Față de gradientul de concentrație |
Tabelul 3.3. transportul nutrienților din celula bacteriană.
|
Nume |
Caracteristică |
|
|
Reacția fosfotransferazei |
Apare atunci când o moleculă transferată este fosforilată. |
|
|
Secreție translațională |
În acest caz, moleculele sintetizate trebuie să aibă o secvență principală specifică de aminoacizi pentru a se atașa de membrană și a forma un canal prin care moleculele de proteine pot scăpa în mediu. Astfel, toxinele tetanice, difteria și alte molecule părăsesc celulele bacteriilor corespunzătoare. |
|
|
Inmugurire membranara |
Moleculele formate în celulă sunt înconjurate de o veziculă membranară, care este atașată în mediu. |
Tabelul 4. Înălțimea.
|
concept |
Definirea conceptului. |
|
|
Creșterea ireversibilă a cantității de materie vie, cel mai adesea din cauza diviziunii celulare. Dacă în organismele multicelulare se observă de obicei o creștere a dimensiunii corpului, atunci în organismele multicelulare numărul de celule crește. Dar chiar și în bacterii ar trebui să se distingă o creștere a numărului de celule și o creștere a masei celulare. |
||
|
Factori care afectează creșterea bacteriilor in vitro. |
Mijloace de cultură: Mycobacterium leprae nu poate fi utilizat in vitro Temperatura (creștere în interval): Bacteriile mezofile (20-40 o C) Bacteriile termofile (50-60 o C) Psihofil (0-10 o C) |
|
|
Evaluarea creșterii bacteriene |
Cuantificarea creșterii se realizează de obicei în medii lichide, unde bacteriile în creștere formează o suspensie omogenă. Creșterea numărului de celule se determină prin determinarea concentrației de bacterii în 1 ml, sau creșterea masei celulare se determină în unități de greutate pe unitate de volum. |
factori de crestere
Aminoacizi
vitamine
Baze azotate
Tabelul 4.1. factori de crestere
|
factori de crestere |
Caracteristică |
Funcţie |
||
|
Aminoacizi |
|
Multe microorganisme, în special bacteriile, au nevoie de anumiți aminoacizi (unul sau mai mulți) deoarece nu îi pot sintetiza singure. Astfel de microorganisme sunt numite auxotrofe pentru acei aminoacizi sau alți compuși pe care nu sunt în măsură să-i sintetizeze. |
||
|
Baze purinice și derivații acestora |
Nucleotide: |
Sunt factori de creștere a bacteriilor. Unele tipuri de micoplasme necesită nucleotide. Necesar pentru construirea acizilor nucleici. |
||
|
Baze pirimidinice și derivații acestora |
Nucleotide |
|||
|
factori de crestere |
Caracteristică |
Funcţie |
||
|
Lipide neutre |
Ele fac parte din lipidele membranare |
|||
|
Fosfolipide |
||||
|
Acid gras |
Sunt componente ale fosfolipidelor |
|||
|
Glicolipidele |
Micoplasmele fac parte din membrana citoplasmatică |
|||
|
vitamine (în principal grupa B) |
Tiamina (B1) |
Staphylococcus aureus, pneumococ, brucella |
||
|
Acid nicotinic (B3) |
Toate tipurile de bacterii în formă de tijă |
|||
|
Acid folic (B9) |
Bifidobacterii și acid propionic |
|||
|
Acid pantotenic (B5) |
Unele tipuri de streptococi, bacili tetanici |
|||
|
Biotină (B7) |
Drojdii și bacterii fixatoare de azot Rhizobium |
|||
|
Hemii sunt componente ale citocromilor |
Bacteria Hemophilus, Mycobacterium tuberculosis |
|||
Tabelul 5. Respirația.
|
Nume |
Caracteristică |
|
|
Oxidare biologică (reacții enzimatice) |
||
|
Baza |
Respirația se bazează pe reacții redox care merg odată cu formarea ATP - un acumulator universal de energie chimică. |
|
|
Procese |
În timpul respirației au loc următoarele procese: Oxidarea este donarea de hidrogen sau electroni de către donatori. Recuperarea este adăugarea de hidrogen sau electroni la un acceptor. |
|
|
Respirație aerobică |
Acceptorul final al hidrogenului sau electronilor este oxigenul molecular. |
|
|
Respirația anaerobă |
Un acceptor de hidrogen sau electroni este un compus anorganic - NO 3 -, SO 4 2-, SO 3 2-. |
|
|
Fermentaţie |
Acceptorul hidrogenului sau electronilor sunt compuși organici. |
Tabelul 5.1. Clasificarea după tipul de respirație.
|
bacterii |
Caracteristică |
Note |
|
|
Anaerobi stricti |
Schimbul de energie are loc fără participarea oxigenului liber. Sinteza ATP în timpul consumului de glucoză în condiții anaerobe (glicoliză) are loc datorită fosforilării substratului. Oxigenul pentru anaerobi nu servește ca acceptor final de electroni. Mai mult, oxigenul molecular are un efect toxic asupra lor. |
anaerobilor stricti le lipsește enzima catalaza, prin urmare, acumularea în prezența oxigenului are un efect bactericid asupra lor; Anaerobii stricti le lipsește un sistem de reglare a potențialului redox (potențial redox). |
|
|
Aerobi stricti |
Capabil să primească energie doar prin respirație și, prin urmare, are nevoie în mod necesar de oxigen molecular. Organisme care obțin energie și formează ATP cu ajutorul doar fosforilării oxidative a substratului, unde doar oxigenul molecular poate acționa ca agent oxidant. Creșterea majorității bacteriilor aerobe se oprește la o concentrație de oxigen de 40-50% sau mai mult. |
Aerobii stricti includ, de exemplu, reprezentanți ai genului Pseudomonas |
|
|
bacterii |
Caracteristică |
Note |
|
|
Anaerobi facultativi |
Crește în prezența sau absența oxigenului molecular Organismele aerobe conțin cel mai adesea trei citocromi, anaerobi facultativi - unul sau doi, anaerobii obligați nu conțin citocromi. |
Anaerobii facultativi includ enterobacterii și multe drojdii care pot trece de la respirație în prezența 0 2 la fermentație în absența 0 2 . |
|
|
microaerofile |
Un microorganism care, spre deosebire de anaerobii stricti, necesită prezența oxigenului în atmosferă sau mediu nutritiv pentru creșterea sa, dar în concentrații mai mici în comparație cu conținutul de oxigen din aerul obișnuit sau din țesuturile normale ale organismului gazdă (spre deosebire de aerobii, care necesită normal oxigen pentru creştere).conţinutul de oxigen din atmosferă sau mediu nutritiv). Mulți microaerofili sunt și capnofili, ceea ce înseamnă că necesită o concentrație crescută de dioxid de carbon. |
În laborator, astfel de organisme sunt ușor de cultivat într-un „borcan cu lumânări”. Un „borcan cu lumânări” este un recipient în care se aduce o lumânare aprinsă înainte de a fi sigilată cu un capac ermetic. Flacăra lumânării va arde până când se stinge din lipsă de oxigen, rezultând o atmosferă saturată cu dioxid de carbon și redusă în oxigen în borcan. |
Tabelul 6. Caracteristici ale reproducerii.
Schema 6. Dependenţa duratei generaţiei de diverşi factori.
Durata generației
Tip de bacterii
populatie
Temperatura
Compoziția mediului nutritiv
Tabelul 6.1. fazele reproducerii bacteriene.
|
Fază |
Caracteristică |
|
|
Faza staționară inițială |
Durează 1-2 ore. În această fază, numărul de celule bacteriene nu crește. |
|
|
Faza de întârziere (faza de întârziere a reproducerii) |
Se caracterizează prin începutul creșterii celulare intensive, dar rata diviziunii lor rămâne scăzută. |
|
|
Faza logaritmica (logaritmica) |
Diferă prin rata maximă de reproducere celulară și o creștere exponențială a numărului de populații bacteriene |
|
|
Faza de accelerare negativă |
Se caracterizează prin activitate mai mică a celulelor bacteriene și prelungirea perioadei de generație. Acest lucru are loc ca urmare a epuizării mediului nutritiv, a acumulării de produse metabolice în acesta și a deficienței de oxigen. |
|
|
Faza stationara |
Se caracterizează printr-un echilibru între numărul de celule moarte, nou formate și latente. |
|
|
Faza de doom |
Are loc cu o rată constantă și este înlocuită cu fazele UP-VSH de scădere a ratei de moarte celulară. |
Schema 7. Cerințe pentru mediile nutritive.
Cerințe
Viscozitate
Umiditate
Sterilitate
Nutriție 
Transparenţă
izotonicitate
Tabelul 7. Reproducerea bacteriilor pe medii nutritive.
|
Mediu nutritiv |
Caracteristică |
||
|
Mediu de cultură dens |
Pe medii nutritive dense, bacteriile formează colonii - grupuri de celule. |
||
|
S- un fel(neted - neted și strălucitor) Rotund, cu marginea netedă, netedă, convexă. |
R- un fel(aspru - aspru, inegal) Formă neregulată cu margini zimțate, aspre, crestat. |
||
|
Medii de cultură lichide |
Creștere inferioară (sediment) Creștere la suprafață (film) Creștere difuză (turbiditate uniformă) |
||
Tabelul 7.1. Clasificarea mediilor nutritive.
|
Clasificare |
feluri |
Exemple |
|
|
Compoziţie |
MPA - meat-peptone agar MPB - bulion de carne-peptonă PV - apă peptonă |
||
|
agar cu sânge JSA - agar gălbenuș-sare Şuierat media |
|||
|
Cu programare |
Principal | ||
|
electivă |
agar alcalin Apă peptonă alcalină |
||
|
Diferenţial - diagnostic |
|
||
|
Special |
Wilson-Blair Kitta-Tarozzi Bulion de tioglicol Lapte conform lui Tukaev |
||
|
Prin consecvență |
agar cu sânge agar alcalin |
||
|
semi-lichid |
Agar semi-lichid |
||
|
Origine |
natural | ||
|
Semi sintetic | |||
|
Sintetic |
|
Tabelul 7.2. Principiile izolării culturilor celulare pure.
|
Principiul mecanic |
principiul biologic |
|
1. Diluții fracționate de L. Pasteur 2. Diluții în plăci de R. Koch 3. Culturile de suprafață ale lui Drigalsky 4. Cursuri de suprafață |
A lua în considerare: a - tip de respirație (metoda Fortner); b - mobilitate (metoda Shukevich); c - rezistenta la acizi; d - formarea sporilor; e - temperatura optima; e - sensibilitatea selectivă a animalelor de laborator la bacterii |
Tabelul 7.2.1. Etapele izolării culturii celulare pure.
|
Etapă |
Caracteristică |
|
|
1 etapă de cercetare |
Luați material patologic. Se studiază - aspectul, consistența, culoarea, mirosul și alte semne, se prepară un frotiu, se pictează și se examinează la microscop. |
|
|
Stadiul 2 de cercetare |
Pe suprafața unui mediu nutritiv dens, microorganismele formează o creștere continuă, densă sau colonii izolate. colonia- sunt acumulări de bacterii vizibile cu ochiul liber la suprafață sau în grosimea mediului nutritiv. De regulă, fiecare colonie este formată din descendenții unei celule microbiene (clone), astfel încât compoziția lor este destul de omogenă. Caracteristicile creșterii bacteriene pe mediile nutritive sunt o manifestare a proprietăților lor culturale. |
|
|
cercetare în 3 etape |
Se studiază natura creșterii unei culturi pure de microorganisme și se realizează identificarea acesteia. |
Tabelul 7.3. Identificarea bacteriilor.
|
Nume |
Caracteristică |
|
|
Identificare biochimică |
Determinarea tipului de agent patogen prin proprietățile sale biochimice |
|
|
Identificarea serologică |
Pentru a stabili speciile de bacterii, structura lor antigenică este adesea studiată, adică sunt identificate prin proprietăți antigenice. |
|
|
Identificarea după proprietăți biologice |
Uneori, identificarea bacteriilor se realizează prin infectarea animalelor de laborator cu o cultură pură și observarea modificărilor pe care agenții patogeni le produc în organism. |
|
|
Identificarea culturală |
Definiții ale tipului de agenți patogeni în funcție de caracteristicile lor culturale |
|
|
Identificarea morfologică |
Determinarea tipului de bacterii după caracteristicile lor morfologice |
Care dintre procese nu are legătură cu fiziologia bacteriilor?
reproducere
Ce substanțe alcătuiesc 40-80% din masa uscată a unei celule bacteriene?
Carbohidrați
Acizi nucleici
Ce clase de enzime sunt sintetizate de microorganisme?
oxidoreductaze
Toate clasele
Transferaze
Enzime a căror concentrație în celulă crește brusc ca răspuns la apariția unui substrat inductor în mediu?
Iuducibil
constituţional
Reprimabil
Complexe multienzimatice
Enzimă de patogenitate secretată de Staphylococcus aureus?
Neuraminidaza
Hialuronidază
Lecitinaza
fibrinolizină
Care este funcția enzimelor proteolitice?
Defalcarea proteinelor
Defalcarea grăsimilor
Defalcarea carbohidraților
Formarea alcaline
Fermentarea enterobacteriilor?
acid lactic
Acid formic
acid propionic
butiric
Ce compuși minerali sunt utilizați pentru a lega ARNt de ribozomi?
Oxidarea biologică este...?
reproducere
moartea celulelor
Care substanțe sintetizează în sine toate componentele celulei care conțin carbon din CO 2 .
Prototrofe
Heterotrofe
Autotrofi
Saprofite
Mediile nutritive sunt diferite:
Compoziţie
Prin consecvență
Cu programare
Pentru toate cele de mai sus
Faza de reproducere, care se caracterizează printr-un echilibru între numărul de celule moarte, nou formate și latente?
Faza de accelerare negativă
Faza stationara
Durata generației depinde de?
vârstă
Populațiile
Toate cele de mai sus
Pentru a stabili apartenența la specii a bacteriilor, se studiază adesea structura lor antigenică, adică sunt identificate, care?
biologic
Morfologic
Serologic
Biochimic
Metoda de însămânțare la suprafață a lui Drygalski este denumită...?
Principii mecanice ale izolării culturii pure
Principii biologice pentru izolarea unei culturi pure
Bibliografie
1. Borisov L. B. Microbiologie medicală, virologie, imunologie: un manual pentru miere. universități. - M .: SRL „Agenția de Informații Medicale”, 2005.
2. Pozdeev O. K. Microbiologie medicală: un manual pentru miere. universități. – M.: GEOTAR-MED, 2005.
3. Korotyaev A. I., Babichev S. A. Microbiologie medicală, imunologie și virologie / manual pentru miere. universități. - Sankt Petersburg: SpecLit, 2000.
4. Vorobyov A. A., Bykov A. S., Pashkov E. P., Rybakova A. M. Microbiologie: manual. – M.: Medicină, 2003.
5. Microbiologie medicală, virologie și imunologie: manual / ed. V. V. Zvereva, M. N. Boycenko. – M.: GEOTar-Media, 2014.
6. Ghid de exerciții practice de microbiologie medicală, virologie și imunologie / ed. V. V. Tets. – M.: Medicină, 2002.
Introducere 6
Compoziția bacteriilor în ceea ce privește fiziologia lor. 7
Metabolismul 14
Nutriția (transportul nutrienților) 25
Respirația 31
Reproducerea 34
Comunitățile microbiene 37
ANEXE 49
Referințele 105
Structura antigenică a microorganismelor este foarte diversă. În microorganisme, există antigene comune, sau de grup și specifice, sau tipice.
Antigenele de grup sunt comune pentru două sau mai multe tipuri de microbi aparținând aceluiași gen și, uneori, aparținând unor genuri diferite. Deci, antigenele de grup comune sunt prezente în anumite tipuri din genul Salmonella; agenții cauzali ai febrei tifoide au antigene de grup comune cu agenții patogeni ai paratifoidului A și paratifoidului B (0-1,12).
Antigenii specifici sunt prezenți doar într-un anumit tip de microbi, sau chiar doar într-un anumit tip (variantă) sau subtip în cadrul unei specii. Determinarea antigenelor specifice face posibilă diferențierea microbilor în cadrul unui gen, specie, subspecie și chiar tip (subtip). Deci, în cadrul genului Salmonella, au fost diferențiate peste 2000 de tipuri de Salmonella în funcție de combinația de antigene, iar în subspecia Shigella Flexner - 5 serotipuri (serovariante).
În funcție de localizarea antigenelor într-o celulă microbiană, există antigene somatice asociate cu corpul celulei microbiene, antigene capsulare de suprafață sau înveliș și antigene flagelare localizate în flageli.
Somatice, O-antigene(din germană ohne Hauch - fără a respira), sunt asociate cu corpul unei celule microbiene. În bacteriile gram-negative, antigenul O este un complex complex de natură lipidă-polizaharid-proteină. Este foarte toxic și este o endotoxină a acestor bacterii. În agenții patogeni ai infecțiilor cocice, Vibrio cholerae, agenți patogeni de bruceloză, tuberculoză și unii anaerobi, din corpul celulelor microbiene au fost izolate antigene polizaharide, care determină specificitatea tipică a bacteriilor. Ca antigeni, ele pot fi active în forma lor pură și în combinație cu lipide.
Flageli, antigene H(din germană Hauch - respirație), sunt de natură proteică și se găsesc în flagelii microbilor mobili. Antigenele flagelare sunt distruse rapid prin încălzire și prin acțiunea fenolului. Sunt bine conservate în prezența formolului. Această proprietate este utilizată la fabricarea cumsurilor diagnostice ucise pentru reacția de aglutinare, atunci când este necesar să se păstreze flagelul.
Capsulare, K - antigene, - sunt situate pe suprafața celulei microbiene și sunt numite și superficiale, sau înveliș. Ele au fost studiate în detaliu la microbii din familia intestinală, în care se disting antigenele Vi-, M-, B-, L- și A-. Antigenul Vi este de mare importanță printre ei. A fost descoperit pentru prima dată în tulpini de bacterii tifoide cu virulență ridicată și a fost numit antigen de virulență. Când o persoană este imunizată cu un complex de antigeni O- și Vi-, se observă un grad ridicat de protecție împotriva febrei tifoide. Antigenul Vi este distrus la 60°C și este mai puțin toxic decât antigenul O. Se găsește și în alți microbi intestinali, cum ar fi Escherichia coli.
De protecţie(din lat. protectio - patronaj, protectie), sau protector, antigenul este format din microbii antraxului din corpul animalelor si se gaseste in diverse exsudate cu antrax. Antigenul protector face parte din exotoxina secretată de microbul antraxului și este capabil să inducă imunitatea. Ca răspuns la introducerea acestui antigen, se formează anticorpi de fixare a complementului. Un antigen protector poate fi obținut prin creșterea microbului antrax pe un mediu sintetic complex. Din antigenul protector a fost preparat un vaccin chimic foarte eficient împotriva antraxului. Antigenele protectoare de protecție au fost găsite și în agenții patogeni de ciume, bruceloză, tularemie, tuse convulsivă.
Antigeni completi provoaca in organism sinteza anticorpilor sau sensibilizarea limfocitelor si reactioneaza cu acestea atat in vivo, cat si in vitro. Antigenele cu drepturi depline se caracterizează prin specificitate strictă, adică determină în organism producerea numai de anticorpi specifici care reacționează numai cu acest antigen. Acești antigeni includ proteine de origine animală, vegetală și bacteriană.
Antigene defecte (haptene) sunt carbohidrați complecși, lipide și alte substanțe care nu sunt capabile să provoace formarea de anticorpi, dar intră într-o reacție specifică cu aceștia. Haptenele dobândesc proprietățile antigenelor cu drepturi depline numai dacă sunt introduse în organism în combinație cu o proteină.
Reprezentanții tipici ai haptenelor sunt lipidele, polizaharidele, acizii nucleici, precum și substanțele simple: coloranți, amine, iod, brom etc.
Vaccinarea ca metodă de prevenire a bolilor infecțioase. Istoria dezvoltării vaccinării. Vaccinuri. cerințe pentru vaccinuri. Factori care determină posibilitatea creării de vaccinuri.
Vaccinurile sunt medicamente active biologic care previn dezvoltarea bolilor infecțioase și a altor manifestări ale imunopatologiei. Principiul utilizării vaccinurilor este de a avansa în crearea imunității și, ca urmare, a rezistenței la dezvoltarea bolii. Vaccinarea se referă la activități care vizează imunizarea artificială a populației prin introducerea de vaccinuri pentru creșterea rezistenței la boală. Scopul vaccinării este de a crea o memorie imunologică împotriva unui anumit agent patogen.
Distingeți imunizarea pasivă și cea activă. Introducerea imunoglobulinelor derivate din alte organisme este imunizare pasivă. Este utilizat atât în scop terapeutic, cât și în scop profilactic. Introducerea vaccinurilor este imunizarea activă. Principala diferență între imunizarea activă și imunizarea pasivă este formarea memoriei imunologice.
Memoria imunologică asigură îndepărtarea accelerată și mai eficientă a agenților străini atunci când aceștia reapar în organism. Baza memoriei imunologice sunt celulele cu memorie T și B.
Primul vaccin și-a primit numele de la cuvânt vaccinia(vaccinia) este o boală virală a bovinelor. Medicul englez Edward Jenner a folosit pentru prima dată vaccinul împotriva variolei la băiatul James Phipps, obținut din veziculele de pe brațul unui pacient cu variolă bovină, în 1796. Abia după aproape 100 de ani (1876-1881) Louis Pasteur a formulat principiul principal al vaccinării. - utilizarea preparatelor slabite din microorganisme pentru formarea imunitatii impotriva tulpinilor virulente.
Unele dintre vaccinurile vii au fost create de oamenii de știință sovietici, de exemplu, P. F. Zdrodovsky a creat un vaccin împotriva tifosului în 1957-59. Vaccinul antigripal a fost creat de un grup de oameni de știință: A. A. Smorodintsev, V. D. Solovyov, V. M. Zhdanov în 1960. P. A. Vershilova în 1947-51 a creat un vaccin viu împotriva brucelozei.
Vaccinul trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:
● activarea celulelor implicate în procesarea și prezentarea antigenului;
● conțin epitopi pentru celulele T și T, oferind un răspuns celular și umoral;
● ușor de prelucrat cu prezentare ulterioară eficientă de către antigenele de histocompatibilitate;
● induce formarea celulelor T efectoare, a celulelor producătoare de anticorpi și a celulelor de memorie corespunzătoare;
● previne dezvoltarea bolii pentru o lungă perioadă de timp;
● să fie inofensiv, adică să nu provoace boli grave și reacții adverse.
Eficacitatea vaccinării este de fapt procentul celor vaccinați care au răspuns la vaccinare cu formarea imunitații specifice. Astfel, dacă eficacitatea unui anumit vaccin este de 95%, atunci aceasta înseamnă că din 100 vaccinați, 95 sunt protejați în mod fiabil, iar 5 sunt încă expuși riscului de îmbolnăvire. Eficacitatea vaccinării este determinată de trei grupuri de factori. Factori care depind de preparatul vaccinului: proprietățile vaccinului în sine, care determină imunogenitatea acestuia (viu, inactivat, corpuscular, subunitate, cantitate de imunogen și adjuvanți etc.); calitatea produsului vaccinal, adică imunogenitatea nu s-a pierdut din cauza datei de expirare a vaccinului sau din cauza faptului că acesta nu a fost depozitat sau transportat corect. Factori în funcție de vaccinat: factori genetici care determină posibilitatea (sau imposibilitatea) fundamentală de dezvoltare a imunității specifice; vârsta, deoarece răspunsul imun este cel mai strâns determinat de gradul de maturitate al sistemului imunitar; starea de sănătate „în general” (creștere, dezvoltare și malformații, alimentație, boli acute sau cronice etc.); starea de fond a sistemului imunitar - în primul rând prezența imunodeficiențelor congenitale sau dobândite.
Agenția Federală pentru Educație
Institutul Tehnologic Biysk (filiala)
institutie de invatamant de stat
la cursurile „Biologie generală și microbiologie”, „Microbiologie” pentru studenții specialităților 240901 „Biotehnologie”,
260204 „Tehnologia producției prin fermentație și vinificație”
toate formele de educație
UDC 579.118:579.22
Kamenskaya, microorganisme: linii directoare pentru munca de laborator la cursurile „Biologie generală
și Microbiologie”, „Microbiologie” pentru studenții specialităților 240901 „Biotehnologie”, 260204 „Tehnologia producerii fermentației și vinificației” tuturor formelor de învățământ/,
.
Alt. stat tehnologie. un-t, BTI. - Biysk:
Editura Alt. stat tehnologie. un-ta, 2007. - 36 p.
Aceste linii directoare discută conceptele de bază, regulile și principiile pentru clasificarea și identificarea microorganismelor. Este prezentată o lucrare de laborator privind studiul diferitelor proprietăți ale bacteriilor necesare pentru descrierea unei tulpini bacteriene și identificarea acesteia la nivelul unui gen.
Revizuit și aprobat
la o ședință a departamentului
„Biotehnologie”.
Proces-verbal nr.88 din data de 01.01.2001
Referent:
Doctor în științe biologice, profesor, BPSU numit după
© BTI AltSTU, 2007
1 CONCEPTE DE BAZĂ ȘI REGULI DE NUME
MICROORGANISME
Au fost descrise câteva mii de specii de microorganisme, dar se crede că aceasta este mai mică de 1 % din cele reale. Studiul diversității microorganismelor face obiectul taxonomiei. Sarcina sa principală este de a crea un sistem natural care să reflecte relațiile filogenetice ale microorganismelor. Până de curând, taxonomia microorganismelor se baza în principal pe caractere fenotipice: morfologice, fiziologice, biochimice etc., prin urmare, sistemele de clasificare existente sunt în mare măsură artificiale. Cu toate acestea, ele fac relativ ușor identificarea unor tulpini nou izolate de microorganisme.
Taxonomia include secțiuni precum clasificare, nomenclatură și Eden certificare . Clasificare determină ordinea în care indivizii cu un anumit grad de omogenitate sunt plasați în anumite grupuri (taxa). Nomenclatură este un set de reguli pentru denumirea taxonilor. Identificare înseamnă determinarea apartenenței organismului studiat la unul sau altul taxon.
Termenul „taxonomie” este adesea folosit ca sinonim pentru taxonomie, dar uneori este înțeles ca o secțiune a taxonomiei, incluzând teoria clasificării, doctrina sistemului de categorii taxonomice, limitele și subordonarea taxonomiei. Principala categorie taxonomică în microbiologie, ca și în alte științe biologice, este vedere- un ansamblu de indivizi caracterizați printr-un număr de caracteristici comune morfologice, fiziologice, biochimice, genetice moleculare.
Termenul „tulpină” înseamnă o cultură pură a unui microorganism izolat dintr-un habitat specific (apă, sol, organism animal etc.). Diferite tulpini ale aceluiași tip de microorganisme pot diferi în anumite privințe, de exemplu, sensibilitatea la antibiotice, capacitatea de a sintetiza anumite produse metabolice etc., dar aceste diferențe sunt mai mici decât diferențele dintre specii. Conceptul de „tulpină” în microbiologie și genetică este oarecum diferit: în microbiologie, acest concept este mai larg. Speciile de microorganisme sunt combinate în categorii taxonomice de ordin superior: genuri, familii, ordine, clase, diviziuni, regate. Aceste categorii sunt numite obligatorii. Sunt oferite și categorii opționale: subclasă, subordine, subfamilie, trib, subtrib, subgen, subspecie. Cu toate acestea, în taxonomie, categoriile opționale sunt rareori utilizate.
Nomenclatura microorganismelor este supusă regulilor internaționale. De exemplu, există Codul internațional de nomenclatură pentru bacterii. Pentru ciupercile cu drojdie, ghidul principal este The Yeasts. A Taxonomic Study”, pentru ciuperci filamentoase și alge - International Code of Botanical Nomenclature.
Pentru a denumi obiecte în microbiologie, ca în zoologie și botanică, ele folosesc binar sau binom (din lat. bis- de două ori) un sistem de nomenclatură, conform căruia fiecare specie are un nume format din două cuvinte latine. Primul cuvânt înseamnă gen, iar al doilea definește o specie specifică a acestui gen și se numește epitet specific. Numele generic este întotdeauna scris cu majuscule, în timp ce specificul – cu litere mici chiar dacă epitetul specific este atribuit în onoarea omului de știință, de exemplu Clostridium pasteurianum. În text, în special cu grafică latină, întreaga frază este scrisă în italic. Când numele unui microorganism este repetat, numele generic poate fi abreviat la una sau mai multe litere inițiale, de exemplu CU.pasteurianum. Dacă textul conține numele a două microorganisme care încep cu aceeași literă (de exemplu, Clostridium pasteurianumși Citrobacterfreundii), atunci abrevierile trebuie să fie diferite (S. pasteurianumși CT. freundii). Dacă microorganismul este identificat doar cu genul, în locul epitetului specific se scrie cuvântul sp. (specii- amabil), de exemplu Pseudomonas sp. În acest caz, când numele microorganismului este menționat din nou în text, denumirea generică trebuie întotdeauna scrisă în întregime.
Pentru numele unei subspecii se folosește o frază, constând din numele genului, precum și epitetele specifice și subspecifice. Pentru a distinge între aceste epitete, este scrisă o combinație de litere între ele, care este un cuvânt prescurtat subspecie - „subsp”. sau (mai rar) „ss.”. De exemplu, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Pentru fiecare tulpină, indicați și prescurtarea denumirii colecției de culturi de microorganisme în care este depozitată și numărul sub care apare acolo. De exemplu, Clostridium butyricum ATCC 19398 înseamnă că tulpina este stocată în American Type Culture Collection (ATCC) sub numărul 19398. O listă a colecțiilor de microorganisme de renume mondial este dată în Manualul Bergeys de bacteriologie sistematică, 1984–1989), în cataloagele culturilor de microorganisme și alte publicații de referință.
Descrierea oricărui tip nou de microorganisme se bazează pe o tulpină de tip, care este stocată într-una dintre colecțiile de microorganisme și pe baza combinației de proprietăți ale cărora acest tip.
caracterizate în articolul sau calificativul original. Tulpina tip este tipul nomenclatural al speciei, deoarece i se atribuie un nume specific. Dacă se constată ulterior că vreo tulpină inclusă inițial în aceeași specie merită să fie evidențiată ca specii separate, ar trebui să li se dea noi denumiri, iar vechiul nume specific păstrat de tip și de tulpinile înrudite. În acest caz, numărul tulpinii redenumite rămâne același. Tulpinile autentice sunt cele care se potrivesc complet în proprietățile lor.
Pentru un gen, tipul purtător de nume este o specie tip special desemnată, care are un set de trăsături cele mai caracteristice reprezentanților acestui taxon. De exemplu, în gen bacil specia tip este V.subtilis.
În unele ghiduri și cataloage sunt indicate denumirile vechi ale microorganismelor redenumite, precum și numele autorilor care au izolat pentru prima dată acest microorganism și anul publicării în care a fost descris pentru prima dată acest organism. De exemplu, una dintre speciile de drojdie este listată în catalogul Colecției de microorganisme din întreaga Rusie (VKM) ca Candida magnolie(Lodder et Kreger van Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978, BKM Y-1685. Aceasta înseamnă că a fost descrisă pentru prima dată de Lodder și Kreger van Rij într-o publicație din 1952, când specia a fost numită. Torulopsis magnolie. În 1978 Torulopsis magnolie a fost redenumit de astfel de cercetători ca Meyer și Yarrow, în Candida magnolieși este stocat în prezent în VKM sub numărul VKM Y-1685. Litera Y din fața numărului tulpinii înseamnă „drojdiile” - drojdie.
Pe lângă conceptul de „tulpină” în microbiologie, sunt utilizați termenii „variantă”, „tip”, „formă”. Ele sunt de obicei folosite pentru a desemna tulpini de microorganisme care diferă într-un fel de tipul de tulpină. O tulpină care diferă de tulpina tipică în caracteristicile morfologice este numită morfovar(morfotip), caracteristici fiziologice și biochimice - biovar(biotip, tip fiziologic), în funcție de capacitatea de a sintetiza anumiți compuși chimici - chemovar(chemoform, chemotip), condiții de cultivare - soi,în funcție de tipul de răspuns la introducerea unui bacteriofag - fagovar(fagotip, lizotip), caracteristici antigenice - serovar(serotip)
etc.
În lucrările despre genetica microorganismelor, termenul este adesea folosit "clona", ceea ce înseamnă o populație de celule înrudite genetic obținute asexuat dintr-o celulă părinte. În biologia moleculară, clonele sunt multiple
copii ale secvențelor de ADN identice obținute prin inserarea lor în vectori de clonare (de exemplu plasmide). Termenul „tulpini modificate genetic” sau „recombinant” se referă la tulpini de microorganisme obținute ca rezultat al manipulărilor de inginerie genetică. Adesea, noi tulpini de microorganisme sunt obținute folosind mutageni.
Fiecare tulpină nouă de microorganisme izolate din surse naturale sau artificiale trebuie caracterizată pentru a obține un set complet de date privind proprietățile microorganismului.
în cultură pură. Aceste date pot fi folosite, de exemplu, pentru a compila un pașaport de tulpini valoroase din punct de vedere industrial, precum și pentru a le identifica.
Scopul identificării
– să stabilească poziția taxonomică a tulpinii studiate pe baza unei comparații a proprietăților acesteia cu speciile studiate și acceptate (înregistrate oficial). Prin urmare, rezultatul identificării este, de obicei, identificarea microorganismului studiat cu un fel sau o misiune
la un anumit gen. Dacă tulpina studiată sau grupul de tulpini diferă în proprietățile lor de reprezentanții taxonilor cunoscuți, atunci acestea pot fi separate într-un nou taxon. Pentru a face acest lucru, dați o descriere a noului taxon, inclusiv, de exemplu, în cazul bacteriilor, următoarele: o listă a tulpinilor incluse în taxon; caracteristicile fiecărei tulpini; lista proprietăților considerate esențiale
într-un taxon; o listă de proprietăți care califică taxonul pentru reprezentare în taxonul următor superior; o listă de caracteristici de diagnostic care diferențiază taxonul propus de taxonii strâns înrudiți; o descriere separată a tulpinii tip (pentru specie); fotografia unui microorganism.
Pentru ca un taxon nou propus să fie acceptat oficial, descrierea acestuia trebuie publicată în conformitate cu anumite reguli. De exemplu, o publicație validă sau legală a unui taxon de bacterii implică publicarea unui articol care îl descrie în Jurnalul Internațional de Microbiologie Sistematică și Evolutivă (IJSEM). Dacă o publicație apare într-o altă revistă științifică de renume (publicare eficientă), atunci o retipărire a articolului din revista respectivă este trimisă la IJSEM. Din 1980, așa-numitele liste de nume bacteriene legale au fost publicate în mod regulat în IJSEM. Ele enumeră toate denumirile bacteriene care au fost publicate în IJSEM (publicare validă sau legală) sau care au fost publicate efectiv înainte în orice
alte reviste de renume. Odată ce numele unei bacterii a fost introdus în lista de nume legalizate IJSEM, acel nume este recunoscut ca valid, indiferent dacă a fost publicat anterior în IJSEM sau în altă revistă. Data publicării numelui acestui taxon în IJSEM sau în lista de nume legalizate a IJSEM este o prioritate pentru taxon.
Cultura unei tulpini tip a unui nou tip de microorganisme este transferată pentru depozitare într-una dintre colecțiile de microorganisme de importanță mondială. Dacă tulpina tip este pierdută, aceasta poate fi înlocuită cu așa-numita tulpină neotip. În același timp, trebuie să se confirme că proprietățile noii tulpini sunt în bună concordanță cu descrierea celei pierdute. Pentru a indica faptul că taxonul este propus pentru prima dată, abrevierea „fam. nov.", un nou gen - "gen. nov.", și o nouă specie - "sp. nov.”. De exemplu,
în 2000, împreună cu co-autorii, a fost propusă o nouă familie de bacterii - Oscillochloridaceae,
fam. nov. Expresia „specie insertac sedis” înseamnă că vorbim despre o specie care temporar nu are un statut taxonomic definit, întrucât nu este clar în ce taxon de ordin superior – gen sau familie – această specie ar trebui plasată datorită lipsa datelor experimentale necesare pentru aceasta.
date.
2 DESCRIERE ȘI IDENTIFICARE
MICROORGANISME
După cum sa menționat deja, principiile clasificării și identificării diferitelor grupuri de procariote și microorganisme eucariote au diferențe semnificative. Identificarea ciupercilor la cursuri, comenzi
iar familiile se bazează pe trăsăturile caracteristice ale structurii și metodelor de formare, în primul rând, a structurilor sexuale. În plus, se folosesc caracteristicile sporulării asexuate, structura și gradul de dezvoltare a miceliului (rudimentar, bine dezvoltat, septat sau neseptat), caracteristici culturale (colonie) și fiziologice. Diferențierea genurilor în cadrul familiilor și identificarea speciilor se realizează folosind caracterele morfologice obținute
folosind microscopia electronică, precum și caracteristicile fiziologice și culturale. Nu există un singur determinant pentru identificarea tuturor ciupercilor, așa că mai întâi determinați clasa sau ordinea ciupercii identificate și apoi utilizați determinantul potrivit pentru această clasă sau ordine.
Identificarea ciupercilor de drojdie, care se numără printre obiectele utilizate pe scară largă ale diverselor studii microbiologice, se bazează pe caracteristici culturale (macromorfologice), citologice, fiziologice și biochimice, caracteristici ale ciclurilor de viață și ale procesului sexual, semne specifice asociate ecologiei și este purtată. folosind determinanți speciali pentru drojdie.
Sistematica formelor microscopice de alge se bazează pe structura celulelor lor și pe compoziția pigmenților. Determinarea poziției sistematice a protozoarelor se realizează folosind caracteristici morfologice și cicluri de viață. Astfel, identificarea eucariotelor se bazează în principal pe caracteristicile morfologiei și ciclurilor lor de dezvoltare.
Identificarea procariotelor, care sunt morfologic mai puțin diverse decât eucariotele, se bazează pe utilizarea unei game largi de trăsături fenotipice și, în multe cazuri, genotipice. Este, mai mult decât o identificare eucariotă, bazată pe caractere funcționale, deoarece majoritatea bacteriilor pot fi identificate nu după aspectul lor, ci doar prin aflarea proceselor pe care sunt capabile să efectueze.
La descrierea și identificarea bacteriilor, proprietățile lor culturale, morfologia, organizarea celulară, caracteristicile fiziologice și biochimice, compoziția chimică a celulelor, conținutul
guanina și citozină (GC) în ADN, secvența de nucleotide din gena care codifică sinteza ARNr 16S și alte caracteristici fenotipice și genotipice. În acest caz, trebuie respectate următoarele reguli: lucrul cu culturi pure, aplicarea metodelor standard de cercetare și, de asemenea, utilizarea celulelor care se află într-o stare fiziologică activă pentru inoculare.
2.1 Proprietăți culturale
Proprietățile culturale sau macromorfologice includ trăsături caracteristice ale creșterii microorganismelor pe medii nutritive solide și lichide.
2.1.1 Creșterea pe medii solide
Pe suprafața mediilor nutritive dense, în funcție de semănat, microorganismele pot crește sub formă de colonie, de accident vascular cerebral sau de gazon continuu. colonie numită acumulare izolată de celule de același tip, crescute în majoritatea cazurilor dintr-o singură celulă. În funcție de locul în care s-au dezvoltat celulele (pe suprafața unui mediu nutritiv dens, în grosimea acestuia sau în fundul vasului), ele disting superficial, profundși fund colonii.
Educaţie pestenostalgic coloniile sunt caracteristica cea mai semnificativă a creșterii multor microorganisme pe un substrat dens. Aceste colonii sunt foarte diverse. La descrierea acestora, se iau în considerare următoarele caracteristici:
profil- plat, convex, crater, conic etc. (Figura 1);
formă- rotunjit, ameboid, neregulat, rizoid etc. (Figura 2);
dimensiune (diametru)- măsurat în milimetri; dacă dimensiunea coloniei nu depășește 1 mm, atunci acestea se numesc punctate;
suprafaţă- netede, aspre, brazdate, pliate, sifonate, cu cercuri concentrice sau striate radial;
strălucireși transparenţă- colonia este lucioasă, ternă, ternă, făinoasă, transparentă;
culoare- incolore (coloniile alb murdar sunt clasificate ca incolore) sau pigmentate - alb, galben, auriu, portocaliu
wai, liliac, roșu, negru etc.; subliniază accentul pus pe
substrat pigmentar; la descrierea coloniilor de actinomicete, se observă pigmentarea miceliului aerian și substrat, precum și eliberarea pigmenților în mediu;
margine- uniformă, ondulată, zimțată, franjuri etc. (Figura 3);
structura- omogen, fin sau grosier, striat etc. (Figura 4); marginea şi structura coloniei se determină cu lupa sau la micşorarea microscopului. Pentru a face acest lucru, placa Petri este așezată pe scena microscopului cu capacul în jos;
consistenta determinată prin atingerea suprafeţei coloniei cu o buclă. Colonia poate fi îndepărtată cu ușurință din agar, să fie densă, moale sau în creștere în agar, lipicioasă (se lipește de buclă), vâscoasă, să aibă aspectul unei pelicule (înlăturată în întregime), să fie fragilă (se rupe ușor când este atinsă de buclă).
1 - curbat; 2 - în formă de crater; 3 - denivelat;
4 - creșterea în substrat; 5 - apartament; 6 - convex;
7 - în formă de picătură; 8 - conic
Figura 1 - Profilul coloniei
colonie adâncă, dimpotrivă, sunt destul de uniforme. Cel mai adesea arată ca linte mai mult sau mai puțin turtită,
în proiecţia având formă de ovale cu capete ascuţite. Numai
în câteva bacterii, coloniile adânci seamănă cu smocuri de vată
cu excrescenţe filamentoase într-un mediu nutritiv. Formarea coloniilor profunde este adesea însoțită de ruperea mediului dens dacă microorganismele eliberează dioxid de carbon sau alte gaze.
Colonii de jos diferite microorganisme arată de obicei ca niște pelicule subțiri transparente care se târăsc de-a lungul fundului.
Mărimea și multe alte caracteristici ale coloniei se pot schimba odată cu vârsta și depind de compoziția mediului. Prin urmare, la descrierea acestora se indică vârsta culturii, compoziția mediului și temperatura de cultură.
1
– rotund; 2
– rotund cu marginea festonată; 3
- rotund cu rola de-a lungul marginii; 4, 5
- rizoidal; 6
- cu marginea rizoidă; 7 - amiboid;
8
- filiform; 9
- pliat; 10
- incorect;
11 - concentrice; 12 - complex
Figura 2 - Forma coloniei
/ - neted; 2 - ondulat; 3 - dinţat; 4 - cu lame; 5 - incorect; 6 - ciliat; 7 - filamentos; 8 - vilozitate; 9 - ramificată
Figura 3 - Marginea coloniei
1 - omogen; 2 - granulație fină; 3 - granulație grosieră;
4 - avion; 5 - fibroase
Figura 4 - Structura coloniei
Când se descrie creșterea microorganismelor prin accident vascular cerebral notează următoarele caracteristici: rar, moderat sau abundent, continuu
cu o margine netedă sau ondulată, asemănătoare unor mărgele, asemănătoare lanțurilor de colonii izolate, difuze, pinnate, asemănătoare arborilor sau rizoide (Figura 5). Ele caracterizează proprietățile optice ale plăcii, culoarea, suprafața și consistența acesteia.
Pentru a caracteriza coloniile și creșterea dungilor, multe microorganisme sunt adesea cultivate pe agar de vită. Se mai folosește și gelatină din carne-peptonă. Pentru o mai bună vizualizare a coloniilor adânci, se recomandă clarificarea agarului sau a mediului gelatină.
1 - solid cu marginea neteda; 2 - solid cu marginea ondulata; 3 - clar vizibil; 4 – difuză; 5 - emplut; 6 - rizoid
Figura 5 - Creșterea bacteriilor de-a lungul accidentului vascular cerebral
2.1.2. Creștere în medii nutritive lichide
Creșterea microorganismelor în mediile nutritive lichide este mai uniformă și este însoțită de turbiditatea mediului, formarea unui film sau sediment. Caracterizarea creșterii microorganismelor într-un mediu lichid, notează tulbureala(slab, moderat sau puternic) caracteristici ale filmului(subțire, dens sau liber, neted sau pliat),
iar când se formează un precipitat, se indică dacă este puțin sau abundent, dens, afanat, slăbănog sau fulgi.
Adesea, creșterea microorganismelor este însoțită de apariția unui miros, pigmentarea mediului și eliberarea de gaze. Acesta din urmă este detectat prin formarea de spumă, bule și, de asemenea, cu ajutorul „plutitorilor” - tuburi mici sigilate la un capăt. Flotitorul este plasat
în eprubetă cu capătul sigilat în sus înainte de a steriliza mediul și asigurați-vă că acesta este complet umplut cu mediu. Dacă se eliberează gaz, acesta se acumulează în plutitor sub forma unei bule.
Pentru a descrie natura creșterii microorganismelor în medii lichide, acestea sunt cultivate pe bulion de carne-peptonă (MPB) sau pe alt mediu care asigură o creștere bună.
2.2 Caracteristici morfologice
Caracteristicile morfologice și organizarea celulelor bacteriene includ caracteristici precum forma și dimensiunea celulelor, mobilitatea lor, prezența flagelilor și tipul de flagelare și capacitatea de a sporula. De asemenea, poate fi util să se detecteze în celule
sisteme membranare caracteristice (clorozomi, carboxizomi, ficobilis, vacuole gazoase etc.) inerente grupurilor individuale de bacterii.
rii, precum și incluziuni (corpi parasporali, granule de volutină,
poli-β-hidroxibutirat, polizaharide etc.). De o importanță capitală pentru taxonomia bacteriilor este acordată colorației Gram a celulelor.
și structura pereților lor celulari.
2.3 Proprietăți fiziologice și biochimice
Studiul proprietăților fiziologice și biochimice include, în primul rând, stabilirea metodei de nutriție a bacteriei studiate (foto/chimio-, auto/heterotrofie) și tipul de metabolism energetic (capacitate de fermentare, respirație aerobă sau anaerobă sau fotosinteză). Este important să se determine caracteristici precum raportul dintre bacterii și oxigenul molecular, temperatura, pH-ul, salinitatea, iluminarea și alți factori de mediu. În acest grup de semne
include, de asemenea, o listă de substraturi utilizate ca surse de carbon, azot și sulf, nevoia de vitamine și alți factori de creștere, formarea de produse metabolice caracteristice, prezența anumitor enzime. Pentru aceasta se folosesc teste speciale.
Multe dintre testele utilizate pentru a detecta aceste caracteristici (uneori denumite teste de rutină) sunt importante pentru diagnostic și sunt utilizate pe scară largă în microbiologia medicală. Setarea lor necesită o investiție semnificativă de timp, un număr mare de medii și reactivi complexi, respectarea condițiilor standard și acuratețea execuției. Pentru a accelera și facilita procesul de identificare a unor microorganisme, care au în principal importanță medicală, au fost dezvoltate diverse sisteme de testare, de exemplu, sistemele Oxi / Ferm Tube, Mycotube și Enterotube II de la Hoffmann-La Roche (Elveția), etc. Astfel, sistemul Enterotube II, conceput pentru identificarea enterobacteriilor, este o cameră de plastic cu 12 celule ce conţin medii colorate de diagnostic. Semănatul tuturor mediilor se realizează prin mișcări de translație-rotație prin camera acului cu sămânță. Incubarea se efectuează timp de 24 de ore la o temperatură de 37 ° C. Un rezultat pozitiv sau negativ al testului se apreciază după modificarea culorii mediului, ruperea agarului (testul de formare a gazelor) sau după introducerea unor reactivi speciali (testul de formare a indolului, reacția Voges-Proskauer). Fiecare caracteristică este desemnată printr-un anumit număr, astfel încât datele obținute pot fi introduse într-un computer cu programul corespunzător și pot primi un răspuns despre poziția taxonomică a tulpinii studiate.
Determinarea compoziției celulelor bacteriene este, de asemenea, importantă pentru sistematica acestora (chimiosistematica). Metodele chemotaxonomice pot fi importante, în special, pentru acele grupuri de bacterii în care caracteristicile morfologice și fiziologice variază foarte mult și sunt insuficiente pentru identificarea lor satisfăcătoare. Pereții celulari ai diferitelor procariote includ mai multe clase de heteropolimeri unici: mureină (sau pseudomureină), lipopolizaharide, acizi micolici și teicoici. Compoziția peretelui celular determină și proprietățile serologice ale bacteriilor. Aceasta stă la baza metodelor imunochimice pentru identificarea lor.
Compoziția de lipide și acizi grași a celulelor bacteriene este uneori folosită și ca marker chemotaxonomic. Un studiu intensiv al acizilor grași a devenit posibil odată cu dezvoltarea metodei de analiză gaz-cromatografică. Diferențele în compoziția lipidelor sunt folosite pentru a identifica bacteriile la nivel de gen și chiar de specie. Această metodă, totuși, are anumite limitări, deoarece conținutul de acizi grași din celule poate depinde de condițiile de cultură și de vârsta culturii.
Taxonomia unor bacterii ține cont de compoziția chinonelor
și alți purtători de electroni, precum și pigmenți.
Informații importante despre relația reciprocă a bacteriilor pot fi obținute prin studierea proteinelor celulare, produse ale traducerii genelor. Pe baza studiului proteinelor celulare membranare, ribozomale, totale, precum și al enzimelor individuale, s-a format o nouă direcție - taxonomia proteinelor. Spectrele proteinelor ribozomale sunt printre cele mai stabile și sunt folosite pentru a identifica bacteriile la nivel de familie sau ordine. Spectrele proteinelor membranare pot reflecta diferențe generice, de specii și chiar intraspecifice. Cu toate acestea, caracteristicile compușilor chimici ai celulei nu pot fi utilizate pentru a identifica bacteriile izolat de alte date care descriu fenotipul, deoarece nu există un criteriu pentru evaluarea semnificației trăsăturilor fenotipice.
Uneori se folosește o metodă pentru a identifica bacteriile sau alte microorganisme, cum ar fi drojdia. Taxonomie numerică (sau adansoniană).. Se bazează pe ideile botanistului francez M. Adanson, care a propus ca diferite trăsături fenotipice care pot fi contabilizate să fie considerate echivalente, ceea ce face posibilă cuantificarea distanțelor taxonomice dintre organisme ca raport dintre numărul de trăsături pozitive și numărul total al celor studiate. Asemănarea dintre cele două organisme studiate este determinată prin cuantificarea a cât mai multe (de obicei cel puțin o sută) trăsături fenotipice, care sunt selectate astfel încât variantele lor să fie alternative și să poată fi notate prin semne minus și plus. Gradul de similitudine este stabilit pe baza numărului de caracteristici de potrivire și este exprimat ca un coeficient de potrivire S:
Unde A + d este suma trăsăturilor conform cărora tulpinile A și B coincid;
A– ambele tulpini cu semne pozitive;
d– ambele cu negativ;
b- suma semnelor pentru care tulpina A este pozitivă, B este negativă;
Cu- suma semnelor pentru care tulpina A este negativă, tulpina B este pozitivă.
Valoarea coeficientului de potrivire poate varia de la 0 la 1. Coeficientul 1 înseamnă identitate completă, 0 - diferență totală. Evaluarea combinațiilor de semne se face cu ajutorul unui calculator. Rezultatele obținute sunt prezentate ca o matrice de similaritate și/sau ca o dendrogramă. Taxonomia numerică poate fi utilizată în evaluarea similitudinii dintre taxonii microorganismelor de rang scăzut (genuri, specii). Nu permite concluzii directe despre relația genetică a microorganismelor, dar într-o anumită măsură reflectă proprietățile filogenetice ale acestora. Astfel, s-a stabilit că trăsăturile fenotipice ale bacteriilor care pot fi studiate în prezent reflectă de la 5 până la 20% din proprietățile genotipului lor.
2.4 Studiul genotipului
Studiul genotipului microorganismelor a devenit posibil ca urmare a dezvoltării cu succes a biologiei moleculare și a condus la apariția sistematicii genelor. Studiul genotipului bazat pe analiza acizilor nucleici, în principiu, face posibilă construirea unui sistem natural (filogenetic) de microorganisme în timp. Se evaluează relațiile filogenetice ale bacteriilor determinarea conţinutului molar guanina si citozina (GC) în ADN, metode ADN–ADN și ADN–Hibridarea ARNr, folosind sonde ADN, precum și studiul secvenței de nucleotide în 5S,
J6
Sși
23
S ARNr.
2.4.1 Determinarea conținutului molar de HC
Determinarea conținutului molar de HC din numărul total de baze ADN la procariote, așa cum sa menționat deja, variază de la 25 la 75%. Fiecare specie bacteriană are ADN cu un conținut mediu caracteristic de HC. Cu toate acestea, deoarece codul genetic este degenerat, iar codificarea genetică se bazează nu numai pe conținutul de baze nucleotidice în unități de codare (triplete), ci și pe aranjarea reciprocă, atunci același conținut mediu de GC în ADN-ul a două specii bacteriene pot fi însoțite de genotipul lor semnificativ
separare. Dacă două organisme sunt foarte apropiate în compoziția nucleotidelor, atunci aceasta poate fi o dovadă a relației lor evolutive numai dacă au un număr mare de trăsături fenotipice comune sau asemănări genetice confirmate prin alte metode. În același timp, discrepanța (mai mult de 10...15%) în compoziția nucleotidelor ADN a două tulpini bacteriene cu proprietăți fenotipice comune arată că acestea aparțin, cel puțin, unor specii diferite.
2.4.2 Metoda ADN –Hibridarea ADN-ului
Această metodă este mai importantă pentru evaluarea relației genetice a bacteriilor. Cu o experimentare atentă, se pot obține informații valoroase despre gradul de omologie genetică a acestora. În cadrul unei specii de bacterii, gradul de omologie genetică a tulpinilor ajunge de la 70 la 100%. Cu toate acestea, dacă, ca urmare a divergenței evolutive, secvențele de baze de nucleotide ale genomului a două bacterii diferă într-o măsură mai mare, atunci reasociera specifică ADN-ADN devine atât de slabă încât nu poate fi măsurată. În acest caz, hibridizarea ADN-ARNr face posibilă creșterea semnificativă a gamei de organisme în care gradul de omologie genetică poate fi determinat datorită faptului că într-o regiune relativ mică a genomului bacterian care codifică ARN ribozomal, secvența de bază originală. se păstrează mult mai complet decât în alte regiuni ale cromozomului. Ca rezultat, metoda de hibridizare ADN-ARNr dezvăluie adesea o omologie destul de mare a genomilor bacterieni, în care reasociere ADN-ADN nu dezvăluie o omologie vizibilă.
2.4.3 Metoda sondei ADN (sonde genetice)
Metoda sondei ADN este o variație a metodei de hibridizare moleculară ADN-ADN. În acest caz, reacția de hibridizare se efectuează nu între două preparate de ADN total, ci între un fragment al secvenței de nucleotide ADN (sondă), care include o genă (marker genetic) responsabil pentru o funcție specifică (de exemplu, rezistența la ceva antibiotic), iar ADN-ul studiat bacteria. Cea mai comună modalitate de a crea sonde genetice este izolarea fragmentelor specifice prin clonare moleculară. Pentru a face acest lucru, creați mai întâi o bancă de gene a bacteriei studiate prin împărțirea ADN-ului acesteia cu endonucleaze.
restricție, iar apoi clona dorită este selectată din suma fragmentelor de ADN prin electroforeză, urmată de verificarea proprietăților genetice ale acestor fragmente prin transformare. Apoi, fragmentul de ADN selectat este legat într-o plasmidă adecvată (vector),
iar această plasmidă combinată este introdusă într-o tulpină de bacterii convenabilă pentru lucru (de exemplu, Escherichia coli).
Din biomasa unei bacterii care poartă o sondă ADN, ADN-ul plasmidic este izolat și marcat, de exemplu, cu o etichetă de radioizotop. Sonda ADN este apoi hibridizată
cu ADN bacterian. Zonele hibride rezultate sunt prezentate prin autoradiografie. În funcție de frecvența relativă de hibridizare a unui marker genetic cu cromozomul unei anumite bacterii,
concluzie despre relația genetică a acestor bacterii cu tulpina studiată.
2.4.4 Metoda de analiză a secvenței de nucleotide
în ARN ribozomal
Pentru identificarea bacteriilor și crearea unui sistem filogenetic pentru clasificarea lor, metoda de analiză a secvențelor de nucleotide din ARN-ul ribozomal a primit cea mai largă distribuție și importanță. Moleculele de ARNr 5S, 16S și 23S conțin regiuni cu cel mai înalt grad de stabilitate genetică. Se crede că sunt în afara mecanismului selecției naturale și evoluează doar ca urmare a mutațiilor spontane care au loc într-un ritm constant. Acumularea mutațiilor depinde doar de timp, astfel încât informațiile despre secvența de nucleotide a acestor molecule sunt considerate cele mai obiective pentru determinarea relației filogenetice a organismelor la nivel de la subspecie la regn. În cazul analizei
ARNr-ul 5S determină de obicei secvența completă de nucleotide, care în această moleculă la procariote este de 120 de nucleotide. În studiul ARNr 16S și 23S care conține 1500 și, respectiv, 2500 de nucleotide, oligonucleotidele derivate din aceste molecule sunt adesea analizate folosind endonucleaze de restricție specifice. Studiul secvenței de nucleotide în ARNr 16S a devenit cel mai răspândit. Studiul structurii ARNr 16S a reprezentanților diferitelor microorganisme a condus la identificarea grupului arheal printre procariote. Valorile coeficientului de similaritate SAB,
separarea ARNr-ului I6S al bacteriilor și al arheilor se află în intervalul 0,1, în timp ce valoarea SAB,
egal cu 1,0 corespunde omologiei complete a secvențelor de nucleotide și 0,02 nivelului de coincidență aleatorie.
Din ce în ce mai mult, dendrogramele sunt oferite pentru a identifica bacteriile, arătând relația dintre genurile, speciile sau tulpinile bacteriene pe baza studiului secvenței nucleotidelor (sau oligonucleotidelor) din ARNr, precum și ADN-ADN.
și hibridizarea ADN-ARNr. Cu toate acestea, identificarea bacteriilor înainte de livrare numai pe baza metodelor genetice, fără un studiu preliminar al caracteristicilor lor fenotipice, este adesea imposibilă. Prin urmare, cea mai bună abordare în munca privind taxonomia bacteriilor este studiul proprietăților atât genotipice, cât și fenotipice. În cazul unei discrepanțe între datele filogenetice și cele fenotipice, acestea din urmă se acordă temporar prioritate.
O problemă deosebită este identificarea unor astfel de bacterii și arhei, în special specii marine, care nu pot crește pe medii de cultură de laborator cunoscute și pentru care, prin urmare, cultura pură nu a putut fi obținută. Până de curând, această problemă părea de nerezolvat. Cu toate acestea, în urmă cu aproximativ 15 ani, au fost dezvoltate metode care au făcut posibilă extragerea, clonarea, secvența
și comparați ARN-urile ribozomale direct din mediu. Acest lucru a făcut posibilă numărarea și identificarea cu precizie a microorganismelor care locuiesc în acest biotop fără a le izola într-o cultură pură. Un microorganism „necultivat” astfel identificat în laborator poate fi chiar descris, dar cu adăugarea cuvântului „candidatus” (candidat). Cuvântul „candidatus” va însoți noua specie până când oamenii de știință vor găsi condițiile pentru cultivarea acestui organism în laborator și vor obține cultura lui pură, ceea ce îi va permite să-și studieze toate proprietățile și să-l publice ca legal.
Bacteriile sunt de obicei identificate folosind Manualul de bacteriologie determinativă a lui Bergey. Prima ediție a acestui manual a fost publicată în 1923 sub îndrumarea celebrului bacteriolog american D. Bergey (DHBergey, 1860–1937). De atunci, a fost republicat în mod regulat cu participarea microbiologilor de top din lume. În cea mai recentă ediție, a noua, definiți, toate bacteriile sunt împărțite în 35 de grupuri în funcție de caractere fenotipice ușor de identificat.
în numele grupului. Poziția taxonomică a bacteriilor în cadrul grupurilor este determinată folosind tabele și chei compilate pe baza unui număr mic de caractere fenotipice. Tabele de diferențiere pentru diferențierea speciilor bacteriene din anumite genuri, cum ar fi genul bacil,
nu sunt date, iar cititorul este trimis la Ghidul lui Burgey pentru sistematica bacteriilor.
Manualul lui Bergey de bacteriologie sistematică, în patru volume, 1984–1989, conține informații mai complete despre poziția taxonomică a bacteriilor.Pentru fiecare grup de bacterii, este dată o descriere a genurilor incluse în acesta.
și specii, inclusiv cele cu statut taxonomic neclar. Pe lângă o descriere fenotipică detaliată, inclusiv morfologia, organizarea și compoziția chimică a celulelor, proprietățile antigenice, tipul de colonii, caracteristicile ciclului de viață și ecologie, caracteristicile genurilor oferă, de asemenea, informații despre conținutul de GC în ADN, rezultate ale hibridizării ADN-ADN și ADN-ARNr. Cheile și tabelele permit identificarea bacteriilor nu numai la gen, ci și la specie.
În prezent, a fost publicată cea de-a doua ediție a Manualului de bacteriologie sistematică a lui Bergcy, în patru volume. În 2002, a fost publicat primul volum. În plus, există o serie de articole și cărți care oferă chei originale pentru identificarea grupurilor individuale de bacterii, de exemplu, bacili, Pseudomonas, actinomicete, enterobacterii.
În prezent, s-au acumulat o mulțime de date noi, inclusiv cele obținute în urma analizei secvențelor de nucleotide ale ARN-ului ribozomal, despre speciile bacteriene studiate anterior și nou izolate. Pe baza acestor informații, compoziția speciei a anumitor grupuri de bacterii, de exemplu, genul bacil, vor fi revizuite: unele specii vor rămâne în gen bacil, iar unele formează noi genuri sau vor fi atribuite altor genuri de bacterii deja existente. De asemenea, trebuie remarcat faptul că, de regulă, sunt studiate mai multe caractere pentru a descrie noile tulpini de bacterii decât sunt necesare pentru identificarea lor, deoarece cheile și tabelele nu includ toate caracterele bacteriilor identificabile, ci doar cele care diferă în diferite specii (Tabelul 1).
Tabelul 1 - Lista minimă de date necesare pentru
descrieri ale noilor tulpini de bacterii (conform H. Truper, K. Schleifer, 1992)
Proprietăți | Caracteristici principale | Caracteristici suplimentare |
Morfologia celulară | Formă; marimea; mobilitate; structuri intra și extracelulare; aranjarea reciprocă a celulelor; diferențierea celulară; tipul de diviziune celulară; ultrastructura celulară | Culoare; natura flagelării; conflicte; capsule; huse; excrescente; ciclu de viață; heterochisturi; ultrastructura flagelilor, membranei și peretelui celular |
Tabelul 1 a continuat
model de creștere | Caracteristici de creștere pe medii nutritive solide și lichide; morfologia coloniei | Culoarea coloniilor, suspensiilor |
rezistență la acid; colorarea sporilor, flagelilor |
||
compozitia celulara | Compoziția ADN-ului; substanțe de rezervă | Omologia acizilor nucleici; pigmenți celulari; compoziția peretelui celular; enzime tipice |
Fiziologie | raport cu temperatura; la pH-ul mediului; tip de metabolism (fototrof, chemotrof, litotrof, organotrof); relație cu oxigenul molecular; acceptori de electroni; surse de carbon; surse de azot; surse de sulf | Nevoia de săruri sau factori osmotici; nevoia de factori de creștere; produse metabolice tipice (acizi, pigmenți, antibiotice, toxine); rezistență la antibiotic |
Ecologie | conditii de viata | patogenitate; cerc de gazde; formarea de antigene; serologie; susceptibilitate la fagi; simbioză |
3 LUCRĂRI DE LABORATOR „IDENTIFICARE
MICROORGANISME»
Obiectiv: familiarizarea cu principiile de bază ale determinării microorganismelor. În procesul de realizare a lucrărilor de laborator, fiecare student studiază proprietățile bacteriilor necesare pentru a descrie o tulpină bacteriană și a o identifica la nivelul genului.
Sarcini
1. Determinați puritatea bacteriei identificate și studiați morfologia celulelor acesteia.
2. Descrieți proprietățile culturale.
3. Să studieze proprietăţile citologice ale bacteriilor identificate.
4. Să studieze proprietăţile fiziologice şi biochimice ale bacteriilor identificate.
5. Determinați sensibilitatea bacteriilor la antibiotice.
6. Completați tabelul și rezumați.
3.1 Determinarea purității unei bacterii identificabile
și studierea morfologiei celulelor sale
Pentru a efectua lucrări de identificare a microorganismelor, fiecare elev primește o cultură de bacterii (pe un mediu de agar înclinat într-o eprubetă), care este apoi verificată pentru puritate. Acest lucru se realizează în mai multe moduri: vizual, însămânțare pe medii nutritive și microscopie.
model de creștere bacteriile obţinute sunt privite printr-o lovitură pe suprafaţa mediului de agar înclinat. Dacă creșterea de-a lungul cursei este eterogenă, atunci cultura este contaminată. Apoi cultura este cernută într-o eprubetă pe un mediu înclinat (agar peptonă de carne) pentru utilizare.
în lucrări ulterioare și, de asemenea, faceți cernerea pe suprafața unui mediu solid într-o cutie Petri utilizând metoda cursei exhaustive pentru a verifica puritatea (prin uniformitatea coloniilor crescute). Tuburile și cupele inoculate sunt plasate într-un termostat la o temperatură de 30 °С pentru o perioadă de 2 până la 3 zile. Restul culturii originale de bacterii dintr-o eprubetă este utilizat pentru a verifica puritatea prin microscopie (în funcție de omogenitatea morfologică a populației), precum și pentru a studia forma, poziția relativă, mobilitatea celulelor și dimensiunile acestora. Cultura este microscopizată folosind preparate de picături zdrobite și un preparat de celule fixate colorate cu magenta. Rezultatele sunt introduse într-un tabel alcătuit sub forma tabelului 2.
masa 2 – Proprietățile bacteriei identificate
Proprietăți | semne | rezultate |
proprietăți culturale | ||
Dimensiune, mm | ||
Suprafaţă | ||
Structura | ||
Consecvență | ||
Morfologia celulară și | Forma și aranjarea celulelor | |
Mobilitate | ||
Prezența endosporilor | ||
Pata Gram | ||
Vopsea pentru rezistenta la acizi | ||
Proprietăți fiziologice și biochimice | Relația cu moleculară oxigen | |
Creștere pe mediu cu glucoză | ||
Creșteți pe mediu cu gelatină | ||
Creștere pe mediu cu lapte | ||
Creștere pe mediu cu amidon | ||
Testul catalazei | ||
Sensibilitate la antibiotice |
3.2 Proprietăți culturale
În lecția următoare, este vizualizată o placă Petri inoculată cu o suspensie dintr-o bacterie identificabilă. Criteriul de puritate a culturii este omogenitatea coloniilor crescute. Descrieți proprietățile culturale ale coloniilor bacteriene în conformitate cu secțiunea
restul 2.1, iar rezultatele sunt introduse în tabelul 2.
3.3 Studiul proprietăților citologice ale bacteriilor identificate
3.3.1 Prezența endosporilor
O cantitate mică de celule din mediul solid este plasată într-o buclă pe o lamă de sticlă într-o picătură de apă de la robinet și se face un frotiu. Frotiul se usucă în aer, se fixează într-o flacără a arzătorului și se aplică o soluție de acid cromic de 5%. După 5-10 minute, se spală cu apă. Preparatul este acoperit cu o fâșie de hârtie de filtru și hârtia este umezită abundent cu Ziehl carbol fuchsine. Medicamentul este încălzit la flacără până când apar vapori (nu până la fierbere), apoi se ia deoparte și se adaugă o nouă porțiune de colorant. Această procedură se efectuează timp de 7 minute. Este important ca vopseaua să se evapore, dar hârtia nu se usucă. După răcire, se îndepărtează, preparatul se spală cu apă și se tamponează bine cu hârtie de filtru.
Dacă toate operațiile sunt efectuate corect, culoarea este contrastantă, iar sporii roșu strălucitor ies în evidență clar pe fundalul albastru al citoplasmei.
3.3.2 Colorarea Gram
3.3.2.1 Se face un frotiu subțire pe o lamă de sticlă degresată într-o picătură de apă, astfel încât celulele să fie distribuite uniform pe suprafața sticlei și să nu formeze ciorchini.
3.3.2.2 Preparatul se usucă la aer, se fixează pe flacăra unui arzător și se colorează timp de 1-2 min cu gențiană carbolice sau cristal violet.
3.3.2.3 Apoi colorantul este scurs și frotiurile sunt tratate cu soluție Lugol timp de 1 ... 2 minute până la înnegrire.
3.3.2.4 Se scurge soluția Lugol, preparatul se decolorează timp de 0,5 ... 1,0 min cu alcool etilic 96% și se spală rapid cu apă.
3.3.2.5 Se colorează suplimentar timp de 1...2 min cu fuchsină apoasă.
3.3.2.6 Colorantul se scurge, preparatul se spală cu apă și se usucă.
3.3.2.7 Microscopic cu sistem de imersie.
Atunci când sunt colorate corespunzător, bacteriile Gram-pozitive sunt albastru-violet, Gram-negative – culoare roz-rosu.
Pentru a obține rezultate fiabile, este necesar să se pregătească frotiuri pentru colorația Gram din culturi tinere, în creștere activă (de obicei, de o zi), deoarece celulele din culturi vechi dau uneori o reacție Gram instabilă. Bacteriile Gram-negative pot apărea ca Gram-pozitive dacă pelicula bacteriană (frotiul) este prea groasă și decolorarea alcoolului nu este completă. Bacteriile Gram-pozitive pot apărea ca Gram-negative dacă frotiul este decolorat cu alcool.
3.3.3 Colorare pentru rezistență la acid
Un frotiu al bacteriei studiate se prepară pe o lamă de sticlă degresată într-o picătură de apă. Medicamentul este uscat la aer și fixat peste flacăra arzătorului. Pe frotiu se pune hârtie de filtru, se toarnă preparatul cu fuchsin carbolic Ziel și se încălzește de 2-3 ori până când apar vapori, ținând lama de sticlă cu penseta sus deasupra flăcării arzătorului. Se observă apariția vaporilor, uitându-se la frotiu din lateral, iar când apar, sunt imediat puse deoparte
medicamentele deoparte. Lăsați preparatul să se răcească, îndepărtați hârtia de filtru, scurgeți colorantul și spălați frotiul cu apă. Atunci
celulele sunt decolorate cu o soluție de acid H 5% https://pandia.ru/text/79/131/images/image009_42.gif "width="11" height="23 src=">. Pentru a face acest lucru, slide-ul se scufundă de 2-3 ori într-un pahar cu acid sulfuric,
fără să-l ţină în ea. Preparatul se spală din nou bine cu apă și se colorează timp de 3 până la 5 minute cu albastru de metilen (conform lui Leffler). Vopseaua se scurge, preparatul se spală cu apă, se usucă și se examinează cu un sistem de imersie. Când sunt colorate corespunzător, celulele bacteriilor acido-rezistente sunt roșii, în timp ce celulele bacteriilor non-acido-rezistente sunt roșii. – albastru.
3.3.4 Determinarea mobilității
Semănat culturii studiate într-o coloană de 0,2 ... 0,5% agar semi-lichid prin injectare. Pentru ca caracteristicile de creștere să se manifeste cel mai clar, se face o puncție în imediata apropiere a peretelui eprubetei. Semănatul se pune într-un termostat timp de 24 de ore. Semănatul realizat astfel face posibilă identificarea și separarea microorganismelor mobile de cele imobile.
Formele nemotile de bacterii cresc de-a lungul liniei de injectare, formând mici excrescențe de formă cilindrică sau conică. Mediul rămâne complet transparent. Microbii mobili în timpul unei astfel de inoculări provoacă turbiditate pronunțată, răspândindu-se mai mult sau mai puțin uniform pe toată grosimea mediului.
3.4 Studiul proprietăților fiziologice și biochimice
bacterii identificabile
3.4.1 Relația cu oxigenul molecular
În legătură cu oxigenul molecular, microorganismele sunt împărțite în patru grupe: aerobi obligați, microaerofili, aerobi facultativi (anaerobi) și anaerobi obligatorii. A judeca
despre apartenența microorganismelor la un anumit grup, suspensia microbiană este însămânțată în eprubete cu mediu nutritiv agarizat topit și răcit la o temperatură de 45 ºС. Semănatul se poate face și prin injecție. Aerobi stricti cresc pe suprafața mediului și în stratul superior, microaerofile- la o oarecare distanta de suprafata. Anaerobi facultativi se dezvoltă de obicei pe toată grosimea mediului. Anaerobi stricti cresc numai în adâncimea mediului, chiar în fundul tubului (Figura 6).
|
1 - aerobi; 2 – microaerofile; 3 - anaerobi facultativi;
4 – anaerobi
Figura 6 - Creșterea microorganismelor atunci când sunt inoculate cu o injecție ( A) și atunci când este inoculat într-un mediu dens topit ( b)
3.4.2 Creștere pe mediu cu glucoză și peptonă
Cultura se introduce cu o ansă sterilă într-un mediu lichid care conține: 5,0 g/l peptonă, 1,0 g/l K2HPO4, 10,0 g/l glucoză, 2 ml albastru de bromtimol (soluție alcoolică 1,6%), apă distilată turnată în eprubete ( 8 ... 10 ml fiecare) cu flotoare. Durata de cultivare este de 7 zile într-un termostat la o temperatură de 30 °C. Creșterea microorganismelor sau absența acesteia este determinată de turbiditatea mediului, formarea unei pelicule sau a unui sediment. O modificare a culorii indicatorului (albastru de bromotimol) indică formarea de produse metabolice acide (culoarea galbenă a mediului) sau alcaline (culoarea albastră a mediului). Formarea gazului se evidențiază prin acumularea acestuia în flotor. Rezultatele observațiilor sunt comparate cu un mediu steril.
3.4.3 Creștere pe mediu gelatină
Activitatea enzimelor proteolitice extracelulare în microorganisme este determinată folosind gelatina, cazeina sau alte proteine ca substrat. Mediul cu gelatină este format din bulion de peptonă de carne (MPB) și 10-15% gelatină (MB). Semănatul se realizează prin injecție.
Celulele de microorganisme sunt selectate steril din articulație cu un ac bacteriologic și acul este introdus în grosimea coloanei NRM până la fundul tubului.
Durata de cultivare este de la 7 la 10 zile la temperatura camerei. Lichefierea gelatinei este observată vizual. Dacă gelatina se lichefiază, indicați intensitatea și forma lichefierii - stratificată, în formă de pâlnie, în formă de pungă, în formă de crater, în formă de nap, în formă de bule.
3.4.4 Creștere pe mediu cu lapte
Semănatul pe „agar cu lapte” în vase Petri se face pentru a determina capacitatea bacteriilor de a descompune cazeina din lapte. Mediul constă din părți egale de lapte degresat steril și agar-agar apos steril 3%. Bacteriile sunt semănate în buclă, trasând o lovitură de-a lungul diametrului cupei sau în centrul sectorului în care este împărțită cupa. Durata de cultivare a bacteriilor într-un termostat la o temperatură de 30 °C este de 7 zile. Hidroliza cazeinei este detectată de zona de curățare a mediului din jurul coloniilor sau de cultura de microorganisme crescute de-a lungul cursului. Zona este vizibilă în mod deosebit după tratarea mediului cu bacterii crescute cu o soluție de acid tricloroacetic 5%. Zona de hidroliză a cazeinei este măsurată în milimetri de la marginea cursei sau a coloniei până la marginea zonei luminoase. Cu cât diametrul zonei luminoase este mai mare, cu atât activitatea cazeinolitică a bacteriilor este mai mare.
3.4.5 Creștere pe mediu amidon
Semănat pe mediu de agar cu amidon (în vase Petri) care conține (g/l): peptonă – 10,0; KN2R04 – 5,0; amidon solubil – 2,0; agar – 15,0; pH 6,8 – 7.0, produs pentru a determina formarea amilazei de către microorganisme. Bacteriile sunt semănate în buclă, trasând o lovitură de-a lungul diametrului cupei sau în centrul sectorului în care este împărțită cupa. Durata de cultivare a bacteriilor este de 7 zile într-un termostat la o temperatură de 30 °C. Hidroliza amidonului este detectată după tratarea mediului cu bacteriile crescute cu soluție Lugol. Pentru a face acest lucru, se toarnă 3 până la 5 ml de soluție Lugol pe suprafața mediului. Mediul care conține amidon devine albastru, iar zona de hidroliză rămâne incoloră sau capătă o culoare brun-roșcată dacă amidonul a fost hidrolizat în dextrine. Zona de hidroliză a amidonului este măsurată de la marginea cursei (colonie) până la marginea zonei de lumină (mm). Cu cât diametrul zonei luminoase este mai mare, cu atât activitatea amilazei este mai mare.
3.4.6 Testul catalazei
O parte din cultura crescută este suspendată folosind o buclă bacteriologică într-o picătură de peroxid de hidrogen 3% pe o lamă de sticlă. Prezența catalazei este evidențiată de formarea de bule de gaz observată la 1–5 min după introducerea bacteriilor cu ochiul liber sau la microscop la mărire mică. Se pot aplica câteva picături de peroxid de hidrogen direct pe o colonie sau pe o cultură crescută pe agar agar și se pot observa eliberarea de oxigen molecular.
3.4.7 Determinarea susceptibilității bacteriene
la antibiotice
Este convenabil să se determine sensibilitatea microorganismelor la antibiotice folosind discuri de hârtie gata făcute impregnate cu anumite antibiotice. Microorganismele studiate sunt cultivate pe un mediu nutritiv dens adecvat. O suspensie groasă a microorganismului studiat se prepară în apă sterilă de la robinet prin spălarea celulelor cu apă de la suprafața unui mediu nutritiv solid. Lucrând lângă flacăra arzătorului, adăugați 1 ml din suspensia rezultată
într-o eprubetă cu 20 ml de mediu de agar topit și răcit la o temperatură de 50 °С, de exemplu, cu agar peptonă de carne (MPA). Dacă microorganismele au fost crescute într-un mediu nutritiv lichid, atunci volumul corespunzător de cultură este adăugat la agar. Conținutul tubului este amestecat rapid și bine și turnat într-o cutie Petri sterilă.
Când mediul se întărește, se pune hârtie pe suprafața sa.
discuri la distanțe egale între ele și la distanță
1,5 ... 2,0 cm de marginea cupei. Vasele Petri sunt păstrate timp de 2 ore la temperatura camerei pentru o mai bună difuzare a antibioticelor în grosimea mediului de agar, apoi, fără a se întoarce, sunt plasate într-un termostat timp de 24 de ore la o temperatură de 30 ºС. O zi mai târziu, se observă formarea unor zone de inhibare a creșterii microorganismelor studiate în jurul discurilor. Dacă bacteria studiată este sensibilă la anumite antibiotice, în jurul discurilor se găsesc zone fără creștere a culturii. Diametrul zonei de inhibare a creșterii este măsurat cu o riglă milimetrică și rezultatele sunt înregistrate în Tabelul 3. O zonă mai mare de 30 mm indică
despre sensibilitatea ridicată a microorganismelor la antibiotic și mai puțin de 12 mm - despre sensibilitatea slabă.
Când soluțiile sunt disponibile pentru experimentator
substanţe antibiotice sau fluide de cultură care conţin
antibiotic, utilizați metoda folosind găuri în grosimea agarului.
În acest caz, într-un mediu de agar înghețat inoculat cu microorganismul testat, se fac găuri cu un burghiu de plută steril (diametru 6 până la 8 mm) la o distanță de 1,5–2,0 cm de marginea vasului.
În godeuri se adaugă soluții de antibiotice sau fluid de cultură. Această metodă face, de asemenea, posibilă dezvăluirea capacității de a forma substanțe antibiotice de către microorganismele crescute într-un mediu lichid.
Tabelul 3 – Efectul antibioticelor asupra creșterii bacteriene
Antibiotic | Diametrul zonelor de inhibare a creșterii, mm |
Disc cu penicilină | |
Disc cu cloramfenicol |
4 ÎNTREBĂRI DE CONTROL
1. Definiți următorii termeni:
- încordare; tulpină autentică; tulpină de tip;
- colonia;
– proprietăți culturale;
– taxonomie;
– clasificare;
- nomenclatura;
– plasmidă;
- Tastarea fagilor.
2. Ce secțiuni include taxonomia microorganismelor? Dă-le o descriere.
3. De ce sunt artificiale sistemele existente de clasificare a microorganismelor?
5. Ce caracteristici disting diferitele tulpini ale aceluiași tip de microorganism?
6. Ce categorii taxonomice de microorganisme sunt considerate obligatorii și care sunt opționale?
7. Enumeraţi regulile de bază pentru nomenclatura microorganismelor.
8. Care este scopul principal al identificării microorganismelor?
9. Care este diferența dintre principiile clasificării și identificării diferitelor grupuri de procariote și eucariote?
10. Ce proprietăți sunt studiate în descrierea și identificarea bacteriilor?
11. De ce semne se iau în considerare atunci când se descriu coloniile de microorganisme de suprafață, adâncime și fund?
12. Ce trăsături se notează când se descrie creșterea microorganismelor printr-un accident vascular cerebral?
13. Ce se notează la caracterizarea creșterii microorganismelor într-un mediu nutritiv lichid?
14. Ce caracteristici includ caracteristicile morfologice și organizarea celulelor bacteriene?
15. Ce proprietăți fiziologice și biochimice sunt studiate la identificarea bacteriilor?
16. Când ar trebui folosite metodele chemotaxonomice?
17. Dați exemple de substanțe folosite ca markeri chimio-taxonomici?
18. Care sunt caracteristicile taxonomiei proteinelor?
19. Descrieți metoda taxonomiei numerice, ce limitări are?
20. Ce metode sunt folosite pentru a evalua relațiile filogenetice ale bacteriilor?
21. Care este esența metodei sondei ADN și diferența acesteia față de metodă
Hibridarea ADN-ADN?
22. Care sunt caracteristicile metodei de analiză a secvențelor de nucleotide din ARN ribozomal?
23. Ce semne stau la baza clasificării bacteriilor în „Cheia bacteriilor lui Burgey”?
24. Ce proprietăți și caracteristici sunt studiate atunci când se descriu noile tulpini de bacterii?
25. Ce metode determină puritatea unei bacterii identificate?
26. Care sunt regulile de bază pentru efectuarea tehnicii colorației Gram?
27. În ce grupe se împart microorganismele în raport cu oxigenul molecular?
28. Ce se folosește ca substrat în determinarea activității enzimelor protolitice extracelulare în microorganisme?
29. Ce metode de determinare a sensibilității microorganismelor la antibiotice cunoașteți, dați caracteristicile acestora.
30. Ce metodă determină formarea amilazei de către microorganisme?
31. Cum face însămânțarea posibilă identificarea și separarea microorganismelor mobile de cele imobile?
5 RETETE DE COLORANTI SI MEDII NUTRIENTI
5.1 Fuchsin carbolic bazic (fuchsin Tsiliya)
- soluție apoasă 5% de fenol proaspăt distilat - 100 ml;
- soluție alcoolică saturată de fuchsin bazic - 10 ml;
Amestecul preparat este filtrat după 48 de ore.
5.2 Albastru de metilen (conform lui Loeffler)
- soluție saturată de alcool de albastru de metilen - 30 ml;
- apa distilata - 100 ml;
- soluție apoasă 1% de KOH - 1 ml.
5.3 Supă de peptonă de carne (MPB)
500 g de carne tocată fără grăsime și tendoane se toarnă în 1 litru de apă de la robinet și se extrag la temperatura camerei timp de 12 ore sau într-un termostat la o temperatură de 37 °С - 2 ore și la o temperatură de 50 °С - o oră. Apoi carnea se stoarce prin tifon, iar infuzia rezultată se fierbe timp de 30 de minute. Aceasta pliază proteinele. Masa răcită este filtrată printr-un filtru de bumbac și completată cu apă până la volumul inițial. În plus, la 1 litru de bulion de carne se adaugă de la 5 până la 10 g de peptonă și 5 g de sare de masă. Mediul se încălzește până când peptona se dizolvă, amestecând constant. MPB este sterilizat la o presiune de 2 atm timp de 20 de minute.
5.4 Agar peptonă de carne (MPA)
La 1 litru de MPB se adaugă 20 g de agar. Mediul este încălzit până când agarul se dizolvă, apoi se stabilește o reacție slab alcalină a mediului
20% NaCO64" height="52" bgcolor="white" style="vertical-align:top;background: white">
Se încarcă...