Bakterijski antigeni:
specifično za grupu (nalazi se u različitim vrstama istog roda ili porodice)
specifične vrste (kod različitih predstavnika iste vrste);
tip-specifične (odredite serološke varijante - serovare, antigenovare unutar jedne vrste).
Ovisno o lokalizaciji u bakterijskoj ćeliji, razlikuju se K-, H-, O-antigeni (označeni slovima latinične abecede).
O-AG je lipopolisaharid stanične stijenke gram-negativnih bakterija. Sastoji se od polisaharidnog lanca (sam O-Ar) i lipida A.
Polisaharid je termostabilan (podnosi ključanje 1-2 sata), hemijski stabilan (podnosi obradu formalinom i etanolom). Čisti O-AG je slabo imunogen. Pokazuje strukturnu varijabilnost i koristi se za razlikovanje mnogih serovarijanti bakterija iste vrste. Na primjer, svaku grupu salmonele karakterizira prisustvo određenog O-AG (polisaharida) - u grupi A
Ovo je faktor 2, grupa B ima faktor 4, itd. U R-oblici bakterija, O-AG gubi bočne lance
polisaharida i specifičnosti tipa.
Lipid A - sadrži glukozamin i masne kiseline. Ima jaku pomoćnu, nespecifičnu imunostimulirajuću aktivnost i toksičnost. Općenito, LPS je endotoksin. Već u malim dozama izaziva groznicu zbog aktivacije makrofaga i njihovog oslobađanja IL1, TNF i drugih citokina, degranulacije granulocita, agregacije trombocita. Može se vezati za bilo koju ćeliju u tijelu, a posebno za makrofage. U velikim dozama inhibira fagocitozu, izaziva toksikozu, disfunkciju kardiovaskularnog sistema, trombozu, endotoksični šok. LPS nekih bakterija je dio imunostimulansa (prodigiosan,
pirogenal). Peptidoglikani staničnog zida bakterije imaju snažan adjuvantni učinak na SI ćelije.
N-AG dio je bakterijskih flagela, njegova osnova je protein flagelin. Termolabilan je.
K-AG je heterogena grupa površinskih, kapsularnih AG bakterija.
U kapsuli su. Sadrže uglavnom kisele polisaharide, koji uključuju galakturonsku, glukuronsku i iduronsku kiselinu. Postoje varijacije u strukturi ovih antigena, na osnovu kojih se, na primjer, razlikuje 75 tipova (serotipova) pneumokoka, 80 vrsta Klebsiella itd. Kapsularni antigeni se koriste za pripremu vakcina za meningokoke, pneumokoke i klebsielu. Međutim, primjena visokih doza polisaharidnih antigena može izazvati toleranciju.
Bakterijski antigeni su i njihovi toksini, ribozomi i enzimi.
Neki mikroorganizmi sadrže unakrsno reaktivne antigene determinante koje se nalaze u mikroorganizmima i ljudima/životinjama.
Kod mikroba raznih vrsta i kod ljudi postoje uobičajeni, strukturno slični AG. Ove pojave se nazivaju antigenska mimikrija. Često unakrsno reaktivni antigeni odražavaju filogenetsku zajedništvo ovih predstavnika, ponekad su rezultat slučajne sličnosti konformacije i naboja - AG molekula.
Na primjer, Forsmanov AG se nalazi u barachovim eritrocitima, salmoneli i u zamorcima.
Hemolitički streptokoki grupe A sadrže unakrsno reaktivne antigene (posebno M-protein), uobičajene za antihipertenzive endokarda i glomerula ljudskog bubrega. Takvi bakterijski antigeni uzrokuju stvaranje antitijela koja unakrsno reagiraju s ljudskim stanicama, što dovodi do razvoja reumatizma i poststreptokoknog glomerulonefritisa.
Uzročnik sifilisa ima fosfolipide slične strukture onima koji se nalaze u srcu životinja i ljudi. Stoga se kardiolipinski antigen srca životinja koristi za otkrivanje antitijela na spirohetu kod bolesnih ljudi (Wassermanova reakcija).
Antigeni su jedinjenja visoke molekularne težine. Kada se progutaju, izazivaju imunološku reakciju i stupaju u interakciju s produktima te reakcije: antitijelima i aktiviranim limfocitima.
Klasifikacija antigena.
1. Po poreklu:
1) prirodni (proteini, ugljeni hidrati, nukleinske kiseline, bakterijski egzo- i endotoksini, antigeni tkiva i krvnih zrnaca);
2) veštački (dinitrofenilovani proteini i ugljeni hidrati);
3) sintetički (sintetizovane poliaminokiseline, polipeptidi).
2. Po hemijskoj prirodi:
1) proteini (hormoni, enzimi, itd.);
2) ugljeni hidrati (dekstran);
3) nukleinske kiseline (DNK, RNK);
4) konjugovani antigeni (dinitrofenilovani proteini);
5) polipeptidi (polimeri a-aminokiselina, kopolimeri glutamina i alanina);
6) lipidi (holesterol, lecitin, koji mogu djelovati kao hapten, ali u kombinaciji sa serumskim proteinima dobijaju antigena svojstva).
3. Po genetskom odnosu:
1) autoantigeni (potiču iz tkiva sopstvenog tela);
2) izoantigeni (izvedeni od genetski identičnog donora);
3) aloantigeni (potiču od nesrodnog donora iste vrste);
4) ksenoantigeni (izvedeni od donora druge vrste).
4. Po prirodi imunološkog odgovora:
1) antigeni zavisni od timusa (imuni odgovor zavisi od aktivnog učešća T-limfocita);
2) antigeni nezavisni od timusa (pokreću imuni odgovor i sintezu antitela od strane B-ćelija bez T-limfocita).
Također razlikovati:
1) spoljni antigeni; ulazi u telo spolja. To su mikroorganizmi, presađene ćelije i strane čestice koje mogu ući u organizam alimentarnim, inhalacionim ili parenteralnim putem;
2) unutrašnji antigeni; nastaju iz oštećenih tjelesnih molekula koji su prepoznati kao strani;
3) latentni antigeni - određeni antigeni (npr. nervno tkivo, proteini sočiva i spermatozoida); su anatomski odvojeni od imunog sistema histohematogenim barijerama tokom embriogeneze; ne javlja se tolerancija na ove molekule; ulazak u krvotok može dovesti do imunološkog odgovora.
Imunološka reaktivnost protiv izmijenjenih ili latentnih autoantigena javlja se kod nekih autoimunih bolesti.
Svojstva antigena:
1) antigenost - sposobnost izazivanja stvaranja antitela;
2) imunogenost - sposobnost stvaranja imuniteta;
3) specifičnost - antigenske karakteristike, zbog kojih se antigeni razlikuju jedni od drugih.
Hapteni su supstance male molekularne težine koje, u normalnim uslovima, ne izazivaju imuni odgovor, ali kada se vežu za molekule visoke molekularne težine, postaju imunogeni. Hapteni uključuju droge i većinu hemikalija. Oni su u stanju da izazovu imuni odgovor nakon vezivanja za proteine u telu.
Antigeni ili hapteni koji, kada se ponovo unesu u organizam, izazivaju alergijsku reakciju nazivaju se alergeni.
2. Antigeni mikroorganizama
Infektivni antigeni su antigeni bakterija, virusa, gljivica, protozoa.
Postoje sljedeće vrste bakterijskih antigena:
1) grupni (nalaze se u različitim vrstama istog roda ili porodice);
2) specifičan za vrstu (nalazi se kod različitih predstavnika iste vrste);
3) tipski (odrediti serološke varijante - serovare, antigenovare - unutar jedne vrste).
Ovisno o lokalizaciji u bakterijskoj ćeliji, razlikuju se sljedeće:
1) O - AG - polisaharid; dio je ćelijskog zida bakterija. Određuje antigensku specifičnost lipopolisaharida ćelijskog zida; prema njemu se razlikuju serovarijante bakterija iste vrste. O - AG je slabo imunogen. Termički je stabilan (izdrži ključanje 1-2 sata), hemijski stabilan (izdrži obradu formalinom i etanolom);
2) lipid A je heterodimer; sadrži glukozamin i masne kiseline. Ima jaku pomoćnu, nespecifičnu imunostimulirajuću aktivnost i toksičnost;
3) H - AG; dio je bakterijskih flagela, njegova osnova je protein flagelin. Termolabilan je;
4) K - AG - heterogena grupa površinskih, kapsularnih antigena bakterija. Oni se nalaze u kapsuli i povezani su sa površinskim slojem lipopolisaharida ćelijskog zida;
5) toksini, nukleoproteini, ribozomi i bakterijski enzimi.
Antigeni virusa:
1) superkapsidni antigeni - površinski omotač;
2) proteinski i glikoproteinski antigeni;
3) kapsid - membranski;
4) nukleoproteinski (core) antigeni.
Svi virusni antigeni su T-ovisni.
Zaštitni antigeni su skup antigenskih determinanti (epitopa) koji izazivaju najjači imuni odgovor, koji štiti organizam od ponovne infekcije ovim patogenom.
Načini prodiranja infektivnih antigena u organizam:
1) kroz oštećenu i ponekad netaknutu kožu;
2) kroz sluzokožu nosa, usta, gastrointestinalnog trakta, urinarnog trakta.
Heteroantigeni su antigeni kompleksi zajednički predstavnicima različitih vrsta ili zajedničke antigene determinante na kompleksima koji se razlikuju po drugim svojstvima. Zbog heteroantigena može doći do unakrsnih imunoloških reakcija.
U mikrobima različitih tipova i kod ljudi postoje uobičajeni, strukturno slični antigeni. Ove pojave se nazivaju antigenska mimikrija.
Superantigeni su posebna grupa antigena koji u vrlo malim dozama izazivaju poliklonsku aktivaciju i proliferaciju velikog broja T-limfocita. Superantigeni su bakterijski enterotoksini, stafilokoki, toksini kolere i neki virusi (rotavirusi).
Izolacija mikroorganizama iz različitih materijala i proizvodnja njihovih kultura imaju široku primjenu u laboratorijskoj praksi za mikrobiološku dijagnostiku zaraznih bolesti, u istraživačkom radu i u mikrobiološkoj proizvodnji vakcina, antibiotika i drugih biološki aktivnih produkata vitalne aktivnosti mikroba.
Uslovi uzgoja zavise i od svojstava dotičnih mikroorganizama. Većina patogenih mikroba uzgaja se na hranljivim podlogama na 37 °C tokom 12 dana. Međutim, nekima od njih je potrebno duže vrijeme isporuke. Na primjer, bakterije velikog kašlja - za 2-3 dana, a mycobacterium tuberculosis - za 3-4 sedmice.
Za stimulaciju procesa rasta i reprodukcije aerobnih mikroba, kao i za smanjenje vremena njihovog uzgoja, koristi se metoda potopljene kultivacije koja se sastoji u kontinuiranom prozračivanju i miješanju hranljivog medija. Dubinska metoda je našla široku primjenu u biotehnologiji.
Za uzgoj anaeroba koriste se posebne metode, čija je suština uklanjanje zraka ili njegova zamjena inertnim plinovima u zatvorenim termostatima - anaerostatima. Anaerobi se uzgajaju na hranjivim podlogama koje sadrže redukcijske tvari (glukoza, natrijum format itd.) koje smanjuju redoks potencijal.
U dijagnostičkoj praksi od posebnog su značaja čiste kulture bakterija koje se izoluju iz test materijala uzetog od pacijenta ili objekata iz okoline. U tu svrhu koriste se umjetne hranjive podloge koje se dijele na osnovne, diferencijalno dijagnostičke i elektivne podloge najrazličitijeg sastava. Izbor hranljive podloge za izolaciju čiste kulture je bitan za bakteriološku dijagnostiku.
U većini slučajeva koriste se čvrsta podloga za kulturu, prethodno izlivena u Petrijeve posude. Ispitni materijal se stavlja na površinu podloge u petlji i triturira lopaticom kako bi se dobile izolirane kolonije izrasle iz jedne ćelije. Subkultura izolovane kolonije na kosi agar u epruveti daje čistu kulturu.
Za identifikaciju, tj. utvrđujući generičku i vrstu pripadnosti odabrane kulture, najčešće se proučavaju fenotipski karakteri:
a) morfologija bakterijskih ćelija u obojenim razmazima ili nativnim preparatima;
b) biohemijske znakove kulture prema sposobnosti da fermentira ugljikohidrate (glukozu, laktozu, saharozu, maltozu, manitol i dr.), da formira indol, amonijak i sumporovodik, koji su produkti proteolitičke aktivnosti bakterija.
Za potpuniju analizu koristi se plinsko-tečna hromatografija i druge metode.
Uz bakteriološke metode, metode imunološkog istraživanja široko se koriste za identifikaciju čistih kultura, koje imaju za cilj proučavanje antigenske strukture izolirane kulture. U tu svrhu koriste se serološke reakcije: aglutinacija, imunofluorescentna precipitacija, vezivanje komplementa, enzimski imunotest, metode radioimunog testa itd.
Metode za izolaciju čiste kulture
Da bi se izolovala čista kultura mikroorganizama, potrebno je odvojiti brojne bakterije koje se nalaze u materijalu, jednu od druge. Ovo se može postići korišćenjem tehnika koje se zasnivaju na dva principa - mehanički i biološki disocijacija bakterija.
Metode za izolaciju čistih kultura zasnovane na mehaničkom principu
Metoda serijskog razrjeđivanja , koji je predložio L. Pasteur, bio je jedan od prvih, koji je korišten za mehaničko odvajanje mikroorganizama. Sastoji se od izvođenja serijskih serijskih razrjeđivanja materijala koji sadrži mikrobe u sterilnoj posudi tečnost hranljivi medij. Ova tehnika je prilično mukotrpna i nesavršena u radu, jer vam ne dozvoljava da kontrolišete broj mikrobnih ćelija koje ulaze u epruvete tokom razblaživanja.
Ona nema ovaj nedostatak Kochova metoda (metoda razblaživanja ploče ). R. Koch je koristio čvrste hranljive podloge na bazi želatine ili agar-agar. Materijal sa asocijacijama različitih vrsta bakterija razrijeđen je u nekoliko epruveta sa rastopljenom i blago ohlađenom želatinom, čiji je sadržaj kasnije izliven na sterilne staklene ploče. Nakon geliranja medijuma, kultivisan je na optimalnoj temperaturi. U njegovoj debljini formirale su se izolovane kolonije mikroorganizama koje su se lako mogle prenijeti u svježu hranjivu podlogu pomoću platinaste petlje kako bi se dobila čista kultura bakterija.
Metoda Drygalskog je naprednija metoda koja se široko koristi u svakodnevnoj mikrobiološkoj praksi. Prvo se ispitni materijal nanosi na površinu medija u Petrijevoj posudi pomoću pipete ili petlje. Koristeći metalnu ili staklenu lopaticu, dobro je utrljajte u medijum. Posuda se drži otvorenom tokom setve i lagano se okreće kako bi se materijal ravnomerno rasporedio. Bez sterilizacije lopatice, posuđeni materijal prenose u drugu Petrijevu posudu, po potrebi i u treću. Tek tada se lopatica umoči u rastvor za dezinfekciju ili prži na plamenu plamenika. Na površini podloge, u prvoj posudi, u pravilu se uočava kontinuirani rast bakterija, u drugoj - gusti rast, au trećoj - rast u obliku izoliranih kolonija.
Kolonije po Drigalskom metodu
Metoda kulture linije danas se najčešće koristi u mikrobiološkim laboratorijama. Materijal koji sadrži mikroorganizme sakuplja se bakteriološkom petljom i nanosi na površinu podloge za kulturu blizu ruba posude. Uklonite višak materijala i povucite ga paralelnim potezima od ruba do ruba čaše. Nakon jednog dana inkubacije inokulacija na optimalnoj temperaturi, na površini posude rastu izolirane kolonije mikroba.
Metoda udara
Da biste dobili izolirane kolonije, možete koristiti prekriveni bris, koji je korišten za prikupljanje materijala za ispitivanje. Petrijevu posudu sa hranljivim podlogom malo otvorite, ubacite tamo tampon i pažljivim pokretima utrljajte materijal u površinu posude, postepeno vraćajući tampon i posudu.
Dakle, značajna prednost metoda razrjeđivanja ploča po Koch, Drygalsky i streak culture je to što stvaraju izolirane kolonije mikroorganizama, koje se, kada se inokuliraju na drugu hranjivu podlogu, pretvaraju u čistu kulturu.
Biološke metode za izolaciju čistih kultura
Biološki princip odvajanja bakterija omogućava svrsishodnu potragu za metodama koje uzimaju u obzir brojne karakteristike mikrobnih ćelija. Među najčešćim metodama su sljedeće:
1. Po vrsti disanja. Svi mikroorganizmi prema vrsti disanja dijele se u dvije glavne grupe: aerobna (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio sholeraeitd) i anaerobni (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringensi sl.)... Ako se materijal iz kojeg treba izolirati anaerobni patogeni prethodno zagrijati i potom uzgajati u anaerobnim uvjetima, tada će te bakterije rasti.
2. By sporulacija . Poznato je da su neki mikrobi (bacili i klostridije) sposobni za plodnost. Među njima Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus... Sporovi su otporni na djelovanje faktora okoline. Posljedično, ispitivani materijal može biti podvrgnut djelovanju termičkog faktora, a zatim inokulativno prebačen u hranljivi medij. Nakon nekog vremena na njemu će rasti upravo one bakterije koje su sposobne za plodnost.
3. Otpornost mikroba na kiseline i baze. Neke klice (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) kao rezultat posebnosti svoje hemijske strukture, otporni su na djelovanje kiselina. Zato se materijal koji ih sadrži, na primjer, sputum kod tuberkuloze, prethodno tretira jednakim volumenom 10% otopine sumporne kiseline, a zatim sije na hranjive podloge. Strana flora umire, a mikobakterije rastu kao rezultat njihove otpornosti na kiseline.
Kolera vibrio (Vibrio sholerae) naprotiv, radi se o halofilnoj bakteriji, pa se za stvaranje optimalnih uslova rasta seje na podloge koje sadrže alkalije (1% alkalne peptonske vode). Već nakon 4-6 sati na površini podloge pojavljuju se karakteristični znakovi rasta u obliku nježnog plavkastog filma.
4. Mobilnost bakterija. Neke klice (Proteus vulgaris) imaju tendenciju puzanja i mogu se brzo širiti po površini nečega vlažnog. Da bi se izolirali takvi patogeni, oni se inokuliraju u kapljicu kondenzacijske tekućine, koja nastaje kada se agar kosa ohladi. Nakon 16-18 godina šire se na cijelu površinu okoliša. Ako uzmemo materijal sa vrha agara, imaćemo čistu kulturu patogena.
5. Osetljivost mikroba na dejstvo hemikalija, antibiotika i drugih antimikrobnih agenasa. Kao rezultat karakteristika metabolizma bakterija, one mogu imati različitu osjetljivost na određene kemijske faktore. Poznato je da su stafilokoki, aerobni bacili koji formiraju spore, otporni na djelovanje 7,5-10% natrijum hlorida. Zbog toga se za izolaciju ovih patogena koriste elektivni hranljivi mediji (agar žumanca-sol, beckon-salt agar) koji sadrže upravo ovu supstancu. Druge bakterije praktički ne rastu pri ovoj koncentraciji natrijevog klorida.
6. Davanje nekih antibiotika (nistatin) se koristi za inhibiciju rasta gljivica u materijalu koji je njima jako kontaminiran. Suprotno tome, dodavanje antibiotika penicilina u podlogu pospješuje rast bakterijske flore ako se gljive izoluju. Dodavanje furazolidona u određenim koncentracijama u hranjivu podlogu stvara selektivne uvjete za rast korinebakterija i mikrokoka.
7. Sposobnost mikroorganizama da prodiru kroz netaknutu kožu. Neke patogene bakterije (Yersinia pestis) kao rezultat prisustva velikog broja enzima agresije, oni su u stanju da prodru kroz netaknutu kožu. Da biste to učinili, dlaka na tijelu laboratorijske životinje se brije i ispitni materijal se utrlja u ovo područje, koje sadrži patogen i veliku količinu mikroflore treće strane. Nakon nekog vremena, životinja se zakolje, a mikrobi se oslobađaju iz krvi ili unutrašnjih organa.
8. Osetljivost laboratorijskih životinja na uzročnike zaraznih bolesti. Neke životinje su vrlo osjetljive na različite mikroorganizme.
Na primjer, s bilo kojim načinom primjene Streptococcus pneumoniae bijeli miševi razvijaju generaliziranu pneumokoknu infekciju. Slična se slika opaža kada su zamorci zaraženi uzročnicima tuberkuloze. (Mycobacterium tuberculosis) .
U svakodnevnoj praksi bakteriolozi koriste koncepte kao što su naprezati i čista kultura mikroorganizmi. Pod sojem se podrazumijevaju mikrobi iste vrste, koji su izolirani iz različitih izvora, ili iz istog izvora, ali u različito vrijeme. Čista kultura bakterija su mikroorganizmi iste vrste, potomci jedne mikrobne ćelije, koji su rasli na (u) hranljivom mediju.
Izolacija čiste kulture aerobny mikroorganizmi sastoji se od više faza.
Prvi dan (Faza 1 istraživanja) patološki materijal se uzima u sterilnu posudu (epruveta, boca, boca). Proučavaju ga - izgled, teksturu, boju, miris i druge znakove, pripremaju bris, farbaju i ispituju pod mikroskopom. U nekim slučajevima (akutna gonoreja, kuga) u ovoj fazi se može postaviti preliminarna dijagnoza, a osim toga moguće je odabrati podlogu na koju će se materijal inokulirati. Zatim provode bakteriološku petlju (najčešće korištenu), uz pomoć lopatice - metodom Drygalsky, s štapićem od pamučne gaze. Čaše se zatvaraju, okreću naopačke, potpisuju posebnom olovkom i stavljaju u termostat na optimalnu temperaturu (37°C) 18-48 sati. Cilj ove faze je dobijanje izolovanih kolonija mikroorganizama.
Međutim, ponekad se radi nakupljanja materijala sije na tekuće hranjive podloge.
Drugog dana (Faza 2 istraživanja) na površini guste hranjive podloge mikroorganizmi formiraju kontinuirani, gust rast ili izolirane kolonije. Kolonija- To su nakupine bakterija vidljive golim okom na površini ili u debljini hranljive podloge. U pravilu se svaka kolonija formira od potomaka jedne mikrobne ćelije (klonova), pa je njihov sastav prilično homogen. Karakteristike rasta bakterija na hranljivim medijima su manifestacija njihovih kulturnih svojstava.
Ploče se pomno pregledavaju i ispituju na izolirane kolonije koje su izrasle na površini agara. Obratite pažnju na veličinu, oblik, boju, prirodu rubova i površine kolonija, njihovu konzistenciju i druge karakteristike. Ako je potrebno, pregledajte kolonije pod lupom, malim ili velikim uvećanjem mikroskopa. Struktura kolonija se ispituje u propuštenoj svjetlosti uz malo povećanje mikroskopa. Mogu biti hijalne, granularne, filamentne ili vlaknaste, koje karakterizira prisustvo isprepletenih niti u debljini kolonija.
Karakterizacija kolonija važan je dio posla bakteriologa i laboratorijskog asistenta, jer mikroorganizmi svake vrste imaju svoje posebne kolonije.
Trećeg dana (Faza 3 istraživanja) proučiti prirodu rasta čiste kulture mikroorganizama i izvršiti njegovu identifikaciju.
Prvo, obraćaju pažnju na osobitosti rasta mikroorganizama na podlozi i prave bris, bojeći ga Gram metodom, kako bi provjerili čistoću kulture. Ako se pod mikroskopom promatraju bakterije iste vrste morfologije, veličine i tinktorijalnih (sposobnosti slikanja) svojstava, zaključuje se da je kultura čista. U nekim slučajevima, već po izgledu i karakteristikama njihovog rasta, moguće je izvući zaključak o vrsti izoliranih patogena. Određivanje vrste bakterija prema njihovim morfološkim karakteristikama naziva se morfološka identifikacija. Određivanje vrste patogena prema njihovim kulturnim karakteristikama naziva se kulturna identifikacija.
Međutim, ove studije nisu dovoljne da se donese konačni zaključak o vrsti izoliranih mikroba. Stoga proučavaju biohemijska svojstva bakterija. Oni su prilično raznoliki.
Identifikacija bakterija.
Određivanje vrste patogena prema njegovim biohemijskim svojstvima naziva se biohemijska identifikacija.
Da bi se utvrdila vrsta bakterija, često se proučava njihova antigena struktura, odnosno identifikuju se po antigenskim svojstvima. Svaki mikroorganizam sadrži različite antigene supstance. Konkretno, predstavnici porodice enterobacteriaceae (Yesherichia, Salmoneli, Shigela) sadrže membranski O-antigen, flagelalni H-antigen i kapsularni K-antigen. Heterogeni su po svom hemijskom sastavu, pa postoje u mnogim varijantama. Mogu se odrediti upotrebom specifičnih aglutinoznih seruma. Ova definicija vrste bakterija se zove serološka identifikacija.
Ponekad se bakterije identificiraju inficiranjem laboratorijskih životinja čistom kulturom i promatranjem promjena koje patogeni uzrokuju u tijelu (tuberkuloza, botulizam, tetanus, salmoneloza itd.). Ova metoda se zove identifikacija po biološkim svojstvima... Kao predmeti - najčešće se koriste zamorci, bijeli miševi i pacovi.
ANEKSI
(tabele i dijagrami)
Fiziologija bakterija
Shema 1. Fiziologija bakterija.
uzgoj
raste na hranljivim podlogama
Tabela 1. Opća tabela fiziologije bakterija.
|
Karakteristično |
||
|
Proces sticanja energije i supstanci. |
||
|
Skup biohemijskih procesa, kao rezultat kojih se oslobađa energija neophodna za vitalnu aktivnost mikrobnih ćelija. |
||
|
Koordinirana reprodukcija svih ćelijskih komponenti i struktura, što u konačnici dovodi do povećanja ćelijske mase |
||
|
Reprodukcija |
Povećanje broja ćelija u populaciji |
|
|
Raste na hranljivim podlogama. |
U laboratorijskim uslovima mikroorganizmi se uzgajaju na hranljivim podlogama koje moraju biti sterilne, providne, vlažne, sadržati određene hranljive materije (proteine, ugljene hidrate, vitamine, elemente u tragovima itd.), imati određeni puferski kapacitet, imati odgovarajući pH, redoks potencijal. |
Tabela 1.1 Hemijski sastav i fiziološke funkcije elemenata.
|
Element kompozicije |
Karakteristike i uloga u fiziologiji ćelije. |
||
|
Glavna komponenta bakterijske ćelije, koja čini oko 80% njene mase. Nalazi se u slobodnom ili vezanom stanju sa strukturnim elementima ćelije. U sporovima se količina vode smanjuje na 18,20%. Voda je rastvarač za mnoge supstance i takođe igra mehaničku ulogu u obezbeđivanju turgora. Tokom plazmolize - gubitka vode od strane ćelije u hipertoničnom rastvoru - protoplazma se odvaja od ćelijske membrane. Uklanjanje vode iz ćelije, sušenje, zaustavljanje metaboličkih procesa. Većina mikroorganizama dobro podnosi sušenje. Uz nedostatak vode, mikroorganizmi se ne razmnožavaju. Vakuumsko sušenje iz zamrznutog stanja (liofilizacija) zaustavlja reprodukciju i promoviše dugotrajno očuvanje mikrobnih uzoraka. |
|||
|
40 - 80% suve materije. Oni određuju najvažnija biološka svojstva bakterija i obično se sastoje od kombinacija od 20 aminokiselina. Bakterije uključuju diaminopimelnu kiselinu (DAP), koja je odsutna u ljudskim i životinjskim stanicama. Bakterije sadrže više od 2000 različitih proteina koji se nalaze u strukturnim komponentama i uključeni su u metaboličke procese. Većina proteina ima enzimsku aktivnost. Proteini bakterijske ćelije određuju antigenost i imunogenost, virulenciju i vrstu bakterija. |
|||
|
Element kompozicije |
Karakteristike i uloga u fiziologiji ćelije. |
||
|
Nukleinske kiseline |
Obavljaju funkcije slične nukleinskim kiselinama eukariotskih stanica: molekula DNK u obliku kromosoma odgovorna je za nasljeđe, ribonukleinske kiseline (informacijske, ili matrične, transportne i ribosomske) su uključene u biosintezu proteina. |
||
|
Ugljikohidrati |
Predstavljaju ih jednostavne supstance (mono- i disaharidi) i složena jedinjenja. Polisaharidi se često nalaze u kapsulama. Neki intracelularni polisaharidi (škrob, glikogen, itd.) su rezervni nutrijenti. |
||
|
Oni su dio citoplazmatske membrane i njenih derivata, kao i stanične stijenke bakterija, na primjer, vanjske membrane, gdje se pored biomolekularnog sloja lipida nalazi i LPS. Lipidi mogu igrati ulogu rezervnih nutrijenata u citoplazmi. Bakterijski lipidi su predstavljeni fosfolipidima, masnim kiselinama i gliceridima. Mycobacterium tuberculosis sadrži najveću količinu lipida (do 40%). |
|||
|
Minerali |
Nalazi se u pepelu nakon što su ćelije spaljene. U velikim količinama detektuju se fosfor, kalij, natrijum, sumpor, gvožđe, kalcijum, magnezijum, kao i elementi u tragovima (cink, bakar, kobalt, barijum, mangan itd.) Uključeni su u regulaciju osmotskog pritiska, pH sredine, redoks potencijal, aktiviraju enzime, dio su enzima, vitamina i strukturnih komponenti mikrobne ćelije. |
||
Tabela 1.2. Azotne baze.
Tabela 1.2.1 Enzimi
|
Karakteristično |
|||
|
Definicija |
Specifični i efikasni proteinski katalizatori prisutni u svim živim ćelijama. |
||
|
Enzimi smanjuju energiju aktivacije, osiguravajući nastanak takvih kemijskih reakcija koje bi se bez njih mogle odvijati samo pri visokim temperaturama, previsokom pritisku i pod drugim nefiziološkim uvjetima neprihvatljivim za živu ćeliju. |
|||
|
Enzimi povećavaju brzinu reakcije za oko 10 redova veličine, što skraćuje poluživot bilo koje reakcije sa 300 godina na jednu sekundu. |
|||
|
Enzimi "prepoznaju" supstrat po prostornom rasporedu njegove molekule i raspodjeli naboja u njemu. Određeni dio enzimske proteinske molekule - njegov katalitički centar - odgovoran je za vezivanje za supstrat. U tom slučaju nastaje intermedijarni kompleks enzim-supstrat, koji se zatim razgrađuje formiranjem produkta reakcije i slobodnog enzima. |
|||
|
Sorte |
Regulatorni (alosterični) enzimi percipiraju različite metaboličke signale i u skladu s njima mijenjaju svoju katalitičku aktivnost. |
Efektorski enzimi - enzimi koji katalizuju određene reakcije (za više detalja vidi tabelu 1.2.2.) |
|
|
Funkcionalna aktivnost |
Funkcionalna aktivnost enzima i brzina enzimskih reakcija zavise od uslova u kojima se mikroorganizam nalazi, a pre svega od temperature sredine i njenog pH. Za mnoge patogene mikroorganizme optimalna temperatura je 37°C i pH 7,2-7,4. |
||
KLASE ENZIMA:
mikroorganizmi sintetiziraju različite enzime koji pripadaju svih šest poznatih klasa.
Tabela 1.2.2. Klase efektorskih enzima
|
Enzimska klasa |
Katalizuje: |
|
|
Oksidoreduktaza |
Prenos elektrona |
|
|
Transferaze |
Transfer raznih hemijskih grupa |
|
|
Hidrolaze |
Prijenos funkcionalnih grupa na molekul vode |
|
|
Vezanje grupa na dvostruke veze i reverzne reakcije |
||
|
Izomeraza |
Prijenos grupa unutar molekula sa formiranjem izomernih oblika |
|
|
Formiranje C-C, C-S, C-O, C-N veza zbog kondenzacijskih reakcija povezanih s razgradnjom adenozin trifosfata (ATP) |
Tabela 1.2.3. Vrste enzima formiranjem u bakterijskoj ćeliji
|
Karakteristično |
Bilješke (uredi) |
||
|
Iiducibilan (prilagodljiv) enzimi "Indukcija supstrata" |
Enzimi, čija koncentracija u ćeliji naglo raste kao odgovor na pojavu induktorskog supstrata u mediju. Sintetizira ih bakterijska stanica samo ako u mediju postoji supstrat ovog enzima | ||
|
Represivni enzimi |
Sinteza ovih enzima je potisnuta kao rezultat prekomjernog nakupljanja produkta reakcije kataliziranog ovim enzimom. |
Primjer enzimske represije je sinteza triptofana, koji nastaje iz antranilne kiseline uz sudjelovanje antranilat sintetaze. |
|
|
Konstitutivni enzimi |
Enzimi se sintetišu bez obzira na uslove okoline |
Enzimi glikolize |
|
|
Multienzimski kompleksi |
Intracelularni enzimi kombinovani strukturno i funkcionalno |
Enzimi respiratornog lanca lokalizovani na citoplazmatskoj membrani. |
Tabela 1.2.4. Specifični enzimi
|
Enzimi |
Identifikacija bakterija |
|
|
Superoksid dismutaza i katalaza |
Svi aerobi ili fakultativni anaerobi posjeduju superoksid dismutazu i katalazu - enzime koji štite ćeliju od toksičnih produkata metabolizma kisika. Gotovo svi obvezni anaerobi ne sintetiziraju ove enzime. Samo jedna grupa aerobnih bakterija - bakterije mliječne kiseline su katalazno negativne. |
|
|
Peroksidaza |
Bakterije mliječne kiseline akumuliraju peroksidazu - enzim koji katalizuje oksidaciju organskih spojeva pod djelovanjem H2O2 (reduciranog u vodu). |
|
|
Arginin dihidrolaza |
Dijagnostička značajka koja vam omogućava da razlikujete saprofitske vrste Pseudomonas od fitopatogenih. |
|
|
Među pet glavnih grupa porodice Enterobacteriaceae, samo dvije - Escherichiae i Erwiniae - ne sintetiziraju ureazu. |
Tabela 1.2.5. Primjena bakterijskih enzima u industrijskoj mikrobiologiji.
|
Enzimi |
Aplikacija |
|
|
Amilaza, celulaza, proteaza, lipaza |
Za poboljšanje probave koriste se gotovi pripravci enzima koji olakšavaju, odnosno, hidrolizu škroba, celuloze, proteina i lipida. |
|
|
Invertaza kvasca |
U proizvodnji slatkiša za sprječavanje kristalizacije saharoze |
|
|
Pektinaza |
Koristi se za bistrenje voćnih sokova |
|
|
Kolagenaza klostridija i streptokinaza streptokoka |
Hidrolizira proteine, pospješuje zacjeljivanje rana i opekotina |
|
|
Litički enzimi bakterija |
Izlučuju se u životnu sredinu, deluju na ćelijske zidove patogenih mikroorganizama i služe kao efikasno sredstvo u borbi protiv potonjih, čak i ako imaju višestruku rezistenciju na antibiotike. |
|
|
Ribonukleaze, deoksiribonukleaze, polimeraze, DNK ligaze i drugi enzimi koji specifično modificiraju nukleinske kiseline |
Koristi se kao alat u bioorganskoj hemiji, genetskom inženjeringu i genskoj terapiji |
Tabela 1.2.6. Klasifikacija enzima prema lokalizaciji.
|
Lokalizacija | |||
|
Endozimi |
U citoplazmi U citoplazmatskoj membrani U periplazmatskom prostoru |
Oni funkcionišu samo unutar ćelije. Oni katalizuju reakcije biosinteze i energetskog metabolizma. |
|
|
Egzozimi |
Ispuštaju se u životnu sredinu. |
Ćelija ih oslobađa u okoliš i katalizuju reakcije hidrolize složenih organskih spojeva do jednostavnijih koji su dostupni mikrobnoj ćeliji za asimilaciju. To uključuje hidrolitičke enzime, koji igraju izuzetno važnu ulogu u ishrani mikroorganizama. |
Tabela 1.2.7. Enzimi patogenih mikroba (enzimi agresije)
|
Enzimi | |||
|
Lecitovitelaza Lecitinaza |
Uništava ćelijske membrane |
Sjetva ispitnog materijala na hranljivi medij ZhSA Rezultat: oblačno područje oko kolonija na JSA. |
|
|
Hemolizin |
Uništava crvena krvna zrnca |
Sjetva test materijala na hranljivu podlogu s krvnim agarom. Rezultat: potpuna zona hemolize oko kolonija na krvnom agaru. |
|
|
Koagulazno pozitivne kulture |
Izaziva zgrušavanje krvne plazme |
Inokulacija ispitnog materijala na sterilnu citratnu krvnu plazmu. Rezultat: zgrušavanje plazme |
|
|
Koagulazno negativne kulture |
Proizvodnja manitola |
Sjetva manitola na hranljivi medij u anaerobnim uslovima. Rezultat: Pojava obojenih kolonija (u boji indikatora) |
|
|
Enzimi |
Formiranje određenih enzima u laboratoriju |
||
|
Hijaluronidaza |
Hidrolizira hijaluronsku kiselinu - glavnu komponentu vezivnog tkiva |
Sjetva test materijala na hranjivu podlogu koja sadrži hijaluronsku kiselinu. Rezultat: ne dolazi do stvaranja ugruška u epruvetama koje sadrže hijaluronidazu. |
|
|
Neuraminidaza |
Odvaja sijaličnu (neuraminsku) kiselinu od različitih glikoproteina, glikolipida, polisaharida, povećavajući propusnost različitih tkiva. |
Detekcija: reakcija za određivanje antitijela na neuraminidazu (RINA) i druge (imunodifuzijske, imunoenzimske i radioimune metode). |
Tabela 1.2.8. Klasifikacija enzima prema biohemijskim svojstvima.
|
Enzimi |
Detekcija |
||
|
Sugarolitic |
Razgradnja šećera |
Diferencijalno - dijagnostička okruženja kao što su Gissovo okruženje, Olkenitskyjevo okruženje, Endovo okruženje, Levinovo okruženje, Ploskirevovo okruženje. |
|
|
Proteolitički |
Razgradnja proteina |
Mikrobi se inokuliraju injekcijom u kolonu želatine, a nakon 3-5 dana inkubacije na sobnoj temperaturi uočava se karakter tečnosti želatine. Proteolitička aktivnost je određena i stvaranjem proizvoda razgradnje proteina: indola, sumporovodika, amonijaka. Da bi se oni odredili, mikroorganizmi se inokuliraju u mesno-peptonsku juhu. |
|
|
Enzimi krajnjeg proizvoda |
Formiranje alkalija Formiranje kiseline Formiranje vodonik sulfida Formiranje amonijaka itd. |
Koriste se za razlikovanje nekih vrsta bakterija od drugih na osnovu njihove enzimske aktivnosti diferencijalno dijagnostička okruženja |
Šema 1.2.8. Enzimski sastav.
ENZIMSKI SASTAV BILO KOGA MIKROORGANIZMA:
Definisano svojim genomom
Je stabilan znak
Široko se koristi za njihovu identifikaciju
Određivanje saharolitičkih, proteolitičkih i drugih svojstava.
Tabela 1.3. Pigmenti
|
Pigmenti |
Sinteza mikroorganizama |
|
|
Karotenoidni pigmenti rastvorljivi u mastima crvene, narandžaste ili žute boje |
Formiraju sarcine, mycobacterium tuberculosis, neke aktinomicete. Ovi pigmenti ih štite od UV zraka. |
|
|
Crni ili smeđi pigmenti - melanini |
Sintetiziraju ga obavezni anaerobi Bacteroides niger i dr. Nerastvorljiv u vodi pa čak i u jakim kiselinama |
|
|
Svijetlo crveni pirol pigment - prodigiosin |
Formiran od nekih serata |
|
|
Pigment fenozin rastvorljiv u vodi - piocijanin. |
Proizvodi ga bakterija Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). U tom slučaju podloga za kulturu neutralnog ili alkalnog pH postaje plavo-zelena. |
Tabela 1.4. Svjetleći mikroorganizmi koji stvaraju aromu
|
Stanje i karakteristike |
||
|
Sjaj (luminiscencija) |
Bakterije uzrokuju luminescenciju tih supstrata, na primjer riblje ljuske, viših gljiva, trulog drveća, prehrambenih proizvoda na čijoj se površini razmnožavaju. Većina luminiscentnih bakterija su halofilne vrste koje se mogu razmnožavati pri povišenim koncentracijama soli. Žive u morima i okeanima i rijetko u slatkovodnim tijelima. Sve luminiscentne bakterije su aerobne. Mehanizam luminescencije povezan je sa oslobađanjem energije tokom biološke oksidacije supstrata. |
|
|
Formiranje arome |
Neki mikroorganizmi proizvode hlapljive arome, kao što su etil acetat i amil acetat, koji daju aromu vinu, pivu, mliječnoj kiselini i drugim prehrambenim proizvodima, te se stoga koriste u njihovoj proizvodnji. |
Tabela 2.1.1 Metabolizam
|
Definicija |
|||
|
Metabolizam |
Biohemijske procese u ćeliji objedinjuje jedna riječ - metabolizam (grč. metabole - transformacija). Ovaj izraz je ekvivalentan konceptu "metabolizam i energija". Postoje dvije strane metabolizma: anabolizam i katabolizam. |
||
|
Anabolizam je skup biohemijskih reakcija koje sintetiziraju ćelijske komponente, odnosno onu stranu metabolizma koja se naziva konstruktivni metabolizam. |
Katabolizam je skup reakcija koje ćeliji daju energiju potrebnu, posebno za reakcije konstruktivnog metabolizma. Stoga se katabolizam definira i kao energetski metabolizam ćelije. |
||
|
Amfibolizam |
Srednji metabolizam, koji pretvara fragmente nutrijenata niske molekularne težine u brojne organske kiseline i fosforne estre, naziva se |
||
Šema 2.1.1. Metabolizam
METABOLIZAM -
skup dva suprotna, ali međusobno povezana procesa: katabolizam i anabolizam
Anabolizam= asimilacija = plastični metabolizam = konstruktivni metabolizam
Katabolizam= disimilacija = energetski metabolizam = raspadanje = opskrba ćelije energijom
Sinteza (ćelijskih komponenti)
Enzimske kataboličke reakcije koje rezultiraju oslobađanje energije, koji se nakupio u molekulima ATP-a.
Biosinteza monomera:
aminokiseline nukleotidi monosaharidi masnih kiselina
Biosinteza polimera:
proteini nukleinske kiseline polisaharidi lipidi
Kao rezultat enzimske anaboličke reakcije, energija oslobođena u procesu katabolizma troši se na sintezu makromolekula organskih spojeva iz kojih se potom sastavljaju biopolimeri - sastavni dijelovi mikrobne ćelije.
Energija se troši na sintezu ćelijskih komponenti
Tabela 2.1.3. Metabolizam i transformacija ćelijske energije.
|
Metabolizam |
Karakteristično |
Bilješke (uredi) |
|
|
Metabolizam osigurava dinamičku ravnotežu svojstvenu živom organizmu kao sistemu, u kojem su sinteza i uništavanje, reprodukcija i smrt međusobno uravnoteženi. |
Metabolizam je glavni znak života |
||
|
Razmjena plastike Sinteza proteina, masti, ugljenih hidrata. |
Ovo je skup reakcija biološke sinteze. |
Od tvari koje ulaze u ćeliju izvana nastaju molekule, slične ćelijskim spojevima, odnosno dolazi do asimilacije. |
|
|
Razmjena energije |
Suprotan proces od sinteze. Ovo je skup reakcija cijepanja. |
Kada se visokomolekularni spojevi razgrađuju, oslobađa se energija koja je neophodna za reakciju biosinteze, odnosno dolazi do disimilacije. Kada se glukoza razgrađuje, energija se oslobađa u fazama uz učešće brojnih enzima. |
Tabela 2.1.2. Razlika u metabolizmu za identifikaciju.
Tabela 2.2 Anabolizam (konstruktivni metabolizam)
Šema 2.2.2. Biosinteza aminokiselina kod prokariota.
Šema 2.2.1. Biosinteza ugljikohidrata u mikroorganizmima.
Slika 2.2.3. Biosinteza lipida
Tabela 2.2.4. Faze energetskog metabolizma - Katabolizam.
|
Faze |
Karakteristično |
Bilješka |
|
|
Pripremni |
Molekuli disaharida i polisaharida, proteini se razlažu na male molekule - glukozu, glicerin i masne kiseline, aminokiseline. Veliki molekuli nukleinske kiseline po nukleotidu. |
U ovoj fazi se oslobađa mala količina energije koja se raspršuje u obliku topline. |
|
|
Anoksična ili nepotpuna ili anaerobna ili fermentirana ili disimilirana. |
Supstance nastale u ovoj fazi uz učešće enzima dalje se razgrađuju. Na primjer: glukoza se razlaže na dva molekula mliječne kiseline i dva ATP molekula. |
ATP i H 3 PO 4 su uključeni u reakcije cijepanja glukoze. Tokom razgradnje glukoze bez kiseonika, 40% energije se pohranjuje u molekulu ATP-a u obliku hemijske veze, a ostatak se raspršuje u obliku toplote. U svim slučajevima razgradnje jednog molekula glukoze nastaju dva ATP molekula. |
|
|
Faza aerobnog disanja ili razgradnje kiseonika. |
Kada je kiseonik dostupan ćeliji, supstance nastale tokom prethodne faze se oksidiraju (razgrađuju) do konačnih proizvoda CO 2 iH 2 O. |
Ukupna jednačina aerobnog disanja:
|
Šema 2.2.4. Fermentacija.
Metabolizam fermentacije - karakterizira stvaranje ATP-a fosforilacijom supstrata.
Prvo (oksidacija) = cijepanje
Drugo (oporavak)
Uključuje konverziju glukoze u pirogrožđanu kiselinu.
Uključuje obnavljanje vodika za oporavak pirogrožđane kiseline.
Putevi stvaranja pirogrožđane kiseline iz ugljikohidrata
Šema 2.2.5. Pirogrožđana kiselina.
Glikolitički put (Embden-Meyerhof-Parnassus put)
Entner-Dudorov put
Pentozofosfatni put
Tabela 2.2.5. Fermentacija.
|
Vrsta fermentacije |
Predstavnici |
Finalni proizvod |
Bilješke (uredi) |
|
|
Mliječna kiselina |
|
Od piruvata stvara mliječnu kiselinu |
U nekim slučajevima (homofermentna fermentacija) nastaje samo mliječna kiselina, u drugim i nusproizvodi. |
|
|
Mravlja kiselina |
Enterobacteriaceae |
Mravlja kiselina je jedan od konačnih proizvoda. (zajedno sa njom - strana) |
Neke vrste enterobakteriaceae razlažu mravlju kiselinu do H 2 i CO 2 / |
|
|
Maslačna kiselina |
Maslačna kiselina i nusproizvodi |
Neke vrste klostridija, zajedno sa butirnom i drugim kiselinama, stvaraju butanol, aceton itd. (tada se to naziva aceton-butilna fermentacija). |
||
|
Propionska kiselina |
Propionobacterium |
Formira propionsku kiselinu iz piruvata |
Mnoge bakterije fermentiraju ugljikohidrate zajedno s drugom hranom u etilni alkohol. Međutim, to nije glavni proizvod. |
Tabela 2.3.1. Sistem sinteze proteina, jonska izmjena.
|
Naziv artikla |
Karakteristično |
|
|
Ribosomalne podjedinice 30S i 50S |
U slučaju bakterijskih 70S ribozoma, 50S podjedinica sadrži 23S rRNA (~ 3000 nukleotida dužine), a 30S podjedinica sadrži 16S rRNA (~ 1500 nukleotida dužine); velika ribosomalna podjedinica, pored "duge" rRNA, sadrži i jednu ili dvije "kratke" rRNA (5S rRNA bakterijskih ribosomalnih podjedinica 50S ili 5S i 5.8S rRNA velikih ribosomalnih podjedinica eukariota). (Za više detalja, pogledajte sliku 2.3.1.) |
|
|
Messenger RNA (mRNA) | ||
|
Kompletan set od dvadeset aminoacil-tRNA, za čije su formiranje potrebne odgovarajuće aminokiseline, aminoacil-tRNA sintetaze, tRNA i ATP |
To je aminokiselina, nabijena energijom i vezana za tRNA, spremna za transport do ribozoma i ugradnju u polipeptid koji se na njemu sintetizira. |
|
|
Transportna RNK (tRNA) |
Ribonukleinska kiselina, čija je funkcija transport aminokiselina do mjesta sinteze proteina. |
|
|
Faktori inicijacije proteina |
(kod prokariota - IF-1, IF-2, IF-3) Ime su dobili jer su uključeni u organizaciju aktivnog kompleksa (708-kompleksa) 30S i 50S podjedinica, mRNA i inicijatorske aminoacil-tRNA (u prokarioti - formilmetionil -tRNA), koja "pokreće" (inicira) rad ribozoma - translaciju mRNA. |
|
|
Faktori elongacije proteina |
(kod prokariota - EF-Tu, EF-Ts, EF-G) Učestvuju u elongaciji (elongaciji) sintetizovanog polipeptidnog lanca (peptidila). Faktori oslobađanja proteina (RF) obezbjeđuju kodon-specifično odvajanje polipeptida od ribozoma i završetak sinteze proteina. |
|
|
Naziv artikla |
Karakteristično |
|
|
Faktori terminacije proteina |
(kod prokariota - RF-1, RF-2, RF-3) |
|
|
Neki drugi faktori proteina (asocijacije, disocijacija podjedinica, oslobađanje, itd.). |
Faktori translacije proteina potrebni za funkcionisanje sistema |
|
|
gvanozin trifosfat (GTP) |
Za emitovanje je potrebno učešće GTF-a. Potreba sistema za sintezu proteina za GTP je vrlo specifična: ne može se zamijeniti nijednim drugim trifosfatom. Ćelija troši više energije na biosintezu proteina nego na sintezu bilo kojeg drugog biopolimera. Za stvaranje svake nove peptidne veze potrebno je cijepanje četiri visokoenergetske veze (ATP i GTP): dvije da bi se tRNA molekul napunio aminokiselinom, i još dvije tokom elongacije - jedna tokom vezivanja aa-tRNA i drugo tokom translokacije. |
|
|
Anorganski kationi u određenoj koncentraciji. |
Za održavanje pH sistema u fiziološkim granicama. Amonijeve jone koriste neke bakterije za sintezu aminokiselina, kalijevi ioni se koriste za vezanje tRNA na ribozome. Joni željeza i magnezija igraju ulogu kofaktora u brojnim enzimskim procesima |
Slika 2.3.1. Šematski prikaz strukture prokariotskih i eukariotskih ribozoma.
Tabela 2.3.2. Osobine jonske izmjene u bakterijama.
|
Posebnost |
Karakteriziraju: |
||
|
Visok osmotski pritisak |
Zbog značajne intracelularne koncentracije kalijevih jona u bakterijama, održava se visok osmotski tlak. |
||
|
Unos gvožđa |
Za niz patogenih i oportunističkih bakterija (Escherichia, Shigella, itd.) potrošnja željeza u tijelu domaćina je otežana zbog njegove netopivosti na neutralnim i blago alkalnim pH vrijednostima. |
Siderofori - posebne supstance koje ga, vezujući gvožđe, čine rastvorljivim i prenosivim. |
|
|
Asimilacija |
Bakterije aktivno asimiliraju SO2 / i PO34 + anione iz okoline za sintezu spojeva koji sadrže ove elemente (aminokiseline koje sadrže sumpor, fosfolipide, itd.). |
||
|
Za rast i razmnožavanje bakterija potrebna su mineralna jedinjenja - joni NH4+, K+, Mg2+ itd. (za više detalja videti tabelu 2.3.1.) |
|||
Tabela 2.3.3. Jonska izmjena
|
Naziv mineralnih jedinjenja |
Funkcija |
|
|
NH 4 + (amonijum joni) |
Koriste ga neke bakterije za sintezu aminokiselina |
|
|
K + (joni kalija) |
Koristi se za vezivanje t-RNA za ribozome Održavajte visok osmotski pritisak |
|
|
Fe 2+ (joni gvožđa) |
Igraju ulogu kofaktora u brojnim enzimskim procesima Ulaze u sastav citohroma i drugih hemoproteina |
|
|
Mg 2+ (joni magnezijuma) |
||
|
SO 4 2 - (sulfatni anion) |
Neophodan za sintezu spojeva koji sadrže ove elemente (aminokiseline koje sadrže sumpor, fosfolipidi, itd.) |
|
|
PO 4 3- (fosfatni anion) |
Šema 2.4.1. Energetski metabolizam.
Za sintezu, bakterijama je potrebno...
Nutrients
Tabela 2.4.1. Energetski metabolizam (biološka oksidacija).
|
Proces |
potrebno: |
|
|
Sinteza strukturnih komponenti mikrobnih ćelija i održavanje vitalnih procesa |
Adekvatna količina energije. Ovu potrebu zadovoljava biološka oksidacija, kao rezultat koje se sintetiziraju molekuli ATP-a. |
|
|
energija (ATP) |
Bakterije željeza primaju energiju koja se oslobađa prilikom njihove direktne oksidacije željeza (Fe2+ u Fe3+), koja se koristi za fiksiranje CO2, bakterije koje metaboliziraju sumpor, osiguravaju se energijom zbog oksidacije spojeva koji sadrže sumpor. Međutim, velika većina prokariota dobija energiju dehidrogenacijom. Energija se takođe prima tokom disanja (pogledajte detaljnu tabelu u odgovarajućem odeljku). |
Šema 2.4. Biološka oksidacija u prokariota.
Razgradnja polimera na monomere
Ugljikohidrati
glicerin i masne kiseline
amino kiseline
monosaharidi
Raspadanje u anoksičnim uslovima
Formiranje intermedijarnih proizvoda
Oksidacija u uslovima kiseonika do finalnih proizvoda
Tabela 2.4.2. Energetski metabolizam.
|
Koncept |
Karakteristično |
|
|
Suština energetskog metabolizma |
Osiguravanje ćelija energijom potrebnom za ispoljavanje života. |
|
|
ATP molekul se sintetizira kao rezultat prijenosa elektrona od njegovog primarnog donora do konačnog akceptora. |
||
|
Disanje je biološka oksidacija (razgradnja). U zavisnosti od toga šta je konačni akceptor elektrona, postoje dah: Aerobni - tokom aerobnog disanja, molekularni kiseonik O 2 služi kao konačni akceptor elektrona. Anaerobno - anorganska jedinjenja služe kao konačni akceptor elektrona: NO 3 -, SO 3 -, SO 4 2- |
||
|
Mobiliziranje energije |
Energija se mobilizira u reakcijama oksidacije i redukcije. |
|
|
Reakcija oksidacije |
Sposobnost supstance da donira elektrone (oksidira) |
|
|
Reakcija oporavka |
Sposobnost supstance da veže elektrone. |
|
|
Redox potencijal |
Sposobnost supstance da donira (oksidira) ili primi (oporavi) elektrone. (kvantitativni izraz) |
Šema 2.5. Sinteza.
ugljikohidrati
Tabela 2.5.1. Sinteza
Tabela 2.5.1. Sinteza
|
Biosinteza |
Od čega |
Bilješke (uredi) |
|
|
Biosinteza ugljikohidrata |
Autotrofi sintetiziraju glukozu iz CO2. Heterotrofi sintetiziraju glukozu iz spojeva koji sadrže ugljik. |
Calvinov ciklus (vidi dijagram 2.2.1.) |
|
|
Biosinteza aminokiselina |
Većina prokariota može sintetizirati sve aminokiseline iz: piruvat α-ketoglutarat fumorate |
Izvor energije je ATP. Piruvat nastaje u glikolitičkom ciklusu. Auksotrofni mikroorganizmi – konzumiraju se gotovi u tijelu domaćina. |
|
|
Biosinteza lipida |
Lipidi se sintetiziraju iz jednostavnijih spojeva - metaboličkih proizvoda proteina i ugljikohidrata |
Acetil-transfer proteini igraju važnu ulogu. Auksotrofni mikroorganizmi – konzumiraju se gotovi u tijelu domaćina ili iz hranjivih podloga. |
Tabela 2.5.2. Glavne faze biosinteze proteina.
|
Faze |
Karakteristično |
Bilješke (uredi) |
|
|
Transkripcija |
Proces sinteze RNK na genima. Ovo je proces prepisivanja informacija sa DNK - gena na mRNA - gen. |
Izvodi se korištenjem DNK - zavisne RNK - polimeraze. Prijenos informacija o strukturi proteina do ribozoma odvija se uz pomoć mRNA. |
|
|
Emitiranje (prijenos) |
Proces vlastite biosinteze proteina. Proces dekodiranja genetskog koda u mRNA i implementacije u obliku polipeptidnog lanca. |
Budući da svaki kodon sadrži tri nukleotida, isti genetski tekst može se čitati na tri različita načina (počevši od prvog, drugog i trećeg nukleotida), odnosno u tri različita okvira čitanja. |
Napomena uz tabelu: Primarna struktura svakog proteina je redoslijed aminokiselina u njemu.
Šema 2.5.2. Lanci prijenosa elektrona od primarnog donora vodonika (elektrona) do njegovog konačnog akceptora O2.
Organska materija
(primarni donor elektrona)
Flavoprotein (- 0,20)
kinon (- 0, 07)
citokrom (+0,01)
citokrom C (+0,22)
citokrom A (+0,34)
konačni akceptor
Tabela 3.1. Klasifikacija organizama prema vrstama hrane.
|
Organogeni element |
Vrste hrane |
Karakteristično |
|
|
ugljik (C) |
Autotrofi |
Oni sami sintetiziraju sve komponente ćelije koje sadrže ugljik iz CO 2. |
|
|
Heterotrofi |
Ne mogu da zadovolje svoje potrebe sa CO 2, već koriste gotova organska jedinjenja. |
||
|
Saprofiti |
Izvor hrane su mrtvi organski supstrati. |
||
|
Izvor hrane su živa tkiva životinja i biljaka. |
|||
|
Prototrofi |
Zadovoljiti svoje potrebe atmosferskim i mineralnim azotom |
||
|
Auksotrofi |
Potrebna su gotova organska azotna jedinjenja. |
||
|
Vodik (H) |
Glavni izvor je H2O |
||
|
kiseonik (O) |
|||
Tabela 3.1.2. Transformacija energije
Tabela 3.1.3. Metode hranjenja ugljikom
|
Izvor energije |
Donator elektrona |
Metoda hranjenja ugljenikom |
|
|
Sunčeva energija |
Neorganska jedinjenja |
Fotolitoheterotrofi |
|
|
Organska jedinjenja |
Fotoorganoheterotrofi |
||
|
Redox reakcije |
Neorganska jedinjenja |
Chemolithotheterotrophs |
|
|
Organska jedinjenja |
Hemoorganoheterotrofi |
Tabela 3.2. Mehanizmi snage:
|
Mehanizam |
Uslovi |
Gradijent koncentracije |
Potrošnja energije |
Specifičnost supstrata |
|
|
Pasivna difuzija |
Koncentracija hranjivih tvari u mediju je veća od koncentracije u ćeliji. |
Po gradijentu koncentracije | |||
|
Olakšana difuzija |
Uključeni su proteini permeaze. |
Po gradijentu koncentracije | |||
|
Aktivan transport |
Uključeni su proteini permeaze. | ||||
|
Translokacija hemijskih grupa |
Tokom procesa transfera dolazi do hemijske modifikacije hranljivih materija. |
Protiv gradijenta koncentracije |
Tabela 3.3. Transport nutrijenata iz bakterijske ćelije.
|
Ime |
Karakteristično |
|
|
Reakcija fosfotransferaze |
Javlja se prilikom fosforilacije prenesene molekule. |
|
|
Translaciona sekrecija |
U tom slučaju, sintetizirani molekuli moraju imati posebnu vodeću aminokiselinsku sekvencu kako bi se vezali za membranu i formirali kanal kroz koji proteinski molekuli mogu pobjeći u okolinu. Tako se iz ćelija odgovarajućih bakterija oslobađaju toksini tetanusa, difterije i drugih molekula. |
|
|
Pupanje membrane |
Molekuli formirani u ćeliji okruženi su membranskim vezikulom, koji je uvezan u okolinu. |
Tabela 4. Rast.
|
Koncept |
Definicija pojma. |
|
|
Nepovratno povećanje količine žive tvari, najčešće zbog diobe stanica. Ako se kod višećelijskih organizama obično opaža povećanje veličine tijela, tada se kod višećelijskih organizama povećava broj stanica. Ali čak i kod bakterija treba razlikovati povećanje broja ćelija i povećanje ćelijske mase. |
||
|
Faktori koji utječu na rast bakterija in vitro. |
Kulturni mediji: Mycobacterium leprae nije sposobna za in vitro Temperatura (porast u opsegu): Mezofilne bakterije (20-40 o C) Termofilne bakterije (50-60 o C) Psihrofilni (0-10 o C) |
|
|
Procjena rasta bakterija |
Kvantifikacija rasta obično se provodi u tekućim medijima gdje rastuće bakterije formiraju homogenu suspenziju. Povećanje broja ćelija utvrđuje se određivanjem koncentracije bakterija u 1 ml, ili se povećanje ćelijske mase utvrđuje u jedinicama težine po jedinici zapremine. |
Faktori rasta
Amino kiseline
Vitamini
Azotne baze
Tabela 4.1. Faktori rasta
|
Faktori rasta |
Karakteristično |
Funkcija |
||
|
Amino kiseline |
|
Mnogim mikroorganizmima, posebno bakterijama, potrebna je jedna ili više aminokiselina (jedna ili više), budući da ih ne mogu sami sintetizirati. Mikroorganizmi ove vrste nazivaju se auksotrofnim za one aminokiseline ili druge spojeve koje nisu u stanju sintetizirati. |
||
|
Purinske baze i njihovi derivati |
nukleotidi: |
Oni su faktori rasta bakterija. Nekim vrstama mikoplazmi su potrebni nukleotidi. Potreban za izgradnju nukleinskih kiselina. |
||
|
Pirimidinske baze i njihovi derivati |
Nukleotidi |
|||
|
Faktori rasta |
Karakteristično |
Funkcija |
||
|
Neutralni lipidi |
Dio membranskih lipida |
|||
|
Fosfolipidi |
||||
|
Masna kiselina |
Sastojci su fosfolipida |
|||
|
Glikolipidi |
U mikoplazmi su dio citoplazmatske membrane |
|||
|
Vitamini (uglavnom grupa B) |
tiamin (B1) |
Staphylococcus aureus, pneumokok, Brucella |
||
|
nikotinska kiselina (B3) |
Sve vrste štapićastih bakterija |
|||
|
folna kiselina (B9) |
Bifidobakterije i propionska kiselina |
|||
|
Pantotenska kiselina (B5) |
Neke vrste streptokoka, bacili tetanusa |
|||
|
biotin (B7) |
Kvasac i bakterije koje fiksiraju dušik Rhizobium |
|||
|
Hemovi - komponente citokroma |
Hemofilne bakterije, mikobakterija tuberkuloze |
|||
Tabela 5. Disanje.
|
Ime |
Karakteristično |
|
|
Biološka oksidacija (enzimske reakcije) |
||
|
Baza |
Disanje se zasniva na redoks reakcijama koje dovode do stvaranja ATP-a, univerzalnog akumulatora hemijske energije. |
|
|
Procesi |
Prilikom disanja odvijaju se sljedeći procesi: Oksidacija je doniranje vodonika ili elektrona od strane donatora. Redukcija je vezanje vodika ili elektrona za akceptor. |
|
|
Aerobno disanje |
Konačni akceptor vodonika ili elektrona je molekularni kiseonik. |
|
|
Anaerobno disanje |
Akceptor vodonika ili elektrona je neorgansko jedinjenje - NO 3 -, SO 4 2-, SO 3 2-. |
|
|
Fermentacija |
Organska jedinjenja su akceptori vodonika ili elektrona. |
Tabela 5.1. Klasifikacija disanja.
|
Bakterije |
Karakteristično |
Bilješke (uredi) |
|
|
Strogi anaerobi |
Razmjena energije odvija se bez sudjelovanja slobodnog kisika. Sinteza ATP-a tokom potrošnje glukoze u anaerobnim uslovima (glikoliza) nastaje usled fosforilacije supstrata. Kiseonik za anaerobe ne služi kao konačni akceptor elektrona. Štoviše, molekularni kisik ima toksičan učinak na njih. |
strogim anaerobima nedostaje enzim katalaza, stoga, akumulirajući se u prisustvu kisika, ima baktericidni učinak na njih; strogim anaerobima nedostaje sistem za regulaciju redoks potencijala (redox potencijal). |
|
|
Strogi aerobi |
Oni su u stanju da primaju energiju samo disanjem i stoga im je nužno potreban molekularni kiseonik. Organizmi koji primaju energiju i formiraju ATP koristeći samo oksidativnu fosforilaciju supstrata, gdje samo molekularni kisik može djelovati kao oksidans. Rast većine aerobnih bakterija zaustavlja se pri koncentraciji kisika od 40-50% i više. |
Strogi aerobi uključuju, na primjer, predstavnike roda Pseudomonas |
|
|
Bakterije |
Karakteristično |
Bilješke (uredi) |
|
|
Fakultativni anaerobi |
Raste u prisustvu i odsustvu molekularnog kiseonika Aerobni organizmi najčešće sadrže tri citokroma, fakultativni anaerobi - jedan ili dva, obvezni anaerobi ne sadrže citokrome. |
Fakultativni anaerobi uključuju enterobakterije i mnoge kvasce koji mogu preći s disanja u prisustvu 0 2 na fermentaciju u odsustvu 0 2. |
|
|
Mikroaerofili |
Mikroorganizam koji za svoj rast zahtijeva, za razliku od strogih anaerobnih, prisustvo kisika u atmosferi ili hranjivom mediju, ali u smanjenim koncentracijama u odnosu na sadržaj kisika u običnom zraku ili u normalnim tkivima tijela domaćina (za razliku od aerobnih). , koji zahtijevaju normalan sadržaj kisika u atmosferi ili hranljivom mediju). Mnogi mikroaerofili su također kapnofili, odnosno zahtijevaju povećanu koncentraciju ugljičnog dioksida. |
U laboratoriji se takvi organizmi lako uzgajaju u "tegli za svijeće". "Tegla za svijeće" je posuda u koju se ubacuje zapaljena svijeća prije nego što se zatvori hermetičkim poklopcem. Plamen svijeće će gorjeti sve dok se ne ugasi zbog nedostatka kisika, zbog čega se u limenci stvara atmosfera zasićena ugljičnim dioksidom sa smanjenim sadržajem kisika. |
Tabela 6. Karakteristike reprodukcije.
Šema 6. Ovisnost trajanja generacije o različitim faktorima.
Trajanje generacije
Vrsta bakterije
Populacija
Temperatura
Sastav hranljive podloge
Tabela 6.1. Faze razmnožavanja bakterija.
|
Faza |
Karakteristično |
|
|
Početna stacionarna faza |
Traje 1-2 sata. Tokom ove faze, broj bakterijskih ćelija se ne povećava. |
|
|
Lag faza (faza kašnjenja reprodukcije) |
Karakterizira ga početak intenzivnog rasta stanica, ali stopa diobe stanica ostaje niska. |
|
|
Log faza (logaritamska) |
Razlikuje se po maksimalnoj stopi reprodukcije ćelija i eksponencijalnom povećanju broja bakterijske populacije |
|
|
Faza negativnog ubrzanja |
Karakterizira ga niža aktivnost bakterijskih stanica i produljenje perioda generiranja. To se događa kao rezultat iscrpljivanja hranjivog medija, nakupljanja metaboličkih proizvoda u njemu i nedostatka kisika. |
|
|
Stacionarna faza |
Karakteriše ga ravnoteža između broja mrtvih, novonastalih i uspavanih ćelija. |
|
|
Faza propasti |
Javlja se konstantnom brzinom i zamjenjuje se UP-USH fazama smanjenja stope ćelijske smrti. |
Šema 7. Zahtjevi za medije kulture.
Zahtjevi
Viskoznost
Vlažnost
Sterilnost
Nutritivna vrijednost 
Transparentnost
Izotoničnost
Tabela 7. Reprodukcija bakterija na hranljivim podlogama.
|
Hranljivi medij |
Karakteristično |
||
|
Gusti hranljivi mediji |
Na gustim hranjivim podlogama bakterije formiraju kolonije - nakupine stanica. |
||
|
S- vrstu(glatka - glatka i sjajna) Okrugla, sa ravnom ivicom, glatka, konveksna. |
R- vrstu(grubo - grubo, neravno) Nepravilnog oblika sa nazubljenim ivicama, hrapav, udubljen. |
||
|
Tečni mediji za kulturu |
Rast na dnu (sediment) Rast površine (film) Difuzni rast (ujednačena magla) |
||
Tabela 7.1. Klasifikacija medija kulture.
|
Klasifikacija |
Pregledi |
Primjeri |
|
|
Po sastavu |
MPA - Meat Pepton Agar BCH - mesno-peptonski bujon PV - peptonska voda |
||
|
Krvni agar YSA - agar od žumanca Giss Wednesday |
|||
|
Po dogovoru |
Glavni | ||
|
Izborni |
Alkalni agar Alkalna peptonska voda |
||
|
Diferencijalno - dijagnostički |
|
||
|
Poseban |
Wilson-Blair Kitta-Tarozzi Tioglikolni bujon Mlijeko prema Tukajevu |
||
|
Po doslednosti |
Krvni agar Alkalni agar |
||
|
Polutečno |
Polutečni agar |
||
|
Po poreklu |
Prirodno | ||
|
Polusintetički | |||
|
Sintetički |
|
Tabela 7.2. Principi izolacije čiste ćelijske kulture.
|
Mehanički princip |
Biološki princip |
|
1. Frakcijska razrjeđenja L. Pasteura 2. Razblaženja ploča R. Koch 3. Površinski usjevi Drigalsky 4. Površinski potezi |
Uzmite u obzir: a - tip disanja (Fortnerova metoda); b - mobilnost (Shukevichova metoda); c - otpornost na kiseline; d - sporulacija; d - temperaturni optimum; e - selektivna osjetljivost laboratorijskih životinja na bakterije |
Tabela 7.2.1. Faze izolacije čiste ćelijske kulture.
|
Stage |
Karakteristično |
|
|
Faza 1 istraživanja |
Odnesite patološki materijal. Proučavaju ga - izgled, teksturu, boju, miris i druge znakove, pripremaju bris, farbaju i ispituju pod mikroskopom. |
|
|
Faza 2 istraživanja |
Na površini guste hranjive podloge mikroorganizmi formiraju kontinuirani, gust rast ili izolirane kolonije. Kolonija- To su nakupine bakterija vidljive golim okom na površini ili u debljini hranljive podloge. U pravilu se svaka kolonija formira od potomaka jedne mikrobne ćelije (klonova), pa je njihov sastav prilično homogen. Karakteristike rasta bakterija na hranljivim medijima su manifestacija njihovih kulturnih svojstava. |
|
|
Faza 3 istraživanja |
Proučava se priroda rasta čiste kulture mikroorganizama i vrši se njena identifikacija. |
Tabela 7.3. Identifikacija bakterija.
|
Ime |
Karakteristično |
|
|
Biohemijska identifikacija |
Određivanje vrste patogena prema njegovim biohemijskim svojstvima |
|
|
Serološka identifikacija |
Da bi se utvrdila vrsta bakterija, često se proučava njihova antigena struktura, odnosno identifikacija se vrši po antigenskim svojstvima. |
|
|
Identifikacija prema biološkim svojstvima |
Ponekad se bakterije identificiraju inficiranjem laboratorijskih životinja čistom kulturom i promatranjem promjena koje patogeni uzrokuju u tijelu. |
|
|
Kulturna identifikacija |
Određivanje vrste patogena prema njihovim kulturnim karakteristikama |
|
|
Morfološka identifikacija |
Određivanje vrste bakterija prema njihovim morfološkim karakteristikama |
Koji od procesa nije povezan s fiziologijom bakterija?
Reprodukcija
Koje tvari čine 40-80% suhe mase bakterijske ćelije?
Ugljikohidrati
Nukleinske kiseline
Koje klase enzima sintetiziraju mikroorganizmi?
Oksi reduktaza
Sve klase
Transferaze
Enzimi, čija koncentracija u ćeliji naglo raste kao odgovor na pojavu induktorskog supstrata u mediju?
Iiducible
Ustavno
Represivno
Multienzimski kompleksi
Enzim patogenosti koji luči Staphylococcus aureus?
Neuraminidaza
Hijaluronidaza
Lecitinaza
Fibrinolizin
Da li proteolitički enzimi obavljaju funkciju?
Razgradnja proteina
Razbijanje masti
Razgradnja ugljikohidrata
Formiranje alkalija
Fermentacija Enterobacteriaceae?
Mliječna kiselina
Mravlja kiselina
Propionska kiselina
Maslačna kiselina
Koja mineralna jedinjenja se koriste za vezivanje t-RNA za ribozome?
Biološka oksidacija je ...?
Reprodukcija
Ćelijska smrt
Koje tvari same sintetiziraju sve komponente ćelije koje sadrže ugljik iz CO 2.
Prototrofi
Heterotrofi
Autotrofi
Saprofiti
Kulturni mediji se razlikuju:
Po sastavu
Po doslednosti
Po dogovoru
Sve navedeno
Faza reprodukcije, koju karakteriše ravnoteža između broja mrtvih, novonastalih i uspavanih ćelija?
Faza negativnog ubrzanja
Stacionarna faza
Trajanje generacije zavisi od?
Dob
Populacije
Sve navedeno
Da bi se utvrdila vrsta bakterija, često se proučava njihova antigena struktura, odnosno vrši se identifikacija, koja?
Biološki
Morfološki
Serološki
Biohemijski
Metoda površinske sjetve Drygalskog se naziva ...?
Mehanički principi izolacije čiste kulture
Biološki principi izolacije čiste kulture
Bibliografija
1. Borisov LB Medicinska mikrobiologija, virologija, imunologija: udžbenik za med. univerziteti. - M.: DOO "Medicinska informativna agencija", 2005.
2. Pozdeev OK Medicinska mikrobiologija: udžbenik za med. univerziteti. - M.: GEOTAR-MED, 2005.
3. Korotyaev AI, Babichev SA Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija / udžbenik za med. univerziteti. - SPb.: SpetLit, 2000.
4. Vorobiev A.A., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija: udžbenik. - M.: Medicina, 2003.
5. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija: udžbenik / ur. V.V. Zvereva, M.N. Boychenko. - M.: GEOTar-Media, 2014.
6. Vodič za praktičnu obuku iz medicinske mikrobiologije, virologije i imunologije / ur. V. V. Teza. - M.: Medicina, 2002.
Uvod 6
Sastav bakterija sa stanovišta njihove fiziologije. 7
Metabolizam 14
Ishrana (transport hranljivih materija) 25
Dah 31
Uzgoj 34
Mikrobne zajednice 37
PRILOZI 49
Literatura 105
Antigenska struktura mikroorganizama je vrlo raznolika. U mikroorganizmima se razlikuju opšti, ili grupni, i specifični, ili tipični, antigeni.
Grupne antigene dijele dvije ili više vrsta mikroba koji pripadaju istom rodu, a ponekad i različitim rodovima. Dakle, antigeni zajedničke grupe nalaze se u određenim tipovima roda Salmonella; uzročnici trbušnog tifusa imaju zajedničke antigene grupe sa uzročnicima paratifusa A i paratifusa B (0-1,12).
Specifični antigeni su prisutni samo u datom tipu mikroba, ili čak samo u određenom tipu (varijanti) ili podtipu unutar vrste. Određivanje specifičnih antigena omogućava razlikovanje mikroba unutar roda, vrste, podvrste, pa čak i tipa (podtipa). Dakle, unutar roda Salmonella, kombinacijom antigena razlikuje se više od 2000 tipova Salmonella, a u podvrsti Shigella Flexner - 5 serotipova (serovarijanti).
Prema lokalizaciji antigena u mikrobnoj ćeliji razlikuju se somatski antigeni povezani sa tijelom mikrobne ćelije, kapsularni antigeni - površinski ili omotačni antigeni i flagelarni antigeni koji se nalaze u flagelama.
Somatski, O-antigeni(od njemačkog ohne Hauch - bez disanja), povezuju se s tijelom mikrobne ćelije. Kod gram-negativnih bakterija, O-antigen je složen kompleks lipid-polisaharid-proteinske prirode. Veoma je toksičan i endotoksin ovih bakterija. Kod uzročnika koknih infekcija, vibriona kolere, uzročnika bruceloze, tuberkuloze i nekih anaeroba, iz tijela mikrobnih stanica izoluju se polisaharidni antigeni koji određuju tipičnu specifičnost bakterija. Kao antigeni, mogu biti aktivni u čistom obliku iu kombinaciji s lipidima.
Flagelati, H antigeni(od njemačkog. Hauch - disanje), proteinske su prirode i nalaze se u flagelama pokretnih mikroba. Antigeni flagelata se brzo uništavaju toplotom i fenolom. Dobro su očuvani u prisustvu formalina. Ovo svojstvo se koristi u proizvodnji mrtvih kumova kod kojih je dijagnosticirana reakcija aglutinacije, kada je potrebno sačuvati flagelu.
Kapsula, K - antigeni, - nalaze se na površini mikrobne ćelije i nazivaju se i površina ili ljuska. Najdetaljnije su proučavani kod mikroba iz intestinalne porodice, u kojima se razlikuju Vi-, M-, B-, L- i A-antigeni. Od njih je veliki značaj Vi antigen. Prvi put je otkriven u sojevima bakterija trbušnog tifusa s visokom virulentnošću, a nazvan je antigen virulencije. Kada je osoba imunizirana kompleksom O- i Vi-antigena, uočava se visok stepen zaštite od tifusne groznice. Vi-antigen se uništava na 60°C i manje je toksičan od O-antigena. Također se nalazi u drugim crijevnim mikrobima, kao što je E. coli.
Zaštitni(od lat. protectio - pokroviteljstvo, zaštita), ili zaštitni, antigen nastaje od mikroba antraksa u organizmu životinja i nalazi se u raznim eksudatima oboljelih od antraksa. Zaštitni antigen je dio egzotoksina koji luči mikrob antraksa i može izazvati razvoj imuniteta. Kao odgovor na uvođenje ovog antigena, formiraju se antitijela koja se vezuju za komplement. Zaštitni antigen se može dobiti uzgojem antraks mikroba na složenom sintetičkom mediju. Od zaštitnog antigena pripremljena je visokoefikasna hemijska vakcina protiv antraksa. Zaštitni zaštitni antigeni pronađeni su i kod uzročnika kuge, bruceloze, tularemije, velikog kašlja.
Kompletni antigeni izazivaju sintezu antitijela ili senzibilizaciju limfocita u tijelu i reagiraju s njima i in vivo i in vitro. Za visokogradne antigene karakteristična je stroga specifičnost, odnosno uzrokuju da tijelo proizvodi samo specifična antitela koja reaguju samo sa ovim antigenom. Ovi antigeni uključuju proteine životinjskog, biljnog i bakterijskog porijekla.
Defektni antigeni (haptens) su složeni ugljikohidrati, lipidi i druge tvari koje nisu sposobne izazvati stvaranje antitijela, ali s njima stupaju u specifičnu reakciju. Hapteni stječu svojstva punopravnih antigena samo ako se unose u tijelo u kombinaciji s proteinom.
Tipični predstavnici haptena su lipidi, polisaharidi, nukleinske kiseline, kao i jednostavne supstance: boje, amini, jod, brom itd.
Vakcinacija kao metoda prevencije zaraznih bolesti. Istorija razvoja vakcinacije. Vakcine. Zahtjevi za vakcine. Faktori koji određuju mogućnost stvaranja vakcina.
Vakcine su biološki aktivni lijekovi koji sprječavaju razvoj zaraznih bolesti i drugih manifestacija imunopatologije. Princip upotrebe vakcina je da se unapredi stvaranje imuniteta i, kao rezultat, otpornost na razvoj bolesti. Vakcinacija se odnosi na mjere koje imaju za cilj vještačku imunizaciju stanovništva uvođenjem vakcina radi povećanja otpornosti na bolest. Cilj vakcinacije je stvaranje imunološke memorije protiv određenog patogena.
Razlikovati pasivnu i aktivnu imunizaciju. Uvođenje imunoglobulina dobijenih iz drugih organizama je pasivna imunizacija. Koristi se i u terapeutske i u profilaktičke svrhe. Primjena vakcina je aktivna imunizacija. Glavna razlika između aktivne i pasivne imunizacije je formiranje imunološke memorije.
Imunološka memorija omogućava ubrzano i efikasnije uklanjanje stranih agenasa kada se ponovo pojave u tijelu. Osnova imunološke memorije su memorijske T i B ćelije.
Prva vakcina je dobila ime po toj reči vaccinia(kravlje boginje) je virusna bolest goveda. Engleski ljekar Edward Jenner prvi je primijenio vakcinu protiv velikih boginja dječaku Jamesu Phippsu, dobijenu iz vezikula na ruci pacijenta s vakcinijom, 1796. Samo skoro 100 godina kasnije (1876-1881) Louis Pasteur formulirao je glavni princip vakcinacije - upotreba oslabljenih preparata mikroorganizama za formiranje imuniteta protiv virulentnih sojeva.
Neke od živih vakcina kreirali su sovjetski naučnici, na primjer, P.F.Zdrodovsky je stvorio vakcinu protiv tifusa 1957-59. Vakcinu protiv gripa kreirala je grupa naučnika: A. A. Smorodincev, V. D. Solovjev, V. M. Ždanov 1960. godine. P. A. Vershilova je 1947-51 stvorila živu vakcinu za brucelozu.
Vakcina mora ispunjavati sljedeće uslove:
● aktivirati ćelije uključene u procesiranje i prezentaciju antigena;
● sadrže epitope za T i T ćelije, obezbeđujući ćelijski i humoralni odgovor;
● jednostavan za obradu uz naknadnu efektivnu prezentaciju antigena histokompatibilnosti;
● indukuju stvaranje efektorskih T-ćelija, ćelija koje proizvode antitela i odgovarajućih memorijskih ćelija;
● spriječiti razvoj bolesti na duže vrijeme;
● biti bezopasan, odnosno ne izazivati ozbiljne bolesti i neželjene efekte.
Efikasnost vakcinacije je zapravo procenat vakcinisanih koji su na vakcinaciju odgovorili formiranjem specifičnog imuniteta. Dakle, ako je efikasnost određene vakcine 95%, onda to znači da je od 100 vakcinisanih 95 pouzdano zaštićeno, a 5 je i dalje u opasnosti od bolesti. Efikasnost vakcinacije određuju tri grupe faktora. Faktori u zavisnosti od preparata vakcine: svojstva same vakcine koja određuju njenu imunogenost (živa, inaktivirana, korpuskularna, podjedinica, količina imunogena i adjuvansa, itd.); kvalitet preparata vakcine, odnosno imunogenost se ne gubi usled isteka roka trajanja vakcine ili zbog činjenice da nije pravilno skladištena ili transportovana. Faktori u zavisnosti od vakcinisanog: genetski faktori koji određuju fundamentalnu mogućnost (ili nemogućnost) razvoja specifičnog imuniteta; godine, jer je imuni odgovor usko određen stepenom zrelosti imunog sistema; zdravstveno stanje "općenito" (rast, razvoj i malformacije, prehrana, akutne ili kronične bolesti itd.); pozadinsko stanje imunog sistema je prvenstveno prisustvo urođenih ili stečenih imunodeficijencija.
Federalna agencija za obrazovanje
Bijski tehnološki institut (filijala)
državna obrazovna ustanova
na predmetima "Opća biologija i mikrobiologija", "Mikrobiologija" za studente specijalnosti 240901 "Biotehnologija",
260204 "Tehnologija proizvodnje fermentacije i vinarstva"
svim oblicima obrazovanja
UDK 579.118: 579.22
Kamenskaya, mikroorganizmi: smjernice za laboratorijski rad na predmetima „Opća biologija
i mikrobiologija“, „Mikrobiologija“ za studente specijalnosti 240901 „Biotehnologija“, 260204 „Tehnologija fermentacione proizvodnje i vinarstva“ svih oblika obrazovanja/,
.
Alt. stanje tech. un-t, BTI. - Biysk:
Izdavačka kuća Alt. stanje tech. Univerzitet, 2007. - 36 str.
Ove smjernice razmatraju osnovne koncepte, pravila i principe klasifikacije i identifikacije mikroorganizama. Prikazan je laboratorijski rad na proučavanju različitih svojstava bakterija neophodnih za opis bakterijskog soja i njegovu identifikaciju do nivoa roda.
Pregledano i odobreno
na sednici odeljenja
"Biotehnologija".
Zapisnik broj 88 od 01.01.2001
Recenzent:
Doktor bioloških nauka, profesor, BPGU im
© BTI AltSTU, 2007
1 OSNOVNI POJMOVI I PRAVILA IMENOVANJA
MIKROORGANIZMI
Opisano je nekoliko hiljada vrsta mikroorganizama, ali se vjeruje da je to manje od 1 % od pravih. Proučavanje raznolikosti mikroorganizama je predmet taksonomije. Njegov glavni zadatak je stvaranje prirodnog sistema koji odražava filogenetske odnose mikroorganizama. Donedavno se taksonomija mikroorganizama bazirala uglavnom na fenotipskim karakteristikama: morfološkim, fiziološkim, biohemijskim itd., stoga su postojeći sistemi klasifikacije uglavnom umjetni. Međutim, oni olakšavaju identifikaciju nekih novoizoliranih sojeva mikroorganizama.
Taksonomija uključuje dijelove kao što su klasifikacija, nomenklatura i eden tifikacija . Klasifikacija određuje redoslijed smještanja jedinki sa datim stepenom homogenosti u određene grupe (taksone). Nomenklatura je skup pravila za imenovanje svojti. Identifikacija znači utvrđivanje pripadnosti proučavanog organizma određenoj taksonu.
Termin "taksonomija" se često koristi kao sinonim za taksonomiju, ali se ponekad shvata kao grana taksonomije koja uključuje teoriju klasifikacije, doktrinu sistema taksonomskih kategorija, granice i podređenost svojti. Glavna taksonomska kategorija u mikrobiologiji, kao iu drugim biološkim naukama, je pogled- skup jedinki koje karakteriše niz zajedničkih morfoloških, fiziološko-biohemijskih, molekularno-genetskih karakteristika.
Pod pojmom "soj" se podrazumijeva čista kultura mikroorganizma izolovanog iz određenog staništa (voda, tlo, životinjski organizam, itd.). Različiti sojevi istog tipa mikroorganizama mogu se razlikovati po nekim osobinama, na primjer, osjetljivosti na antibiotike, sposobnosti sintetiziranja određenih metaboličkih proizvoda, itd., ali su te razlike manje od razlika u vrsti. Koncept "soj" u mikrobiologiji i genetici je nešto drugačiji: u mikrobiologiji je ovaj koncept širi. Tipovi mikroorganizama su grupisani u taksonomske kategorije višeg reda: rodovi, porodice, redovi, klase, odjeli, kraljevstva. Ove kategorije se nazivaju obaveznim. Postoje i izborne kategorije: podklasa, podred, potporodica, pleme, podplemena, podrod, podvrsta. Međutim, u taksonomiji, neobavezne kategorije se rijetko koriste.
Nomenklatura mikroorganizama podliježe međunarodnim pravilima. Dakle, postoji Međunarodni kodeks nomenklature za bakterije. Za kvasce, glavni vodič je „Kvasci. Taksonomska studija“, za filamentne gljive i alge - Međunarodni kodeks botaničke nomenklature.
Za imenovanje objekata u mikrobiologiji, kao u zoologiji i botanici, koristite binarno ili binomno (od lat. bis- dva puta) sistem nomenklature, prema kojem svaka vrsta ima naziv koji se sastoji od dvije latinske riječi. Prva riječ označava rod, a druga definira određenu vrstu ovog roda i naziva se specifičnim epitetom. Generičko ime se uvijek piše velikim slovom, a specifično – malim slovima čak i ako je određeni epitet dodijeljen u čast naučnika, na primjer Clostridium pasteurianum. U tekstu, posebno sa latiničnim grafikama, ceo izraz je ispisan kurzivom. Kada se ponovo spomene naziv mikroorganizma, generički naziv se može skratiti na jedno ili više početnih slova, npr. WITH.pasteurianum. Ako tekst sadrži nazive dva mikroorganizma koji počinju istim slovom (npr. Clostridium pasteurianum i Citrobacterfreundii), onda skraćenice moraju biti različite (C. pasteurianum i Ct. freundii). Ako se mikroorganizam identificira samo s rodom, umjesto specifičnog epiteta upisuje se riječ sp. (vrste- pogled), na primjer Pseudomonas sp. U tom slučaju, prilikom ponovnog spominjanja naziva mikroorganizma u tekstu, generički naziv treba uvijek napisati u cijelosti.
Za naziv podvrste koristi se izraz koji se sastoji od naziva roda, kao i epiteta specifične i podvrste. Da bi se razlikovali između ovih epiteta, između njih je napisana kombinacija slova, što je skraćena riječ podvrsta - "subsp". ili (rjeđe) "ss." Na primjer, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Za svaki soj navode i skraćenicu naziva zbirke kultura mikroorganizama u kojoj se čuva i broj pod kojim se tu pojavljuje. Na primjer, Clostridium butyricum ATCC 19398 znači da je soj pohranjen u American Type Culture Collection (ATCC) pod brojem 19398. Za listu svjetski poznatih kolekcija mikroba, pogledajte Bergeysov priručnik za sistematsku bakteriologiju (1984–1989), u katalozima kultura mikroorganizama i druge referentne publikacije.
Opis svake nove vrste mikroorganizama zasniva se na tipičnom soju koji je pohranjen u jednoj od zbirki mikroorganizama i na osnovu kombinacije svojstava ove vrste.
okarakteriziran u originalnom članku ili kvalifikatoru. Tipski soj je nomenklaturni tip vrste, budući da mu je dodijeljen naziv vrste. Ako se za bilo koji soj, koji je prvobitno bio uključen u istu vrstu, kasnije utvrdi da zaslužuje da se odvoji u posebne vrste, treba im dati nova imena, a stari naziv vrste se zadržava za tip i srodne sojeve. U ovom slučaju, broj preimenovanog soja ostaje isti. Autentični sojevi su oni koji se potpuno podudaraju po svojim svojstvima.
Za rod, tip nomenklature je posebno određena tipska vrsta, koja ima skup karakteristika najkarakterističnijih za predstavnike ove taksona. Na primjer, u rodu Bacillus tip je V.subtilis.
U nekim ključevima i katalozima navedeni su stari nazivi preimenovanih mikroorganizama, imena autora koji su prvi izolovali ovaj mikroorganizam i godina izdanja u kojoj je ovaj organizam prvi put opisan. Na primjer, jedna od vrsta kvasca navedena je u katalogu Sveruske zbirke mikroorganizama (VKM) kao Candida magnolije(Lodder et Kreger van Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978, BKM Y-1685. To znači da su je prvi opisali Lodder i Kreger van Rij u publikaciji iz 1952. godine, a zatim je ova vrsta dobila ime Torulopsis magnolije. Godine 1978. g. Torulopsis magnolije je preimenovan od strane istraživača kao što su Meyer i Yarrow, u Candida magnolije i trenutno je pohranjen u VKM pod brojem VKM Y-1685. Y ispred broja soja označava "the Yeasts" - kvasac.
Pored pojma "soj" u mikrobiologiji se koriste izrazi "varijanta", "tip", "oblik". Obično se koriste za označavanje sojeva mikroorganizama koji se na neki način razlikuju od tipskog soja. Soj koji se razlikuje od tipičnog po morfološkim karakteristikama naziva se morfovar(morfotip), fiziološke i biohemijske karakteristike - biovar(biotip, fiziološki tip), prema sposobnosti sinteze određenih hemijskih jedinjenja - hemovar(hemoform, hemotip), uslovi uzgoja - sorta, po vrsti odgovora na uvođenje bakteriofaga - phagovar(fag, lizotip), antigenske karakteristike - serovar(serotip)
itd.
U radovima o genetici mikroorganizama, termin se često koristi "klon",što znači populaciju genetski srodnih ćelija dobijenih aseksualno iz jedne roditeljske ćelije. U molekularnoj biologiji klon se naziva višestrukim
kopije identičnih DNK sekvenci dobijenih njihovim umetanjem u vektore za kloniranje (na primjer, plazmide). Pojam "genetski modificirani" ili "rekombinantni" sojevi označavaju sojeve mikroorganizama dobivene kao rezultat genetski modificiranih manipulacija. Često se novi sojevi mikroorganizama dobivaju korištenjem mutagena.
Svaki novi soj mikroorganizama izolovan iz prirodnih ili veštačkih izvora mora biti okarakterisan kako bi se dobio kompletan skup podataka o svojstvima mikroorganizma.
u čistoj kulturi. Ovi podaci se mogu koristiti, na primjer, za izradu pasoša industrijski vrijednih sojeva, kao i za njihovu identifikaciju.
Svrha identifikacije
- utvrditi taksonomski položaj istraživanog soja na osnovu poređenja njegovih svojstava sa proučavanim i prihvaćenim (zvanično registrovanim) vrstama. Stoga je rezultat identifikacije obično identifikacija proučavanog mikroorganizma s nekom vrstom ili zadatkom
određenom rodu. Ako se ispitivani soj ili grupa sojeva po svojim svojstvima razlikuju od predstavnika poznatih svojti, onda se mogu izdvojiti u novi takson. Za to je dat opis novog taksona, uključujući, na primjer, u slučaju bakterija, sljedeće: listu sojeva uključenih u takson; karakterizacija svakog soja; spisak nekretnina koje se smatraju bitnim
u taksonu; spisak svojstava koja kvalifikuju takson za predstavljanje u sledećem višem taksonu; spisak dijagnostičkih karakteristika koje razlikuju predloženi takson od blisko povezanih taksona; poseban opis tipičnog (za vrstu) soja; fotografija mikroorganizma.
Da bi novopredloženi takson bio zvanično prihvaćen, njegov opis mora biti objavljen u skladu sa određenim pravilima. Na primjer, stvarno ili legalno objavljivanje taksona bakterija uključuje objavljivanje članka koji ga opisuje u International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Ako se publikacija pojavi u drugom uglednom naučnom časopisu (efikasna publikacija), onda se reprint članka iz tog časopisa šalje IJSEM-u. IJSEM od 1980. godine redovno objavljuje takozvane liste legalizovanih naziva bakterija. Oni navode sve nazive bakterija koji su objavljeni u IJSEM-u (važeća ili legalna publikacija) ili su efektivno objavljeni ranije u bilo kojem
drugim uglednim časopisima. Nakon što se naziv bakterije unese u listu legaliziranih IJSEM naziva, naziv je važeći, bez obzira da li je prethodno objavljen u IJSEM-u ili nekom drugom časopisu. Datum pojavljivanja objave naziva ove taksona u IJSEM-u ili na listi zakonskih naziva IJSEM-a je prioritet za takson.
Kultura tipičnog soja nove vrste mikroorganizama prenosi se na skladištenje u jednu od zbirki mikroorganizama od svjetskog značaja. U slučaju gubitka tipske deformacije, ona se može zamijeniti takozvanom netipskom deformacijom. U ovom slučaju, mora se potvrditi da se svojstva novog soja dobro slažu s opisom izgubljenog. Da bi se naznačilo da se takson po prvi put predlaže, skraćenica „fam. nov.", nova vrsta -"gen. nov.", a nova vrsta -" sp. nov.“. Na primjer,
2000. godine, sa koautorima, predložena je nova porodica bakterija - Oscillochloridaceae,
fam. nov. Izraz "species insertac sedis" znači da je riječ o vrsti koja privremeno nema određeni taksonomski status, jer nije jasno u koji takson višeg reda - rod ili porodicu - ovu vrstu treba svrstati zbog na nedostatak neophodnih eksperimentalnih
podaci.
2 OPIS I IDENTIFIKACIJA
MIKROORGANIZMI
Kao što je već napomenuto, principi klasifikacije i identifikacije različitih grupa prokariota i eukariotskih mikroorganizama imaju značajne razlike. Identifikacija gljiva prema razredima, narudžbama
i porodice zasniva se na karakterističnim karakteristikama strukture i metodama formiranja, prije svega, reproduktivnih struktura. Pored toga, koriste se karakteristike aseksualne sporulacije, struktura i stepen razvoja micelija (rudimentaran, dobro razvijen, septički ili neseptički), kulturni (kolonija) i fiziološki znaci. Diferencijacija rodova u okviru porodica i identifikacija vrsta vrše se korišćenjem dobijenih morfoloških karakteristika
korišćenjem elektronske mikroskopije, kao i fiziološke i kulturne karakteristike. Ne postoji jedinstveni identifikator za identifikaciju svih gljiva, stoga se prvo utvrđuje klasa ili redosled identifikovane gljive, a zatim se koristi odgovarajući identifikator za ovu klasu ili red.
Identifikacija gljivica kvasca, koje su među široko korišćenim objektima različitih mikrobioloških istraživanja, zasniva se na kulturnim (makromorfološkim), citološkim, fiziološkim i biohemijskim karakteristikama, karakteristikama životnih ciklusa i seksualnog procesa, specifičnim znakovima vezanim za ekologiju, a sprovodi se koriste posebne determinante za kvasac.
Taksonomija mikroskopskih oblika algi zasniva se na strukturi njihovih ćelija i sastavu pigmenata. Određivanje sistematskog položaja protozoa vrši se korišćenjem morfoloških karakteristika i životnih ciklusa. Dakle, identifikacija eukariota se uglavnom zasniva na karakteristikama njihove morfologije i razvojnih ciklusa.
Identifikacija prokariota, koji su morfološki manje raznoliki od eukariota, zasniva se na korištenju širokog spektra fenotipskih i, u mnogim slučajevima, genotipskih osobina. U većoj mjeri nego identifikacija eukariota, temelji se na funkcionalnim karakteristikama, jer se većina bakterija može identificirati ne po izgledu, već samo po saznanju koje su procese sposobne provesti.
Prilikom opisivanja i identifikacije bakterija, njihovih kulturnih svojstava, morfologije, organizacije ćelije, fizioloških i biohemijskih karakteristika, hemijskog sastava ćelija, sadržaja
gvanin i citozin (GC) u DNK, sekvenca nukleotida u genu koji kodira sintezu 16S rRNA i druge feno- i genotipske osobine. U tom slučaju se moraju poštovati sljedeća pravila: raditi s čistim kulturama, primjenjivati standardne metode istraživanja, a također koristiti ćelije koje su u aktivnom fiziološkom stanju za inokulaciju.
2.1 Kulturna dobra
Kulturološke, ili makromorfološke, osobine uključuju karakteristične karakteristike rasta mikroorganizama na čvrstim i tečnim hranljivim podlogama.
2.1.1 Rast na čvrstim hranljivim podlogama
Na površini čvrstih hranjivih podloga, ovisno o sjetvi, mikroorganizmi mogu rasti u obliku kolonije, linije ili čvrstog travnjaka. Kolonija naziva se izolirani skup stanica iste vrste, koji je u većini slučajeva izrastao iz jedne ćelije. U zavisnosti od toga gde su se ćelije razvile (na površini gustog hranljivog medija, u njegovoj debljini ili na dnu posude), razlikuju se površno, duboko i dnu kolonije.
Obrazovanje gotovonostal kolonije - najbitnija karakteristika rasta mnogih mikroorganizama na gustom supstratu. Takve kolonije su veoma raznolike. Prilikom njihovog opisivanja uzimaju se u obzir sljedeće karakteristike:
profil- ravne, konveksne, kraterolike, konusne, itd. (Slika 1);
oblik- zaobljena, ameba, nepravilna, rizoidna, itd. (Slika 2);
veličina (prečnik)- mjereno u milimetrima; ako veličina kolonije ne prelazi 1 mm, tada se nazivaju točkastim;
površine- glatka, hrapava, užljebljena, naborana, naborana, sa koncentričnim krugovima ili radijalno prugasta;
sijati i transparentnost- kolonija je sjajna, mutna, mutna, brašnasta, providna;
Boja- bezbojne (bez bojene kolonije) ili pigmentirane - bijele, žute, zlatne, narančaste
valovita, lila, crvena, crna, itd .; označite
pigmentni supstrat; pri opisivanju kolonija aktinomiceta uočava se pigmentacija micelija zraka i supstrata, kao i oslobađanje pigmenata u okoliš;
rub- glatke, valovite, nazubljene, rese itd. (Slika 3);
struktura- homogena, fino - ili krupnozrna, prugasta, itd. (Slika 4); ivica i struktura kolonije određuje se lupom ili pri malom povećanju mikroskopa. Za to se Petrijeva posuda postavlja na podijum mikroskopa sa poklopcem nadole;
konzistentnost određuje se dodirivanjem površine kolonije petljom. Kolonija se lako može izvaditi iz agara, biti gusta, mekana ili raste u agar, sluzava (ljepi se za petlju), žilasta, ima izgled filma (u potpunosti uklonjena), lomljiva (lako se lomi kada se dodirne petlja).
1 - zakrivljena; 2 - nalik na krater; 3 - kvrgav;
4 - urastanje u podlogu; 5 - stan; 6 - konveksna;
7 - u obliku kapljice; 8 - konusno
Slika 1 - Profil kolonije
Duboke kolonije naprotiv, prilično su monotoni. Najčešće izgledaju kao manje-više spljoštena sočiva,
u projekciji imaju oblik ovala sa šiljastim krajevima. Samo
kod nekoliko bakterija duboke kolonije nalikuju snopovima vate
sa filamentoznim izraslinama u hranljivi medij. Stvaranje dubokih kolonija često je praćeno pucanjem gustog medija ako mikroorganizmi ispuštaju ugljični dioksid ili druge plinove.
Donje kolonije različiti mikroorganizmi obično imaju oblik tankih prozirnih filmova koji puze po dnu.
Veličina i mnoge druge karakteristike kolonije mogu se mijenjati s godinama i zavise od sastava okoliša. Stoga, kada ih opisujete, navedite starost kulture, sastav podloge i temperaturu uzgoja.
1
- okrugli; 2
- okrugla sa zaobljenim rubom; 3
- okrugli sa valjkom uz rub; 4, 5
- rizoid; 6
- sa rizoidnim rubom; 7 - ameba;
8
- niti nalik; 9
- presavijeni; 10
- pogrešno;
11 - koncentrična; 12 - kompleks
Slika 2 - Oblik kolonije
/ - glatko; 2 - valovita; 3 - nazubljeni; 4 - oštrica; 5 - pogrešno; 6 - trepavica; 7 - filamentozna; 8 - vilous; 9 - razgranat
Slika 3 - Rub kolonije
1 - homogena; 2 - sitnozrnati; 3 - krupnozrnati;
4 - prugasta; 5 - vlaknaste
Slika 4 - Struktura kolonije
Kada se opisuje rast mikroorganizama moždanim udarom obratite pažnju na sljedeće karakteristike: oskudan, umjeren ili obilan, čvrst
sa glatkim ili valovitim rubom, perlasti, nalik lancima izoliranih kolonija, difuzni, pernati, drvoliki ili rizoidni (slika 5). Oni karakteriziraju optička svojstva plaka, njegovu boju, površinu i konzistenciju.
Da bi se opisali kolonije i rast moždanim udarom, mnogi mikroorganizmi se često uzgajaju na mezopatamia agaru. Mesopatamia želatin se također koristi. Za bolji pregled dubokih kolonija, preporučuje se bistriti podlogu agarom ili želatinom.
1 - čvrsta sa glatkom ivicom; 2 - čvrsta sa valovitim rubom; 3 - perle; 4 - difuzno; 5 - pernato; 6 - rizoid
Slika 5 - Rast bakterija duž moždanog udara
2.1.2. Rast u tečnim podlogama
Rast mikroorganizama u tekućim hranljivim medijima je ujednačeniji i praćen je zamućenjem podloge, stvaranjem filma ili sedimenta. Karakteriziranje rasta mikroorganizama u tečnom mediju, napomena stepen zamućenosti(slab, umjeren ili jak), filmske karakteristike(tanke, guste ili labave, glatke ili presavijene),
a kada se formira sediment, ukazuje se da je oskudan ili obilan, gust, labav, sluzav ili ljuskav.
Često je rast mikroorganizama praćen pojavom mirisa, pigmentacijom okoline i evolucijom gasova. Potonje se otkriva stvaranjem pjene, mjehurića, a također i uz pomoć "plovka" - malih cijevi zapečaćenih s jednog kraja. Plovak je postavljen
u epruvetu sa zapečaćenim krajem pre sterilizacije medijuma i proverite da li je potpuno napunjena medijumom. Ako se plin razvija, on se akumulira u plovku u obliku mjehurića.
Da bi se opisala priroda rasta mikroorganizama u tečnim podlogama, oni se uzgajaju u mezopatamijskom bujonu (MPB) ili na drugom medijumu koji obezbeđuje dobar rast.
2.2 Morfološke karakteristike
Morfološke karakteristike i organizacija bakterijskih ćelija uključuju karakteristike kao što su oblik i veličina ćelija, njihova pokretljivost, prisustvo flagella i vrsta bičanja, sposobnost sporulacije. Detekcija ćelija također može biti od pomoći.
karakteristični membranski sistemi (hlorosomi, karboksizomi, fikobilizomi, gasne vakuole, itd.) svojstveni pojedinačnim grupama bakterija
ry, kao i inkluzije (parasporalna tijela, granule volutina,
poli-β-hidroksibutirat, polisaharidi, itd.). Bojenje ćelija po Gramu je od najveće važnosti za taksonomiju bakterija.
i strukturu njihovih ćelijskih zidova.
2.3 Fiziološka i biohemijska svojstva
Proučavanje fizioloških i biohemijskih svojstava uključuje, prije svega, utvrđivanje načina ishrane proučavane bakterije (foto/kemo-, auto/heterotrofija) i vrste energetskog metabolizma (sposobnost za fermentaciju, aerobno ili anaerobno disanje ili fotosintezu). ). Važno je odrediti takve osobine kao što su omjer bakterija i molekularnog kisika, temperatura, pH okoline, salinitet, osvjetljenje i drugi faktori okoline. Ova grupa znakova
uključuje i listu supstrata koji se koriste kao izvori ugljika, dušika i sumpora, potrebu za vitaminima i drugim faktorima rasta, stvaranje karakterističnih metaboličkih proizvoda, prisustvo određenih enzima. Za to se koriste posebni testovi.
Mnogi testovi koji se koriste za otkrivanje ovih znakova (ponekad se nazivaju rutinskim testovima) važni su za dijagnozu i široko se koriste u medicinskoj mikrobiologiji. Njihova formulacija zahteva značajno ulaganje vremena, veliki broj složenih medija i reagensa, poštovanje standardnih uslova i tačnost. Da bi se ubrzala i olakšala identifikacija nekih mikroorganizama, koji su uglavnom od medicinskog značaja, razvijeni su različiti test sistemi, na primer, sistemi Oxi/Ferm Tube, Mycotube i Enterotube II iz Hoffmann-La Roche (Švajcarska) itd. Na primjer, Enterotube II sistem, dizajniran za identifikaciju enterobakteriaceae, je plastična komora sa 12 ćelija koje sadrže obojene dijagnostičke medije. Sjetva svih podloga se vrši naprijed-rotacijskim pokretima kroz igličnu komoru sa sjemenom. Inkubacija se vrši 24 sata na temperaturi od 37 ºS. Pozitivan ili negativan rezultat testa ocjenjuje se po promjeni boje podloge, pucanju agara (test za stvaranje plina) ili nakon uvođenja specijalnih reagensa (test za stvaranje indola, Voges-Proskau-erova reakcija). Svako svojstvo je označeno određenim brojem, pa se dobijeni podaci mogu uneti u kompjuter sa odgovarajućim programom i dobiti odgovor o taksonomskom položaju soja koji se proučava.
Određivanje sastava bakterijskih ćelija važno je i za njihovu sistematiku (hemosistematika). Kemotaksonomske metode mogu biti važne, posebno za one grupe bakterija kod kojih morfološke i fiziološke karakteristike uvelike variraju i nedostatne za njihovu zadovoljavajuću identifikaciju. Stanični zidovi različitih prokariota uključuju nekoliko klasa jedinstvenih heteropolimera: murein (ili pseudomurein), lipopolisaharide, mikolne i teihoične kiseline. Sastav ćelijskog zida također određuje serološka svojstva bakterija. Ovo je osnova imunohemijskih metoda za njihovu identifikaciju.
Sastav lipida i masnih kiselina u bakterijskim stanicama ponekad se također koristi kao hemotaksonomski marker. Intenzivno proučavanje masnih kiselina postalo je moguće razvojem metode gasne hromatografske analize. Razlike u sastavu lipida koriste se za identifikaciju bakterija na nivou roda, pa čak i vrste. Ova metoda, međutim, ima određena ograničenja, jer sadržaj masnih kiselina u ćelijama može zavisiti od uslova kulture i starosti kulture.
Taksonomija nekih bakterija uzima u obzir sastav kinona
i drugi nosioci elektrona, kao i pigmenti.
Važne informacije o međusobnom odnosu bakterija mogu se dobiti proučavanjem ćelijskih proteina - proizvoda translacije gena. Na osnovu proučavanja membranskih, ribosomskih, ukupnih ćelijskih proteina, kao i pojedinačnih enzima, formiran je novi pravac – taksonomija proteina. Spektri ribosomskih proteina su među najstabilnijima i koriste se za identifikaciju bakterija na nivou porodice ili reda. Spektri membranskih proteina mogu odražavati generičke, vrste, pa čak i intraspecifične razlike. Međutim, karakteristike hemijskih jedinjenja ćelije ne mogu se koristiti za identifikaciju bakterija izolovano od drugih podataka koji opisuju fenotip, jer ne postoji kriterijum za procenu značaja fenotipskih osobina.
Ponekad se koristi metoda za identifikaciju bakterija ili drugih mikroorganizama kao što je kvasac numerička (ili Adansonova) taksonomija... Zasniva se na idejama francuskog botaničara M. Adansona, koji je predložio različite fenotipske osobine koje se mogu uzeti u obzir, da se smatraju ekvivalentnim, što omogućava kvantitativno izražavanje taksonomskih udaljenosti između organizama u obliku omjera broj pozitivnih osobina na ukupan broj proučavanih. Sličnost između dva proučavana organizma utvrđuje se kvantificiranjem najvećeg mogućeg broja (obično najmanje sto) fenotipskih osobina, koje su odabrane tako da su njihove varijante alternativne i mogu biti označene znakovima "minus" i "plus". Stepen sličnosti se utvrđuje na osnovu broja podudarnih karakteristika i izražava se kao koeficijent podudaranja S:
gdje a + d- zbir osobina po kojima se sojevi A i B poklapaju;
a- oba soja sa pozitivnim osobinama;
d- oba sa negativnim;
b- zbir znakova prema kojima je deformacija A pozitivna, B negativna;
sa- zbir znakova za koje je soj A negativan, soj B pozitivan.
Vrijednost koeficijenta usklađenosti može varirati od 0 do 1. Koeficijent 1 znači potpuni identitet, 0 - potpunu različitost. Kombinacije karakteristika se procjenjuju pomoću računara. Dobiveni rezultati su prikazani u obliku matrice sličnosti i/ili u obliku dendrograma. Numerička taksonomija se može koristiti za procjenu sličnosti između taksona mikroorganizama samo nižeg ranga (rodova, vrsta). Ne dopušta izvođenje direktnih zaključaka o genetskom odnosu mikroorganizama, ali u određenoj mjeri odražava njihova filogenetska svojstva. Tako je utvrđeno da fenotipske osobine bakterija koje se danas mogu proučavati odražavaju od 5 do 20% svojstava njihovog genotipa.
2.4 Proučavanje genotipa
Proučavanje genotipa mikroorganizama postalo je moguće kao rezultat uspješnog razvoja molekularne biologije i dovelo do pojave genosistematike. Proučavanje genotipa zasnovano na analizi nukleinskih kiselina, u principu, omogućava da se vremenom izgradi prirodni (filogenetski) sistem mikroorganizama. Procjenjuju se filogenetski odnosi bakterija određivanje molarnog sadržaja gvanin i citozin (HC) u DNK, DNK metodama–DNK i DNK–rRNA hibridizacijom, upotrebom DNK sondi, kao i proučavanjem nukleotidne sekvence u 5S,
J6
Si
23
S rRNA.
2.4.1 Određivanje molarnog sadržaja HZ
Određivanje molarnog sadržaja GC iz ukupnog broja DNK baza u prokariotima, kao što je već naznačeno, kreće se od 25 do 75%. Svaka bakterijska vrsta ima DNK sa karakterističnim prosječnim sadržajem HC. Međutim, kako je genetski kod degenerisan, a genetsko kodiranje se zasniva ne samo na sadržaju nukleotidnih baza u kodirajućim jedinicama (trojkama), već i na međusobnom rasporedu, isti prosječni GC sadržaj u DNK dvije bakterijske vrste može biti praćene njihovim značajnim genotipom
divizije. Ako su dva organizma vrlo bliska po sastavu nukleotida, onda to može biti dokaz njihovog evolucijskog odnosa samo ako imaju veliki broj zajedničkih fenotipskih osobina ili genetskih sličnosti potvrđenih drugim metodama. U isto vrijeme, neslaganje (više od 10 ... 15%) u nukleotidnom sastavu DNK dva soja bakterija sa zajedničkim fenotipskim svojstvima pokazuje da one barem pripadaju različitim vrstama.
2.4.2 DNK metoda –DNK hibridizacija
Ova metoda je važnija za procjenu genetskog odnosa bakterija. Pažljivo eksperimentisanje može pružiti vrijedne informacije o stepenu genetske homologije. Unutar jedne vrste bakterija stepen genetske homologije sojeva dostiže od 70 do 100%. Međutim, ako se, kao rezultat evolucijske divergencije, sekvence nukleotidnih baza genoma dvije bakterije razlikuju u većoj mjeri, tada specifična reasocijacija DNK – DNK postaje toliko slaba da se ne može izmjeriti. U ovom slučaju, hibridizacija DNK – rRNA može značajno povećati raspon organizama kod kojih se može odrediti stupanj genetske homologije zbog činjenice da je u relativno malom području bakterijskog genoma koji kodira ribosomske RNK, originalna bazna sekvenca mnogo veća. kompletan nego u drugim regijama hromozoma. Kao rezultat toga, metoda hibridizacije DNK – rRNA često otkriva prilično visoku homologiju bakterijskih genoma, u kojoj reasocijacija DNK – DNK ne otkriva nikakvu uočljivu homologiju.
2.4.3 Metoda DNK sonde (genske sonde).
Metoda DNK sonde je varijacija metode molekularne hibridizacije DNK-DNK. Reakcija hibridizacije se u ovom slučaju ne odvija između dva preparata ukupne DNK, već između fragmenta nukleotidne sekvence DNK (sonde), koji uključuje gen (genetski marker) odgovoran za neku specifičnu funkciju (npr. otpornost na neki antibiotik) i DNK bakterije koja se proučava. Najčešći način stvaranja genskih sondi je izolacija specifičnih fragmenata molekularnim kloniranjem. Da biste to učinili, prvo napravite banku gena proučavane bakterije cijepanjem njene DNK endonukleazama
restrikcijom, a zatim se elektroforezom odabere željeni klon iz zbira DNK fragmenata, nakon čega slijedi provjera genetskih svojstava ovih fragmenata transformacijom. Zatim se odabrani DNK fragment ligira u odgovarajući plazmid (vektor),
a ovaj kombinovani plazmid se uvodi u pogodan soj bakterija (na primjer, Escherichia coli).
Plazmidna DNK je izolirana iz biomase bakterije koja nosi DNK sondu i označena, na primjer, oznakom radioizotopa. Zatim izvršite hibridizaciju DNK sonde
sa bakterijskom DNK. Rezultirajuća hibridna područja se razvijaju autoradiografijom. Prema relativnoj učestalosti hibridizacije genetskog markera sa hromozomom određene bakterije,
zaključak o genetskom odnosu ovih bakterija sa ispitivanim sojem.
2.4.4 Metoda za analizu nukleotidnih sekvenci
u ribosomalnoj RNK
Za identifikaciju bakterija i stvaranje filogenetskog sistema za njihovu klasifikaciju, metoda analize nukleotidnih sekvenci u ribosomskim RNK je najrasprostranjenija i najvažnija. Molekuli 5S, 16S i 23S rRNA sadrže regije s najvišim stepenom genetske stabilnosti. Vjeruje se da su izvan mehanizma djelovanja prirodne selekcije i da evoluiraju samo kao rezultat spontanih mutacija koje se javljaju konstantnom brzinom. Akumulacija mutacija ovisi samo o vremenu, stoga se informacija o nukleotidnoj sekvenci ovih molekula smatra najobjektivnijom za određivanje filogenetskog odnosa organizama na razini od podvrste do carstva. U slučaju analize
5S rRNA obično određuje kompletan niz nukleotida, koji u ovoj molekuli kod prokariota iznosi 120 nukleotida. Prilikom proučavanja 16S i 23S rRNA koje sadrže 1500 odnosno 2500 nukleotida, često se provodi analiza oligonukleotida dobivenih iz ovih molekula korištenjem specifičnih restrikcijskih endonukleaza. Najrasprostranjenija studija je proučavanje nukleotidne sekvence u 16S rRNA. Proučavanje strukture 16S rRNA predstavnika različitih mikroorganizama dovelo je do identifikacije grupe arheja među prokariotima. Vrijednosti stope sličnosti SAB,
razdvajajući I6S rRNA bakterija i arheja, leže unutar 0,1, dok je vrijednost SAB,
jednako 1,0 odgovara potpunoj homologiji nukleotidnih sekvenci, a 0,02 nivou slučajne koincidencije.
Sve češće se predlažu dendrogrami za identifikaciju bakterija, koji pokazuju odnos između bakterijskih rodova, vrsta ili sojeva na osnovu proučavanja sekvence nukleotida (ili oligonukleotida) u rRNA, kao i DNK-DNK
i DNK-rRNA hibridizacija. Međutim, identifikacija bakterija prije porođaja samo na osnovu genetskih metoda, bez prethodnog proučavanja njihovih fenotipskih karakteristika, često je potpuno nemoguća. Stoga se najboljim pristupom u radu na taksonomiji bakterija smatra proučavanje i genotipskih i fenotipskih svojstava. U slučaju neslaganja između filogenetskih i fenotipskih podataka, potonji se privremeno daje prednost.
Poseban problem predstavlja identifikacija takvih bakterija i arheja, posebno morskih vrsta, koje ne mogu rasti na poznatim laboratorijskim podlogama za uzgoj i za koje je stoga bilo nemoguće dobiti čistu kulturu. Donedavno se ovaj problem činio nerešivim. Međutim, prije otprilike 15 godina razvijene su metode koje su omogućile ekstrakciju, kloniranje, sekvenciranje
i uporedi ribosomske RNK direktno iz okoline. To je omogućilo precizno prebrojavanje i identifikaciju mikroorganizama koji naseljavaju ovaj biotop bez izolacije u čistu kulturu. Ovako identificiran mikroorganizam "nekultivisan" u laboratoriji može se čak i opisati, ali uz dodatak riječi "candidatus" (kandidat). Riječ "candidatus" pratit će novu vrstu sve dok naučnici ne pronađu uslove za uzgoj ovog organizma u laboratoriji i dok se ne dobije njegova čista kultura, što će omogućiti da se prouče sva njena svojstva i objave kao legalizovane.
Bakterije se obično identifikuju pomoću Bergeyjevog priručnika za determinantnu bakteriologiju, koji je prvi put objavljen 1923. godine pod vodstvom poznatog američkog bakteriologa D. Bergeyja (DH Bergey, 1860-1937), od tada se redovno iznova izdaje uz učešće vodećih mikrobiologa iz svijet.
u nazivima grupa. Taksonomski položaj bakterija unutar grupa određuje se pomoću tabela i ključeva sastavljenih na osnovu malog broja fenotipskih znakova. Tablice diferencijacije za razlikovanje vrsta bakterija nekih rodova, na primjer, roda Bacillus,
nije dato, ali se čitalac upućuje na Burgeyjev vodič za sistematiku bakterija.
Bergeyev četvorotomni priručnik za sistematsku bakteriologiju (1984–1989) pruža potpunije informacije o taksonomskom položaju bakterija.
i vrste, uključujući one sa nejasnim taksonomskim statusom. Pored detaljnog fenotipskog opisa, uključujući morfologiju, organizaciju i hemijski sastav ćelija, antigena svojstva, tip kolonija, karakteristike životnog ciklusa i ekologiju, karakteristike rodova daju i informacije o sadržaju GC u DNK, rezultatima hibridizacije DNK – DNK i DNK – rRNA. Ključevi i tablice omogućavaju identifikaciju bakterija ne samo za rod, već i za vrstu.
Drugo izdanje Bergcyjevog priručnika za sistematsku bakteriologiju od četiri toma je sada objavljeno, a prvi tom je objavljen 2002. Osim toga, postoji niz članaka i knjiga koje nude originalne tragove za identifikaciju pojedinačnih grupa bakterija, za na primjer, bacili, pseudomonade, aktinomicete, enterobakterije.
Trenutno je prikupljeno mnogo novih podataka, uključujući i one dobijene kao rezultat analize nukleotidnih sekvenci ribosomske RNK, o prethodno proučavanim i novoizolovanim vrstama bakterija. Na osnovu ovih informacija, sastav vrsta nekih grupa bakterija, na primjer, rod Bacillus, će se revidirati: neke vrste će ostati u rodu Bacillus, a neki formiraju nove rodove ili će biti pripisani drugim već postojećim rodovima bakterija. Također treba napomenuti da se u pravilu proučava više svojstava za opis novih sojeva bakterija nego što je potrebno za njihovu identifikaciju, budući da ključevi i tabele ne uključuju sve osobine bakterija koje se mogu identificirati, već samo one koje se razlikuju u različitim vrstama. (Tabela 1).
Tabela 1 - Minimalna lista podataka potrebnih za
opisi novih sojeva bakterija (prema H. Truperu, K. Schleifer, 1992.)
Svojstva | Glavni znakovi | Dodatni znakovi |
Morfologija ćelije | Forma; veličina; mobilnost; unutarnje i ekstracelularne strukture; međusobni raspored ćelija; diferencijacija ćelija; vrsta ćelijske diobe; ultrastruktura ćelije | boja; priroda flagelacije; sporovi; kapsule; poklopci; izrasline; životni ciklus; heterociste; ultrastruktura flagela, membrane i ćelijskog zida |
Nastavak tabele 1
Obrazac rasta | Karakteristike rasta na čvrstim i tekućim hranjivim podlogama; morfologija kolonije | Boja kolonije, suspenzija |
otpornost na kiseline; obojenost spora, flagele |
||
Ćelijski sastav | DNK sastav; rezervne supstance | Homologija nukleinske kiseline; stanični pigmenti; sastav ćelijskog zida; tipični enzimi |
fiziologija | Odnos prema temperaturi; na pH podloge; vrsta metabolizma (fototrof, hemotrof, litotrof, organotrof); odnos prema molekularnom kiseoniku; akceptori elektrona; izvori ugljika; izvori dušika; izvori sumpora | Potreba za solima ili osmotskim faktorima; potreba za faktorima rasta; tipični metabolički proizvodi (kiseline, pigmenti, antibiotici, toksini); rezistencija na antibiotike |
Ekologija | Uslovi staništa | Patogenost; krug vlasnika; stvaranje antigena; serologija; osjetljivost na fage; simbioza |
3 LABORATORIJSKI RAD „IDENTIFIKACIJA
MIKROORGANIZMI"
svrha rada: upoznavanje sa osnovnim principima određivanja mikroorganizama. U procesu izvođenja laboratorijskih radova svaki student proučava svojstva bakterija koja su neophodna za opisivanje bakterijskog soja i njegovu identifikaciju do nivoa roda.
Zadaci
1. Odredite čistoću identifikovane bakterije i proučite morfologiju njenih ćelija.
2. Opišite kulturna dobra.
3. Proučiti citološka svojstva identificiranih bakterija.
4. Proučiti fiziološka i biohemijska svojstva identifikovanih bakterija.
5. Odrediti osjetljivost bakterija na antibiotike.
6. Popunite tabelu i rezimirajte.
3.1 Određivanje čistoće bakterije koju treba identificirati
i proučavanje morfologije njegovih ćelija
Za obavljanje poslova na identifikaciji mikroorganizama svaki učenik dobija jednu kulturu bakterija (na kosi agar u epruveti), koja se zatim provjerava čistoća. To se radi na nekoliko načina: vizualno, sijanjem na hranjive podloge i mikroskopski.
Obrazac rasta rezultirajuće bakterije se posmatraju prugama na površini podloge s kosim agarom. Ako je rast duž poteza heterogen, onda je kultura kontaminirana. Zatim se kultura zasija u epruvetu na kosoj podlozi (mesopatamia agar) za upotrebu
u daljem radu, a takođe izvršiti prosijavanje na površini čvrstog medijuma u Petrijevoj posudi metodom depletion streak radi provere čistoće (prema homogenosti uzgojenih kolonija). Inokulirane epruvete i posude stavljaju se u termostat na temperaturu od 30 ºS u trajanju od 2 do 3 dana. Ostatak originalne kulture bakterija u epruveti koristi se za mikroskopsku provjeru čistoće (prema morfološkoj homogenosti populacije), kao i za proučavanje oblika, relativnog položaja, pokretljivosti ćelija i njihove veličine. Mikroskopska kultura korištenjem preparata "drobljena kap" i preparata fiksiranih ćelija obojenih fuksinom. Rezultati se unose u tabelu sastavljenu u obliku tabele 2.
tabela 2 – Osobine bakterije koje treba identificirati
Svojstva | Znakovi | rezultate |
Kulturna dobra | ||
Veličina, mm | ||
Površina | ||
Struktura | ||
Dosljednost | ||
Morfologija ćelija i | Oblik i raspored ćelije | |
Mobilnost | ||
Prisustvo endospora | ||
Boja po Gramu | ||
Boja za otpornost na kiseline | ||
Fiziološka i biohemijska svojstva | Odnos prema molekularnom kiseonik | |
Rast na podlozi sa glukozom | ||
Rast na podlozi sa želatinom | ||
Raste na podlozi sa mlekom | ||
Rast na medijumu sa skrobom | ||
Test katalaze | ||
Preosjetljivost na antibiotike |
3.2 Kulturna dobra
U sljedećoj lekciji ispituje se Petrijeva posuda inokulirana suspenzijom identificiranih bakterija. Kriterijum za čistoću kulture je homogenost uzgojenih kolonija. Opišite kulturna svojstva kolonija bakterija u skladu s odjeljkom
bilješku 2.1 i rezultati se unose u tabelu 2.
3.3 Proučavanje citoloških svojstava bakterija koje se mogu identificirati
3.3.1 Prisustvo endospora
Mali broj ćelija iz čvrste podloge namotava se na stakalce u kapi vode iz slavine i uzima se razmaz. Razmaz se suši na vazduhu, fiksira u plamenu plamenika i na njega se nanosi 5% rastvor hromne kiseline. Nakon 5 ... 10 minuta ispere se vodom. Preparat se prekrije trakom filter papira i papir se obilno navlaži Tsilovim karbonskim fuksinom. Zagrijte preparat na vatri dok se ne pojave pare (da ne proključa), a zatim ga odvojite i dodajte novi dio boje. Ovaj postupak se izvodi 7 minuta. Važno je da boja ispari, ali da se papir ne osuši. Nakon hlađenja, uklanja se, preparat se ispere vodom i dobro upija filter papirom.
Ako se sve operacije izvode ispravno, boja je kontrastna, a jarko crvene spore se jasno ističu na plavoj pozadini citoplazme.
3.3.2 Boja po Gramu
3.3.2.1 Na odmašćenom predmetnom predmetu se pravi tanak razmaz u kapi vode tako da se ćelije ravnomerno raspoređuju po površini stakla i ne stvaraju grudvice.
3.3.2.2 Preparat se suši na vazduhu, fiksira iznad plamena plamenika i boji 1 ... 2 min karboličnim gentijanom ili kristalno ljubičastom.
3.3.2.3 Zatim se boja odlije i razmazi se tretiraju 1 ... 2 min Lugolovim rastvorom dok ne pocrne.
3.3.2.4 Ocijediti Lugolov rastvor, preparat se obezboji 0,5 ... 1,0 min sa 96% etil alkoholom i brzo ispere vodom.
3.3.2.5 Osim toga, boji se 1 ... 2 min vodenom otopinom fuksina.
3.3.2.6 Boja se odlije, preparat se ispere vodom i osuši.
3.3.2.7 Mikroskopija sa imerzionim sistemom.
Kada su pravilno obojene, gram-pozitivne bakterije imaju plavo-ljubičastu, gram-negativnu – roze-crvene boje.
Da bi se dobili pouzdani rezultati, potrebno je pripremiti briseve za bojenje po Gramu iz mladih, aktivno rastućih (obično jednodnevnih) kultura, budući da stanice iz starih kultura ponekad daju nestabilnu Gramovu reakciju. Gram-negativne bakterije mogu izgledati kao gram-pozitivne ako je bakterijski film (razmaz) predebeo i alkoholna dekolorizacija nije završena. Gram-pozitivne bakterije mogu izgledati kao gram-negativne bakterije ako je bris promijenjen alkoholom.
3.3.3 Boje za otpornost na kiseline
Razmaz ispitivane bakterije priprema se na odmašćenom predmetnom staklu u kapi vode. Preparat se suši na vazduhu i fiksira nad plamenom gorionika. Na razmaz se stavlja filter bamaga, preparat se prelije sa Tsilya carbolic fuksinom i zagrijava 2-3 puta dok se ne pojave pare, držeći stakalce pincetom visoko iznad plamena plamenika. Pojava para se posmatra posmatranjem mrlje sa strane, a kada se pojave, odmah se odlažu.
drogu na stranu. Ostavite preparat da se ohladi, uklonite filter papir, bacite boju i isperite mrlju vodom. Onda
ćelije su obezbojene 5% rastvorom kiseline H https://pandia.ru/text/79/131/images/image009_42.gif "width =" 11 "height =" 23 src = ">. puta u čaši sumporne kiseline ,
a da ga ne zadrži u sebi. Preparat se ponovo dobro ispere vodom i farba od 3 do 5 min metilen plavim (prema Leffleru). Boja se odlije, preparat se ispere vodom, osuši i pregleda uranjanjem. Kada su pravilno obojene, ćelije bakterija otpornih na kiselinu su crvene i nisu otporne na kiselinu – plava.
3.3.4 Određivanje mobilnosti
Ispitna kultura se sije u kolonu od 0,2 ... 0,5% polutečnog agara metodom injekcije. Da bi se karakteristike rasta najjasnije ispoljile, ubod se vrši u neposrednoj blizini zida epruvete. Setva se stavlja u termostat na 24 sata. Ovako napravljena sjetva omogućava identifikaciju i odvajanje mobilnih mikroorganizama od nepokretnih.
Nepokretni oblici bakterija rastu duž linije uboda, tvoreći male izrasline cilindričnog ili konusnog oblika. Istovremeno, okruženje ostaje potpuno transparentno. Pokretni mikrobi kod takve sjetve izazivaju izraženu zamućenost, koja se manje-više ravnomjerno širi po cijeloj debljini podloge.
3.4 Proučavanje fizioloških i biohemijskih svojstava
prepoznatljive bakterije
3.4.1 Odnos prema molekularnom kiseoniku
U odnosu na molekularni kiseonik, mikroorganizmi se dijele u četiri grupe: obvezni aerobi, mikroaerofili, fakultativni aerobi (anaerobi) i obvezni anaerobi... Da sudi
o pripadnosti mikroorganizama jednoj ili drugoj grupi, mikrobna suspenzija se inokulira u epruvete s rastopljenim agar hranjivim podlogom ohlađenim na temperaturu od 45 ºS. Setva se može obaviti injekcijom. Strogi aerobi rastu na površini medija i u gornjem sloju, mikroaerofili- na određenoj udaljenosti od površine. Fakultativni anaerobi obično se razvijaju po cijeloj debljini podloge. Strogi anaerobi rastu samo u dubini medijuma, na samom dnu epruvete (slika 6).
|
1 - aerobi; 2 - mikroaerofili; 3 - opcioni anaerobi;
4 - anaerobi
Slika 6 - Rast mikroorganizama pri sjetvi injekcijom ( a) i kada se inokulira u rastopljenu gustu podlogu ( b)
3.4.2 Rast na podlozi sa glukozom i peptonom
Kultura se sterilnom petljom unosi u tečni medij koji sadrži: 5,0 g/l peptona, 1,0 g/l K2HP04, 10,0 g/l glukoze, 2 ml bromotimol plavog (1,6% rastvor alkohola), destilovanu vodu sipanu u epruvete ( 8 ... 10 ml svaki) sa plovcima. Trajanje uzgoja je 7 dana u termostatu na temperaturi od 30°C. Rast mikroorganizama ili njegovo odsustvo determinisano je zamućenjem medija, stvaranjem filma ili sedimenta. Promjena boje indikatora (bromotimol plava) ukazuje na stvaranje kiselih (žuta boja podloge) ili alkalnih (plava boja medija) metaboličkih proizvoda. O formiranju plina svjedoči njegovo nakupljanje u plovku. Rezultati posmatranja se upoređuju sa sterilnom okolinom.
3.4.3 Rast na podlozi sa želatinom
Aktivnost ekstracelularnih proteolitičkih enzima u mikroorganizmima određuje se korištenjem želatine, kazeina ili drugih proteina kao supstrata. Srijeda sa želatinom sastoji se od mezopatamia bujona (MPB) i 10 ... 15% želatine (MPF). Sjetva se vrši injekcijom.
Bakteriološkom iglom sterilno se uzimaju ćelije mikroorganizama iz dovratnika i igla se uvlači u debljinu MPG kolone do dna epruvete.
Trajanje uzgoja je od 7 do 10 dana na sobnoj temperaturi. Ukapljivanje želatine se posmatra vizuelno. Ako se želatin ukapljuje, navesti intenzitet i oblik ukapljivanja - sloj po sloj, u obliku lijevka, vrećastog oblika, u obliku kratera, u obliku repa, u obliku mjehurića.
3.4.4 Rast na podlozi sa mlekom
Nanošenje na "mliječni agar" u Petrijevim posudama vrši se kako bi se utvrdila sposobnost bakterija da razgrađuju mliječni kazein. Podloga se sastoji od jednakih dijelova sterilnog obranog mlijeka i sterilnog 3% vodenog agar-agara. Bakterije se inokuliraju u petlji, crtajući potez duž prečnika posude ili u sredini sektora na koji je posuda podijeljena. Trajanje uzgoja bakterija u termostatu na temperaturi od 30°C je 7 dana. Hidroliza kazeina se otkriva po zoni bistrenja podloge oko kolonija ili kulturom mikroorganizama uzgojenih duž pruge. Zona je posebno jasno vidljiva nakon tretiranja podloge sa uzgojenim bakterijama rastvorom 5% trihloroctene kiseline. Zona hidrolize kazeina mjeri se u milimetrima od ruba linije ili kolonije do granice svjetlosne zone. Što je veći promjer svijetle zone, to je veća kazeinolitička aktivnost bakterija.
3.4.5 Rast na podlozi sa škrobom
Sjetva na agar podlogu sa škrobom (u Petrijevim posudama) koja sadrži (g/l): pepton – 10.0; KN2R04 – 5.0; rastvorljivi skrob – 2.0; agar – 15.0; pH 6,8 – 7.0, proizveden za određivanje formiranja amilaze od strane mikroorganizama. Bakterije se inokuliraju u petlji, crtajući potez duž prečnika posude ili u sredini sektora na koji je posuda podijeljena. Bakterije su kultivisane 7 dana u termostatu na temperaturi od 30°C. Hidroliza škroba se otkriva nakon tretiranja podloge sa uzgojenim bakterijama Lugolovom otopinom. Za to se na površinu medija izlije od 3 do 5 ml Lugolove otopine. Podloga koja sadrži škrob postaje plava, a zona hidrolize ostaje bezbojna ili postaje crveno-smeđa ako se škrob hidrolizira u dekstrine. Zona hidrolize škroba mjeri se od ruba pruge (kolonije) do granice svijetle zone (mm). Što je veći promjer svjetlosne zone, to je veća aktivnost amilaze.
3.4.6 Test katalaze
Dio uzgojene kulture suspendira se pomoću bakteriološke petlje u kapi 3% vodikovog peroksida na stakalcu. Prisutnost katalaze dokazuje formiranje mjehurića plina uočeno 1 ... 5 minuta nakon unošenja bakterije golim okom ili pod mikroskopom pri malom povećanju. Možete nanijeti nekoliko kapi vodikovog peroksida direktno na koloniju ili kulturu uzgojenu na kosom agaru i promatrati evoluciju molekularnog kisika.
3.4.7 Određivanje osjetljivosti bakterija
na antibiotike
Pogodno je odrediti osjetljivost mikroorganizama na antibiotike pomoću gotovih papirnih diskova impregniranih određenim antibioticima. Ispitivani mikroorganizmi se uzgajaju na odgovarajućem čvrstom hranljivom mediju. Gusta suspenzija ispitivanog mikroorganizma priprema se u sterilnoj vodi iz slavine ispiranjem ćelija vodom sa površine čvrstog hranljivog medija. Radeći u blizini plamena plamenika, dodajte 1 ml dobivene suspenzije
u epruvetu sa 20 ml agar podloge, rastopljene i ohlađene na temperaturu od 50 ºS, na primjer, sa mesopatamia agarom (MPA). Ako su mikroorganizmi uzgajani u tekućem hranljivom mediju, tada se agaru dodaje odgovarajuća zapremina kulture. Sadržaj epruvete se brzo i temeljno miješa i sipa u sterilnu Petrijevu posudu.
Kada se medij stvrdne, na njegovu površinu se stavlja papir.
diskovi na jednakoj udaljenosti jedan od drugog i na udaljenosti
1,5 ... 2,0 cm od ruba čaše. Petrijeve zdjelice se drže 2 sata na sobnoj temperaturi radi bolje difuzije antibiotika u agar podlogu, a zatim se, bez invertiranja, stavljaju u termostat na 24 sata na temperaturi od 30 ºS. Nakon jednog dana primjećuje se formiranje zona supresije rasta ispitivanih mikroorganizama oko diskova. Ako je ispitivana bakterija osjetljiva na određene antibiotike, tada se oko diskova nalaze zone bez rasta kulture. Prečnik zone inhibicije rasta se meri milimetarskim lenjirom, a rezultati se beleže u tabeli 3. Zona veća od 30 mm označava
o visokoj osjetljivosti mikroorganizama na antibiotik, a manje od 12 mm - o slaboj osjetljivosti.
Kada eksperimentator ima rješenja
antibiotske supstance ili tečnost kulture koja sadrži
antibiotik, koristite metodu koristeći rupe u debljini agara.
U ovom slučaju, rupe se prave na udaljenosti od 1,5 ... 2,0 cm od ruba čaše u zamrznutoj agar podlozi inokulisanoj test mikroorganizmom sterilnom bušilicom za plute (promjer od 6 do 8 mm).
U jažice se dodaju rastvori antibiotika ili tečnosti za kulturu. Ova metoda također omogućava otkrivanje sposobnosti mikroorganizama uzgojenih u tečnom mediju da formiraju antibiotske supstance.
Tabela 3 – Učinak antibiotika na rast bakterija
Antibiotik | Prečnik zona inhibicije rasta, mm |
Penicilinski disk | |
Disk sa hloramfenikolom |
4 KONTROLNA PITANJA
1. Definirajte sljedeće pojmove:
- naprezanje; authentic strain; tip strain;
- kolonija;
- kulturna dobra;
- taksonomija;
- klasifikacija;
- nomenklatura;
- plazmid;
- tipizacija faga.
2. Koje dijelove obuhvata taksonomija mikroorganizama? Navedite njihove karakteristike.
3. Zašto su postojeći sistemi klasifikacije mikroorganizama umjetni?
5. Koje su karakteristike različitih sojeva istog tipa mikroorganizma?
6. Koje taksonomske kategorije mikroorganizama su potrebne, a koje opcione?
7. Navedite osnovna pravila za nomenklaturu mikroorganizama.
8. Koja je glavna svrha identifikacije mikroorganizama?
9. Koja je razlika između principa klasifikacije i identifikacije različitih grupa prokariota i eukariota?
10. Koja svojstva se proučavaju prilikom opisivanja i identifikacije bakterija?
11. Koji se znakovi uzimaju u obzir pri opisivanju površinskih, dubokih i donjih kolonija mikroorganizama?
12. Koje karakteristike se primjećuju kada se opisuje rast mikroorganizama moždanim udarom?
13. Šta se primjećuje kada se karakteriše rast mikroorganizama u tečnom hranljivom mediju?
14. Koji znaci uključuju morfološke karakteristike i organizaciju bakterijskih ćelija?
15. Koja se fiziološka i biohemijska svojstva proučavaju prilikom identifikacije bakterija?
16. Kada je potrebno koristiti hemotaksonomske metode?
17. Koji su neki primjeri supstanci koje se koriste kao kemo-taksonomski markeri?
18. Koje su karakteristike taksonomije proteina?
19. Opišite metodu numeričke taksonomije, koja ograničenja ima?
20. Koje metode se koriste za procjenu filogenetskih odnosa bakterija?
21. Koja je suština metode DNK sonde i njena razlika od metode
DNK – DNK hibridizacija?
22. Koje su karakteristike metode za analizu nukleotidnih sekvenci u ribosomalnoj RNK?
23. Koji se znakovi koriste kao osnova za klasifikaciju bakterija u "Bergeyjevom identifikatoru bakterija"?
24. Koja svojstva i znakovi se proučavaju kada se opisuju novi sojevi bakterija?
25. Koje metode se koriste za određivanje čistoće identificiranih bakterija?
26. Koja su osnovna pravila za primjenu tehnike bojenja po Gramu?
27. Na koje grupe se dijele mikroorganizmi u odnosu na molekularni kiseonik?
28. Šta se koristi kao supstrat za određivanje aktivnosti ekstracelularnih protolitičkih enzima u mikroorganizmima?
29. Koje metode određivanja osjetljivosti mikroorganizama na antibiotike poznajete, dajte njihove karakteristike.
30. Koja metoda se koristi za određivanje stvaranja amilaze kod mikroorganizama?
31. Kako izvršena sjetva omogućava identifikaciju i odvajanje mobilnih mikroorganizama od nepokretnih?
5 RECEPATA ZA BOJE I NUTRITIVNE MEDIJE
5.1 Fuchsin osnovni karbolic (fuksin Tsilya)
- 5% vodeni rastvor sveže destilovanog fenola - 100 ml;
- zasićeni alkoholni rastvor bazičnog fuksina - 10 ml;
Pripremljena smjesa se filtrira nakon 48 sati.
5.2 Metilensko plavo (prema Leffleru)
- zasićeni alkoholni rastvor metilen plavog - 30 ml;
- destilovana voda - 100 ml;
- 1% vodeni rastvor KOH - 1 ml.
5.3 Mesna peptonska čorba (BCH)
500 g mljevenog mesa bez masnoće i tetiva sipa se u 1 litar vode iz slavine i ekstrahira na sobnoj temperaturi 12 sati ili u termostatu na 37 ºS 2 sata, a na 50 ºS jedan sat. Zatim se meso protisne kroz gazu, a dobivena infuzija se kuha 30 minuta. U ovom slučaju dolazi do koagulacije proteina. Ohlađena masa se filtrira kroz pamučni filter i dodaje vodom do prvobitne zapremine. Zatim se u 1 litar mesne juhe dodaje 5 do 10 g peptona i 5 g natrijum hlorida. Medijum se zagreva dok se pepton ne rastvori, uz stalno mešanje. BCH se steriliše pod pritiskom od 2 atm tokom 20 minuta.
5.4 Meat Pepton Agar (MPA)
U 1 l MPB dodajte 20 g agara. Podloga se zagrijava dok se agar ne otopi, a zatim se uspostavlja blago alkalna reakcija podloge
20% otopina NaCO64 "visina =" 52 "bgcolor =" bijela "style =" vertikalno poravnanje: vrh; pozadina: bijela ">
Učitavanje ...